Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки

Дубровский, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки"

604612029

На правах рукописи

Дубровский Алексей Владимирович

Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки.

03.01.02 - биофизика

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине2010 г. 1 1 НОЯ 2010

004612029

Работа выполнена в секторе физической химии биополимеров Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Сухорукое Борис Иванович

кандидат биологических наук Шабарчина Людмила Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Орлов Николай Яковлевич

доктор химических наук Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится «17» ноября 2010 г. в 1330 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь совета Д 002.093.01 кандидат физико-математических наук

Актуальность темы. Создание новых материалов является одной из движущих сил для развития как фундаментального знания, так и промышленности. Полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК), изготавливаемые методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микро размеров с последующим разрушением и удалением этих частиц, являются объектами новой быстро развивающийся области — полимерной нанотехнологии. Полученные к настоящему времени результаты демонстрируют широкие возможности использования ПНМК при разработке нового класса химических и биохимических реакторов и изучения особенностей протекания физических и химических процессов в малом объеме, при создании нового типа зондов и высокочувствительных сенсоров и разработке оригинальных методов разделения смесей различных органических и неорганических веществ, в частности, выделения из среды ионов тяжелых металлов. Применение микрокапсул в биомедицине позволяет реализовать ряд важных возможностей капсулирования, таких как защита биологически активных веществ (БАВ) от окисления под воздействием внешней среды, обеспечение пролонгированного и/или контролируемого выхода БАВ, придание микрокапсулированным продуктам новых физических свойств.

В последнее время ПНМК находят свое применение при разработке нового класса диагностических средств - полиэлектролитных ферментных микродиагностикумов, т.е. средств микро- и наноразмерной величины, позволяющих распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества как в нативных биологических жидкостях, так и в сточных водах. Такие микродиагностикумьг представляют собой ансамбль полиэлектролитных микрокапсул с включенным в них ферментом, оболочки которых состоят из чередующихся слоев поликатиона и полианиона, содержащих гидрофобный остов. Благодаря полупроницаемости оболочки микрокапсула с включенным ферментом, помещенная в многокомпонентную среду, становится анализатором в ней низкомолекулярных веществ - субстратов, ингибиторов или активаторов инкапсулированного фермента. Использование такого фермента по сравнению со «свободным» в клинико-биохимическом анализе имеет неоспоримые преимущества. Они связаны в первую очередь с высокой стабильностью инкапсулированного фермента и возможностью его многократного использования.

Научная новизна. В рамках выполнения диссертации разработана и запатентована технология получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул. Отличительной ее особенностью является стадия подбора полиэлектролитной пары оболочки, которая обеспечивает максимальную сохранность активности инкапсулированного фермента. Методом трансмиссионной электронной микроскопии установлена структурная организация содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул. Изучена термочувствиельность полых и содержащих интерполиэлектролитные комплексы и белки полиэлектролитных микрокапсул. На их основе разработан полиэлектролитный ферментный микродиагностикум с регистрацией его работы по изменению скорости седиментации микрокапсул.

Практическая ценность. Полученные в ходе данной работы полиэлектролитные микрокапсулы, содержащие фермент будут использованы в качестве основного компонента полиэлектролитного ферментного микродиагностикума широкого, в том числе медицинского, назначения. Разработанный способ регистрации его работы по изменению скорости седиментации микрокапсул позволяет улучшить существующие па сегодняшний день клинико-биохимические методы анализа, в частности определение мочевины в различных биологических жидкостях. Результаты исследования термочувствительности и ультраструктурной организации микрокапсул имеют не только фундаментальное, но и практическое значение в связи с нахождением оптимальных режимов для полиэлектролитного капсулирования и декапсулирования белковых систем.

Целыо данной работы было изучение структуры и термочувствительности содержащих белки полиэлектролитных микрокапсул, а так же создание на их основе нового типа микродиагностикума, с регистрацией его работы по изменению седиментационных характеристик микрокапсул.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить полиэлектролитиые микрокапсулы трех типов: полые, содержащие интерполиэлектролитные комплексы и белки. Установить оптимальные условия включения ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы.

2. Изучить ультраструктурную организацию содержащих и не содержащих белки полиэлектролитных микрокапсул.

3. Исследовать влияние температуры на полые и заполненные полиэлектролитные м икрокапсулы.

4. Разработать полиэлектролитный ферментный микродиагностикум с регистрацией его работы по изменению скорости седиментации микрокапсул.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международных конференциях "Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposytes" 2006 и «Современные проблемы науки о полимерах» 2007, Санкт-Петербург, 4-й международной конференции "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies" 2007, Пущино, I региональной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)» 2006, Иваново, конференции «Биология - наука XXI века», 2005, 2006, 2007 Пущино и международном форуме по нанотехнологиям 2008, Москва.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 8 статей и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена па 80 страницах с использованием 27 рисунков, 5 таблиц и включает: введение, обзор |

литературы, материалы и методы, полученные результаты и их обсуждение, выводы. i

Список литературы содержит 161 ссылку.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Полиэлектролитный микрокапсулы получали методом послойной адсорбции полиэлектролитов на сферические ядра. Схема этого процесса представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема формирования полиэлектролитной оболочки на поверхности заряженной

коллоидной микрочастицы методом последовательной адсорбции и удаление ядра.

Отрицательно заряженные коллоидные частицы, выступающие в качестве ядра.

инкубируются в растворе положительно заряженного полиэлектролита, после чего его молекулы адсорбируются на поверхности частицы. Не связавшиеся молекулы полиэлектролита удаляют и затем наносят полиэлектролит противоположного заряда Многократное повторение процедур нанесения полиэлектролитов приводит к формированию "многослойной" полиэлектролитной пленки на поверхности коллоидной частицы.

Формирование полых полиэлектролитных микрокапсул (ПМК).

Для образования полых ПМК необходимо выполнение двух основных условий.

Во-первых, удаление ядра не должно приводит к растворению образовавшейся оболочки. Во-вторых, продукты разрушения ядра должны свободно проникать через поры оболочки капсулы. Нами были подобраны оптимальные условия получения полиэлектролитных микрокапсул на латексных ядрах. Факторами, влияющим на формирование таких капсул, являются концентрация реагентов, температура, гидродинамические характеристики процесса, рН среды, растворитель.

При получении полиэлектролитных микрокапсул на латексных микрочастицах мы использовали полистиролсульфонат натрия (ПСС) и полиаллиламин гидрохлорид (ПАА). Для формирования таких микрокапсул были подобраны следующие условия:

1) все полиэлектролиты с концентрацией 1-2 мг/мл готовили на 0,5 М растворе №С1. Для формирования первого полиэлектролитного слоя использовали поликатион, поскольку поверхность латексных микрочастиц стабилизирована карбоксильными группами, и, соответственно, такие частицы несут на своей поверхности отрицательный заряд.

2) кислотность среды поддерживали в интервале рН 6-8, что обеспечивало стабильность латексной микрочастицы.

3) процедуру формирования микрокапсул проводили при комнатной температуре (15-25°С), т.к. повышение ее, как будет показано ниже, влияло на структуру полиэлектролитной оболочки.

4) для предотвращения агрегации частиц в процессе адсорбции полиэлектролитов, их суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 1-3 сек.

5) после адсорбции полиэлектролита микрочастицы тщательно промывали от его не связавшейся части.

На стадии разрушения латексной микрочастицы было изучено влияние двух органических растворителей - диметилформамида (ДМФА) и тетрагидрофурана (ТГФ). В литературных источниках преимущество отдавалось ТГФ, но на практике мы столкнулись с его абсолютной непригодностью при данной методике получения ПМК, т. к. при этом происходило слипание полученных капсул при их контакте с этим растворителем. Выбранный нами ДМФА оказался более подходящим растворителем, т. к. хорошо смешивался с водой, а также способствовал полному растворению латексного ядра внутри оболочки микрокапсулы.

В ходе проделанной работы были сформированы следующие полые микрокапсулы, состоящие из различных по составу и числу слоев полиэлектролитов:

«четные»: (ПАА/ПСС)3; (ПАА/ПСС)4; (ПАА/ПСС)5;

«нечетные»: (ПАА/ПСС)3 /ПАА; (ПАА/ПСС)4 /ПАА.

Нами были использованы разные типы латексных микрочастиц, отличающиеся

числом карбоксильных групп на поверхности микрочастицы. Было обнаружено, что

при использовании латексных частиц с незаряженной поверхностью получить

микрокапсулы не удается из-за неспособности полиэлектролитов связаться с

поверхностью ядра. Эти данные получены нами с использованием метода

конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для выяснения способности

ПАА связываться с поверхностью латексных микрочастиц с различным зарядом на

ней, нами были приготовлены частицы, покрытые одним слоем флуоресцентно-

меченого ПАА и получены их конфокально-микроскопические изображения.

Флуоресцентной меткой служил флуоресцеин-5'-изотиоционата (ФИТЦ), который

ковалентно связывается с аминогруппами полиаллиламина. Реакцию проводили

следующим образом: к раствору полиэлектролита (1-10 мг/мл) в 50 мМ боратпом

буфере, рН 9,0 при перемешивании (300-400 об/мин) медленно добавляли ФИТЦ в

том же буфере. Компоненты смешивали в мольном соотношении

ФИТЦ:полиаллиламин (по аминогруппам)=1:100. После 1,5-2 часов инкубации

полученный раствор диализовали против воды (10 литров, диализные мешки «БресИ!

Рог») и затем лиофильно высушивали. Нами были получены микросферолиты

карбоната кальция и латексные микрочастицы с разным числом карбоксильных групп

на поверхности, содержащие первым слоем ФИТЦ-меченый ПАА. На конфокальных

микрофотографиях этих частиц видно, что флуоресцентная метка находится на

поверхности карбонатного кора, а также на латексных микрочастицах с

концентрацией карбоксильных групп 0,48 мкг-экв/м . Для латексных микрочастиц, у которых отсутствует заряд, конфокальная микроскопия показала отсутствие меченого полиэлектролита на их поверхности.

Рис. 2. Конфокальная

микрофотография латексных

микрочастиц с отрицательно заряженной поверхностью покрытых . слоем флуоресцентно - меченого ПАА.

Формирование мультислойных полиэлектролитных микрокапсул на микросферолитах СаС03

Также, как и для получения полых микрокапсул, мы использовали полистиролсульфонат (ПСС) и полиалиламин (ПАА). Условия для формирования оболочек на микросферолитах карбоната кальция соответствуют условиям получения полых микрокапсул. Как правило, в качестве первого полиэлектролита используют поликатион, поскольку микрочастицы СаСОз в целом отрицательно заряжены. Однако в нами было показано, что полианионы, например полистиролсульфонат, также связываются с частицами карбоната кальция и могут быть использованы в качестве первого слоя при формировании полиэлектролитных микрокапсул, например, с числом полиэлектролитных слоев 7, 9.

Нами были сформированы следующие типы микрокапсул, состоящие из различных по составу и числу слоев полиэлектролитов, со следующей архитектурой: с четным числом слоев оболочки (четные): (ПАА/ПСС)3; (ПАА/ПСС)4; (ПАА/ПСС)5; с нечетным числом слоев оболочки (нечетные): (ПСС/ПАА)3/ПСС; (ПСС/ПАА)4/ПСС;

Для конфокально-микроскопических исследований нами были сформированны

микрокапсулы, содержащие флуоресцентно меченый ПАА. Флуоресцентное мечение

проводили как было описано выше. Нами были получены ФИТЦ-меченые

полиэлектролитные микрокапсулы с числом слоев от 6 до 10. Из конфокально-

лазерных микрофотографий этих капсул следует, что флуоресцентная метка

распределена вдоль всего оптического среза. Это означает, что ФИТЦ-меченый

полиэлектролит локализуется по всему объему капсулы. Однако ближе к поверхности

его количество увеличивается (рис.3). Это становится особенно заметным с увеличением числа слоев.

Рис. 3. Конфокальная лазерная микрофотография полиэлектролитных

микрокапсул. Оптический срез с шагом I мкм. Метка 1 мкм.

Принимая во внимание, что микросферолиты СаС03 являются пористым образованием с размером пор от 30 до 90 нм [Petrov A.l. el al. Biotechnol. Prog. 2005. 21.(3). 918] становится очевидным, что полиэлектролиты при адсорбции на их поверхности проникают в поры.

Получение полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки и ферменты.

Получение составных микросферолитов СаСОз - белок

Под термином «составные микросферолиты» мы подразумеваем сферолиты СаС03 содержащие в своем составе белки, ферменты и другие вещества. Получение составных микросферолитов было изучено нами для бычьего сывороточного альбумина (БСА), гемоглобина, ферритина, лактатдегидрогеназы, ацетилхолинэстеразы и уреазы. Количество включенного в составной сферолит белка определяли либо по методу Бредфорда либо спектрофотометрически при сравнении абсорбции при Х=280 нм исходных растворов белка и супернатанта, образовавшегося после осаждения составных микросферолитов. Содержание белка в полученных микросферолитах рассчитывали как отношение массы включенного белка к числу микросферолитов, концентрацию которых определяли с помощью камеры Горяева. Показано, что метод характеризуется достаточно высокой эффективностью (в микросферолиты включается 60 и более процентов от исходного количества белка).

Формирование мультислойных полиэлектролитных микрокапсул на микросферолитах СаСОз - фермент.

Поскольку включение фермента в капсулы любого происхождения обычно ведет к изменению его активности, то одной из важных задач является формирование

оболочки капсулы путем подбора такой противоположно заряженной пары полиэлектролитов, которая была бы оптимальна для функционирования инкапсулированного фермента.

Нами было установлено [Сухорукое Б.И. и др. Биофизика. 2007 52 (6). 1041], что полианионы не оказывают на уреазу ингибирующего воздействия, тогда как ПАА заметно понижет ее активность. Поликатион ПДАДМА также не оказывает воздействия на фермент, однако он является неподходящим полиэлектролитом для инкапсулирования уреазы из-за того, что вызывает высокую агрегацию микрокапсул на стадии его наслаиваивания. Поэтому первым слоем оболочки был выбран отрицательно заряженный полиэлектролит ПСС, вторым и последующими четными слоями -ПАА, что было сделано с целью избежать или уменьшить вероятность прямого контакта инактивирующего полиэлектролита с ферментом. Для инкапсулирования уреазы мы формировали оболочки со следующей архитектурой: (ПСС/ПАА)3/ПСС, (ПСС/ПАА)4/ПСС, (ПСС/ПАА)5/ПСС.

Остальные условия формирования оболочки на составных микросферолитах СаСОз-белок не отличаются от условий ее создания на простых микросферолитах СаС03.

Таким образом, полиэлектролиты, которые могут быть использованы при формировании фермент содержащих ПМК, во-первых, не должны сколько-нибудь заметно инактивировать фермент в концентрациях используемых при формировании оболочки капсулы (1-2 мг/мл), во-вторых, необходимо, чтобы они имели гидрофобный остов.

Исследование внутренней ультраструктурной организации полых полиэлектролитных микрокапсул

Информация об ультраструктурной организации микрокапсул была получена

методом трансмиссионной микроскопии. Подготовку образцов проводили следующим образом: в фиксирующем растворе, содержащем какодилатный буфер, диметилсульфоксид, 25 % глутаральдегид, образец выдерживали около 12 часов при комнатной температуре. После промывки буфером, образец дополнительно фиксировали 4 часа в 2 % растворе четырёхокиси осмия на том же буфере, обезвоживание проводили в спиртах возрастающей концентрации ив 100 % ацетоне. Затем его пропитывают смесью эпон - ацетон в пропорции 1:1 первые сутки и 3:1 вторые сутки, после этого образцы заключают в эпоновую смолу. Полимеризацию смолы проводили в течение 24 часов в термостате при 37°С и последующие 24 часа при

60"С. Для электронно-микроскопических исследований из зафиксированного образца готовили серийные срезы. Резание готового блока образца производили стеклянными ножами на ультратоме ЬК.В-3 (Швеция). Срезы помещали на медные палладированные клистерные сетки с величиной ячейки 30 мкм, контрастирование проводили насыщенным водным раствором уранилацетата (1.5 - 2 часа при 37аС) и 20 - 40 мин при комнатной температуре цитратом свинца. Просмотр срезов осуществляли в электронный микроскоп В8-500 (Чехословакия) при ускоряющем напряжении 90 кВ и увеличении 10000 или 24000 раз.

На рисунке 4 представлена фотография ультратонкого среза полой полиэлектролитной микрокапсулы, оболочка который содержит 6 полимерных слоев.

зшшшашжзеЕяхзкн^л. шя^ ^¡шашяшл

Из рисунка видно, что такие микрокапсулы представляют собой полые образования, у которых хорошо выражена внешняя одинаковая по толщине оболочка, начиная уже с 6-ти полиэлектролитных слоев. Наличие плотной, хорошо организованной оболочки можно объяснить тем, что весь полиэлектролит собирается только в приповерхностном слое и совершенно не проникает внутрь латексного ядра. Толщина такой оболочки составляет для микрокапсул с шестью слоями 34 нм. У десятислойных она возрастает до 57 нм. Эти данные находятся в близком соответствии с толщиной полиэлектролитной оболочки для микрокапсул, содержащих БСА и имеющих такое же число полимерных слоев (см. ниже).

Исследование внутренней ультраструктурной организации полиэлектролитных микрокапсул, заполненных интерполиэлектролитными комплексами и белками

На рисунках 5 и 6 представлены фотографии ультратонких срезов микрокапсул, сформированных на сферолитах СаС03 и составном ядре СаС03- БСА. Микрокапсулы имеют различное число слоев полиэлектролитов от 6 до 10.

Рис. 4. Электронная микроскопия ультратонкого среза полой шестислойных полиэлектролитной микрокапсулы.

Рис. 5. Электронная микроскопия ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул, не содержащих белок (А -6 полиэлектролитных слоев, Б - 7 слов, В - 9 слоев, Г - 10 слоев).

Рис. 6. Электронная микроскопия ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белок (А - 6 полиэлектролитных слоев, Б - 7 слов, В — 9 слоев, Г - 10 слоев).

Микрокапсулы, сформированные на СаС03-ядре, имеют средние размеры 4,5 - 5 мкм и обладают сложной морфологией. Как видно из рисунка, в структуре исследуемых нами микрокапсул можно выделить две подсистемы. Одна - внутренняя, «матриксная» задаваемая наноструктурной организацией пористого каркаса СаС03 микросферолита и другая - плотная пространственно организованная структура оболочки формируемой на поверхности микросферолита. При сравнении «четных» и «нечетных» микрокапсул обнаруживается их различие, связанное с более рыхлым внутренним строением «нечетных» капсул, наличием полостей. Кроме того, из рисунка 5 видно, что формирование упорядоченной полиэлектролитной оболочки происходит при числе слоев = 9. Ее толщина при этом составляет порядка 46 нм. Микрокапсулы с числом слоев 6, 7, 8 не обладают регулярной внешней оболочкой и состоят из набора нитевидных и замкнутых наноразмерных элементов. Восьмислойные микрокапсулы обладают фрагментарно сформированной внешней оболочкой. Толщина внешних и внутренних структур 6, 7, 8-слойных микрокапсул одинакова и составляет 22-33 нм.

Микрокапсулы, сформированные на составных микросферолитах СаС03 -БСА, заметно отличаются от капсул, полученный на сферолитах СаС03 - в них отсутствует сложная внутриобъемная молекулярная организация. В полиэлектролитной микрокапсуле, содержащей белок, полиэлектролит распределяется только в

приповерхностном слое. Различие в пространственной организации этих двух типов микрокапсул обусловлено, по всей вероятности, прочным связыванием белка с СаС03 и тем самым формированием прочного составного микросферолита с существенно меньшим по количеству и размерам пор. Поэтому при адсорбции на составной микросферолит СаС03 - белок противоположно заряженных полиэлектролитов лишь малая часть их оказывается включенной в объем сферолита. В основном же они располагаются на поверхности образуя пространственно организованную прочную оболочку микрокапсулы.

Число полиэлектролитных слоев 6 7 8 9 10

Толщина внешней оболочки, нм 36,92± 3,28 46,15±2,98 58,43±2,82 66,15+7,67 61,54±3,21

Таблица 1. Значение толщины полиэлектролитной оболочки для микрокапсул, содержащих белок.

Распределение белка во внутреннем объеме такой капсулы возможно в двух вариантах: равномерное распределение белка по всему объему и концентрирование его агрегатов в пристенковом пространстве. Для того чтобы установить это, нами был закапсулирован ферритин - электронноплотный белок, который хорошо виден в электронный микроскоп. Наши исследования показали, что расположение белка внутри микрокапсул зависит от рН. На рис. 7 представлены электронно-микроскопические фотографии ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул, содержащих ферритин при различных рН внешней среды.

- '.- . V .; / Щ: ■

РН4 нз РН2

рН 5 н

Рис. 7. Электронная микроскопия ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул, содержащих ферритин при различных рН внешней среды.

Из рис. 7 видно, что в том случае, когда рН равен 5, что приблизительно

соответствует изоэлектрической точке белка, молекулы протеина располагаются преимущественно вблизи внутренней поверхности оболочки. При смещении рН в кислую область наблюдается равномерное распределение белка по всему объему микрокапсулы. Такое его распределение обусловлено, по-видимому, тем, что молекулы белка, заряженные преимущественно нейтрально в области изоэлектрической точки, хорошо взаимодействуют с внутренней поверхностью оболочки микрокапсулы. В случае же смещения рН в кислую область, молекулы белка заряжаются положительно и отталкиваются от внутреннего полиэлектролитного слоя оболочки, который сформирован из положительно заряженного ПАА.

Таким образом, электронно-микроскопическое исследование иллюстрирует сложную ультраструктурную организацию полиэлектролитных капсул, не содержащих белки, и заполненных ими. Показано, что при использовании в качестве ядра составного сферолита СаС03-белок формируются полиэлектролитные микрокапсулы с оболочкой определенной толщины, ограничивающей объем, с заключенным в него белком.

Изучение методами светорассеяния и оптической микроскопии термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул разных типов

Изучение термочувствительное™ полых полнэлектролитных микрокансул.

На рис. 8 представлены типичные кинетические кривые изменения интенсивности светорассеяния (<3) полых полиэлектролитных микрокапсул, состоящих из чередующихся слоев полиаллиламина (ПАА) и полистиролсульфоната (ПСС). Из рисунка видно, что величина 0 уменьшается во времени и скорость падения 0 увеличивается с ростом температуры. Аналогичный эффект мы наблюдали для микрокапсул с числом полиэлектролитных слоев от 6 до 10.

1,0

температура °С

..........130

.....140

Рис. 8. Типичные кинетические кривые изменения светорассеяния суспензии полых микрокапсул при температурах от 30 °С до 60 °С. Кривые приведены для микрокапсул состава (ПАА/ПСС)4.

0,9

. 0,8

5 0,7

X 0,6

О 0,5

а 04

0,3 0,2

0 2 4

8 10 12

время, мин.

Используемый в нашей работе метод светорассеяния позволяет количественно оценить термочувствительность полиэлектролитных микрокапсул. Для этого мы ввели такую величину, как температурный коэффициент скорости сжатия оболочки (Ес). Так как светорассеяние зависит от диаметра капсулы, то по изменению светорассеяния (см. рис.10) можно охарактеризовать способность капсулы к сжатию. Для измерения Ес мы определяли начальную скорость изменения 0 при каждой заданной температуре и строили зависимость («НЗ/сИ),^ от 1/Т. Величину Ес вычисляли как tg угла наклона прямой, построенной в этих координатах.

Зависимость значений Ес для полых микрокапсул от числа полиэлектролитных слоев представлена на рис. 9. Анализируя эти данные, можно заметить, что значения Ес для микрокапсул, состоящих из четкого, или нечетного числа слоев различно, причем они изменяются чередуясь.

9000

С 6000

со

4500

3000

Рис. 9. Зависимость температурного коэффициента скорости сжатия полых микрокапсул от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

Число слоев

Методом оптической микроскопии нами было исследовано изменение диаметра полых микрокапсул с числом полиэлектролитных слоев от 6 до 10 при их прогреве в течение 20 мин. при 90°С. Зависимость их диаметра после прогрева от числа полиэлектролитных слоев представлена на рис. 10.

5.2

г *

5 4,8

О.

Ё 4,4

§ 4,0 с£

3,6

7 8 9

число слоев

1 Рис. 10. Зависимость диаметра полых ПМК до (пунктирная линия) и после (сплошная линия) их

2 прогрева при 90° С в течение 20 мин. от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

Здесь также наблюдается альтернантное изменение термочувтвительности. Такая альтернантность (чередование) диаметров четных и нечетных капсул может быть объяснена тем, что оболочка микрокапсул с нечетным числом слоев имеет

некоторый избыточный заряд, вследствие чего является более рыхлой, нежели оболочка капсул с четным числом слоев, заряды в которой практически полностью скомпенсированы. Чередование значений Ес полностью согласуется с чередованием значений их диаметров: для большей величины сжатия капсулы (диаметр уменьшается сильнее) требуется большая энергия и наоборот.

Изучение термочувствнтельности полиэлектролитиых микрокапсул, содержащих интерполиэлектролитные комплексы.

Вторым типом микрокапсул, для которых исследовали их

термочувствительность, были капсулы, полученные на пористых микросферолитах карбоната кальция и, соответственно, содержащие внутри интерполиэлектролитные комплексы. Для капсул, содержащих полиэлектролиты, также как и для полых микрокапсул, и величина диаметра (рис. 11) и температурный коэффициент скорости сжатия Ес (рис.12) изменяются, чередуясь, в зависимости от четности или нечетности полиэлектролитных слоев.

Различие состоит в том, что у полых капсул их диаметры для четного числа полиэлектролитных слоев больше, чем для нечетного, а у микрокапсул с полиэлектролитами внутри все наоборот - четные капсулы сжимаются при прогреве сильнее, чем нечетные. Эти зависимости для заполненных полиэлекиролитами микрокапсул риведены на рис. И и 12 соответственно.

Рис. 11. Зависимость диаметра ПМК, заполненных интерполиэлектролитными

комплексами, до (1) и после (2) их прогрева при 90° С в течение 20 мин. от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

Рис. 12. Зависимость температурного коэффициента скорости сжатия микрокапсул, заполненных интерполиэлектролитными

комплексами, от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

■ 1

6 7 8 9 10

число слоев

Число слоев

Данное различие, по-видимому, может быть обусловлено тем, что находящиеся внутри капсул полиэлектролиты с ростом температуры могут дополнительно связываться с внутренней приповерхностной частью фрагментарной оболочки микрокапсулы и изменять ее структутру, добавляя еще один полиэлектролитный слой.

Изучение термочувствителыюстц ПМК, содержащих белки

Третьим типом полиэлектролитных микрокапсул, для которых исследовалась их термочувствительность, были микрокапсулы, содержащие внутри белки -сывороточный альбумин и гемоглобин быка. Изучение термочувствительности таких капсул проводилось в двух направлениях. Во-первых, рассматривалось их температурное поведение в зависимости от состояния и количества инкапсулированного белка и, во-вторых, - от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

Нами были получены полиэлектролитные микрокапсулы с одинаковой оболочкой, имеющей 6 полимерных слоев, но содержащие разное количество гемоглобина: 25, 40, 58, 95 и 125 пикограмм на капсулу (пкг/капс.). Данные по зависимости температурного коэффициента скорости сжатия Ес гемоглобиновой полиэлектролитной микрокапсулы от количества в ней белка приведены в табл.2.

Количество белка, пг/капс 125 95 58 40 25

Ес * 103 кал/капс 5,1+0,59 4,6 ± 0,52 2,1+0,61 3,8 ±0,58 6,8 + 0,64

Таблица 2. Значения температурного коэффициента скорости сжатия оболочки для микрокапсул с разным количеством включенного в них гемоглобина.

Из данных табл. 2 видно, что с уменьшением количества белка в капсуле Ес

вначале падает, но по достижении определенной величины включенного белка

начинает расти. Падение Ес можно объяснить уменьшением количества белка

непосредственно контактирующего с оболочкой, а, следовательно, и ослаблением его

влияния на состояние оболочки. Доля белка непосредственно взаимодействующего с

полиэлектролитной оболочкой пропорциональна его количеству в капсуле. Чем

больше белка связано с приповерхностным слоем оболочки, тем сильнее эффект его

влияния на взаимодействие «полиэлектролит-полиэлектролит», тем рыхлее и лабильнее оболочка. Причиной же возрастания Ес при малом содержании белка в капсуле является пористость микросферолита СаС03 обуславливающая, как отмечали выше, включение полиэлектролитов внутрь капсулы при ее формировании. Свойства капсул, содержащих малое количество белка, такие же, как и у капсул второго типа.

На способность оболочки к сжатию можно влиять не только варьируя количество белка в капсуле, но и изменяя его конформационное состояние.

Для исследования термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул в зависимости от состояния инкапсулированного белка нами были получены и проанализированы кинетические кривые изменения светорассеяния шестислойных капсул, содержащих внутри БСА при различных значениях рН: 5, 4, 3 и 2. При всех значениях рН светорассеяние падало, но с различной скоростью. Было выявлено, что переход от рН 5 до рН 3 приводит лишь к незначительному уменьшению значений температурного коэффициента скорости сжатия, а дальнейшее уменьшение рН до 2 приводит к резкому ее падению. В табл. 3 представлены данные по изменению Ес й шестислойной ПЭ микрокапсулы, содержащей БСА, от рН среды.

рН 5 4 3 2

Ес * Ю-3 5,62 ±0,87 5,05 ± 0,92 4,50 ± 0,96 2,60 + 0,84

кал/капс

Таблица 3. Значения температурного коэффициента скорости сжатия оболочки для микрокапсул с включенным в них бычьим сывороточным альбумином в зависимости от рН среды.

рН-зависимость величины Ес можно объяснить следующим образом. Известно, что сывороточный альбумин в зависимости от кислотности среды существует в нескольких конформационных состояниях [ Нямаа Д. и др. Молекулярная Биология. 1985. 19 (3). 833]. Нативная форма белка в виде компактной глобулы N при смещении рН в кислую область переходит вначале в отличающиеся по структуре и свойствам компактные глобулы ?! и Е2, а затем при значительном подкислении - в состояние расплавленной «разбухшей» глобулы Бз. Переход N -> Р| -> Р2 происходит в интервале рН 5-3. Как видно из табл. 3, такой переход сопровождается понижением сжимаемости полиэлектролитной оболочки Ес от 0,0056 до 0,0045 кал/капс., свидетельствуя об уменьшении количества белка связанного с оболочкой. Это

вызвано протонированием карбоксильных групп и соответствующим увеличением положительного заряда на молекуле белка. Поскольку первым слоем оболочки, определяющим ее приповерхностную область, является поликатион ПАА, то естественно, что количество связанного с оболочкой белка будет меньше в результате электростатического отталкивания. При подкислении до рН 2 величина положительного заряда на белке возрастает настолько, что связывание его с оболочкой становится невозможным и полиэлектролитная белковая капсула ведет себя аналогично полой. Аналогия в поведении заполненной белком и полой капсулы наблюдается и при изучении их термочувствительное™ в зависимости от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

Следующим шагом в изучении термочувствительности содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул было определение методом оптической микроскопии изменения их диаметров. При измерении диаметров микрокапсул, состоящих из четного или нечетного числа полиэлектролитных слоев, нами было установлено, что для них также характерно альтернантное изменение диаметров после прогрева при 90 °С в течение 20 мин. При этом также, как и для полых, в заполненных белком капсулах, по крайней мере, для исследуемого нами числа слоев от 6 до 10, для нечетного слоя уменьшение диаметра при тепловом воздействии существенно больше, чем для четного. Данная зависимость диаметров капсул от числа полиэлектролитных слоев оболочки представлена на рис. 13.

3,9

5 3,6 ^

2 3,3 о.

I 3,0 га

^ 2,7 2,4

А 2

Рис. 13. Зависимость диаметра полиэлектролитных микрокапсул,

содержащих БСА, до (1) и после (2) их прогрева при 90 °С в течение 20 мин. от числа полиэлектролитных слоев оболочки.

7 8 9

число слоев

Сходство в поведении полых и заполненных БСА микрокапсул может быть объяснено тем, что в случае наслаивания оболочки на составном микросферолите СаСОз - белок, она образуется даже при шести полиэлектролитных слоях, что во многом определяет поведение микрокапсул при повышенной температуре. Этот результат имеет не только фундаментальное, но и практическое значение в связи с

нахождением оптимальных режимов для полиэлектролитного капсулирования и декапсулирования белковых систем.

Разработка полиэлектролитного ферментного микродиагностикума с регистрацией его работы по изменению скорости осаждения микрокапсул.

В работе предпринята попытка разработки нового типа диагностикума, который будет изготавливаться на основе мультислойных полиэлектролитных микрокапсул, содержащих ферменты. Этот диагностикум предназначен для обнаружения и количественного анализа низкомолекулярных веществ в различных водных средах, в том числе. В предлагаемом нами микродиагностикуме сенсором служит полиэлектролитная микрокапсула, содержащая фермент, субстратом которого является один из компонентов анализируемой среды, легко проницаемый через оболочку капсулы.

Для решения поставленной задачи были получены полиэлектролитные капсулы с включенной в них уреазой, сформированные на составных сферолитах СаС03 - уреаза методом последовательной адсорбции ПСС и ПАА. Были исследованы капсулы, содержащих различное число полиэлектролитных слоев: (ПСС/ПАА)з/ПСС; (ПСС/ПААУПСС и (ПСС/ПАА)3/ПСС.

Известно, что в растворе уреаза катализирует разложение мочевины на С032~ и

Ш4+:

уреаза

СО(>Ш2)2 -" С032 + ЫН4+.

Присутствие в растворе катионов двухвалентных металлов, например Са2+ или Ва2+, приводит к образованию нерастворимого карбоната:

Ме2++ С032 -► МеС031

Если же уреаза находится в полиэлектролитных капсулах, то каталитическое разложение мочевины и образование карбоната будет происходить непосредственно внутри капсул. Взаимодействие образующегося карбонат - аниона с катионом металла из окружающего раствора приводит к образованию осадка МеС03. Схематически этот процесс представлен на рис. 14.

Са'

уреаэа СО(ЫНг);

Рис. 14. Схема катализируемого уреазой синтеза СаС03 внутри полиэлектролитных

Поскольку полиэлектролитные оболочки капсул хорошо проницаемы для

низкомолекулярных соединений, то необходимо, чтобы концентрация катионов металлов внутри капсулы была высокой, что приведет к полному связыванию карбоната внутри капсулы и не позволит ему выйти сквозь оболочку наружу и образовать осадок в растворе.

Капсулы с титром 2*107 помещали в раствор хлорида бария с концентрацией 1 моль/л на 15 минут. После насыщения капсул ионами Ва2+ к ним добавляли мочевину в различных концентрациях. Смесь инкубировали в течение 30 минут при температуре 25°С. Затем суспензию капсул центрифугировали при 3000 об/мин., супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в трис - НС1 с рН 6.2. Далее полученную дисперсную систему анализировали по скорости осаждения микрокапсул, заполненных карбонатом бария, фиксируя изменение оптической плотности от времени на X = 400 нм. На рис. 15 приведена зависимость скорости оседания содержащих уреазу полиэлектролитных микрокапсул от концентрации мочевины через 5 минут от начала их осаждения.

капсул.

0,12 I 0,10

0,08

осаждения полиэлектролитных

Рис. 15. Зависимость скорости

-о

микрокапсул от концентрации

S 0,02 О

мочевины.

0 1 2 3 4 5

Концентрация мочевины, мг/мл

Линейный характер этой зависимости позволяет рассматривать ее в качестве калибровочной кривой для проведения измерений в растворе, содержащем мочевину.

Подбор условий оптимальной работы диагностикума.

Разработка микродиагностикума включала подбор:Иона - осадителя и его концентрации.

2. Оптимального числа полиэлектролитных слоев оболочки микрокапсул.

3. Количества микрокапсул, оптимального для работы микродиагностикума.

В качестве иона - осадителя нами был выбран Ва2+ с концентрацией 1 моль/л. Главное его преимущество перед ионам кальция заключается в том, что он имеет больший молекулярный вес, что приводит к более быстрому оседанию микрокапсул и, как, следствие, ускорению проведения анализа.

Для выбора оптимального числа полиэлектролитных слоев оболочки микрокапсул нами была проведена работа по определению активности инкапсулированной урезы при различном числе слоев оболочки.

Было установлено, что наиболее активным является фермент, заключенный в семислойную оболочку. С ростом числа полиэлектролитных слоев его активность несколько снижается вплоть до И слоев. При переходе к 13 слоям активность резко падает, что можно связать с плохой проницаемостью такой оболочки для субстрата. В итоге для создания микродиагностикума нами были выбраны девятислойные микрокапсулы, поскольку у имеющих несколько большую активность семислойных капсул, оболочка является недостаточно упорядоченной и регулярной, что может приводить к потерям инкапсулированного фермента.

Оптимальный для функционирования микродиагностикума титр микрокапсул -это 2* 107 - 107 штук/мл. Меньшее количество капсул приводит к недостаточной разнице в скоростях их осаждения при разных концентрациях мочевины в растворе.

Повторное использование микродиагностикума.

Возможность повторного использования содержащих уреазу полиэлектролитных микрокапсул для анализа мочевины в различных жидкостях - это одно из преимуществ разработанного нами микродиагностикума. Для того, чтобы продемонстрировать возможность повторного использования

микродиагностикума, нами были взяты содержащие уреазу одиннадцатислойные полиэлектролитные микрокапсулы, с которыми была проделана описанная выше

процедура, приводящая к построению представлена на рис. 16.

0 1 2 3 4 5 6 Концентрация мочевины, мг/мл

градуировочной кривой. Эта кривая

Рис. 16. Зависимость скорости осаждения одиннадцатислойных полиэлектролитных микрокапсул от концентрации мочевины.

После построения данной кривой микрокапсулы были выделены из раствора с помощью центрифугирования и помещены на 12 часов в 0,2 М раствор ЭДТА для растворения образовавшегося в них карбоната бария. Далее микрокапсулы были троекратно отмыты водой и повторно использованы для построения градуировочного графика. Результаты данного эксперимента приведены на рис. 17.

I 0,06

ч-Г 0,04 "О

I 0,02

О о

2. о,оо а

■С

0 1 2 3 4 5 6

Концентрация мочевины, мг/мл

Рис. 17. Зависимость скорости оседания одиннадцаислойных микрокапсул от концентрации мочевины при повторном использовании микродиагностикума.

Линейный характер этой кривой позволяет сделать вывод о возможности повторного использования содержащих уреазу полиэлектролитных микролкапсул в качестве микродиагностикума.

Выводы

1. Получены полиэлектролитные микрокапсулы различных типов: полые, содержащие интерполиэлектролитные комплексы, белки и ферменты. Установлены оптимальные условия включения ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы; произведен подбор противоположно заряженной пары полиэлектролитов, которая оптимальна для функционирования инкапсулированного фермента.

2. Исследована ультраструктурная организация содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул. Показано, что микрокапсулы, сформированные на микроеферолитах СаС03, имеют 2 подсистемы: внутреннюю «матриксную» и внешнюю оболочку. Установлено распределение белка внутри микрокапсул в зависимости от рН среды.

3. Показано, что полиэлектролитные микрокапсулы с ростом температуры и длительности теплового воздействия сжимаются, их диаметр уменьшается. Обнаружено, что для исследованных микрокапсул характерно явление альтернантности (чередования) термочувствительности в зависимости от числа слоев оболочки. Исследована зависимость термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белок от количества и степени его ионизации.4. Разработан и запатентован полиэлектролитный ферментный микродиагностикум с регистрацией его работы по изменению скорости седиментации микрокапсул. Подобраны оптимальные условия его функционирования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Дубровский А.В., Шабарчина Л.И., Ким Ю.А., Сухоруков Б.И. Влияние температуры на полиэлектролитные микрокапсулы: светорассеяние и конфокальная микроскопия. Журнал Физической Химии, 2006, т.80, N10, с.1914-1919.

2. A.V.Dubrovsky, Y.A.Kim, L.I.Shabarchina, B.I.Sukhorukov. Investigation of the Influence of Temperatureon Polyelectrolyte Microcapsules. Glass Physics and Chemistry, 2007, Vol. 33, No. 3, pp. 226-231.

3. S.A. Tikhonenko, E.A. Saburova, A.V. Dubrovsky, L.I. Shabarchina, Ju.N. Dybovskaja, B.I. Sukhorukov. Methodology of inclusion of enzymes in polyelectrolyte nano- and microcapsules on example of lactate dehydrogenase. Glass Physics and Chemistry, 2007, Vol. 33, No. 3, pp. 287-293.

4. Казакова Л.И., Дубровский A.B., Мошков Д.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Электронно-микроскопическое исследование струцктуры полиэлектролитных микрокапсул, содержащих и не содержащих белок. Биофизика, 2007, т.52, вып.5.,

с.855-860.

5. Б.И. Сухоруков, С.А. Тихоненко, Е.А. Сабурова, А.В. Дубровский, Ю.Н.

Дыбовская, Л.И. Шабарчина. Инкапсулирование фрментов в полиэлектролитные нано- и микрокапсулы в связи с проблемой микродиагностикума. Биофизика, 2007, т.52, вып.6, с.1041-1048.

6. Дубровский А.В., Казакова Л.И., Гужвина Д.В., Шабарчина Л.И., Сухорукое Б.И. Структура и свойства полиэлектролитных нано- и микрокапсул, содержащих транспортные белки крови. Альманах клинической медицины, т. XVII, ч. 2, с. 325328.

7. Сухоруков Б.И., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Дубровский А.В., Стаменов М.Н., Шабарчина Л.И. Получение полиэленктролитного ферментного микродиагностикума методами нанотехнологии и его применение в клинико-биохимическом анализе. Альманах клинической медицины, т. XVII, ч. 2, с. 371-373.

8. Гужвина Д.В., Дубровский А.В., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Исследование влияния температуры на полиэлекиролитные микрокапсулы, содержащие и не содержащие белки. Биофизика, 2010, т.55, вып.1, с. 54-61.

Патенты

1. Б.И. Сухоруков, Е.А. Сабурова, Л.И. Шабарчина, А.В. Дубровский, С.А. Тихоненко. Микродиагностикум и способ ферментативного определения концентрации анализируемого вещества. N20061 34125/15(037115), 23.05.2007.

2. Сухоруков Б.И., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И., Дубровский А.В., Тихоненко С.А. Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул. Заявка N20071 35518/15(038833). Решение о выдаче патента на изобретение от 06.04.2009.

Тезисы

1. Горячева Ю.А., Дубровский А.В. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С НЕЙТРОФИЛАМИ. Труды конф. «Биология - наука XXI века», 2005 Пущино, с. 115.

2. Дубровский А. В., Шабарчина Л. И., Ким Ю. А., Сухоруков Б. И. Изучение термочувствительности полых полиэлектролитных нано- и микрокапсул, содержащих четное и нечетное число слоев. Труды конф. «Биология - наука XXI века», 2006, Пущино, с. 111.

3. A.V.Dubrovsky, Y.A.Kim, L.I.Shabarchina, B.I.Sukhorukov. Difference in thermosensitivity of hollow polyelectrolyte nano- and microcapsules consisting of even or odd number of layers. Abstr. "Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposytes", 2006, St.-Peterburg, p. 167.

4. A.V.Dubrovsky, Y.A.Kim, L.I.Shabarchina, B.I.Sukhorukov. Studying of structural and dynamical properties of polyelectrolyte nano- and microcapsules and receiving of their confocal images with amphifil fluorescent probe. Abstr. "Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposytes", 2006, St.-Peterburg, p. 168.

5. S.A. Tikhonenko, E.A. Saburova, A.V. Dubrovsky, L.l. Shabarchina, Ju.N. Dybovskaja, B.I. Sukhorukov. Methodology of inclusion of enzymes in polyelectrolyte nano- and microcapsules on example of lactate dehydrogenase. Abstr. "Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposytes", 2006, St.-Peterburg, p. 169.

6. Тихоненко C.A., Дубровский A.B., Сабурова E.A, Шабарчина Л.И., Дыбовская Ю.Н.,Сухоруков Б.И. Включение лактатдегидрогеназы в полиэлектролитные микрокапсулы. Международная научная конференция студентов, аспирантов и

молодых ученых, «Ломоносов 2006».

7. Дубровский А.В., Мошков Д.А., Казакова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухорукое Б.И. Изучение интерполиэлектролитных комплексов в составе микрокапсул, содержащих белки, методом электронной микроскопии. Труды 1ой региональной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)», 2006, Иваново.

8. Гужвина Д.В., Дубровский А.В., Шабарчина Л.И., Сухорукое Б.И. Термочувствительность мультислойных полиэлектролитных микрокапсул: зависимость от природы «коровой» микрочастицы. - Труды Межд.конф. «Современные проблемы науки о полимерах», С-Петербург, 2007, с.232.

9. Дубровский А.В., Мошков Д.А., Казакова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Исследование ультраструктурной организации содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул методом электронной микроскопии. Труды Межд. конф. «Современные проблемы науки о полимерах», С-Петербург, 2007, с 72.

10. Тихоненко С.А., Дубровский А.В., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Полиэлектролитные ферментные микрокапсулы, получение, изучение свойств и применение. Труды Межд.конф. «Современные проблемы науки о полимерах», С-Петербург, 2007, с 99.

11. Тихоненко С.А., Дубровский А.В., Дыбовская Ю.Н. Сравнительное исследование каталитических характеристик и стабильности уреазы в свободном состоянии и включенной в полиэлектролитну микрокапсулу. - Труды Межд. конф. «Биология наука XXI века», Пущино, 2007, с.197-198.

12. Shabarchina L.I., Dubrovsky A.V., Tikhonenko S.A., Saburova E.A, Sukhorukov B.I. Design of Enzyme-containing Polyelectrolyte Nano- and Microcapsules and Creation of Microdiagnosticum. Materials of the Fourth Intern.Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007, p.228-229.

13. Guzhvina D.V., Dubrovsky A.V., Shabarchina L.I., Sukhorukov B.I. Thermal Sensitivity of Polyelectrolyte Nano- and Microcapsules. Materials of the Fourth Intern. Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007, p. 188-190.

14. Dubrovsky A.V., Kazakova L.I.,Moshkov D.A., Shabarchina L.I., Sukhorukov B.I. Ultrastructural Organization of Polyelectrolyte Microcapsules with and without Protein. Materials of the Fourth Intern.Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007, p.178-181.

15. Sukhorukov B.I., Saburova E.A, Tikhonenko S.A., Dubrovsky A.V., Shabarchina L.I.Polyelectrolyte Enzyme-bearing Nano- and Microdiagnosticum and its Properties. Materials of the Fourth Intern.Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007, p.233-234.

16. Дубровский А.В., Мошков Д.А., Гужвина Д.В., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Изучение структурной организации и термочувствителыюсти полиэлектролитных нано- и микрокапсул, полых и содержащих интерполиэлектролитные комплексы и белки. Труды Международного форума по нанотехнологиям, 2008, Москва.

17. Дубровский А.В. Термочувствительность полиэлектролитных микрокапсул. Труды Конкурса работ молодых ученых ИТЭБ РАН, 2009, Пущино.

Подписано в печать:

11.10.2010

Заказ № 4272 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубровский, Алексей Владимирович

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Формирование и свойства полиэлектролитных пленок, полученных методом последовательной адсорбции полиэлектролитов на плоских подложках.

2.2. Принципы послойной электростатической самосборки.

2.3. Рост слоев: условия и кинетика.

2.4. Структура и свойства мультислоев.

2.5. Использованные материалы.

2.6. Использованные субстраты.

2.7. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции полиэлектролитов.

2.7.1. Формирование полиэлектролитных оболочек на поверхности коллоидных частиц.

2.7.2. Образование полых полиэлектролитных микрокапсул.

2.7.3. Некоторые физико-химические свойства полых полиэлектролитных микрокапсул.

2.8. Включение макромолекулярных соединений в полиэлектролитные микрочастицы/капсулы с применением метода последовательной адсорбции.

2.8.1. Мультислои макромолекул на поверхности коллоидных микрочастиц.

2.8.2. Включение макромолекул в полиэлектролитных микрокапсул путем изменения проницаемости их оболочки.

2.8.3. Покрытие кристаллов или агрегатов белков полиэлектролитной оболочкой.

2.8.4. Метод, основанный на преципитации вещества на поверхности коллоидной матрицы.

2.9. Кристаллизация карбоната кальция.

2.10. Образование пористых частиц из карбоната кальция.

3."Материалы и методы.32'

3.1. Материалы и реактивы.

3.2. Латексные микрочастицы как «ядра» для ПМК.

3.3. Получение микросферолитов СаСОз.

3.4. Получение составных микросферолитов СаСОз - белок.

3.5. Формирование мультислойных полиэлектролитных микрокапсул на латексных микрочастицах.

3.6. Формирование мультислойных полиэлектролитных микрокапсул на простых и составных микросферолитах СаСОз.

3.7. Трансмиссионная электронная микроскопия.

3.8. Малоугловое светорассеяние.

3.9. Определение ферментативной активности уреазы.

3.10. Определение ферментативной активности лактатдегидрогеназы.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Получение полиэлектролитных микрокапсул различных типов.

4.1.1. Формирование полых ПМК с использованием в качестве «ядер» латексных микрочастиц.

4.1.2. Формирование мультислойных полиэлектролитных микрокапсул на микросферолитах СаСОз.

4.1.3. Получение полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки и ферменты.

4.2. Исследование ультраструктурной организации полиэлектролитных микрокапсул .44 4.2.1. Исследование внутренней ультраструктурной организации полых полиэлектролитных микрокапсул.

4.2.2. Исследование внутренней ультраструктурной организации полиэлектролитных микрокапсул, содержащих интерполиэлектролитные комплексы и белки.

4.3. Изучение методами светорассеяния и оптической микроскопии термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул разных типов.

4.3.1. Изучение термочувствительности полых полиэлектролитных микрокапсул,

4.3.2. Изучение термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул, содержащих интерполиэлектролитные комплексы.

4.3.3. Изучение термочувствительности полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки.

4.4. Разработка полиэлектролитного ферментного микродиагностикума с регистрацией его работы по изменению скорости осаждения микрокапсул.

4.4.1. Подбор условий оптимальной работы диагностикума.

4.4.2. Повторное использование микродиагностикума.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки"

Создание новых материалов является одной из движущих сил для развития как фундаментального знания, так и промышленности. Полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК), изготавливаемые методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микро размеров с последующим разрушением и удалением этих частиц, являются объектами новой быстро развивающийся области — полимерной нанотехнологии [1-5].

Полученные к настоящему времени результаты демонстрируют широкие возможности использования ПНМК при разработке нового класса химических и биохимических реакторов и изучения особенностей протекания физических и химических процессов в малом объеме, при создании нового типа зондов и высокочувствительных сенсоров и разработке оригинальных методов разделения смесей различных органических и неорганических веществ, в частности, выделения из среды ионов тяжелых металлов [510]. Впечатляющими являются результаты по использованию ПНМК в качестве матриц для получения металлических полупроницаемых оболочек с магнитными и проводящими свойствами [11-14]. Наряду с такими работами, имеющими ярко выраженную техническую направленность, в настоящее время ряд исследователей- ведут активную разработку ПНМК применительно к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия с управляемой доставкой [15-20]. ПНМК в этом случае используются как контейнер для транспортировки лекарственного вещества, а сама капсула изготавливается из биоразрушаемых полимеров. Скорость выхода лекарственного вещества из нее помимо природы и числа полиэлектролитных слоев оболочки будет определяться, с одной стороны, скоростью деградации оболочки под воздействием ферментов организма, с другой - такими* факторами, как рН, солевой состав1 среды и, что особенно важно, температурой.

Применение микрокапсул в биомедицине позволяет реализовать ряд важных возможностей капсулирования, таких как защита биологически активных веществ (БАВ) от окисления под воздействием внешней среды, обеспечение пролонгированного и/или контролируемого выхода БАВ, придание микрокапсулированным продуктам новых физических свойств.

В последнее время ПНМК находят свое применение при разработке нового класса диагностических средств - полиэлектролитных ферментных микродиагностикумов (ПФМ), т.е. средства микро- и наноразмерной величины, позволяющего распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества как в нативных биологических жидкостях, так и в сточных водах [21]. Такой микродиагностикум представляет собой ансамбль полиэлектролитных микрокапсул с включенным в них ферментом, оболочки которых состоят из чередующихся слоев поликатиона и полианиона, содержащих гидрофобный остов. Благодаря полупроницаемости оболочки микрокапсула с включенным ферментом, помещенная в многокомпонентную среду, становится анализатором в ней низкомолекулярных веществ - субстратов, ингибиторов или активаторов инкапсулированного фермента. Использование такого фермента по сравнению со «свободным» в клинико-биохимическом анализе имеет неоспоримые преимущества. Они связаны в первую очередь с высокой стабильностью инкапсулированного фермента и возможностью его многократного использования.

Для успешного создания таких микродиагностикумов необходимы широкие знания о структуре и свойствах их основных компонентов — полиэлектролитных микрокапсул. Так, например, если при создании пролонгированных лекарственных средств оболочку капсулы делают из биодеградабельных полиэлектролитов, то условиями для функционально-активного микродиагностикума являются небиодеградабельность оболочки и ее термостабильность. Они обеспечиваются, в частности, такой противоположно - заряженной парой полиэлектролитов как полиаллиламин (ПАА) и полистиролсульфонат (ПСС).

Целью данной работы было изучение структуры и термочувствительности содержащих белки полиэлектролитных микрокапсул, а так же создание на их основе нового, уникального типа микродиагностикума, с регистрацией его работы по изменению седиментационных характеристик микрокапсул.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить полиэлектролитные микрокапсулы трех типов: полые, содержащие интерполиэлектролитные комплексы и белки. Установить оптимальные условия включения ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы.

2. Изучить ультраструктурную организацию содержащих и не содержащих белки полиэлектролитных микрокапсул.

3. Исследовать влияние температуры на полые и заполненные полиэлектролитные микрокапсулы.

2. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дубровский, Алексей Владимирович

5. Выводы

2. • Исследована ультраструктурная организация содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул. Показано, что микрокапсулы, сформированные на микросферолитах СаСОз, имеют 2 подсистемы: внутреннюю «матриксную» и внешнюю оболочку. Установлено распределение белка внутри микрокапсул в зависимости от рН среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубровский, Алексей Владимирович, Пущино

1. Sukhorukov G.B., Donath Е., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.I. and Mohwald H.

2. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: a novel approach to colloid design. Polym. Adv. Technol., 1998, v. 9(10-11), p. 759-767.

3. Donath E., Sukhorukov G.B., Caruso F., Davis S.A. and Mohwald H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed., 1998, v. 37(16), p. 2202-2205.

4. Andreeva D.V., Gorin D.A., Mohwald H., Sukhorukov G.B. Novel type of self-assembled polyamide and polyimide nanoengineered shells—fabrication of microcontainers with shielding properties. Langmuir. 2007 v. 23(17), p. 9031-9036.

5. Shchukin D.G., Ustinovich E., Sviridov D.V., Lvov Y.M., Sukhorukov G.B. Photo catalytic microreactors based on Ti02-modified polyelectrolyte multilayer capsules. Photochemical & Photobiological Science. 2003. v. 2. (10). p. 975-977.

6. Mohwald H., Donath E. and Sukhorukov G. B. In book: Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials (Ed. By G. Decher and J. B. Schlenoff). Wiley-VCH. 2002. p. 363-392.

7. Voigt A., Buske N., Sukhorukov G.B., Antypov A.A., Leporatti S., Lichtenfeld H., Baumer H., Donath E. Novel polyelectrolyte multilayer micro- and nanocapsules as magnetic carriers. J. Magnetism and Magnetic Materials. 2001. v. 225. p. 59-66.

8. Shchukin D.G., Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B. Synthesis of nanosized magnetic ferrite particles inside hollow polyelectrolyte capsules. J. Phys. Chem. B. 2003. v. 107. p. 86-90.

9. Ященок A.M., Иноземцева О.А., Горин Д.А., Нанокомпозитные микрокапсулы, содержащие наночастицы коллоидного золота и магнетита: формирование и характеризация. Российские нанотехнологии. 2009 т. 4 (5-6). с. 85-88.

10. Grigoriev D, Gorin D, Sukhorukov GB, Yashchenok A, Maltseva E, Mohwald H. Polyelectrolyte/magnetite nanoparticle multilayers: preparation and structure characterization. Langmuir. 2007. v. 23 (24). p. 12388-12396.

11. Antipov A. A., Sukhorukov G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 2004. v. Ill (1-2). p. 49-61.

12. Ai H., Jones S.A. and Lvov Y.M. Biomedical Applications of electrostatic Layer-by-Layer nano-assembly of polymers, enzymes, and nanoparticles. Cell Biochem. Biophys. 2003. v. 39. p. 23-43.i

13. Reibetanz U., Claus C., Typlt E., Hofmann J., Donath E. Defoliation and plasmid delivery with Layer-by-Layer coated colloids. Macromolecular Bioscience. 2006. v. 6. p. 153-160.

14. Bedard M.F., De Geest B.G., Skirtach A.G., MShwald H., Sukhorukov G.B. Polymeric microcapsules with light responsive properties for encapsulation and release. Adv Colloid Interface Sci. 2009 Epub.

15. Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Куиижев C.M., Сухоруков Г.Б., Ворожцов Г.Н., Фельдман Б.М., Марквичева Е.А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки-биологически активных веществ. Биомедицинская химия. 2007. т. 53 (5). с. 557-565.

16. Her R.K. Multilayers of colloidal particles. J. Colloid Interface Sci. 1966. v. 21 (6). p. 569575.

17. Lee H., Kepley L.J., Hong H.G., Akhter S. and Mallouk Т.Е. Adsorption of ordered zirconium phosphonate multilayer films on silicon and gold surfaces. J. Phys. Chem. 1988 v. 92 (9). p. 2597-2601.

18. Decher G. and Hong J.D, Buildup of ultrathin multilayer films by a self- assembly process. 1. Consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles on charged surfaces. Makromol. Chem. Macromol. Symp. 1991. v. 46. p. 321-327.

19. Decher G., Hong J.D. and Schmitt J. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process. 3. Alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces. Thin Solid Films, 1992. v. 210(1-2). p. 831-835.

20. Stockton W.B. and Rubner M.F. Molecular-level processing of conjugated polymers .4. Layer-by- layer manipulation of polyaniline via hydrogen-bonding nteractions. Macromolecules. 1997. v. 30(9). p. 2717-2725.

21. Kotov N.A. Layer-by-layer self-assembly: The contribution of hydrophobic interactions. Nanostruct. Mater. 1999. v. 12(5-8). p. 789-796.

22. Sukhishvili S.A. and Granick S. Layered erasable polymer multilayers formed by hydrogen-bonded sequential self-assembly. Macromolecules, 2002. v. 35 (1). p. 301-310.

23. Netz R. and Andelman D. Polyelectrolytes in Solution and at Surfaces, in Encyclopedia^ of Electrochemistry. E. Giladi Editor. 2002. Wiley-VCH: Weinheim.

24. Michaels A.S., Polyelectrolyte Complexes. Industrial and Engineering Chemistry. 1965. v. 57 (10). p. 32-35.

25. Michaels A.S., Mir L., and Schneide N. A Conductometric Study of Polycation-Polyanion Reactions in Dilute Aqueous Solution. Journal of Physical Chemistry, 1965. v. 69 (5). p. 14471451.

26. Dubas S.T. and Schlenoff J.B. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid: Construction and deconstruction. Macromolecules. 2001. v. 34 (11). p. 3736-3740.

27. Zezin A.B. and Rogacheva V.B. Polyelectrolyte Complexes. In Uspechi Himii i Fiziki Polimerov, G.L. Slonimsky, Editor. 1973, Himija: Moscow, p. 3-30.

28. Israelachvili J. Intermolecular and Surface Forces. 2 ed. 1992, San Diego: Academic Press.

29. Arys X., Jonas A.M., Laguitton B., Laschewsky A., Legras R. and Wischerhoff E., Ultrathin multilayers made by alternate deposition of ionenes and polyvinylsulfate: from unstable to stable growth. Thin Solid Films, 1998. v. 329. p. 734-738.

30. Dubas S.T. and Schlenoff J.B., Factors controlling the growth of polyelectrolyte multilayers. Macromolecules. 1999. v. 32 (24). p. 8153-8160.

31. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M.; Budde N. and Mohwald H. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles. Colloid.

32. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects. 1998. v. 137 (1-2). p. 253-266.

33. Yoo D., Shiratori S.S., and Rubner M.F. Controlling bilayer composition and surface wettability of sequentially adsorbed multilayers of weak polyelectrolytes. Macromolecules. 1998. v. 31 (13). p. 4309-4318.

34. Losche M., Schmitt J., Decher G., Bouwman W.G. and Kjaer K. Detailed structure of molecularly thin polyelectrolyte multilayer films on solid substrates as revealed by neutron reflectometry. Macromolecules. 1998. v. 31 (25). p. 8893-8906.

35. Schmitt J., Grunewald T., Decher G., Pershan P.S., Kjaer K. and Losche M. Internal Structure of Layer-by-Layer Adsorbed Polyelectrolyte Films a Neutron and X-Ray Reflectivity Study. Macromolecules. 1993. v. 26 (25). p. 7058-7063.

36. Fendler J.H. Self-assembled nanostructured materials. Chemistry of Materials. 1996. v. 8 (8). p. 1616-1624.t

37. Kotov N.A., Dekany I. and Fendler J.H. Ultrathin graphite oxide-polyelectrolyte composites prepared1 by self-assembly: Transition between conductive and non-conductive states. Advanced Materials. 1996. v. 8 (8). p. 637-641.

38. Laschewsky A., Mayer B., Wischerhoff E., Arys X. and Jonas A. Polyelectrolyte complexes at interfaces. Berichte Der Bunsen-Gesellschaft-Physical Chemistry Chemical Physics, 1996. v. 100 (6). p. 1033-1038:

39. Fischer P., Laschewsky A., Wischerhoff E., Arys X., Jonas A. and Legras R. Polyelectrolytes bearing azobenzenes for the functionalization of multilayers. Macromolecular Symposia. 1999. v. 137. p. 1-24.

40. Hoogeveen N.G., Stuart M.A.C., Fleer G.J. and Bohmer M.R. Formation and stability of multilayers of polyelectrolytes. Langmuir. 1996. v. 12 (15). p. 3675-3681.

41. Schlenoff J.B., Ly H., and Li M. Charge and mass balance in polyelectrolyte multilayers. Journal of the American Chemical Society. 1998. v. 120 (30). p. 7626-7634.

42. Hsieh M.C., Farris R.J. and McCarthy T.J. Surface "priming" for layer-by-layer deposition: Polyelectrolyte multilayer formation on allylamine plasma- modified poly(tetrafluoroethylene). Macromolecules. 1997. v. 30 (26). p. 8453-8458.

43. Caruso F. and Mohwald H. Protein multilayer formation on colloids through a stepwise self-assembly technique. Journal of the American Chemical Society. 1999. v. 121 (25). p. 60396046.

44. Okubo T. and Suda M. Absorption of polyelectrolytes on colloidal surfaces as studied by electrophoretic and dynamic light-scattering techniques. Journal of Colloid and Interface Science. 1999. v. 213 (2). p. 565-571.

45. VonKlitzing R. and Mohwald H., A realistic diffusion model for ultrathin polyelectrolyte films. Macromolecules. 1996. v. 29 (21). p. 6901-6906.

46. VonKlitzing R. and Mohwald H. Transport through ultrathin polyelectrolyte films. Thin Solid Films. 1996. v. 285. p. 352-356.

47. Lvov Y., Ariga K., Onda M., Ichinose I. and Kunitake T. Alternate assembly of ordered multilayers of Si02 and other nanoparticles and polyions. Langmuir. 1997. v. 13 (23). p. 61956203.

48. Ariga K., Lvov Y., Onda M., Ichinose I., and Kunitake T. Alternately assembled ultrathin film of silica nanoparticles and linear polycations. Chemistry Letters. 1997. 2. p. 125-126.

49. Caruso F. and Mohwald H. Preparation and characterization of ordered nanoparticle and polymer composite multilayers on colloids. Langmuir. 1999. v. 15 (23). p. 8276-8281.

50. Caruso R.A., Susha A. and Caruso F. Multilayered titania, silica, and Laponite nanoparticle coatings on polystyrene colloidal templates and resulting inorganic hollow spheres. Chemistry of Materials. 2001. v. 13 (2). p. 400-409.

51. Iler R.K., Multilayers of Colloidal Particles. Journal of Colloid and Interface Science. 1966. v. 21 (6). p. 569-572.

52. Hao E.C., Yang B., Zhang J.H., Zhang X., Sun J.Q. and Shen S.C. Assembly of alternating-Ti02/CdS nanoparticle composite films. Journal of Materials Chemistry. 1998. v. 8 (6). p. 13271328.

53. Caruso F., Caruso R.A. and Mohwald H. Production of hollow microspheres from nanostructured composite particles. Chemistry of Materials. 1999. v. 11 (11). p. 3309-3314.

54. Keller S.W., Kim H.N. and Mallouk T.E. Layer-by-Layer assembly of intercalation compounds and heterostructures on surfaces toward molecular beaker epitaxy. Journal of the American Chemical Society. 1994. v. 116 (19). p. 8817-8818.

55. Ichinose I., Tagawa H., Mizuki S., Lvov Y. and Kunitake T. Formation process of ultrathin multilayer films of molybdenum oxide by alternate adsorption of octamolybdate and linear polycations. Langmuir. 1998. v. 14 (1). p. 187-192.

56. Yonezawa T., Onoue S.Y. and Kunitake T. Growth of closely packed layers of gold nanoparticles on an aligned ammonium surface. Advanced Materials. 1998. v. 10 (5). p. 414416.

57. Feldheim D.L., Grabar K.C., Natan M.J. and Mallouk T.E. Electron transfer in self-assembled inorganic polyelectrolyte/metal nanoparticle heterostructures. Journal of the American Chemical Society. 1996: v. 118 (32). p. 7640-7641.

58. Schmitt J., Decher G., Dressick W.J., Brandow S.L., Geer R.E.,Shashidhar R. and Calvert J.M. . Metal nanoparticle/polymer superlattice films: Fabrication and control of layer structure. Advanced Materials. 1997. v. 9 (1). p. 61-63.

59. Gao M.Y., Gaoi M.L., Zhang X. Yang-Y-., Yang B;, and-Shen J;C. Constructing Pbi2 Nanoparticles into a Multilayer Structure: Using the Molecular Deposition (Md) Methpd. Journal; of the Chemical Society-Chemical Communications. 1994; v. 24. p. 2777-2778:

60. Caruso F., Schuler C. and Kurth.D.G. Core-shell particles > andi hollow shellsv containing metallo- supramolecular components. Chemistry of Materials; 1999. v. lil (11): p: 3394-3399.

61. Kurth D.G. and- Osterhout R. In situ analysis of metallosupramolecular coordination-polyelectrolyte films by surface plasmon* resonance spectroscopy. Langmuir. 1999. v. 15 (14). p. 4842-4846.

62. Schutte M., Kurth D.G., LinfordiM.R., Colfen H: and Mohwald H. Metallosupramolecular thin polyelectrolyte films. Angewandte Chemie-International Edition; 1998: v. 37 (20). p. 28912893.

63. Van Duffel B., Schoonheydt R.A., Grim C.P.M. and De Schryver F.C. Multilayered clay films: Atomic force microscopy study and modeling. Langmuir. 1999. v. 15 (22). p. 7520-7529.

64. Glinel K., Laschewsky A. and Jonas A.M. Ordered polyelectrolyte "multilayers". 3. Complexing clay platelets with polycations of varying structure. Macromolecules. 2001. v. 34 (15). p. 5267-5274.

65. Lvov Y., Ariga K., Ichinose I. and Kunitake T. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. J. Amer. Chem. Soc. 1995. v. 117 (22). p. 6117-6123.

66. Lvov Y., Onda M., Ariga K. and Kunitake T. Ultrathin films of charged polysaccharides assembled alternately with linear polyions. Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition. 1998. v. 9 (4). p. 345-355.

67. Qiu X.P., Leporatti S., Donath E. and Mohwald.H. Studies on the drug release roperties of polysaccharide multilayers encapsulated.ibuprofen microparticles. Langmuir. 2001. v. 17 (17). p. 5375-5380.

68. Dhamodharan R. and McCarthy T.J. Adsorption of alginic acid and chondroitin sulfate-A to amine functionality introduced on polychlorotrifluoroethylene and- glass surfaces. Macromolecules. 1999. v. 32 (12). p. 4106-4112. >

69. Houska M. and Brynda E. Interactions of proteins with polyelectrolytes at solid/liquid, interfaces: Sequential adsorption * of albumin and heparin. Journal of Colloid and> Interface Science. 1997. v. 188 (2). p. 243-250.

70. Akari S., Schrepp W. and Horn D. Imaging of single polyethylenimine polymers adsorbed on negatively charged latex spheres by chemical force microscopy. Langmuir. 1996. v. 12 (4). p. 857-860.

71. Decher G., Lvov Y. and Schmitt J. Proof of Multilayer Structural1 Organization in Self-Assembled Polycation Polyanion Molecular Films. Thin Solid Films. 1994: v. 244 (1-2). p: 772777.

72. Laschewsky A., Wischerhoff E., Bertrand P. and Delcorte A. Polyelectrolyte multilayers containing photoreactive groups. Macromolecular Chemistry and Physics. 1997. 198 (10). p. 3239-3253.

73. Ariga K., Lvov Y. and Kunitake T. Assembling alternate dye-polyion molecular films by electrostatic layer-by-layer adsorption. Journal of the American Chemical Society. 1997. v. 119 (9). p. 2224-2231.

74. Laschewsky A., Wischerhoff E., Denzinger S., Ringsdorf H., Delcorte A. and Bertrand P. Molecular recognition by hydrogen bonding in polyelectrolyte multilayers. Chemistry-a

75. European Journal. 1997. v. 3 (1) p. 34-38.

76. Fendler J.H. Self-assembled nanostructured materials. Chemistry of Materials. 1996. v. 8 (8). p. 1616-1624.

77. Ibarz G., Dahne L., Donath E. and Mohwald H. Resealing of polyelectrolyte capsules after core removal. Macromol. Rapid Commun, 2002. v. 23 (8). p. 474-478.

78. Moya S., Schoeler B. and Caruso F. Preparation and organisation of nanoscale polyelectrolyte-coated gold nanoparticles. Adv. Funct. Mater. 2003. v. 13 (3). p. 183-188.

79. Shenoy D.B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Layer-by- layer engineering of biocompatible, decomposable core-shell structures. Biomacromolecules. 2003. v. 4 (2). p. 265-272.

80. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects. 2003: v. 224. p. 175- 184.

81. Donath E., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules. Nachrichten Aus Chemie Technik Und-Laboratorium. 1999. v. 47 (4). p. 400-405.

82. Moya S., Dahne L., Voigt A., Leporatti S., Donath E. and'Mohwald-H. Polyelectrolyte multilayer capsules templated on biological cells: core oxidation influences layer chemistry. Colloid. Surf. Physicochem. Eng. Aspects. 2001. v. 183-185. p. 27-40;

83. Бобрешова M., Сухоруков Г.Б., Сабурова- E.A., Елфимова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе. Функция и стабильность. Биофизика. 1999. т. 44 (5). с. 813-820.

84. Caruso F., Trau D., Mohwald H. and Renneberg R. Enzyme Encapsulation in Layer-by-Layer engineered polymer multilayer capsules. Langmuir. 2000. v. 16. p. 1485-1488.

85. Trubetskoy V.S., Loomis A., Hagstrom I.E., Budker V.G. and Wolff J.A. Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface f condensed DNA particles. Nucl. Acid Res. 1999. v. 27 (15). p. 3090-3095.

86. Sukhorukov G.B., Donath E., Moya S. and Susha A.S. Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes. Microencapsulation. 2000. v. 7 (2). p. 177-185.

87. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. Biomacromolecules. 2002. v. 3 (3). p. 579-590.

88. Dubas S.T. and Schlenoff J.B. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid: Construction and deconstruction. Macromolecules. 2001. v. 34 (11). p. 3736-3740.

89. Moya S., Donath E., Sukhorukov G.B., Auch M., Baumler H., Lichtenfeld H. and

90. Mohwald H. Lipid coating on polyelectrolyte surface modified colloidal particles andtpolyelectrolyte capsules. Macromolecules. 2000. v. 33 (12). p. 4538-4544.

91. Caruso F. Hollow capsule processing through colloidal templating and self- assembly. Chem. Eur. J. A. 2000. v. 6 (3). p. 413-419.

92. Caruso F., Susha A.S., Giersig M. and Mohwald H. Magnetic core-shell particles: Preparation of magnetite multilayers on polymer latex microspheres. Adv. Mater. 1999. v. 11 (11). p. 950-953.

93. Caruso F., Fiedler H. and Haage K. Assembly of beta-glucosidase multilayers on spherical colloidal particles and their use as active catalysts. Colloid. Surf. Physicochem. Eng. Aspects. 2000. v. 169 (1-3). p. 287-293.

94. Schuler C. and Caruso F. Preparation of enzyme multilayers on colloids for iocatalysis. Macromol. Rapid Commun. 2000. v. 21 (11). p. 750-753'.

95. Caruso F., Fiedler H. and Haage K. Assembly of beta-glucosidase multilayers on spherical colloidal particles and their use as active catalysts. Colloid. Surf. Physicochem. Eng. Aspects. 2000. v. 169 (1-3). p. 287-293.

96. Schuler C. and Caruso F. Preparation of enzyme multilayers on colloids for biocatalysis.

97. Mäcromol. Rapid Commun. 2000. v. 21 (11). p. 750-753'.

98. Leporatti S., Voigt A., Mitlohner R., Sukhorukov G., Donath E. and Mohwald H. Scanning force microscopy investigation of polyelectrolyte nano- and microcapsule wall texture. Langmuir. 2000. v. 16 (9). p. 4059-4063.

99. Sukhorukov G.B., Donath E., Moya S. and Susha A.S. Microencapsulation by means of stepwise adsorption of polyelectrolytes. Microencapsulation. 2000. v. 17 (2). p. 177-185.

100. Caruso F., Caruso R.A. and Mohwald H. Nanoengineering of inorganic and hybrid hollow spheres by colloidal templating. Science. 1998. v. 282 (5391). p. 1111-1114.

101. Itoh Y., Matsusaki M., Kida T. and Akashi M. Preparation of Biodegradable Hollow Nanocapsules by Silica Template Method. Chem. Lett. 2004. .v. 33 (12). p. 1552-1553.

102. Moya S., Dahne L., Voigt A., Leporatti S., Donath E. and,Mohwald,H. Polyelectrolyte multilayer capsules templated on biological cells: core oxidation influences layer chemistry. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects. 2001. v. 183-185. p. 27-40.

103. Neu B., Voigt A., Mitlohner R., Leporatti S., Gao C.Y., Donath E., Kiesewetter H., Mohwald H., Meiselman» H.J. and Baumler H. Biological cells as templates for hollow microcapsules. J. Microencapsul. 2001. v. 18 (3). p. 385-395.

104. Donath E., Moya S., Neu B., Sukhorukov G.B., Georgieva R., Voigt A., Baumler H., Kiesewetter H. and Mohwald H. Hollow polymer Shells from biological Templates: fabrication and potential applications. Chem. Eur. J. 2002. v. 8 (23). p. 5481-5485.

105. Gao C., Donath E., Mohwald H. and Shen J. Spontaneous deposition of water-soluble substances into microcapsules: Phenomenon, mechanism, and application. Angew. Chem. Int. Ed. 2002. v. 41 (20). p. 3789-3793.

106. Gao C., Leporatti S., Moya S., Donath E. and Mohwald H. Swelling and Shrinking of Polyelectrolyte Microcapsules in Response to Changes in Temperature and Ionic Strength. Chem. Europ. J. 2003. v. 9 (4). p. 915-920.

107. Skirtach AG, Karageorgiev P, Bedard MF, Sukhorukov GB, Möhwald H. Reversibly permeable nanomembranes of polymeric microcapsules. J Am Chem Soc. 2008. v. 130 (35). p. 11572-11573.

108. Kohler K., Shchukin D.G., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Drastic Morphological Modification of Polyelectrolyte Microcapsules Induced by High Temperature. Macromolecules. 2004. v. 37. p. 9546-9550.

109. Kohler K., Shchukin D.G., Mohwald H. and Sukhorukov G.B. Thermal Behavior of Polyelectrolyte Multilayer Microcapsules. 1. The Effect of Odd and Even Layer Number. J. Phys. Chem. B. 2005. v. 109. p. 18250-18259.

110. Karen Kohler, Helmuth Mohwald, and Gleb B. Sukhorukov Thermal Behavior of Polyelectrolyte Multilayer Microcapsules: 2. Insight into Molecular Mechanisms for the PDADMAC/PSS System J. Phys. Chem. B. 2006. v. 110. p. 24002-24010.

111. Moya S., Sukhorukov G.B., Auch M., Sonath E. and Mohwald H. Microencapsulation of organic solvents in polyelectrolyte multiplayer micrometer-sized shells. J. Colloid Interface Sei.1999. v. 216. p. 297-302.

112. Caruso F., Yang W.J., Trau D. and Renneberg R. Microencapsulation of uncharged low molecular weight organic materials by polyelectrolyte multiplayer self-assembly. Langmuir.2000. v. 16(23). p. 8932-8936.

113. Arshady R., Microspheres, microcapsules and liposomes. Vol. II: Medical and biotechnology applications. Part I and II. London: Citus books. 1999. 683 p.

114. Prior S., Gamazo C., Irache J.M., Merkle H.P. and Gander B. Gentamicin encapsulation in PLAIPLGA microspheres in view of treating Brucella infections. Int. J. Pharm. 2000. v. 196. p. 1 15-125.

115. Couvreur P. and Puisieux F. Nano- and microparticles for the delivery of polypeptides and proteins. Adv. Drug Deliv. Rev. 1993. v. 10. p. 141-162.

116. Rafati H., Coombes A., Adler J., J. H. and Davis S.S. Protein-loaded poly(DL-lactide-co-glycolide) microparticles for oral administration: formulation, structural and release characteristics. J. Controlled Release. 1997. v. 43. p. 89-102.

117. Lacasse F.X., Hildgen P. and McMullen J.N. Surface and morphology of spray-dried pegylated PL A microspheres. Int. J. Pharm. 1998. v. 174. p. 101-109.

118. Yang L. and Alexandridis P. Physicochemical aspects of drug delivery and release from polymer-based colloids. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 2000, v. 5, p. 132-143.

119. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E. and Mohwald H. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. J. Phys. Chem. B. 2001. v. 105 (12). p. 2281-2284.

120. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Incorporation of acromolecules into Polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface ontrolled precipitation on colloidal particles. Colloid. Surf. A. 2000. v. 202. p. 27-131.

121. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. A novel method for ncapsulation of poorly water-soluble drugs: precipitation in poly electrolyte ultilayer shells. Int. J. Pharm. 2002. v. 242. p. 219-223.

122. Дарбре А. Практическая химия белка. M.: Мир. 1989. 621 с.

123. Petrov A.I., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B. Protein calcium carbonate co-precipitation: a tool of protein encapsulation. Biotechnol. Prog. 2005. v. 21.(3). p. 918-925.

124. Sukhorukov G.B., Volodkin D.V., Gunther A.M., Petrov A.I. Shenoy D.B., Mohwald H. Porous calcium carbonate microparticles as templates for encapsulation of bioactive compounds. J. Materials Chemistry. 2004. V. 14 (14). p. 2073-2081.

125. Lippmann F. Sedimentary carbonate minerals. Berlin: Springer-Verlag. 1973. 146 p.

126. Colfen H. and Qi L. A Systematic Examination of the morphogenesis of calcium carbonate in the presence of a double-hydrophilic block copolymer. Chem. Eur. J. 2001. v. 7 (1). p. 106-1 16.

127. Guo J. and Severtson S.J. Application of classical nucleation theory to characterize the influence of carboxylate-containing additives on СаСОз Nnucleation at high temperature, pH, and ionic strength. Ind. Hng. Chem. Res. 2003. v. 42. p. 3480-3486.

128. Naka K. and Chujo Y. Control of crystal nucleation and growth of calcium carbonate by synthetic substrates. Chem. Mater. 2001. v. 13. p. 3245-3259.

129. Colfen H. Precipitation of carbonates: recent progress in controlled production of complexshapes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2003. v. 8. p. 23-31.

130. Kitamura M. Crystallization and transformation mechanism of calcium carbonate polymorphs and the effect of magnesium ion. J. Colloid Interface Sci. 2001. v. 236. p. 318-327.

131. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. v. 224. p. 175-184.

132. Казакова Л.И., Дубровский А.В., Мошов Д.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И., Электронно-микроскопическое исследование структуры полиэлектролитных микрокапсул, содержащих и не содержащих белок. Биофизика. 2007. т. 52 (5). с.850-854.

133. Paddeu S., Fanigliulo A., Lanzin М., Dubrovsky Т., Nicolini С. LB-Based РАВ immunosystem: Activity of an immobilized urease monolayer. Sens. Actuators. 1995. v. 25. p. 876-882.

134. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding. Analytical biochemistry. 1976. v. 75. p. 248-254.

135. Юрию Александровичу Киму за помощь в исследовании термочувствительности; а также всему коллективу Лаборатории Физической и радиационной химии биополимеров за постоянную под держку и помощь в работе.

Информация о работе

Дубровский, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Получение, структура, термочувствительность и использование полиэлектролитных микрокапсул, содержащих белки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы