Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Многофункциональные магнитоуправляемые нано- и микроагенты и методы их регистрации in vivo для биомедицинских применений

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Многофункциональные магнитоуправляемые нано- и микроагенты и методы их регистрации in vivo для биомедицинских применений"

На правах рукописи

Никитин Максим Петрович

МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫЕ НАНО- И МИКРОАГЕНТЫ И МЕТОДЫ ИХ РЕГИСТРАЦИИ IN VIVO ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИМЕНЕНИЙ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

г 8 НОЯ 2013

005541325

Москва, 2013

005541325

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, член-корр. РАН Деев Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор, Биологический факультет Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова"

Шайтан Константин Вольдемарович

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории конформационного полиморфизма белков в норме и патологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Чехов Владимир Олегович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится .2013 г. в ?(?мин. на заседании диссертационного совета Д002.235.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН Автореферат разослан « ¡Я ИСЛ^и* 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ^ ^рицын

им.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последнее время наблюдается неуклонный рост использования нанотехнологий в биологии и медицине. Наночастицы представляют большой интерес для медицины XXI века из-за принципиально новых возможностей по сравнению с существующими лекарствами в молекулярной форме. Особый интерес вызывает применение различных наночастиц для лечения и диагностики таких заболеваний, как рак, инсульт, атеросклероз, а также инфекционных заболеваний. На данный момент существует большое разнообразие наночастиц, обладающих различными полезными физико-химическими свойствами: полимерные, золотые и магнитные частицы (МЧ), квантовые точки (КТ), наноалмазы и многие другие. В то время как некоторые наночастицы уже допущены для введения человеку в диагностических целях, а другие проходят клинические испытания, большая часть разработанных наночастиц еще только изучается в научных лабораториях: разрабатываются как новые подходы синтеза, так и новые применения in vitro (методы иммуноанализа, магнитная сортировка клеток) и in vivo (визуализация опухолей, направленная доставка лекарств и т.п.). Большинство применений in vitro, например иммуноанализ, требуют «узкоспециализированных частиц», оптимизированных по таким параметрам, как размер, максимальный специфический и минимальный неспецифический сигналы и т.п. Применения in vivo, наоборот, требуют, в первую очередь, расширенной функциональности частиц, например, одновременной способности к диагностике заболевания и его терапии. Так, например, для лечения онкозаболеваний были бы полезны частицы, способные одновременно подтвердить злокачественную природу опухоли (за счет иммунохимии), визуализировать распространение опухоли (за счет, например, флуоресцентного сигнала) и убить раковые клетки (за счет токсичных веществ, нагрева и т.п.). Разработка методов получения многофункциональных структур, содержащих в себе различные вышеперечисленные наночастицы, является важной задачей биомедицины.

Не менее важной является задача изучения поведения созданных нано- и микроагентов in vivo. Для создания эффективных препаратов требуется оптимизировать не только функционал структур, но и их фармакокинетические свойства - время циркуляции в кровотоке, распределение по органам, а также сделать их наименее токсичными и либо деградируемыми до безопасных молекулярных веществ, либо максимально инертными. Поэтому создание надежных методов детекции агентов и методов, позволяющих отслеживать их биотрансформацию и поведение после введения, является одной из актуальнейших проблем тераностического использования наночастиц.

Цель работы - разработка многофункциональных магнитоуправляемых нано- и микроструктур, а также разработка новых методов для всестороннего изучения поведения таких структур ш vivo, в частности, для определения фармакокинетических параметров, например, времени циркуляции структур в крови, для количественного изучения распределения в органах, а также для определения путей биодеградации структур и их компонентов в тканях.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- разработать метод самосборки многофункциональных структур на основе магнитных нано- и микрочастиц и молекулярного интерфейса барназа-барстар;

- разработать метод детекции магнитных частиц ex vivo и in vivo в организме экспериментальных животных: в кровотоке и в органах;

- синтезировать оптимальные магнитные метки для высокочувствительной регистрации разработанным методом;

- разработать методы изучения фармакокинетических характеристик наночастиц, таких как время выведения из кровотока, распределения в органах и процессов биодеградации частиц.

Научная новизна

Впервые предложен метод получения многофункциональных нано- и микро-суперструктур путем самосборки функциональных агентов различной природы с помощью белок-белковых взаимодействий, а именно, с помощью молекулярного адаптера барназа-барстар. Впервые продемонстрировано, что системы нековалентной самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы - конъюгаты коллоидных частиц с белками, могут быть необычно стабильными и выдерживать экстремальные для молекулярных белков денатурирующие условия. Впервые в данной работе был предложен и разработан высокочувствительный метод количественной детекции магнитных частиц как нелинейных магнитных материалов при комнатной температуре в реальном времени в экспериментальных животных. Впервые предложен метод исследования процессов деградации in vivo магнитных наночастиц до ферритино-подобного железа с помощью мёссбауэровской спектроскопии.

Практическая значимость работы

Разработанная методика получения многофункциональных нано- и микроконструкций в сочетании с уникальным по чувствительности методом их детекции в живых организмах перспективна для исследований в области диагностики и терапии различных заболеваний на ранних стадиях, например, для

обнаружения раковых опухолей внешним зондом по скоплению магнитных структур, несущих специфические антитела к онкомаркерам. Предложенный метод белок-опосредованной самосборки сверхпрочных многофункцональных структур может быть использован для создания тераностических агентов с переменным составом и функционалом для целей персонализированной медицины. Разработанный метод мониторинга структур на основе магнитных маркеров в тканях организма и непосредственно в токе крови может успешно заменить диагностические методы на основе радиоактивности. Кроме того, разработанный метод регистрации МЧ позволяет эффективно контролировать и выбирать оптимальные нано- и микроагенты для управляемой доставки лекарственных препаратов, гипертермии опухолей и т.д. Кроме того, метод, являясь принципиально новым физическим методом изучения поведения нано- и микрочастиц в организме, может быть использован для получения новой информации касательно фармакокинетики частиц, их токсичности и т.п.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 9th International Conference on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, США 2012; IV Международный форум по нанотехнологиям, Россия, 2011; EMBO Conference on Biological Surfaces and Interfaces, Испания, 2011; Конференция «Нанотехнологии в онкологии», Россия, 2010; Пленум научного совета по биологической физике: биофизика и нанотехнологии. Проблемы и перспективы, Россия, 2010; 8th International Conference on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, Германия, 2010; Конгресс «Биотехнология -состояние и перспективы развития», Россия, 2009; Международный Форум по Нанотехнологиям, Россия, 2008; Конференция «Нанотехнологии в онкологии 2008», Россия, 2008; Nanomedicine and Drug Delivery Symposium, США, 2007.

Публикации. По материалам работы опубликовано 11 статей в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, 1 патент РФ и 8 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, одной главы литературного обзора, четырех глав описания экспериментов, заключения и списка литературы из 150 наименований, изложена на 139 страницах машинописного текста, и содержит 79 рисунков, 3 таблицы.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода белок-опосредованной самосборки

магнитоуправляемых многофункциональных структур при помощи молекулярного адаптера барназа-барстар

Принцип самосборки и самоорганизации в микро- и наномасштабах привлекает внимание исследователей в различных областях науки, от коллоидной и супрамолекулярной химии и наук о материалах до молекулярной биологии. Возможность манипулирования веществом на таком уровне позволяет создавать материалы с новыми свойствами, не достижимыми с помощью традиционных подходов химического синтеза или методов «сверху вниз» (фотолитография и др.). В частности, самосборка может быть использована для получения мультифункциональных структур из коллоидных частиц различной природы за счет специфических взаимодействий между ними. При этом движущей силой процесса часто является броуновское движение частиц, а «связывающая сила» во многом определяется поверхностными свойствами частиц. Задача исследователя заключается в подборе такой поверхностной функционализации частиц, чтобы их сборка происходила в желаемом направлении и приводила к образованию нужных структур из множества возможных.

Одним из перспективных способов такой модификации частиц является использование «молекулярного клея» из различных биомолекул, обладающих сродством друг к другу (специфически распознающих друг друга). Будучи прикрепленными к поверхности разных частиц, такие молекулы способны опосредовать заранее запрограммированную сборку частиц. В качестве таких молекул в литературе широко обсуждаются комплементарные олигонуклеотиды, пары антитело-антиген, стрептавидин-биотин и др. В данной работе описывается система «наноконструктора», основанная на белок-белковых взаимодействиях, а именно, на специфическом взаимодействии между двумя бактериальными белками, рибонуклеазой барназой и ее природным ингибитором барстаром из Bacillus amyloliquefaciens. Барназа и барстар характеризуются чрезвычайно быстрой кинетикой (k<,n ~ 108 M"V) и высокой аффинностью (Ка~ 1014 М"1), а также высокой индивидуальной стабильностью в широком диапазоне pH и температуры.

1.1. Бифункциональные частицы: одновременно магнитные и флуоресцентные

Принцип наноконструктора был использован для объединения в единую суперструктуру различных магнитных (МЧ) и флуоресцентных (ФЧ) частиц. В качестве ядра структуры были выбраны магнитные частицы, конъюгированные с

барназой [МЧ-Бн]. Для простоты наблюдения структур с помощью оптического микроскопа были использованы частицы от 500 нм до 3 мкм. В качестве второго модуля были использованы конъюгаты квантовых точек с барстаром [КТ-Бс] (созданные ранее в нашей лаборатории) или конъюгированные с барстаром различные полистирольные флуоресцентные частицы размером от 50 до 200 нм. После ковалентного конъюгирования частиц с белками при помощи карбодиимидного метода магнитные и флуоресцентные модули смешивались в определенных пропорциях при комнатной температуре. Затем собранные суперструктуры отмывали с помощью магнитной сепарации от несвязавшихся флуоресцентных модулей. Кроме того, была проведена серия контрольных экспериментов, в которых: 1) МЧ была конъюгирована с бычьим сывороточным альбумином [МЧ-БСА] вместо барназы, 2) белки на частицах ингибировались свободным комплементарным белком перед смешением модулей.

Для достижения оптимальных условий самосборки было важно обеспечить максимально возможную плотность покрытия поверхности частиц активными (т.е. способными к связыванию с партнером) белками. Кроме того, важно придать исходным конъюгатам достаточно высокую коллоидную стабильность, подразумевающую их седиментативную и агрегативную устойчивость. С этой целью в работе был использован гидрофильный полимер полиэтиленгликоль (его производные амино-ПЭГ-карбокси, 3 и 10 кДа) как линкер между молекулами барназы и поверхностью МЧ. Наличие линкера позволяет перейти от «одноточечного» режима связывания на интерфейсе МЧ и ФЧ к «многоточечному», благодаря удалению молекул барназы от поверхности МЧ и, соответственно, возможности образования многочисленных пар барназа-барстар между частицами в составе сборки. Общая идея многоточечное™ контактов на интерфейсе МЧ - ФЧ иллюстрируется рисунком 1.

Рисунок 1. Идея мультиточечности контактов на интефейсе МЧ - ФЧ. (А) - Множественные пары барназа (показана в виде оранжевых чашеобразных структур) - барстар (зеленые объемные стрелки) на интерфейсе частиц (серая - МЧ, красная - ФЧ). (В) - общий схематический вид одной собранной структуры. (С) - Микрофотография настоящей сборки, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Флуоресцентная частица

Барстар

Барназа

Крупным планом схематически изображены множественные пары барназа-барстар, которые удерживают частицы в сборке (рисунок \А), общий вид собранной структуры (рисунок 15), а также реальная СЭМ-микрофотография сборки из [МЧ 3.3 мкм-ПЭГ 3 кДа-Бн] и [ФЧ 200 нм-Бс] (рисунок 1С).

На рисунке 2 представлены репрезентативные фотографии собранных структур, полученные с помощью оптического эпифлуоресцентного микроскопа. При подготовке образца частицы осаждались с помощью магнита на предметном стекле так, что можно легко соотнести фотографии, сделанные в светлом поле (рисунок 2А,Б, С), с соответствующими флуоресцентными (рисунок 2В,Е,Н).

«ъ ° о ° 9 8 ' ЦЖ, ® о ЛО & „ 00® ® °о о . «9<Ч» ° с * се <Ъ && О О 0 о в в о 9 «р в д • « ■ШЯШШе $

Рисунок 2. Барназа и барстар как эффективный «молекулярный клей». На рисунке представлены репрезентативные фотографии собранных с помощью барназы и барстара структур, полученные с использованием оптического флуоресцентного и сканирующего электронного микроскопов. (А) Светлопольное изображение 3.3-мкм МЧ, конъюгированных через ПЭГ 10 кДа с барназой и собранных со 110-нм ФЧ с барстаром на поверхности. (В) Те же частицы при возбуждении флуоресценции ФЧ. (С) СЭМ микрофотография структур такого же состава (крупным планом). (О) Светлопольное изображение общего вида структур, собранных из конъюгатов [МЧ 3.3 мкм-ПЭГ 3 кДа-Бн] и [ФЧ 200 нм-Бс]. (Е) Те же структуры при возбуждении флуоресценции 200 нм ФЧ. (Б) СЭМ микрофотография структур, изображенных на (Б, Е). (О, Н) Одна из структур, изображенных, соответственно, на (Б, Е), крупным планом. (I) СЭМ микрофотография структуры того же состава, что в (в, Н), крупным планом. Шкала - 10 мкм (А, В, Э, Е, С, Н) и 1 мкм (С, Б, I).

1.2. Трифункциональные частицы (магнитные, флуоресцентные, противораково-направленные) в качестве диагностического агента

Тот же общий подход был задействован для сборки более сложных суперструктур с использованием большего количества различных модулей. В качестве другого примера мы собрали трифункциональные суперструктуры,

добавив третий противоопухолевый модуль на основе антитела. Такие структуры могут быть использованы для узнавания (с помощью антитела), мечения (квантовой точкой) и для разрушения (нагреванием магнитной частицы переменным магнитным полем) раковых клеток. Бифункциональный белок антитело-барназа-антитело (модуль [антитело-барназа]), разработанный в нашей лаборатории, был выбран в качестве третьего антитело-направленного модуля. В данном белке домен антитела представлен мини-антителом 4Б5, распознающим рецептор НЕЯ2/пеи (рецептор эпидермального фактора роста).

Трифункциональные структуры были собраны из бифункциональных частиц, описанных выше, путем связывания дополнительного слоя модуля [антитело-барназа], как показано на схеме справа. Полученные структуры состоят из ядра, представляющего собой модуль [МЧ-барназа] размером 1 мкм, затем слоя модулей [КТ-барстар] толщиной приблизительно 10 нм, и наконец, модуля [антитело-барназа] - еще 4 нм.

1.3. Демонстрация трифункциональности полученных комплексов

Для подтверждения многофункциональности полученных суперструктур был предложен следующий эксперимент. На сильный неодимовый дисковый магнит (диаметром 3 см) был помещен макет латинских букв «МБ» (Ми1й-Рипсиопа1 - мультифункциональный англ.) размером 3 мм в ширину, сделанный из тонкой ферромагнитной фольги. Поверх фольги было положено покровное стекло толщиной 100 мкм. В такой системе создается сильное магнитное поле, притягивающее магнитные частицы к краям фольги, т.е. к контуру букв «МБ».

В качестве биологической цели для структур использовались адгезивные клетки аденокарциномы яичника БКОУ-З, которые гиперэкспрессируют рецептор НЕК2/пеи на мембране. Мы добавили суспензию трифункциональных суперструктур к клеткам, прикрепленным ко дну чашки Петри. После инкубации клетки были отмыты от несвязавшихся структур. Затем клетки 8КОУ-3, меченные трифункциональными структурами, были ресуспендированы раствором Версена. После этого капля суспензии клеток была нанесена на покровное стекло, находящееся над ферромагнитной фольгой, как показано на рисунке За,Ь. Через 5 мин распределение клеток на покровном стекле было изучено с помощью флуоресцентного микроскопа. На рисунке 3с,е показаны фотографии, полученные без возбуждения КТ, на рисунке Зс// - с возбуждением. Ясно видно, что раковые клетки преимущественно располагаются в областях сильного магнитного поля, образующего контур букв «МР». Это подтверждает, что МЧ в суперструктурах действительно направили меченные клетки к источнику магнитного поля. Рисунок 3с/ наглядно демонстрирует содержание в структурах КТ, благодаря которым формируется высококонтрастное флуоресцентное изображение распределенных

клеток. Следовательно, этот эксперимент подтверждает одновременную трифункциональность супер структур: флуоресцентность, обладание суперпарамагнитными свойствами и способностью связываться с раковыми клетками посредством антитела.

а

; ¥ ЙЙр£№ A — e W" :" ■

• i _ * f r-

Magnet

Рисунок 3. «Рисование» контура букв «МР» с помощью магнитного поля клетками, меченными трифункциональными структурами: (а) капля суспензии клеток рака яичников (8КОУ-3), меченных собранными трифункциональными структурами, наносится на покровное стекло, расположенное над ферромагнитной фольгой; (Ь) Магнитное поле намагничивает фольгу так, что создается градиент магнитного поля, который стягивает клетки, меченные магнитными структурами, к контуру букв "МР"; (с) фотография образца в видимом свете без возбуждения квантовых точек; (с!) - с возбуждением. Вставка фотографии (с) показывает -30 клеток в поле зрения; - фотография 3 индивидуальных клеток, меченных трифункциональными

структурами. Шкалы: (с,с!) - 1мм, врезка (с), (е,0 - 50 мкм.

Результаты исследования взаимодействия структур с клетками более высокого разрешения представлены на рисунке Зе/, на котором видны как индивидуальные структуры, так и кластеризация суперструктур на поверхности индивидуальных клеток из-за антитело-опосредственного взаимодействия. Легко заметить, что расположение ярких флуоресцентных точек хорошо совпадает с расположением магнитных частиц (черных точек), входящих в состав трифункциональных структур.

2. Сверхпрочные самоорганизованные структуры, стабильные в экстремальных денатурирующих условиях

Учитывая высокую стабильность барназы и барстара и «прочность» их молекулярного комплекса, в настоящей работе была поставлена цель изучить стабильность коллоидных конструкций, собранных с помощью этой белковой системы (СББ - система барназа-барстар), в экстремальных условиях, приводящих, как правило, к денатурации большинства про- и эукариотических белков. Для проверки «предела прочности» описываемой системы самосборки частиц использовались такие условия, как высокая температура, низкие значения рН, а также высокие концентрации денатурирующих агентов и высокая ионная сила. На основании проведенных экспериментов можно заключить, что полученные структуры обладают необычной стабильностью и выдерживают условия, существенно отличные от физиологических. Более того, в данной работе проводится сравнение системы самосборки, основанной на СББ, с другими хорошо известными системами, основанными на взаимодействиях типа «белок-белок» или «белок-малый лиганд», а именно: 1) стрептавидин • биотин (конъюгированный с мышиными IgG) - далее Ств-био; 2) кроличьи анти-козьи IgG • козьи анти-биотиновые IgG - далее RAG-GAb, от англ. rabbit anti-goat IgG • goat anti-biotin IgG); 3) козьи анти-биотиновые IgG • биотин (конъюгированный с мышиными IgG) - далее GAb-bioIgG; 4) белок А • кроличьи анти-козьи IgG. Магнитные частицы были сконъюгированы через 3-кДа ПЭГ-линкер с барназой, стрептавидином, козьими анти-биотиновыми IgG или белком А; флуоресцентные 200-нм частицы — с барстаром, биотинилированными мышиными IgG или кроличьими анти-козьими IgG. При выборе функциональных компонентов систем самосборки мы руководствовались соображениями удобства их сравнения между собой. В частности, каждый из использованных флуоресцентных модулей, кроме конъюгатов с барстаром, участвует в двух различных системах самосборки (см. выше). Таким образом, возможно более объективное сравнение этих систем в отличие от случая, когда они никак не связаны между собой (не имеют никаких общих компонентов). Эти системы сравнивались в отношении устойчивости предварительно собранных с их помощью коллоидных структур к разрушению в денатурирующих условиях, а также в отношении способности исходных конъюгатов белок-частица к сборке в экстремальных условиях. В то время, как в первом случае тестируемые системы демонстрируют относительно сходное поведение, их характеристики во втором случае различаются существенно.

2.1. Самосборка в экстремальных условиях

2.1.1. Влияние низких рН

Из литературы известно, что для свободных белков барназа и барстар рН < 4,0-4,5 практически полностью ингибирует формирование молекулярного комплекса. Даже при этих условиях (рН 4,0-5,0) наблюдалось образование флуоресцирующих МЧ с такой же эффективностью, как в фосфатно-солевом буфере (PBS). Рисунок 4 иллюстрирует рН-зависимость эффективности самосборки для всех пяти тестируемых систем.

Барназа - Барстар

рН2.0 рНЗ.О рН4.0 рН 5.0 рН 7.4.

Кроличьи антикозьи IgG - Козьи IgG

PH2.0 рНЗ.О рН4.0 рН 5.0 1 рН 7.4

Стрептавидин - Биотин *

рН 2.0 рНЗ.О рН 4.0 рН 5.0 рН7.4

Белок А - Кроличьи IgG

рН 2.0 рН 3.0 рН4.0 рН 5.0 рН 7.4

Рисунок 4. рН-зависимость эффективности самосборки (рН 2,0 - рН 7,4). Среднее значение и стандартное отклонение приведены по 25 частицам из соответствующих флуоресцентных фотографий. По оси ординат отложена средняя нормированная

(относительно сборки в PBS) интенсивность флуоресценции собранных структур.

2.1.2. Хаотропные агенты: мочевина и гуанидин гидрохлорид (Сс1тНС1)

Несмотря на хорошо известный белок-денатурирующий эффект мочевины, во

всем изученном диапазоне концентраций (1-8 М) не наблюдалось заметного влияния этого денатуранта на эффективность самосборки в СББ. Можно предположить, что при высоких концентрациях мочевины наблюдаемая структура собранных МЧ-ФЧ конструкций обусловлена, по крайне мере, частично, неспецифическими взаимодействиями между денатурированными белками на поверхности частиц. Действительно, мы наблюдали слабую неспецифическую агрегацию МЧ, конъюгированных с БСА, с 110-нм ФЧ, конъюгированными с барстаром, при высоких концентрациях мочевины, но не в случае 1ЧаС1 и ОётНО - по-видимому, эти денатуранты сильно подавляют любые, в том числе, неспецифические, взаимодействия между конъюгатами. Сходное с СББ поведение наблюдается в случае систем Ств-био и белок А - кроличьи которые также оказались такими же устойчивыми к действию мочевины. Напротив, системы САЬ-Ыо^С и ЯАСНОАЬ демонстрируют существенно сниженную способность к самосборке в данных условиях.

В соответствии с данными о сравнительной денатурирующей способности мочевины и вс1тНС1, последний оказался более эффективным в подавлении сборки исходных конъюгатов. Однако, и при таких высоких концентрациях, как 6-8 М, все же наблюдается «сборка» (или агрегация) частиц, функционализированных стрептавидином и биотинилированным но сборка

всех остальных систем сильно подавлена.

2.1.3. Высокая ионная сила (ЫаС1)

ЫаС1 при высоких концентрациях (т.е. при повышенной ионной силе) представляется наиболее мощным ингибирующим агентом, препятствующим процессу самосборки всех систем, в том числе, Ств-био.

2.1.4. Влияние добавления свободных белков в системе при самосборке

Принимая во внимание экстремальность рассматриваемых условий, возникает вопрос, опосредована ли самосборка специфическим взаимодействием участвующих белков. Для тестирования специфичности в работе была проведена серия дополнительных экспериментов по самосборке конструкций в экстремальных условиях и в присутствии других (ингибирующих и «инертных») белков. В то время как для всех условий и систем добавление свободных ингибирующих белков приводило к прекращению самосборки, добавление бычьего сывороточного альбумина как ослабляло сборку в некоторых условиях, так и усиливало ее. Кроме того, например, для 5М ЫаС1 добавление БСА кардинально меняло картину - почти для всех систем структуры собирались почти

так же эффективно, как в PBS, в то время как без БСА сборка была существенно подавлена.

2.2. Стабильность предварительно собранных структур в экстремальных условиях

2.2.1. Изучение влияния наиболее жестких денатурирующих условий

Во второй серии экспериментов, структуры, предварительно собранные в оптимальных условиях, изучались в отношении их устойчивости и резистентности к разрушению в возрастающих концентрациях мочевины, GdmHCl и NaCl, как описано выше; при нагревании водных суспензий вплоть до 80 °С и при инкубации в кислых буферах с рН 2,9 до 1,5 (с шагом 0,7 единиц рН) в течение продолжительного времени (до двух недель и более).

Для СББ влияние денатурантов мочевины и GdmHCl, а также высокой ионной силы на сохранность «сборок» существенно менее выражено по сравнению с их действием на процесс самосборки (см. рисунок 5). Таким образом, если сборка произошла (в оптимальных условиях), то значительно труднее ее разрушить, чем препятствовать формированию соответствующих структур из исходных компонентов, хотя последнее тоже требует экстремальных условий.

5 М NaCl

100 300

-Барназа - Барстар

-Стрептаеидин - Биотин

-Козьи антибиотиновые IgG - Биотин

рН 1.5

100 300

-Кроличьи анти-козьи IgG - Козьи IgG -Белок А - Кроличьи IgG

Рисунок 5. Влияние экстремальных условий на «разборку» пяти систем в наиболее жестких условиях (указаны на рисунке) структур, предварительно собранных в оптимальных условиях. По оси ординат отложена нормированная средняя (относительно значению сборки в PBS) интенсивность флуоресценции структур.

Сравнение СББ с другими системами самосборки показывает, что, кроме GAb • bioIgG, остальные системы демонстрируют примечательно сходное поведение, в пределах ошибки эксперимента, в отношении устойчивости предварительно собранных структур к разрушению в изучаемых экстремальных условиях (рисунок 5). В частности, сборки, в основном, сохраняют свою целостность в белок-денатурирующих условиях в течение продолжительного времени (по крайней мере, до двух недель).

2.2.2. Температурная устойчивость собранных структур

Одним из наиболее изученных видов денатурации белков является тепловая денатурация, поэтому естественно было исследовать влияние высоких температур на целостность собранных структур. В целом, системы самосборки ведут себя сходно, демонстрируя высокую устойчивость к разрушению при крайне высоких (вплоть до 80 °С) температурах в течение достаточно продолжительного времени (2 ч).

Возможное объяснение наблюдаемой стабильности собранных структур заключается в том, что белки, конъюгированные с частицами, денатурируют в тестируемых условиях. Однако, находясь в пространственной близости друг к другу в составе комплекса, они могут взаимодействовать развернутыми гидрофобными участками, таким образом сохраняя общий внешний вид сборок. Более того, кроме неспецифических взаимодействий между денатурированными белками, непосредственные гидрофобные взаимодействия между полистирольными частицами также могут вносить вклад в наблюдаемую исключительную стабильность сборок. Важно, что системы самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы - конъюгаты коллоидных частиц с белками, могут быть существенно более стабильными и устойчивыми к денатурирующим условиям, чем те же белки, взятые как молекулярные объекты. В то же время, необходимо учитывать, что представленные данные относятся к конкретной системе полистирольных нано- и микрочастиц, использованных в настоящей работе.

3. Разработка новых методов регистрации нано- и микроагентов in vivo. Изучение поведения нано и микрочастиц в экспериментальных животных

3.1 Разработка метода детекции магнитных агентов для биомедицинских применений и синтез оптимальных магнитных меток

Несмотря на большое количество работ, посвященных созданию наноагентов для биомедицинских применений, на данный момент мало известно об их поведении in vivo. Количество методов, позволяющих изучать

фармакокинетические свойства наночастиц, весьма ограничено. Визуализация наночастиц с помощью оптических или электронных микроскопов может быть применена для изучения поведения наночастиц на микроуровне, например для изучения процессов интернализации наночастиц в клетки. Однако такие методы не эффективны для получения информации об интегральном содержании частиц в объемном образце. Кроме того, такие визуализирующие методики, как магнитнорезонансная томография, как правило, используются лишь для получения качественной картины поведения наночастиц. Получение же количественной информации чрезвычайно трудоемко и реально не позволяет проводить подробное изучение фармакокинетики частиц in vivo. Другие, более сложные методы, такие как томография с радиоактивными изотопами, требуют соблюдения многочисленных мер предосторожности, и на практике область их применения весьма ограничена.

На данный момент возникла острая необходимость в новых удобных количественных методах регистрации наночастиц in vivo и в подробных количественных исследованиях зависимости фармакокинетических параметров наночастиц от их различных характеристик, таких как размер, биохимические свойства покрытия, форма и т.п. Наибольший интерес и насущную необходимость представляет выявление фундаментальных закономерностей, связывающих физико-химическими параметры наночастиц с такими факторами, как скорость выведения агентов из кровотока, биораспределение, биотрансформация, возможность биодеградации, выведение наночастиц из отдельных органов и всего организма.

В данной работе предложен новый метод высокочувствительного неинвазивного количественного детектирования в реальном времени магнитных наночастиц (как модельных агентов) непосредственно в тканях и кровотоке живого организма на основе принципа регистрации магнитных частиц как нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах и использование данного метода для получения фундаментальных зависимостей фармакокинетических параметров наноагентов от их свойств и способов введения. В экспериментах использовался прототип биосенсорного устройства «БиоМаг». Прибор ранее был успешно применен для детекции магнитных меток в различных системах для иммуноанализа. «БиоМаг» позволяет высокочувствительно регистрировать изменения относительной магнитной проницаемости вплоть до 10~8 при комнатной температуре. Таким образом, он позволяет количественно регистрировать МЧ в некотором объеме или в проточной системе, которая проходит через измерительную систему прибора. Метод детекции МЧ основан на их нелинейных магнитных свойствах. Образец помещается в переменное магнитное поле, которое генерируется на двух частотах f|~100 кГц и f2~100 Гц с разными амплитудами 10 и 200 эрстед, соответственно. Отклик образца

измеряется на комбинаторных частотах, например, на частоте f = f|±2 f2. Сигнал прибора линейно зависит от количества магнитного материала в образце в большом динамическом диапазоне около 5 порядков. Предел детектирования прибора - это единицы нанограмм Fe304 частиц.

3.1.1 Инвазивные измерения in vivo в реальном времени

Экспериментальный образец магнетометра был использован для измерения in vivo в реальном времени абсорбирования из крови МЧ тканями различных органов крысы. Поток крови живой крысы через катетер дважды проходил через прибор, который непрерывно измерял концентрацию МЧ с интервалом 1,8 сек. Фотография соответствующей установки показана на рисунке 6. В кровеносную систему крысы были сделаны три инъекции МЧ с 20-минутными интервалами. Сигнал с магнетометра представлен на рисунке 6. Динамика изменения концентрации МЧ также была проверена независимым путем дискретных измерений МЧ в крови, отобранной спустя определенный период после 5-, 10- и 15-мг инъекций в левую бедренную артерию крыс, не затронутую катетером. Пробы крови отбирались с временными интервалами от 1 до 60 мин из правой бедренной артерии для количественного измерения МЧ. Эти измерения подтвердили динамику, наблюдаемую в экспериментах в реальном времени.

Рисунок 6. Фотография установки для экспериментов in vivo (слева) и сигнал с макета магнетометра при инъекции МЧ в кровь в экспериментах in vivo (справа).

3.1.2. Сравнение с методом регистрации на основе радиоактивных меток

Было проведено сравнение предложенного метода с методом радиоактивного детектирования. Поскольку радиоактивный метод не позволяет проводить измерения в реальном времени в потоке крови, выполнялись только дискретные измерения с использованием специально синтезированных МЧ, полученных с использованием изотопа 59Fe. Было проведено качественное сравнение обоих

методов. Доза в 5 мг таких радиоактивных МЧ вводилась в левую бедренную артерию крысы. Пробы крови отбирались сразу после инъекции и спустя 1,5, 10, 20, 30, 40, и 50 минут из правой бедренной артерии. После этого готовились образцы из органов крысы. Концентрация МЧ в крови и образцах органов измерялась по уровню у-радиации и с использованием экспериментального образца магнетометра. Для обоих типов измерений использовались разные образцы, но приготовленные из тканей тех же органов.

Оба метода показали хорошую корреляцию для проб крови, взятых после инъекции и спустя 1 и 5 мин, как показано на рисунке 7. Для проб крови, взятых спустя 5 мин, оба метода давали очень низкий уровень сигнала на уровне шума. Эксперименты показали, что пороги чувствительности радиоактивного и предложенного магнитного методов одинаковы.

Затем с помощью обоих методов было изучено распределение МЧ по органам крысы. Для измерений органы гомогенизировали. Распределение МЧ (на грамм соответствующей ткани) для обоих методов показано на рисунке 7. Поскольку МЧ в крови практически отсутствовали, сигналы соответствуют количеству МЧ в тканях органов. Отклонение сигнала с различных образцов одного и того же органа составляет около 20%. Это, в основном, объясняется механической гомогенизацией органов. Однако, в пределах отклонения результаты обоих методов хорошо коррелируют.

Магнитный сигнал, отн. ед.

Магнитный сигнал, отн. ед.

^—1—ь=

1, мин.

Почки Печень Сердце

Легкие Селезенка Мозг

Рис. 7. Сравнение сигналов при использовании предложенного метода (красный график) и метода на основе радиоактивных меток (синий график). Слева - динамика содержания частиц в кровотоке. Справа - распределение частиц в органах.

3.1.3. Синтез оптимальных магнитных меток

В данной работе был также разработан протокол синтеза (методом щелочного

соосаждения солей железа) магнитных маркеров, оптимизированных для данного

метода детекции по чувствительности детекции. Рекордная чувствительность

составила 1 нг магнитных частиц, покрытых полимерной полиэтилениминовой

оболочкой. Кроме того, созданы коллоидно-стабильные магнитные частицы

18

различных размеров и поверхностных свойств для разнообразных биохимических применений.

3.2 Разработка метода исследования поведения магнитных агентов в кровотоке животных in vivo в реальном времени

Нами был предложен неивазивный метод изучения в реальном времени выведения МЧ из кровотока экспериментальных животных. Для этого хвост мыши помещали в катушку детектора и фиксировали (рисунок 8), а затем ретроорбитально вводили магнитные наночастицы. Наличие в хвосте мыши сравнительно крупных вен и артерий позволяет измерять динамику содержания частиц в кровотоке с хорошей точностью и надежностью. Оказалось, что в определённом диапазоне концентраций при использовании низкодисперсных частиц динамика концентрации МЧ в кровотоке очень точно аппроксимируется экспоненциальной зависимостью (рисунок 8). За счёт неинвазивности метода достигается высокое временное разрешение до 3 сек, позволяющее детально исследовать изменения концентрации, которые ранее было невозможно детектировать такими методами, как радиоактивное мечение МЧ или ЯМР проб крови.

Рисунок 8. Неинвазивное измерение содержания магнитных наночастиц в кровотоке мыши. Схема (слева) и детектируемый магнитный сигнал (справа).

Сравнивая полученные таким образом времена полувыведения в случаях динамик, хорошо аппроксимируемых моноэкспоненциальной функцией, оказалось возможно охарактеризовать различные типы частиц и сравнивать по одному параметру полные динамики в кровотоке. Было проведено масштабное исследование влияния на время выведения частиц из кровотока различных факторов, таких как размер, покрытие и количество частиц, анестезирование животного и др.

3.3 Разработка неинвазивного метода исследования распределения магнитных агентов по органам экспериментальных животных. Магнитометрическое исследование процессов биодеградации магнитных агентов в организме экспериментальных животных

Важной задачей нанобиомедицины является изучение биораспределения лекарственных агентов в органах, а также исследование выведения таких агентов из организма. Процессы биораспределения, биотрансформации и деградации наночастиц напрямую связаны с возможными побочными действиями агентов, в частности, с их токсичностью. Для исследования данных процессов на примере магнитных наночастиц нами был разработан метод детекции магнитных материалов в органах экспериментальных животных in vivo с помощью мобильного измерительного зонда, представляющего собой систему концентрических катушек индуктивности: внешний диаметр большой катушки детектора 62 мм, внешний диаметр меньшей катушки 35 мм, а внутренний - 20 мм. Была разработана методика неинвазивного измерения содержания МЧ в органах крыс. Оказалось, что пространственного разрешения созданной системы достаточно для получения информации о биораспределении частиц по органам крыс, хорошо коррелирующей с данными ex vivo измерений содержания частиц в органах тех же животных.

Предложенная неинвазивная измерительная методика была использована для долговременного изучения биодеградации магнитных частиц в органах мышей. В экспериментах были использованы мыши линии Balb/c, которым ретроорбитально вводили частицы различной природы со средними размерами в диапазоне от 35 до 100 нм. После инъекции в различное время было магнитометрически измерено эффективное содержание МЧ в органах, преимущественно в печени и селезенке, как показано на рисунке 9 (в каждой временной точке регистрировали максимально детектируемый сигнал). Оказалось, что полученные зависимости деградации МЧ также аппроксимируются моноэкспоненциальной функцией с высокой точностью (рисунок 9).

Рисунок 9. Измерение содержания магнитных наночастиц в органах мыши. Слева - схема измерения, справа - динамика содержания магнитных наночастиц в зоне измерения мыши с течением времени после введения 200 мкг 50 нм частиц с глюкуроновой полимерной матрицей. Сплошной черной линией отмечена зависимость аппроксимирующей экспоненциальной функции. На графике отмечена аппроксимирующая функция и точность аппроксимации.

3.4 Разработка метода исследования процессов биодеградации и биотрансформации магнитных агентов в организме экспериментальных животных методами мёссбауэровской спектроскопии

Методами мёссбауэровской спектроскопии (в соавторстве с НИЦ «Курчатовский институт» и Физико-технологическим институтом РАН) были исследованы процессы катаболизма магнитных наночастиц в организме экспериментальных животных. После внутривенного введения магнитных частиц мыши были забиты в различное время: через 2 часа, 2 дня, 2 недели, 2 месяца после введения. После этого органы забитых мышей (печень, селезенка, почки, желудок, легкие, сердце, мозг) были извлечены, лиофилизованы и подготовлены для дальнейшего изучения методами мёссбауэровской спектроскопии. Было обнаружено, что в спектрах, снятых с лиофилизованных образцов печени мышей спустя определенное время после внутривенных инъекций магнитных наночастиц, появляются линии, отличные от линий, характерных для самих магнитных частиц (рисунок 10). Было показано, что после инъекции магнитные частицы претерпевают химические изменения в организме и переходят в форму ферритино-подобного железа (рисунок 11). Это свидетельствует о наличии в организме мышей (и, очевидно, других млекопитающих) механизмов разложения наночастиц оксидов железа до безопасных молекулярных и/или ионных форм железа, что делает магнитные наночастицы перспективными агентами для нанобиомедицины.

' т=яхж ' миЧЛ Ал/Ч, Ы ■ ШХЛАП

■ МЧ V Н=3.4 кое V

р^гтп

■ 2м у 1 . 1 , 1 . 1 . 1 ■ 2м У «уууу^"-

0.01 0.1 1 10 100 1000 Время после введения частиц, часы

Рисунок 10. Мёссбауэровские спектры ядер Ре введенных наночастиц (а) в образцах печени мышей после 2 часов (Ь), 2 дней (с), 2 недель(ё), и 2 месяцев (е) с момента введения частиц. Спектры, измеренные при комнатной температуре (слева), в жидком азоте (посередине) и во внешнем магнитном поле 3.4 кЭ (справа).

Рисунок 1 1. Концентрация ядер " Ре в образцах мышей как функция от времени после введения наночастиц. Белые точки - концентрация наночастиц, черные точки - концентрация ферритино-подобного железа.

выводы

1. Разработан метод получения многофункциональных нано- и микроагентов путем белок-опосредованной самосборки функциональных модулей различной природы с помощью молекулярного адаптера барназа-барстар на примере трифункциональных магнитных и, одновременно, флуоресцентных суперструктур, нацеленных мини-антителами на опухолевые клетки.

2. Показана необычная стабильность в экстремальных денатурирующих условиях структур, полученных на основе систем нековалентной самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы - конъюгаты коллоидных частиц с белками, по сравнению с теми же белками в свободном виде.

3. Разработаны методы высокочувствительной детекции в экспериментальных животных различных магнитных нано- и микроагентов по их нелинейной намагничиваемости. Показано, что чувствительность разработанных

59т-

методов детекции не уступает регистрации агентов на основе re по их радиоактивности.

4. Разработаны неинвазивные методы изучения фармакокинетических параметров магнитных агентов в экспериментальных животных: а) оригинальная методика регистрации динамики концентрации агентов в кровотоке хвоста животных, не требующая микрохирургии; б) метод неинвазивного мониторинга распределения агентов в тканях и органах живых организмов на глубине до 2 см.

5. С помощью разработанных магнитометрических методов и методов мёссбауэровской спектроскопии исследованы процессы биодеградации магнитных агентов in vivo; показано, что после инъекции магнитные наночастицы оксидов железа разлагаются в организме животных до безопасных форм ферритино-подобного железа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи и патенты

1. Nikitin М.Р.. Zdobnova T.A., Lukash S.V., Stremovskiy O.A., Deyev S.M. Proteinassisted self-assembly of multifunctional nanoparticles // Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2010. V.107. 5827-5832.

2. Никитин М.П.. Здобнова T.A., Стремовский O.A., Лукаш C.B., Деев C.M. Конструкция на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения // Патент РФ №2480524 приоритет от 13.09.2010.

3. Nikitin M.. Gabbasov R., Cherepanov V., Chuev M., Polikarpov M., Panchenko V., Deyev S. Magnetic Nanoparticle Degradation in vivo Studied by Mössbauer Spectroscopy // AIP Conf. Proc. 2010. CP1311. 401-407.

4. Nikitin M.. Vetoshko P., Brusentsov N., Nikitin P. Highly sensitive room-temperature method of non-invasive in vivo detection of magnetic nanoparticles // J. Magn. Magn. Mat. 2009. V. 321. 1658-1661.

5. Nikitin M., Torno M., Chen H., Rosengart A., Nikitin P. Quantitative real-time in vivo detection of magnetic nanoparticles by their non-linear magnetization // J. Appl. Phys. 2008. V. 103. 07A304.

6. Aghayeva U.F.*, Nikitin M.P.*, Lukash S.V., Deyev S.M. Denaturation-Resistant Bifunctional Colloidal Superstructures Assembled via the Proteinaceous BarnaseBarstar Interface HACSNano, 2013. V.7. №2. 950-961. (* - равный вклад).

7. Шипунова B.O., Никитин М.П.. Лизунова A.A., М.А. Ермакова, Деев С.М., Петров Р.В. Магнитные наночастицы с полиэтилениминовой оболочкой для модификации клеток // Доклады Академии Наук. 2013. Т. 452. № 3. 333-335.

8. Агаева У.Ф., Никитин М.П.. Коростылев Е.В., Лукаш C.B., Деев С.М., Петров Р.В. Самосборка магнитно-флуоресцентных коллоидных конструкций на основе белок-белковых взаимодействий // Доклады Академии Наук. 2012. Т. 445. №6. 692-695.

9. Polikarpov D.M., Gabbasov R.R., Cherepanov V.M., Chuev M.A., Korshunov V.A., Nikitin M.P., Deyev S.M., Panchenko V.Y. Biodegradation of Magnetic Nanoparticles in Rat Brain Studied by Mössbauer Spectroscopy // Magnetics, IEEE Transactions on. 2013. V.49. №1. 436-439.

10. Gabbasov R.R., Cherepanov V.M., Chuev M.A., Polikarpov M.A., Nikitin M.P.. Deyev S.M., Panchenko V.Y. Study of Nature of Paramagnetic Doublet in Mössbauer Spectra of Mice Liver Using External Magnetic Field // Solid State Phenomena. 2012. V.190. 729-732.

11.Chuev M.A., Cherepanov V.M., Deyev S.M., Mischenko I.N., Nikitin M.P.. Polikarpov M.A., Panchenko V.Y. Interpretation of the Môssbauer Spectra of the Magnetic Nanoparticles in Mouse Spleen // AIP Conf. Proc. 2010. CP1311. 322-328.

12. Gabbasov, R., Cherepanov, V., Chuev, M., Polikarpov, M., Nikitin. M.. Deyev, S„ Panchenko, V. Biodégradation of Magnetic Nanoparticles in Mouse Liver From Combined Analysis of Môssbauer and Magnetization Data // Magnetics, IEEE Transactions on. 2013. V.49. №1. 394-397.

Тезисы докладов на конференциях

13.Nikitin М.Р., Yalayev T.R., Ksenevich T.I., Deyev S.M. A novel method for study of magnetic nanomaterial pharmacokinetics in vivo И IV Международный форум по нанотехнологиям «RUSNANOTECH 2011», Москва, 26-28 октября 2011.

14.Nikitin M. Self-Assembly of Multifunctional Structures and Novel Methods for their Quantitative Detection in vivo II ESF-EMBO Conference on Biological Surfaces and Interfaces, Сант Фелиу де Гишольс, Испания, 26 июня - 1 июля 2011.

15.Никитин М.П.. Здобнова Т.А., Лукаш C.B., Стремовский О.А., Деев С.М. Магнитоуправляемые многофункциональные конструкции на основе белкового модуля барназа-барстар // Тезисы конференции «Нанотехнологии в онкологии 2010», Москва, 30 октября 2010.

16.Никитин М.П. Магнитные наночастицы - многофункциональные агенты для тера(г)ностики // XXV Международная зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 11-15 февраля, 2013.

17.Nikitin М.Р.. Zdobnova T.A., Lukash S.V., Stremovskiy О.A., Deyev S.M., Self-assembly of multifunctional nanoparticles via barnase and barstar, // Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, Росток, Германия, 25-29 Мая, 2010.

18.Nikitin M.P., Gabbasov R.R., Cherepanov V.M., Chuev M.A., Panchenko V.Y., Polikarpov M.A., Deyev S.M., Study of magnetic particle degradation in vivo by Môssbauer spectroscopy // Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, Росток, Германия, 25-29 Мая, 2010.

19.Никитин М.П., Деев С.М., Наноконструктор: новый подход к созданию диагностических и терапевтических нанобиоагентов и новые методы их регистрации in vivo II Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, Март 16-20, 2009.

20.Никитин М., Лукаш С., Здобнова Т., Деев С. Мультифункциональные нанобиоконъюгаты и новые методы их количественной детекции in vivo II Международный Форум по Нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря, 2008.

25

Отпечатано в типографии ООО "Копировальный мир", 119049, г.Москва, Ленинский проспект, дом 4 к.1 Заказ № 11/11, тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Никитин, Максим Петрович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201365705

Никитин Максим Петрович

¿JfJlíttC'u.mu

МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫЕ НАНО- И МИКРОАГЕНТЫ И МЕТОДЫ ИХ РЕГИСТРАЦИИ IN VIVO ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИМЕНЕНИЙ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор, член-корреспондент РАН Деев С.М.

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................9

1.1. Разнообразие наночастиц и способов их самосборки..................................................................9

1.1.1. Наночастицы..................................................................................................................................9

1.1.2. Требования, предъявляемые к наноагентам для медицины....................................................13

1.1.3. Мультифункциональные структуры в нано- и микромасштабах...........................................15

1.1.3.1. «Капсулирование»....................................................................................................................15

1.1.3.2. Реакция между компонентами................................................................................................16

1.1.3.3. Одновременный синтез компонент на одном зародыше......................................................20

1.1.3.4. Самосборка: теория и примеры..............................................................................................21

1.1.4. Самосборка с помощью биомолекулярных интерфейсов/адаптеров.....................................24

1.1.4.1. Самосборка наночастиц, опосредованная нуклеиновыми кислотами................................28

1.1.4.2. Белок-опосредованная самосборка: примеры.......................................................................31

1.2. Система барназа-барстар...............................................................................................................36

1.3. Денатурация белков.......................................................................................................................38

1.3.1. Общие положения.......................................................................................................................39

1.3.2. Термическая денатурация..........................................................................................................41

1.3.3. Хаотропные агенты: гуанидин гидрохлорид и мочевина.......................................................42

1.3.4. Денатурация под действием экстремальных значений рН.....................................................43

1.3.5. Высокая ионная сила как денатурант........................................................................................44

1.4. Особое место магнитных частиц в биомедицине.......................................................................44

1.4.1. Различные типы магнитных частиц..........................................................................................44

1.4.2. Применения магнитных частиц.................................................................................................46

1.4.3. Способы детекции магнитных частиц......................................................................................47

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................50

2.1. Материалы и оборудование..........................................................................................................50

2.2. Методы исследования....................................................................................................................51

2.2.1. Ковалентная конъюгация биомолекул с магнитными наночастицами..................................51

2.2.2. Определение ферментативной активности барназы................................................................51

2.2.3. Биотинилирование белков..........................................................................................................51

2.2.4. Детекция магнитных частиц........................................ ..............................................................52

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АГЕНТОВ..............................................................................................................................................54

3.1. Самосборка многофункциональных частиц................................................................................54

3.1.1. Конъюгация белков барназы и барстара с наночастицами.....................................................55

3.1.2. Соотношение количества белков и МЧ при конъюгации.......................................................56

3.1.3. Определение количества активного белка на поверхности частицы.....................................57

3.1.2. Магнитно-флуоресцентные частицы на основе белков барназа и барстар...........................58

3.1.2.1. Бифункциональные частицы: одновременно магнитные и флуоресцентные....................58

3.1.2.2. Трифункциональные частицы (магнитные, флуоресцентные, противораково-направленные) в качестве диагностического агента.........................................................................60

3.1.2.3. Демонстрация трифункциональности полученных комплексов.........................................61

3.1.2.4. Разнообразие строения суперструктур...................................................................................63

3.2. Прочность самособранных частиц...............................................................................................65

3.2.1. Оптимизация протокола конъюгации частиц с белками.........................................................65

3.2.2. Самосборка конъюгатов.............................................................................................................67

3.2.3. Оптическая и сканирующая электронная микроскопия образцов: результаты самосборки в оптимальных условиях.................................................................................................68

3.2.4. Временная зависимость эффективности самосборки..............................................................73

3.2.5. Исследование результатов самосборки с помощью катодолюминесценции........................74

3.2.6. Выбор метода визуализации для дальнейшего (полу)количественного анализа самосборки в различных условиях......................................................................................................75

3.2.7. Самосборка в экстремальных условиях....................................................................................76

3.2.7.1. Влияние низких рН..................................................................................................................78

3.2.7.2. Хаотропные агенты: мочевина и гуанидин гидрохлорид....................................................79

3.2.7.3. Высокая ионная сила (NaCl)...................................................................................................80

3.2.7.4. Влияние добавления свободных белков в системе при самосборке...................................82

3.2.8 Стабильность предварительно собранных структур в экстремальных условиях..................83

3.2.8.1. Изучение влияния наиболее жестких денатурирующих условий.......................................83

3.2.8.2. Влияние на целостность предварительно собранных структур более мягких денатурирующих условий....................................................................................................................84

3.2.8.3. Температурная устойчивость собранных структур..............................................................86

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДЕТЕКЦИИ МАГНИТНЫХ АГЕНТОВ В

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ.........................................................................................88

4.1. Разработка метода детекции магнитных структур in vivo..........................................................88

АЛЛ. In vitro модель динамического потока......................................................................................89

4.1.2. Инвазивные измерения in vivo в реальном времени................................................................90

4.1.3. Сравнение с методом регистрации на основе радиоактивных меток....................................93

4.2. Синтез магнитных частиц.............................................................................................................95

4.2.1. Синтез магнетита.........................................................................................................................95

4.2.2. Стабилизация МЧ оболочкой.....................................................................................................98

4.2.3. Влияние соотношения железа II и III на магнитный сигнал...................................................99

4.3. Детекция магнитных частиц в кровотоке..................................................................................101

4.3.1. Методика измерения динамики концентрации магнитных наночастиц в кровотоке мышей...................................................................................................................................................101

4.3.2. Динамика концентрации магнитных наночастиц в кровотоке мышей................................102

4.3.2.1. Влияние анестезии.................................................................................................................103

4.3.2.2. Влияние введенного количества наночастиц......................................................................105

4.3.2.3. Влияние размера.....................................................................................................................107

4.3.2.4. Влияние поверхности.............................................................................................................108

4.3.2.5. Влияние повторного введения..............................................................................................109

4.3.2.6. Увеличение времени циркуляции наночастиц....................................................................110

4.4. Разработка метода неинвазивной детекции магнитных частиц в органах экспериментальных животных..........................................................................................................112

4.4.1. Калибровка детектора...............................................................................................................113

4.4.2. Измерения биораспределения наночастиц в организме крыс..............................................116

4.4.3. Динамика биораспределения наночастиц в крысах...............................................................118

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ МАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ...........................119

5.1. Исследование долговременной динамики магнитного материала в печени мышей на протяжении нескольких месяцев.......................................................................................................119

5.2. Изучение биодеградации магнитных наночастиц с помощью Мёссбауэровской

спектроскопии.....................................................................................................................................126

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................................................129

ВЫВОДЫ.............................................................................................................................................130

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ......................................................131

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................................132

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В последнее время наблюдается неуклонный рост использования нанотехнологий в биологии и медицине. Наночастицы представляют большой интерес для медицины XXI века из-за принципиально новых возможностей по сравнению с существующими лекарствами в молекулярной форме. Особый интерес вызывает применение различных наночастиц для лечения и диагностики таких заболеваний, как рак, инсульт, атеросклероз, а также инфекционных заболеваний. На данный момент существует большое разнообразие наночастиц, обладающих различными полезными физико-химическими свойствами: полимерные, золотые и магнитные частицы (МЧ), квантовые точки (КТ), наноалмазы и многие другие. В то время как некоторые наночастицы уже допущены для введения человеку в диагностических целях, а другие проходят клинические испытания, большая часть разработанных наночастиц еще только изучается в научных лабораториях: разрабатываются как новые подходы синтеза, так и новые применения in vitro (методы иммуноанализа, магнитная сортировка клеток) и in vivo (визуализация опухолей и направленная доставка лекарств, и т.п.). Большинство применений in vitro, например иммуноанализ, требуют «узкоспециализированных частиц», оптимизированных по таким параметрам как размер, максимальный специфический и минимальный неспецифический сигналы и т.п. Применения in vivo, наоборот, требуют в первую очередь большей функциональности частиц, например, одновременную способность к диагностике заболевания и его терапии. Так, например, для лечения онкозаболеваний были бы полезны частицы, способные одновременно подтвердить злокачественную природу опухоли (за счет иммунохимии), визуализировать распространение опухоли (за счет, например, флуоресцентного сигнала), и убить раковые клетки (за счет токсичных веществ, нагрева и т.п.). Разработка методов получения многофункциональных структур, содержащих в себе различные вышеперечисленные наночастицы, является важной задачей биомедицины.

Не менее важной является задача изучения поведения созданных нано- и микроагентов in vivo. Для создания эффективных препаратов требуется оптимизировать не только функционал структур, но и их фармакокинетические свойства - время циркуляции в кровотоке, распределение по органам, а также сделать их наименее токсичными и либо деградируемыми до безопасных молекулярных веществ, либо максимально инертными. Поэтому создание надежных методов детекции агентов и методов, позволяющих отслеживать их биотрансформацию и поведение после введения, является одной из актуальнейших проблем тераностического использования наночастиц.

Цель работы - разработка многофункциональных магнитоуправляемых нано- и микроструктур, а также разработка новых методов для всестороннего изучения поведения таких структур in vivo, в частности, для определения фармакокинетических параметров, например, времени циркуляции структур в крови, для количественного изучения распределения в органах, а также для определения путей биодеградации структур и их компонентов в тканях. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- Разработать метод самосборки многофункциональных структур на основе магнитных нано- и микрочастиц и молекулярного интерфейса барназа-барстар.

- Разработать метод детекции магнитных частиц ex vivo и in vivo в организме экспериментальных животных: в кровотоке и в органах.

- Синтезировать оптимальные магнитные метки для высокочувствительной регистрации разработанным методом.

- Разработать методы изучения фармакокинетических характеристик наночастиц, таких как время выведения из кровотока, распределения в органах и процессов биодеградации частиц.

Научная новизна

Впервые предложен метод получения многофункциональных нано- и микро-суперструктур путем самосборки функциональных агентов различной природы с помощью белок-белковых взаимодействий, а именно, с помощью молекулярного адаптера барназа-барстар. Впервые продемонстрировано, что системы нековалентной самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы - конъюгаты коллоидных частиц с белками, могут быть необычно стабильными и выдерживать экстремальные для молекулярных белков денатурирующие условия. Впервые в данной работе был предложен и разработан высокочувствительный метод количественной детекции магнитных частиц как нелинейных магнитных материалов при комнатной температуре в реальном времени в экспериментальных животных. Впервые предложен метод исследования процессов деградации in vivo магнитных наночастиц до ферритино-подобного железа с помощью мёссбауэровской спектроскопии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанная методика получения многофункциональных нано- и микроконструкций в сочетании с уникальным по чувствительности методом их детекции в живых организмах перспективна для исследований в области диагностики и терапии различных заболеваний на ранних стадиях, например, для обнаружения раковых опухолей внешним зондом по скоплению

магнитных структур, несущих специфические антитела к онкомаркерам. Предложенный метод белок-опосредованной самосборки сверхпрочных многофункцональных структур может быть использован для создания тераностических агентов с переменным составом и функционалом для целей персонализированной медицины. Разработанный метод мониторинга структур на основе магнитных маркеров в тканях организма и непосредственно в токе крови может успешно заменить диагностические методы на основе радиоактивности. Кроме того, разработанный метод регистрации МЧ позволяет эффективно контролировать и выбирать оптимальные нано- и микроагенты для управляемой доставки лекарственных препаратов, гипертермии опухолей, и т.д. Также метод, являясь принципиально новым физическим методом изучения поведения нано- и микрочастиц в организме, может быть использован для получения новой информации касательно фармакокинетики частиц, их токсичности и т.п.

Методология и методы исследования

В работе использован широкий спектр химических, биохимических и физических методов подробно описанных в главе 2 «Методы и материалы» и в главах 3-5.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод получения многофункциональных нано- и микроагентов путем белок-опосредованной самосборки функциональных модулей различной природы с помощью молекулярного адаптера барназа-барстар на примере трифункциональных магнитных и, одновременно, флуоресцентных суперструктур, нацеленных мини-антителами на опухолевые клетки.

2. Показана необычная стабильность в экстремальных денатурирующих условиях структур, полученных на основе систем нековалентной самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы - конъюгаты коллоидных частиц с белками, по сравнению с теми же белками в свободном виде.

3. Разработаны методы высокочувствительной детекции в экспериментальных животных различных магнитных нано- и микроагентов по их нелинейной намагничиваемое™. Показано, что чувствительность разработанных методов детекции не уступает регистрации агентов на основе 59Ре по их радиоактивности.

4. Разработаны неинвазивные методы изучения фармакокинетических параметров магнитных агентов в экспериментальных животных: а) оригинальная методика регистрации динамики концентрации агентов в кровотоке хвоста животных, не требующая микрохирургии;

б) метод неинвазивного мониторинга распределения агентов в тканях и органах живых организмов на глубине до 2 см.

5. С помощью разработанных магнитометрических методов и методов мёссбауэровской спектроскопии исследованы процессы биодеградации магнитных агентов in vivo; показано, что