Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях

Мороз, Максим Аркадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях"

Мороз Максим Аркадьевич

Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

4841772

Работа выполнена в научно-клиническом отделе Федерального Государственного учреждения Федерального научно-клинического Центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Министерства здравоохранения и социального развития России (ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития РФ) и в лаборатории нейроонкологии по программе неинвазивной визуализации_ге-нов, Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического центра, Нью-Йорк, США (МСКОЦ)

Научные руководители:

Член-корр. РАМН, д.м.н., проф. А. Г. Румянцев

Проф. Р. Д. Бласберг

Официальные оппоненты:

д.б.н. Э.А. Брага

д.б.н., проф. П.М. Рубцов

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

заседании диссертационного Совета Д (

пени доктора и кандидата наук в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32)

Защита диссертации состоится «

Автореферат разослан «

// .цфаХ-

2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного кандидат химических наук

Список сокращений

чНАТ МИБГ ОФКТ ПЭТ ВЭБ

ШЕТ-ШЕБ-ОРР:

ЫЧЕТ человеческий норадреналиновый транспортер

ГОЕБ внутренний участок присоединения рибосомы

вБР зеленый флуоресцирующий белок

КРС сыворотка крупного рогатого скота

БЛВ биолюминесцентная визуализация

ЕАСБ проточная цитофлуорометрия

чНИС человеческий сгш-транспортер натрия и йода

НА Норадреналин

человеческий норадреналиновый транспортер мета-йод-бензил-гуанидин комплекс однофотонная компьютерная томография позитронно-эмиссионная томография вирус Эпштейн-Бара

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время метод молекулярной визуализации («molecular imaging») является одним из наиболее перспективных методов анализа на молекулярном уровне патологических процессов in vivo в злокачественных новообразованиях. По мере развития этого метода все большее значение приобретает его клиническое использование как для диагностики, так и лечения онкологических заболеваний. Более того, методы молекулярной визуализации являются одним из основных источников информации о механизмах и путях регуляции патофизиологических процессов, затрагивающих практически все значимые онкогены и онкобелки [Bonisch Н., Bruss М., 2006; Barnett Е. et al., 2009; Tsien С. et al., 2009]. Здесь главные направления - изучение факторов лекарственной устойчивости [Bigott Н. et al., 2005], неоангиогенеза [Rossin R. et al., 2007], роли цитокинов [Massague J. et al., 2001], пролиферации [Solit D. et al., 2006] и метастазирования [Scholz М. et al., 2007] клеток.

Выделенный в отдельное направление около пятнадцати лет назад подход, использующий способы визуализации накопления, распределения и переноса радиоактивно меченых маркеров, основан на принципах молекулярной биологии, фармакологии и биохимии, лежащих в основе исследований различных химических соединений [Phelps M.et al., 1979]. В настоящее время этот метод представляет собой сплав фармакологии и радиологии, находящийся под влиянием достижений клеточной и молекулярной биологии, химии и физики элементарных частиц [Hackman Т. et al., 2002]. Все большее значение приобретают методы математической оценки биологических процессов, что позволяет использовать различные методы, основанные на реконструировании данных и презентации их в легко читаемом формате [Zanzonico Р. et al., 2006; Serganova et al., 2008].

Однако на пути применения всех этих подходов в клинике возникают значительные трудности, главной из которых является иммунологическая реактивность большинства репортерных белков, полученных от других животных.

В связи с этим особое значение приобретают поиски для визуализации белков человеческого происхождения, которые могли бы использоваться при изучении болезней человека. Одним из новых и перспективных белков, в этой связи, является транспортер норадреналина человека (чНАТ). Этот белок блокирует передачу нервного импульса через норадреналиновые рецепторы путем быстрой транспортировки норадреналина, выделяемого в межсинаптическое пространство, в пресинаптические терминалы. чНАТ осуществляет контроль опосредуемых норадреналином физиологических процессов и эффектов поведения.

В последние годы клонированы гены HAT крысы, быка и человека. У млекопитающих эти гены экспрессируют HAT практически только в центральной и периферической симпатической нервной системы. Поэтому ген может выступать в качестве репортерного при изучении злокачественных новообразований в других тканях у экспериментальных животных и у человека. Такой подход обладает рядом преимуществ, главным из которых является наличие тестированных и одобренных в ряде государств радиоизотопных маркеров.

Основная задача в настоящее время - использование метода на этапе доклинических испытаний для оценки его потенциала при визуализации клинически значимых патофизиологических параметров популяций опухолевых клеток. Ключевое значение здесь приобретает разработка новых радиоактивно меченых проб, которые могли бы улучшить безопасность и эффективность применения их как на лабораторных животных, так и, в дальнейшем, у больных в клинике.

Цель исследования

Изучить ген норадреналинового транспортера человека (чНАТ) и кодируемый им белок; изучить возможность его применения в качестве репортерного гена для инструментальной визуализации различных биологических процессов, характерных для патофизиологии опухолевых клеток и тканей у экспериментальных животных, а также для доклинического анализа и клинической диагностики злокачественных новообразований.

Конкретные задачи работы

1. Создать стабильно синтезирующие чНАТ клеточные линии с целью выяснить, накапливают ли трансдуцированные клетки радиоактивно меченые пробы в количествах, достаточных для визуализации in vivo, в сравнении с клетками неонкогенного происхождения.

2. Оценить распределение чНАТ в трансдуцированных опухолях, для чего провести сравнительное исследование накопления ш1- и 1241-меченого синтетического аналога норадреналина методом визуализации при помощи одно-фотонного и позитронно-эмиссионного томографов.

3. Исследовать возможность использования оптических репортерных систем как независимого контроля экспрессии конструкций, содержащих ген чНАТ, in vitro и in vivo.

4. Выяснить, является ли применение репортерной системы чНАТ информативным для оценки корреляции между усилением сигнала и уровнем пролиферации опухолевых клеток.

5. Определить, возможна ли визуализация чНАТ-позитивных опухолевых клеток в процессе метастазирования.

Научная новизна результатов работы

Впервые осуществлен анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ), как репортерного гена, в злокачественных и нормальных клетках мыши, крысы, обезьяны и человека. Так, показано, что клетки, трансдуцированные геном чНАТ, стабильно экспрессируют его в течение более двух лет. Сконструированы чНАТ-позитивные клеточные линии со склонностью к метастазиро-ванию. Создан аналог норадреналина, меченый испускающим позитроны изотопом йод-124, - [1241]-мета-йодбензилгуанидин (МИБГ). Проведено комплексное сравнение in vitro и in vivo используемой в клинике пробы [ш1]-МИБГ и созданной впервые пробы [1241]-МИБГ. Получены изображения чНАТ-позитивных опухолей различной локализации, с применением позитронно-эмиссионной томографии. Разработан метод стимуляции метастатического рас-

пространения чНАТ-позитивных опухолей с последующей неинвазивной визуализацией радиоактивности in vivo.

Научно-практическая значимость

Разработанные и оптимизированные чНАТ-содержащие репортерные системы позволяют проводить доклиническую и клиническую оценку некоторых физиологических и патофизиологических процессов in vitro и in vivo с помощью новейших инструментов молекулярной визуализации, таких как ОФКТ и ПЭТ. Применение генов, кодирующих флуоресцентный белок, используемый для оптической визуализации, предоставляет возможность независимо оценивать экспрессию чНАТ и изучать корреляцию различных процессов в опухолях.

Содержащие ген чНАТ репортерные системы используют при диагностике различных форм онкологических заболеваний в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и педиатрии Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического центра (МСКОЦ, Нью-Йорк, США). Радиоактивно меченая проба [1241]-МИБГ проходит в настоящее время процедуру официальной регистрации для внесения в список реагентов для клинического применения. Репортер-ную систему с геном чНАТ активно используют в доклинической практике для изучения возможности терапии лимфомы, вызываемой вирусом Эпштейн-Барра, с помощью Т-лимфоцитов.

Работа выполнена на базе научно-клинических отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития РФ (Москва, РФ) и на базе МСКОЦ (Нью-Йорк, США), в Отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и радиохимии.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты работы представлены в виде докладов и стендовых презентаций на Конференции Общества молекулярной визуализации, Провиденс, 2007; на Межлабораторной конференции Мемориал Слоан-Кеттеринг Онкологического центра, Нью-Йорк, 2006-2008 гг.; Совместной лабораторно-клинической конференции сотрудников ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии, 2008-2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано шесть статей в зарубежных изданиях и две - в отечественных журналах. Также было сделано и опубликовано 8 докладов на международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (96 источников), методической части, пяти глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка публикаций. В тексте содержится 9 рисунков (диаграмм и фотографий), 1 таблица.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа основана на экспериментальных данных, полученных лично автором и опубликованных в рецензируемых научных журналах.

Объект исследования. Работа выполнена на 250 мышах-самцах линии nude (nu/nu), полученных из питомника Национального института рака (NCI, Bethesda, USA).

Создание химерного репортерного гена hNET-IRES-GFP. Ретровирусный вектор, несущий ген, кодирующий чНАТ, создан путем замещения гена сим-транспортера натрия и йода (чНИС) в векторе, ранее созданном в нашей лаборатории. ДНК, кодирующую чНАТ, получали с помощью полимеразной цепной реакции с применением олигонуклеотидов, специфичных для рестриктаз Notl и BamHl. В качестве основы использовали плазмидную ДНК M48EFla/IINETIVSIRES-hyg, любезно предоставленную др-м У. Хаберкорном (U. Habercorn, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany).

Клеточные линии. Для получения обогащенных вирусом супернатантов, 20 мкг плазмидной ДНК трансфицировали с помощью липофектамина («Life Technologies», USA) в клетки линии GPG29. Супернатанты собирали каждые 24 ч в течение 4 дней и хранили при температуре - 20°С.

В работе использовали также клеточные линии С6 (глиома крысы), SK-H-SHK (нейробластома человека), Jurkat (клетки-предшественники лимфоцитов

человека), COS-7 (клетки почки обезьяны), NIH ЗТЗ (нормальные фибробласты мыши).

Клеточные культуры растили в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки КРС, и среде RPMI 1640. Для инфицирования клеточных линий ретровирус-ной ген-репортерной системой hNET-IRES-GFP использовали супернатанты вирус-продуцирующих культур в присутствии полибрена (8мкг/мл). Клеточную линию SK-H-SHK не трансдуцировали, так как ее использовали в качестве позитивного контроля экспрессии чНАТ, как описано ранее [Haberkorn U., Altmann А., 2001].

Проточная цитофлуорометрия (FACS); анализ и сортировка. После 6-8 дней культивирования, трансдуцированные и не трансдуцированные клеточные линии снимали с чашек Петри (после пятиминутной инкубации в 0,05% растворе трипсина) и суспендировали в соответствующей среде. Клеточный осадок центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали и фильтровали через миллипоровый фильтр с диаметром пор 40 мкм. Клеточную взвесь анализировали на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США) для оценки состояния клеток и уровня трансдукции вектором, а затем сортировали по размеру на проточном сортировочном аппарате той же компании с использованием лазера с длиной излучаемого луча 488 нм.

Данные обрабатывали с помощью программного пакета Cell Guest, и полученные клеточные популяции использовали в дальнейшей работе.

Флуоресцентную микроскопию осуществляли на анализаторе Nuance, оснащенном необходимым источником возбуждения флуоресценции (380 нм) и фильтрами поглощения (435 нм) и эмиссии (485 нм).

Иммуноблот-анализ белка чНАТ в клеточных линиях и образцах опухоли проводили по стандартной методике с использованием моноклональных антител к этому белку («Clontech», США) в разведении 1:1000.

Модели подкожных опухолей у экспериментальных животных. Подкожные опухоли С6 получали на иммунокомпрометированных мышах линии nude (nu/nu) путем подкожного введения суспензии опухолевых клеток в плечевые

области передних лапок из расчета 2х106 клеток в 100 мкл физиологического раствора. Через 10 дней после инокуляции размер опухоли был в пределах 0,51,0 см, что является оптимальным для проведения исследований in vivo.

«Чрезкожная» (неинвазивная) визуализация флуоресценции. Для наблюдения GFP-флуоресценции на коже использовали внешний источник голубого света (480 нм). Флуоресценцию детектировали, используя цифровую систему анализатора Nuance.

Анализ захвата и [Ш1]-МИБГ культурами клеток in vitro.

Метод подробно описан нами ранее [Moroz М.А. et al., 2007]. Он позволяет определять накопление меченой пробы в клетках, экспрессирующих ген чНАТ, после инкубации в течение различных промежутков времени. Уровень накопления выражали как соотношение активности для клеток и среды, нормализованных по весу клеточной массы (для коррекции различного начального числа клеток).

Синтез радиоактивно меченых маркеров. [т1]-МИБГ получен от компании «Nordion» (США). Удельная радиоактивность, определяемая при промышленном изготовлении, составляла 300 мБк/мкмоль, при чистоте конечного вещества

-97%. Ш1-МИБГ синтезировали впервые для нашей работы в лаборатории радиохимии МСКОЦ (Нью-Йорк, США).

Визуализация и количественная оценка захвата радиоактивной пробы с помощью гамма-камеры и позитронно-эмиссионной томографии. Исследования в гамма-камере проводили, используя двухголовочную систему Vertex («ADAC laboratories», США), оснащенную коллиматорами высокого разрешения для высокоэнергетических нуклидов. Средняя продолжительность исследования - 30 мин. Позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) проводили на системе Advance («General Electric», США). Изображения получали через 24 ч после введения радиоактивного препарата, в течение которых происходит вымывание незахваченного препарата и повышается специфичность получаемых изображений. Накопление радиоактивного йода (минимальные примеси) в щитовидной железе животных в результате радиолиза блокировали путем предва-

рительного введения 2 мл 0,9% раствора Nal интраперигонеально. [1231]-МИБГ и [Ш1]-МИБГ вводили в дозе 300 мкКи и 200 мкКи на мышь соответственно.

В ходе анализа полученных изображений с применением программного обеспечения MicroPET ASIpro ("Concorde", СА) определяли концентрацию радиоактивности в интересующих нас участках тела мыши. Независимо измеряли концентрации радиоактивности, отбирая образцы тканей и измеряя уровень их радиоактивности с помощью гамма-счетчика.

Статистический анализ. Данные сравнивали с помощью метода Стью-дента, определяя вероятность достоверности различий. Статистически значимыми признавались результаты со стандартным отклонением р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание экспериментальных клеточных линий, трансдуцирован-ных химерным геном, включающим маркерный ген чНАТ

Вначале был создан химерный репортерный ген, состоящий из кодирующей последовательности гена чНАТ, внутреннего участка прикрепления к рибосоме (1RES) и зеленого флуоресцентного белка (GFP) (рис.1).

ЛТР

чНАТ

1RES GFP алтр

Рис. 1. Структура чНАТ - несущего вектора. Экспрессия стимулируется ЛТР (LTR -long terminal repeat) промоторной последовательностью, а ген чНАТ костимулируется также промотором цитомегаловируса (CMV - cytomegalovirus). чНАТ и зеленый флуоресцирующий белок (GFP) соединены линкером IRES для обеспечения независимой экспрессии

Ген создали методом молекулярного клонирования с использованием гена HAT, предоставленного У. Хаберкорном, и коммерчески доступных генетических последовательностей IRES и GFP. Полученную генетическую последовательность секвенировали для подтверждения успешности клонирования. После этого химерный ген hNET-IRES-GFP помещали в культуру ретровирус-

продуцирующих клеток и трансфицировали, используя раствор липофектами-на, повышающего проницаемость клеточной стенки. Собранные в течение пяти последующих дней супернатанты, содержащие ретровирусы, использовали для трансдукции ряда клеточных линий. Мы исследовали две клеточные линии не-онкогенной природы - фибробласты мыши (NIH ЗТЗ) и клетки почки обезьяны (COS-7), причем трансдукции были подвергнуты только последние, а также предшественники Т-клеток человека (Jurkat). Эти клетки предназначались для получения данных, которые можно будет использовать в дальнейшем для возможного визуального анализа миграции Т-лимфоцитов человека. В качестве онкогенных линий изучали линии глиомы крысы (С6) и опухоли молочной железы человека (MDA-MB-231).

Из этих линий, при помощи проточного сортирующего цитофлуориметра, выделяли фракции клеток, синтезирующих GFP. Изначальная эффективность трансдукции составила 29% для клеток С6, 12% - для предшественников Т-клеток человека, 25% - для MDA-MB-231 и 33% - для COS-7 (рис. 2).

С6

COS-7 ° s

• s

Jurkat § ~

О со

М1

Рис. 2. Основные экспериментальные клеточные линии до (слева) и после (справа) сортировки по экспрессии флуорохрома. Данные представлены в величинах отношения между количеством клеток (ось абсцисс), и уровнем флуоресценции (ось ординат)

Таким образом, на первом этапе, были созданы четыре чНАТ-несущие линии, отрицательными контролями для которых служили те же линии, не под-

вергнутые ретровирусной трансдукции, а также нормальные фибробласты мыши. Для положительного контроля использовали линию нейробластомы человека (SK-N-SH), которая в норме экспрессирует ген чНАТ.

2. Анализ экспрессии гена чНАТ и функции (транспорт адреналина) в созданных клеточных линиях

После выделения в результате отсортировки 90% и более положительных популяций (-80% для Jurkat), клеточные линии подготовили для определения in vitro функциональной активности чНАТ. Для этого применяли метод захвата in vitro меченой пробы, в нашем исследовании - [1231]-меченого МИБГ. Результат оценивали по величине соотношения накопленной радиоактивности в среде и в клетках после инкубации с пробой в течение различных промежутков времени. Измерения проводили на гамма-счетчике («Nordion», США).

Во всех трансдуцированных клеточных линиях наблюдается быстрое накопление радиоактивности в течение первых 15 мин, с выходом на плато после инкубации с пробой в течение 90 и более минут. Для сравнения были взяты величины радиоактивности, полученные после 120 мин инкубации. Данные были представленны в величинах соотношения между количеством изотопа в осадке клеточной массы и уровнем свободного (незахваченного) изотопа в среде. Показатели составили 12+3 для отрицательных контролей и фибробластов мыши, 430+22 для Jurkat клеток, 590+30 для линии С6, 510+15 для MDA-MB-231 и 1320+41 для клеток почек обезьяны (COS-7) (рис. ЗА).

Для подтверждения синтеза белка и для сравнения уровня синтеза чНАТ в клеточных линиях проводили Вестерн-блот-анализ (рис. ЗБ), с помощью которого установлен значительно более высокий уровень чНАТ в линиях COS-7, несколько меньший - в онкогенных линиях и Jurkat, при полном отсутствии синтеза в отрицательных контролях (некоторое превышение над контролем было обнаружено в нетрансдуцированной линии COS-7, что наблюдалось также в работе других авторов [Pacholczyk Т. et al., 1991], и при небольшом уровне синтеза в положительном контроле.

1 ft

I 8 1

r t-

0 60 100 150 200

Time (min)

hNET P-Actin

Рис. 3. A - Уровень захвата радиоактивной пробы клеточными линиями COS-7 (а), С6 (Ь) и Jurkat (с) по отношению ко времени инкубации. Б - Вестерн-блот-анализ с применением специфических к чНАТ моноклоналъных антител на образцах, полученных из клеток С6 (1, 2), COS-7 (3, 4) и Jurkat (5, 6) дикого типа и несущих чНАТ соответственно. Положительным контролем синтеза чНАТ был образец из линии нейробласгомы человека (7)

Таким образом, в ходе этих опытов мы установили, что трансдуцирован-ные геном чНАТ линии синтезируют значительное количество функционально активного белка, а нетрансдуцированные контроли не накапливают радиоактивную метку норадреналина в количествах, превышающих фоновые значения.

3. Создание экспериментальных моделей in vivo с применением чНАТ-положнтельных клеточных линий и их обследование на однофотон-ном и позитронно-эмиссионном томографах

Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих ген чНАТ, позволило выяснить, присутствует ли он у экспериментальных животных. Для создания первой модели была выбрана линия глиомы крысы - Сб. Через 14 дн после подкожного введения в область передних конечностей иммунокомпроме-тированных мышей линии nude (nu/nu) 2x106 трансдуцированных (опыт) и не-трансдуцированных (контроль) клеток животных обследовали с помощью од-нофотонного томографа (гамма-камеры) и позитронно-эмиссионного томографа.

3.1. Обследование мышей линии nude на однофотонном томографе/ гамма-камере

Животных обследовали через 4, 24 и 48 ч после внутривенного введения меченого [Ш1]-МИБГ (период полураспада изотопа 13 ч) (рис. 4). Экспериментальную группу составили 30 животных. чНАТ-позитивные опухоли были обнаружены путем визуализации радиоактивности на всех трех временных точках; наибольшие величины, характеризующие соотношение специфического сигнала к неспецифическому, наблюдались через 24 ч после введения метки.

Щитовидная ^^^елеза

чНАТ опухоль

Мочевой пузырь

Щитовидная Хкелеза

чНАТ^

Щитовидная железа

чНАТ опухоль

Мочевой пузырь

Щитовидная V железа \ »

чНАТ опухоль

Мочевой пузырь

Щитовидная железа

чНАТ опухоль

Мочевой пузырь

опухоль

Мочевой пузырь

■ 9 cpm/pixel

J0 cpm/pixel

i11 cpm/voxel

0 cpm/voxel

4 часа

24 часа

48 часов

Рис. 4. Изображения одного и того же животного, полученные с помощью гамма-камеры и однофотонного томографа через 4, 24 и 48 ч после внутривенного введения 300 мкКи [|23 Ц-МИБГ. Животное несет контрольную и чНАТ-опухоль на протиположных плечах. (Изображения нормализованы по числу событий на графическую точку)

Низкий уровень радиоактивности наблюдается через 48 ч после введения. Высокий уровень неспецифического накопления радиоактивности отмечен на ранних сроках в кишечнике, щитовидной железе и мочевом пузыре. В отрицательных контролях уровень накопления пробы не превышает фонового.

3.2. Обследование экспериментальных животных с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)

Животных обследовали на позитронно-эмиссионном томографе FOCUS-120 в течение 15 мин, съемки через 1, 2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч после внутривенного введения радиоактивной пробы (рис. 5).

В этих опытах использовали аналог норадреналина [1241]-МИБГ (период полураспада изотопа 108 ч). Этот изотоп йода, в отличие от1231, является высокоэнергетическим - пик излучения при 511 кЭВ (для Ш1 - 150 кЭВ) - и излучает позитроны. Следует отметить, что П41 не может быть использован на од-нофотонном томографе из-за слишком высокой энергии, делающей невозможной фиксацию фотонного излучения детекторами СПЕКТ/гамма-камеры, но этот изотоп позволяет применить более чувствительный метод ПЭТ.

BlBIIlf

DDDDDDD1

1 час 2 часа 4 часа 8 часов 24 часа 48 часов 72 часа

Рис. 5. Данные с позитронно-эмиссионного томографа на одном и том же животном. Корональные (А) и аксиальные изображения (Б) получены в течение 72 ч анализа после введения [1241]-МИБГ. Стрелки указывают на чНАТ опухоли

Опыт ставили на тех же животных, которые использовали и в предыдущем опыте, после того, как их выдерживали в течение времени, соответствую-

I I i Ö < * I 1 w t 1 1 1

в в в В • в в

1 час 2 часа 4 часа 8 часов 24 часа 48 часов 72 часа

щего восьми периодам полураспада 1231 (для освобождения от радиоактивности). чНАТ-позитивные опухоли обнаруживались путем визуализации на всех временных точках от 1 до 72 ч, но лучшее соотношение специфического сигнала к неспецифическому наблюдалось через 24-72 ч после введения метки. Высокий уровень неспецифического накопления радиоактивности отмечен на ранних сроках после введения меченого соединения в кишечнике, почках, сердце, щитовидной железе и мочевом пузыре. В отрицательных контролях уровень накопления пробы не превышает фонового значения.

S.S. Анализ распределения меченого 124I синтетического норадренали-на (МИБГ)

Распределение тестировали через 72 ч после введения пробы мышам, измеряя уровень накопления меченого соединения в органах животных с помощью гамма-счетчика (табл. 1).

Таблица 1.

Распределение [1241]-МИБГ через 72 ч после введение. Оценка данных анализа ex vivo после вскрытия животных (колонки 1 и 2) и данных

компьютерного анализа изображений с томографа (колонка 3)(приводятся усредненные данные по десяти животным)

Радиоактивность Анализ интересующей нас области

Ткань Накопление, отношение к фоно- данные компьютерно-

в % от введен- вой радиоактивно- го анализа, в % от вве-

ной дозы сти в мышце денной дозы

чНАТ-опухоль 1,5 ±0,3 293 ± 48 1,5 ±0,3

Негативная опухоль 0,0037 ±0,0021 0,71 ±0,19 0,018 ±0,006

Мозг 0,0014 ±0,0004 0,22 ± 0,04

Сердце 0,018 ±0,005 2,7 ±0,5 0,09 ± 0,03

Легкие 0,011 ±0,005 2,4 ± 0,3

Щитовидная железа 0,033 ± 0,024 6,2 ±1,2 0,24 ±0,16

Печень 0,017 ±0,004 2,5 ± 0,6

Почки 0,016 ±0,002 1,5 ±0,3 0,045 ± 0,004

Надпочечники 0,014 ±0,016 2,5 ± 0,3

Кишечник 0,028 ±0,017 4,2 ± 0,8 0,055 ±0,033

Содержимое кишечника 0,026 ±0,018 4,1 ±0,6

Желудок 0,036 ± 0,024 6,2 ± 1,5

Содержимое желудка 0,016 ±0,024 2,5 ± 0,5

Мочевой пузырь 0,12± 0,12 22 ±3 0,11 ±0,034

Мышца 0,0054 ± 0,002 1

В большинстве органов определяются лишь ничтожно малые количества радиоактивности (не более 0,01% общей дозы на грамм ткани, кроме щитовидной железы и кишечника (0,06%) и мочевого пузыря (0,11%), тогда как в чНАТ-позитивных опухолях наблюдали значительный уровень активности (до 1,5% общей дозы на грамм).

Для создания графика накопления активности в различных участках организма животных применяли метод трехмерной реконструкции изображения с позитронно-эмиссионного томографа, что позволило определить уровень накопления изотопа по числу графических трехмерных точек (вокселей) на площадь изображения. В ходе графического анализа было установлено, что пик накопления пробы у чНАТ-позитивных опухолей возникает через 8 ч после введения изотопа, однако уровень неспецифического накопления в различных тканях на всех ранних (до 24 ч) сроках был очень высоким (рис. 6).

Время (часы)

Рис. 6. Накопление радиоактивной пробы по данным позитронно-эмиссионной томографии в чНАТ- положительной опухоли (А) и в мышце (фоновая активность) - (Б).

По мере биологического вымывания 1241 величина соотношения специфического сигнала из чНАТ-позитивных опухолей и неспецифического повышается и составляет 60:1 через 24 ч; 98:1 через 48 ч и 157:1 через 72 часа после введения (рис. 7). В отрицательных контролях уровень накопления пробы не превышает фонового.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

i i i

I /

¡ А/

I /

« jL*

1 -

I S Б__

О 10 20 30 40 SO 60 70 80 Tima (h)

Рис. 7. Накопление радиоактивной пробы НАТч-положительной опухоли (А) и в мышце (фоновая активность) (Б).

Таким образом, эта серия опытов показала, что чНАТ-положительные клеточные линии накапливают такое количество меченой пробы, которое достаточно для визуализации в опухоли in vivo как на однофотонном, так и на по-зитронно-эмиссионном томографах. При этом очевидно преимущество изотопа с более длинным периодом полураспада.

4. Независимое определение экспрессии химерного гена у экспериментальных животных с помощью неинвазивной оптической визуализации

Для независимого определения экспрессии химерного гена была определена флуоресценция GFP как in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии (рис. 8А), так и in vivo у мышей линии nude со сформированными подкожными опухолями из клеток, несущих экспериментальный вектор, с применением спектрального анализатора флуоресценции Nuance («CRI», СА).

Животных, подготовленных к анализу на однофотонном и позитронно-эмиссионном томографах, обследовали с применением испускающих и поглощающих световых фильтров различной длины волны. Свет с длиной волны 510 им. определяли как испускаемый GFP и он был зафиксирован в местах имплантации клеток С6, трансдуцированных экспериментальным химерным геном hNET-IRES-GFP (рис. 8Б).

Рис. 8. Определение экспрессии химерного гена hNET-IRES-GFP путем регистрации зеленого флуоресцирующего белка (GFP) в клеточной культуре in vitro (А) и в экспериментальном животном in vivo (Б).

Таким образом, нам удалось показать возможность независимого определения чНАТ-позитивного химерного гена, в том числе, - in vivo.

5. Использование чНАТ-репортерных систем для визуализации различных патофизиологических процессов в опухолевых клеточных линий

5.1. Применение чНАТ-репортерных систем для визуализации пролиферации опухолей

Для определения способности чНАТ-положительных репортерных систем визуализировать изменение количества опухолевых клеток в процессе пролиферации использовали линии глиомы человека Сб. Десяти мышам линии nude вводили подкожно различное количество чНАТ-положительных клеток, после чего мышей обследовали на позитронно-эмиссионном томографе после

124»

введения меченого 1 синтетического норадреналина.

Зонд вводили в нижнюю часть грудной клетки, поскольку в этой области наблюдается наименьший уровень неспецифического накопления. Каждому животному ввели ЗхЮ4, 1х105, ЗхЮ5 и 1х106 клеток, соответственно. Группе из пяти животных было введено такое же количество клеток дикого типа в качестве отрицательного контроля. В результате анализа установлена зависимость между числом клеток и уровнем накопления пробы через 24 ч после введения близкая к линейной (рис. 9).

Количество клеток

Рис. 9. Соотношения величин уровня накопления радиопробы и количества чНАТ-несущих клеток, введенных подкожно

5.2. Использование чНАТ-репортерных систем для визуализации ме-тастазирования опухолей

Ретровирусный вектор чНАТ-IRES-GFP и ранее созданный в нашей лаборатории вектор, кодирующий красный флуоресцирующий белок (tdRFP) и лю-циферазу файрфлай (FLuc), использовали для создания двойных трансдуциро-ванных линий MDA-MB-231 (опухоли молочной железы человека). В качестве контроля в опытах по изучению влияния чНАТ на способность клеток к мета-стазированию использовали однократно трансдуцированные клетки SFG-dsRED-cmvFLuc MDA-MB-231.

1x10s клеток данных линий вводили в левый желудочек сердца двух групп (по 15 животных в каждой) мышей линии nude для симулирования образования метастазов по большому кругу кровообращения. Для мониторинга клеточной миграции и развития метастазов проведены серийные исследования с помощью биолюминесцентного анализатора. Через три недели после введения клеток животных обеих групп обследовали на гамма-камере, однофотонном томографе, компьютерном томографе и позитронно-эмиссионном томографе.

При биолюминесцентной визуализации (БЛВ) установлена миграция трансдуцированных клеток от сердца по кровотоку к различным местам накопления (в позвоночнике, внутренних органах и конечностях) с последующим развитием метастазов в некоторых из них. В течение месяца проводили мониторинг развития очагов накопления с помощью БЛВ и не обнаружили стати-

стически достоверной разницы в числе и скорости развития метастазов у чНАТ-позитивных и чНАТ-негативных животных.

Через три недели после введения клеток две мыши были обследованы на однофотонном томографе после введения 0,4 мкКи меченого 1231 синтетического норадреналина. У животных обнаружены единичные очаги накопления, в то время как с помощью БЛВ было визуализировано более десяти очагов.

Для изучения морфологии очага животным вводили дополнительно 1 мкКи [Ш1]-МИБГ и обследовали еще раз с помощью «пинхол»-детектора, который дает увеличение чувствительности до пяти раз. Зона анализа - участок площадью 2 см2 вокруг очага накопления. Несмотря на использование «пин-холл-детектора результаты исследования были отрицательными.

На четвертой неделе опыта чНАТ-животных обследовали на позитронно-эмиссионном томографе после введения 0,7 мкКи [Ш1]-МИБГ через 24, 48 и 72 ч нам удалось четко визуализировать до восьми метастазов на животное, притом, что с помощью БЛВ было определено десять. Таким образом, данное исследование позволило установить, что интенсивность биолюминесцентного сигнала и показатели позитронно-эмиссионной томографии с применением чНАТ-репортерной системы хорошо скоррелированы. На основании представленных данных можно сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы генетические контрукции, которые содержат ген, кодирующий норадреналиновый транспортер человека (чНАТ). Эти конструкции, после введения в них радиоактивной метки и с применением однофо-тонной и позитронно-эмиссионной томографии, позволяют проследить неинва-зивно динамику некоторых патофизиологических процессов развития опухоли. Созданы ретровирусные носители для трансдукции клеток-мишеней.

2. Разработаны мультимодальные генетические конструкции, кодирующие как чНАТ, так и зеленый флуоресцирующий белок (GFP), красный флуоресцирующих белок (RFP) и люциферазу светлячка (Firefly luciferase), для оптической визуализации (флуоресцентной, конфокальной микроскопии, проточ-

ной цитофлуорометрии, оценки флуоресцентного и биолюминесцентного сигналов in vitro и in vivo)

3. Сравнительный анализ накопления [1231]-МИБГ и [1241]-МИБГ в клетках мыши (фибробласты), крысы (глиома), обезьяны (клетки опухоли почечной ткани) и человека (предшественники Т-лимфоцитов, нейробластома, фибробласты) показал, что накопление йода в нормальных клетках не отличается от отрицательных контролей, а соотношение величин накопления в чНАТ-позитивных и негативных клетках составляет от 45:1 до 150:1. Экспрессия гена белка чНАТ была стабильна в течение двух лет наблюдений.

4. Сравнительный анализ обычно применяемой в клинических условиях пробы [1231]-МИБГ с созданной нами впервые позитрон-испускающей пробой [1241]-МИБГ показал её преимущество, которое определяется более длительным периодом полураспада этого изотопа. Получены более высокие соотношения специфического и неспецифического сигнала через 24 (30:1), 48 (90:1) и 72 ч (160:1) после введения метки. Применение позитронно-эмиссионного томографа с высокой (до 1,8 мм) разрешающей способностью, по сравнению с однофо-тонной томографией (5-15 мм), увеличивает информативность предложенного метода: использование [1241]-МИБГ в НАТ-позитивной системе позволяет вести наблюдение в течение 96 ч.

5. чНАТ-негативные ткани не накапливают меченые радиоактивным йодом пробы, а в тканях, естественно экспрессирующих ген чНАТ (сердце, надпочечники), несмотря на некоторое накопление до 4 ч после введения, наблюдается быстро , практически полное к 12 ч , их выведение после начала опыта.

6. Уровень накопления радиоактивной пробы в чНАТ-позитивной модели in vivo достаточно высок, чтобы увидеть состояние значительной массы клеток, а также обнаружить незначительные клеточные популяции (метастазы).

7. Доказана возможность визуализации метастазов, состоящих из чНАТ-позитивных клеток, с помощью анализа биолюминесценции.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Serganova I., Moroz Е.д Moroz М. A. et al. Non-invasive molecular imaging and reporter genes. // Centr Europ J Biol. 2006. V. 1, N. 1. p. 88-123.

2. Moroz M. A., Serganova I., Zanzonico P. et al. Imaging hNET reporter gene expression with [124I] MIBG // J nucl. med. 2007. v.48(5), p.827-836

3. Solit D.B, Santos E. Pratilas C.A,Lobo J, Moroz M. A. et al. FLT PET is a non-invasive marker of response to MEK inhibition. // Cancer Res. 2007. v. 67(23), p.1463-1469.

4. Serganova I., Moroz E., Vider J., Gogiberidze G., Moroz M. A. et al. Mul-timodality imaging of TGF&[beta] signaling in breast cancer metastases // The FA-SEB J. 2009. v.23(8), p.2662-2672

5. Zhang H., Moroz M. A.. Serganova I. et al. Imaging the expression of the human somatostatin receptor subtype-2 hSSTr2) reporter-gene with[<SUP>68</SUP>Ga]-DOTATOC // J Nucl Med. 2011. v.52(l), p.123-131

6. Moroz M. A., Kochetkov Т., Cai S., Wu J. et al. Colon cancer response following treatment with AZD1152: an analysis of [18F]fluoro-2-deoxyglucose and 3'-deoxy-3'-[18F] fluorothymidine imaging // Clin Cancer Res. 2011. Jan 18. [Epub ahead of print].

7. Ликарь Ю.Н., Мороз M.A., Румянцев А.Г. Применение гена тимидин-киназы вируса простого герпеса в качестве суицидального гена в протоколах генной терапии. // Вопр. гематол. онкол. и иммунопатологии в педиатрии. 2009. т. 8, с.31-35.

8. Мороз М.А., Ликарь Ю.Н., Дубровин М.М., Румянцев А.Г. Ген норадреналинового транспортера человека в качестве мишени для визуализации онкологических заболеваний на молекулярном уровне. // Вопр. гематол. онкол. и иммунопатологии в педиатрии.2009. т. 8, с.36-40.

Тираж: 100 экз. Заказ № 3787 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Фридриха Энгельса, д. 3/5, стр. 2 (495) 661-60-89; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мороз, Максим Аркадьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Свойства, физиология и фармакология норадреналинового транспортера.

1.2. Изучение белка HAT, как участника широкого спектра клинически значимых процессов в неврологии, кардиологии и онкологии.

1.2.1. Роль белка HAT в физиологии центральной нервной системы и патофизиологии нарушений ее функции

1.2.2. Роль белка HAT в физиологии сердечно-сосудистой системы и патофизиологии нарушений ее функции

1.3. Комплекс методов молекулярной визуализации, их клиническое и лабораторное значение. Стратегии визуализации. Оптическая и ядерная визуализация. Разработка новых репор-терных генов и подходов к их применению в клинической практике.:.

1.3.1. Молекулярная визуализация в лабораторной и клинической практике. Развитие, формирование, значение

1.3.2. Стратегии методов молекулярной визуализации. Прямая и опосредованная визуализация. Принципы различных видов визуализации. Формирование концепции репортерных генов, как одного из вариантов визуализации.

1.3.3. Ядерная визуализация. Однофотонная томография. Позитронно-эмиссионная томография. Репортер-ные гены для ядерной визуализации.

1.3.4. Оптическая визуализация. Флуоресценция и биолюминесценция. Репортерные гены для оптической визуализации

1.3.5. Классические клинические методики в комплексе методов молекулярной визуализации. Ядерно-магнитный резонанс, компьютерная томография, ультразвуковые исследовании.

1.3.6. Перспективы использования репортерных генов в лабораторной и клинической практике.

1.4. Роль норадреналина (НА) в комплексе методов молекулярной визуализации. Клинические перспективы.

1.4.1. Использование человеческого транспортера норадреналина для неинвазивной молекулярной визуализации биологических процессов.

1.4.2. Клинические перспективы. 4g

Глава 2. Материал и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2. Создание химерного репортерного гена hNET-IRES-GFP.

2.3. Клеточные линии.

2.4. Проточная цитофлуорометрия (FACS). Анализ и сортировка

2.5. Флуоресцентная микроскопия.

2.6. Иммуноблот анализ.

2.7. Модели подкожных опухолей у экспериментальных животных

2.8. Чрезкожная (поверхностная) визуализация флуоресценции.

2.9. Анализ захвата [1231] МИБГ и [1241] МИБГ культурами клеток in vitro.

2.10. Синтез радиоактивных маркеров

2.11. Визуализация и количественная оценка захвата радиоактивной пробы с помощью гамма-камеры и позитронно-эмиссионной томографии.

2.12. Статистический анализ.

Глава 3. Создание экспериментальных клеточных линий, несущих чНАТ-содержащий химерный ген. Анализ экспрессии и функции чНАТ в этих линиях.

Глава 4. Создание in vivo экспериментальных моделей с подкожными опухолями, образованными из чНАТ-положительных клеточных линий и их обследование на однофотонном и позитронно-эмиссионном томографах. Независимое определение экспрессии химерного гена у экспериментальных животных с помощью неинвазивной оптической визуализации.

4.1. Обследование мышей линии nude на однофотонном томографе/ гамма-камере.

4.2. Обследование экспериментальных животных с помощью позитронно-эмиссионной томографии.

4.3. Анализ распределения [1241]МИБГ в организме экспериментальных животных после системного введения.

Глава 5. Использование чНАТ репортерных систем для визуализации различных патофизиологических процессов в клетках экспериментальных опухолей.

5.1. Применение чНАТ репортерных систем для визуализации пролиферации опухлей.

5.2. Использование чНАТ репортерных систем для визуализации метастазирования опухолей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях"

Актуальность проблемы

В настоящее время технология молекулярной визуализации («molecular imaging») является наиболее перспективной для изучения на молекулярном уровне патологических процессов, присходящих in vivo и приводящих к злокачественным новообразованиям. По мере развития этой технологии все большее значение приобретает её клиническое использование как для диагностики, так и для лечения больных с онкологическими заболеваниями. Лабораторное применение молекулярной визуализации для исследования патофизиологии опухолей является одним из основных источников информации о механизмах и путях регуляции практически всех значимых онкогенов и онкопротеинов [Tsien S. et al., 1995; Blasberg R. et al., 2002; Barnett E. et al., 2009]. Исследования факторов лекарственной устойчивости [Bigott Н. et al., 2005] , неоангиогенеза [Rossin R. et al., 2007], роли цитокинов [Massague J., 2001], пролиферации [Solit D. et al., 2006] и метастазирования [Scholz М. et al., 2007] стали основными в последние годы.

Выделенный в отдельное направление около пятнадцати лет назад метод молекулярной визуализации основан на принципах фармакологии и на исследовании накопления и распределения в организме различных химических соединений [Phelps М. et al., 1979]. В настоящее время этот метод представляет собой сплав фармакологии и ядерной медицины, в котором велика доля методов клеточной и молекулярной биологии, а также химии и физики элементарных частиц [Hackman Т. et al., 2002]. Все большее значение начинают приобретать также математическое описание и оценка биологических процессов, что позволяет использовать различные способы анализа, основанные на реконструировании данных и их представления в легко читаемом формате [Zanzonico Р., 2006; Serganova I. et al., 2008].

Однако возникают существенные препятствия на пути использования этих методов в клинике, одно из них — иммунологическая реактивность человека к большинству репортерных белков. Поэтому особое значение (при лечении людей) имеют попытки использовать в методе визуализации белки человека.

В качестве одного из новых и перспективных белков для доклинической и клинической визуализации рассматривают транспортер норад-реналина человека (чНАТ). Этот белок прекращает передачу нервного импульса через норадреналиновые рецепторы путем быстрого захвата и переноса выделенного в межсинаптическое пространство норадреналина в пресинаптические терминалы. чНАТ осуществляет контроль опосредуемых норадреналином физиологических процессов и эффектов поведения.

В настоящее время клонированы гены белка HAT крысы, быка и человека. Экспрессия гена HAT у млекопитающих происходит почти исключительно в центральной и периферической симпатической нервной системе. Эта особенность явилась основой для предложений попытаться использовать ген чНАТ в качестве репортерного при различных злокачественных новообразованиях у экспериментальных животных и человека. Такой подход дает ряд преимуществ, главным из которых является то, что имеются тестированные и опробованные радиохимические маркеры, одобренные в ряде государств.

Основной этап исследований в данный момент — проведение доклинических исследований, направленных на изучение возможности использования белка чНАТ для его применения при визуализации клинически значимых патофизиологических параметров опухолевых клеточных популяций. Ключевое значение приобретает разработка новых радиоактивно меченых проб, которые были бы более безопасны и эффективны для применения как на лабораторных животных, так и, в дальнейшем, у больных в клинике.

Цель исследования

Целью нашего исследования является анализ функции и свойств человеческого норадреналинового транспортера (чНАТ) для изучения перспектив его использования в качестве репортерного гена при визуализации биологических процессов, характерных для патофизиологии опухолевых клеток и тканей. Вначале эти исследования проводятся на экспериментальных животных, а затем - в доклиническом анализе и в клинической диагностике злокачественных новообразований у человека.

Конкретные задачи

1. Создать стабильно экспрессирующие ген транспортера чНАТ клеточные линии и выяснить, накапливают ли трансдуцированные клетки радиоактивно меченые пробы в количествах, существенно больших и достаточных для визуализации метки in vivo по сравнению с клетками неонкогенного происхождения (отрицательный контроль).

2. Оценить, функционирует ли чНАТ в трансдуцированных опухолях, и провести сравнительные опыты по визуализации накопления

123 124 меченых I и I проб белка при помощи однофотонного и позитронно-эмиссионного томографов.

3. Исследовать возможность использования оптических репортер-ных систем в качестве независимых контролей экспрессии конструкций, содержащих ген чНАТ, in vitro и in vivo.

4. Выяснить, имеется ли корреляция между увеличением интенсивности сигнала и уровнем пролиферации опухолевых клеток при использовании репортерной системы чНАТ.

5. Определить, можно ли визуализировать чНАТ-позитивные опухолевые клетки в процессе метастазирования.

Научная новизна

При комплексном анализе человеческого норадреналинового транспортера (чНАТ) в злокачественных и нормальных клетках мыши, крысы, обезьяны и человека впервые получены следующие результаты.

Показано, что в клетках, трансдуцированных геном чНАТ, сохраняется его стабильная экспрессия в течение более двух лет.

Сконструированы синтезирующие белок чНАТ (позитивные) клеточные линии со склонностью к метастазированию.

Создан аналог норадреналина, меченый позитрон-испускающим изотопом йода — [1241]-тиеша-йодбензилгуанидин (МИБГ).

Проведено комплексное сравнение in vitro и in vivo используемой в клинике пробы, меченой позитрон-испускающим изотопом йода — [1241]-МИБГ.

Получены изображения чНАТ позитивных опухолей различной локализации с применением позитронно-эмиссионной томографии.

Разработана модель стимуляции метастатического распространения чНАТ-позитивных опухолей с последующей неинвазивной визуализацией метки in vivo.

Научно-практическая значимость

Разработанные и оптимизированные чНАТ-содержащие репортер-ные системы позволяют проводить доклиническую и клиническую оценку ряда физиологических и патофизиологических процессов in vitro и in vivo с помощью новейших методов молекулярной визуализации, таких как ОФКТ и ПЭТ. Разработка нового радиоактивного препарата, с изотопом, разрешенным для клинического использования, способствовала активным усилиям по внедрению данной пробы в клиническую практику и для продолжения работы по изучению возможности создания более совершенных клинико-лабораторных радиоактивных препаратов на основе синтетического нордреналина. Очень важна также работа, направленная на изучение способов применения данного репортерного гена для решения различных лабораторных задач, таких как оценка миграции, селективности и пролиферации клеток-мишеней. Это придает данной работе статус универсального подхода к изучению любых других биологических процессов, выходящих за пределы раковых клеток, в частности, и онкологических заболеваний, в целом. Применение генов, белки которых облегчают оптическую визуализацию, предоставляет возможность независимой оценки экспрессии чНАТ и корреляции различных процессов в опухолях.

Внедрение в практику

Содержащие ген чНАТ репортерные системы используют при различных моделях раковых заболеваний в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и педиатрии Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического центра (МСКОЦ, Нью-Йорк, США). Радиоактивно меченая проба, [1241]-МИБГ, проходит в настоящее время процедуру официальной регистрации для внесения в список реагентов для клинического применения. Репортерную систему с геном чНАТ активно используют в доклинической практике для изучения возможности терапии лим-фомы, вызываемой вирусом Эпштейн-Барра, с помощью Т-лимфоцитов.

Место выполнения работы

Работа выполнена на базе научно-клинических отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития (Москва, РФ) и на базе МСКОЦ (Нью-Йорк, США), в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и радиохимии.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из Оглавления, Введения, Обзора литературы (96 источника), Методической части, пяти глав по результатам Собственных исследований и их обсуждения, Заключения, Выводов и Списка цитируемых публикаций. В тексте содержится 16 рисунков (диаграмм и фотографий), 1 таблица.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мороз, Максим Аркадьевич

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы генетические контрукции, кодирующие человеческий транспортер норадреналина (чНАТ), для использования его при динамической неинавазивной оценке различных патофизиологических процессов в опухолевых клетках с применением однофотон-ной и позитронно-эмиссионной томографии. Созданы ретровирусные носители для трансдукции клеток-мишеней.

2. Разработаны мультимодальные генетические конструкции, содержащие как ген чНАТ, так и ряд других генов для оптической визуализации (с помощью флуоресцентных маркеров, конфокальной микроскопии, проточной цитофлуорометрии и общей оценки флуоресцентного и биолюминесцентного сигналов in vitro и in vivó).

3. Сравнительный анализ распределения меченых радиоактивным йодом проб в клетках мыши (фибробласты), крысы (глиома), обезьяны (клетки опухоли почечной ткани) и человека (предшественники Т-лимфоцитов, нейробластома, фибробласты) показал, что накопление в нормальных клетках не отличается от отрицательных контролей, а соотношение накопления в чНАТ-позитивных и негативных клетках составляет от 45:1 до 150:1. Экспрессия гена чНАТ стабильна в течение двух лет наблюдений.

4. Показано преимущество впервые предложенной нами пози-трон-испускающеи пробы [1241]МИБГ перед клинически одобренной joi пробой [ ЦМИБГ, которое состоит в том, что возникает возможность использования позитронной томографии, а также в том, что период полураспада этого изотопа существенно больше. Возможность применить для визуализации меченой пробы позитронно-эмиссионный томограф позволяет определять клетки-мишени с высокой (до 1,8 мм) разрешающей способностью (по сравнению с 5-15 мм при однофотонной томографии), а использование долгоживущего изотопа позволяет проводить мониторинг в течение 96 ч и получать высокое соотношение специфического и неспецифического сигнала через 24 ч (30:1), 48 ч (90:1) и 72 ч(160:1).

5. чНАТ-негативные ткани не накапливают радиоактивно меченые пробы, а в тканях, естественно экспрессирующих ген чНАТ (сердце, надпочечники), радиактивность вначале накапливается до 4 ч после введения, а затем быстро и практически полностью к 12 ч выводится из организма.

6. При достаточно высоком уровне накопления радиоактивной пробы в чНАТ-позитивной модели in vivo возникает возможность проводить визуализацию не только значительной массы клеток, но и малых клеточных популяций.

7. Доказана возможность визуализации метастазов, состоящих из чНАТ-позитивных клеток.

Благодарности

В заключение, я приношу глубокую благодарность моим руководителям за переданные знания и помощь. Я благодарен коллективу моей лаборатории, а особенно Инне Сергеевне Сергановой, за помощь в работе и опыт, которым они щедро делились со мной. Я благодарю моих оппонентов и рецензентов, а особенно Вернату Викторовну Гречко за советы и конструктивную критику моей работы.

Отдельно я благодарю мою семью за терпение и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее десятилетие быстрое развитие получили молекуляр-но-генетические исследования в онкологии, направленные на изучение многочисленных, часто пересекающихся, путей регуляции при формировании злокачественных новообразований, особенно в таких разделах, как онкогенез и развитие опухолей.

Началась эра молекулярной медицины, и ее преимущества для пациентов будут очевидны в ближайшем будущем. В качестве примера можно привести высокую эффективность препарата Гливек (imatinib mesylate) в лечении ранее практически неизлечимых стромальных гастро-интерстициальных опухолей и хронического миелоидного лейкоза, механизм действия которого основан на избирательном взаимодействии с рецепторами мутированных или гиперэкспрессированных тирозинкиназ cKit u Bcr-Abl [Сельчук В.Ю., 2004].

Разработанные способы оценки механизмов клеточной активации, пролиферации, экспрессии генов пока не дают возможности проводить анализы, которые позволили бы получить в режиме реального времени информацию, имеющую принципиально важное значение для тактики лечения и прогноза онкологических больных. Развитие и клиническая адаптация использования репортерных генов является важным фактором развития таких многообещающих направлений современной медицины как генная терапия, адаптивная терапия, трансплантация стволовых клеток.

Генетическая визуализация живых организмов в качестве диагностической клинико-лабораторной процедуры также переживает значительный подъем и на данный момент может быть определена как макроскопическая визуализация процессов в клетке на молекулярном уровне в реальном времени.

Данная дисциплина уходит корнями, как в молекулярную биологию, так и в химию, в целом, и радиохимию, в частности.

Существуют три основные стратегии визуализации, основанные на «прямом» или «опосредованном» определении молекулярно-генетических процессов, а также, так называемая «суррогатная» визуализация биомаркеров, представляющая сочетание методов визуализации, созданных на основании использования радионуклидных, магнитно-резонансных и оптических систем.

На данный момент наиболее хорошо внедрены в клиническую практику методы «прямой» ядерной визуализации (nuclear imaging), основанные на использовании химических и радиохимических соединений: биоконъюгатов со специфическими свойствами образования комплексов с другими молекулами, содержащими парамагнитные частицы для ядерно-магнитной визуализации или радиоизотопов для позитронно-эмиссионной или однофотонной томографии.

Радиоактивно меченые пробы, основанные на «прямой» визуализации широко используют в отделениях радиологии. Современный уровень радиохимии позволяет разрабатывать химические пробы специфичные для отдельных групп белков, что дает возможность снизить уровень неспецифического накопления и получать четко различимый сигнал при низких дозах радиоактивности.

Однако не решенными остаются вопросы, связанные с применением различных белков в комплексе методов молекулярной визуализации, что представляет все больший интерес для фундаментальных и клинических исследований в гематологии, онкологии и иммунологии.

Тем не менее, подобная практика активно внедряется в настоящее время с целью скорейшего создания, тестирования и внедрения новых компонентов для визуализации, таких как активируемые ферментативные сигнальные системы, специфичные для определенных путей регуляции, а также веществ, имеющих узкоспецифическую реактивность к молекулам, таким как ДНК, мРНК и белки.

Однако, постоянным лимитирующим фактором для «прямой» визуализации является необходимость разработки проб, специфичных для каждой отдельной молекулы-мишени и для длительного тестирования, направленного на определение чувствительности, специфичности и безопасности данного соединения, перед разрешением к применению в клинической практике.

Принципиально важным вопросом в процессе клинической адаптации методов молекулярной визуализации является иммунореактив-ность применяемых репортерных белков. Наиболее распространенные пути решения данной проблемы - это разработка синтетических аналогов различных соединений и применение в качестве репортерных белков, имеющих человеческое происхождение.

Биомаркёрная, или «суррогатная», визуализация отражает внутренние молекулярно-генетические процессы и наиболее привлекательна для клинического внедрения в ближайшее время. Основанием для этого является наличие большого числа радиопрепаратов и существующих методов, которые можно применить для мониторинга на молекулярном уровне путей регуляции различных процессов, значимых для развития онкологических заболеваний. Пример подобного подхода - визуализация с помощью позитронно-эмиссионной томографии молекул глюкозы, меченых изотопом 18Б.

Следует отметить что «суррогатная» визуализация является менее специфичной и менее обеспеченной количеством различных проб, чем другие методы, но это в значительной степени компенсируется тем, что уже создано и тестировано большое число радиопроб, многие из которых в настоящее время внедрены в клиническую практику.

Данный вид визуализации лучше всего характеризуется результатами клинического применения позитронно-эмиссионной томографии молекул глюкозы, меченых изотопом 18Р для оценки развития и ответа на терапию различных опухолей. Разработка новых методов биомаркерной визуализации на основе уже одобренных для клинического применения радиопроб и контрастёров более оперативно решаемая задача, чем внедрение любых других методов визуализации, таких как визуализация репортерных генов или «прямая» визуализация.

Исследования в области визуализации репортерных генов на данный момент ограничены, практически, использованием лабораторных животных, поскольку необходимо создать и использовать клеточные культуры, экспрессирующие специфические генетические конструкции; альтернативой для этого является только создание специальных линий трансгенных животных, несущих необходимые векторы в своем геноме.

Идеальных генетических векторов для избирательной визуализации процессов в конкретных органах и тканях (в частности опухолевой) на данный момент не существует, но ведутся их активные поиски в области генетической терапии. Следует отметить, что каждый новый вектор требует тщательного и длительного тестирования для получения разрешения применять его в клинической практике. Тем не менее, визуализация репортерных генов, особенно экспрессированных в специально созданных клеточных линиях, имеет ряд преимуществ. На данный момент имеется три хорошо изученных репортерных гена - симпортер натрия и йода (чНИС), транспортер норадреналина (чНАТ) и соматоста-тиновый репортер 2 (Ъ88ТЕ12), для которых разработаны радиопробы, одобренные для клинического применения с использованием позитронно-эмиссионной и однофотонной томографии. Данные пары (ген + проба) являются отличными кандидатами для визуализации репортерных генов у больных. Важно отметить, что репортеные гены человеческого происхождения, как мы уже отмечали, вызывают значительно менее выраженный иммунный ответ, чем те репортерные гены, которые в данный момент используются для опытов у лабораторных животных (вирусные ферменты, люциферазы и флуоресцентные белки). Следует также отметить, что одна и та же пара ген-проба может быть использована для визуализации различных репортерных систем и, следовательно, для оценки различных биологических и молекулярно-генетических процессов.

В случае одобрения «репортерной пары» (ген — проба) основное внимание разрешающих организаций будет обращено на генетическую последовательность вектора, частью которого является репортерный ген, который и будет использован для трансдукции репортерных клеточных линий или тканей как ex vivo, так и ш vivo.

Основным лимитирующим фактором для перевода «репортерной» визуализации в клинику является необходимость проведения трансдукции (чаще всего, с помощью вирусных носителей — для достижения высокой эффективности) клеточных линий. Начало новому направлению современной функциональной диагностики положила разработка методик неинвазивной визуализации различных молекулярно-биологических процессов в режиме реального времени на основе репортерных систем, экспрессирующих тимидинкиназу вируса простого герпеса первого типа (ТКВПГ1, ТК) в качестве репортерного гена. Эти тест-системы позволили определить локализацию и количественно оценить степень и длительность экспрессии репортерного гена in vivo с помощью рутинного клинического радиологического оборудования, такого как гамма-камера или ПЭТ. Применение данной методики в целях мониторинга молеку-лярно-биологических процессов в Т-лимфоцитах позволяет определить локализацию и оценить их функциональное состояние (активацию, анергию, апоптоз) в организме животного или человека, что и явилось одной из ключевых задач данной диссертационной работы. Исследования вариантов применения репортерных генов, в целом, и ядерных ре-портерных генов для оценки специфической активации, миграции и пролиферации Т-лимфоцитов представляет огромный интерес для клинической практики. Отсутствие эффективных методик оценки функционального состояния Т-клеток in vivo в режиме реального времени требует разработки новых методов мониторинга их локализации и функции in vivo.

Основная задача нашей работы состояла в разработке и оптимизации тест-системы для неинвазивной визуализации различных клеточных линий in vivo с помощью транспортера норадреналина человека (чНАТ). Это, в принципе, могло бы помочь контролировать эффективность новых методов иммунотерапии в гематологии, онкологии и иммунологии, а также визуально отслеживать миграцию и пролиферацию различных клеточных образований.

В результате нашего исследования был сконструирован, получен и апробирован репортерный химерный ген hNET-IRES-GFP, который можно использовать для динамической прижизненной оценки различных молекулярно-биологических процессов с использованием флуоресцентной, конфокальной микроскопии и FACS in vitro и in situ, а также гамма-камеры и ПЭТ- для неинвазивной визуализации этих процессов in vivo. Этот репортерный ген можно использовать также при разработке и оценке других репортерных систем с целью мониторинга различных молекулярно-биологических процессов in vitro и in vivo.

Далее нами показано, что функциональная активность системы hNET-IRES-GFP in vitro вполне пригодна для ПЭТ-визуализации и оценки жизнеспособности клеток, трандуцированных этим геном in vivo, с помощью чрезкожной (поверхностной) оптико-флуоресцентной визуализации (GFP-флуоресценции), индуцированной источником голубого света. Для исследования этой проблемы мы создали ряд клеточных линий, трансдуцированных химерным геном ЫчЕТ-ШЕБ-ОРР. Изучали линии как онкогенного, так и нормального происхождения - для оценки вероятных различий в экспрессии и функционировании системы. Многие линии были использованы впервые.

Основой проведенного исследования являлись последовательные сканирования экспериментальных животных на однофотонном и пози-тронно-эмиссионном томографах. Цель этих опытов — показать возможность в течение длительного времени оценивать уровень накопления радиоактивных маркеров в чНАТ-позитивных опухолях и обосновать подходы для использования технологии ПЭТ при визуализации данных проб. Впервые показано, что функция чНАТ может быть определена с высокой точностью и специфичностью в отдаленные сроки после однократной инъекции радиоактивной пробы.

Важным этапом нашей работы было изучение возможности использовать впервые синтезированный в МСКОЦ синтетический норад-реналин, меченый излучающим позитроны изотопом 1241 ([1241]МИБГ). На момент исследования в клинической практике применяли только синтетический норадреналин, меченный изотопом [1231], что не позволяло применять позитронно-эмиссионную томографию. [1241]МИБГ, в отличие от [1231]МИБГ, излучает позитроны с высокой энергией и его можно детектировать при помощи значительно более чувствительного метода - позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). После публикации наших исследований началась процедура сертификации синтетиче

124т ского норадреналина, меченого изотопом I, что позволит переити к применению его в клинике. Важно отметить еще одно важное, помимо

124т эмиссии протонов, преимущество, которое имеет изотоп I - время его периода полураспада больше, что позволяет проводить оценку его накопления в течение более длительных периодов времени, уже после выведения большей части неспецифической радиоактивности.

На заключительном этапе был разработан и экспериментально апробирован метод, позволяющий оценивать пролиферацию и метастази-рование различных клеточных линий, трансдуцированных химерным геном ЬЫЕТ-ЖЕЗ-ОРР, на основе визуализации радиоактивно меченой пробы — синтетического норадреналина. Показано, что возможна четкая визуализация небольших групп клеток (на примере метастатической модели карциномы легких). Это позволяет надеяться на применение чНАТ для оценки жизнеспособности, пролиферации и миграции небольших клеточных популяций как для диагностики онкологических заболеваний, так и для оценки эффективности клеточной терапии.

Учитывая то, что естественная экспрессия чНАТ происходит только в нервных клетках, а также то, что он имеет человеческое происхождение (а это определяет его специфичность и относительно низкую иммунореактивность), использование этого маркера в клинической практике как репортерного гена для ПЭТ-визуализации опухолей,, развивающихся из предшественников нервной ткани (нейробластома, фео-хромоцитома), а также при проведении клеточной и генной терапии, представляется весьма перспективной и реально выполнимой задачей.

Как минимум, две разновидности репортерных конструкций будут востребованы в ближайшем будущем для «репортерной» визуализации. Одна из них - постоянно экспрессирующиеся векторы, которые могут быть использованы для идентификации места, длительности и срока доставки вектора и трансдукции тканей или для определения миграции, распределения мишеней репортерных клеток. Их можно использовать для определения длительности переживания (присутствия) терапевтических клеток при адаптивной терапии.

Вторая разновидность - системы с «включаемой» экспрессией, которые будут чувствительны к наличию и/или активации внутренних транскрипционных факторов, необходимых для регуляции различных процессов, а также для белковых взаимодействий, которые имеют значение в регуляции, функции и биологической активности репортерных клеток.

Вначале использование таких двойных репортерных систем в клинике, скорее всего, будет определяться участием в генетической и адаптивной терапии с применением собственных клеток больного (Т-клеток, клеток-предшественников и т.д.) в качестве репортерных. Для этого клетки будут выделены и трансдуцировны ex vivo специфической конструкцией, а затем введены обратно пациенту. С нашей точки зрения, адаптивная Т-клеточная терапия может значительно выиграть от возможности визуализации миграции, активации, пролиферации и сохранения эффекторных клеток. Все это процессы вполне могут быть визуализированы с помощью серии позитронно-эмиссионных сканирований пациентов [Ширяев C.B., 2004].

Возможность визуализировать транскрипционную и пост-транкрипционную регуляцию эндогенной экспрессии гена-мишени, так же как и внутриклеточного белкового взаимодействия, является весьма перспективной и в будущем предоставит новые возможности для лечения пациентов, включая визуализацию «фенотипа» опухолевых клеток на молекулярном уровне и его изменения во времени. Очень важна возможность мониторинга лекарственного эффекта узкоспецифичных препаратов на молекулярном уровне, за счет изучения различных путей регуляции культур опухолевых клеток, взятых от пациентов.

Развитие данного комплекса методов в клинике будет зависеть от того, как быстро будут созданы «диагностические» генетические конструкции, несущие репортерные гены для создания репортерных клеточных линий, но можно быть уверенным, что в ходе развития «прямой» и «непрямой» визуализации в ближайшее десятилетие эти проблемы будут успешно решены.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мороз, Максим Аркадьевич, Москва

1. Altmann A., Kissel М. et al. Increased MIBG uptake after transfer of the human norepinephrine transporter gene in rat hepatoma// J Nucl Med.- 2003.- v. 44.- p. 973-980.

2. Anton M., Wagner B. et al. Use of the norepinephrine transporter as a reporter gene for non-invasive imaging of genetically modified cells// J Gene Med.- 2004.- v. 6.- p. 119-126.

3. Axelrod J., Weil-Malherbe H., Tomchic K. The physiological disposition of H3-epinephrine and its metabolite metanephrine// J Pharmacol Exp Ther.- 1969.- v. 127.- p. 251-256.

4. Axelrod J., Kopin I.J. The uptake, storage, release and metabolism of noradrenaline in sympathetic nerves!I Prog Brain Res.- 1969.- v. 31.-p. 21-32.

5. Barnett E.M.,Zhang X. et al. Singlecell imaging of retinal ganglion cell apoptosis win a cell-penetrating, activatable peptide probe glaucoma model//Proc Natl Acad Sci (USA).- 2009.- v. 9.- p. 11-16.

6. Barrio J.R.,Satyamurhy N. et al. 3-(2'-18F.fluoroethyl) spiperone: in vivo biochemical and kinetic characterization in rodents, nonhuman primates, and humans//J Cereb Blood Flow Metab.- 1989.- v. 9.- p. 830-839.

7. Beattie В.J.,Forster G.J. et al. Multimodality registration without a dedicated multimodality scanner// Mol Imaging.- 2007.- v. 6.- p. 108-120.

8. Bigott H., Prior J.L., Piwnica-Worms D., Welch M. Imaging multidrug resistance P-glycoprotein transport function using micro pet with technetium94msestambili//Mol Imaging.- 2005.- v. 4- p. 30-39.

9. Blasberg R. Imaging gene expression and endogenous molecular processes: molecular imaging// J Cereb Blood Flow Metab.- 2002.- v. 22.- p. 1157-1164.

10. Bonisch H., Bruss M. The no epinephrine transporter in physiology and disease//High-Energy Physics.- 2006.- v. 175.- p. 485-524.

11. Brader P.,Riedl C.C., et. al. Imaging of hypoxia-driven gene expression in an orthotopic liver tumor model// Mol Cancer Ther.- 2007.- v. 6.-p. 2900-2908.

12. Bruss M., Kunz J., Lingen B., Bonisch H. Chromosomal mapping of the human gene for the tricyclic antidepressant sensitive noradrenaline transporter//Human Genet.- 1993.- v. 91.- p. 278-280.

13. Buursma A.R., Beerens A.M. et al. The human norepinephrine transporter in combination with 1 lC-m-hydroxyephedrine as a reporter gene/reporter probe for PET of gene therapy// J Nucl Med.- 2005.- v. 46.- p. 2068-2075.

14. Che J., Dubrovin M. et al. hNIS-IRES-eGFP dual reporter gene imaging// Mol Imaging.- 2005.- v. 4.- p. 128-136.

15. Ciceri F., Bonini C. et al. Antitumor effects of HSV-TK-engineered donor lymphocytes after allogeneic stem-cell transplantation// Blood.- 2007.-v. 109.-p. 4698-4707.

16. Coyle J.T., Snyder S.H. Catecholamine uptake by synaptosomes in homogenates of rat brain: stereospecificity in different areas// J Pharmacol Exp Ther.- 1969.- v. 170.- p. 221-231.

17. De Vries E.F., Buurma et al. Scintigraphic imaging of HSVtk gene therapy//Curr Pharm Des.- 2002.- v. 8.- p. 1435-1450.

18. Ding Y.S., Fowler J. New-generation radiotracers for nAChR and NET//Nucl Med Biol.- 2005.- v. 32.- p. 707-718.

19. Doubrovin M., Ponomarev V. et al. Imaging transcriptional regulation of p53-dependent genes with positron emission tomography in vivo// Proc Natl Acad Sci (USA).- 2001.- v. 98.- p. 9300-9305.

20. Doubrovin M., Ponomarev V., Blasberg R.G. PET-based reporter gene imaging. Assessment of endogenous molecular-genetic events// IEEE Eng Med Biol Mag.- 2004.- v. 23.- p. 38-50.

21. Doubrovin M.,Serganova I. et al. Multimodality in vivo molecular-genetic imaging//Bioconjug Chem.- 2004.- v. 15.- p. 1376-1388.

22. Doubrovin M.M., Dubrovina E.S. et al. In vivo imaging and quantitation of adoptively transferred human antigen-specific T cells transduced to express a human norepinephrine transporter gene// Cancer Res.- 2007.- v. 67.-p. 11959-11969.

23. Dubey P.,Su H. et al. Quantitative imaging of the T cell antitumor response by positron-emission tomography// Proc Natl Acad Sci (USA).-2003.-v. 100.-p. 1232-1237.

24. Edelstein M.L., Abedi M.R., Wixon J. Gene therapy clinical trials worldwide to 2007-an update,//J Gene Med.- 2007.- v. 9.- p. 833-842.

25. Edelstein M.L.,Fbedi M.R. et al. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004-an overview//J Gene Med.- 2004.- v. 6.- p. 597-602.

26. Esler M., Jennings G., Korner P., Willett I., Dudley F., Hasking G., Anderson W., Lambert G. Assessment of human sympathetic nervous-system activity from measurements of norepinephrine turnover// Hypertension.- 1988.- v.ll.- p.3-20.

27. Elshina M.A. Functional development of inferior mesenteric ganglion during ontogenesis in cats// Neuroscience and Behavioral Physiology.- v. 2.- p. 631-636.

28. Ezziddin S., Logvinski T. et al. Factors predicting tracer uptake in somatostatin receptor and MIBG scintigraphy of metastatic gastroenteropan-creatic neuroendocrine tumors// J Nucl Med.- 2006.- v. 47.- p. 223-233.

29. Faraone S.V., Perlis R.H. et al. Molecular ginetics of attention deficit / hyper-reactivity disorder// Biol Psychiatry.- 2005.- v. 57.- p. 13131323.

30. Gelernter J., Kruger S. et al. Assignment of the nor epinephrine transporter protein (NET1) locus to chromosome-16// Genomics.- 1993.- v. 18.-p. 690-692.

31. Glowniak J.V. Cardiac uptake of MIBG in patients with aortic stenosis// JNuclMed.- 1993.-v. 34.- p. 1392-1395.

32. Glowniak J.V., Kilty J.E. et al. Evaluation of metaiodobenzylgua-nidine uptake by the norepinephrine, dopamine and serotonin transporters// J Nucl Med.- 1993.- v. 34.- p. 1140-1146.

33. Haberkorn U., Altmann A. Imaging methods in gene therapy of cancer// Curr Gene Ther.- 2001.- v. 1,- p. 163-182.

34. Haberkorn U., Henze M. et al. Transfer of the human Nal sym-porter gene enhances iodide uptake in hepatoma cells// J Nucl Med.- 2001.-v. 42.- p. 317-325.

35. Haberkorn U., KinscherfR. et al. Enhanced iodide transport after transfer of the human sodium iodide symporter gene is associated with lack of retention and low absorbed dose// Gene Ther.- 2003.- v. 10.- p. 774-780.

36. Haberkorn U., Schoenberg S.O. Imaging of lung cancer with CT, MRTand PET//Lung Cancer.- 2001.- v. 34.- p. 13-23.

37. Hackman T.,Doubrovin M. et al. Imaging expression of cytosine deaminase-herpes virus thymidine kinase fusion gene (CD/TK) expression with 124IJFIAU and PET// Mol Imaging.- 2002.- v. 1.- p. 36-42.

38. Heemskerk B.,Liu K. et al. Adoptive Cell Therapy for Patients with Melanoma, Using Tumor-Infiltrating Lymphocytes Genetically Engineered to Secrete Interleukin-2//Hum Gene Ther.- 2008.- v. 2.- 63 P.

39. Hoffman J.M., Gambhir S.S. Molecular imaging: the vision and opportunity for radiology in the future// Radiology.- 2007.- v. 244.- p. 39-47.

40. Hoffman J.M., Gambhir S.S., Kelloff G.J. Regulatory and reimbursement challenges for molecular imaging// Radiology.- 2007.- v. 245.- p. 645-660.

41. Iversen L.L. The uptake of Noradrenaline by the isolated perfused rat heart//Br J Pharmacol Chemother.- 1963.- v. 21.- p.523-537.

42. Jacobs A., Braulich I. et al. Quantitative kinetics of 124IJFIAU in cat and man// J Nucl Med.- 2001.- v. 42,- p. 467-475.

43. Jacobs A., Voges J. et. al. Positron-emission tomography of vector-mediated gene expression in gene therapy for gliomas!I Lancet.- 2001.- v. 358.- p. 727-729.

44. Koehne G., Doubrovin M. et al. Serial in vivo imaging of the targeted migration of human HSV-TK-transduced antigen-specific lymphocytes// Nat Biotechnol.- 2003.- v. 21.- p. 405-413.

45. Laxman B., Laxman B. et al. Noninvasive real-time imaging of apoptosis//Proc Natl Acad Sci (USA).- 2002.- v. 99.- p. 16551-16555.

46. Lin Z., Madras B.K. Human genetics and pharmacology of neurotransmitter transporters// Handb Exp Pharmacol.- 2006,- v. 175.- p. 327371.

47. Logan J.,Ling Y.S. et al. Modeling and analysis of PET studies with norepinephrine transporter ligands: the search for a reference region// Nucl Med Biol.- 2005.- v. 32.- p. 531-542.

48. Lu C.C., Tseng C.J., Tang H.S., Tung C.S. Orthostatic intolerance: potential pathophysiology and therapy// Chin J Physiol.- 2004.- v. 47.-p. 101-109.

49. MacLaren D.C.,Gambhir S.S. et al. Repetitive, non-invasive imaging of the dopamine D2 receptor as a reporter gene in living animals// Gene Ther.- 1999.-v. 6.- p. 785-791.

50. McElroy W.D, DeLuca M.A. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications// J Appl Biochem.- 1983.- Jun.- v. 5(3).-p. 197-209.

51. Massague J. TGF beta in cancer// Cell.- 2001.- v. 134.- p. 215230.

52. Moroz M.A.,Serganova I. et al. Imaging hNET reporter gene expression with 124I-MIBG// J Nucl Med.- 2007.- v. 48.- p. 827-836.

53. Moroz M.A., Kochetkov T. et al. Imaging colon cancer response following treatment with AZD1152: a preclinical analysis of 18F.fluoro-2-deoxyglucose and 3'-deoxy-3'-[18F]fluorothymidine imaging//Q\m Cancer Res.- 2011.- Jan 18. [Epub ahead of print]

54. Owen D., Du L.S., Bakish D., Hzdina P.D. Nor epinephrine transporter gene polymorphism in not associated with susceptibility to major depression//Vsychidtry Res.- 1999.-v. 87.-p. 1-5.

55. Pacholczyk T., Blakely R.D., Amara S.G. Expression cloning of a cocaine- and antidepressant-sensitive human noradrenaline transporter// Nature.- 1991.- v. 350.- p. 350-354.

56. Penuelas I.,Mazzolini G. et al. Positron emission tomography imaging of adenoviral-mediated transgene expression in liver cancer patients// Gastroenterology.- 2005.-v. 128.-p. 1787-1795.

57. Phelps M.E., Huang S.C. et al. Tomographic measurement of local cerebral glucose metabolic rate in humans with (F-18) 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose: validation of met hog// Ann Neurol.- 1979.- v. 6.- p. 371388.

58. Ponomarev V., Doubrovin M. et al. Imaging TCR-dependent NFAT-mediated T-cell activation with positron emission tomography in vivo// Neoplasia.- 2001.- v. 3.- p. 480-488.

59. Ponomarev V., Doubrovin M. et al. Cytoplasmically retargeted HSVl-tk/GFP reporter gene mutants for optimization of noninvasive molecular-genetic imaging// Neoplasia.- 2003.- v. 5.- p. 245-254.

60. Porzgen P., Bonisch H., Bruss M. Molecular cloning and organization of the coding region of the human norepinephrine transporter gene// Biochem Biophys Res Commun.- 1995.- v. 215.- p. 1145-1150.

61. Qiao J.,Doubrovin M. et al. Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy// Gene Ther.- 2002,- v. 9.- p. 168-175.

62. Reeves S.J.,Grasby P.M. et al. A positron emission tomography (PET) investigation of the role of striatal dopamine (D2) receptor availability in spatial cognition//Neuroimage.- 2005.- v. 28.- p. 216-226.

63. Riddell S.R.,Elliot M. et al. T-cell mediated rejection of gene-modified HIV-specific cytotoxic T lymphocytes in HIV-infected patients// Nat Med.- 1996.- v. 2.- p. 216-223.

64. Rogers B.E., McLean S.F. et al. In vivo localization of (lll)In.-DTPA-D-Phel-octreotide to human ovarian tumor xenografts induced to express the somatostatin receptor subtype 2 using an adenoviral vector/I Clin Cancer Res.- 1999.- v. 5.- p. 383-393.

65. Rosenberg S.A., Restifo N.P. et al. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy// Nat Rev Cancer.- 2008.- v. 8.-p. 299-308.

66. Rossin R., Berndorff D. et al. Small animal PET of tumor angio-genesis using a (76) Br-labeled human recombinant antibody fragment to the domain of fibronectin// J Nucl Med.- 2007.- v. 48.- p. 1172-1179.

67. Сельчук В. Ю. Неэпителиалъные опухоли ЖКТмезенхималъ-ного происхождения// Энциклопедия клинической онкологии.- М.-2004.- с. 241-244.

68. Scholz М., Lorenz A. et al. Current status of intraoperative real-time vibrography in neurosurgery// Ultraschall Med.- 2007.- Bd. 28.-S. 497-498.

69. Schomig E., Haass M., Richardt G. Catecholamine release and arrhythmias in acute myocardial ischaemiall Eur Heart J.-1991.- 12 Suppl F.-p.38-47

70. Schroeder C., Tank J., Boschmann M., Diedrich A., Sharma A.M., Biaggioni I., Luft F.C., Jordan J. Selective norepinephrine reuptake inhibition as a human model of orthostaticintolerance// Circulation.- 2002.- v. 105.- p. 347-353.

71. Schwaiger M., Kalff V. et al. Noninvasive evaluation of sympathetic nervous system in human heart by positron emission tomography// Circulation.- 1990.- v. 82.- p. 457-464.

72. Schwimmer J., Essner R. et al. A review of the literature for whole-body FDG PET in the management of patients with melanoma// J Nucl Med.- 2000.- v. 44.- p. 153-167.

73. Serganova J., Ponomarev V., Blasberg R. Human reporter genes: potential use in clinical studies// Nucl Med Biol.- 2007.- v. 34.- p. 791-807.

74. Serganova J., Mayer-Kukuck P., Huang R., Blasberg R. Molecular imaging: reporter gene imaging// Handb Exp Pharmacol.- 2008.- v. 185.-p. 167-223.

75. Shulkin B.L., Shapiro В. et al. Primary extra-adrenal pheochro-mocytoma: pos itive 1-123 MIBG imaging with negative 1-131 MIBG imaging// Clin Nucl Med.- 1986.- v. 11.- p. 851-854.

76. Shulkin B.L., Shapiro B. et al. Iodine-123-4-amino-3-iodobenzylguanidine, a new sympathoadrenal imaging agent: comparison with iodine-123 metaiodobenzylguanidine// J Nucl Med.- 1986.- v. 27.- p. 1138-1142.

77. Sisson J.C., Frager M.S. et al. Scintigraphic localization of pheo-chromocytoma// N Engl J Med.- 1981.- v. 305.- p. 12-17.

78. Solit D.B., Garraway L.A. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition// Nature.- 2006.- v. 439.- p. 358-362.

79. Ширяев C.B. Ядерная медицина в онкологии Л Энциклопедия клинической онкологии.- М.- 2004.- с. 117-125.

80. Tazebay U.H., Wapnir I.L. et al. The mammary gland iodide transporter is expressed during lactation and in breast cancer!7 Nat Med.-2000.- v. 6,- p. 871-878.

81. Tjuvajev J.G., Stockhammer G. et al. Imaging the expression of transfectedgenes in vivoII Cancer Res.- 1995.- v. 55.- p. 6126-6132.

82. Thomas J. Bruno, Paris D.N. Svoronos. CRC Handbook of Fundamental Spectroscopic Correlation Charts// CRC Press.- 2005.

83. Thorne N., Inglese J., Auld D.S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology// Chem Biol.- 2010.- v. 17- p. 646-57.

84. Tsien C.I., Cao Y., Lanrence T.S. Functional and metabolic magnetic resonance imaging and positron emission tomography for tumor volume definition in high-grade gliomas // Semin Radiat Oncology.- 2009.- v. 19.-p. 155-162.

85. Valk T.W., Frager M.S. et al. Spectrum of pheochromocytoma in multiple endocrine neoplasia. A scintigraphic portrayal using 1311-metaiodobenzylguanidine // Ann Intern Med.- 1981.- v. 94.- p. 762-767.

86. Wieland D.M., Brown L.E. et al. Myocardial imaging with a ra-dioiodinated norepinephrine storage analog// J Nucl Med.- 1981.- v. 22.- p. 22-31.

87. Wieland D.M., Brown L.E. et al. Imaging the primate adrenal medulla with 1231. and [1311] meta-iodobenzylguanidine: concise communication//! Nucl Med.- 1981.- v. 22.- p. 358-364.

88. Wu X., Lin D., Li G., Zuo Z. Statin post-treatment provides protection against simulated ischemia in bovine pulmonary arterial endothelial cells//"Eur J Pharmacol.- 2010.- v. 636 p. 114-20.

89. Yamada Y., Miyajima E., Tochikubo O., Matsukawa T., Ishii M. Age-related-changes in muscle sympathetic-nerve activity in essential-hypertension// Hypertension.- 1989.-v. 13.-p. 870-877.

90. Young J.B., Landsberg L. Cate-Cholamines and the adrenal medulla. In: Wilson J.D. et.al. (eds) Williams textbook of endocrinology, 9th end, W.B. Saunders, Philadelphia.- 1989.- p. 665-728.

91. Zanzonico P.B. Broad-spectrum multi-modality image registration: from PET, CT, and MRI to autoradiography, microscopy, and beyond// Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc.- 2006.- v. 1.- p. 1584-1588.

92. Zanzonico P.B. PET-based biological imaging for radiation therapy treatment planning// Crit Rev Eukaryot Gene Expr.- 2006.- v. 16.- p. 61101.

93. Zanzonico P.B. et al. Animal-specific positioning molds for registration of repeat imaging studies: comparative microPET imaging of F18-labeledfluoro-deoxyglucose and fluoro-misonidazole in rodent tumorsll Nucl Med Biol.- 2006.- v. 33.- p. 65-70.

Информация о работе

Мороз, Максим Аркадьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы