Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследвоание транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследвоание транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма"

На правах рукописи

({т

Блашко Эдуард Львович

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ФОРМ ГОМОЦИСТЕИНА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА

03.00.04. - биохимия Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007

003056076

Работа выполнена в отделе биохимии НИЦ (заведующий отделом- профессор А. А. Жлоба) ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ректор - академик РАМН Н. А. Яицки й)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Александр Анатольевич Жлоба Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Александр Дорофеевич Денисенко, доктор биологических наук, профессор

Марина Николаевна Маслова Ведущее учреждение: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 2007 г. в

часов на заседании диссертационного совета К.208.088.01 по специальности 03.00.04 - биохимия при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. профессора Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. профессора Попова, д. 14.

Автореферат разослан " (ЩСи^^пЯ 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук / А. В. Караваева

Актуальность темы.

С 90-х годов прошлого века концентрация общего гомоцистеина плазмы крови признана независимым фактором риска развития атеросклероза [Guba S.C. et.al., 1996] и сердечно-сосудистых заболеваний. Распространенность ГГци в Санкт-Петербурге с учетом возраста и пола обследуемых впервые показана в Институте Экспериментальной Медицины РАМН в 2001 г. Как известно из литературных источников, приблизительно 70% Гци в плазме крови связано с альбумином, 15% окисляется до дисульфидов, и только приблизительно 1-15% присутствует как свободный Гци. В связи с изучением метаболизма транспортных форм Гци в плазме крови, его влиянием на окислительно-восстановительные равновесия других аминотиолов, участием в генерации супероксид-аниона, ковалентных модификациях нативных белков, а также важностью в качестве диагностического маркера, разработка и совершенствование методов анализа оГци приобрели актуальность не только для развития фундаментальной биохимии, но и большое практическое значение при реализации программ охраны здоровья населения [Rasmussen К. et. al., 2000]. До открытия связанного с белком Гци, диагностика умеренных повышений его уровня в плазме крови была крайне затруднительной. С введением методов измерения оГци в крови, предусматривающих обработку проб редуцирующими агентами, стало реальным измерение его небольших уровней в крови.

В настоящее время еще недостаточно изучен вклад других белков, помимо альбумина, в транспорт Гци. Гци может избирательно возвращаться в некоторые клетки путем эндоцитоза, находясь в связанном состоянии с белками. Не изучен вопрос о параметрах оксидативиого стресса при различных ГГци.

Исследования последних 25 лет подтвердили гомоцистеиновую теорию развития сосудистых нарушений. В клинической лабораторной диагностике используется термин «общий гомоцистеин плазмы крови» (оГци), который обозначает сумму различных состояний вещества. L-Гци и его дисульфидные формы, накапливающиеся в плазме крови в концентрациях выше 12-15 мкМ в пересчете на оГци, токсичны для тканей [Welch G.N. et al., 1997] и вызывают усиление атерогенеза [Herrmann W., 2002], обозначенного в современной литературе как гипергомоцистеинемия (ГГци).

Все вышеизложенные положения позволили сформулировать тему диссертационной работы.

Цель исследования заключалась в развитии представлений о транспортных формах Гци в плазме крови с использованием современного высокочувствительного экспресс-метода ВЭЖХ-анализа оГци, а также в изучении некоторых показателей оксидативного стресса при ГГци различного уровня.

Для достижения этой цели были поставлены следующие

задачи:

1. Изучить параметры хроматографического разделения хромогенных производных аминотиолов глутатиона, гомоцистеина и пеницилламина с использованием колонок обращенно-фазных сорбентов С8 и С18.

2. Изучить УФ-спектры поглощения ТНБ-производных различных аминотиолов и зависимость абсорбции света в области максимума поглощения для производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина при различных концентрациях.

3. Выявить оптимальные параметры температурной обработки при высвобождении гомоцистеина из связанных дисульфидных форм. Для моделирования связанного состояния гомоцистеина в плазме крови изучить возможность использования раствора альбумина в качестве носителя свободной тиоловой группировки. Оптимизировать условия подготовки экспериментальных образцов плазмы крови, при которых Гци претерпевает полную модификацию, сопоставимую с таковой для Глт, изучить воспроизводимость исчерпывающего перевода различных форм Гци, имеющихся в плазме крови, в одну регистрируемую производную форму.

4. Исследовать связывание гомоцистеина с фракциями белков крови методом гель-фильтрации у здоровых доноров и у пациентов с гипергомоцистеинемией. Методом гель-фильтрации изучить транспорт гомоцистеина белками плазмы крови при умеренных и промежуточных формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ).

5. Получить очищенные препараты альфа-2-макроглобулина из плазмы крови человека и изучить методом гель-фильтрации связывание гомоцистеина активированными и неактивированными трипсином препаратами альфа-2- макроглобулина.

6. Изучить влияние однократных инъекций препарата гомоцистина и его смеси с субстратом >Ю-синтаз аргинина экспериментальным животным на концентрации свободных тиоловых групп, малонового диальдегида и ТБК-активных продуктов.

-57. Изучить корреляцию между уровнем гомоцистеина SH-rpynn, концентрацией малонозого диальдегида и ТБК-активных продуктов при умеренных и промежуточных формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ).

Научная новизна. Показано, что при различных степенях гипергомоцистеинемии (ГГци), в отличие от здорового состояния организма, значительная часть Гци связывается не с альбуминовыми, а с глобулиновыми фракциями плазмы крови, в частности, с альфа-2-макроглобулином (МГ).

Связывание гомоцистеина МГ становится возможным после активации последнего протеиназой, т. е. после экспрессии свободных тиоловых групп МГ. В работе показано, что тиоловые группировки активированного МГ являются центрами связывания Гци.

Впервые было показано, что Гци образует очень прочные, смешанные дисульфиды белков, которые могут быть полностью восстановлены только в более жестких условиях, чем другие дисульфиды.

Проанализирован протективный при развитии ПОЛ эффект аргинина при ГГци.

Предложенная методика анализа Гци позволяет выявлять различные эндогенные аминотиолы и их восстановленные формы, в частности восстановленную форму Гци, которая содержится в значительно меньших количествах, чем оГци.

Положения, выносимые на защиту.

1. Для анализа аминотиолов с близкими параметрами удерживания при разделении с использованием обращенно-фазных сорбентов наряду с колонками на основе октадецильных сорбентов (С 18) допустимо использовать обращенно-фазные сорбенты с октальными радикалами (С8).

2. УФ-спектры поглощения ТНБ-производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина имеют совпадающий для различных производных аминотиолов максимум светопоглощения в области 330 нм. Зависимость абсорбции света в области максимума поглощения для производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина при различных концентрациях описывается линейными близкими друг другу уравнениями: для оГци у (mAU) = 1,209х + 1,071 (г = 0,9992); для Глт у (mAU) = 1,3 84х - 0,334 (г = 0,9999); для Пна у (mAU) = 1,376х + 0,342 (г = 0,9999).

-63. В ходе инкубации в течение 10 минут при +60°С в среде избыточного дитиотреитола наблюдается полный перевод изученных аминотиолов в восстановленное состояние (и поддержание в восстановленной форме) с соответствующим образованием ТНБ-производных, тогда как при более низкой температуре +45°С в среде дитиотреитола наблюдается пониженный выход аминотиолов, в особенности, гомоцистеина.

4. В норме Гци связывается как с альбуминовыми фракциями, так и с крупномолекулярными фракциями в количестве 0,195±0,030 и 0,175±0,026 мкмоль/г белка, соответственно. Выявлено резкое повышение содержания Гци, связанного с крупномолекулярными фракциями - 1,6 мкмоль/г белка, что почти в 10 раз больше, чем в плазме крови здоровых доноров.

5. Очищенные препараты альфа-2-макроглобулина после активации трипсином экспрессируют тиоловые группировки и связывают (но данным метода гель-фильтрации) гомоцистеин, в отличие от неактивированных препаратов альфа-2- макроглобулина.

6. В случае с ТБК-активными продуктами и собственно МДА, введение аргинина экспериментальным животным смягчает прооксидантные эффекты Гци, наряду с этим, тормозя окисление свободных тиолов плазмы крови.

7. При анализе концентрации тиоловых групп в плазме крови различных контингентов обследованных с гипергомоцистеинемией и уровня восстановленного Гци показано, что доля восстановленного Гци (вГци) и содержание тиоловых групп снижается при умеренной и промежуточной формах гипергомоцистеинемии различного генеза.

8. Предложенная модификация метода анализа гомоцистеина позволяет выявлять восстановленные формы гомоцистеина, присутствующие в плазме крови в концентрации до 0,1 мкМ и общую форму гомоцистеина и глутатиона в широком диапазоне концентраций.

9. Разработана высокочувствительная воспроизводимая, селективная модификация ВЭЖХ-анализа гомоцистеина и глутатиона на основе регистрации продуктов взаимодействия исследуемых аминотиолов и ДТНБ.

Теоретическая значимость работы состоит в обнаружении возможного механизма транспорта гомоцистеина при различных степенях ГГци в составе молекулы альфа-2 макроглобулина в фагоцитирующие клетки. Этот факт, возможно, объясняет ускорение атерогенеза за счет трансформации макрофагов.

-7-

Практическая ценность работы

1. Проведена модификация метода определения общего Гци в плазме крови с предколоночной модификацией ДТНБ и фотометрическим детектированием продуктов реакции. Процесс подготовки проб сокращен с 10 до 7 стадий с одним буферным раствором для приготовления восстановителя - дитиотреитола и модификатора - ДТНБ.

2. Модификация метода определения оГци с предколоночной обработкой проб ДТНБ и фотометрическим детектированием позволяет определять соотношение общего и восстановленных форм Гци и Глт.

3. Впервые, в качестве калибровочных растворов, использовались растворы окисленного Глт и Гци, приготовленные с использованием сывороточного альбумина в качестве матрицы. Солюбилизация Гци альбумином позволяла моделировать образование дисульфидов Гци в крови. Растворы окисленных Глт и Гци, приготовленные на альбумине, рекомендуются в качестве калибровочных при анализе серий образцов плазмы крови.

4. В процессе обследования пациентов с церебрально-васкулярными нарушениями кровообращения, коронарным атеросклерозом, хронической почечной недостаточностью (ХПН) показано, что повышение содержания оГци выше нормы (<12-15 мкМ) сопровождается активацией ПОЛ.

Внедрение результатов работы. Результаты исследований внедрены в практику работы кафедр: факультетской терапии, пропедевтики внутренних болезней, госпитальной хирургии № 1; лаборатории интенсивного гемодиализа нефрологического центра; лаборатории гомеостаза ЦЛД ГОУ ВПО СПбГМУ имени И.П. Павлова Росздрава; в практику обследования пациентов поликлиники № 31 Петроградского района г. Санкт-Петербурга.

Апробация работы и публикации. Материалы исследований и основные положения работы были представлены на Международном Симпозиуме «Аналитический Форум-2002» (Москва, 17-18 апреля 2002 г.) по высокоэффективным жидко-фазовым разделениям и смежным технологиям, организованном компанией «Hewlett Packard/Agilent Technologies» (Germany) и ЗАО «Юнилаб»(Россия), на Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» - 3-ем Международном Симпозиуме по современным разделениям в биологических исследованиях (Москва, 03-18 мая 2003 г.), на Симпозиуме «Неделя

здорового сердца и мозга» (Санкт-Петербург, 25-30 мая 2003 г.), на научно-практической конференции «Лабораторные исследования в диагностике сердечно- сосудистой патологии» (Санкт-Петербург, 14 апреля 2005 г.), на Симпозиуме «Неделя здорового сердца и мозга» (Санкт-Петербург, 14 апреля 2005 г.), на Международном Конгрессе «Гипертензия - от Короткова до наших дней» (Санкт-Петербург, 15-17 сентября 2005 г.)

По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано l4> печатных работ, в том числе научных публикаций в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка используемых сокращений. Диссертация изложена на 125 печатных страницах, работа иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Указатель литературы включает 40 отечественных и 104 иностранных источника.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. В процессе работы обследовано здоровых доноров - 20, пациентов с диагнозом «церебральный атеросклероз» - 145, пациентов с диагнозом «коронарный атеросклероз» -220, пациентов с диагнозом «хроническая почечная недостаточность» -255. При моделировании акселерации токсических эффектов на фоне ГГци введением гомоцистина и его смеси с аргинином экспериментальным крысам проанализировано 72 образца сыворотки крови.

Материалы для исследования. Все использованные в работе реактивы были особо чистые (ОСЧ) и химически чистые (ХЧ). Плазму крови здоровых доноров и пациентов получали путем забора крови натощак в пробирки с насыщенным раствором ЭДТА. Неиспользованную плазму крови хранили в морозильнике при -25°С. Аналогичным способом отделяли сыворотку крови в эксперименте с крысами и хранили до анализа в тех же условиях, что и плазму крови.

Методы исследования. В работе были применены две группы методов: жидкостная хроматография высокого и низкого давления, спектрофотометрические методы.

ВЭЖХ-анализ оГци проводили на хроматографе Agilent 1100 с колонкой Zorbax Eclipse XDB С8, 5 мкм; 150x4,6 мм, Kromasíl С8, 3,5 мкм; 100x4,6 мм, Luna С)8,, 5 мкм; 150x4,6 мм.

Усовершенствованная процедура анализа аминотиолов заключалась в следующем: 0,1 мл плазмы крови смешивали с 0,05 мл 0,5 М калий-фосфатного буфера рН 8,0 или 0,05 мл калибровочного раствора и 0,02 мл ДТТ 10 мМ. Смеси инкубировали 10 минут при +60°С, добавляли 0,1 мл 10 мМ ДТНБ. Затем добавляли 0,15 мл сульфосалициловой кислоты в концентрации 90 г/л. Осажденные сульфосалициловой кислотой белки отделяли центрифугированием в течение 5 минут при 8000 g. В случае определения восстановленной формы Гци в рабочую пробу вместо ДТТ, в том же объеме добавляли 0,5 М калий фосфатный буфер с рН 8,0. Для серийного анализа плазмы крови калибровочный раствор смеси Гци и Глт использовали как в начале, так и конце серии проб. Подвижная фаза для элюции представляла собой ацетонитрил : 0,1 М калий-фосфатный буфер рН 3,78 в соотношении 9:91. Скорость подачи подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин, температура анализа - 30°С, объем вводимого на колонку образца - 0,01 мл.

Количественное определение МДА проводили на колонке КготаБи С8, 3,5 мкм; 100x4,6 мм по методике [Ри11е Б. е1. а1., 2000]. В качестве внешнего стандарта использовали водный раствор тетраэтоксипропана с концентрацией 1 мкМ и 10 мкМ. Метод использовали при моделировании акселерации токсических эффектов на фоне ГТци различного уровня при внутримышечном введении гомоцистина и его смеси с аргинином экспериментальным крысам.

Гель-фильтрация на колонках с ссфадексом использована при изучении связывания Гци белками крови и альфа 2-макроглобулином (МГ), активированным и неактивированным трипсином, а также для вспомогательных целей оценки препаратов Гци на 2% альбумине.

Изучение связывания Гци белками крови проводили методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-200 (450x10 мм, рабочий объем VI = 35,6 мл), на которую наносили 0,5 мл плазмы крови или 0,5 мл солюбилизированного альбумином Гци после инкубации с МГ, активированным или неактивированным трипсином. Элюент - 0,1 М двузамещенный натрий-фосфатный буфер с рН 7,50. Скорость подачи элюента - 0,2 мл/мин, объем отбираемых фракций - 0,2 мл. Определение белка проводили по реакции Лоури, а также измерением светопоглощения при 260 и 280 им.

Человеческий МГ выделяли модификацией методики Ъх\-хелатного фракционирования [Жлоба А. А., Иванова С. Ю., 2002].

Сиектрофотометрические методы исследования изложены в пособии [Жлоба А. А., 2001]. Были применены спектрофотометрические

методы исследования: определение свободных тиоловых групп; ТБК-активных продуктов, включая МДА, а также определение аргинина по реакции Сакагучи и белка по Лоури.

Математическая обработка полученных данных.

Расчеты параметров разделения на колонках С8 и С,8 проводили по формулам: k' = (tR-tO)/tO , а = к27 к'1 , Rs= ч'Ы(а.-1)к74а (1+ к'). Данные были проанализированы с помощью непарного t-теста Стьюдента. Различия принимались не достоверными при р < 0,05. Результаты выражали в средних со стандартным отклонением (SD). Для всех статистических анализов использовали программы Statsoft® Statistica, версия 6, и Microsoft® Excel ХР.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение свойств ашшотиолов и их производных

Сродство гомоцистеина и глутатиона к октадецилыю- и октильно-замещенным сорбентам. В процессе исследований была изучена селективность разделения Гци и Глт на колонках с сорбентами Zorbax Exlipse XDB С8, Kromasil Cs, Luna Ci8. Параметры разделения, полученные на больших сериях опытов, отображены в табл. 1. Как видно из приведенных экспериментальных данных, время удерживания производных Глт и Гци на колонке Luna Ci8 несколько больше, чем на колонке с сорбентом Zorbax Eclipse XDB С8 и Kromasil С8; выше и фактор удерживания этих соединений. Однако сорбент Zorbax Eclipse XDB С8 характеризуется более высокой селективностью в отношении разделения производных Гци и Глт. Как видно из табл. 1, значения фактора разделения (Rs) Гци и Глт на колонках с сорбентом С)8 и С8 практически одинаковы. Для всех случаев сравнения селективности разделения не могут выявляться достоверные отличия селективности а (Рис. 1). Несмотря на близкие средние значения параметра селективности, полученного для всех трех типов колонок в отношении разделения ТНБ-производных Глт и оГци на больших сериях наблюдений, показано его достоверное отличие при хроматографии на колонках С8 (Zorbax/Kromasil) р = 2,59Е-11 и на колонках С8/С,8 Zorbax/Luna р = 1,74Е-09; а на Kromasil/ Lunaр = 9,87Е-04.

К0Л0НХ4 Глт Гцк ♦в Пка к' Глт к' Гцк к' Пна «1 а, & Глт & Гни & Пна

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12

2оЛах ЕсНрге ХИВ С5, Зтлжм; 150 я 4,6 гаг, Коттчестго олытое-225 3,84 ±о,озз 4,23 ±0,049 Р ги> = б,57Е-275 4,51 ±0,055 Рп.-> = 1.93Е- 33 0,995 ±0,034 1,22 ±0,025 Рм ~ 6,57Е-275 1,34 ±0,023 Рм = 1,93Е- 33 1,23 ±0,013 1,10 ±0,003 Р[3<9) = 4,11Е- 92 2,70 ±0,142 2,98 ±0,179 1,51 ±0,122

КготазЦ С-, 3,5г.тигт, 100 х 4,бга^ Кяпичестто опьпо1=255 3,61 ±0,029 3,92 ±0,024 Рол = 9,03Е-21б 2,22 ±0,026 2,50 ±0,021 Рс.и -О.ОССОЗ 1,12 ±0,010 2,65 ±0,235 2,75 ±0,251

1лта С|2, 5*ткм; 150 х 4дбмп, 10= 1,66; N^,<8^,=15205 Количество огштог=33 5,03 ±0,03 5,54 ±0,07 Рм = 6,24Е- 36 2,03 ±0,05 2,34 ±0,04 Pti.ii = 1.3СЕ- 35 1,15 ±0,01 2,72 ±0,078 2,34 ±0,087

Дм расчета параметрог удерживания испотазоЕаны паспортные данные колонок дня 1о (гремя элюцки неудержнзаемого Еепестга, е обоих случаях урацип, при скорости эшоцик 0,8 мл/мин) и числа теоретических тарелок (N5-

Кготаы! CS Тип колонки

Го~| Mean Т" iSD

Рис.1. Изменение селективности а, характеризующего разделение производных глутатиона и гомоцистеина при хроматографии на колонках Zorbax Eclipse XDB С8 (п = 226; Среднее значение = 1,229; Стандартное отклонение = 0,018; Мах = 1,311; Min = 1,192); Kromasil C¡¡ (n = 255; Среднее значение = 1,122; Стандартное отклонение = 0,010; Мах = 1,144; Min = 1,106) Luna CI 8 (n = 33; Среднее значение = 1,151; Стандартное отклонение = 0,006; Мах =1,164; Min = 1,142).

ТНБ-производные изученных аминотиолов имеют существенно различное сродство к обращенно-фазным сорбентам с октадецильными и октальными радикалами.

Абсорбционные спектры ТНБ-производных аминотиолов.

В связи с тем, что известный ранее метод анализа с использованием ДТТ и ДТНБ для получения производных аминотиолов предполагал различное светопоглощение для ТНБ-производных Глт и Гци были изучены спектры поглощения Глт-ТНБ, Гци-ТНБ и Пна-ТНБ. Абсорбционные спектры этих производных аминотиолов были при одинаковых концентрациях, взятых в опыт, почти совпадающими. Их максимум поглощения обнаружен при длине волны 330 нм. Аналитическая концентрация, определенная при соотношении сигнал : фон = 3:1, была принята как возможный предел детекции. Наименьшие концентрации для Глт и оГци, которые могут быть выявлены и определены как предел детектирования (чувствительность метода), были приблизительно 0,020 и 0,028 мкМ соответственно.

Высвобожденке восстановленного гомоцистеина из дисульфид ны\ форм, В практическом отношении было важно, чтобы оба аминотиола Гци и Глт восстанавливались с одинаковым образованием восстановленных форм и, -затем их производных в реакции с ДТНВ. Это достигается инкубацией при температуре ~60°С в течение 10 минут. Концентрации полученных производных при температуре +25°С Глт и Гци были ниже на 50% у Глт на 75% у Гци соответственно, по сравнению с данными, полученными их восстановлением при +60°С.

; ГцчЗЬ'С Гпт 25 "С Гц*«Э'С ГптйО'С

Глт- 25"С I) Гц* 25'С ГпИ5"С Гци 6П"С

Рис. 2. Восстановление окисленных аминотилов Глт 21 мкМ и Гци 20 мкМ в среде \ ,76 мМ ДТТ в течение 10 минут при различных температурах. 1. Водные растворы аминотиолов. 2-4. Ам и мот иолы в 2% растворе альбумина. Данные обработаны как средние значения ± стандартные отклонения (5В), из 4 отдельных экспериментов.

Изучение снизывания гомоцистеина альфа-2-макро глобулином Изучение распределения гомоцистеина в белковых фракциях плазмы крови.

Изучение распределения Гци во фракциях плазмы крови проводили методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом в-ЗОО. Полученные экспериментальные результаты представлены на рис. 3-)

У здоровых доноров Гци может быть связан как с альбуминовыми фракциями в концентрации 0,195=0,030 мкмоль Гц и/г белка, так и с глобулиновыми фракциями с массой больше 200 КД (0,175*0,026 мкмоль Гци/г белка).

У больных с высоким уровнем оГци резко повышено содержание Гци, связанного с крупномолекулярными фракциями и составило 1,6 мкмоль Гци/г белка, что почти в 10 раз больше, чем в плазме крови здоровых доноров.

В плазме крови больных с ГГци значительная часть этого аминотиола связана с крупномолекулярными глобулиновыми фракциями крови, содержащими альфа-2-макроглобулин.

Рис. 3. Распределение Гци (левые столбцы - глобулиновые фракции, правые — альбуминовые) в плазме крови при гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-200. 1.У здоровых доноров, 2. При умеренной ГГци. 3, При промежуточной ГГци.

Изучеиие связывания гомоцистсина очищенными препаратами альфа-2-макроглобулина (МГ)

При активации МГ различными лигандами, включая протеиназы, молекула МГ высвобождает до 4-х свободных тиоловых группировок. Препараты МГ, полученные из плазмы доноров, после очистки содержали больше 2-х тиоловых групп на молекулу МГ. Эти препараты подвергали обработке растворами Гци. Активированный трипсином МГ использовали для анализа тиоловых групп и связывания Гци методом гель-фильтрации. Гци не связывается с крупномолекулярными фракциями неактивированного МГ (Рис. 4 слева). Этот аминотиол может удерживаться за счет дисульфидных связей в активированном трипсином МГ.

: -I.....)

5 7 9 11 13 15 171921 23 25 №фракции

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

3 25

а Ь

я и.

05

04-( -м-

I 3 5 7 9 11 13 5 17192123 25

Рис. 4. Гель-фильтрация на колонке сефадекса в-200 (450x10 мм, рабочий объем VI = 35,6 мл), солюбилизированного альбумином Гци после инкубации с неактивированным (слева) и активированным (справа) трипсином препаратами МГ. Объем отбираемых фракций — 2 мл. Элюент- 0,1 М двузамещенный натрий-фосфатный буфер с рН 7,50. Линия с квадратными маркерами - содержание белка, линия с треугольными маркерами - содержание Гци.

По-видимому, при патологических состояниях,

сопровождающихся активацией протеолитических систем, происходит увеличение доли Гци, транспортируемого в составе активированного МГ. Активированный МГ быстро извлекается из кровотока макрофагами, экспрессирующими рецептор LRP (Lipoprotein-P.elatcd-Protein-receptor). Активированные макрофаги являются носителях«!! этого рецептора и в большом количестве обнаруживаются при развитии процессов атерогенеза.

Исследование эндотоксического действия гомоцисти(е)ина

Прооксидантные эффекты гомоцистенна у пациентов и при состояниях оксидатнвного стресса в опытах с крысами.

Инъекции гомоцистина крысам производили внутримышечно в дозе 200 мкмоль/кг без и в смеси с аргинином (в соотношении 1:1). В процессе эксперимента измеряли динамику изменения концентрации оГци в крови с параллельным контролем динамики ТБК-активных продуктов и свободных тиоловых групп. В крови у крыс наблюдаются четкие зависимости усиления накопления ТБК-активных продуктов при введении препарата Гци по сравнению с контрольной группой (внутримышечно вводили раствор без гомоцистина) и группой интакгных животных. Аргинин, нарастая в плазме, смягчает прооксидантные эффекты Гци, что выявляли, как по уровню ТБК-активных продуктов, так и по концентрации собственно МДА в крови экспериментальных животных (Рис. 5).

У животных, которым вводили раствор Гци, наблюдалось достаточно резкое падение свободных SH- групп (сравнить колонки 2 и 3 на Рис. 6.2), что также смягчалось при введении смеси Гци с аргинином (колонки 3 и 4 на Рис. 6.2, р < 0,05).

ГГци человека приводит к усилению ПОЛ, что продемонстрировано при анализах крови пациентов с коронарным атеросклерозом и различными уровнями оГци в крови (Рис. 6.). У пациентов с коронарным атеросклерозом, при умеренной и промежуточной ГГци, с повышением уровня оГци наблюдали снижение

] 2 Рис. 5. Влияние на содержание МДА (!) и тиолОвых групп (2) в сыворотке крови крыс внутримышечного введения физиологического раствора с 2% альбумина; гомоцистина. приготовленного на 2% растворе альбумина; комбинированного препарата гомоцистина, приготовленного на 2% растворе альбумина и аргинина.

■ т'Ета ; ________' ____.__^

(v* Varl - - г. м 11 р -doxwn V- f.^-fi U .'IlCnUS'i

I 2

Рис. 6. Зависимость между концентрацией свободных тиоловых соединений (R-SH), МДА и концентрацией оГци JtHcy) у пациентов с различными уровнями ГГци.

I. Зависимость R-SH от концентрации оГци. 2. Зависимость МДА от концентрации о Гци,

1Л X

свободных тиоловых групп (г = -0,63; р = 0,003; 11-8Н = 212,3 - 1,65*оГци; Рис. 6.1) и повышение уровня МДА. При тяжелой форме ГГци корреляции с уровнем 8Н-групл не обнаружено. У пациентов с хронической почечной недостаточностью, при умеренной и промежуточной ГГци, уровень МДА имеет положительную корреляцию с уровнем оГци (г = -0,84; р = 0,000003; МДА = -078 + 0,71 *оГци; Рис. 6.2)., что не было обнаружено при тяжелой форме ГГци.

Соотношения общей и восстановленной формы гомоцистеина в образцах плазмы крови больных различных групп было не одинаково. В этих опыта были обследованы пациенты с церебрально-васкулярными нарушениями кровообращения (группа № 1) и хронической почечной недостаточностью (группа № 2).Уровень оГци в первой группе обследованных составил 14,3414,56 мкМ (п = 7), концентрация восстановленной формы Гци составила 2,52+1,05 мкМ. Уровень оГци во второй группе обследованных больных составил 21,15+4,77 мкМ (п = 8), а концентрация восстановленной формы Гци составила 1,25+0,28 мкМ. Содержание оГци в плазме крови второй группы обследованных значительно превышало концентрацию оГци в первой группе (р < 0,05). Следует отметить также, что среднее содержание тиоловых групп в плазме крови пациентов, имевших церебральную форму атеросклероза, достоверно выше (р < 0,05). При изучении взаимосвязи уровня оГци и содержания тиоловых групп в крови пациентов с коронарным атеросклерозом выявлена также отрицательная корреляция этих показателей, что было подтверждено при моделировании оксидативного стресса у крыс.

Наиболее существенные результаты, полученные лично автором.

Показано, что связывание остатков гомоцистеина альбумином моделирует состояние этого аминотиола в крови и позволяет контролировать полноту получения его хромогенных производных в ходе анализа.

При переводе всех форм связанного гомоцистеина в восстановленную форму образуются ТНБ-производные, характеризующиеся таким же светопоглощением при X = 330 нм, что и ТНБ-производные глутатиона, составляющих примерно 1,28 таи/мкМ.

- 19В плазме крови больных с гипергомоцистеинемией значительная часть гомоцистеина, в отличие от гомоцистеина здоровых доноров, связывается с глобулиновыми фракциями крови.

Очищенные препараты альфа-2-макроглобулина после активации трипсином экспрессируют тиоловые группировки и связывают (по данным метода гель-фильтрации) гомоцистеин.

При умеренной и промежуточной формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ) у пациентов с коронарным атеросклерозом наблюдается положительная корреляция между уровнем гомоцистеина и концентрацией малонового диальдегида и ТБК-активных продуктов и отрицательная между уровнем оГци и содержанием тиоловых групп.

В результате модификации метода Katrusiak А. Е., Paterson P. G. разработана высокочувствительная, селективная и воспроизводимая модификация метода анализа оГци в плазме крови человека с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе регистрации продуктов взаимодействия исследуемых аминотиолов и ДТНБ.

Выводы

1. Параметры удерживания хромогенных производных аминотиолов допускают использование колонок с обращенно-фазными сорбентами двух типов модификаций - С8 и С18 для одновременного анализа гомоцистеина и глутатиона.

2. При переводе всех форм связанного гомоцистеина в восстановленную форму образуются ТНБ-производные, характеризующиеся таким же светопоглощением при X = ЗЗОнм, что и ТНБ-производные глутатиона, составляющим 1,28шаи/мкМ.

3. В результате 10 минут инкубации при +60°С наблюдается исчерпывающий и необратимый перевод различных аминотиолов в восстановленное состояние с соответствующим образованием ТНБ-производных.

4. Связывание остатков гомоцистеина альбумином моделирует состояние этого аминотиола в крови и позволяет контролировать полноту получения его хромогенных производных.

5. В плазме крови больных с гипергомоцистеинемией значительная часть гомоцистеина, в отличие от гомоцистеина здоровых доноров, связывается с крупномолекулярными фракциями крови.

6. Очищенные препараты активированного трипсином альфа-2-макро-глобулина, в отличие от неактивированного, связывают гомоцистеин.

-207. Введение аргинина экспериментальным животным в дозе 100 мкмоль/кг смягчает прооксидантные эффекты гомоцистеина, в отношении содержания свободных SH-групп и нарастания уровня МДА.

8. При умеренной и промежуточной формах гипергомоцистеинемии (от 15 до 100 мкМ) у пациентов с коронарным атеросклерозом наблюдается положительная корреляция между уровнем гомоцистеина и концентрацией малонового диальдегида и ТБК-активных продуктов и отрицательная -между уровнем оГци и содержанием тиоловых групп.

9. Предложенная модификация метода пригодна для серийных анализов общего гомоцистеина плазмы крови и его различных форм в диагностической практике и научных исследованиях.

Научно-практические рекомендации При определении оГци е плазме крови пациентов с ГГци необходимо использовать в качестве калибровочных растворов, растворы окисленного Глт и Гци, приготовленные на сывороточном альбумине в качестве матрицы. Солюбилизация Гци альбумином позволяет моделировать образование дисульфидов Гци в крови. Растворы окисленных Глт и Гци, приготовленные на альбумине, рекомендуются в качестве калибровочных при анализе серий образцов плазмы крови при использовании метода в фундаментальной биохимии и практической медицине.

Публикации по теме диссертации

1. Блашко Э.Л. Повышение точности и воспроизводимости анализа общего гомоцистеина плазмы креви у больных с почечной недостаточностью //Нефрология.- СПб.- 2003,- №3, Прилож. .№ 1.- С. 147148.

2. Жлоба A.A., Блашко Э.Л., Шляхто Е.В., Волкова Е.В., Беркович O.A., Беляева О.Д., Баженова Е.А., Ларионова В.И., Козулин В.Ю., Хромова Н.В. Некоторые показатели функционального состояния эндотелия у пациентов с ишемической болезнью сердца с различными генотипами гена метилтетрагидрофолатредуктазы // Неделя здорового сердца и мозга. Сборник тезисов докладов,- СП6.-2003.-С. 145.

3. Жлоба A.A., Блашко Э.Л. Определение общего гомоцистеина в плазме крови методом обращенно-фазной жидкостной хроматографии с использованием колонок С8 и С18// Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. -СПб.-2004.-Т.Х1.-№2,- С. 20-25

4. Блашко Э.Л., Жлоба А.А., Шляхто Е.В. Связывание гомоцистенна высокомолекулярными белками и альфа-2-макроглобулином в плазме крови у пациентов с гипегомоцистеинемией // Неделя здорового сердца и мозга. Бюллетень научно-исследовательского института кардиологии имени Алмазова В.А.-СПб.-2005.-Т.Ш.-№1.-С. 67.

5. Смирнов А.В., Добронравов В.А., Неворотин А.И., Хохлов С.Е., Сиповский В.Г., Барабанова В.В., Чефу С.Г., Жлоба А.А., Блашко Э.Л. Гомоцистеин вызывает повреждение не только клубочкового, но и канального отдела нефрона (Экспериментальное исследование) // Нефрология,- 2005.- СПб.- Т.9.- №3.- С. 81-87.

6. Смирнов А.В., Добронравов В.А., Неворотин А.И., Хохлов С.Е., Сиповский В.Г., Барабанова В.В., Чефу С.Г., Жлоба А.А., Блашко Э.Л. Гипергомоцистеинемия усугубляет повреждение нефорона при экспериментальной хронической почечной недостаточности.// Нефрология,- 2005,- СПб.- Т.9.- №4,- С. 67-74.

7. Смирнов А.В., Добронравов В.А., Голубев Р.В., Панина И.Ю., Жлоба А.А., Блашко ЭЛ., Распространенность гипергомоцистеинемии в зависимости от стадий хронической болезни почек // Нефрология.- 2005.-СПб,- Т.9.- №9,- С.48-52.

8. Смирнов А.В., Добронравов В.А., Жлоба А.А., Голубев Р.В., Блашко Э.Л. Оценки уровня общего и восстановленного гомоцистенна и глутатиона плазмы крови у больных с почечной недостаточностью.// Клинико-лабораторный консилиум.- 2006.- СПб.- №12.- С. 65-67.

9. Zhloba А.А., Blashko E.L. HPLC analysis of total homoysteine (tHcy) in blood plasma.// "100 years of chromatography", 3rd Int. Simposium on Separation in BioSciensies SBS'03.-Moscow- 2003.- P. 141.

10. Zhloba A.A., Blashko E.L. Liquid chromatographic determination of total homocysteine in blood plasma with photometric detection // J. Chromatography B- 2004.- V. 800,- P. 275-280.

11. Blashko E.L., Zhloba A.A., Bercovich O.A., Chromova N.V., Kaminskaya L.U., Shlyakhto E.V. Plasma NO-sintase products value and total homocysteine in postinfarct patients // International Congress "Hypertension - from Korotkov to present days"- Abstracts book - Saint- Petersburg, Russia.- 2005. - P. 148.

Рационализаторские предложения по теме диссертации

1. Способ определения гомоцистенна в плазме крови. Удостоверение на рационализаторское предложение № 1385 от 18.03.2002 г., выданное Санкт-Петербургским государственным медицинским университетом имени академика И. П. Павлова

-22 -

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

Глт - глутатион в свободной восстановленной или окисленной форме, в

том числе в виде смешанного дисульфида

Гци - гомоцистеин в свободной восстановленной или окисленной форме, в том числе в виде смешанного дисульфида

оГци - общий гомоцистеин плазмы крови выявляемый в анализе после

восстановления всех форм Гци

вГци - восстановленный гомоцистеин

ГГци - гипергомоцистеинемия

ДТНБ - 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота), реактив Эллмана

ДТТ - дитиотреитол

МГ - альфа-2-макроглобулин

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТНБ - производные - тионитробензоатные производные

Отпечатано в ООО «АиБ», 190013, Санкт-Петербург, ул. Рузовская, д.9, Заказ № 235. Формат А5, бумага 80гр/кв.м. Тираж 50 экз. Подписано в печать 16.03.2007