Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro"

На правах рукописи

005044719

КУЧМИЙ АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ЛИНИЙ РЕПОРТЕРНЫХ МЫШЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ IN VIVO И IN VITRO

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 МАЙ 2012

Москва-2012

005044719

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук Научный руководитель: заведующий Лабораторией молекулярной

иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Недоспасов С.А.

Официальные оппоненты: заведующий Лабораторией иммунохимии

Федерального государственного бюджетного учреждения Государственного научного центра Института Иммунологии Федерального медико-биологического агентства России, доктор биологических наук, профессор Филатов A.B.

руководитель Группы эпигенетических механизмов регуляции активности генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук, доктор биологических наук Тиллиб C.B.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук Защита состоится UtCH^ 2012 г. в Ц_ часов на заседают диссертационного совета Д. 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российском академии наук по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

A.M. Крицьн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фактор Некроза Опухолей (Tumor Necrosis Factor,TNF) -плейотропный провоспалительный и иммунорегуляторный цитокин, играющий важную роль в защите организма от внутриклеточных патогенов и организации структуры вторичных лимфоидных органов. Нарушение регуляции и избыточная продукция TNF приводят к развитию ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, а в острых случаях может приводить к симптомам септического шока. Фармакологическая блокировка TNF оказалась эффективной при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний и была одобрена для применения в клинике. Однако, системная инактивация TNF является симптоматическим лечением и сопряжена с рядом осложнений, таких как повышенная восприимчивость к инфекциям, реактивация туберкулеза и некоторыми другими. Для преодоления побочных эффектов анти-TNF терапии ведется разработка альтернативных подходов к ингибированию действия TNF, в том числе и предложенная нашей лабораторией стратегия блокировки TNF из определенных клеточных источников.

Исследования нашей лаборатории показали, что некоторые биологические функции TNF зависят от вида клеток-продуцентов и их локализации (Grivennikov S, Immunity, 2005; Tumanov et al. Blood, 2010; Kruglov, JI, 2011). Так, блокирование цитокина, производимого отдельным типом клеток, или в определенных тканях может нейтрализовать преимущественно негативные эффекты TNF, сохраняя его защитные функции. Вместе с тем, роль индивидуальных клеточных источников TNF в патогенезе аутоиммунных заболеваний по-прежнему до конца не понята. Более того, на настоящий момент далеко не все подтипы клеток, экспрессирующих TNF, хорошо охарактеризованы, и не исключено, что существуют новые типы клеток - как иммунных, так и стромальных - продуцирующих TNF в норме и при различных патологиях.

Чтобы подробно охарактеризовать экспрессию TNF на молекулярном уровне, клеточном уровне и на уровне целого организма, нами получены и изучены 2 линии новых репортерных мышей, экспрессирующих два разных флуоресцентых белка. Во-первых, в сотрудничестве с Д. Чудаковым и С. Лукьяновым (Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) получены мыши, в которых транскрипция TNF сопряжена с экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка Katushka (TNF-2A-Kat, сокращенно Kat-TNF). Во-вторых, в сотрудничестве с И. Гореном и А. Вайсманом, (Медицинский факултьтет Университета им. Йохана Гутенберга в Майнце), были получены трансгенные мышиные модели, в которых

синтез TNF сопряжен с экспрессией зеленого флоресцентного белка eGFP (del RP23EGfp3126), сокращенно eGFP-TNF. Эти мыши были предоставлены нам для изучения.

В обоих случаях флуоресцентные белки являются репортерами синтеза TNF. Однако в eGFP-TNF репортерных мышах намеренно был ослаблен контроль экспрессии мРНК зеленого репортерного белка (по сравнению с TNF) и такая система, согласно дизайну, отражает продукцию «патогенного» TNF в отсутствие супрессорных механизмов (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Такую eGFP-TNF репортерную систему, отражающую продукцию «патогенного» TNF, было интересно изучить одновременно с репортерной системой Kat-TNF, которая содержит все регуляторные элементы и является физиологически корректной. Для этого линии мышей были скрещены друг с другом (сокращенное название гибридной линии Kat*eGFP-TNF).OKa3arcocb, что репортерные белки eGFP и Katushka в Kat*eGFP-TNF мышах, когда синтезируются в одной клетке, не влияют на экспрессию друг друга (контроль репортерных мышей только с eGFP-TNF трансгеном не приведен в рамках этой работы). Благодаря этому была получена уникальная линия двойных репортерных мышей, которая отражает разные аспекты экспрессии TNF.

В предыдущих вариантах TNF-репортерных мышей использовались другие, менее совершенные, типы меток и методы детекции сигнала. Так, в линии мышей CAT-TNF (Beutler, PNAS, 1992) экспрессия TNF определялась по активности хлорамфеникол-трансферазы в гомогенатах тканей. В этом случае невозможно проанализировать экспрессию TNF на уровне отдельных клеток, и неприменимы микроскопические методы анализа. При биолюминесцентной детекции в TNF-Luc модели (Kravchenko, Science, 2008), в свою очередь, достигается меньшее разрешение, нежели чем при флуоресцентных методах анализа. Использование генетически запрограммированной флуоресцентной метки позволяет сортировать популяции живых клеток, помеченных флуорофором, и анализировать фенотип TNF-продуцентов на уровне одной клетки ex vivo. При помощи микроскопических методов in vivo можно локализовать помеченные клетки внутри органа, проследить их динамику и межклеточные взаимодействия в тканях живых экспериментальных животных.

Таким образом, нами были получены и/или охарактеризованы новые животные модели для детального изучения роли TNF, производимого отдельными типами клеток, в норме и при патологиях на молекулярном, клеточном и организменном уровнях. Подобные модели в перспективе применимы и для разработки/тестирования нового поколения ингибиторов TNF.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и/или характеристика новых линий TNF-репортерных мышей с генетически-запрограммированной флуоресцентной меткой, экспрессируемой совместно с TNF. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получение и характеристика новой линии репортерных мышей Kat-TNF, где экспрессия TNF сопровождается экспрессией красного флуоресцентного белка Katushka. Характеристика двойной репортерной линии мышей Kat*eGFP-TNF, в которой есть еще один маркер экспрессии TNF - зеленый флуоресцентный белок eGFP.

2. Анализ соответствия экспрессии флуоресцентных меток TNF-продукции в иммуноцитах репортерных мышей в ответ на TNF-индуцирующий стимул in vitro, а именно, изучение экспрессии флуоресцентных маркеров и TNF в миелоидных клетках после стимуляции липополисахаридом (ЛПС) и в лимфоцитах после стимуляции форбол-12-миристил-13-ацетатом (ФМА) совместно с иономицином.

3. Анализ транскрипционной регуляции и экспрессии TNF, закодированного трансгенной вставкой Kat-TNF, и красного флуоресцентного белка, в первичных культурах макрофагов из Kat-TNF линии мышей.

4. Анализ применимости флуоресцентной репортерной системы Kat-TNF для изучения экспрессии TNF in vivo в моделях септического шока, индуцированного ЛПС, аутоиммунного гепатита, индуцированного конканавалином - А (Кон А) и при экспериментальном энцефаломиелите - мышиной модели рассеянного склероза.

5. Анализ экспрессии TNF, красного и зеленого репортерных белков в лимфоидных органах из наивных неиммунизованных Kat*eGFP-TNF мышей.

Научная новнзна работы. В ходе этой работы была получена и охарактеризована новая уникальная линия генетически модифицированных мышей Kat-TNF, в геном которых методом трансгенеза была интегрирована репортерная конструкция, программирующая параллельную экспрессию TNF и красного флуоресцентного белка Katushka. В состав конструкции для получения линии мышей Kat-TNF включены все известные регуляторные элементы гена TNF, в том числе последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м нитроне и З'-нетранслируемой областью, что обеспечивает сохранение правильной регуляции трансгена. Белок Katushka обладает уникальными спектральными характеристиками ?,х=588нм и Km =633нм (Shcherbo, Nat.Methods, 2007) , длины волн возбуждения и эмиссии этого белка попадают в «оптическое окно», благоприятное для проникновения флуоресценции сквозь живые ткани (630-1100 нм). Следует отметить, что на момент создания Kat-TNF -репортерной модели была опубликована только одна трансгенная линия мышей, созданная с использованием белка Katushka (Diéguez-Hurtado.R, Genesis, 2011).

Одновременно и независимо коллегами из Университета им. Йохана Гутенберга в Майнце, была получена другая трансгенная TNF-репортерная линия мышей eGFP-TNF, в которой экспрессия TNF сопряжена с экспрессией зеленого флуоресцентного белка с улучшенными спектральными характеристиками. В случае eGFP-TNF мышей использовалась другая

конструкция на основе искусственной бактериальной хромосомы (bacterial artificial chromosome, ВАС). Особенностью этой конструкции является то, что экспрессия eGFP регулируется только промоторной областью TNF и в ней отсутствуют важные регуляторные элементы - AU-богатые участки, расположенные в З'-нетранслируемой области гена TNF.

В результате скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF была получена еще одна линия двойных репортерных мышей Kat*eGFP-TNF, которая отчасти представляет собой пример комплементации двух трансгенов.

Две созданные модели представляют собой первый пример использования флуоресцентного белка для мечения TNF-экспрессирующих клеток. Использование флуоресцентной метки является перспективным подходом для выявления экспрессии TNF на уровне одной клетки, позволяющим осуществлять всесторонний анализ с использованием современных флуоресцентных методов.

В работе по характеристике Kat-TNF и Kat*eGFP-TNF мышей было показано, что экспрессия флуоресцентных белков соответствует экспрессии TNF. Таким образом, впервые становится возможным с большой точностью и разрешением определять клетки, экспрессирующие TNF в ответ на различные стимулы in vitro и in vivo. Совместно с доктором Ф.Сиффриным из Лаборатории иммунодинамики в центральной нервной системе, Медицинского Университета в Майнце, при помощи Kat-TNF репортерных мышей удалось наблюдать TNF-продуценты в инфильтратах спинного мозга в модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в живых экспериментальных животных.

При анализе двойных репортерных мышей была обнаружена выраженная базальная экспрессия eGFP в иммуноцитах из наивных, неиммунизованных мышей, указывающая на корректное функционирование промотора гена TNF в составе eGFP-TNF конструкции, при нарушенной регуляции AU-богатымн участками. Таким образом, Kat*eGFP-TNF мыши представляют собой первый пример флуоресцентной репортерной системы с высокой чувствительностью к транскрипции гена TNF in vivo.

В результате, полученные модели (каждая из которых имеет свои особенности) являются не имеющим аналогов инструментом для изучения регуляции биосинтеза и биологических функции TNF в норме и при патологиях с использованием современных методов флуоресцентного анализа. При помощи этих моделей удалось обнаружить конститутивную экспрессию циоткина Т-клетками в пейеровых бляшках кишечника.

Научно-практическая ценность. Модели TNF-репортерных мышей, охарактеризованные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии TNF с применением современных методов флуоресцентного анализа.

В линии Kat-TNF мышей методами проточной цитофлуориметрии с высокой точностью можно определить фенотип TNF-экспрессирующих клеточных субпопуляций in vitro и в условиях модели ЛПС-токсичности in vivo. Более того, линия Kat-TNF репортерных мышей была положительно охарактеризована для in vivo микроскопии нервной системы в условиях модели экспериментального энцефаломиелита . Таким образом, применение Kat-TNF мышей в других моделях TNF-зависимых заболеваний (коллаген-индуцированный артрит, колит, индуцированный CD4+CD45RBhl Т-клетками и др.) позволит определить фенотип TNF-экспрессирующих клеток, проследить за их миграцией и межклеточными взаимодействиями in vivo, и установить роль этих клеток в патогенезе заболеваний. Методы проточной цитофлуориметрии так же позволяют выделять высокоочищенные субпопуляции жизнеспособных TNF-экспрессирующих клеток для последующего транскриптомного анализа.

Результатом отсутствия регуляторных AU-богатых элементов в конструкции для получения eGFP-TNF репортерной модели стало то, что клетки, в которых транскрипция TNF в норме незначительна (или даже отсутствует), экспрессируют детектируемые уровни зеленого, репортерного для TNF белка. Такая модель представляет собой интерес для чувствительного поиска новых источников TNF в наивных неиммунизованных мышах - эти клетки могут оказаться важными для развития патологии, С другой стороны, транскрипция гена TNF не означает экспрессию цитокина этими клетками. Характеристика синтеза TNF eGFP+ клетками является фундаментальной задачей для будущих работ.

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном коллоквиуме Лаборатории молекулярной иммунологии и Лаборатории иммунорегуляции при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук. Результаты работы были представлены на 13-ом международном TNF конгрессе, « TNF 2011», Хиого, Япония, 2011.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, которые соответствую требованиям, предъявляемым Высшей аттестационной комиссией.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (10 глав), раздела «Материалы и Методы исследования» (9 глав), результатов и обсуждения (9 глав), заключения и выводов. Диссертация изложена на 125 странице машинописного текста, содержит 21 рисунок и 1 таблицу. Список литературы включает 195 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

К моменту начала работы сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии Учреждения Российской академии наук ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН с помощью

стандартных биоинформатических и молекулярно-генетических методов был проведен дизайн, клонирование и наработка генно-инженерной TNF-репортерной конструкции Kat-TNF. Цикл работ по инъекциям линейной Kat-TNF конструкции в ооциты осуществлялся в отделении по работе с трансгенными животными Института Клеточной Биологии и Генетики им. Макса Планка, Дрезден, Германия. Отбор животных, имеющих в геноме трансгенную вставку, и контроль количества копий вставки осуществлялся стандартными методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации по Саузерну.

Первичные культуры клеток были получены с использованием стандартных клеточных методов. Костномозговые макрофаги были дифференцированы из клеток костного мозга in vitro в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (ЗОнг/мл). Поляризация подтипов Т-хелперных клеток осуществлялась путем стимуляции наивных CD4* CD62L+CD25* Т-клеток сочетанием антител к CD3 (1мкг/мл) и CD28 (1мкг/мл) в присутствии специфичных цитокинов, определяющих тип дифференцировки. Для получения Т-хелперных клеток 1-го типа использовались рекомбинантный цитокин IL-12 (5нг/мл) и антитела, блокирующие IL-4 (10мкг/мл). Для получения Т-хелперных клеток 2 типа дополнительно использовали рекомбинантный цитокин IL-4 (Юнг/мл) и нейтрализующие антитела к цитокину IL-12 (10мкг/мл) и к цитокину IFNy (10мкг/мл). Блокирующие антитела к упомянутым цитокинам добавлялись для увеличения эффективности поляризации Т-хелперных клеток. Фенотип клеток, экспрессирующих TNF, красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок после стимуляции in vitro определялся методами иммунофлуоресцентного окрашивания и последующего анализа на проточном цитофлуориметре BD LSRFortessa. Для детекции красного флуоресцентного белка использовалась следующая конфигурация прибора: фильтр нижних частот 600 нм, полосовой фильтр 610/20нм, при ХеХ= 561 нм (желто-зеленый лазер, 100 мВ). Для визуализации флуоресцентной метки в клетках и на гистологии тканей использовались стандартные методы конфокальной микроскопии на приборе Zeiss LSM 710 при Х«х=591нм и Х„=488 нм. Оценка транскрипционной регуляции красного репортерного белка и гена TNF осуществлялась при помощи ПЦР в реальном времени продуктов обратной транскрипции. Применимость флуоресцентной репортерной системы Kat-TNF для изучения TNF in vivo анализировалась в моделях септичекого шока, индуцированного элементом клеточной стенки Грам+ бактерий - липополисахаридом (ЛПС, 50 мкг/мышь), и Конканавалин А (КонА, 20мг/кг) - индуцированного аутоиммунного гепатита при помощи вышеприведенных иммунофлуоресцентных методов. Для исследования токсичности TNF, транскрибируемого с трансгенной вставки, использовался тест восстановления МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, желтый тетразоль) до диформазана живыми клетками линии WEHI 164 клон 13.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и отбор линии трансгенных TNF-репортерных мышей.

Для получения линии TNF-репортерных мышей Kat-TNF применяли методику трансгенеза с использованием для микроинъекций генетической конструкции, изображенной на Рис. 1А. Для того, чтобы максимально сохранить регуляторные генетические элементы, ответственные за правильный биосинтез TNF, в генетической конструкции использовалась часть локуса TNF/LT размером в И т.п.н., в частности, была включена последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м интроне и З'-нетранслируемой областью. В качестве флуоресцентной метки для TNF-экспрессирующих клеток использовался белок Katushka.

Для раздельного синтеза TNF и красного флуоресцентного белка с единого транскрипта Kat-TNF использовалась генетическая последовательность вирусного 2А пептида, работающая по механизму рибосомального пропуска: в результате стерических взаимодействий в пептидильном центре при трансляции 2А пептида рибосома делает пропуск между 19-тым остатком глицина на С-конце и 20-ым остатком пролина на N-конце. В результате с общей мРНК сначала экспрессируется TNF с дополнительными 19 аминокислотами на С-конце, а затем экспрессируется белок Katushka.

Для получения eGFP-TNF репортерных линий мышей использовался подход трансгенеза, где в качестве генетической конструкции была использована модифицированная искусственная бактериальная хромосома ВАС (схема конструкции изображена на рис.1 Б). ВАС представляет собой F-плазмиду фертильності! бактерий, в которую клонированы фрагменты генома мыши. Общие размеры такого конструкта составляют порядка 150350 т.п.н. В данном случае, в ВАС с локусом TNF/LT вместо гена TNF путем сайт-специфической рекомбинации были встроены последовательность зеленого флуоресцентного белка и последовательность гена устойчивости к неомицину (NEO-кассета), фланкированная FRT сайтами для узнавания Flp-рекомбиназой. NEO-кассета выступает в качестве маркера положительной селекции для отбора ВАС-плазмиды, в которой прошла рекомбинация. Получившаяся ВАС-конструкция использовалась для микроинъекций. После получения трансгенной линии eGFP-TNF, несущей NEO-кассету, маркер положительной селекции был удален из генома в результате сайт-специфической Flp-опосредованішой рекомбинации во всем организме. Делеция во всем организме достигалась путем скрещивания eGFP-TNF мышей, несущих NEO-кассету, с мышами, у которых Flp-рекомбиназа экспрессирутеся убиквитарно. В результате, в репортерной конструкции eGFP-TNF экспрессия зеленого репортерного белка находится под контролем

промотора TNF и З'-энхансера NFkB (кВ4, кВ4а, кВ4аЬ), при этом синтез eGFP не регулируется AU- богатыми участками в З'-нетранслируемой области.

Рис. 1 Получение линий трансгенных TNF-репортерных мышей. А. Схема генетической конструкции для получения линии TNF-2A-KaT, в дальнейшем Kat-TNF.Обозначения: mLTa - ген лимфотоксина a мыши, mLTß - ген лимфотоксина ß мыши, UTR - нетранслируемая 3' последовательность. Kat-TNF- последовательность, содержащая ген TNF (боковая штриховка), и ген флуоресцентного белка Katushka - Kat (сетка), разделенные последовательностью вирусного 2А пептида (черная заливка). Б. Схема генетической конструкции для получения del RP23EGfp3126 или eGFP-TNF репортерной линии мышей. Обозначения: схематически указана последовательность дополнительных генов, eGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок(волна) с рА-сигналом полиаденилирования (белая заливка), NEO - кассета устойчивости к неомицину (серая заливка), фланкированная FRT-сайтами (прямоугольники с кружочками).

В результате микроинъекций конструкции Kat-TNF были получены 6 линий животных, несущих различное число копий трансгена Кат-TNF (данные приведены в полном тексте диссертации). Анализ экспрессии TNF и красного флуоресцентного белка в мононуклеарных клетках периферической крови после стимуляции ЛПС (10мкг/мл) позволил отобрать линию номер 6, показавшую наиболее высокий уровень экспрессии репортёрного белка с корреляцией между экспрессией TNF и Katushka. Таким образом, линия мышей Kat-TNF-6 с двумя копиями трансгенной вставки была использована в дальнейшей работе. Линия eGFP-TNF-репортерных животных была отобрана и первично охарактеризована в лаборатории А. Вайсмана (Майнц). Путем скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF трансгенных линий была получена линия двойных репортерных мышей (Kat*éGFP-TNF), непосредственно охарактеризованная в нашей работе.

2. Характеристика экспрессии репортерных белков и TNF в миелоидных клетках линий репортерных мышей ¡П vitro.

TNF, продуцирующийся миелоидными клетками, играет критическую роль при инициации и развитии реакции воспаления в ответ на активацию Toll - подобных рецепторов (TLR) различными патогенами. Активация клеток врожденного иммунитета эндотоксином через TLR4 является хорошо охарактеризованной моделью экспрессии молекул

воспалительного ответа, в том числе и TNF (Shakhov AN, J.Exp.Med., 1990; Hargreaves DC, Cell, 2009). Для того, чтобы проанализировать, насколько экспрессия флуоресцентных белков отражает синтез TNF в миелодных клетках, была использована система in vitro, в которой свежевыделенные клетки из вторичных лимфоидных органов были стимулированы ЛПС (100нг/мл) в присутствии брефельдина А (5мкг/мл) для внутриклеточного накопления TNF. В ответ на ЛПС нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки из мышей дикого типа производят TNF, как это показано на рис.2А, Б. В случае Kat-TNF репортерных мышей наблюдается высокая корреляция экспрессии TNF и красного репортерного белка (Рис. 2Б, черная стрелка). Таким образом, TNF-экспрессирующие CDllb+CDllc~ макрофаги, CD1 lb+CDl 1с+ дендритные клетки и CD1 lbhigh CD11с" нейтрофилы оказываются помечены белком Katushka. Примечательно, что в нестимулированных ЛПС клетках Katushka не детектировалась.

все клетки

дикии тип

только TNF'

Katushka

все клетки

Kat*GFP-TNF

Katushka

Рис.2 Анализ экспрессии TNF и репортерных белков клетками лимфоидных органов в ответ на стимуляцию ЛПС in vitro. А. Представлены типичные точечные диаграммы, отражающие процентный состав/фенотип клеток миелоидного ряда (наверху) и процентный состав/фенотип клеток, экспрессирующих TNF в ответ на ЛПС (внизу), в селезенках мышей дикого типа и линии Kat-TNF. Б. Анализ экспрессии TNF и Katushka в спленоцитах после стимуляции ЛПС. Ко-экспрессия TNF и красного белка в спленоцитах Kat-TNF мышей показана черной стрелкой. В. Двумерные графики, отражающие ко-экспрессию красного и зеленого репортерных белков в спленоцитах линии двоиных-репортерных мышей (черные стрелки) после стимуляции ЛПС. Серой стрелкой показана базальная экспрессия eGFP. Цифрами указан процент клеток в соответствующем квадранте.

Параллельно были проанализированы спленоциты из двойных Kat*eGFP-TNF репортерных мышей, в которых TNF-экпрессирующие клетки помечены не только красным, но и зеленым белком. В результате была обнаружена выраженная базальная экспрессия eGFP в спленоцитах еще до стимуляции (рис. 2В, серая стрелка). После стимуляции ЛПС интенсивность eGFP в клетках заметно возрастает, превышая базальную экспрессию eGFP (в

дальнейшем «eGFPhigh» популяция). Более того, эти eGFPhlgh клетки ко-экспрессируют и белок Katushka (рис. 2В, черная стрелка) в подтипах клеток, для которых характерна экспрессия TNF. Таким образом, в системе in vitro представляется возможным детектировать TNF-экспрессирующие клетки миелоидного ряда по продукции флуоресцентных белков в обеих линиях репортерных мышей.

3. Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах костномозговых макрофагов in vitro.

Культуры костномозговых макрофагов являются удобной и распространенной модельной системой для изучения регуляции экспрессии TNF на уровнях транскрипции и трансляции в ответ на TLR4 агонисты (Foster, Nature,2007; Ivashkiv, EJI, 2011).

А.

Б.

0.25-1

cd Н 0.20-

а Н У

о <и Ж 0.15-

т Оч

Я 2

о .я °-10'

И я

а

q 0.05-

0 00-

□ 1ч

ВЗч Шбч Ш8ч

IL iL

TrTNF+/" Ts TNF+/" Tr TNF"'

¿1 о.ю

й Я о*

2 0.05

>я

Я

с 8 а 0.00

Е31ч

ШЗч ГППбч

TrTNF+/" Tr TNF+/" i г TNFJ

В. 3000-, 'S 25002000-U- 1500-

z

H 10005000

ЕЭОч ЕЗ 1ч

ВЗч fTTTil 6ч Щ 8ч

TrTNF^'- Tr TNF+'-Tr TNF-'-

Рис.З Особенности регуляции экспрессии гена TNF, кодируемого трансгенной вставкой, in vitro в культурах костномозговых макрофагов . А. Кинетика продукции мРНК гена TNF костномозговыми макрофагами в ответ на стимуляцию ЛПС. Б. Продукция мРНК гена Katushka костномозговыми макрофагами после стимуляции ЛПС. В. Кинетика накопления белка TNF в среде от макрофагов, с указанным генотипом, после стимуляции ЛПС. ч. - час, количества мРНК были нормализованы на количества мРНК ß-актина.

Чтобы охарактеризовать транскрипционную регуляцию и оценить продукцию TNF, кодируемого трансгенной вставкой независимо от эндогенных аллелей, мыши Kat-TNF были скрещены с мышами, дефицитными по TNF (Kuprash, EJI, 2005). Для получения культур

костномозговых макрофагов использовались гемизиготы по трансгенной вставке, имеющие один аллель TNF дикого типа (Tr+TNF+/"); гемизиготы по трансгенной вставке на генетической основе TNF-дефицитных мышей (Tr+TNF+) и мыши с делецией одного аллеля TNF (Tr"TNF+/"). Как видно из графика на рис. ЗА, относительные количества транскриптов мРНК «трансгенного» TNF и TNF дикого типа имеют схожую кинетику экспрессии с пиком через 1 час после активации ЛПС (100нг/мл), что соответствует опубликованным данным (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Одинаковые количества мРНК Katushka в макрофагах Tr+TNF+/" и Tr+TNFV" говорят о том, что экспрессия мРНК с трансгенной вставки не зависит от наличия или отсутствия эндогенных аллелей TNF (Рис.ЗБ). Снижение транскрипции «трансгенного» TNF может быть связано как с активностью только одной копии трансгена, так и с мозаичной экспрессией трансгена в гомогенной культуре клеток. Количество иммунореактивного TNF в супернатантах от макрофагов Tr+TNF~'~ было сильно снижено по сравнению с макрофагами TNF+/\ Непропорциональное снижение синтеза «трансгенного» TNF будет обсуждено ниже.

А. и, £

Tf*TNF+/-

| щт а НвР**

Tr-TNF+/

Tr+TNFV-

В.

Б.

T1+TNF+/+

Tr-TNF+/-

Katushka

Tr+TNF-/-

19,7 77,9 95,7 1,75 10,6 88,0

fW

1ч Зч 6ч

- eGFP -е- XNF

Katushka

Рис.4 Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах косномозговых макрофагов in vitro. А. Точечные диаграммы, отражающие типичный процент TNF и Katushka экспрессирующих костномозговых макрофагов (показано стрелкой) указанного генотипа после стимуляции ЛПС в течение 9ч. с добавлением брефельдина А. Б. Экспрессия красного флуоресцентного белка в костномозговых макрофагах указанного генотипа после стимуляции ЛПС в течение 24 ч. с добавлением брефельдина А. В. Кинетика изменения интенсивности свечения зеленого репортерного белка и количества внутриклеточного TNF после стимуляции ЛПС Базальный уровень eGFP показан пунктиром. СЗИФ - средние значения интенсивности флуоресценции нормализованные на СЗИФ негативного окрашивания в соответствующем канале детекции, ч.-час

Затем был осуществлен анализ экспрессии красного белка в культуре костномозговых макрофагов после стимуляции ЛПС на проточном цитофлуориметре. Макрофаги выдерживались в течение 9 часов в присутствии брефельдина А (5мкг/мл). Живые клетки

были помечены зеленым витальным красителем CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester). Оказалось, что только часть макрофагов, экспрессирующих TNF, спустя 9 часов после начала стимуляции, помечена белком Katushka (рис.4А, показана стрелкой). Однако, спустя 24 часа после начала стимуляции, количество клеток, помеченных красным репортерным белком, заметно возрастает (рис. 4Б). Совместно с данными транскрипционного анализа (рис.ЗА) данные проточной цитофлуориметрии указывают на запаздывание кинетики появления Katushka+ клеток относительно кинетики биосинтеза эндогенного TNF. Это может быть обусловлено параметрами биосинтеза флуорохрома со сложной мРНК Kat-TNF или замедленной скоростью созревания флуорохрома красного белка. Более того, заниженные количества «трансгенного» TNF в супернатантах от макрофагов можно объяснить замедленной трансляцией мРНК Kat-TNF. Тем не менее, замедленная скорость репортирования в условиях хронической патологии не должна быть помехой для детекции TNF-экспрессирующих клеток.

Макрофаги из eGFP-TNF репортерной линии мышей уже без стимуляции экспрессируют флуоресцентный белок (рис. 4В, пунктирная линия), что, скорее всего, происходит из-за отсутствия AU - богатых участков в З'-нетранслируемой области (Kontoyiannis, Immunity, 1999). Тем не менее, анализ кинетики экспрессии eGFP в ответ на стимуляцию ЛПС показал, что содержание eGFP заметно повышается в ответ на стимул и отражает, правда с небольшим запаздыванием, кинетику продукции TNF как показано на графике на рис.4В.

4. TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки в Kat-TNF мышах, является биологически неактивным.

Как было упомянуто выше, TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки, имеет дополнительные 19 аминокислот на С-конце. Известно, что С-конец TNF важен для формирования биологически активных тримеров цитокнна (Eck J.M., J Biol Chem, 1989) и, соответственно, для эффективной передачи сигнала через TNFPp55 и TNFPp75 (Tartaglia LA, J.Biol.Chem., 1992).

Для оценки биологической активности TNF, экспрессируемого с трансгенной вставки, использовалась линия мышей Kat-TNF на генетическом фоне TNF-дефицитных мышей (Tr+TNF/_). Для in vitro теста цитотоксичности TNF дикого типа и «трансгенного» TNF, супернатанты от стимулированных ЛПС макрофагов из Тг+ TNF'" и TNF+/" мышей инкубировались с клетками WEHI 164 (клон 13) в течение суток. Анализ количества живых клеток показал сниженную цитотоксичность «трансгенного» TNF (рис.5А). Более того, фенотип наивных Tr+TNF"'" мышей полностью соответствовал фенотипу TNF-дефицитных мышей - в селезенках взрослых мышей не созревали кластеры фолликулярных дендритных клеток (рис.5Б). Отсутствие биологической активности трансгенного TNF было также

подтверждено в модели TNF-зависимого септического шока, индуцированного ЛПС (10 мкг/мышь) совместно с D-галактозамином (20мг/кг) (Galanos С., PNAS, 1979): когда концентрация трансгенного TNF в сыворотке составляла летальную для ЛПС/D-галактозамин индуцированной токсичности дозу > Юнг/мл (данные не приведены), все мыши Tr'TNF " выживали (рис. 5В).

А.

TNF дикого типа

Тг TNF-'"

Тг TNF-'"

10 100 1000 TNF пг/мл

0,01 0,1 1 Г" TNF дикого типа

TNF + блокирующие TNF антитела (ЗОмкг/мл) Т антитела против TNF (ЗОмкг/мл) «трансгенный» TNF

I1'2 I 1

к 0,8 ё 0,6

•П- TNF4-'-

/

Тг TNFW

/

В.

0,01 0,1 1 % трансгениьгй TNF

TNF+ блокирующие TNF антитела (ЗОмкг/мл) антитела против TNF (ЗОмкг/мл)

TrTNF-'-Tr TNF-'-TrTNF*'-TrTNF+/+ 4/4 4/4 0/2 0/3

Рис.5 Кодируемый трансгенной вставкой TNF является биологически неактивным. А. Анализ цитотоксичности TNF дикого типа и «трансгенного» TNF. Б. Иммуногистохимическое окрашивание срезов селезенки из наивных мышей на маркер фолликулярных дендритных клеток CR-1 (показано стрелкой). В. График выживаемости мышей разного генотипа после инъекций ЛПС (Юмг/мышь) совместно с D-галактозамином (20мг/мл).

Полученные данные свидетельствуют о том, что TNF, кодируемый трансгенной вставкой, биологически неактивен. Поэтому продукция TNF с трансгенной вставки не создаёт нежелательной сверхэкспресии в репортерных мышах, которая могла бы проявиться в некоторых патофизиологических моделях. Формирует ли «трансгенный» TNF тримеры или же существует в мономерной форме, еще предстоит установить.

5. Характеристика экспрессии флуоресцентных белков и TNF в лимфоцитах репортерных мышей.

TNF из Т-клеток играет роль в антивирусной защите, защите от микобактерий туберкулеза и листерии (вместе с TNF из макрофагов) (Herbein G., Proc.Soc. Exp. Biol. Med, 2000;

Grivennikov S., Immunity, 2005). В некоторых случаях Т-лимфоцитарный TNF важен при развитии аутоиммунных заболеваний (Rruglov, JI, 2011; Kontoyiannis, J.Exp.Med., 2002). В Т- и B-клетках TNF экспрессируется конститутивно на уровне, достаточном для поддержания структуры лимфоидных органов, как это было показано на мышах с делецией TNF специфически в Т- и в В- лимфоцитах (Tumanov, Blood, 2010).

Для изучения соответствия экспрессии флуоресцентных белков и экспрессии TNF клетками адаптивной иммунной системы была проанализирована их продукция в Т- и В- клетках из лимфатических узлов репортерных мышей без стимуляции и в условиях стимуляции ФМА(100нг/мл)/Иономицин (1мкг/мл) (рис.6, и данные для B-клеток не приведены). ФМА/Иономицин представляет собой биохимический аналог активации Т- и В-клеточного рецепторов.

Анализ нестимулированных лимфоцитов из Kat-TNF-репортерных мышей не выявил заметной экспрессии TNF и красного флуоресцентного белка ни в Т-клетках (рис. 6А, Б) ни в B-клетках. Однако, в Kat*eGFP-TNF мышах детектировалась выраженная базальная экспрессия зеленого флуоресцентного белка, как в Т-лимфоцитах (рис. 6 В, серая стрелка) так и в B-лимфоцитах. Причины появления базальной флуоресценции eGFP в нестимулированных иммуноцитах будут рассмотрены в следующей главе.

CD3+ Т-клетки

СРЗ+ Т-клетки

дикии тип

' 0,7 0,1

99,0 0,2

Kat-TNF

кґ

?' 2.І.6 18,6

49,2 8,6

в,

К § +

0 ©

1 s

1 € я

5

о ,

о ©

2 2

= ^

с с; в

СРЗ+ Т-клетки Kat*GFP-TNF

15,8І37,8

23,6122,8

Л щ ¡¡¡І&'

щ щ.

„•- з> ,? :j

0,2 І 0.1

51,7| 48,0

іґ

ш

Katushka

eGFP

Рис.6 Характеристика экспрессии репортерных белков и TNF в CD3+ Т-клетках из репортерных мышей. А. Типичный процент Т-клеток в лимфатических узлах из репортерных мышей и мышей дикого типа. Б. Точечные диаграммы, отражающие экспрессию TNF и красного репортерного белка Т-клетками из Kat-TNF мышей без стимуляции и после стимуляции ФМА/Иономицин, в присутствии брефелъдина А. Стрелкой показана фракция клеток совместно производящая TNF и Katushka. В. Анализ экспрессии TNF и зеленого репортерного белка в ответ на ФМА/Иономицин в лимфоцитах из двойных репортерных мышей. Фракция клеток, экспрессирующих совместно TNF и eGFP показана черной стрелкой. Серой стрелкой показана базальная экспрессия eGFP. Цифрами указан процент клеток в соответствующем квадранте.

На Рис. 6А, Б изображены двумерные графики, отражающие процентное содержание Т-клеток из лимфатических узлов Kat-TNF мышей, производящих TNF и красный репортерный белок после стимуляции ФМА/Иономицином. Из графиков видно, что TNF -экспрессирующая популяция лимфоцитов разделяется на TNF* и Katushka+TNF+ , таким образом, белком Katushka оказывается помечена только часть TNF-производящих Т- клеток (справедливо и для B-клеток). Интересно, что подобный результат был получен и для Kat*eGFP-TNF-penopTepHbix мышей (рис.бВ, и данные для B-клеток не приведены). На точечных диаграммах рис.бВ та фракция TNF-экспрессирующих Т-клеток, которая помечена зеленым флуоресцентным белком, показана черной стрелкой.

Еще одной особенностью экспрессии eGFP в лимфоцитах Kat*eGFP-TNF мышей является то, что значения интенсивности зеленого свечения после стимуляции не превышают уровня максимальной шггенсивности базальной экспрессии eGFP, как в случае с макрофагами (рис.2Б). Не исключено, что это явление связано с разной ролью AU-богатых участков в регуляции в лимфоцитах и миелоидных клетках. То, что eGFP аккумулируется в лимфоцитах в меньшей степени, чем в макрофагах, может помешать отличить стимулированные клетки от нестимулированных, например, при сортировке маркированных TNF-экспресирующих клеток или при микроскопическом анализе.

Таким образом, экспрессия зеленого и красного репортерных белков отражает экспрессию TNF, но только в определенной фракции лимфоцитов в определенный момент времени, что предположительно связано с разной кинетикой экспрессии TNF, eGFP и Katushka. То есть, в то время как некоторые количества эндогенного TNF уже синтезированы, красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок только начинают экспрессироваться, либо с неким опоздаш!ем происходит созревание флуорохрома в составе маркерных белков.

6. Выраженная базальная экспрессия eGFP коррелирует с транскрипцией TNF.

Анализ наивных Kat*eGFP -TNF мышей показал базальную экспрессию eGFP в лимфоцитах (рис.бВ и данные не приведены). Наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что флуоресцентным белком метятся В- и Т-клетки, которые гомеостатически производят TNF, необходимый для поддержания микроархитектуры вторичных лимфоидных органов. С другой стороны, не все регуляторные элементы были включены в конструкцию для eGFP-TNF линии мышей, а именно отсутствует AU-богатый участок в З'-нетранслируемой области. В работах лаборатории Дж. Коллиаса было показано, что при удалении AU-богатого участка в З'-нетранслируемой области гена TNF, пропорционально (линейно) увеличивается экспрессия мРНК цитокина, увеличивается трансляция белка (иногда без стимуляции), так же происходит незначительная эктопическая экспрессия цитокина

(Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Дальнейшей задачей стало выяснить, насколько выраженная базальная экспрессия eGFP отражает синтез TNF в наивных мышах при нарушенной регуляции трансгенной вставки.

Для характеристики базальной экспрессии TNF и зеленого белка в лимфоцитах, из пула CD4 Т-клеток eGFP-TNF мышей были очищены разные по интенсивности зеленой флуоресценции подгруппы клеток. Были получены: "eGFPneg" - популяция без зеленой флуоресценции; две "eGFPmtl" и "eGFPmt2" группы с промежуточной интенсивностью свечения eGFP, и "eGFPh,gh" - популяцию с высокой интенсивностью флуоресценции зеленого репортерного белка. После анализа уровня транскрипции гена TNF и зеленого флуоресцентного белка, оказалось, что в eGFPh,sh популяции экспрессируется больше всего TNF мРНК и мРНК eGFP (рис.7А). Таким образом, данные на рис.7А показывают линейную корреляцию активности транскрипции TNF и активности транскрипции eGFP , которая, в свою очередь, соответствует интенсивности свечения eGFP.

А. С04+Т-клетки „„,, „„„,

пея rntlinl

high

20,0 29,1 16,1 5,4

eGFP

С04+Т-клетки

neg intl int2 high

CD44"CD62L+

\ CD44- CD62L" \ \ CD44*CD62L+

neg Intl Int2 high

CD44

eGFP

eGFP

Рис.7 Базальная экспрессия eGFP коррелирует с транскрипцией TNF в наивных мышах. А. На

точечной диаграмме показана стратегия выделения отдельных субпопуляций CD4+ Т-клеток отличающихся по интенсивности eGFP. На графиках представлен анализ количеств транскриптов мРНК TNF и мРНК eGFP. Количества мРНК были нормализованы на количества мРНК ß-актина Б. Стратегия выделения популяций Т-клеток представлена на точечной диаграмме. Распределение интенсивности eGFP в разных субпопуляциях Т-клеток показано на гистограмме. В. На гистограмме отражено распределение интенсивности eGFP в разных субпопуляциях Т-клеток, без стимуляции и после стимуляции ФМА/Иономицин. Тх1 - Т-хелперные клетки 1 типа, Тх2 - Т-хелперные клетки 2 типа.

Параллельно, была проанализирована картина экспрессии eGFP в разных популяциях суммарных CD4" Т-клеток из лимфоидных органов eGFP-TNF мышей. Как видно из рис.7Б, средние значения интенсивности флуоресценции зеленого белка неравномерно распределены среди разных видов Т- клеток. Эффекторные (CD44*CD62L~) и центральные (CD44+CD62L+) CD4 Т-клетки памяти производят больше eGFP, чем наивные Т-клетки, что соответствует их способности немедленно и эффективно производить TNF при повторной встрече с антигеном. Такая специфичность в интенсивности синтеза зеленого флуоресцентного белка разными популяциями еще раз указывает на то, что уровень eGFP отражает интенсивность транскрипции мРНК TNF.

Дополнительным аргументом в пользу того, что интенсивность eGFP отражает потенциальную способность клеток производить мРНК TNF, является анализ поляризованных in vivo Т-хелперных (Тх) клеток 1-го и 2-го типа (рис.7В). Базальная интенсивность флуоресценции eGFP в Тх2 клетках воспроизводимо на порядок ниже, чем в Тх1 клетках. Из литературы известно, что Тх2 клетки производят значительно меньше TNF (Chiang Е, Nat. Med.,2009) и TNF мРНК (Cherwinski et al. J.E.M. 1987), чем Txl. Механистически, в геноме Txl и Тх2 при «поляризации» (под управлением транскрипционных факторов T-bet и GATA3, соответственно) происходит ряд эпигенетических модификаций, что, по-видимому, приводит к стойким различиям в активности транскрипции гена TNF в двух субпопуляциях Т-клеток.

Суммируя все сказанное, можно предположить, что интенсивность свечения eGFP отражает интенсивность транскрипции TNF в клетках из наивных неиммунизоваиных мышей. В результате Kat*eGFP-TNF модель позволяет увидеть сигнал репортерного белка в тех клетках, в которых при налишш всех рсгуляторных элементов интенсивность транскрипции гена TNF невелика. Фактическая экспрессия цитокина такими клетками в каждом случае требует экспериментальной проверки.

7. « Гомеостатичсская» экспрессия репортерных белков.

В работах Б. Бойтлера в начале 90-х годов прошлого столетия с использованием CAT-TNF репортерной модели была выявлена экспрессия TNF в тимусе из наивных мышей. Дальнейшие исследования показали, что TNF преимущественно экспрессируется в корковом слое тимуса на стадиях дифференцировки двойных негативных предшественников (Double Negative, DN). Во время созревания DN тимоциты проходят несколько стадий, охарактеризованных определенным сочетанием антигенных маркеров на поверхности клеток: DN1=CD44"CD25", DN2=CD44+CD25+, DN3=CD44"CD25\ DN4=CD44"CD25" (рис.8А). В работе Godfrey D, JI, 1993 было определено, что на разных стадиях созревания тимоциты имеют разную потенциальную способность экспрессировать белок TNF после

стимуляции ФМА/Иономицин: DN1>DN2>DN3>DN4. В работе нашей лаборатории Liepinsh.EJI 2009 бьша продемонстрирована аналогичная корреляция продукции мРНК TNF на стадиях созревания лимфоцитов и биологическая роль белка TNF при переходе клеток коры тимуса из DN1 в DN2.

При анализе тимоцитов из Kat*eGFP-TNF мышей выяснилось, что интенсивность eGFP на стадиях созревания DN популяции тимоцитов коррелирует со способностью клеток экспрессировать мРНК TNF. В свою очередь, экспрессия красного репортерного белка не детектировалась в тимоцитах из Kat-TNF мышей при анализе методом проточной цитофлуориметрии (данные не приведены). Таким образом, при анализе экспрессии TNF в тимусе репортерная система Kat-TNF имеет меньшую чувствительность, чем Kat*eGFP-TNF.

А.

CD4

Б. Си 120.0

и.

О 100.0

<и

0 80.0

S

го

и 60.0

X

X m 40.0

о

& 20.0

0.0

Л

! ;! 1 -Ц . — -

j; \ —

.о5- 16.5 DN1 DN2

10 | •■А?--

Vo'

IG" ■ Щ

18,5 DN4 DN3 TT

Q 10 'Л

щр в

52,0

CD25

Показаны сфТОГ CD4" CD44^CD62L"T клетки

DN1DN2DN3DN4koht

дикий тип Kat-TNF

Рис.8 «Гомеосгатическан» экспрессия eGFP и Katushka в наивных ренортерных мышах. А.

Точечные диаграммы демонстрируют стратегию выделения двойной негативной фракции тимоцитов (DN). Цифрами указан типичный процентный состав популяций тимоцитов. Б. На графике приведены значения СЗИФ на стадиях созревания тимоцитов , нормализованные на интенсивность eGFP негативных клеток. В. На графике приведен процент % Katushka* клеток среди CD4*CD44+CD62L' Т-клеток, выделенных из пейеровых бляшек.

Регуляция экспрессии TNF в кишечнике в норме и ее изменение при патологиях является предметом активного изучения, поскольку её нарушение е приводит к развитию ряда воспалительных заболеваний (болезни Крона, язвенного колита). Следует отметить, что клетки слизистой кишечника (в отличие от клеток из вторичных лимфоидных органов) находятся в условиях постоянной стимуляции пищевыми антигенами и продуктами

бактериальной флоры кишечника (Suzuki К, Annu.Rev.Immunology, 2009). При исследовании клеток пейеровых бляшек (ПБ) кишечника Kat-TNF мышей удалось обнаружить экспрессию красного репортерного белка в активированных Т-клетках (рис.8В). Способность клеток пейеровых бляшек спонтанно экспрессировать другие провоспалительные цитокины была показана в ряде других работ (Monteleone G, JI, 2003).

В результате, на примере тимуса и ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани было продемонстрировано, что обе линии репортерных мышей в дальнейшем могут быть использованы для изучения физиологии TNF в наивных, неиммунизованных мышах с использованием методов проточной цитометрии.

В Kat*eGFP-TNF мышах гистологически была выявлена компартментализация eGFP+ клеток. Однако, в связи с ограничениями чувствительности методов микроскопии, видны только самые яркие клетки-продуценты eGFPhlgh. В селезенках eGF?1"8'1 клетки преимущественно расположены в Т-клеточной зоне, тогда как в B-клеточной зоне клетки имеют менее интенсивную зеленую флуоресценцию ( рис. 9А, верхняя панель). Интересно, что яркие клетки из Т- клеточных зон не являются CD3+ Т-лимфоцитами (рис.9А, в центре, желтая стрелка), их фенотип необходимо уточнить дополнительно - судя по морфологии, это могут быть дендритные клетки, клетки стромы или макрофаги.

Фенотип клеток, меченых eGFP в ПБ отличается от такового в селезенках. Большое сосредоточение eGFPhlEh клеток опять же приходится на Т-клеточные зоны ПБ (рис. 9А, нижняя панель), однако CD3* Т-клеткн оказываются помечены зеленым репортерным белком (рис. 9А, в центре, белые стрелки). Кроме того, B-клетки имеют более высокую экспрессию зеленого флуоресцентного белка (рис. 9А, справа, голубые стрелки), чем в селезенке (рис. 9А, верхняя панель, справа). Повышенный синтез eGFP и, предположительно, активность транскрипции TNF в Т- и B-клетках из ПБ соответствует их более активированному состоянию, по сравнению с лимфоцитами из селезенок. На рис.9Б (белые стрелки) показано, что сильными eGFP-продуцентами являются также клетки, индуцирующие развитие лимфоидных тканей (lymphoid tissue inducer cells, LTIC) с фенотипом Thy+CD3"B220", сосредоточенные в лимфоидных бляшках оснований крипт. Приведенные данные подтверждает активную транскрипцию TNF LTIC собственной пластинки слизистой кишечника взрослых мышей (Tsuji М., Immunity, 2008). Важно отметить, что Katushka не детектировалась микроскопически в органах из наивных Kat-TNF мышей (данные не приведены). Наши гистологические данные говорят о том, что Kat*eGFP-TNF репортерная модель является инструментом для скрининга TNF-экспрессирующих клеток в наивных мышах методами микроскопии, которые особенно важны для изучения стромапьных компонентов. Однако при таком анализе необходимо учитывать нарушения регуляции eGFP и подтверждать экспрессию TNF другими методами. Совокупность

гистологических данных, полученных при анализе кишечника Kat*eGFP-TNF мышей, и данные проточной цитофлуориметрии лимфоцитов из пейеровых бляшек Kat-TNF мышей позволяют сделать вывод о том, что Т-клетки из пейеровых бляшек кишечника «гомеостатически» производят TNF, не вызывающий спонтанного воспаления.

общий вид

В-клеточная зона

Рис.9 Иммунофлуоресцентный гистологический анализ еСГРЫ81' клеток на срезах органов двойных-репортерных мышей. А. иммунофлуоресцентный анализ срезов селезенок(верхняя панель) и пейеровых бляшек (нижняя панель) перечислено слева-направо: общий вид, Т-клеточная зона, В-клеточная зона Б. Иммунофлуоресцентный анализ бляшек оснований крипт, перечислено слева-направо: общий вид распределение еОРР экспрессирующих клеток в собственной пластинке кишечника и в бляшках оснований крипт,еОРР производится в ТИу+СОЗ" клетках, еОИР производится в ТЬу*В220" клетках.

GFPB220CD3 В - B-клеточная зоная Т - Т-клеточная зона

Т-клеточная зона

8.Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo.

Для того, чтобы охарактеризовать экспрессию TNF и репортерного белка в Kat-TNF линии in vivo, были использованы модели, в которых TNF является основным патогенным фактором: модель септического шока, вызванного инъекцией бактериального эндотоксина (ЛПС, 50 мкг/мышь) и КонА (20 мг/кг) - опосредованной гепатотоксичности. Данные по Кон А-индуцированной гепатотоксичности приведены в главе 8 полного текста диссертации.

Продукция патогенного TNF в этих моделях была ранее охарактеризована в нашей лаборатории (Grivennikov S, Immunity, 2005). В частности, было показано, что при ЛПС-токсичности TNF, производимый макрофагами/нейтрофилами, играет патогенную роль.

На рис.ЮА приведены точечные диаграммы, отражающие совпадение экспрессии TNF и красного репортерного белка в клетках селезенки в ответ на системное введение ЛПС (показано стрелкой). Клетки селезенки выделялись через час после индукции эндотоксического шока и для накопления детектируемых количеств TNF в эндоплазматическом ретикулуме инкубировались в течение 6 часов вместе с брефельдином А (5 мкг/мл) in vitro.

А./

ÜH

Z _клетки инкубировались с Брефельдином А в течение 5 часов

Kat -TNF (ЛПС)

TNF -дефицитные

Kat-TNF(cDB) Ш'

дикий тип (ЛПС)

»

Katushka

2. CD 11 bh¡ehLy6Clm 3. CD 11 b+LyöC1™ нейтрофилы ^ макрофаги

1. CDl lb+Ly6Chlsh воспалительные ■и макрофаги___

Рис.10 Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo. А. Точечные диаграммы, характеризующие экспрессию TNF и красного репортерного белка клетками селезенки после введения ЛПС мышам указанного генотипа. Клетки селезенки инкубировались с брефельдином А в течение 5 часов. Б. Анализ фенотипа клеток, экспрессирующих Katushka, среди свежевыделенных спленоцитов, через час после инъекций ЛПС. Стрелками указана продукция красного флуоресцентного белка. ФБ - фосфатный буфер

В свою очередь, анализ живых клеток селезенки, выделенных через час после внутрибрюшинных инъекций ЛПС, который представлен на рисунке 10Б, позволил определить фенотип Katushka- экспрессирующих клеток. Флуорохромом были специфически маркированы нейтрофилы (CD 11 b+Ly6Clow) и воспалительные макрофаги (CD 11 b+Ly6Chlgh), которые соответствуют TNF-экспрессирующим популяциям. Эти клеточные субпопуляции, поскольку остаются живыми, могут быть выделены и использованы для транскриптомного анализа.

В другой in vivo модели экспериментального энцефаломиелита, в которой TNF играет защитную роль, анализ Kat-TNF мышей проводился методом двухфотонной микроскопии. Микроскопическое исследование в спинном мозге живых экспериментальных животных позволило наблюдать подвижные клетки в составе воспалительных инфильтратов, которые были помечены красным флуоресцентным белком. Таким образом, Kat-TNF репортерная линия мышей позволяет наблюдать динамику, распределение и межклеточные контакты маркированных красных флуоресцентным белком TNF-продуцентов in vivo. Дальнейшие наблюдения за динамикой красных клеток и характеристика фенотипа этих клеток предстоит в будущем.

В результате Kat-TNF модель позволяет достоверно определить клетки, экспрессирующие TNF in vivo. Более того, отсутствие базальной экпрессии красного репортерного белка в Kat-TNF мышах позволяет с большей точностью, чем в eGFP-TNF репортерной модели, определить индуцированную экспрессию TNF, что делает эту модель оптимальной для микроскопии in vivo.

выводы

1. Получены и охарактеризованы две новых линии TNF-репортерных мышей, с красным белком Katushka и двойные репортерные мыши с красным и зеленым флуоресцентными белками Kat*eGFP-TNF.

2. Анализ миелоидных клеток обеих линий репортерных мышей показал достоверное маркирование TNF-экспрессирующих клеток флуоресцентными белками после активации ЛПС. При этом регистрировалась нормальная транскрипционная регуляция продукции мРНК Kat-TNF в культурах костномозговых макрофагов.

3. По экспрессии флуоресцентных белков определяется фракция TNF-экспрессирующих лимфоцитов из обеих линии репортерных мышей. Детекция флуоресцентных белков только в части трансгенных лимфоцитов связана с разной кинетикой экспрессии флуоресцентных белков и цитокина.

4. TNF, кодируемый трансгенной вставкой Kat-TNF, является биологически неактивным. Нарушение биологической активности происходит в результате присоединения 2А-пептида на С-конец белка, который важен для взаимодействия с рецептором цитокина. Поэтому Kat-TNF мыши продуцируют нормальные уровни биологически активного TNF.

5. Интенсивность базалыюй флуоресценции eGFP в иммуноцитах из неиммунизованных, наивных eGFP-TNF мышей отражает активность транскрипции гена TNF в разных клеточных субпопуляциях.

6. Т-клетки из Пейеровых бляшек в наивных, неиммунизованных мышах конститутивно производят TNF. Модель Kat*cGFP-TNF пригодна для гистологического скрининга TNF-экспрессирующих клеток в наивных неиммунизованных мышах.

7. TNF-экспрессирующие клетки детектируются по экспрессии флуоресцентного белка Katushka в in vivo моделях с Kat-TNF мышами при помощи проточной цитофлуориметрии и двухфотонной микроскопии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1) Кучмий А.Л.. Круглое А.А., Галимов А.Р., Шебзухов Ю.В., Чудаков ДМ., Лукьянов С.А., Недоспасов С.А. Новая линия трансгенных репортерных мышей для изучения экспрессии Фактора Некроза Опухолей // Российский имунологический журнал, Том5(14), №3-4 2011 с 205215

2) Kruglov A.A., Kuchmiv А.А.. Grivennikov S.I., Tumanov А. V., Kuprash D. V., Nedospasov S.A. Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: mouse models // Cytokine Growth Factor Rev. 2008 Jun-Aug l9(3-4):p231-44.

3) Liepinsh D.J., Kruglov A.A., Galimov A.R., Shakhov A.N., Shebzukhov Y. V., Kuchmiv A.A.. Grivennikov S. /., Tumanov A. V., Drutskaya M.S., Feigenbaum L„ Kuprash D. V., Nedospasov S.A. Accelerated thymic atrophy as a result of elevated homeostatic expression of genes encoded by TNFMymphotoxin cytokine locus // Eur J Immunol. 2009 39(10):2906-15.

4) Kruglov A.A., Tumanov A.V., Grivennikov S.I., Shebzukhov Y.V., Kuchmiv A. A.. Efimov G.A., Drutskaya M.S., SchellerJ., Kuprash D. V„ Nedospasov S.A. Modalities of experimental TNF blockade in vivo: mouse models //Adv Exp Med Biol. 2011;691:421-31.

Тезисы конференций

П Kuchmiv A.A.. Kruglov A.A.. Kuprash D.V., Chudakov D.M.,. Lukyanov S.A, Nedospasov S.A. New TNF reporter mouse with red fluorescent protein Katushka. 13th international TNF conference: TNF2011. Hyogo, Japan, May 15-18, 2011.

Благодарности

Работа была выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".

Подписано в печать 18.05.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1224 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кучмий, Анна Александровна, Москва

61 12-3/1297

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

; i A. i...

ч '

Кучмий Анна Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ЛИНИЙ РЕПОРТЕРНЫХ МЫШЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ

IN VIVO И IN VITRO

(03.04.03 - молекулярная биология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор С.А.Недоспасов

Москва-2012

Список сокращений

ТОР - фактор некроза опухолей

йпЮТ - трансмембранная форма фактора некроза опухолей

ЬТ -лимфотоксин

ТОРКр55 - рецептор фактора некроза опухолей 1 - рецептор фактора некроза опухолей 2 №N7 - интерферон гамма

1Ь - интерлейкины

^ё - иммуноглобулины изотипов М, А, О

ЛПС - липополисахарид (бактериальный эндотоксин)

Ка^ТЫР - линия репортерных мышей, в которых экспрессия ТОБ

сопровождается экспрессией красного флуоресцентного белка КаШэЬка еОРР-ТЫБ - линия репортерных мышей, в которых экспрессия зеленого

флуоресцентного белка евРР регулируется промотором гена ЮТ

Ка^еОРР-ТЫР — двойные ТЫР-репортерные мыши с красным и зеленым флуоресцентными белками в качестве меток

Оглавление

Введение........................................................................................................................................5

Обзор литературы.......................................................................................................................7

Методы флуоресцентной визуализации......................................................................................7

Разнообразие методов флуоресцентной визуализации для исследований in vivo................8

Флуоресцентные белки в качестве молекулярных меток.......................................................11

Методы направленного флуоресцентного мечения клеточных и молекулярных

мишеней...................................................................................................................................13

«Репортерные» линии экспериментальных животных для биологических исследований. 15

Репортерные линии мышей с флуоресцентной меткой для изучения биологии TNF..........23

Общие сведения о Факторе Некроза Опухолей: структура белка, регуляция биосинтеза

цитокина, рецепторы TNF.....................................................................................................25

Мышиные модели для изучения функций TNF in vivo...........................................................37

Биологические функции TNF и актуальные вопросы биологии TNF....................................39

Преимущества «репортерных» линий мышей с флуоресцентным белком в качестве

метки для изучения биологии TNF.......................................................................................49

Материалы и методы................................................................................................................52

Результаты и их обсуждение...................................................................................................61

1. Получение и отбор линии трансгенных TNF-репортерных мышей......................61

2. Экспрессия репортерных белков и TNF в миелоидных клетках репортерных мышей in vitro.....................................................................................................................65

3. Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах костномозговых макрофагов in vitro.............................................................................................................67

4. TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки в Kat-TNF мышах, является биологически неактивным................................................................................................71

5. Экспрессия флуоресцентных белков и TNF в лимфоцитах репортерных мышей.. 73

6. Базальная экспрессия eGFP коррелирует с активностью промотора и уровнем транскрипции гена TNF.....................................................................................................77

7. « Гомеостатическая» экспрессия репортерных для TNF белков..............................85

8. Использование TNF-репортерных мышей для гистологического анализа клеток, экспрессирующих TNF......................................................................................................88

9. Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo..............................................91

Заключение.......................................................................................96

Выводы.......................................................................... _ дд

Список литературы ................................................................................................................Ю1

Введение

Визуализация отдельных молекул и клеточных популяций широко используются в изучении биологических процессов на молекулярном уровне. Особую роль для изучения биологических процессов играют флуоресцентные методы визуализации. Флуоресцентные белки, будучи экспрессированными под контролем регуляторных элементов белка-мишени в составе репортерной конструкции, делают возможным оптическое наблюдение за экспрессией белка-мишени in vivo и in vitro. Технически использование именно флуоресцентных меток, в отличие от изотопных или люминесцентных меток, позволяет использовать комбинированно большое количество методов флуоресцентного анализа, имеющих высокое разрешение (на уровне клетки и субклеточном уровне), например, микроскопию совместно с цитофлуориметрией и клеточной сортировкой.

Благодаря внедрению репортерной конструкции в организм лабораторных мышей был создан ряд так называемых «репортерных» линий - когда экспрессия определенной молекулы (транскрипционный фактор, белок адгезии, хемокин, цитокин и пр.) сопровождается экспрессией флуоресцентного белка in vivo. В результате подробного анализа репортерных линий животных современными флуоресцентными методами стало возможным проследить происхождение, дифференцировку, пролиферацию, выживание и локализацию клеток, экспрессирующих изучаемый белок, и показать механизм участия этих клеток при развитии патологий.

Благодаря появлению новых технических решений, визуализация биологических объектов претерпела качественный переход от получения отдельных статических изображений к наблюдению за динамикой клеточных событий в организмах живых репортерных животных в реальном времени in vivo. Важнейшее и уникальное свойство визуализации in vivo - это возможность неинвазивно (или микроинвазивно) в условиях,

приближенных к физиологическим, получать изображение и наблюдать динамику клеток внутри органов и тканей, анализировать процессы их миграции и, самое главное, отслеживать межклеточные контакты. Этот подход активно развивается и успешно применяется для фармакологических и медико-биологических исследований моделей человеческих заболеваний на экспериментальных животных.

Использование репортерных линий лабораторных животных является популярным подходом для изучения биологии цитокинов in vivo. Цитокины представляют собой биологически активные пептидные продукты секреции клеток, которые обеспечивают формирование иммунной системы и согласованность функционирования ее компонентов в нормальных условиях и при патологических воздействиях. Как правило, один цитокин производит ся разными клеточными популяциями и может оказывать разнообразные биологические эффекты. Главным преимуществом использования «репортерных» линий при изучении цитокинов является возможность идентификации и очистки живых клеток-продуцентов цитокина, а также наблюдение за ними in vivo, что было недоступно ранее.

Значительный интерес представляет собой создание репортерных линий мышей для изучения биологии фактора некроза опухолей (Tumor Necrosis Factor, TNF), поскольку остается нерешенным ряд вопросов об экспрессии TNF в норме и при развитии патологий. TNF является важным провоспалительным цитокином, который играет ключевую роль в защите от внутриклеточных патогенов и в гомеостазе микроструктуры вторичных лимфоидных органов. С другой стороны, TNF представляет собой медиатор хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Создание репортерных линий мышей с флуоресцентной меткой для маркирования клеток, экспрессирующих фактор некроза опухолей, позволит

идентифицировать клеточне источники TNF и проводить исследования по физиологии TNF недоступными прежде методами в норме и при патологиях. Обзор литературы.

Методы флуоресцентной визуализации.

Методы оптической визуализации позволяют наблюдать за распределением биомолекул и молекулярными событиями при помощи меток, испускающих фотоны оптического диапазона (Massoud and Gambhir 2003). По принципу получения оптических фотонов эти методы подразделяются на биолюминесцентный и флуоресцентный.

При флуоресцентной визуализации внешний свет определенной длины волны возбуждает флуоресцентные молекулы-мишени, способные в ответ испускать фотоны с большей длиной волны (и, соответственно, меньшей энергией), последние, в свою очередь, регистрируются детектором (Luker and Luker 2008). Возможна детекция флуоресценции как от эндогенных молекул (коллаген, гемоглобин, НАДФ) (Monici 2005), так и от искусственно внедренных в организм или клетку флуоресцентных белков и флуорофоров. Заметное преимущество флуоресцентных методов визуализации перед другими методами оптического наблюдения в том, что одновременно могут регистрироваться множество проб с различными спектральными характеристиками. Явление флуоресценции от искусственно введенных меток (для молекул-мишеней) широко используется для исследований in vitro и ex vivo в молекулярной и клеточной биологии с использованием большого разнообразия методик: флуоресцентной микроскопии, аналитической проточной цитофлуориметрии, сортировки флуоресцентных клеток, конфокальной микроскопии на срезах и пр. Совершенствование методов флуоресцентной визуализации происходит в трех основных направлениях (Кучмий et al. 2012), развернутое описание которых представлено в следующих главах:

1. Во-первых, технологическое совершенствование инструментальных методов флуоресцентного анализа. Новые приборы позволяют с большим разрешением различать одновременно несколько флуоресцентных меток в толще тканей в реальном времени.

2. Во-вторых, получение новых флуоресцентных меток с улучшенными характеристиками, то есть расширение спектра цветов и совершенствование биофизических параметров флуорохромов: яркость, фотостабильность, pH стабильность и пр.

3. В-третьих, разработка новых молекулярно-биологических подходов для введения флуоресцентных меток в организм. Наиболее перспективный подход - это внедрение генетической последовательности метки в геном организма под контролем специфических для молекулы-мишени регуляторных элементов, что позволяет визуализировать определенные субпопуляции клеток in vivo.

Разнообразие методов флуоресцентной визуализации для исследований in vivo

Технологически новым шагом в области флуоресцентной визуализации была адаптация флуоресцентных методов анализа для исследований in vivo и наблюдением биологических процессов в реальном времени внутри живого организма Разные методы флуоресцентной визуализации in vivo имеют различное разрешение, чувствительность и максимальную глубину детекции. Для анализа на организменном уровне с пространственным разрешением 1-3 мм была разработана флуоресцентная томография (Graves et al. 2003). Сочетание флуоресцентной визуализации in vivo с оптоакустическими методами, а также с методами KT и МРТ позволило существенно улучшить разрешение и глубину наблюдения (Davis et al. 2008). В частности мультиспектральная оптоакустическая томография (МСОТ), основана на регистрации акустических волн, возникающих в результате поглощения сверхкоротких импульсов

света (1-100 не) молекулами флуорофоров. Спектр поглощения молекул-мишеней для детекции методом МСОТ должен находиться в отличной от фонового поглощения (гемоглобин, меланин, липиды, вода) области, т.е. должен находится в красной и дальне-красной области спектра и иметь другую форму. Для количественного анализа пробы глубоко в тканях (>100 мкм) в МСОТ применяют сложные алгоритмы, учитывающие проводимость тканей для света. Таким образом, мультиспектральная оптоакустическая томография делает возможным изучение образцов до 1 см в размере (диаметр) с пространственным разрешением ЮОмкм (Ntziachristos and Razansky 2010). В настоящий момент опубликовано много примеров применения МСОТ для визуализации у рыб, мелких млекопитающих и даже в применении к человеку.

Микроскопия in vivo в настоящий момент обладает, пожалуй, наилучшими техническими характеристиками, и позволяет прижизненное наблюдение молекул-мишеней на клеточном уровне и субклеточном уровне (<200 мкм) (Denk et al. 1990;Niesner and Hauser 2011).

Принципы многофотонной флуоресцентной микроскопии in vivo.

Микроскопия in vivo или «интравитальная» микроскопия - представляет собой разновидность флуоресцентной микроскопии, в которой осуществляется детекция метки в живых экспериментальных животных в реальном времени (Niesner and Hauser 2011;Weigert et al. 2010). Важно отметить, что микроскопия in vivo требует хирургических операций под действием анестезии, что накладывает некоторые ограничения, связанные с наркозом, гипоксией, гипотермией или послеоперационным восстановлением (Germain et al. 2006). Наиболее широко распространенным подходом для микроскопии in vivo высокого разрешения является многофотонная оптическая микроскопия.

Многофотонная оптическая микроскопия (МФМ) основана на том, что молекула флуорофора может быть возбуждена одновременной (или почти одновременной в диапазоне атто- и фемто- 10"18 - 10"15 с ) абсорбцией двух (или даже трех) фотонов которые имеют половину (или треть) той энергии, которая необходима для возбуждения и перехода на более высокий энергетический уровень (Denk et al. 1990). Таким образом, для мультифотонного возбуждения используются дальнекрасные и инфракрасные длины волн, обладающие лучшей способностью проникать в ткани, чем ультрафиолетовый или видимый свет. Действительно, если конфокальная микроскопия может давать изображение на глубине 50-60 мкм, то для мультифотонной микроскопии этот диапазон может быть увеличен до 300 мкм - 1мм (особенно для тканей с низким рассеянием, например, для мозга). Вероятность возникновения многофотонных переходов достаточно низка, поэтому необходима большая концентрация света, как во времени, так и в пространстве. Это достигается путем использования лазеров, которые излучают дальне- и инфракрасный свет очень короткими импульсами (100 фс), с большой частотой (80-100 МГц) и с использованием многочисленных апертурных линз для фокусировки света в точке возбуждения. Абсорбция и эмиссия при многофотонном возбуждении возникает в малом объеме (1фл) снижая, таким образом, фототоксичность и фототушение остальных объемов, и ограничивая эмиссию вне фокуса. Кроме того, для всех охарактеризованных флуорофоров спектр мультифотонной абсорбции намного шире, чем при однофотонном возбуждении, что делает возможным визуализацию нескольких флуорофоров при одной длине волны возбуждения (Weigert et al. 2010),

Часто мультифотонная микроскопия сопряжена с генерацией второй гармоники (ГВГ). ГВГ— это нелинейный оптический процесс, во время которого фотоны, в результате взаимодействия с молекулами определенной структуры, эффективно

комбинируются в новые фотоны с удвоенной энергией (с большей в два раза частотой и половинной длины волны). Так, вторая гармоника в тканях появляется при взаимодействии света с коллагеном, микротрубочками, миозином и липидными тельцами. Таким образом, при мультифотонном возбуждении тканей одновременно с эмиссией молекул мишеней может быть зарегистрирована вторая гармоника от капсулы органа с высоким содержанием коллагена. Определение положения капсулы органа помогает отслеживать глубину исследования в толще органа (Weigert et al. 2010;Кучмий et al. 2012).

Существуют сравнительно новые подходы с использованием оптоволоконных эндоскопов в сочетании с двухфотонной микроскопией, которые позволяют осуществлять анализ в труднодоступных областях организма, как например, визуализация в желудочнокишечном тракте (Polglase et al 2005).

Флуоресцентные белки в качестве молекулярных меток.

Революцию в визуализации клеток произвело открытие, клонирование и экспрессия

зеленого флуоресцентного протеина (GFP) из медузы Aequorea victoria (Chalfie et al. 1994). GFP принимает нативную конформацию и образует флуорофор без добавления дополнительных кофакторов (кроме 02) внутри клеток разных организмов, что делает этот белок практически универсальным внутриклеточным маркёром. GFP представляет собой лишь один пример целого семейства гомологичных флуоресцентных белков (ФБ), полученных из морских кишечнополостных. Флуоресцентные белки, будучи экспрессированными под контролем регуляторных элементов белка-мишени в составе генетической репортерной конструкции, делают возможным оптическое наблюдения за экспрессией белка-мишени in vivo и in vitro.

Основными ограничениями в случае прижизненной флуоресцентной визуализации являются поглощение света гемоглобином и меланином, и рассеяние света тканями

организма, что снижает количественную оценку в глубине тканей (Contag et al. 1995). Мутагенез ФБ в лабораторных условиях позволил преодолеть эти ограничения, а именно были развиты стратегии визуализации белков с эмиссией в наиболее «прозрачном», с точки зрения прохождения света через ткани, диапазо�