Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами

Колесникова, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами"

На правах рукописи

КОЛЕСНИКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

НАНОКОМПОЗИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К УЛЬТРАЗВУКУ, И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ

ОБЪЕКТАМИ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов-2010

1 1 НОЯ 2010

004612388

Работа выполнена на кафедре физики полупроводников факультета нано-и биомедицинских технологий Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук, доцент Горин Дмитрий Александрович

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов Богатырев Владимир Александрович

доктор физико-математических наук, профессор кафедры прикладной оптики и спектроскопии физического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Петров Владимир Владимирович

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится Н0&ЪР61 2010 г. в час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 2(2.243.05 по специальности 03.01.02 - «Биофизика» при Саратовском государственном университете им. Н.Г Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, ул. Университетская, 42).

Автореферат разослан 13 октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, профессор ^ В.Л. Дербов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Адресная доставка может осуществляться при помощи различных типов нано- и микроконтейнеров, пригодных для капсуляции биологически-активных веществ: наночастиц; липосом; полимерных мицелл; различных векторных конструкций, позволяющих направленно связываться и эндоцироваться в клетки-мишени; антител, обеспечивающих селективную сорбцию контейнеров на поверхности раковых клеток; рН-чувствительных носителей. Однако использование данных объектов затруднено высокой стоимостью их изготовления и малой стабильностью во времени. В связи с этим среди потенциальных средств адресной доставки следует особо выделить полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции [1].

Потенциальное использование полиэлектролитных микрокапсул в биомедицинских целях требует решения следующих задач: 1) возможность включения биологически-активных веществ в объем контейнеров с целью защиты организма от их несанкционированного действия, предохранения препаратов от внешней активной среды организма, а также обеспечения возможности их пролонгированного действия; 2) модификация свойств микроконтейнеров с целью реализации их адресной доставки к поврежденным органам и тканям, а также их локализации в строго заданных границах и областях; 3) обеспечение контролируемого высвобождения инкапсулированного вещества в непосредственной близости от пораженных участков организма.

Проницаемость оболочек микрокапсул может изменяться под действием различных факторов (температура, кислотность среды, полярность растворителя, ионная сила раствора и т.д.) [2]. Известны примеры создания биосовместимых микрокапсул с иммобилизованными в них биоактивными соединениями (белками, в частности, ферментами, ДНК, экстрактами лекарственных растений), применяемыми в биомедицине для репарации тканей [3]. Выбор в качестве составных компонентов оболочек микрокапсул материалов различной природы, позволяет получать многофункциональные носители, чувствительные к тому или иному внешнему воздействию (магнитному полю, лазерному излучению, ультразвуку и т.п.), что также существенно расширяет перспективы и повышает эффективность их использования [4-8]. Следует отметить, что не только выбор веществ, но и варьирование размера, структурирование оболочки микрокапсул путем изменения числа слоев в ней, объемной фракции различных

включений и т.п. позволяют достаточно точно управлять их физическими и химическими свойствами и делают возможной реализацию принципа «снизу-вверх».

Однако для достижения желаемого эффекта необходимо иметь механизм высвобождения закапсулированного вещества из объема микроконтейнеров. Воздействовать на проницаемость оболочек микрокапсул можно различными способами. Так, существуют работы по вскрытию микрокапсул лазерным излучением внутри клеток (in vitro) [8]. Однако в этом случае для достижения требуемых плотностей мощности лазерного излучения нужна его фокусировка на поверхности оболочки капсулы, что не всегда достижимо, особенно в биологических средах. В области биомедицинского применения, например, в терапии раковых заболеваний, зачастую требуется менее локальное воздействие, приводящее к одновременному вскрытию множества микрокапсул. Примером такого дистанционного, группового воздействия является ультразвук [6, 7]. Следует отметить, что ультразвук широко применяется в медицине в качестве средства диагностики и лечения многих (в том числе онкологических) заболеваний (ультразвуковая гипертермия, неинвазивная HIFU хирургия, сонодинамическая терапия). Известна возможность использования твердофазных нановключений-соносенсибилизаторов в биологических структурах в качестве концентраторов ультразвуковой энергии [7].

Возможность использования неорганических наночастиц в качестве соно-сенсибилизаторов, повышающих чувствительность полиэлектролитных микрокапсул к ультразвуку, показана ранее на примере наночастиц магнетита [6]. Однако на данный момент мощности ультразвука, используемого для разрушения оболочек микрокапсул, намного превышают безопасные терапевтические мощности. Добиться разрушения микрокапсул при меньших мощностях и более высоких частотах ультразвука можно путем подбора соносенсибилизато-ров, а также варьирования их объемной фракции в оболочке. Это позволит управлять механическими свойствами капсул и, следовательно, их чувствительностью к ультразвуку. В данной работе в качестве соносенсибилизаторов были выбраны наночастицы магнетита и оксида цинка. Магнетит может использоваться для функционализации оболочек микрокапсул с целью обеспечения их управляемого перемещения под действием магнитного поля. Выбор наночастиц оксида цинка обусловлен тем, что они являются хорошим антибактериальным агентом [9] и применяются в терапии онкологических заболеваний [10].

Цель работы и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось создание нанокомпозитных микрокапсул, чувствительных к ультразвуку, повышение их чувствительности путем оптимизации состава и структуры оболочек, а также изучение взаимодействия капсул с биологическими средами и объектами.

Основными задачами исследования являлись: 1. Получение нанокомпозитных микрокапсул, содержащих в структуре оболочки наночастицы магнетита, и исследование их чувствительности к

ультразвуку в зависимости от объемной фракции наночастиц магнетита в оболочке.

2. Формирование и оптимизация структуры и состава оболочек микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка, с целью повышения чувствительности капсул к ультразвуку путем варьирования объемной фракции наночастиц оксида цинка. Изучение взаимосвязи между параметрами, характеризующими механические свойства оболочек микрокапсул и их чувствительности к ультразвуковой обработке в зависимости от объемной фракции наночастиц оксида цинка.

3. Исследование взаимодействия микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка, с клетками крови и определение влияния физиологических свойств среды диспергирования (фосфатного буфера, плазмы крови и цельной крови) на чувствительность микрокапсул к ультразвуковой обработке.

4. Изучение процесса фагоцитоза микрокапсул белыми клетками крови в зависимости от их размера и строения оболочки. Изучение возможности использования фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек нанокомпозитных микрокапсул, образованных в результате ультразвуковой обработки.

5. Определение токсического эффекта, оказываемого ZnO-композитными микрокапсулами со структурой оболочки (PAH/PSS)j(ZnO/PSS)3 (PAH/PSS) и их составляющими компонентами на гидробионтов (церио-дафний (Ceriodaphnia afflnis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. reriö).

Научная новизна работы

1. Продемонстрирована возможность разрушения нанокомпозитных микрокапсул под действием низкочастотного (27 кГц) ультразвука с плотностью мощности 3.5 Вт/см2 в течение нескольких минут и обнаружена зависимость чувствительности капсул от объемной фракции наночастиц магнетита в структуре оболочки [JT4, Л6].

2. Получены нанокомпозитные микрокапсулы, функционализированные наночастицами оксида цинка, обнаружена высокая чувствительность данного типа контейнеров к низкочастотному (20 кГц) ультразвуку с плотностью мощности 0.6 Вт/см2, установлена зависимость механических свойств микрокапсул и их чувствительности к ультразвуку от объемной фракции наночастиц оксида цинка в оболочке [Л8].

3. Произведено разрушение ZnO-композитных оболочек микрокапсул под действием низкочастотного (20 кГц) ультразвука с плотностью мощности 0.6 Вт/см2 в физиологических средах - фосфатно-солевом буфере, плазме крови и крови. Показана возможность разрушения ZnO-композитных капсул в крови под действием ультразвука, не приводящая к нарушению цело-

стности клеток крови [J110].

4. Изучен механизм взаимодействия клеток крови с микрокапсулами в зависимости от их размера (фагоцитоз капсул) и показана возможность утилизации фрагментов оболочек, образовавшихся после ультразвукового разрушения капсул, посредством фагоцитоза.

5. Установлено снижение токсического эффекта, оказываемого нанокомпо-зитными микрокапсулами (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) на гидробио-нтов, по сравнению с их составляющими компонентами - полиэлектролитами и наночастицами оксида цинка.

Научно-практическая значимость работы

Созданы нанокомпозитные микрокапсулы с наночастицами магнетита в структуре оболочки, обладающие чувствительностью к магнитному полю и ультразвуковому излучению, что обеспечивает возможность реализации управляемой магнитным полем адресной доставки лекарственных веществ с последующим вскрытием микрокапсул при помощи ультразвука.

Реализовано существенное повышение чувствительности микрокапсул к ультразвуку путем встраивания в структуру их оболочек в качестве соносенси-билизатора наночастиц оксида цинка, что значительно повышает перспективы их использования в биомедицинских целях в качестве контейнеров адресной доставки за счет снижения необходимой для разрушения капсул мощности ультразвука и сокращения времени ультразвуковой обработки.

Продемонстрировано взаимодействие нанокомпозитных микрокапсул, содержащих наночастицы оксида цинка, с клетками крови, показана гемосовме-стимость данного типа микроконтейнеров и обнаружена зависимость протекания процесса фагоцитоза от размера капсул, что позволяет использовать явление фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул, образовавшихся после их вскрытия ультразвуком.

Обнаружен эффект разрушения ZnO-композитных микрокапсул в суспензии эритроцитов в результате ультразвуковой обработки, сопровождающийся частичным разрушением эритроцитов, то есть обнаружены пороговые параметры ультразвука, применимого для вскрытия капсул в присутствии биологических объектов, и показана необходимость дальнейшего повышения чувствительности микрокапсул путем подбора соносенсибилизаторов или путем оптимизации частоты и мощности ультразвука.

Произведен анализ токсичности ZnO-композитных микрокапсул и их составляющих компонент с использованием в качестве тест-систем гидробионтов (цериодафний (Ceriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio). Установлено, что наибольшей токсичностью из всех используемых компонент микрокапсул обладает раствор катионного полиэлектролита полиалиламина гидрохлорида (РАН) по сравнению с полистирол-сульфонатом натрия (PSS), комплексом PAH+PSS, наночастицами оксида цинка и микрокапсулами. Обнаружено существенное снижение острого токсиче-

ского эффекта для случая полиэлектролитного комплекса PAH+PSS, а также суспензии микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS).

Достоверность полученных результатов

Достоверность полученных результатов обусловлена применением в экспериментах стандартной измерительной аппаратуры и подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изменение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита (¿¡-потенциал -12.5 ±4 мВ, рН 7) позволяет регулировать чувствительность микрокапсул к низкочастотному ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см2). При проведении одного цикла адсорбции магнетита наблюдается увеличение чувствительности микрокапсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Дальнейшее увеличение числа циклов адсорбции магнетита приводит к снижению ультразвуковой чувствительности капсул, что связано с характером адсорбции и распределением наночастиц магнетита в оболочке.

2. Введение наночастиц оксида цинка (¡¡-потенциал +36 ± 5 мВ, рН 7) существенно увеличивает чувствительность полиэлектролитных капсул к низкочастотному ультразвуку (20 кГц, 0.6 Вт/см2). Увеличение числа циклов адсорбции наночастиц (от 1 до 4) приводит к повышению чувствительности капсул, что связано с уменьшением модуля Юнга (от 580 МПа до 31 МПа) и объясняется недостатком полимера, выступающего в нанокомпо-зитной оболочке в качестве связующего компонента.

3. Инкубация в крови нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка, не приводит к гемолизу. Для капсул с диаметром -10 мкм процесс фагоцитоза затруднен. Фрагменты капсул после ультразвуковой обработки, капсулы диаметром 1 мкм и их агрегаты успешно фагоцитируются белыми клетками крови.

4. Из составляющих компонент нанокомпозитных микрокапсул со структурой оболочки (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) максимальный токсический эффект на гидробионтов оказывает катионный полиэлектролит поли-алиламин гидрохлорид (РАН). Минимальное токсическое действие на гидробионтов оказывают нанокомпозитные микрокапсулы, что связано с наличием упорядоченного полиэлектролитного комплекса и компенсацией избыточных зарядов молекул полиэлектролитов в структуре оболочки микрокапсулы.

Апробация работы

устный доклад); 2-ой школе-семинаре «Наночастицы, наноструктурированные покрытия и микроконтейнеры: технология, свойства, применение» в рамках Фестиваля науки, посвященного празднованию 100-летнего юбилея СГУ (Саратов, 2009, устный доклад); 1-ой Международной научной школе «Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009, победитель постерной сессии); Международной конференции «Saratov Fall Meeting 2009» в секции Nanobiophotonics (Саратов, 2009, устный доклад), совместном семинаре Германской службы академических обменов (DAAD) для стипендиатов российско-германских программ «Михаил Ломоносов» и «Иммануил Кант» (Москва, 2010), а также на семинарах рабочей группы и кафедры.

Гранты

Работа, представленная в диссертации, выполнена при финансовой поддержке следующих проектов: «Создание нанокомпозитных планарных слоев и оболочек микрокапсул методом полиионной самосборки и исследование их физических свойств» (Мин. образования и науки РФ РИ-19.0/002/227 ГК №02.442.11.7183) (2005 г.); «Формирование нанокомпозитных микро- и нано-размерных структур и исследование их физических свойств» (Мин. Образования и науки РФ 6РИ-19.0/001/051 ГК №02.442.11.7249) (2006 г.); «Функциона-лизованные наночастицы с настраиваемым плазмонным резонансом и полиэлектролитные микрокапсулы с наночастицами в составе оболочки» (Мин. Образования и науки РФ 2007-3-1.3-07-01-081 ГК №02.513.11.3043) (2007 г.); Инновационно-образовательная программа СГУ (2007-2008 гг.); «Исследование возможности создания водных суспензий микрокапсул с нанокомпозитными оболочками, чувствительными к микроволновому и ультразвуковому облучению» (совместный российско-немецкий проект РФФИ № 06-02-04009 и DFG 436 RUS 113/844/0-1) (2008-2009 гг.); совместная программа Министерства образования и науки РФ и Германской службы академических обменов (DAAD) «Михаил Ломоносов И» (проект А/08/96088) (2009-2010 гг.).

Личный вклад диссертанта

Личный вклад автора состоит в самостоятельном выполнении представленных в диссертации экспериментальных исследований и расчетов, связанных с получением микрокапсул, изучением их физических и механических свойств различными методами, а также анализом полученных результатов. Постановка задач исследования и обсуждение результатов проведены под руководством доцента Д.А. Горина. При использовании результатов других авторов или полученных в соавторстве результатов даются соответствующие ссылки на источник.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах списка ВАК, 1 статья в сборнике конференций, 3 тезисов докладов, 1 учебно-методическое пособие и 1 глава в монографии, изданной за рубежом. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 221 источник. Общий объем диссертации составляет 166 страниц, включая 75 рисунков и 11 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, рассмотрена новизна, практическая значимость, сформулированы цель работы, основные задачи исследований, приведены основные положения, выносимые автором на защиту.

Первая глава содержит аналитический обзор по теме диссертации. В ней сформулированы основные принципы создания и изучения физико-химических свойств оболочек полиэлектролитных и нанокомпозитных микрокапсул, описаны различные методики капсуляции органических реагентов и рассмотрены способы реализации адресной доставки. Описаны методики изучения механических свойств микрокапсул, а также их зависимость от различных факторов (выбора материала и размера ядра, растворителя, комбинации полиэлектролитов и их концентрации, числа слоев и толщины оболочки микрокапсулы, наличия соли и ее концентрации, рН среды, присутствия неорганических нановклю-чений в оболочке и их объемной фракции и т.д.). Проведен анализ принципов, лежащих в основе построения математических моделей для расчета механических свойств оболочек микрокапсул. Описаны эффекты, возникающие в различных средах при распространении ультразвуковых волн в зависимости от их частоты и интенсивности, а также механизм акустической кавитации и применение УЗ в терапии онкологических заболеваний. Приведен анализ результатов работ по изучению взаимодействия микрокапсул с живыми клетками, исследованию их цитотоксичности, изучению поглощения капсул клетками методом проточной цитометрии.

Вторая глава посвящена описанию результатов создания и характериза-ции нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами магнетита, углеродными нанотрубками и наночастицами магнетита, а также наночастицами оксида цинка. Формирование оболочек полиэлектролитных микрокапсул во всех случаях проводили с использованием синтетических полиэлектролитов полиалиламина гидрохлорида (РАН) и полистиролсульфоната натрия (РББ) (молекулярная масса 70 кДа, концентрация 2 мг/мл, Sigma-Aldrich, Германия) в виде солевых растворов (0.5 М №С1).

Микрокапсулы с наночастицами магнетита

Микрокапсулы с наночастицами магнетита получены с использованием в качестве ядер частиц полистирольного латекса диаметром 5.3 ± 0.1 мкм и 9.6 ± 0.1 мкм. Характерные размеры наночастиц магнетита, оцененные по изображениям просвечивающей электронной микроскопии, составили 8-20 нм. потенциал наночастиц магнетита был отрицательным (-12.5 ± 4.0 мВ, рН 7), что определило их положение в структуре получаемых покрытий между слоями ка-тионного полиэлектролита.

На основе исследования полученных микрокапсул методами оптической,

просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии установлено, что минимальное и максимальное число слоев в структуре оболочек, необходимое для формирования стабильных недеформированных микрокапсул, равно 10 и 16 для 10-мкм капсул и 10 и 14 для 5-мкм капсул, соответственно. Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы [11]. Таким образом, выявлена зависимость стабильности капсул от числа слоев, которая является функцией толщины их оболочки.

Экспериментальные образцы микрокапсул, синтезированных на ядрах по-листирольного латекса диаметром 9.6 ±0.1 мкм, были разделены на три группы. Первая группа состояла из образцов, не содержащих в структуре оболочек магнитных наночастиц. Структура образцов: (PAH/PSS)n, где п = 5; 6; 7; 8 -число полиэлектролитных бислоев. Вторая группа различалась общим числом слоев в оболочке капсул (10, 12, 14 и 16) при одинаковом значении числа слоев магнитных наночастиц (2 слоя). Третья - числом слоев наночастиц магнетита (от 1 до 5) при одинаковом значении общего числа слоев в оболочке (16 слоев).

Методом ПЭМ были исследованы микрокапсулы с наночастицами магнетита, и показано, что для наночастиц характерно островковое расположение в структуре оболочки.

Морфологию поверхности микрокапсул в зависимости от их строения исследовали средствами атомно-силовой микроскопии (АСМ). По профилям высоты была рассчитана толщина оболочек микрокапсул (Таблица 1).

Таблица 1. Изменение толщины микрокапсул в зависимости от структуры их оболочек [Л4].

Общее Число Толщина

число слоев Структура оболочки оболочки,

слоев Fe304 нм

10 2 (PAH/PSSMPAH/Fe304)2(PAH/PSS) 23 ±1

12 2 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)2(PAH/PSS)2 26 ±2

14 0 (PAH/PSS)7 47 ±4

14 2 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)2(PAH/PSS)3 39 ±3

16 0 (PAH/PSS)8 59 ±8

16 1 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)(PAH/PSS)s 51 ±3

16 2 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)2(PAH/PSS)4 60 ±5

16 3 (P AH/PS S)2(PAH/Fe3 04)3 (PAH/PS S )3 66 ±2

16 4 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)4(PAH/PSS)2 52 ±4

16 5 (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)5(PAH/PSS) 55 ±2

Результаты показали, что встраивание наночастиц магнетита в структуру оболочки приводило к уменьшению ее толщины по сравнению с капсулами, не содержащими наночастиц. Так, значение толщины для 14-слойных капсул (РАН/РЗБЬ без наночастиц магнетита составило 47 ± 4 нм, тогда как толщина капсул (РАН/Р88)2(РАН/Рез04)2(РАН/Р88)з с тем же общим числом слоев, но с двумя слоями магнитных наночастиц составила 39 ± 3 нм. В данном случае различие в толщине, скорее всего, связано с более слабым электростатическим

взаимодействием между поликатионом и наночастицами, нежели между молекулами противоположно заряженных полиэлектролитов [Л4]. В результате анализа зависимости толщины оболочек микрокапсул от общего числа полиэлектролитных слоев в их структуре (при одинаковом числе слоев магнитных нано-частиц) установлен нелинейный рост толщины, наблюдаемый при увеличении общего числа ПЭ-слоев в оболочке, причем характер нелинейности выражен сильнее для меньшего числа слоев (Рис. 1). Данная зависимость хорошо согласуется с литературными данными, полученными для планарных слоев на твердых подложках [12].

10 12 14 16

Общее число полиэлектролитных слоев

Рис. 1. Зависимость толщины оболочки микрокапсул от общего числа полиэлектролитных слоев [Л4].

На примере 16-слойных микрокапсул обнаружена зависимость толщины оболочки от числа стадий адсорбции наночастиц магнетита (таблица 1). Так, при увеличении числа стадий адсорбции наночастиц от 1 до 3 происходил рост толщины оболочки, а для 4 и 5 слоев магнетита наблюдалось ее уменьшение. Характер данной немонотонной зависимости связан с тем, что увеличение числа слоев магнитных наночастиц приводило, с одной стороны, к увеличению толщины оболочек капсул, а с другой стороны - к уменьшению числа блокирующих полиэлектролитных слоев и, как следствие, к увеличению вероятности десорбции наночастиц из оболочки в процессе растворения ядер. Это в свою очередь вызывало уменьшение толщины ПЭ-оболочки. Поскольку данные процессы являлись конкурирующими, максимум по толщине достигался при наличии в структуре оболочки трех слоев наночастиц магнетита.

С целью изучения влияния ультразвука на свойства сформированных полиэлектролитных и нанокомпозитных оболочек микрокапсул водную суспензию капсул обрабатывали ультразвуком различной длительности с частотой ~ 27 кГц и плотностью мощности ~ 3.5 Вт/см2 с использованием установки УРСК N070 (Россия). При данных параметрах основное влияние ультразвук оказывает за счет возникновения явления кавитации. Для жидкостей и биологических тканей кавитационный порог составляет 0.3 Вт/см2.

Реакцию капсул на облучение ультразвуком контролировали средствами

оптической и атомно-силовой микроскопии. Обнаружили возможность дистанционного разрушения капсул, модифицированных наночастицами магнетита, под действием ультразвука (Рис. 2). При этом методом атомно-силовой микроскопии фрагментов оболочек микрокапсул установлено, что ультразвуковая обработка приводит к нарушению целостности оболочек, а их толщина и состав остаются неизменными.

Рис. 2. Результаты оптической микроскопии нанокомпозитных микрокапсул со структурой оболочки (РАН/Р88)2(РАН/Рез04)2(РАН/Р88)2 до (А) и после (Б) ультразвуковой обработки [Л4].

Обнаружено, что введение магнитных наночастиц в состав оболочек микрокапсул на этапе синтеза увеличивает их чувствительность к ультразвуку, тогда как рост их объемной фракции приводит к снижению данной чувствительности. Повышение УЗ-чувствительности, наблюдаемое при встраивании наночастиц магнетита в структуру оболочки капсул, может быть связано с уменьшением их толщины по сравнению с толщиной полиэлектролитных капсул. Следовательно, для их разрушения ультразвуком требуется меньшее время воздействия. При увеличении числа стадий адсорбции наночастиц от 2 до 5 требовалось увеличивать время УЗ-воздействия от 2.5 до 4.5 минут для полного разрушения микрокапсул. Снижение УЗ-чувствительности скорее всего связано с более равномерным распределением наночастиц магнетита в структуре оболочки при увеличении числа стадий их адсорбции, которое вызвано взаимопроникновением слоев наночастиц и полимера. В результате однородность оболочки повышается, что приводит к увеличению ее эластичности и уплотнению структуры, т.е. повышению механической прочности микрокапсул и их устойчивости к действию ультразвука.

Показано, что увеличение общего числа полиэлектролитных слоев в структуре оболочек микрокапсул требует более продолжительного времени ультразвукового воздействия для их разрушения. Это объясняется увеличением толщины оболочек микрокапсул с ростом числа ПЭ-слоев. Кроме того, обнаружено, что чувствительность капсул к ультразвуку зависит от их размера - для капсул большего диаметра чувствительность к ультразвуку выше, чем для

капсул меньшего диаметра. Это объясняется изменением устойчивости микрокапсул к ультразвуку, которая определятся соотношением между толщиной оболочки капсулы и ее диаметром. Чем больше данное соотношение, тем устойчивее капсула к внешнему воздействию.

Микрокапсулы с наночастицами магнетита и углеродными нанотруб-ками

Второй раздел посвящен созданию многофункциональных микрокапсул (РАН/Р88)з(РАН/Ре304)(РАН/Р88)з(РАН/СЖ8/РАН), модифицированных наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками. ПЭМ-изображения микрокапсул показывают неравномерное, островковое расположение наночастиц магнетита в структуре оболочки и их склонность к агрегации (Рис. 3). При этом поверхность капсул покрыта сеткой из углеродных нанотрубок. Даная структура приводит к увеличению механической прочности капсул в целом.

Рис. 3. ПЭМ-изображения общего вида микрокапсул (А) и их оболочки (Б) для образца состава (PAH/PSS)3(PAH/Fe304)(PAH/PSS)3(PAH/CNTs/PAH).

Морфологию поверхности микрокапсул исследовали средствами атомно-силовой микроскопии. Значение толщины оболочки составило 50 ± 3 нм. Следует отметить, что полученное значение хорошо согласуется с толщиной 16-слойных капсул с одним слоем наночастиц магнетита в структуре оболочки (Таблица 1). Так, для капсул со структурой оболочки (PAH/PSS)2(PAH/Fe304)(PAH/PSS)5 значение толщины составило 51 ± 3 нм.

Ультразвуковую обработку мультифункциональных оболочек микрокапсул производили с использованием установки УРСК N070 (Россия), работающей на частоте 27 кГц и плотности мощности 3.5 Вт/см2. Установили, что для разрушения данного типа микроконтейнеров требуется более длительное воздействие ультразвука (порядка 10 минут), чем в случае микрокапсул, функционализированных наночастицами магнетита. Снижение чувствительности оболочек микрокапсул к УЗ подтвердило предположение об увеличении механической прочности капсул за счет наличия на их поверхности плотной сетки из углеродных нанотрубок.

Микрокапсулы с наночастицами оксида цинка

Данный раздел посвящен формированию и исследованию нанокомпозит-ных микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка ^пО). Значение ¿¡-потенциала для наночастиц оксида цинка составило +36.2 ± 5 мВ (при рН 7), что определило положение наночастиц ХпО между слоями анионного полиэлектролита.

Выбор наночастиц оксида цинка в качестве соносенсибилизатора был обусловлен тем, что наночастицы ZnO являются хорошим антибактериальным агентом [9] и применяются в терапии онкологических заболеваний [10].

Образцы микрокапсул, сформированные на поверхности частиц полисти-рольного латекса диаметром 10.25 ± 0.09 мкм, различались наличием или отсутствием в структуре оболочки наночастиц оксида цинка, а также числом слоев наночастиц (от 1 до 4). Адсорбцию противоположно заряженных молекул полиэлектролитов и наночастиц контролировали путем измерения С,-

потенциала коллоидных частиц. Наночастицы оксида цинка и гпО-композитные микрокапсулы исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (Рис. 4). Результаты ПЭМ выявили увеличение объемной фракции наночастиц оксида цинка в оболочке капсул при увеличении числа стадий их адсорбции от 1 до 3, однако обнаружили отсутствие существенных различий для капсул с 3 и 4 слоями ZnO, что свидетельствовало о насыщении оболочки микрокапсул наночастицами уже после проведения трех стадий адсорбции

Рис. 4. Результаты исследования наночастиц (а) и микрокапсул (б-е) методом просвечивающей электронной микроскопии. Структуры оболочек микрокапсул-. б-(РАН/Р8Э)б;

в - (РАН/Р88)2(2пО/Р88)(РАН/Р85)з; г - (РАН/Р88)2(гпО/Р88)2(РАН/Р85)2; д -(РАН/Р85)2(гпО/Р88)з(РАН/Р85); е - (РАН/Р85)(2пО/Р85)4(РАН/Р88) [Л8].

Морфологию поверхности микрокапсул, различающихся числом слоев на-ночастиц ZnO, также исследовали средствами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (Рис. 5). Анализ результатов ПЭМ и СЭМ показал, что с увеличением числа слоев 2пО в структуре оболочки микрокапсулы происходило увеличение ее диаметра после высыхания, что свидетельствовало об изменении механических свойств микрокапсул. Методом атомно-силовой микроскопии была проведена количественная характеристика некоторых морфологических параметров микрокапсул, таких как диаметр, толщина оболочки (о^), эффективная толщина, приходящаяся на один полиэлектролитный слой (в случае капсул без наночастиц), эффективная толщина слоя наночастиц ZnO (в случае 2пО-композитных капсул) (с1№), средняя шероховатость поверхности (Яа) и объемная фракция наночастиц в оболочке (<рду) (Таблица 2).

Число слоев иаючастиц гпО 1 слой 2 слоя 5 слоя 4 стоя

Рис. 5. Изображения микрокапсул с различным числом слоев наночастиц гпО в оболочке, полученные методом сканирующей электронной микроскопии [Л8].

Таблица 2. Параметры микрокапсул с различным числом слоев наночастиц 1пО, рассчитанные по анализу результатов атомно-силовой микроскопии [Л8].

Число Диаметр Толщина Эффективная Средняя ше- Объемная

слоев оболочки, оболочки толщина слоя роховатость фракция

гпо мкм (¿4), нм 2пО {с1пр), нм (Я,), нм ЯлО ((рыр)

0 10.2 ±0.2 32 ±2 - 9 ± 1 -

1 11.1 ±0.5 38 ±7 8 43 ±8 0.21

2 12.9 ±0.3 56 ±6 15 31 ±4 0.52

3 13.1 ±0.3 97 ±7 24 25 ±8 0.75

4 14.8 ±0.3 104 ±4 21 26 ±4 0.79

Данные таблицы количественно подтверждают обнаруженное ранее методами ПЭМ и СЭМ увеличение диаметра оболочки капсул после высушивания с увеличением числа слоев ZnO. Кроме того установлено, что толщина оболочки нелинейно увеличивается с ростом числа слоев наночастиц оксида цинка (рис.

6). Данный характер приведенной зависимости для толщины хорошо согласуется со значениями шероховатости и эффективной толщины, приходящейся на слой наночастиц оксида цинка. Достаточно малое значение эффективной толщины для капсул с одним слоем ZnO (с1ЫР = 8 нм) говорит о преимущественной адсорбции наночастиц из наиболее мелкой фракции. В то же время, шероховатость поверхности капсул с 1 слоем ХпО (43 нм) резко увеличивается по сравнению с полиэлектролитными капсулами без наночастиц (9 нм), что, скорее всего, свидетельствует об «островковом» заполнении оболочки наночастицами на начальной стадии адсорбции. Дальнейшее уменьшение шероховатости капсул при увеличении числа слоев 2пО свидетельствует о заполнении наночастицами промежутков между «островками» и сглаживании неровностей оболочки. Также следует отметить, что шероховатость капсул с 3 и 4 слоями наночастиц практически не меняется в пределах погрешности и составляет 25 ± 8 нм и 26 ± 4 нм, соответственно. Следовательно, при адсорбции большого количества наночастиц возникает недостаток полиэлектролита для их закрепления в оболочке.

О 4------г---------:----,

I I $ 3 4 5

Число слоев наночастиц ЭЮ

Рис. 6. Изменение толщины оболочки нанокомпозитных капсул в зависимости от числа слоев наночастиц ХпО в оболочке [Л8].

Щ-

I мю ж

I ®>.

Для расчета объемной фракции наночастиц ZnO в оболочке микрокапсул была получена следующая формула:

"«(, ¿л

где с!цр - эффективная толщина, приходящаяся на один слой наночастиц 2пО в оболочке, - число слоев наночастиц ЪпО, 4л - полная толщина оболочки микрокапсулы, ¿РЕ и ЫРЕ ~ эффективная толщина полиэлектролитного слоя и число полиэлектролитных слоев в структуре оболочки микрокапсулы, соответственно. Расчет показал, что объемная фракция наночастиц росла с увеличением числа слоев 2пО от 1 до 3, однако при добавлении 4 слоя не происходило каких-либо существенных изменений, что объяснялось недостатком полиэлектролитного «клея» в оболочке капсулы.

Механические свойства '¿пО-к о м п о з и тн ы х микрокапсул в зависимости от объемной фракции наночастиц исследовали средствами атомно-силовой спектроскопии. Экспериментальные кривые зависимости силы от деформации для капсул с различным числом слоев наночастиц оксида цинка в структуре оболочки представлены на рисунке 7. Жесткость микрокапсул определяли по начальному наклону кривых деформации (Таблица 3). На основе полученных значений для жесткости и в предположении, что для микрокапсул в первом приближении может применяться аппроксимирующая модель тонкой оболочки [13], были рассчитаны значения эффективного модуля Юнга для микрокапсул с различной объемной фракцией наночастиц ZпO в оболочке. В результате установлено, что увеличение объемной фракции наночастиц ZnO приводило к нелинейному уменьшению эффективного значения модуля Юнга и, соответственно, снижению сопротивления капсул деформации.

* огыэ «

а 1 2оО О 4

о ггао л 0 *

Д 3 7.пО С. Й

V 4гвО « О * о о ф „п а ° „У

---,-1-.-1-1-1---

■¡о о я юо па 301

Деформация, нм

Рис. 7. Экспериментальные кривые зависимости силы от деформации для капсул с различным числом слоев наночастиц ZnO в структуре оболочки [ЛВ].

Таблица 3. Механические свойства микрокапсул в зависимости от структуры оболочки [Л8]

Число слоев 7,п О Структура оболочки Жесткость, Н/м Модуль Юнга, МПа

0 (РАН/Р88)б 0.303 ±0.149 580 ±286

1 (РАНЛ^Ь^пО/ТСБХРАН/РЗЗЬ 0.259 ±0.100 403±156

2 (РАН/Р88)2(гпО/Р88)2(РАН/Р88)2 0.339 ± 0.112 275 ±91

3 (РАН/Р88)2(2пО/Р88)3(РАН/Р88) 0.098 ± 0.032 27.1 ±8.8

4 (РАН/Р88)(2пО/Р88)4(РАН/Р88) 0.112 ±0.022 30.5 ±5.9

Ультразвуковую обработку микрокапсул производили с использованием установки ВапёеКп 8опори1к Л О 200 (Германия), с частотой ультразвука 20 кГц и плотностью мощности 0.6 Вт/см2. При таких параметрах основное действие

ультразвука связано с возникновением кавитации, которая, как было показано ранее, может вызывать нарушение целостности оболочек микрокапсул. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что присутствие наночастиц ZnO в оболочке приводит к существенному увеличению чувствительности капсул к УЗ по сравнению с полиэлектролитными капсулами без наночастиц (Рис. 8).

Время ультразвуковой обработки, сек

Ов 38 6$ 95

Рис. 8. Исследование влияния ультразвука на оболочки микрокапсул в зависимости от времени облучения и объемной фракции наночастиц ZnO (конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, режим просвета) [Л8].

Так, в результате действия ультразвука в течение нескольких секунд наблюдается лишь небольшая деформация оболочек полиэлектролитных капсул, тогда как 2пО-композитные капсулы (даже с одним слоем наночастиц) начи-

нают разрушаться уже через 3 сек после начала облучения, а 9 сек воздействия УЗ оказывается достаточно для полного разрушения оболочек ZnO-композитных капсул.

Обнаружено, что с увеличением числа стадий адсорбции наночастиц ZnO, т.е. с увеличением объемной фракции наночастиц в оболочке капсул, происходит уменьшение размера фрагментов оболочек, образовавшихся в результате их УЗ-обработки, следовательно, возрастает чувствительность капсул к ультразвуку. Кроме того, размер фрагментов оболочек микрокапсул зависит не только от объемной фракции наночастиц ZnO, но и от времени их облучения - размер фрагментов уменьшается с увеличением продолжительности УЗ-обработки. Это вызвано изменением механических свойств микрокапсул. Так, увеличение объемной фракции наночастиц ZnO приводит к уменьшению эффективного значения модуля Юнга, т.е. к уменьшению эластичности капсул. В результате повышается чувствительность микрокапсул к УЗ обработке.

Третья глава посвящена исследованию взаимодействия ZnO-композитных микрокапсул с клетками крови, их совместной реакции на облучение ультразвуком, а также зависимости протекания фагоцитоза от размера и состава оболочек микроконтейнеров. Так как все известные на данный момент работы по облучению капсул ультразвуком проводились в водной среде [6, Л4, Л8], то на начальном этапе исследования было изучено влияние свойств среды диспергирования на чувствительность микрокапсул к ультразвуку. В качестве модельной среды, свойства которой наиболее близки к физиологическим, был выбран фосфатно-солевой буфер (PBS). Изучения влияния вязкости и химического состава дисперсной среды на чувствительность капсул к ультразвуку проводили в плазме крови.

Эксперимент проводили с использованием 10-мкм микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS). Облучение капсул ультразвуком осуществлялось посредством ультразвуковой установки Bandelin Sonopuls HD 200 (Германия) (20 кГц, 0.6 Вт/см2). Отмечалось незначительное снижение чувствительности ZnO-композитных микрокапсул к ультразвуку в PBS и плазме крови по сравнению с результатами, полученными в водной среде [Л8, ЛИ].

На следующем этапе микрокапсулы подвергали ультразвуковой обработке в присутствии клеток крови. Исследование взаимодействия капсул с живыми клетками целесообразно проводить на примере клеток крови, так как при использовании микрокапсул в качестве средств адресной доставки и их дистанционном вскрытии в организме помредством ультразвука основное его влияние, в первую очередь, будет сказываться именно на кровеносной системе. Было установлено, что инкубация капсул с клетками крови в течение 30 и 60 минут при 37°С не вызывает повреждения и гибели последних и не приводит к гемолизу. Таким образом, было показано отсутствие негативного влияния 10-мкм капсул на клетки крови (что подтверждало их гемосовместимость).

Ультразвуковая обработка микрокапсул в присутствии клеток крови обнаружила, что ультразвук с частотой 20 кГц и плотностью мощности 0.6 Вт/см2 оказывает разрушающее воздействие на 10-мкм микрокапсулы (PAH/PSS)2 (ZnO/PSS)3(PAH/PSS) уже через 3 секунды после начала облучения и при этом

вызывает лишь частичное повреждение клеток крови (Рис. 9). При этом поврежденные и живые белые клетки крови присутствовали в образце как до, так и после УЗ-обработки. Маркирование оболочек микрокапсул производили с использованием декстрансульфата с молекулярной массой 4 кДа, меченного флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (Р1ТС). Окрашивание поврежденных клеток крови проводили с использованием флуоресцентного красителя пропидиум йодида (Р1), который способен проникать через мембраны погибших и поврежденных клеток, связываться с ДНК и окрашивать ядра клеток.

Перед УЗ-обработкой После УЗ-обработки (3 сек)

Рис. 9. Исследование микрокапсул с 3 слоями наночастиц ZnО в структуре оболочки в суспензии клеток крови до и после ультразвуковой обработки в течение 3 секунд (конфокальная лазерная санирующая микроскопия) [Л11].

На дальнейшем этапе работы был исследован механизм взаимодействия клеток крови с микрокапсулами в зависимости от их размера (фагоцитоз капсул). Было показано отсутствие фагоцитоза капсул с диаметром ~ 10 мкм, так как максимальный размер объектов, способных участвовать в процессе фагоцитоза, составляет 5-7 мкм (Рис. 10).

1 layer of ZnO 2 layers of ZnO 3 layers of ZnO 4 layers of ZnO

Рис.10. Исследование процесса фагоцитоза 2пО-композитных 10-мкм микрокапсул в зависимости от числа слоев наночастиц ХпО в структуре их оболочек (конфокальная микроскопия, суперпозиция флуоресцентного и просвечивающего режимов) [Л11].

Однако, несмотря на превышение данного размера, в случае инкубации клеток крови с 10-мкм капсулами наблюдалась попытка их захвата фагоцитами. При этом встречались случаи объединения нескольких фагоцитов в группы. Следует отметить увеличение степени деформации оболочек микрокапсул фагоцитами в зависимости от числа слоев наночастиц гпО в их оболочке (Рис. 10), что связано с изменением механических свойств микрокапсул, обнаруженным ранее.

Успешное протекание фагоцитоза было показано на примере микрокапсул (РАН/Р88)(гпО/Р88)(РАН/Р88) диаметром 1 мкм, а также для фрагментов оболочек, оставшихся от 10-мкм капсул после их разрушения ультразвуком (Рис. 11). Метод конфокальной микроскопии позволяет качественно определять наличие фагоцитоза, однако не дает возможности получить точные данные о месторасположении микрокапсул после его завершения, так как они могут быть полностью поглощены клетками или же только закреплены на поверхности клеточных мембран.

20 |и>) ' 10 мш 1 ' V- -У- ■ 1

«Г ■щ #

Рис. 11. Исследование процесса фагоцитоза 2пО-содержащих 1-мкм микрокапсул (слева), а также фрагментов оболочек, оставшихся от больших капсул после их разрушения ультразвуком (справа) (конфокальная микроскопия, суперпозиция флуоресцентного и просвечивающего режимов) [Л11].

Количественное исследование процесса фагоцитоза проводили методом проточной цитометрии при 37°С (физиологические условия, когда фагоциты активны) и 4°С (контрольный эксперимент) (Рис. 12). Анализ проводили по следующим основным параметрам - показателю прямого светорассеяния (РБС), который характеризует размеры клеток, и показателю бокового светорассеяния (ЭЭС), который позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы клетки. Кроме того проводили одновременное считывание сигнала флуоресценции от маркированных оболочек микрокапсул и клеток крови. Анализ данных светорассеяния позволяет разделить лейкоциты периферической крови на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характеризуются наименьшими размерами, наиболее крупные клетки - гранулоциты, моноциты занимают промежуточное положение по параметрам РБС. Наиболее низкие характеристики 88С имеют лимфоциты, промежуточные - моноциты и высокие показатели 88С - у гранулоцитов.

Таблица 4. Численные результаты исследования фагоцитоза микрокапсул и фрагментов их оболочек белыми клетками крови человека методом проточной цитометрии [Л 11].

Гранулоциты Моноциты

Разбавление +37°С +4°С +37°С +4°С

Капсулы 1 мкм 1:2 10.8 0.1 26.4 0

1:5 4.8 0.4 15.7 0

1:10 6.6 2.8 14.3 9.0

Фрагменты оболочек 10 мкм капсул - 4.8 1.5 6.6 4.7

Рис. 12. Результаты исследования процесса фагоцитоза для 7пО-содержащих микрокапсул диаметром 1 мкм (А, В) и фрагментов оболочек 10-мкм капсул (С, О) при +37°С и +4°С [Л11].

Инкубация при низкой температуре препятствовала протеканию фагоцитоза и позволяла определить местоположение микрокапсул (поглощение клетками или закрепление на их поверхности). В таблице 4 приведены численные значения, соответствующие количеству клеток (гранулоцитов или моноцитов) в

Lymphocytes

процентах, поглотивших капсулы или фрагменты их оболочек. Результаты при 37°С показали успешное поглощение 1-мкм микрокапсул и фрагментов оболочек 10-мкм капсул. При этом исследование при низкой температуре обнаружило отсутствие закрепления капсул на поверхности клеток.

Таким образом, в данной части работы было обнаружено отсутствие фагоцитоза для ZnO композитных микрокапсул диаметром 10 мкм, возможность их разрушения ультразвуком в присутствии клеток крови, а также возможность использования явления фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул, образовавшихся в результате их ультразвуковой обработки.

Четвертая глава посвящена исследованию токсичности микрокапсул и их составляющих компонент с использованием в качестве тест-систем гидробио-нтов (цериодафний (Ceriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio). Острое токсическое действие исследуемых токсикантов на гидробионтов оценивали по критерию выживаемости на основании величины полулетальной концентрации (JIKs0) и безвредной концентрации (БКю). Определение интегрального экотоксикологического показателя -класса опасности для окружающей природной среды (ОПС) - для всех тест-объектов производили в соответствии с критериями отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей среды

Расчет полулетальных (ЛК50) и безвредных (БКю) концентраций показал, что среди исследуемых веществ наибольшей токсичностью по отношению ко всем рассматриваемым тест-объектам обладает раствор поликатионного поли-элекгролита РАН. Данный факт можно объяснить с точки зрения электростатического взаимодействия исследуемых полимеров и мембран клеток тестируемых объектов. Поскольку в большинстве случаев клеточные мембраны имеют отрицательный заряд, адгезия и дальнейшее взаимодействие с катионным полиэлектролитом (РАН) происходит более эффективно по сравнению с анионным полиэлектролитом (PSS) или незаряженным полимером. Так, PSS показал практическое отсутствие токсического действия на каждый выбранный тип тест-объекта.

При этом установлено, что наибольшей чувствительностью к действию ка-тионного полиэлектролита РАН обладали цериодафнии (Ceriodaphnia affinis), для которых значение полулетальной концентрации ЛК50-48 составило 0.34 мг/л. Личинки хирономид (Chironomus riparius) проявили максимальную резистив-ность по отношению к раствору РАН (ЛК5(мк для них составляет 400 мг/л). Однако, при исследовании токсического действия наночастиц оксида (ZnO) установили, что на личинок хирономид наночастицы оказывали максимальное токсическое действие.

В ходе эксперимента было обнаружено, что ZnO-композитные микрокапсулы проявляют наименьшую токсичность среди всех тестируемых веществ. Это, во-первых, связано с наличием упорядоченного полиэлектролитного комплекса, который образуется в результате послойной адсорбции молекул противоположно заряженных полиэлектролитов при формировании оболочек микро-

капсул. Во-вторых, так как формирование оболочек микрокапсул завершается нанесением слоя отрицательно заряженных молекул РЗЯ, то наличие преимущественно отрицательного заряда на поверхности капсул препятствует их электростатическому взаимодействию с мембранами клеток гидробионтов и приводит к снижению токсическое действия. При этом встраивание наночастиц 2пО в структуру оболочек микрокапсул приводит к существенному снижению их токсичности по сравнению с наночастицами в коллоидном растворе.

Таким образом, обнаружено, что возможности полиионной сборки позволяют существенно снизить токсичность раствора катионного полиэлектролита РАН и наночастиц ZnO, выступающих в качестве составляющих компонентов оболочек нанокомпозитных микрокапсул, что связано с формированием упорядоченной полиэлектролитной структуры, выступающей в качестве защитного покрытия.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы, полученные в ходе выполнения диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Ультразвук (27 кГц, 3.5 Вт/см2) оказывает разрушающее воздействие как на полиэлектролитные, так и на нанокомпозитные микрокапсулы. Присутствие наночастиц магнетита (^-потенциал -12.5 ±4 мВ, рН 7) в структуре оболочки повышает чувствительность капсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Увеличение общего числа полиэлектролитных слоев в оболочке микрокапсул приводит к снижениюих чувствительности к ультразвуковой обработке, что объясняется ростом толщины их оболочек при увеличении числа циклов адсорбции полиэлектролитов. Увеличение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита от 1 до 5 делает оболочку капсул более устойчивой к ультразвуковому воздействию.

2. На примере нанокомпозитных микрокапсул, функционализированных наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками, показано, что одного цикла адсорбции наночастиц магнетита достаточно для придания капсулам чувствительности к магнитному полю. Формирование плотной сетчатой структуры из углеродных нанотрубок на поверхности капсул обеспечивает увеличение их механической прочности и приводит к снижению чувствительности капсул к ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см2).

3. Встраивание наночастиц оксида цинка (^-потенциал +36 ±5 мВ, рН 7) в структуру оболочек микрокапсул приводит к существенному увеличению их чувствительности к ультразвуку (20 кГц, 0.6 Вт/см2) по сравнению с полиэлектролитными капсулами без наночастиц, а также микрокапсулами, функционализированными наночастицами магнетита. Для разрушения микрокапсул с наночастицами гпО требуется гораздо более низкие мощности и время воздействия ультразвука (3-9 секунд), чем для капсул с наночастицами магнетита.

4 слоями наночастиц ZnO, что говорит о «насыщении» оболочки наноча-стицами ZnO вследствие недостатка полиэлектролита, выступающего в качестве связующего компонента для их закрепления. Изменение механических свойств микрокапсул в зависимости от объемной фракции наночастиц ZnO в структуре оболочки (уменьшение жесткости и эффективного значения модуля Юнга (от 580 до 31 МПа) при увеличении числа стадий адсорбции наночастиц ZnO от 1 до 4) приводит к повышению чувствительности микрокапсул к ультразвуку.

5. Чувствительность к ультразвуку нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами ZnO, незначительно снижается при их облучении в средах с физиологическими свойствами (фосфатном буфере, плазме крови и крови) по сравнению с водой. Инкубация ZnO-композитных микрокапсул с клетками крови не вызывает повреждения и гибели клеток и не приводит к гемолизу эритроцитов. Установлена зависимость протекания фагоцитоза от размера фагоцитируемых ZnO-композитных микрокапсул: микрокапсулы большого диаметра (10 мкм) распознаются иммунной системой, однако фагоцитоз таких капсул отсутствует, в результате вероятность преждевременного уничтожения 10-мкм капсул иммунной системой организма мала, что открывает перспективы использования данных систем, например, в качестве контейнеров для адресной доставки. Микрокапсулы малого диаметра (1 мкм) и фрагментов оболочек, образовавшихся в результате ультразвуковой обработки 10-мкм капсул, успешно поглощаются фагоцитами, что открывает возможности использования фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул.

6. Раствор поликатионного полиэлектролита полиалиламин гидрохлорида (РАН), используемого в качестве составляющего компонента для формирования оболочки микрокапсул, обладает максимальной токсичностью по отношению к гидробионтам (цериодафниям (Ceriodaphnia affinis), люминесцентным генноинженерным бактериям Escherichia coli, 1885, М-17, личинкам хирономид (Chironomus riparhis) и аквариумным рыбам D. rerio). Это связано с электростатическим взаимодействием катионного полимера с отрицательно заряженными клеточными мембранами тестируемых объектов. Формирование полиэлектролитного комплекса PAH+PSS приводит к снижению токсического эффекта за счет нейтрализации зарядов молекул полиэлектролитов, участвующих в комплексообразовании. Возможности полиионной сборки позволяют существенно снизить токсичность наночастиц оксида цинка за счет их встраивания в структуру оболочек микрокапсул, что связано с формированием на их поверхности защитного покрытия из полиэлектролитных слоев. Наличие упорядоченной послойной структуры в оболочке микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) проявляется также в минимальном токсическом действии на гидробионтов. При этом безопасная для гидробионтов концентрация микрокапсул в водной среде не превышает 250 мг/л.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Decher G. // Science. - 1997. - Vol. 277. -Р. 1232-1237.

2. Sukhomkov G.B., Antipov A.A., Voigt A., Donath E., Möhwald H. // Macromol. Rapid Commun. - 2001. - Vol. 22. - P. 44-46.

3. Borodina Т., Markvicheva E., Kunizhev S., Möhwald H., Sukhorukov G.B., Kreft O. // Macromol. Rapid Commun.-2007. - Vol. 28.-N. 18-19. -P. 1894-1899.

4. Hu S.-H., Tsai C.-H., Liao C.-F., Liu D.-M., Chen S.-Y. // Langmuir. - 2008. - Vol. 24. - P. 11811-11818.

5. Bukreeva T.V., Parakhonsky B.V., Skirtach A.G., Susha A.S., Sukhorukov G.B. // Crystallo-graphyReports.-2006.-Vol. 51.-N. 5.-P. 863-869.

6. Shchukin D.G., Gorin D.A., Möhwald H. // Langmuir. - 2006. - Vol. 22. - P. 7400-7404.

7. Николаев А.Л., Гопин A.B., Божевольнов B.E., Трещалина E.M., Андронова Н.В., Мелихов И.В. // Акустический журнал. - 2009. - Т. 55. - № 4-5ю - С. 565-574.

8. Skirtach A.G., Javier А.М., Kreft О., Köhler К., Alberola А.Р., Möhwald H.,. Parak W.J, Sukhorukov G.B. //Angew. Chem. - 2006. - Vol. 118.-P. 4728-4733.

9. Reddy K.M., Feris K., Bell J., Wingett D.G., Hanley C„ Punnoose A. // Appl. Phys. Let. -2007. - Vol. 90. - P. 213902-1-213902-3.

10. Hanley C., Layne J., Punnoose A., Reddy K.M., Coombs I., Coombs A., Feris K., Wingett D. //Nanotechnology. - 2008. -Vol. 19.-P. 1-10.

11. Dong W., Ferri J., Adalsteinsson Т., Schonhoff M., Sukhorukov G.B., Möhwald H. // Chem. Mater. -2005. - Vol. 17. - Р. 2603-2611.

12. Porcel C., Lavalle Р., Ball V., Decher G., Senger В., Voegel J.-C., Schaaf P. // Langmuir. -2006. - Vol. 22. - P. 4376-4383.

13. Fery A., Weinkamer R. // Polymer. - 2007. - Vol. 48. - P. 7221-7235.

14. Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Khlebtsov B.N., Kogan B.Ya., Akchu-rin G.G., Shantrocha A.V., Maksimova I.L., Khlebtsov N.G., Tuchin V.V. // Journal of Bio-photonics. - 2009. - Vol. 2. - N. 5. - P. 292-302.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Л1. Портнов С.А., Ященок А.М., Губский A.C., Горин Д.А., Невешкин A.A., Климов Б.Н., Ломова М.В., Колесникова Т.А. Автоматизированная установка для получения нано-композитных покрытий методом полиионной сборки // Федеральная школа-конференция по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и высоких технологий. Сборник материалов докладов. - М., РГУИТП. - 2006. - С. 22-27.

Л2. Портнов С.А., Иноземцева O.A., Колесникова ТА., Ломова М.В., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А. Нанокомпозитные микрокапсулы и перспективы их применения в медицине // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине: Материалы ежегодной Всероссийской научной школы-семинара. Под ред. Проф. Д.А. Усанова - Саратов: Изд-во Саратовского университета. - 2007. - С. 140-143.

ЛЗ. Портнов С.А., Иноземцева O.A., Горин Д.А., Колесникова Т.А. Формирование и физико-химические свойства полиэлектролитных нанокомпозитных микрокапсул // Российские нанотехнологии. - 2007. - Т. 2. - №9-10. - С. 68-80.

Л4. Колесникова Т.А., Горин Д А., Хлебцов Б.Н., Щукин Д.Г. Характеризация чувстви-

тельных к ультразвуковому воздействию нанокомпозитных микрокапсул методом атомно-силовой микроскопии Н Российские нанотехнологии. - 2008. - Т. 3. - № 9-10. -

C. 48-57.

Л5. Климов Б.Н., Штыков С.Н., Горин Д А., Иноземцева О.А., Глуховской Е.Г., Ященок A.M., Колесникова Т.А. Физико-химия наноструктурированных материалов // Учебное пособие для студентов факультета нано- и биомедицинских технологий Саратовского государственного университета. Под ред. Климова Б.Н., Штыкова С.Н. - Саратов: Изд-во «Новый ветер». 2009. 218 с. ISBN 978-5-98116-055-4.

Л6. Колесникова Т.А., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А., Щукин Д.Г. Создание чувствительных к ультразвуковому воздействию полиэлектролитных микрокапсул, функциоиализиро-ванных наночастицами магнетита // 1-я Международная научная школа - Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Сборник материалов докладов. Московская область. 2009. с. 246-249.

Л7. Gorin D.A., Yashchenok A.M., Manturov A.O., Kolesnikova T.A., Mohwald H. Effect of Layer-by-Layer electrostatic assemblies on the surface potential and current voltage characteristic of MIS structures // Langmuir. - 2009. - Vol. 25. -N. 21. - P. 12529-12534.

Л8. Kolesnikova T.A., Gorin D.A., Fernandes P., Kessel S., Khomutov G.B., Fery A., Shchukin

D.G., Mohwald H. Nanocomposite Microcontainers with High Ultrasound Sensitivity // Advanced Functional Materials. -2010. - Vol. 20.-P. 1189-1195.

Л9. Inozemtseva O.A., Portnov S.A., Kolesnikova T.A., Gorin D.A., Sukhorukov G.B. Layer by Layer microencapsulate technology as basis for fabrication of drug delivery nanosystems with remote controlling properties // Handbook of Materials for Nanomedicine (Vol. 1, Chapter 3) by Vladimir Torchilin & Mansoor M. Amiji. World Scientific Pub Co. in English. 2010. 840 p. ISBN-10: 9814267554, ISBN-13: 978-9814267557.

Л10. Колесникова T.A., Георгиева P., Горин Д.А., Щукин Д.Г., Мевальд X. Формирование высокочувствительных к ультразвуковой обработке нанокомпозитных микрокапсул с наночастицами оксида цинка в структуре оболочки и их взаимодействие с клетками крови // Сборник материалов научного семинара стипендиатов программ «Михаил Ломоносов II» и «Иммануил Кант II» 2009/2010 года. Москва, 2010. - 4 с.

ЛИ. Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Горин Д.А., Колесникова Т.А., Портнов С.А., Скиртач А.Г., Сухоруков Г.Б., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Способ селективного разрушения раковых клеток с помощью магнитных микроконтейнеров с фотодинамическими или фототермическими красителями // Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2009106672/14(008911) Российской Федерации, опубл. 01.04.2010, Бюл. №95. -5 с. (Приор, от 25.02.2009).

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Колесникова, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции полиэлектролитов.

1.1.1. Технология создания полиэлектролитных микрокапсул.

1.1.2. Структура и свойства полиэлектролитных мультислоев.

1.1.3. Физико-химические свойства ПЭ микрокапсул. Проницаемость оболочек и методы капсуляции.

1.1.4. Выводы по разделу 1.1.

1.2. Механические свойства полиэлектролитных микрокапсул.

1.2.1. Определение механических свойств микрокапсул методом осмотического расширения.

1.2.1.1. Математическая модель осмотического расширения оболочки микрокапсулы.

1.2.1.2. Экспериментальное определение механических свойств микрокапсул методом осмотического расширения.

1.2.2. Определение механических свойств микрокапсул методом атомно-силовой спектроскопии.

1.2.2.1. Основные принципы атомно-силовой спектроскопии.

1.2.2.2. Математическая модель деформации оболочки микрокапсулы под действием приложенной силы.

1.2.2.3. Определение модуля Юнга по экспериментальным зависимостям силы от деформации.

1.2.2.4. Экспериментальное определение механических свойств микрокапсул методом атомно-силовой спектроскопии.

1.2.3. Выводы по разделу 1.2.

1.3. Ультразвуковое излучение и его применение в нанотехнологии и медицине.

1.3.1. Классификация и характеристические свойства ультразвуковых волн.

1.3.2. Распространение ультразвуковых волн в жидкости.

1.3.3. Акустическая кавитация.

1.3.4. Порог кавитации.

1.3.5. Калориметрический метод определения мощности ультразвука.

1.3.6. Действие ультразвука на биологические системы.

1.3.7. Использование ультразвука в терапии онкологических заболеваний.

1.3.8. Влияние ультразвука на композитные среды и органические микрокапсулы.

1.3.9. Выводы по разделу 1.3.

1.4. Взаимодействие полиэлектролитных микрокапсул с биологическими объектами.

1.4.1. Взаимодействие микрокапсул с живыми клетками.

1.4.2. Исследование процесса поглощения микрокапсул живыми клетками методом проточной цитометрии.

1.4.3. Выводы по разделу 1.4.

ГЛАВА 2. НАНОКОМПОЗИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ,

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ОБРАБОТКЕ.

2.1. Формирование микрокапсул с наночастицами магнетита в структуре оболочки и изучение их чувствительности к ультразвуку.

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы исследования.

2.1.3. Методика приготовления микрокапсул.

2.1.4. Результаты создания и исследования микрокапсул.

2.1.4.1. Оптимизация структуры оболочек полиэлектролитных и нанокомпозитных микрокапсул.

2.1.4.2. Исследование полиэлектролитных микрокапсул средствами ПЭМи АСМ.

2.1.4.3. Исследование нанокомпозитных микрокапсул с наночастицами магнетита в структуре оболочки средствами ПЭМ и KJICM.

2.1.4.4. Исследование морфологических параметров микрокапсул с наночастицами магнетита в структуре оболочки методом АСМ.

2.1.5. Исследование влияния ультразвука на целостность оболочек полиэлектролитных и нанокомпозитных микрокапсул, функционализированных наночастицами магнетита.

2.1.6. Выводы к разделу 2.1.

2.2. Формирование мультифункциональных микрокапсул с наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками в структуре оболочки и изучение их чувствительности к ультразвуку.

2.2.1. Материалы.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.3. Методика приготовления микрокапсул.

2.2.4. Результаты создания и исследования микрокапсул.

2.2.5. Изучение действия магнитного поля на микрокапсулы, модифицированные наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками.

2.2.6. Исследование влияния ультразвука на целостность оболочек микрокапсул, функционализированных наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками.

2.2.6. Выводы к разделу 2.2.

2.3. Формирование и изучение свойств нанокомпозитных микрокапсул, функционализированных наночастицами оксида цинка.

2.3.1. Материалы.

2.3.2. Методы исследования.

2.3.3. Методика приготовления микрокапсул.

2.3.4. Результаты создания и исследования микрокапсул.

2.3.4.1. Исследование процесса формирования полиэлектролитной и нанокомпозитной оболочки на поверхности коллоидных частиц методом динамического светорассеяния.

2.3.4.2. Исследование микрокапсул средствами ПЭМ и СЭМ.

2.3.4.3. Исследование морфологии поверхности микрокапсул средствами АСМ.

2.3.4.4. Определение объемной фракции наночастиц оксида цинка в оболочке микрокапсул.

2.3.4.5. Определение механических свойств микрокапсул методом атомно-силовой спектроскопии.

2.3.5. Исследование влияния ультразвука на целостность оболочек нанокомпозитных микрокапсул, функционализированных наночастицами оксида цинка.

2.3.6. Выводы к разделу 2.3.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами"

Актуальность темы

Разработка новых методов диагностики, лечения и мониторинга различных заболеваний является одним из ведущих направлений в области исследований современной медицины. Основной проблемой, связанной с использованием наноматериалов в этой области, является создание систем адресной доставки лекарственных препаратов, способных осуществлять их контролируемое высвобождение в непосредственной близости от пораженных участков организма. Это позволит существенно повысить эффективность действия лекарственных препаратов и значительно уменьшить их общую концентрацию в организме, и, как результат, снизить побочные эффекты от их применения. Адресная доставка может осуществляться при помощи различных типов нано- и микроконтейнеров, пригодных для капсуляции биологически-активных веществ: наночастиц; липосом; полимерных мицелл; различных векторных конструкций, позволяющих направленно связываться и эндоцироваться в клетки-мишени; антител, обеспечивающих селективную сорбцию контейнеров на поверхности раковых клеток; рН-чувствительных носителей [1-3]. Однако использование данных объектов затруднено высокой стоимостью их 1 изготовления и малой стабильностью во времени. В связи с этим среди потенциальных средств адресной доставки, выступающих, кроме того, в роли модельных объектов, следует особо выделить полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции [4, 5].

На данный момент известно достаточно большое количество различных способов капсуляции лекарственных веществ в объеме полиэлектролитных микрокапсул. Так, проницаемость их оболочек может изменяться под действием различных факторов (температура, кислотность среды, полярность растворителя, ионная сила раствора и т.д.) [6]. Известны примеры создания биосовместимых микрокапсул с иммобилизованными в них биоактивными соединениями (белками, в частности, ферментами, ДНК, ( экстрактами лекарственных растений), применяемыми в биомедицине для репарации тканей [7]. Выбор в качестве составных компонентов оболочек микрокапсул материалов различной природы (обладающих, например,

1 { с магнитными, плазмонно-резонансными, пьезоэлектрическими и др. свойствами), позволяет получать многофункциональные носители, чувствительные к тому или иному внешнему воздействию (магнитному полю, лазерному излучению, ультразвуку и т.п.), что также существенно расширяет перспективы и повышает эффективность их использования [8-14]. Следует отметить, что не только выбор веществ, но и варьирование размера, структурирование оболочки микрокапсул путем изменения числа слоев в ней, объемной фракции различных включений и т.п. позволяют достаточно точно управлять их физическими и химическими свойствами и делают возможной реализацию принципа «снизу-вверх».

Однако для достижения желаемого эффекта необходимо иметь механизм высвобождения закапсулированного вещества из объема микроконтейнеров. Воздействовать на проницаемость оболочек микрокапсул можно различными способами. Так, существуют работы по вскрытию микрокапсул лазерным излучением внутри клеток (ш vitro) [11]. Однако в этом случае для достижения требуемых плотностей мощности лазерного излучения нужна его фокусировка на поверхности оболочки капсулы, что не всегда достижимо, особенно в биологических средах. В области биомедицинского применения, например, в терапии раковых заболеваний, зачастую требуется менее локальное воздействие, приводящее к одновременному вскрытию множества микрокапсул. Примером такого дистанционного, группового воздействия является ультразвук. Он обладает достаточной мощностью для разрушения микроконтейнеров, при этом важную роль играют как состав и структура оболочек микрокапсул, так и параметры ультразвука - частота, мощность и время воздействия [12-14]. Следует отметить, что ультразвук широко применяется в медицине в качестве средства диагностики и лечения многих (в том числе онкологических) заболеваний (ультразвуковая гипертермия, неинвазивная HIFU хирургия, сонодинамическая терапия). Известна возможность использования твердофазных нановключений-соносенсибилизаторов в биологических структурах в качестве концентраторов ультразвуковой энергии [15].

Возможность использования неорганических наночастиц в качестве соносенсибилизаторов, повышающих чувствительность полиэлектролитных микрокапсул к ультразвуку, показана ранее на примере наночастиц магнетита [12]. Однако на данный момент мощности ультразвука, используемого для разрушения оболочек микрокапсул, намного превышают безопасные терапевтические мощности. Добиться разрушения микрокапсул при меньших мощностях и более высоких частотах ультразвука можно путем подбора соносенсибилизаторов, а также варьирования их объемной фракции в оболочке. Это позволит управлять механическими свойствами капсул и, следовательно, их чувствительностью к ультразвуку. В данной работе в качестве соносенсибилизаторов были выбраны наночастицы магнетита и оксида цинка. Магнетит может использоваться для функционал из ации оболочек микрокапсул с целью обеспечения их управляемого перемещения под действием магнитного поля. Выбор наночастиц оксида цинка обусловлен тем, что они являются хорошим антибактериальным агентом и применяются в терапии онкологических заболеваний [16-18].

Цель работы

Задачи исследования

Основными задачами исследования являлись:

1. Получение нанокомпозитных микрокапсул, содержащих в структуре оболочки наночастицы магнетита, и исследование их чувствительности к ультразвуку в зависимости от объемной фракции наночастиц магнетита в оболочке.

2. Формирование и оптимизация структуры и состава оболочек микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка, с целью повышения чувствительности капсул к ультразвуку путем варьирования объемной фракции'наночастиц оксида цинка. Изучение взаимосвязи между параметрами; характеризующими механические свойства оболочек микрокапсул и их чувствительности к ультразвуковой обработке в зависимости от объемной фракции наночастиц оксида цинка.

5. Определение токсического эффекта, оказываемого ZnO-композитными микрокапсулами со структурой оболочки (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3 (PAH/PSS) и их составляющими компонентами на гидробионтов (цериодафний (Ceriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparins) и аквариумных рыб D. rerio).

Научная новизна работы

1. Продемонстрирована возможность разрушения нанокомпозитных микрокапсул под действием низкочастотного (27 кГц) ультразвука с плотностью мощности- 3.5 Вт/см2 в течение нескольких минут и обнаружена зависимость, чувствительности капсул от объемной фракции наночастиц магнетита в структуре оболочки.

3. Произведено разрушение 2пО-композитных оболочек микрокапсул под действием низкочастотного (20 кГц) ультразвука с плотностью мощности 0.6 Вт/см2 в физиологических средах — фосфатно-солевом буфере, плазме крови и крови. Показана возможность разрушения ZnO-композитных капсул в крови под действием ультразвука, не приводящая к нарушению целостности клеток крови.

5. Установлено снижение токсического эффекта, оказываемого нанокомпозитными микрокапсулами (РАН/Р88)2^пО/Р88)з(РАН/Р88) на гидробионтов, по сравнению с их составляющими компонентами — полиэлектролитами и наночастицами оксида цинка.

Научно-практическая значимость работы

Реализовано существенное повышение чувствительности микрокапсул к ультразвуку путем встраивания в структуру их оболочек в качестве соносенсибилизатора наночастиц оксида цинка, что значительно повышает перспективы их использования в биомедицинских целях в качестве контейнеров адресной доставки за счет снижения необходимой для разрушения капсул мощности ультразвука и сокращения времени ультразвуковой обработки.

Продемонстрировано взаимодействие нанокомпозитных микрокапсул, содержащих наночастицы оксида цинка, с клетками крови, показана гемосовместимость данного типа микроконтейнеров и обнаружена зависимость протекания процесса фагоцитоза от размера капсул, что позволяет использовать явление фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул, образовавшихся после их вскрытия ультразвуком.

Обнаружен эффект разрушения гпО-композитных микрокапсул в суспензии эритроцитов в результате ультразвуковой обработки, сопровождающийся частичным разрушением эритроцитов, то есть обнаружены пороговые параметры ультразвука, применимого для вскрытия капсул в присутствии биологических объектов, и показана необходимость дальнейшего повышения чувствительности микрокапсул путем подбора соносенсибилизаторов или путем оптимизации частоты и мощности ультразвука.

Произведен анализ токсичности ZnO-композитных микрокапсул и их составляющих компонент с использованием в качестве тест-систем гидробионтов (цериодафний (Ceriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio). Установлено, что наибольшей токсичностью из всех используемых компонент микрокапсул обладает раствор катионного полиэлектролита полиал ил амина гидрохлорида (РАН) по сравнению с полистиролсульфонатом натрия (PSS), комплексом PAH+PSS, наночастицами оксида цинка и микрокапсулами. Обнаружено существенное снижение острого токсического эффекта для случая полиэлектролитного комплекса PAH+PSS, а также суспензии микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS).

Достоверность полученных результатов

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изменение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита (С,-потенциал -12.5 ±4 мВ, рН 7) позволяет регулировать чувствительность микрокапсул к низкочастотному ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см2). При проведении одного цикла адсорбции магнетита наблюдается увеличение чувствительности микрокапсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Дальнейшее увеличение числа циклов адсорбции магнетита приводит к снижению ультразвуковой чувствительности капсул, что связано с характером адсорбции и распределением наночастиц магнетита в оболочке.

2. Изменение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита (С потенциал -12.5 ±4 мВ, рН 7) позволяет регулировать чувствительность микрокапсул к низкочастотному ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см ). При проведении одного цикла адсорбции магнетита наблюдается увеличение чувствительности микрокапсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Дальнейшее увеличение числа циклов адсорбции магнетита приводит к снижению ультразвуковой чувствительности капсул, что связано с характером адсорбции и распределением наночастиц магнетита в оболочке.

3. Инкубация в крови нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка, не приводит к гемолизу. Для капсул с диаметром ~10 мкм процесс фагоцитоза затруднен. Фрагменты капсул после ультразвуковой обработки, капсулы диаметром 1 мкм и их агрегаты успешно фагоцитируются белыми клетками крови. 4. Из составляющих компонент нанокомпозитных микрокапсул со структурой оболочки (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) максимальный токсический эффект на гидробионтов оказывает катионный полиэлектролит полиалиламин гидрохлорид (РАН). Минимальное токсическое действие на гидробионтов оказывают нанокомпозитные микрокапсулы, что связано с наличием упорядоченного полиэлектролитного комплекса и компенсацией избыточных зарядов молекул полиэлектролитов в структуре оболочки микрокапсулы.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Всероссийской научной конференции «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине (СГУ, 2007); Международной конференции «Saratov Fall Meeting 2007» в секции Nanobiophotonics (Саратов, 2007, устный доклад); научном семинаре, проводимом в рамках российско-британского проекта BRIDGE (Саратов, 2007, устный доклад); 2-ой школе-семинаре «Наночастицы, наноструктурированные покрытия и микроконтейнеры: технология, свойства, применение» в рамках Фестиваля науки, посвященного празднованию 100-летнего юбилея СГУ (Саратов, 2009, устный доклад); 1-ой Международной научной школе «Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009, победитель постерной сессии); Международной конференции «Saratov Fall Meeting 2009» в секции Nanobiophotonics (Саратов, 2009, устный доклад), совместном семинаре Германской службы академических обменов (DAAD) для стипендиатов российско-германских программ «Михаил Ломоносов» и «Иммануил Кант» (Москва, 2010), а также на семинарах рабочей группы и кафедры.

Гранты

Работа, представленная в диссертации, выполнена при финансовой поддержке следующих проектов: «Создание нанокомпозитных планарных слоев и оболочек микрокапсул методом полиионной самосборки и исследование их физических свойств» (Мин. образования и науки РФ РИ-19.0/002/227 ГК №02.442.11.7183) (2005 г.); «Формирование нанокомпозитных микро- и наноразмерных структур и исследование их физических свойств» (Мин. Образования и науки РФ 6РИ-19.0/001/051 ГК №02.442.11.7249) (2006 г.); «Функционализованные наночастицы с настраиваемым плазмонным резонансом и полиэлектролитные микрокапсулы с наночастицами в составе оболочки» (Мин. Образования и науки РФ 2007-3-1.3-07-01-081 ГК №02.513.11.3043) (2007 г.); Инновационно-образовательная программа СГУ (2007-2008 гг.); «Исследование возможности создания водных суспензий микрокапсул с нанокомпозитными оболочками, чувствительными к микроволновому и ультразвуковому облучению» (совместный российско-немецкий проект РФФИ № 06-02-04009 и DFG 436 RUS 113/844/0-1) (2008-2009 гг.); совместная программа Министерства образования и науки РФ и Германской службы академических обменов (DAAD) "Михаил Ломоносов II" (проект А/08/96088) (2009-2010 гг.).

Личный вклад диссертанта

Публикации

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Колесникова, Татьяна Александровна

4.5. Выводы к главе 4

1. Раствор поликатионного полиэлектролита РАН, используемого в качестве составляющего компонента для формирования оболочки микрокапсул, обладает максимальной токсичностью по отношению ко всем рассматриваемым тест-объектам. Данное действие связано с электростатическим взаимодействием исследуемых полимеров и мембран клеток тестируемых объектов. Так как в большинстве случаев клеточные мембраны имеют отрицательный заряд, то в результате адгезия и дальнейшее взаимодействие с катионным полиэлектролитом (РАН) происходит более эффективно по сравнению с анионным полиэлектролитом (РББ) или незаряженным полимером. Так, раствор РББ оказывает минимальное токсическое действие на каждый тип используемых гидробионтов.

Наибольшей чувствительностью к действию катионного полиэлектролита РАН обладают цериодафнии {Сегюёаркта а/АтБ), для которых значение полулетальной концентрации ЛК5(М8 составляет 0.34 мг/л. Личинки хирономид (СЫгопотт Нраг'шз) проявляют наибольшую резистивность по отношению к раствору РАН (ЛК50-48 для них составляет 400 мг/л).

Формирование полиэлектролитного комплекса РАН+Р88 приводит к существенному снижению токсического эффекта по сравнению с влиянием катионного полиэлектролита РАН, что может быть связано с компенсацией зарядов полиэлектролитов в результате их электростатического взаимодействия.

Возможности полиионной сборки' позволяют существенно снизить токсичность наночастиц оксида цинка за счет их встраивания в структуру оболочек микрокапсул. Данный эффект связан с формированием защитного покрытия из полиэлектролитных слоев (так называемого «саркофага») на поверхности наночастиц, которое сопровождается компенсацией их заряда.

Для водной суспензии микрокапсул отмечается значительное снижение острого токсического эффекта по сравнению с воздействием их составных компонентов. Безопасная для гидробионтов концентрация микрокапсул (РАН/Р88)2(7пО/Р88)3(РАН/Р88) в водной среде не превышает 250 мг/л. Снижение токсичности в данном случае связано с наличием упорядоченного полиэлектролитного комплекса, который образуется в результате послойной адсорбции молекул противоположно заряженных полиэлектролитов при формировании оболочек микрокапсул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения диссертационной работы были получены следующие основные результаты:

1. Ультразвук (27 кГц, 3.5 Вт/см2) оказывает разрушающее воздействие как на полиэлектролитные, так и на нанокомпозитные микрокапсулы. Присутствие наночастиц магнетита (¿¡-потенциал -12.5 ±4 мВ, рН 7) в структуре оболочки повышает чувствительность капсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Увеличение общего числа полиэлектролитных слоев в оболочке микрокапсул приводит к снижениюих чувствительности к ультразвуковой обработке, что объясняется ростом толщины их оболочек при увеличении числа циклов адсорбции полиэлектролитов. Увеличение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита от 1 до 5 делает оболочку капсул более устойчивой к ультразвуковому воздействию.

3. Встраивание наночастиц оксида цинка (¿¡-потенциал +36 ± 5 мВ, рН 7) в структуру оболочек микрокапсул приводит к существенному увеличению их чувствительности к ультразвуку (20 кГц, 0.6 Вт/см2) по сравнению с полиэлектролитными капсулами без наночастиц, а таюке микрокапсулами, функционализированными наночастицами магнетита. Для разрушения микрокапсул с наночастицами ZnO требуется гораздо более низкие мощности и время воздействия ультразвука (3-9 секунд), чем для капсул с наночастицами магнетита.

4. Изменение числа стадий адсорбции наночастиц ZnO от 1 до 4 приводит к увеличению объемной неорганической фазы в оболочке от 21 до 79%. При этом отмечается отсутствие существенных различий для микрокапсул с 3 и 4 слоями наночастиц ZnO, что говорит о «насыщении» оболочки наночастицами ZnO вследствие недостатка полиэлектролита, выступающего в качестве связующего компонента для их закрепления. Изменение механических свойств микрокапсул в зависимости от объемной фракции наночастиц ZnO в структуре оболочки (уменьшение жесткости и эффективного значения модуля Юнга (от 580 до 31 МПа) при увеличении числа стадий адсорбции наночастиц ZnO от 1 до 4) приводит к повышению чувствительности микрокапсул к ультразвуку.

5. Чувствительность к ультразвуку нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами ZnO, незначительно снижается при с ) их облучении в средах с физиологическими свойствами (фосфатном буфере, плазме крови и крови) по сравнению с водой. Инкубация ZnO-композитных микрокапсул с клетками крови не вызывает повреждения и гибели клеток и не приводит к гемолизу эритроцитов. Установлена зависимость протекания фагоцитоза от размера фагоцитируемых ZnO-композитных микрокапсул: микрокапсулы большого диаметра (10 мкм) распознаются иммунной системой, однако фагоцитоз таких капсул отсутствует, в результате вероятность преждевременного уничтожения 10-мкм капсул иммунной системой организма мала, что открывает перспективы использования данных систем, например, в качестве контейнеров для адресной доставки. Микрокапсулы малого диаметра (1 мкм) и фрагментов оболочек, образовавшихся в результате ультразвуковой обработки 10-мкм капсул, успешно поглощаются фагоцитами, что открывает возможности использования фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул.

Раствор поликатионного полиэлектролита поли ал ил амин гидрохлорида (РАН), используемого в качестве составляющего компонента для формирования оболочки микрокапсул, обладает максимальной токсичностью по отношению к гидробионтам (цериодафниям (Ceriodaphnia affinis), люминесцентным генноинженерным бактериям Escherichia coli, 1885, М-17, личинкам хирономид (Chironomus riparius) и аквариумным рыбам D. rerio). Это связано с электростатическим взаимодействием катионного полимера с отрицательно заряженными клеточными мембранами тестируемых объектов. Формирование полиэлектролитного комплекса PAH+PSS приводит к снижению токсического эффекта за счет нейтрализации зарядов молекул полиэлектролитов, участвующих в комплексообразовании. Возможности полиионной сборки позволяют существенно снизить токсичность наночастиц оксида цинка за счет их встраивания в структуру оболочек микрокапсул, что связано с формированием на их поверхности защитного покрытия из полиэлектролитных слоев. Наличие упорядоченной послойной структуры в оболочке микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) проявляется также в минимальном токсическом действии на гидробионтов. При этом безопасная для гидробионтов концентрация микрокапсул в водной среде не превышает 250 мг/л.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Колесникова, Татьяна Александровна, Саратов

1. Li X., Jasti B.R. Design of controlled release drug delivery systems. McGraw-Hill. US. 2006. 435 p. DOI: 10.1036/0071417591.

2. Nastruzzi C. Lipospheres in drug targets and delivery: approaches, methods, and applications. CRC Press LLC. US. 2005. 159 p. ISBN 0-8493-1692-8.

3. Arshady R. Microspheres, microcapsules and liposomes. Vol. II: Medical and biotechnology applications. Part I and II. London: Citus books. 1999. 683 p.

4. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites // Science. 1997. - Vol. 277. - P. 1232-1237.

5. Donath E. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes / E. Donath, G.B. Sukhorukov, F. Caruso, S.A. Davis, H. Möhwald // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - Vol. 37. -N. 16. - P. 2202-2205.

6. Sukhorukov G.B. pH-controlled macromolecule encapsulation in and release from polyelectrolyte multilayer nanocapsules / G.B. Sukhorukov, A.A. Antipov, A. Voigt, E. Donath, H. Möhwald // Macromol. Rapid Commun. 2001. - Vol. 22. - P. 44-46.

7. Borodina Т. Controlled release of DNA from self-degrading microcapsules / T. Borodina, E. Markvicheva, S. Kunizhev, H. Möhwald, G.B. Sukhorukov, O. Kreft // Macromol. Rapid Commun. 2007. - Vol. 28.-N. 18-19.-P. 1894-1899.

8. Hu S.-H. Controlled rupture of magnetic polyelectrolyte microcapsules for drug delivery / S.-H. Hu, C.-H. Tsai, C.-F. Liao, D.-M. Liu, S.-Y. Chen // Langmuir. 2008. - Vol. 24. -P. 11811-11818.

9. Skirtach A.G. Laser-induced release of encapsulated materials inside living cells / A.G. Skirtach, A.M. Javier, O. Kreft, K. Köhler, A.P. Alberola, H. Möhwald, W.J. Parak, G.B. Sukhorukov // Angew. Chem. 2006. - Vol. 118. - P. 4728-4733.

10. Shchukin D.G. Ultrasonically induced opening of polyelectrolyte microcontainers / D.G. Shchukin, D.A. Gorin, H. Möhwald // Langmuir. 2006. - Vol. 22. - P. 7400-7404.

11. Skirtach A.G. Ultrasound stimulated release and catalysis using polyelectrolyte multilayer capsules / A.G. Skirtach, B.G. De Geest, A.A. Mamedov, A.A. Antipov, N.A. Kotov, G.B. Sukhorukov // J. Mater. Chem. 2007. - Vol. 17. - P. 1050-1054.

12. De Geest B.G. Ultrasound-triggered release from multilayered capsules / B.G. De Geest, A.G. Skirtach, A.A. Mamedov, A.A. Antipov, N.A. Kotov, S.C. De Smedt, G.B. Sukhorukov // Small. 2007. - Vol. 3. - N. 5. - P. 804-808.

Информация о работе

Колесникова, Татьяна Александровна
кандидата физико-математических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы