Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль полиэлектролит-белковых взаимодействий в создании полиэлектролитного ферментного микродиагностикума

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль полиэлектролит-белковых взаимодействий в создании полиэлектролитного ферментного микродиагностикума"

904612021

На правах рукописи

Тихоненко Сергей Алексеевич

Роль полиэлектролит-белковых взаимодействий в создании полиэлектролитного ферментного микродиагностикума.

03.01.02 - биофизика

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2010 г.

1 1 НОЯ 7010

004612021

Работа выполнена в секторе физической химии биополимеров Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Сухорукое Борис Иванович

доктор биологических наук Сабурова Екатерина Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мошков Дмитрий Алексеевич

доктор химических наук Хотина Ирина Анатольевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Института фундаментальных проблем биологии РАН

Защита диссертации состоится «17 »11 2010 г. в /~>_. на заседании совета

Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН. С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино Автореферат разослан «(&> (О 2010 г.

Ученый секретарь совета Д 002.093.01 j

кандидат физико-математических наук ЛанинаН. Ф.

/

Актуальность проблемы.

Ютинико-биохимические анализы относятся к числу самых распространенных методов используемых для диагностики заболеваний человека. Такого рода исследования, как известно, включают общие анализы крови и мочи, изучение состава ряда других биологических жидкостей организма. Общим недостатком существующих методов качественного и количественного анализа нативных биологических жидкостей является необходимость их предварительного фракционирования. До недавнего времени эти анализы проводились с помощью химических методов, но, в связи с токсичностью многих из них, низкой чувствительностью и другими недостатками, широкое распространение на сегодняшний день получили энзимологичсские методы, когда используется «свободный» фермент. Однако, наряду с явными преимуществами такого подхода, есть и ряд недостатков: неоднозначность анализа в присутствии других, агрессивных к ферменту высокомолекулярных соединений, в частности, протеаз и других внутриклеточных компонентов, одноразовое использование фермента и тд. Таким образом, появляется необходимость защитить фермент-сенсор от неблагоприятного воздействия, сохранив при этом к нему доступ субстрата, увеличить его стабильность при длительном хранении, а также разработать возможность многократного использования фермента. Одним из видов такой защиты нам представляется инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы (ПМК).

Такие ПМК относятся к изделиям новой области полимерной нанотехнологии. В настоящее время это направление бурно развивается во всем мире: в США, странах Евросоюза, Китае, Австралии; растет число научных лабораторий, исследующих эти объекты; появляются первые фирмы, выпускающие коммерческие изделия. При этом наряду с чисто фундаментальными исследованиями структуры, физико-химических и биологических свойств полиэлектролитных микрокапсул, все больший акцент делается на прикладные исследования, направленные на практическое использование ПМК, в частности, в медицине, химической технологии, биотехнологии, экологии и многих других областях. Сочетание уникальных

свойств и сравнительно простая технология получения широкого спектра ПМК с заданными параметрами (структурными, механическими, функциональными), легкость включения в них самых разнообразных веществ, как низко-, так и высокомолекулярных, в том числе лекарственных препаратов, а также возможность управления проницаемостью оболочек ПМК, делает перспективным их использование в качестве средств адресной доставки лекарственных препаратов к органам и тканям, пролонгированного и терапевтического эффекта, в качестве микрореакторов, микроконтейнеров и т.п.

ПМК, содержащие инкапсулированный фермент, можно использовать как микродиагностикум, способный распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества как в нативных биологических жидкостях, так и в сточных водах, если они являются субстратом, ингибитором или активатором инкапсулированного фермента.

Цель исследования - разработка методологии получения высоко функциональных полиэлектролитных фермент-содержащих микрокапсул и создание на их основе нового класса клинико-биохимических методов анализа -микродиагностикумов. Задачи работы.

• Изучение влияния полиэлектролитов (ПЭ) (полианионов и поликатионов) на каталитические и структурные характеристики ферментов -лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уреазы.

• Исследование каталитических характеристик ферментов, заключенных в микрокапсулы с полиэлектролитными оболочками разного состава.

• Изучение влияния моно- и дивалентных солей на свойства полиэлектролит-белковых комплексов. Выбор состава среды, увеличивающего активность инкапсулированных ферментов.

• Изучение свойств полиэлектролитного ферментного микродиагностикума: стабильности при длительном хранении, к разрушению протеазами и возможности многократного использования.

Научная новизна работы. Впервые выявлены структурно-

функциональные особенности белков, обуславливающие разрушающее действие на них полиэлектролитов. Разработан и запатентован не имеющий прямых аналогов клинико-биохимический метод анализа - полиэлектролитный ферментный микродиагностикум.

Практическая значимость. Данная работа позволит решить основные проблемы существующих в настоящий момент биохимических анализов, а именно, даст возможность проводить исследования непосредственно в биологических жидкостях без их предварительного фракционирования. А также значительно удешевит проведение анализа за счет увеличения стабильности фермента-сенсора при его хранении и возможности многократного использования.

Кроме того, результаты анализа механизма полиэлектролит-белковых взаимодействий полезны для понимания роли полиэлектролитов в регуляции внутриклеточных метаболических процессов, для выявления условий токсичности полиэлектролитов (ПЭ) и соответственно для выбора нетоксичных полиэлектролитов для приготовления капсулированных фармакологических лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях: «Ломоносов 2006». (Москва, 2006. Секция «биоинженерии и биоинформатики»), «Ломоносов 2006». (Москва, 2006. Секция «Биология»), «Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposites», (St-Peterburg, 2006), «Биология наука 21 века» (Пущино, Московская обл. 2006), «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем». (Иваново, 2006, 2007), «Современные проблемы науки о полимерах» (С-Пстербург, 2007), «Биология - наука XXI века» (Пущино, Московская обл. 2007), «Математика компьютер образование» (Дубна, Московская обл., 2008, Пущино 2009).

По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работ, в том числе 6 статей и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит_.таблицы и ¿^рисунка.

Результаты и обсуждение.

1. Подбор полиэлектролитов для формирования микрокапсул.

При выборе полиэлектролитов для формирования микрокапсул, составляющих основу микродиагностикума, мы основывались на выполнении следующих условий: 1 - сохранение ферментативной активности после включения белка в ПЭ-микрокапсулу; 2 - повышение длительности хранения фермента в микрокапсуле; 3 - устойчивость микродиагностикума к агрессивным средам; 4 - многократное использование микрокапсул при анализе. Для этого нами были проведены следующие исследования:

- Сравнительное изучение влияние полианионов и поликатионов на каталитические и конформационные свойства двух ферментов - уреазы и ДЦГ.

- Подбор условий, при которых ингибиторное действие полиэлектролитов на фермент было минимально

- Выбор числа и состава полиэлектролитных слоев, для оптимального функционирования инкапсулированного фермента.

1.1. Влияние полиэлектролитов на активность белков (уреазы и ЛДГ.)

Нами изучено влияние четырех полиэлектролитов, двух полианионов-полистиролсульфоната (ПСС) и декстрансульфата (ДС), и двух поликатионов -полиаллиламингидрохлорида (ПАА) и полидиаллилдиметиламмонийхлорида (ПДАДМА) на каталитические характеристики ЛДГ из мышцы свиньи и уреазы СаптаНа етг/огт1в методами стационарной кинетики. Среди исследованных нами четырех полиэлектролитов с разным знаком заряда и разным по гидрофобности остовом сильным ингибитором для ЛДГ являлся ПСС -отрицательно заряженный полиэлектролит с выраженным гидрофобным остовом (рис1 А). Полиэлектролит с такой же ионогенной группой, но с полярным остовом - декстрансульфат, практически не изменял активности ДЦГ вплоть до концентраций 100 мкг/мл. Полиэлектролиты с положительно заряженной ионогенной группой ПАА и ПДАДМА не изменяли активность ЛДГ даже при очень высоких концентрациях - вплоть до 5 мг/мл.

Лакгатдегидрогеназа

Рис. 1. Зависимость активности ЛДГ (А) и уреазы (Б) от концентрации полиэлектролитов: полистиролсульфанат (ПСС), нолиаллиламин (ПАА), полидиаллилдиметиламмонийхло-рид (ПДАДМА), декстрансульфат (ДС). Реакционная смесь для ЛДГ: пируват 1 мМ, NADH 0,2 мМ. 0,05 М фосфатный буфер рН 6,2; - для уреазы: мочевина 125 мМ, бромкрезол 30 мМ, рН 6,2.

Полиэлектролиты, мкг/мл

хИ8

Уреаза

ПАА ПСС — поддал

Иная зависимость получена для уреазы: наибольший

ингибиторный эффект производил полиэлектролит с положительно заряженной группой в боковой цепи - ПАА (рис1 Б). Другой поликатион, также с положительно заряженной аминогруппой, но расположенной в основной цепи - ПДАДМА,

2 3 100 200

Полиэлекхролиты, маУмл практически не изменял ферментативную активность уреазы вплоть до концентраций 10 мг/мл также как и отрицательно заряженные полиэлектролиты -ПСС и ДС. Как видно из рис.1, концентрации полиэлектролитов, вызывающие 50% ингибирование ферментов (ПСС для ЛДГ и ПАА для уреазы) составляли десятые доли мкг/мл.

Таким образом, первыми претендентами на формирование полиэлектролитной оболочки в капсулах являются те полиэлектролиты, которые не влияют на активность ферментов вплоть до концентраций 2,5 мг/мл и выше. Из этих экспериментов следует, что для формирования полиэлектролитных

микрокапсул наилучшими противоположно заряженными полиэлектролитными парами являются ПАА и ДС для ЛДГ, а также ПСС и ПДАДМА для уреазы. Особенно важно, чтобы при формировании микрокапсул в качестве первого слоя оболочки, который непосредственно контактируют с белком, исключить следующие полиэлектролиты - ПСС для капсул, содержащих ЛДГ, и ПАА для уреазы.

1.2. Влияние полиэлектролитов на конформационные свойства белков.

Для того чтобы определить, вызывают ли полиэлектролиты изменения конформации ферментов, мы изучили влияние полиэлектролитов на структурные характеристики этих ферментов методами собственной флуоресценции белка и кругового дихроизма.

1.2.1 Уреаза

Данные флуоресцентного анализа уреазы при связывании с ПАА также как и результаты изучения КД в дальнем ультрафиолете, а именно - содержания элементов вторичной структуры уреазы в комплексе с полиэлектролитом свидетельствуют о том, что связывание ПАА, не производит заметных изменений структуры уреазы. Образование комплекса уреазы с ПАА, по всей видимости, затрагивает только участки молекулы непосредственно связанные с активным центром, не разрушая структуру макромолекулы в целом. Это позволяет использовать ПАА при создании уреазного микродиагностикума, но из-за его ингибиторного действия исключительно во внешних слоях оболочки, чтобы избежать прямого контакта с ферментом.

1.2.2. Лактатдегидрогеназа.

Для понимания природы ингибирования ЛДГ полистиролсульфонатом, мы изучили влияние полиэлектролитов на структурные характеристики данного фермента. Изучение триптофановой флуоресценции ЛДГ при связывании ее с полиэлектролитами.показало, что интенсивность флуоресценции фермента резко

надает при добавлении ПСС (Рис. 2). Спектры флуоресценции, полученные в присутствии других полиэлектролитов - ДС и ПАА, практически не изменяются.

600 -

400

200

250

. 200

S 150

100

50 •

£ s

запуск ПЭ

! ЛДГ+ДС, ПАА

лдг

лдг+псс

f=y0+a*exp(-b*x) ^^

Ь*=0,58 мин-1

300 320

340 360

X, nm

380 4<

2 3 минуты

Рис 2. Спектры флуоресценции ЛДГ в присутствии ПСС - А. (Записаны через 2 ч после добавления ПСС (1 - контроль, 2 - в присутствии ПСС.) Б - Динамика тушения флуоресценции ЛДГ

ЛДГ - 30 мкг/мл, ПСС - 25 мкг/мл, ДС, ПАА - 250 мкг/мл, lus - интенсивность флуоресценции при 345 им, /воз6 = 295 нм; 0,05 M Tris- HCl, pH 6,2.

Изучение динамики тушения флуоресценции ЛДГ сразу после добавления полиэлектролитов показывает, что кинетику тушения флуоресценции ЛДГ после добавления ПСС в первом приближении можно описать одной экспонентой. Тушение флуоресценции - процесс достаточно медленный (значение ип порядка минут) по сравнению с константами скорости связывания кофакторов -субстратов, коферментов и лигандов с ферментами (эти константы лежат в наносекундном диапазоне).

Молекула ЛДГ содержит 6 триптофанов на субъединицу, из них два расположены наиболее плотно в межсубъединичном контакте по оси Р: это Тгр190 и Тгр203 на каждой из субъединиц. Из совокупности данных по изменению белковой флуоресценции и ферментативной активности следует, что ингибирование ЛДГ в присутствии ПСС связано с разрушением третичной структуры.

Изучение кругового дихроизма комплекса ЛДГ-ПСС в области поглощения

(Ч

Е 2

х

Ö о ^

i4 £-6

.лдг

лдг-псс

£

1 о

5 О 6

j! 4

2

О 0

X

« -4

£ -6 О

т О -t> -10

X -12

-14

Трис-НС1

ДДГ лдг-псс

240 260

280 300 нм

320 340

200 210 220 230 240 250 260 нм

Рис. 3. КД спектры в ближней (А) и в дальней (Б) УФ-области ЛДГ в свободном состоянии и в комплексе с ПСС. ЛДГ 0.5 мг/мл; ПСС 0,5 мг/мл. Спектры записаны через 2 часа после добавления ПСС. Длина кюветы 1 см (А) и 0,02 см (Б). 0,05 М трис-HCl буфер pH 6,2.

ароматических аминокислотных остатков ( в ближнем ультрафиолете) и в области поглощения пептидных групп (в дальнем ультрафиолете) показало, что присоединение отрицательно заряженного полиэлектролита - ПСС разрушает третичную структуру и больше половины а-спиральной структуры ЛДГ при pH 6,2 (рис. 3).

На основе анализа экспериментальных данных, с учётом кинетики инактивации ферментов полиэлектролитом, а также расчета РЭП, произведенного для этих белков, процесс разрушения белков полиэлектролитом можно описать следующей схемой:

^ 1 ку.н к необр.

Р + «Е *-» [РлЕ] -> [РиЕ]* [РлЕ]** (1)

где Р - полиэлектролит, Е - фермент, [РлЕ] - комплекс полиэлектролита с п молекулами фермента, [РлЕ]* и [РлЕ]**- комплексы с обратимо и необратимо денатурированным ферментом, к\ и Li - константы скорости образования и распада комплекса соответственно, кш - константа скорости инактивации фермента в комплексе с полиэлектролитом, Ацеобр. - обобщенная константа

скорости последующих стадий конформациопных превращений фермента, приводящих к необратимым изменениям.

Результаты кинетических экспериментов показывают, что £„„ лежит в диапазоне от нескольких сек до минуты в зависимости от концентрации полиэлектролита, ¿,lco6p может меняться от мин до нескольких часов в и зависит в основном от соотношения полиэлектролит/белок.

2. Влияние ионной силы и вида солей на каталитические характеристики ферментов в комплексе с ПЭ.

2.1. Комплекс уреаза-ПАА.

Образование комплекса уреазы с ПАА сопровождается полной потерей активности фермента при больших концентрациях полиэлектролита (рис. 1), при этом структурные характеристики фермента в целом сохранялись. Для того чтобы понять, в чем особенность механизма ингибиторного действия ПАА на ферментативную активность уреазы, который отличается от действия ПЭ на другие белки, мы исследовали влияние различных неорганических солей как противоионов, ослабляющих электростатические взаимодействия ПЭ с белком.

Изучение влияния моно- и дивалентных ионов на каталитические характеристики уреазы в комплексе с полиэлектролитом показало немонотонную зависимость активности уреазы Fmax от концентрации соли для всех изученных нами солей (рис. 4А). Отметим, что значение Км для мочевины при этом не изменялась. Из рис. 4Б видно, что в растворе моновалентных ионов таких солей как NaCl, KCi NH4C1 активность уреазы в комплексе с ПАА монотонно растет с увеличением концентрации соли (в интервале до 100 мМ) согласно классическому закону статистической физики, связывающему радиус Дебая с ионной силой раствора В растворах солей сульфатов Na2S04 и (NH^SO* функция, описывающая зависимость активности от концентрации соли, претерпевает скачок (резкая активация фермента) при низких концентрациях солей в узком интервале ~ 0,6-0,8 мМ, что не укладывается в рамки классической теории взаимодействия зарядов в растворах с разной ионной силой.

Соли, мМ

10000 1 1000 100

I. 10

б

X 1 0.1 0,01 0,001

А-А

КС! ЫН4С1

Ыа2304

ЫаС!

-о- (NN4)2604

Ыа2504\

\

КС!

д-

■Л Д.

0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 /, ионная сила [тМ]

Рис. 4. Зависимость активности уреазы в комплексе с полиаллиламином ПАА от концентрации солей (А). Активность уреазы определяли как наклон кривой на линейном участке, следующем за лаг-периодом. Уреаза в комплексе 5 мкг/мл; ПАА 75 мкг/мл; бромкрезол 30 мкМ; мочевина 125 мМ, рН 6.2. На врезке те же кривые, но в узком интервале концентрации соли - от 0 до 2 мМ. Б. Логарифмическая метаморфоза кривых рис. 4А, где а - отношение активности фермента при заданной концентрации соли к активности фермента в отсутствии соли.

Естественно, что рост активности фермента в комплексе с полиэлектролитом при повышении концентрации соли происходит как следствие экранирования зарядов противоионами как на полиэлектролите, так и на ферменте и соответственно ослабления взаимодействия между ними. Возникает вопрос, почему же тогда эта зависимость активности комплекса уреазы с ПАА от концентрации соли в случае сульфатов отклоняется от классической зависимости энергии электростатических взаимодействий от ионной силы, и какова природа столь кооперативного поведения. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали в области кооперативного перехода, не распадается ли комплекс уреаза-ПАА методом турбидиметрического титрования, поскольку за состоянием комплекса можно следить по его способности к агрегации.

Данные по турбидиметрическому титрованию показывают, что с увеличением концентрации солей сульфатов в интервале - 0,2, и 0,6 мМ, комплекс ПАА с уреазой не только сохраняется, но и значительно увеличивает свою агрегационную способность. Таким образом, резкий скачок увеличения ферментативной активности уреазы в присутствии ПАА не может быть следствием распада комплекса, а скорее всего специфическим взаимодействием аниона 504"2 с одним из компонент раствора. Мы полагаем, что такой молекулой является ПАА, поскольку связывание аниона вО/2 с белком увеличило бы отрицательный заряд белка и как следствие повысило бы сродство к поликатиону - ПАА. Значительно более вероятным объяснением скачка активности является образование ионной связи сульфата с ПАА, поскольку один анион сульфата может связаться по крайней мере с двумя аминами ПАА, что должно привести к кооперативному увеличению жесткости полимерной цепи ПАА и соответственно снижению способности к комплиментарному связыванию его в наиболее важных для катализа участках молекулы белка.

Обнаруженный в работе механизм регуляции ферментативной активности ионами соли не прямым взаимодействием с ферментом, а опосредовано, через взаимодействие с полиэлектролитом, нейтрализуя его ингибиторное действие в

физиологической области концентраций соли, мы полагаем, имеет большое биологическое значение для регуляции функционального состояния полиэлектролит-белковых комплексов в живой клетке. 2.2. Комплекс ЛДГ-ПСС.

Исследовано влияние моно- и дивалентных ионов солей NaCl, KCI NH4C1, (NH4)S04 на скорость восстановления пирувата (Fmax), катализируемого ЛДГ в присутствии ПСС (рис. 5). При низких концентрациях соли (с<0,4 М) активность

Рис. 5. Зависимость скорости восстановления пирувата в лактат, катализируемого ЛДГ, в свободном состоянии и в комплексе с ПСС от концентрации солей. ЛДГ 0,2 мкг/мл; ПСС 1,2 мкг/мл; пируват 1 мМ, ЫАОН 0,2 мМ, рН 6,5

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

Соль, М „_„

ЛДГ монотонно возрастает

для всех исследованных солей. Рост активности может быть объяснен

ослаблением электростатических взаимодействий между заряженными

группами белка и ПЭ за счет экранирования зарядов противоионами соли. Об

основном вкладе электростатических взаимодействий в этот эффект

свидетельствует совпадение кривых для моно- и дивалентных солей, если их

представить как функцию от ионной силы.

3. Формирование полиэлектролитной оболочки микрокапсул.

3.1. Влияние состава полиэлекгролитной оболочки на активность инкапсулированного фермента. На основе полученных выше результатов были сконструированы капсулы, для которых использовали пары противоположно заряженных полиэлектролитов с разным составом и разным числом слоев.

Во всех капсулах, содержащих ЛДГ, первым слоем наносили положительно заряженный полиэлектролит ПАА, вторым и последующим четным слоем были отрицательно заряженные полиэлектролиты ДС или ПСС в зависимости от удаленности от центра микрокапсулы. В микрокапсулах, содержащих уреазу, первым слоем наносили отрицательно заряженный полиэлектролит ПСС,

вторым и последующими четными слоями разные положительно заряженные полиэлектролиты - ПАА или ПДАДМА с целью избежать прямого

0,01

(ШсИ, сек"1

3 ПСС 2 ПСС оде 1 ДС

1 ПСС 2ДС

0 ПСС

зде

Рис.6. Зависимость активности инкапсулированной ЛДГ (Ктах) от содержания полианионов в оболочке микрокапсул. Состав оболочки капсул:

1 - (ПАА/ПСС)з -;

2 - (ПАА/ДС)(ПАА/ПСС)2;

3 - (ПАА/ДС)2(ПАА/ПСС);

4 - (ПАА/ДС)3

Активность ЛДГ определяли по изменению поглощения ИАОН при длине волны 340нм.

Содержание полианионов

контакта с ферментом. Как видно из рис.6, активность ЛДГ в капсуле, образованной полиэлектролитной парой целиком из (ПАА/ПСС)з достаточно низкая. Из этого следует, что ингибиторное действие ПСС на активность ЛДГ проявляется даже в случае, когда ПСС содержится во втором слое оболочки и при этом частично нейтрализован положительно заряженным полиэлектролитом ПАА. Капсулы, в которых отрицательно заряженный полиэлектролит целиком представлен только ДС, имеют нулевую активность. Как было выяснено, причина этого состоит в том, что ДС образует рыхлую полиэлектролитную оболочку в парс с ПАА, поскольку ДС имеет полярный сахарный остов и фермент легко вымывается из таких микрокапсул. И хотя ДС не ингибирует ЛДГ, но по этой причине не может быть использован для создания активных микрокапсул. Наиболее высокую активность имели капсулы состава (ПАА/ДС)2(ПАА/ПСС). В такой оболочке присутствуют полианионы как с полярным - ДС, так и с гидрофобным - ПСС, остовом.

Полиэлектролит с гидрофобным остовом хотя и ингибирует фермент, но образует более плотную непроницаемую для фермента оболочку капсулы. Таким образом, оптимальным вариантом является структура полиэлектролитной оболочки, представляющая следующую комбинацию пар, нанесенных в указанной последовательности: (ПАА/ДС)2(ПАА/ПСС).

3.2. Влияние числа полиэлекгролитных слоев на активность инкапсулированного фермента.

Нами была изучена активность ферментов, включенных в микрокапсулы с разным числом полиэлектролитных слоев в оболочке (рис. 7). Из рисунка 5 видно, что для ПФМК с числом полиэлектролитных слоев от 7 до 11 ферментативная активность инкапсулированной уреазы менялась незначительно, дальнейшее

1,0

0,8

1Л

£ 0.6

тз

0.4

£ 0,2

< 0,0

1

11

13

Число слоев

Рис. 7. Активность уреазы (Гтах) в капсулах с разным числом полиэлектролитных слоев.

Полиэлектролитный состав оболочки микрокапсул: ПСС (ПСС/ПАА)з-7 слоев ПСС (ПСС/ПАА)4-9 слоев ПСС (ПСС/ПАА)5-И слоев ПСС (ПСС/ПАА)6-13 слоев Реакционная смесь: мочевина 125 мМ, бромкрезол 30 мМ, рН6,2

Каждое значение есть среднее из пяти измерений.

увеличение слоев приводило к резкому .снижению активности инкапсулированного фермента.

Аналогичное падение ферментативной активности в микрокапсулах с числом слоев, превышающих 11, наблюдали при включении в них ЛДГ. Падение активности ферментов, включенных в микрокапсулы с числом слоев выше 11, вызвано, как мы полагаем, уплотнением полиэлектролитной оболочки и

соответственно, затруднением проникновения субстрата к ферменту. Этот результат подтверждается данными, ранее полученными с помощью электронной микроскопии тонких срезов микрокапсул [Казакова 2007].

На основе этих исследований для формирования микродиагностикума были отобраны 7, 9 и 11 слойные микрокапсулы для дальнейшего изучения их свойств и возможности применения.

4. Свойства полиэлектролитных фермент-содержащих микрокапсул.

4.1. Каталитические характеристики ПМК

Следующей задачей было изучить, какими каталитическими свойствами обладает фермент, заключенный в микрокапсулах. Для этого мы исследовали зависимости стационарных скоростей реакций, катализируемых ферментами в капсулах, от концентрации субстратов - мочевины для уреазы и пирувата для

ЛДГ.

20 40 60 S0 Мочевина, мМ

Рис. 8. Зависимость скорости реакции расщепления мочевины, катализируемой уреазой в свободном состоянии (1) и в капсулах с семью полиэлектролитными слоями (2) от концентрации мочевины.

Капсулы: ПСС(ПСС/ПАА)3, 2,1* 107 капсул/мл. Реакционная смесь: мочевина 125 мМ, бромкрезол 30 мМ, pH 6,2.

В качестве примера на рис. 8 приведены кривые зависимости скорости реакции расщепления мочевины, катализируемого уреазой, от концентрации мочевины. Зависимость скорости каталитической реакции от концентрации субстрата для уреазы, заключенной в микрокапсулы, в общем виде повторяет ход кривой для свободного фермента, с небольшой лишь разницей в константе сродства для субстрата. Так константа Михаэлиса К» для мочевины составляла около 6,8+- 0,9 мМ для уреазы в капсуле с 11 и 7 слоями, в то время как для

свободной уреазы эта величина была равна 2,5±0,3 мМ;. Величина Vmax для инкапсулированной уреазы составляла 20 % от величины для свободного фермента. Определение Кк по пирувату для микрокапсул с включенной в нее ЛДГ не обнаруживало заметных различий между свободным и инкапсулированным ферментом.

4.2. Влияние солей на активность ферментов в ПМК.

В дальнейшем нами была изучена зависимость скорости реакции для инкапсулированных ферментов от концентрации моно и дивалентных солей. Из полученных данных следует, что зависимости от соли активности инкапсулированной уреазы и свободного фермента в присутствии ПАА отличаются высокой активностью фермента в микрокапсуле в отличие от полной инактивации его в свободном состоянии.

На рис. 9 показана зависимость активности инкапсулированной уреазы от

0,8

(NH4)2S04 —»- NaCI

Рис. 9. Зависимость активности уреазы, включенной в полиэлектролитные микрокапсулы от концентрации солей.

Активность инкапсулированной уреазы определяли как наклон кривой на линейном участке. 9 слойные капсулы ПСС(ПСС/ПАА)4-4*107 капсул/мл., бромкрезол 30 мкМ; мочевина 125 мМ, (NH4)2S04 -

200 400 600 8001000 ^ _ т ^ рН 6 2 Соль, мМ

концентрации разных солей, хлорида натрия и сульфата аммония. Анализ этих кривых показывает, что кривые для разных солей различаются не только по положению максимума, но и по виду функции, описывающей начальный рост активности фермента. Так если для хлорида натрия активность фермента растет монотонно в области до 200 мМ, и может быть описана функцией электростатического экранирования, то для сульфата аммония, рост активности происходит скачкообразно, т.е. функция имеет очень резкий подъем при концентрации соли около 2 мМ. Иными словами, у инкапсулированного фермента, как и у полиэлектролит-ферментного комплекса, рост активности

фермента в растворах хлорида натрия и сульфата аммония обусловлен двумя разными процессами и локализован аналогично тому, что наблюдали для свободного фермента в комплексе с полиэлектролитом (рис. 4).

Дальнейшее повышение концентрации соли приводит к падению активности инкапсулированной уреазы, особенно существенное для солей аммония. Так активность уреазы в капсуле в присутствии хлорида натрия упала на 50% при концентрации соли, равной 350 мМ, а для сульфата аммония при еще более низкой концентрации - 39 мМ.

Таким образом, для ферментов в полиэлектролитной микрокапсуле рост активности с увеличением концентрации соли в общем виде повторяет аналогичные зависимости для свободного фермента в присутствии полиэлектролита. Разница состоит лишь в том, что активносгь фермента, включенного в микрокапсулу, сохраняется достаточно высокой и скачок активности не так ярко выражен, как для свободного фермента.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости использования микродиагностикума в среде, содержащей соль, однако в ограниченной области ее концентраций - до 200 мМ для КтаС1 и до 5 мМ для №25С>4. Показано, что увеличение концентрации №С1 до 0,5 М и выше разрыхляет полиэлектролнтную оболочку и приводит к нежелательному выходу белка из микрокапсулы.

5. Стабильность инкапсулированного фермента при длительном хранении

Известно, что ферменты при малых концентрациях инактивируются при длительном хранении в результате химической модификации, тепловой денатурации, в том числе и в результате того, что являются субстратом для деградации в бактериальной среде. Мы изучили стабильность микрокапсул с включенными ферментами к длительному хранению.

200 |

Капсулы с уреазой в 0,6 мМ N32(804)

Рис. 10. Зависимость активности инкапсулированной уреазы от времени хранения в Н20 и в растворе 0,6 мМ ]Чта2504

при е 18 °С.

Капсулы: «чи капсул/мл.

9 150 {

Тт

о 100

(2 Т*

и ;

О !

Ш 50 |

} ; т 1 А

Г

Капсулы с уреазой в Н20

«

I

<

0 10 20 30 40 50 100 200 300 400

часы

На рис.10 приведена в качестве примера зависимость остаточной активности уреазы в капсулах от времени инкубации. Как видно из рис. 10, присутствие соли №280)4 при концентрации 0,6 мМ увеличивает активность уреазы в 1,8 раза и несколько стабилизирует инкапсулированный фермент к длительному хранению. Полученные данные для уреазы и ДЦГ показывают, что ферменты в микрокапсулах сохраняют ферментативную активность в течение нескольких месяцев. Кроме того, присутствие микрокапсул в воде предотвращает развитие бактериальной флоры, что позволяет избежать применения обычно используемых токсичных консервантов таких, как азид натрия.

6. Стабильность инкапсулированного фермента к разрушению протеолитическими ферментами.

Исследована возможность использования полиэлектролитных микрокапсул с включенной в них уреазой в качестве диагностического средства, в растворах,

Капсулы с уреазой

Рис. 11. Зависимость

ферментативной активности уреазы в свободном и инкапсулированном состоянии от времени инкубации с протеиназой К.

Условия инкубации с протеиназой: уреаза 50 мкг/мл или микрокапсулы с уреазой 8*1О7 капсул/мл, протеиназа К 2 мг/мл, 0.01 М трис-НС1 буфер рН 8,0; 37°С

часы

содержащих протеолитические ферменты.

Изучение зависимости ферментативной активности уреазы в свободном и инкапсулированном состояниях от времени инкубации с протеиназой К, а также с трипсином при 37°С показало, что инкапсулированный фермент полностью защищен от воздействия протеолитических ферментов. Он сохраняет свою активность на всем промежутке эксперимента (50 часов), в то время как свободный фермент в присутствии протеиназы К инактивирован уже через 20 часов инкубации (рис 11).

Как мы видим, одной из важнейших особенностей микродиагностикума является возможность его использования для анализа биологических жидкостей, содержащих агрессивные к ферменту белки, без ее предварительного фракционирования. Это достигается за счет защищенности фермента-сенсора полиэлектролитной оболочкой, не проницаемой для высокомолекулярных соединений.

7. Изучение условий для многократного использования микродиагностикума.

Одно из основных преимуществ предлагаемого нами микродиагностикума -это возможность многократного его применения путем извлечения микрокапсул из реакционной среды и повторного их использования. Для этого мы изучили два способа извлечения микрокапсул из реакционной среды: методом центрифугирования анализируемой жидкости, содержащей микрокапсулы, и методом фильтрации через фильтр "МПНроге 200".

о

концентрация мочевины. мМ

Рис.12. Многократное применение микрокапсул с использованием метода фильтрации через фильтр фирмы «МШПрог».

(а) - Концентрация мочевины 25 мМ. Среднее из трех независимых экспериментов:

(б) - Калибровочная кривая для измерения содержания мочевины. Для всех концентраций мочевины использовали одни и те же микрокапсулы.

Определение концентрации мочевины в моче проводили модифицированным уреазным методом по конечной точке, используя набор реагентов "мочевина КТ ДДС" фирмы Диакон.

При измерении оптической плотности после первого центрифугирования микрокапсул значения совпадали с контролем. Однако последующее центрифугирование давало сильно заниженные значения, да еще с большим разбросом. Такое падение активности инкапсулированного фермента возможно связано с адсорбцией и последующей деструкцией микрокапсул на стенках пробирки в процессе центрифугирования.

Как видно из рис. 12а, метод извлечения микрокапсул с помощью фильтрации, оказался более мягким и сохранил все свойства микродиагностикума, независимо от многократного использования капсул. Разброс значений между повторениями не превысил 3 %, что полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к данному типу диагностических реагентов, установленных МЗиСР РФ.

Аналогично нами была изучена возможность многократного использования ПМК, содержащих уреазу, для определения концентрации мочевины в анализируемой жидкости в широком диапазоне ее концентраций. На основе этих данных построена калибровочная кривая (рис. 12 б), позволяющая в дальнейшем определять концентрацию мочевины в растворах, многократно используя ПМК (до 45 раз).

8. Практическое применение микродиагностикума в качестве диагностического средства.

Нами была продемонстрирована возможность использования полиэлектролитных микрокапсул с включенным ферментом для анализа биологических жидкостей. Для этого было определено содержание мочевины в моче двух волонтеров с использованием микродиагностикума на мочевину. Концентрацию мочевины в биологической жидкости каждого волонтера измеряли не менее 8 раз с использованием одних и тех же капсул; извлекая капсулы методом фильтрации, как указано в разделе 7. Полученные данные сравнивали с результатами измерения концентрации мочевины в моче тех же испытуемых с использованием набора «Мочевина КТ ДДС» фирмы «Диакон-ДС».

Таблица 1. Сравнительные результаты применения микродиагностикума и набора фирмы «Диакон» для определения концентрации мочевины в биологической жидкости.

Микродиагностикум (Среднее из п измер.) Набор фирмы «Диакон».

Оптическ. плотность при 540 нм Конц. мочевины, мМ Оптическ. плотность при 540 нм Конц. мочевины, мМ

Калибратор (Ек) 0,14 8,3 0,065 8,3

1 волонтер (Е0) (/7=10) 0,093±0,004 540±20 0,043 549

2 волонтер (Е0) (и =8) 0,10710,0045 621 ±23 0,049 625,7

Содержание мочевины (С) в суточной моче определяли по формуле:

Е0 хУхЮО С (ммоль/сутки) = *8,3,

где V - количество мочи, собранной за сутки, л; 100- коэффициент разведения мочи; 8,3 - содержание мочевины в калибраторе, ммоль/л.

Из таблицы видно, что данные, полученные с применением микродиагностикума и набора «Мочевина КТ ДДС» практически не отличаются, разброс данных не превышает 3 %, что говорит о достоверности полученных результатов и возможности применения микродиагностикума в клинико-биохимическом анализе.

Выводы:

1. Показано, что из четырех исследованных полиэлектролитов - двух полианионов - полистиролсульфоната (ПСС) и декстрансульфата, и двух поликатионов - полиаллиламингидрохлорнца (ПАА) и полидиаллилдиметиламмонийхлорида (ПДАДМА), сильными ингибиторами уреазы и ЛДГ являются ПАА и ПСС соответственно.

2. Ингибирование ЛДГ полистиролсульфонатом необратимо и сопровождается разрушением третичной и частично вторичной структур фермента.

3. Ингибирование уреазы полиаллиламином обратимо и не сопровождается заметными структурными изменениями.

4. В растворах моновалентных анионов (хлоридов) активность комплексов уреаза-ПАА и ЛДГ-ПСС монотонно растет с повышением ионной силы в интервале 0-400 мМ.

5. В присутствии дивалентных анионов - сульфатов, активность комплекса уреаза-ПАА претерпевает скачок в узком интервале концентраций соли. Эти данные совместно с результатами турбидиметрического титрования интерпретируются как изменение конформации полиэлектролита - ПАА, препятствующее комплиментарному связыванию его с активной петлей уреазы.

6. Активность ферментов, заключенных в полиэлектролитную микрокапсулу, зависит от: 1) последовательности наслоения полиэлектролитов, и 2) от числа полиэлектролитных слоев

7. Полиэлектролитная оболочка защищает инкапсулированные ферменты от разрушающего действия протеаз и сохраняет их активность при длительном хранении.

8. Разработана методика многократного использования микродиагностикума, а также показана возможность его применения в качестве диагностического средства.

Список публикаций по материалам диссертации. Статьи

1. Tikhonenko S.A., Saburova Е.А., Dubrovsky A.V., Shabarchina L.I., Dybovskaja Ju.N., Sukhorukov B.I. Methodology of inclusion of enzymes in polyelectrolyte nano- and microcapsules on example of lactate dehydrogenase. Glass Physics and Chemistry. 2007, Vol. 33, No. 3, P. 287-293.

2. Сухоруков Б.И., Тихонеико C.A., Сабурова E.A., Дубровский A.B., Дыбовская Ю.Н., Шабарчина Л.И. Инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные наш- и микрокапсулы в связи с проблемой микродиагностикума. Биофизика, 2007, т. 52, вып.6, С. 1041-1048.

3. Сабурова Е.А., Тихопенко СЛ., Дыбовская Ю.Н., Сухоруков Б.И. «Изменения активности и структуры уреазы при взаимодействии с полиэлектролитами». Журнал Физической Химии, 2008, т. 82, N 3, С. 554-561.

4. Сухоруков Б.И., Тихонеико С.А., Сабурова Е.А, Дубровский A.B., Стаменов М.Н., Шабарчина Л.И. Получение полиэлектролитного ферментного

микродиагностикума методами нанотехнологии и его применение в клинико-биохимическом анализе. Альманах клинической медицины. М. 2008. Том XVII Часть 2. С. 371-373. ;

5. Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Дурденко Е.В., Сухоруков Б.И. Фермент-полиэлектролитный комплекс. Солевая зависимость активации и ингибирования уреазы в комплексе с полиаллиламином. Журнал Физической Химии, 2009, т. 83 , № 10. С. 1781-1788.

6. Дурденко Е.В., Кузнецова С.М., Тихоненко С.А., Емельяненко В.И., Сабурова Е.А. Температурная стабильность лактатдегидрогеназы в комплексе с анионным нолиэлектролитом полистиролсульфонатом. Биофизика, 2010, т. 55, вып.4, С. 594-604, Патенты:

6. Сухоруков Б.И., Сабурова Е.А, Шабарчина Л.И, Дубровский A.B., Тихоненко С.А.. Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул. № 2369386.

7. Сухоруков Б.И., Сабурова Е.А, Дубровский A.B., Тихоненко С.А., Шабарчина Л.И. Микродиапюстикум и способ ферментативного определения концентрации анализируемого вещества. № 2316769

Тезисы

8. Tikhonenko S.A., Saburova Е.А., Dubrovsky A.V., Shabarchina L.I., Dybovskaja Yu.N., Sukhorukov B.I.. «Methodology of inclusion of enzymes in polyelectrolyte nano- and microcapsules on example of lactate dehydrogenase». Abstr. "Structural chemistry of partially ordered systems, nanoparticles and nanocomposytes", 2006, St.-Peterburg, p. 169

9. Тихоненко C.A., Сабурова Е.А, Шабарчина Л.И., Дыбовская Ю.Н., Сухоруков Б.И. Механизм разрушения ферментов полиэлектролитами. Возможная токсичность для клетки. XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006», Москва 2006 г. секция «Биология» стр. 222-223.

10. Тихоненко С.А., Дубровский A.B., Дыбовская Ю.Н. Сравнительное исследование каталитических характеристик и стабильности уреазы в свободном состоянии и включенной в полиэлектролитную микрокапсулу. «Биология - наука XXI века», Пущино, 2007. стр. 197.

11. Тихонеико С.А., Дыбовская Ю.Н., Сабурова Е.А., Сухоруков Б.И. Образование полиэлектролит-белковых комплексов. Двойное действие солей. — Труды Межд.конф. Современные проблемы науки о полимерах, С-Петербург, 2007, стр. 280.

12. Тихоненко С.А., Дыбовская Ю.Н., Сабурова Е.А, Кузнецова С., Сухоруков Б.И.

Полиэлектролит-белковые комплексы. Влияние длины цепи полиэлектролита на

эффективность его разрушающего действия на белки. Труды. II Региональной конф мол. ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем», Иваново, 2007, стр. 68

13. Shabarchina L.I., Dubrovskiy A.V., Tikhonenko S.A., Saburova E.A., Sukhorukov.B.I. Design of Enzyme-containing Polyelectrolyte Nano- and Microcapsules and

Creation of Microdiagnosticum / Materials of the Fourth Intern. Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007.

14. Sukhorukov.B.I., Saburova E.A, Tikhonenko S.A., Dubrovskiy A.V., Shabarchina L.I. Polyelectrolyte Enzyme-bearing Nano- and Microdiagnosticum and its Properties / Materials of the Fourth Intern.Conf. on Science and Busines "NanoBio and related new Perspective Biotechnologies", Pushchino, 2007.

15. Сухорукое Б.И., Тихонсико C.A., Сабурова E.A., Шабарчина Л.И Создание полиэлектролитного ферментного микродиагаостикума многоразового использования, изучение его свойств и возможности применения для клинико-биохимического анализа. Третья международная научная школа «Наука и инновации - 2008»: 1 -7 июля 2008 г. Йошкар-Ола

16. Тихоненко С. А., Сабурова Е.А, Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Полиэлектролитный ферментный микродиагностикум. Получение, изучение свойств и применение. II Научно-практической конференции "Перспективы развития инноваций в биологии", Москва, 2008

17. Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Сухоруков Б.И. Аномальный эффект экранирования зарядов полизлсктролитов при взаимодействии с белками в растворах солей XX Симпозиума "Современная химическая физика", Туапсе, 2008.С. 99.

18. Тихонечко С.А., Дыбовская Ю.Н., Сабурова Е.А. Применение расчетов электростатического поля белков в исследовании взаимодействия полиэлектролитов с белками в широком диапазоне ионной силы. XV Конференция «Математика. Компьютер. Образование», Дубна 2008 г. стр. 224.

19. Дурденко Е.В., Дыбовская Ю.Н., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А. Полиэлектролит белковый комплекс. Влияние полиаллиламина на структуру и функции урсазы. XVI Конференция «Математика. Компьютер. Образование», Пущино 2009 г. секция «Анализ сложных биологических систем: эксперимент и модели», стр. 244.

20. Дурденко Е.В., Дыбовская Ю.Н., Тихоненко С.А. Существует ли связь между стабильностью белков к тепловой денатурации и к разрушению полиэлектролитами? Тезисы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2009.13-18 апреля 2009, с. 13.

21. Дурденко Е.В., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А, Шабарчина Л.И. Влияние солей с разной высаливающей силой на взаимодействие полиэлектролитов с белками. XII Молодежная конференция по органической химии 7-11 декабря 2009 года Суздаль 2009.

22. Тихоненко С.А., Дурденко Е.В., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И. XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Разработка полиэлектролитного ферментного микродиагаостикума нового типа клишшко-биохимического анализа с использованием нанобиотехнологии. 9-11 февраля 2009, Москва, с. 71

Подписано в печать:

11.10.2010

Заказ № 4273 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихоненко, Сергей Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫЙ.

1. Биохимические методы анализа.

1.1 Анализируемые вещества.

1.2 Ферментативные методы анализа.

1.2.1. Методы с использованием ферментов в растворенном состоянии.

1.2.2. Методы с использованием иммобилизованных ферментов.

2. Полиэлектролитные микрокапсулы.

2.1. Виды ПЭ микрокапсул.

2.2. Применение микрокапсул.

2.2.1. Микрокапсулы как средство адресной доставки.

2.2.2. Микрокапсулы как диагностическое средство.

3. Влияние заряженных частиц на функции белков, содержащихся в растворе.

4. Влияние полиэлектролитов на структуру и функции белков при образовании комплекса.

5. Природа полиэлектролит-белковых взаимодействий.

5.1. Электростатические взаимодействия.

5.2. Гидрофобные взаимодействия.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение полиэлектролит-белковых комплексов в растворе.

1.1 Влияние полиэлектролитов на активность уреазы.

1.2. Влияние полиэлектролитов на конформационные свойства уреазы.

1.2.1. Флуоресцентные свойства комплекса ПАА-уреаза.

1.2.2. Изучение комплекса ПАА-уреаза методом кругового дихроизма.

1.3. Влияние полиэлектролитов на активность ЛДГ.

1.4 Влияние полиэлектролитов на структурные свойства ЛДГ.

1.4.1. Флуоресцентные свойства.

2. Влияние неорганических солей на свойства ферментов в комплексе с полиэлектролитом.

2.1 Каталитические характеристики комплекса уреаза -ПАА.

2.2. Турбидиметрическое титрование уреазы полиаллиламином в присутствии солей.

2.3. Каталитические характеристики комплекса ЛДГ-ПСС.

3. Формирование полиэлектролитной оболочки микрокапсул.

3.1. Влияние состава полиэлектролитной оболочки на активность инкапсулированного фермента.

3.2 Влияние числа полиэлектролитных слоев на активность инкапсулированного фермента.

4. Свойства полиэлектролитных микрокапсул, содержащих фермент.

4.1. Каталитические характеристики ПФМК.

4.2. Влияние различных солей на активность фермента в микрокапсулах.

5. Стабильность инкапсулированного фермента при длительном хранении.

6. Стабильность инкапсулированного фермента к разрушению протеолитическими ферментами.

7. Изучение условий для многоразового использования микродиагностикума.

8. Практическое применение микродиагностикума в качестве диагностического средства.

Выводы:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль полиэлектролит-белковых взаимодействий в создании полиэлектролитного ферментного микродиагностикума"

Клинико-биохимические анализы относятся к числу самых распространенных методов используемых для диагностики заболеваний человека. Такого рода исследования, как известно, включают общие анализы крови и мочи, изучение состава ряда других биологических жидкостей организма. Общим недостатком существующих методов качественного и количественного анализа нативных биологических жидкостей является необходимость их предварительного фракционирования. До недавнего времени эти анализы проводились с помощью химических методов, но, в связи с токсичностью многих из них, низкой чувствительностью и другими недостатками, широкое распространение на сегодняшний день получили энзимологические методы, когда используетсяч<свободный» фермент. Однако, наряду с явными преимуществами такого подхода, есть и- ряд недостатков: неоднозначность анализа в присутствии других, агрессивных к ферменту высокомолекулярных соединений, в частности, протеаз и других внутриклеточных компонентов, одноразовое использование фермента и т.д. Таким образом, появляется необходимость защитить фермент-сенсор от неблагоприятного воздействия, сохранив при этом к нему доступ субстрата, увеличить его стабильность при длительном хранении, а также разработать возможность многократного использования фермента. Одним из видов такой защиты нам представляется инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные микрокапсулы (ПМК).

Такие ПМК относятся к изделиям новой области полимерной нанотехнологии. В настоящее время это направление бурно развивается во всем - мире: в США, странах Евросоюза, Китае, Австралии; растет число научных лабораторий, исследующих эти объекты; появляются первые фирмы, выпускающие коммерческие изделия. При этом наряду с чисто фундаментальными исследованиями структуры, физико-химических и биологических свойств полиэлектролитных микрокапсул, все больший акцент делается на прикладные исследования, направленные на практическое использование ПМК, в частности, в медицине, химической технологии, биотехнологии, экологии и многих других областях. Сочетание уникальных свойств и сравнительно простая технология получения широкого спектра ПМК с заданными параметрами (структурными, механическими, функциональными), легкость включения в них самых разнообразных веществ, как низко-, так и высокомолекулярных, в том числе лекарственных препаратов, а также возможность управления проницаемостью оболочек ПМК, делает перспективным их использование в качестве средств адресной доставки лекарственных препаратов к органам и тканям, пролонгированного и терапевтического эффекта, в качестве микрореакторов, микроконтейнеров и т.п. ПМК, содержащие инкапсулированный фермент, можно использовать как микродиагностикум, способный распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества как в нативных биологических жидкостях, так и в сточных водах, если они являются субстратом, ингибитором или активатором инкапсулированного фермента.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫЙ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тихоненко, Сергей Алексеевич

Выводы:

1. Показано, что из четырех исследованных полиэлектролитов - двух отрицательно заряженных - полистиролсульфоната (ПСС) и декстрансульфата, и двух положительно - полиаллиламингидрохлорида (ПАА) и полидиаллилдиметиламмонийхлорида (ПДАДМА), сильными ингибиторами уреазы и ЛДГ являются ПАА и ПСС соответственно.

2. Ингибирование ЛДГ полистиролсульфонатом, необратимо и сопровождается разрушением третичной и частично' вторичной структур фермента.

3. Ингибирование уреазы полиаллиламином обратимо и не сопровождается заметными структурными изменениями.

4. В растворах моновалентных анионов (хлоридов) активность комплексов уреаза-ПАА и ЛДГ-ПСС с увеличением концентрации соли монотонно, растет как корень квадратный от ионной силы.

5. В присутствии дивалентных анионов - сульфатов активность комплекса-уреаз-ПАА претерпевает скачок в узком интервале их концентраций от 0,6 до 0,8 мМ, увеличиваясь до активности нативного фермента: Эти данные совместно с результатами-турбидиметрического титрования; интерпретируются как изменение конформации полиэлектролита - ПАА, препятствующее комплиментарному связыванию его с активной петлей уреазы.

6. Ферменты, заключенные в полиэлектролитную' микрокапсулу, могут сохранять до 40 % активности и это зависит от: 1) последовательности наслоения полиэлектролитов, и 2) от числа полиэлектролитных слоев

7. Полиэлектролитная оболочка защищает инкапсулированные ферменты от разрушающего действия протеаз и сохраняет их активность при длительном хранении в воде более чем на 6 месяцев.

8. Разработана методика многократного использования микродиагностикума, а также показана возможность его применения в качестве диагностического средства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихоненко, Сергей Алексеевич, Пущино

1. Ai Н., Jones S.A. and Lvov Y.M. Biomedical Applications of Electrostatic Layer-by-Layer Nano-Assembly of Polymers, Enzymes, and Nanoparticles. Cell Biochem. Biophys., 2003, v. 39, p. 23-43.

2. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Leporatti S., Radtchenko I.L., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2002, v. 198, p. 535-541.,

3. Bagel'ova J., M. Antalik and M. Bona, Studies on cytochrome c-heparin interactions by differential scanning calorimetry. Biochem. J. 297, 99 101 (1994).

4. Balabushevitch N.G. and Larionova N.I. Fabrication and characterization of polyelectrolyte microparticles with protein. Biochemistry (Moscow), 2004, v. 69(7), p. 930-936.

5. Balabushevitch N.G., Tiourina O.P., Volodkin D.V., Larionova N.l. and>Sukhorukov G.B. Loading the Multilayer Dextran Sulfate/Prptamine Microsized Capsules with Peroxidase. Biomacromolecules, 2003, v. 4(5), p. 1191-1197.

6. Basova LV, Tiktopulo EI, Kutyshenko VP, Mauk AG, Bychkova VE. Biochim Biophys Acta. 2008 Apr; 1778(4): 1015-26. Epub 2008 Jan 17

7. Berth G., Voigt A., Dautzenberg Hi, Donath E. and. Mohwald H. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. Biomacromolecules, 2002, v. 3(3), p.'579-590.

8. Berth, G., et al., Polyelectrolyte complexes and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. Biomacromolecules, 2002. 3(3): p. 579-590.

9. Borodina, Т., et al., Controlled release of DNA from self-degrading microcapsules. Macromolecular Rapid Communications, 2007. 28(18-19): p. 1894-1899.

10. Caruso F. and Mohwald H. Protein multilayer formation on colloids through a stepwise self-assembly technique. J. Amer. Chem. Soc., 1999, v. 121(25), p. 6039-6046.

11. Caruso F. Hollow capsule processing through colloidal templating and self- assembly. Chem. Eur. J. A, 2000, v. 6(3), p. 413-419.

12. Caruso F., Fiedler H. and Haage K. Assembly of beta-glucosidase multilayers on spherical colloidal particles and their use as active catalysts. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2000, v. 169(1-3), p. 287-293.

13. Caruso F., Susha A.S., Giersig M. and Mohwald H. Magnetic core-shell particles: Preparation of magnetite multilayers on polymer latex microspheres. Adv. Mater., 1999, v. 11(11), p. 950-953.

14. Caruso F., Trau D., Mohwald H. and Renneberg R. Enzyme Encapsulation in Layer-by-Layer

15. Engineered Polymer Multilayer Capsules. Langmuir, 2000, v. 16, p. 1485-1488.

16. De Geest BG, Dejugnat C, Verhoeven E, Sukhorukov GB, Jonas AM, Plain J, Demeester J, De Smedt SC. Layer-by-layer coating of degradable microgels for pulsed drug delivery. J Control Release. 2006 Nov 28; 116(2): 159-69. Epub 2006 Jun 21.

17. De Geest BG, Jonas AM, Demeester J, De Smedt SC. Glucose-responsive polyelectrolyte capsules. Langmuir. 2006 May 23;22(11):5070-4.

18. De Geest, B.G., et al., Intracellularly degradable polyelectrolyte microcapsules. Advanced Materials, 2006. 18(8): p. 1005-+.

19. De Koker, S., et al., In vivo cellular uptake, degradation, and biocompatibility of polyelectrolyte microcapsules. Advanced Functional Materials, 2007. 17(18): p. 3754-3763.

20. Decher G. and Hong J.D; Buildup of ultrathin multilayer films by a self- assembly process. 1. Consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar, amphiphiles on charged surfaces. Makromol. Chem. Macromol. Symp; 1991. v. 46. p. 321-327.

21. Decher G., Hong J.D. and Schmitt J, Buildup of ultrathin multilayer films by a self- assembly process. 3. Alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces. Thin Solid Films, 1992. v. 210(1-2). p. 831-835

22. Decher G., Lvov Y. and Schmitt J. Proof of Multilayer Structural-Organization in Self-Assembled Polycation Polyanion Molecular Films. Thin Solid Films. 1994. v. 244 (1-2). p. 772-777.

23. Dubas S.T. and Schlenoff J.B. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid: Construction and deconstruction. Macromolecules, 2001, v. 34(11), p. 3736-3740.

24. Dumitriu S. and Chornet E. Inclusion and release of proteins from polysaccharide-based polyion complexes. Adv. Drug Deliv. Rev., 1998," v. 31, p. 223-246.

25. Emek Seyrek, Paul L. Dubin, Christophe Tribet, and Elizabeth A. Gamble Ionic Strength Dependence of Protein-Polyelectrolyte Interactions //Biomacromolecules 2003, 4,273-282.

26. Foreman TM, Khalil M; Meier P, et al. Effects of charged water-soluble polymers on the stability and activity of yeast alcohol dehydrogenase and subtilisin Carlsberg Biotechnology and-Bioengineering, 76(3), pp.241-246 (2001)

27. Gao J.Y., Dubin P:, Muhoberac BB.P "Measurement of the binding of proteins to polyelectrolytes by frontal analysis continuous capillary electrophoresis." //Analytical Chemistry 1997V. 69.P. 2945-2951.

28. Gao J.Y., Dubin P.L. and Muhoberac B.B. Capillary Electrophoresis and Dynamic Light Scattering Studies of Structure and Binding Characteristics of Protein-Polyelectrolyte Complexes. J. Phys. Chem., 1998, v. 702, p. 5529-5535.

29. Gebauer, M. and A. Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Current Opinion in Chemical Biology, 2009. 13(3): p. 245-255.

30. Gimmler, H., Kugel, H., Leibfritz, D., and Mayer, A. (1988) Physiol. Plantar., 74, 521-530.

31. Goers, J.; Permyakov, S.E.; Permyakov, E.A.; Uversky, V.N.; Fink, A.L. Conformational Prerequisites for alpha-Lactalbumin Fibrillation. Biochemistry 2002,41, 12546 12551.

32. Gong J., P. Yao, H. Duan, et al., Structural transformation of cytochrome c and apo cytochrome c induced by sulfonated polystyrene

33. Biomacromolecules, 4(5), pp. 1293-1300 (2003).

34. Gourmelin Y. Electrode measurement of glucose and urea in undiluted samples / Y. Gourmelin, B. Gouget, A. Truchaud // Clin Chem. — 1990. — Vol. 36. — P. 1646-1649.

35. Grymonpre, K. R.; Staggemeier, B. A.; Dubin, P. L.; Mattison, K.M. Biomacromolecules 2001, 2, 422-429.

36. Hakansson, A.; Zhivotovsky, B.; Orrenius, S.; Sabharwal, H.; Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 8064 8068:

37. Hattori, T.; Kimura, K.; Seyrek, E.; Dubin, P. L. Anal. Biochem.2001, 158, 158-167.

38. Jacques-Philippe Colletier, Barnabe Chaize, Mathias Winterhalter and Didier Fournier Protein encapsulation in liposomes: efficiency depends on. interactions between protein and phospholipid bilayer. BMC Biotechnology 2002,2:9

39. Jiang H.L. and Zhu K.J. Preparation and characterization of protein-loaded polyanion/gelatin complex. Pharm. Dev. and Tech., 2001; v. 6(2), p. 231 -240*

40. Joana Filipa Pereira da Silva Gomes, Anja Rank, Astrid Kronenberger, JQrgen Fritz, Mathias Winterhalter and Yannic Ramaye Polyelectrolyte Coated Unilamellar Nanometer Sized Magnetic Liposomes Langmuir2009 25 (12), 6793-6799*

41. Jonas A., Laschewsky A. and Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties. Macromol. Rapid Commun., 2000, v. 21(7), p. 319-348.

42. Kabanov V.A., Skobeleva V.B., Rogacheva V.B. and Zezin A.B. Sorption of Proteins by Slightly Cross-Linked Polyelectrolyte Hydrogels: Kinetics and Mechanism. J. Phys. Chem. B, 2004, v. 108, p. 1485-1490.

43. Kaibara К., Okazaki T., Bohidar H.B., Dubin P.L. "pH-Induced Coacervation in Complexes of Bovine Serum Albumin and Cationic Polyelectrolytes" // Biomacromolecules. 2000V. 1. P. 100107.

44. Khotina LA, S. V. Tolkachev, A. L. Rusanov and P. M. Valetsky Synthesis of Polyheteroarylenes Based on Bis(naphthalic) Anhydrides with Acetylene and Substituted Phenylene Groups Doklady Physical Chemistry 2003 V. 389, № 4-6, 106-110,

45. Kokufota E. and Takahashi K. Stoichiometric Complexation of Bovine Trypsin with Potassium Poly(Vinyl Alcohol Sulfate) and Enzyme Activity of the Complex. Polymer, 1 990, v. 31, p. 1177-1182.

46. Langer R. New methods of drug delivery. Science, 1990, v. 249, p. 1527-1533.

47. Lespinas F. Enzyme urea assay: A new colorimetric method based on hydrogen peroxide measurement / F. Lespinas, G. Dupuy, F. Revol, C. Aubry // Clin. Chem. — 1989. — Vol. 35. — P. 654-658.

48. Lvov Y., Ariga K., Ichinose I. and Kunitake T. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. J. Amer. Chem, Soc., 1995, v. 117(22), p. 61 176123.

49. Mattison K.W. and Dubin P.L. Description and Characterization of Soluble Protein-Polyelectrolyte Complexes. Polym. Prep., 1998, v. 39, p. 667-668.

50. Mattison K.W., BrittainT .J. and Dubin P.L. Protein-Polyelectrolyte Phase Boundaries. Biotechnol. Prog., 1995, v. 77, p. 632-637.

51. Mayya S., Schoeler B. and Caruso F. Preparation and organisation of nanoscale polyelectrolyte-coated gold nanoparticles. Adv. Funct. Mater., 2003, v. 13(3), p. 183-188.

52. Mockel T. Evaluation of the i-STAT™ system: a portable chemistry analyser for the measurement of sodium, potassium, chloride, urea, glucose, and hematocrit / T. Mockel, D. Morrison, R. Yatscoff// Clin. Biochem. — 1995. — Vol. 28. — P. 187-192.

53. Morishita Y. Kinetic assay of serum and-urine for urea with use of urease and leucine dehydrogenase / Y. Morishita, K. Nakane, T. Fukatsu et al. H Clin. Chem. — 1997. — Vol. 43. — P. 1932-1936.

54. Moss J. M., VanDamme M. P., Murphy W. H., Preston В. N. "Dependence of salt concentration on glycosaminoglycan-lysozyme interactions in cartilage." // Arch. Biochem. Biophys. 1997V. 348. P. 49-55.

55. Muniruzza man M., Hijikata T.S., Nagano A. and Ikada Y. Structure Change of Basic Fibroblast Growth Factor Through Gelatin Complexation. Polym. Prep., 1998,v. 39, p. 247-248.

56. Naslund B. Luminometric single step urea assay using ATP-hydrolyzing urease / B. Naslund, L. Stable, A. Lundin et al. // Clin. Chem. — 1998. — Vol. 44. — P. 1964-1973.

57. Paddeu S., Fanigliulo A., Lanzin M., Dubrovsky T., Nicolini C. I I Sens. Actuators 1995. V. 25. P. 876-882.

58. Palankar, R., et al., Controlled Intracellular Release of Peptides from Microcapsules Enhances Antigen Presentation on MHC Class I Molecules. Small, 2009. 5(19): p. 2168-76.

59. Park, J. M.; Muhoberac, B. B.; Dubin, P. L.; Xia, J. Macromolecules 1992, 25, 290-295.

60. Pei R., Cui X., Yang X. and Wang E. Assembly of Alternating Polycation and DNA Multilayer Films by Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Biomacromolecules, 2002, v. 13, p. 124-130.

61. Petrov A.I., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B. Protein calcium carbonate co-precipitation: a tool of protein encapsulation. Biotechnol. Prog. 2005. v. 21.(3). p. 918-925.

62. Pierce B.L.J., Gibson T.D. and Bunnel R.A. Preliminary Modeland Evidence for the Mechanism of Stabilization of Analytical Enzymes in Aqueous Solution by Electrolyte and Sugar Derivatives. Spec. Publ.-R; Soc. Chem.-, 1998, v. 767, p. 54-60.

63. Polozov R; Montrel M. Ivanov V., Melnikov Yu., Sivozhelezov V, (2006) Biochemistry V. 45. P: 4481-4490.

64. Qiu X.P., Leporatti S., Donath E. and Mohwald H. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles. Langmuir, 2001, v. 17(17), p. 53755380.

65. Recommendation of the Second Joint Task Force of European» and other Societies on Coronary Prevention. Prevention of coronary heart disease in clinical practice. Eur Heart J 1998; 19: 1434-1503.

66. Rivera-Gil, P., et al., Intracellular processing of proteins mediated by biodegradable polyelectrolyte capsules. Nano Lett, 2009. 9(12): p. 4398-402.

67. Sabini, E., et al., Structural basis for substrate promiscuity of dCK. J Mol Biol, 2008. 378(3): p. 607-21.

68. Schuler C. and Caruso F. Preparation of enzyme multilayers on colloids for biocatalysis. Macromol. Rapid Commun., 2000, v. 21(11), p. 750-753'.

69. Seyrek E., Dubin PL., Tribet C., and Gamble EA. "Ionic Strength Dependence of Protein-Polyelectrolyte Interactions." //Biomacromolecules. 2003V. 4. P. 273-282.

70. Shenoy D.-B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Layer-by- Layer Engineering of Biocompatible, Decomposable Core-Shell Structures. Biomacromolecules, 2003, v. 4(2), p. 265272.

71. Shenoy, D:B., et al., Layer-by-layer engineering of biocompatible, decomposable core-shell structures. Biomacromolecules, 2003. 4(2): p. 265-272.

72. Sivozhelezov V., Nicolini C. "Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor." J. Theor. Biol. 2005V. 234. №4. P. 479-85.

73. Skirtach, A.G., et al., Laser-induced release of encapsulated materials inside living cells. Angew Chem Int Ed Engl, 2006. 45(28): p. 4612-7.

74. Skirtach, A.G., et ah, Nanoparticles distribution control by polymers: Aggregates versus nonaggregates. Journal of Physical Chemistry C, 2007. 111(2): p. 555-564.

75. Sukhorukov G.B., Donath E„ Moy S. and Susha A.S. Microencapsulation by means of stepwise adsorption of polyelectrolytes. Microencapsulation, 2000, v. 17(2), p. 177-185.

76. Sukhorukov, G.B., etal., Multifiinctionalized polymer microcapsules: novel tools for biological.and pharmacological applications. Small, 2007. 3(6): p. 944-55.

77. Svensson, M.; Hakansson, A.; Mossberg, A.K.; Linse, S.; Svanborg, C. Conversion of alpha-lactalbumin to a protein inducing apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97,4221 -4226.

78. Taylor A. J. Analytical reviews in clinical biochemistry: the estimation of urea / A. J. Taylor, P. Vadgama // Ann. Clin. Biochem. — 1992. — Vol. 29. — P. 245-264.

79. Vorlop К., Capan E., Dautzenberg H., Czichocki G. Novel and effectiveentrapment of polyelectrolyte-enzyme-complexes in LentiKats . IX International BRG Workshop of Bioencapsulation, Poland, Warsaw, 2001, poster2.

80. Wearsch, P.A. and P. Cresswell, The quality control of MHC class I peptide loading. Curr Opin Cell Biol, 2008. 20(6): p. 624-31.

81. Wen Y.P. and Dubin P.L. Potentiometric Studies of the Interaction of Bovine Serum Albumin and Poly Dimethyldiallyammonium Chloride). Macromolecules, 1997, v. 30, p. 7856-7861.

82. Wright, C.A., et al., Tapasin and other chaperones: models of the MHC class I loading complex. Biol Chem, 2004. 385(9): p. 763-78.

83. Xia J., Dubhb P.L., Kim Y., Muhoberac B.B. and Klimkowski VJ. Electrophoretic and Quasi-Elastic Light Scattering of Soluble Protein- Polyelectrolyte Complexes. J. Phys. Chem., 1993, v. 97, p. 4528-4534. v

84. Yaneva, R., S. Springer, and M. Zacharias, Flexibility of the MHC class II peptide binding cleft in the bound, partially filled, and empty states: A molecular dynamics simulation study. Biopolymers, 2009. 91(1): p. 14-27.

85. Zacharias, M. and S. Springer, Conformational flexibility of the MHC class I alphal-alpha2 domain in peptide bound and free states: a molecular dynamics simulation'study. Biophys J, 2004. 87(4): p. 2203-14.

86. Zaitsev S.Y., Gorokhova I.V., Kashtigo T.V., Zintchenko A. and Dautzenberg H. General approach for lipases immobilization in polyelectrolyte complexes. Colloid. Surf: Physicochem. Eng. Aspects, 2003, v. 221, p. 209-220.

87. Zebli, В., et al., Magnetic targeting and cellular uptake of polymer microcapsules simultaneously functionalized with magnetic and luminescent nanocrystals. Langmuir, 2005. 21(10): p. 4262-4265.

88. Бобрешова M:, Сухоруков Г.Б., Сабурова E.A., Елфимова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Лактатдегидрогеназа в интерполиэлекгролитном комплексе. Функция и стабильность. Биофизика. 1999. т. 44 (5). с. 813-820.

89. Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Кунижев С.М., Сухоруков Г.Б., Ворожцов1Г.Н., Фельдман Б.М., Марквичева Е.А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ. Биомедицинская химия. 2007. т. 53 (5). с. 557-565.

90. Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Кунижев С.М., Сухоруков Г.Б., Ворожцов Г.Н., Фельдман Б.М., Марквичева Е.А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ. Биомедицинская химия. 2007. т. 53 (5). с. 557-565.

91. Гладилин А.К. Принципы конструирования биокаталитических систем на основе полиэлектролитов в среде органических растворителей. Диссертация докт. хим. наук, М: МГУ, 1999, с. 293

92. Долгов В.В., Селиванова A.B. Биохимические исследования в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ первичного звена здравоохранения. СПб.: «Витал Диагностике СПб», 2006, с. 231

93. Долгов В.В., Шевченко О.П., Шарышев A.A., Бондарь В.А. Турбодиметрия в лабораторной практике. М.: Реаформ, 2007, с. 176

94. Дыбовская Ю.Н. диссер. к. физ-мат наук Применение расчетов электростатического поля белков для анализа взаимодействия полиэлектролитов с белками 2009.

95. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами. Докл. АН СССР, 1984, т. 275, с. 1120-1123.

96. Кабанов В.А., Мустафаев В.И. Влияние ионной силы и pH среды на поведение комплекса БСА с поли-4-винил-Ы-этилпиридинийбромидом в водных растворах. ВМС А, 1981, т. 23, с. 255-260.

97. Казакова Л.И., Дубровский A.B., Мошов Д.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И., Электронно-микроскопическое исследование структуры полиэлектролитных микрокапсул, содержащих и не содержащих белок. Биофизика. 2007. т. 52 (5). с.850-854.

98. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. «Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология», Издательство: Научный мир, 2005 г.

99. Купцова C.B. Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами. Диссертация канд. хим. наук, М.: 2000,128 с.

100. Ларионова Н.И., Унксова И.П., Миронов В.А., Сахаров И.Ю., Казанская Н.Ф:, Березин И.В. Исследование комплексообразования растворимых карбоксиметиловых эфиров полисахаридов с белками. ВМСА, 1981, т. 23(8), с. 1823-1829.

101. Меньшикова В.В. Методики клинических лабораторных исследований. М.: Лабора. 2009, с. 304

102. Мустафаев М.И. Комплексы неприродных полиэлектролитов с белками. Диссертация докт. хим. наук, М.: МГУ, 1981,344 с.

103. Сабурова Е.А., Бобрешова М.Е., Елфимова Л.И., Сухоруков Б.И. Ингибиторный действие полиэлектролитов на олигомерный фермент Биохимия 2000 Т. 65, № 8, с. 976-985.

104. Самсонов В.Г. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активные вещества. ВМС А, 1979, т. 21(4), с. 725-733.