Изучение механизмов ингибирующего действия полиэлектролитов в отношении парамиксо - и ортомиксовирусов

Артюшенко, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов ингибирующего действия полиэлектролитов в отношении парамиксо - и ортомиксовирусов
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов ингибирующего действия полиэлектролитов в отношении парамиксо - и ортомиксовирусов"

4858701

На правах рукописи

АРТЮШЕНКО Сергеи Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ В ОТНОШЕНИИ ПАРАМИКСО - И ОРТОМИКСОВИРУСОВ (КОРЬ И ГРИПП)

03.02.02 - вирусология 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

- 3 коя 2011

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2011

4858701

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Надежда Васильевна Юминова Николай Александрович Контаров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Виктор Николаевич Ляпустин Анатолий Ахсарбекович Катаев

Ведущее учреждение:

ФБГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России

Защита состоится «24» ноября 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «21» октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^.В. Яковлева

Актуальность проблемы

Известно, что ряд веществ обладает повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов (Дурденко Е.В. и др., 2011). Одними из таких веществ являются полиэлектролиты (ПЭ) - полимеры, в состав молекул которых входят группы, способные в растворе к ионизации. Известно, что ПЭ обладают повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов. Также известно, что некоторые ПЭ обладают выраженным иммуностимулирующим действием в отношении Т- и В-лимфоцитов (P.M. Хаитов и др., 2003). Однако, на данный момент практически ничего не известно о влиянии используемых в работе ПЭ на вирусные белки и вирусную оболочку. В ряде работ (Haldar J, An D, 2006, Slita A.V., 2007) указывается на наличие у определенных ПЭ антимикробной активности и вирусингибирующего действия в отношении вируса простого герпеса 1 типа, но отсутствует подробное описание механизмов наблюдаемых явлений. В нашей работе было изучено взаимодействие ПЭ с поверхностными антигенными белками и вирусной оболочкой, а также противовирусная активность полиэлектролитов в отношении вирусов гриппа и кори.

Грипп - высококонтагиозное вирусное заболевание людей, птиц и млекопитающих. Грипп обладает уникальными инфекционными свойствами, а именно склонностью к крупным вспышкам (эпидемиям и даже пандемиям), и является единственной инфекцией, вызывающей в последние столетия пандемии. Гриппозные пандемии характеризуются глобальным распространением болезни с поражением всех возрастных групп населения. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится 90% регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных, из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет 87% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. В течение 2005-2011 гг. выявлены изменения в эпидемиологии гриппа животных.

Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Новый штамм вируса гриппа A/H|N|/California/04/09 впервые выделен весной 2009 года в Калифорнии и Мексике. Быстрое распространение нового вируса послужило причиной объявления Всемирной организацией здравоохранения VI фазы развития пандемии. На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были бы отмечены случаи заболевания гриппом, вызванным пандемическим вирусом H[Ni - 2009 (Johnson N.P et al.,2010). Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся антигенным разнообразием вируса гриппа. Поэтому при появлении нового штамма необходимо заниматься созданием новой вакцины, что экономически невыгодно.

В связи с этим появление нового класса препаратов с вирусингибирующим действием на полиэлектролитной основе может решить данную проблему за счет его сочетанного воздействия как на вирусные антигенные белки вне зависимости от подтипов гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N), так и на фосфолипидную мембрану вирионов, липидный состав которых практически не изменяется в процессе эволюции вирусов.

Корь — острое, высококонтагиозное, антропонозное вирусное заболевание, распространяющееся воздушно-капельным путём, и проявляющееся общей интоксикацией, характерной макуло-папулёзной сыпью на коже, катаром верхних дыхательных путей и конъюктив. Восприимчивость к кори всеобщая, контагиозный индекс составляет 95-96%. Заболеваемость наиболее высока в детском возрасте. В довакцинальный период корь была распространена повсеместно и являлась одной из основных причин смертности детей раннего возраста. В настоящее время в России реализуется программа элиминации кори и уровень заболеваемости этой инфекцией низок. Вместе с тем отмечается немало случаев заболеваний среди подростков и взрослых лиц, особенно в регионах Африки, их доля в общей заболеваемости высока. По данным ВОЗ в мире ежегодно

регистрируется до 30 млн. случаев заболевания корью, из которых более 500 тыс. заканчиваются летальным исходом (WHO, 2010).

Одновременной элиминации кори во всех 6 регионах мира не произойдёт (Зверев В.В., Юминова Н.В. и др., 2011). Еще в течение 7-15 лет в Европейском, Американском, Тихоокеанском и других регионах мира будет существовать серьёзная опасность заноса на эти территории неэндемичных диких штаммов вируса кори и возможно, возникновение вспышек этого тяжелого вирусного заболевания особенно среди взрослого населения. В этой связи, разработка новых химиолрепаратов, основой которых являются ПЭ, будет способствовать повышению эффективности методов лечения вирусных инфекций, за счёт комплексного, одновременного воздействия ПЭ на антигенные белки и вирусную мембрану, приводящая к инактивации вируса.

Цель исследования

Разработка теоретических и научно-практических основ химиотерапии оболочечных вирусов для создания и применения ПЭ, направленных на лечение высококонтагиозных вирусных инфекций на примере вирусов гриппа н кори.

Задачи исследования

1. Изучение полиэлектролитов, обладающих наиболее выраженным вирусингибирующим действием и выбор оптимальных нетоксических концентраций исследуемых полиэлектролитов.

2. Использование методов кругового дихроизма и белковой флуоресценции для оценки структурно-функциональной целостности поверхностных вирусных белков.

3. Разработка методики для оценки кинетических параметров нейраминидазной активности после взаимодействия с ПЭ.

4. Количественный анализ противовирусной активности ПЭ по отношению к вирусам гриппа и кори.

5. Выявление возможных механизмов вирусингибирующего действия выбранных ПЭ на различные штаммы вирусов гриппа и кори.

Научная новизиа

Впервые изучено влияние ПЭ полистиролсульфоната (ПСС) с различными степенями полимеризации и полиаллиламина (ПАА) с молекулярными массами 6 и 8 кДа на инфекционность различных штаммов вирусов гриппа и кори. Показано выраженное вирусингибирующее действие ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори, характеризующееся достоверным снижением инфекционного титра вирусов. Определён диапазон нетоксических концентраций для ПСС-8 - 1-40 мМ, и ПАА (6 кДа) - 1-40 мкМ, с 1С5о= 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно. Впервые для оценки воздействия ПЭ на структурно-функциональные состояния антигенных вирусных белков были использованы методы кругового дихроизма и белковой флуоресценции. Для изучения изменения физико-химических параметров вирусной мембраны после взаимодействия с используемыми в работе ПЭ впервые в качестве экспериментальных моделей были использованы плоские бпслойные липидные мембраны (БЛМ). Определены константы скорости инактивации нейраминидазы ПСС-8 и ПАА. Определен тип ингибирования нейраминидазы указанными ПЭ. Выявлены возможные механизмы вирусингибирующего действия ПЭ на поверхностные вирусные белки и фосфолипидную мембрану вирионов.

Практическая значимость работы

Использованные в работе методические приемы могут быть использованы исследователями для изучения структурно-функциональных изменений вирусных белков и оболочки вирусов.

Полученные автором данные позволяют научно обосновать перспективу создания новых лекарственных средств на основе исследованных в работе полиэлектролитов для борьбы с высококонтагиозными вирусными инфекциями.

Апробация материалов диссертации ц публикации

Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010), научно - практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование

иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), научной конференции молодых учёных НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, 2011).

Апробация диссертации состоялась 14 июня 2011 г. на научной конференции отдела вирусологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Основные положения диссертации изложены в 7 печатных работах, в том числе в 3 журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 94 страницах машинописного текста, иллюстрированы 2 таблицами, 17 рисунками.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 120 работ отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Вирусы. В работе использовались очищенные штаммы вируса гриппа: А/ВЧП/Вейбридж (H7N7), А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (Н51М2), A/NIBRG-14 (HjN,) и вирус кори штамм J1-16 с исходным инфекционным титром 4,5 lg ТЦД5(у'мл и 3,0 lg ТЦД50/мл, соответственно.

ПЭ: Растворы ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430 («Sigma», США) готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Раствор ПАА с молекулярной массой 6 и 8 кДа («Sigma», США), готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 9,0, содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Концентрацию ПЭ в растворе рассчитывали относительно заряженных групп, конечная концентрация ПЭ составляла 180 мМ для ПСС и 1-80 мкМ для ПАА. ПЭ представлены на рис.1.

Рис. 1

-СН-СН2-

НгС

NHz

J п

so3

ПАА

ПСС

Спектры флуоресценции и кругового дихроизма. Спектры флуоресценции поверхностных вирусных белков регистрировали на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) в термостатируемой кювете с длиной оптического пути 1,0 см при возбуждении светом с длиной волны 295 нм. Спектры кругового дихроизма регистрировали на дихрографе Jasco J-810 (Япония) в термостатируемой кювете с длиной оптического пути 0,1 см при длине волны 222 нм.

Титрование вирусов. Титрование вируса кори осуществлялось в перевиваемой культуре клеток Vero (состав поддерживающей среды: питательная среда ДМЕМ (ФГУП "НПО "Микроген" РФ), пенициллин-стрептомицин (Gibco, США), 10% фетальная бычья сыворотка (Gibco, США), концентрация клеток составляла 2,5-106 кл/мл. С целью определения ЦПД вирусы гриппа титровали в перевиваемой культуре клеток линии MDCK (состав поддерживающей среды: питательная среда RPMI-1640 (ФГУП "НПО "Микроген" РФ), ТРСК — трипсин (три-тозил-1-фенилаланилхлорэтилкетон) в конечной концентрации 2 мкг/мл, пенициллин - стрептомицин (Gibco, США), 10% фетальная бычья сыворотка (Gibco, США), концентрация клеток составляла примерно 2,0-106 кл/мл, инфекционный титр по ЦПД рассчитывался по методу Рида-Менча в модификации Томпсона (Tompson et al., 1948). Добавление ПЭ в поддерживающую среду проводили через 30 мин после инфицирования клеточного монослоя. Исследование за кинетикой снижения инфекционного титра проводилось в течение 7 суток. Множественность заражения для всех вирусов составляла 0,01 ТЦД50/КЛ.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов осуществляли с применением методов параметрической статистики и однофакторного дисперсионного анализа, используя пакет программ Statistica 6,0.

Получение вирусных белков. Поверхностные вирусные белки, используемых в работе вирусов (гемагглютинин вируса гриппа - Н, F - белок вируса кори), получали с помощью инкубирования их в водном растворе

октил-Р-О-глкжогшранозида. Нуклеопротеид отделяли от смеси вирусных белков с помощью ультрацентрифугирования. Детергент удаляли диализом против бидистиллированной воды. Неструктурные белки вирусов изолировали с помощью препаративного электрофореза вирусных белков в полиакриламидном геле после дезинтеграции вирионов в додецилсульфате натрия. Додецилсульфат натрия удаляли диализом против бидистиллированной воды. Чистоту препарата контролировали с помощью диск-электрофореза.

Бислойные лнпидные мембраны. БЛМ формировали по методу Мюллера (Mueller P. et al., 1968) на отверстии в тефлоновой кювете диаметром 0,5 мм в растворе 0,2 М KCI + 5 мМ трис - НС1, рН - 7,4. Для формирования БЛМ использовали раствор азолектина в н-гептане концентрации 26 мг/мл. Все измерения проводились при 25°С. Вирусные белки и ПЭ добавляли к БЛМ с одной стороны кюветы в количествах соответствующих конечным концентрациям 10*6 - 3,2-10"6 М и 30-10 3 М, соответственно. Концентрации вирусных белков определяли по методу Лоури (Lowry О. et al. 1951).

Коэффициент поверхностного натяжения. Измерения коэффициента поверхностного натяжения БЛМ основывалось на несимметричном изменении гидростатического давления буферного раствора при опускании электрода в одну из сторон кюветы. При этом избыточное гидростатическое давление компенсируется действием сил поверхностного натяжения:

. AS pgh = — R '

где Р - плотность раствора, g - ускорение свободного падения, h -разность уровней, R - радиус мембраны, <> - коэффициент поверхностного натяжения.

Цитотоксичность препаратов. Цитотоксичность действия полимеров оценивали по жизнеспособности клеток, которую определяли с помощью МТТ — теста (колориметрический тест определения митохондриальных

дегидрогеназ) (Niks М, Otto М, 1990). Клетки рассеивали в 96-луночные планшеты по 2,5-104 клеток линии MDCK и Vero в лунку в питательной среде RPMI-1640. Через одни сутки её удаляли и добавляли питательную среду без сыворотки с исследуемыми ПЭ (конечная концентрация от 1 до 80 мМ для ПСС и от 1 до 80 мкМ для ПАЛ) или без них. После 1,5 часов инкубации клеток при 37°С инкубационную среду удаляли и вносили свежую среду. В каждую лунку добавляли 0,5 мг/мл МТТ - реагента (3-(4,5-диметилтиазолил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) («Sigma», США) в фосфатно-буферном растворе и инкубировали 2 часа 40 минут при 37°С в атмосфере 5% С02. О количестве жизнеспособных клеток судили по изменению величины оптической плотности на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) при длине волны 570 им.

Оценка выживаемости клеток. Выживаемость клеток оценивали с использованием трипанового синего. Клеточную суспензию вносили по 105 клеток линии MDCK и Vero в лунку планшета в питательной среде без сыворотки и инкубировали с ПЭ (конечная концентрация 1-80 мМ для ПСС и 1-80 мкМ для ПАА (6 кДа)) или без них при 37°С в течение 30, 60 или 90 минут. Затем клетки окрашивали 0,2%-ным трипановым синим и через 5 минут подсчитывали количество живых (с интактной мембраной) и неживых (с повреждённой мембраной и потому окрашенных) клеток, используя камеру Горяева.

Определение 1С50. С целью определения 1С50 ПЭ использовали ПАА (6 кДа) и ПСС-8 в диапазоне конечных концентраций 1-40 мкМ и 1-40 мМ, соответственно. IC_s0 определяли как концентрацию ПЭ, при которой инфекционный титр вируса по ЦПД уменьшался на 50% от исходного.

Определение активности нейраминидазы вируса гриппа. Использовали штаммы вируса гриппа после удаления низкомолекулярных ингибиторов нейраминидазы диализом против бидистиллированной воды. Субстратом нейраминидазы являлся фетуин («Sigma», США) в конечных концентрациях от 0.052 до 1,2 мкМ для ПАА (6 кДа) и от 0,052 до 1,2 мМ

для ПСС-8. Для построения калибровочной кривой готовили ряд пробирок, содержащих от 5 до 40 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты («Sigma», США) в 0,2 мл 0,2 М фосфатно-буферного раствора, рН = 6,0. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 0,1 мл перийодатного реагента, тщательно перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли 1,0 мл арсенитного реагента и перемешивали до тех пор, пока выпавший в осадок йод не растворится вновь. К смеси добавляли 2,5 мл тиобарбитуратного реагента, перемешивали и помещали на 15 мин в кипящую водяную баню. При этом смесь становилась темно-розовой, но при охлаждении бледнела. К смеси добавляли 4 мл бутанолового реагента (N-бутанол, содержащий 5% по объему концентрированной НС1) и интенсивно встряхивали, чтобы экстрагировать окрашенное вещество. Пробирки центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге при комнатной температуре, отбирали водную (нижнюю) фазу и определяли на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) величину поглощения при длине волны 549 нм с соответствующим контролем (Мейхи Б., 1988).

Определение типа ингибировапня нейраминидазнон активности вируса гриппа ПЭ комбинированным методом Диксона и ЛаГшуивера-Берка.

Метод Диксона обладает тем преимуществом по сравнению с методом Лайнуивера-Берка, что он позволяет определять значение константы ингибирования непосредственно из кинетических данных, не прибегая к дополнительным построениям. С другой стороны, график в координатах Диксона не позволяет отличить смешанный тип ингибирования от конкурентного или неконкурентного ингибирования, как это можно сделать в координатах Лайнуивера-Берка. Поэтому в ряде случаев ингибирования наиболее эффективным методом обработки экспериментальных данных является совместный анализ графиков в координатах Диксона и Лайнуивера-Берка (Butterworth Р., 1972).

Результаты собственных исследовании и их обсуждение

1. Исследование токсичности используемых полнэлектролитов.

Оценка токсичности полиэлектролитов ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430, ПАА с молекулярной массой 6 и 8 кДа проводилось по данным выживаемости и жизнеспособности клеток линии MDCK и Vero. Жизнеспособность клеток оценивали по результатам МТТ-теста. Выживаемость клеток оценивали путём подсчёта клеток, окрашенных трипановым синим, в камере Горяева. На основе данных по жизнеспособности клеток линии MDCK был определён нетоксический диапазон концентраций для ПСС всех степеней полимеризации, который составил 1-40 мМ (Рис. 2, данные приведены для ПСС-8).

Рис. 2

Жизнеспособность клеток линии MOCK по данным МТТ - теста (оценка активности митохондриальных дегидрогеназ) после добавления различных концентраций ПСС - 8 (р<0,05)

120 -i

5 m-rh г+1 г+1 ñ г+1 г-ь

6 80- РП i-4-i

к 1 10 20 30 40 50 60 70 80

Концентрация ПСС,С, мМ

Оценка жизнеспособности клеток после взаимодействия с ПАА с молекулярными массами 6 и 8 кДа показала, что для ПАА (6 кДа) характерен нетоксический диапазон 1-40 мкМ (рис.3), в то время как ПАА (8 кДа) оказывал выраженный токсический эффект на клетки уже при концентрации 30 мкМ (рис.4). В результате исследований была также получена зависимость

доли живых клеток от степени полимеризации ПСС для различных концентраций (1-80 мМ) по данным окрашивания клеток трипановым синим (табл.1).

Таблица I

Зависимость выживаемости клеток линии \1DCK от концентрации ПСС н ПАА (6 кДа) (окрашивание трипановым синим).

Концентрация ПЭ, мМ (для ПСС), мкМ (для ПАА) Доля живых клеток, %

ПСС-8 псс- 31 псс- 77 псс- 170 псс- 360 псс- 430 ПАА (6 кДа)

0 100 100 100 100 100 100 100

1 100 98± 2 97± 3 97±2 96 ±2 96± 2 95±2

10 100 95±2 95±1 95±2 95±1 94±2 100

20 100 90±2 87±2 84±2 80±2 80±2 100

30 97±1 85±1 80±2 74±2 67±1 61±2 99±1

40 85±2 74±2 71±1 60±2 57±3 52±1 90±2

50 80±2 65±2 59±2 54±1 49±2 46±2 86±2

60 52±2 40±1 38±2 37±2 32±1 28±2 54±2

70 36±1 35±2 31±2 28±2 26±2 22±2 41±2

80 29±2 25±2 20±2 16±2 14±2 10±2 34±2

Жизнеспособность клеток линии МйСК по данным МТТ - теста после добавления различных концентраций ПАА (6 кДа) (р<0,05)

J±L

10 20 30 40 50 60 70 80 Концентрация ПАА (6 кДа), С, мкМ

Из полученных данных можно заключить, что наибольший процент выживших клеток после взаимодействия с ПСС с различными степенями полимеризации и ПАА (6 кДа) наблюдается при концентрациях 1-40 мМ для ПСС и 1-40 мкМ для ПАА (6 кДа).

ПАА (8 кДа) обладал высокой токсичностью при более низких концентрациях (начиная с 30 мкМ), чем ПАА (6 кДа) и поэтому не использовался в последующих исследованиях. Для клеток линии Vero получены идентичные результаты по оценки жизнеспособности и выживаемости клеток для ПСС и ПАА.

Жизнеспособность клеток линии МйСК по данным МТТ - теста после добавления различных концентраций ПАА (8 кДа) (р<0,05)

Концентрация ПАА (8 кДа), С, мкМ

Дальнейшим этапом исследований явилось изучение вирусингибирующего действия указанных ПЭ в отношении вирусов гриппа и кори.

2. Изучение влияния ПЭ на инфекцнонность вирусов кори п гриппа.

В последние годы появилось большое количество исследований, посвященных изучению взаимодействия различных ПЭ с белками и ферментами. В отношении изучения влияния ПЭ на вирусные белки на данный момент практически ничего не известно.

Чтобы восполнить этот пробел в представленной работе было впервые подробно изучено взаимодействие ПСС и ПАА (6 кДа) с поверхностными белками вирусов кори и гриппа. Используемые в работе ПЭ выбраны не случайным образом. Известно, что ПЭ имеющие неполярный остов и, соответственно, высокую гидрофобность способны к разрушению структуры белка, в то время как ПЭ с полярным остовом, наоборот, защищают белковые структуры от повреждения. Одним из таких веществ является, например, декстрансульфат. В настоящей работе было изучено

влияние данных ПЭ на инфекционность вирусов кори и гриппа. После взаимодействия ПСС и ПАА (6 кДа) с вирусами кори и гриппа наблюдалось снижение инфекционного титра в среднем на 3,0 lg ТЦД50/мл. С помощью методов белковой флуоресценции и кругового дихроизма выявлено разрушающее действие ПСС и ПАА (б кДа) на поверхностные белки вирусов кори и гриппа.

По результатам оценки ЦПД вирусов кори и гриппа в культуре клеток Vero и MDCK. после взаимодействия с 30 мМ ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430 наиболее выраженным вирусингибирующим действием обладает ПСС-8. Взаимодействие вирусов кори и гриппа и ПСС с другими степенями полимеризации не приводило к достоверному снижению инфекционного титра вируса. ПАА (6 кДа) в концентрации 30 мкМ обладал еще более выраженной противовирусной активностью (рис.5а, 56). Отсутствие противовирусной активности у ПСС, имеющих степени полимеризации больших восьми, связано с уменьшением подвижности данных ПЭ при связывании с противоионами поддерживающей среды клеточных культур.

Анализ спектров кругового дихроизма показал, что ПСС-8 и ПАА (6 кДа) оказывают выраженное повреждающее действие на а- спирали поверхностных белков вирусов кори и гриппа. На рис. 6а, 66 приведены спектры кругового дихроизма, на которых видно уменьшение эллиптичности при длине волны 222 им, при которой определяются а-спиральные участки белков. Как видно из рис. 7а, 76, интенсивность флуоресценции вирусных белков падает при добавлении ПСС-8 и ПАА (6 кДа) по сравнению с контролем, что также указывает на повреждение вторичной структуры поверхностных вирусных белков.

Кинетика снижения инфекционного титра вируса корн

4 5

Время инкубации, сут.

•-».....3 4 -*- 5 е

1- добавление к вирусу 30 мкМ ПЛА (6 кДа). 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8. 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31. 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 5 -добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360. 7 -добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430. 8 - контроль вируса.

Рис. 56

Кинетика снижения инфекционного ти гра вируса гриппа

! -1- 2 -1-Г-Г- 1 3 4 5 6 Время ннкубацнн, сут. 7 8

| — 2 3 — 4 -<—5 —»6 -7 - 8

1 - добавление к вирусу 30 мкМ ПЛА (6 кДа). 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8. 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31. 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77. 5 -добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170. 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360. 7 -добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430. 8 - контроль вируса.

20000

15000

10000

5000

-юооо

Спектры кругового дихроизма антигенных белков вируса кори

Рис.6а

100

150

200

Длима волны, Л, км 3 4 —5 -

1 - контроль вируса. 2-добавление к вирусу 30 мМ Г1СС-8. 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170. 5 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 7 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31,8- добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа).

Рис. 66

Спектры кругового дихроизма антигенных белков вируса гриппа

20000

10000

5000

с к т

\\ ч\

100

200

--250

-5000

-10000

-15000

-20000

Длина волны, л, им

I - контроль вируса, 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31. 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170. 5 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 7 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 8 - добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа).

300 320 340 360 380 400 420

Длина волны, А,нм -1 -»-2 -3

Спектры белковой флуоресценции антигенных белков вируса кори

I - контроль вируса, 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 -добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа).

Рис. 76

250 1

о с

-е-

Спектры белковой флуоресценции антигеных белков вируса гриппа

Длина волны, Я.нм

1 - контроль вируса, 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа).

Из полученных результатов можно сделать вывод, что механизм вирусингибирующего действия ПСС-8 и ПАА (6 кДа), который проявляется достоверным снижением инфекционного титра вирусов кори и гриппа, заключается в повреждении исследуемыми ПЭ вторичной структуры вирусных белков, а именно их а - спиральных участков. Можно предложить два механизма разрушительного действия ПСС-8.

Первый механизм заключается в связывании данного ПЭ с противоположно заряженными группами белка, что, в свою очередь, приводит к образованию крупных петель либо массивных «хвостов», которые в силу высокого вращательного момента становятся разрушительными. Второй механизм, касающийся не только ПСС-8, но и ПАА (6 кДа), основан на повреждающем действии вторичной структуры поверхностных вирусных белков с помощью гидрофобного остова указанных ПЭ с образованием ПЭ - белковых комплексов.

Таким образом, полученные в данной работе результаты указывают на наличие как у поликатионов, так и у полианионов выраженного вирусингибирующего действия, что может послужить основанием для разработки нового противовирусного лекарственного препарата на основе вышеуказанных соединений.

Методы белковой флуоресценции и кругового дихроизма можно рекомендовать к применению с целью выяснения повреждающего действия вторичной структуры белков, входящих в состав различных иммунобиологических препаратов, например вакцин.

3. Изучение влияния ПЭ на физико-химические свойства бнслоиной лиинднои мембраны.

Перед исследованием взаимодействия ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ было изучено влияние вирусных белков на поверхностное натяжение БЛМ. При встраивании Р - белка вируса кори и Н вируса гриппа в БЛМ обнаружено увеличение коэффициента поверхностного натяжения мембраны (рис.8), что может быть связано с глубоким проникновением

указанных белков в фосфолипидный слой БЛМ. Вследствие этого происходит изменение упаковки липидных молекул и соответствующее увеличение поверхностной энергии бислоя.

При исследовании взаимодействия соединений ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ было показано, что препараты изменяют упругость бислоя и нарушают встраивание поверхностных белков в БЛМ клетки. Увеличение коэффициента поверхностного натяжения мембраны в присутствии ПЭ (ПСС-8 - д = 2,4-10"7 Дж/см2, ПАА (6 кДа) - 2,5-Ю'7 Дж/см2) в 2,5 раза по сравнению с контролем может существенно влиять на изменение локальной кривизны мембраны и образования спикул в местах адсорбции белков, что наряду с изменением упругости бислоя может затруднять слияние вириона с клеточной мембраной и препятствовать самосборке вирусной оболочки и отпочковыванию вириона от мембраны.

Рис. 8

Изменение поверхностного натяжения БЛМ при адсорбции различных концентраций вирусных белков.

3.0т

т т

& 2

о «

X ю

а а

2 |

~ к н

3 4 5

Концентрация, С10АМ

■ - - адсорбция Н (Н7Ы?) —■•— адсорбция Р-белка — адсорбция Н (Н Ц,)

ПСС-8 30 мМ

Изменение поверхностного натяжения мембраны и ее упругости в результате адсорбции вирусных белков ведет к изменению поверхностной энергии монослоев, что, в свою очередь, влияет на изменение упругой энергии и может приводить к локальному изменению спонтанной кривизны мембраны, а также к нарушению адсорбции вирусных белков в билипидную мембрану в областях контакта с ПЭ. В результате такого изгиба БЛМ выпуклым будет монослой с меньшим поверхностным натяжением. Все описанные выше процессы также приводят, в свою очередь, к невозможности слияния вируса с клеткой и самосборке вирионов.

Таким образом, проведенное исследование по изучению взаимодействия ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ выявило принципиально новый механизм ингибирования вирусной активности ПЭ, основанный на изменении механических свойств мембран.

4. Изучение ингибирования нейраминидазы (¡4) ПЭ ПСС-8 и ПАА.

Причиной снижения инфекционное™ служит не только повреждение вторичной структуры гемагглютинина вируса гриппа, но и повреждение нейраминндазы, проявляющееся в ингибировании ее ферментативной активности. В связи, с чем было необходимо количественно оценить минимальную ингибирующую концентрацию 1С50 (табл.2).

Таблица 2

Определение 1С50 для ПСС-8 и ПАА (6 кДа).

Штаммы вирусов гриппа 1С50, иМ (для ПСС-8), мкМ (для ПАА)

ПСС-8 ПАА (6 кДа)

А/ВЧП/Вейбридж (Н7М7) 4,0 ± 0,5 2,0 ±0,5

А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (Н^) 3,8 ± 0,3 1,8 ±0,4

А/1М1ВИС-14(Н5К,) 3,7 ± 0,5 1,65 ±0,2

Полученные результаты указывают на достаточно эффективное ингибирование нейраминидазной активности ПСС-8 и ПАА (6 кДа). Определение наличия ингибирования нейраминидазы после взаимодействия

с указанными ПЭ показало необходимость выявления и типа ингибирования нейраминидазной активности.

5. Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ ПСС-8 и ПАА (6 кДа).

С целью определения типа ингибирования нейраминидазной активности ПСС-8 и ПАА (6 кДа) был использован комбинированный графический метод Диксона и Лайнуивера - Берка. Исходя из анализа полученных зависимостей можно сделать вывод о неконкурентном типе ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа со средней константой ингибирования К,= 1,6±0.08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К,= 1,7±0.085 мМ для ПСС-8 (рис.9).

Рис. 9

Определение в координатах Диксона константы неконкурентного ингибирования ПАА (6 кДа) нейрамнннджы вируса гриппа штамма A/NIBRG-14 (H5N1)

Концентрации субстрата (фетуин) I - 0.052 мкМ, 2 - 0.092 мк-М, 3 - 0,27 мкМ, 4 - 1.2 мкМ

В данном случае неконкурентный механизм ингибирования нейраминидазной активности вирусов гриппа ПЭ объясняется повреждением последними вторичных структур фермента и/или фермент-субстратного комплекса.

Выводы:

1. Выявлено выраженное ингибирующее действие полиэлектролитов ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори. Показано, что снижение противовирусной активности связано с уменьшением подвижности ПЭ в растворе при увеличении их степени полимеризации и молекулярной массы.

2. Показано, что наиболее выраженным вирусингибирующим действием в отношении вирусов гриппа и кори обладают ПСС-8 в нетоксическом диапазоне концентраций 1-40 мМ и ПАА (6 кДа) - 1-40 мкМ.

3. Рассчитаны средние значения 1С50 для ПСС-8 и ПАА (6 кДа) равные 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно.

4. Выявлены и изучены механизмы взаимодействия указанных ПЭ с поверхностными вирусными белками вирусов гриппа и кори, заключающиеся в повреждении поверхностных вирусных белков гидрофобным остовом ПЭ и увеличении поверхностного натяжения в вирусной оболочке.

5. Показана наибольшая эффективность методов кругового дихроизма и белковой флуоресценции, по сравнению с вирусологическими методами, в определении структурно-функциональной целостности вирусных белков.

6. Выявлен неконкурентный тип ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ со средней константой ингибирования К] = 1,6 ± 0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К, = 1,7 ± 0,085 мМ для ПСС-8.

7. Определён возможный механизм инактивации нейраминидазы гриппа ПЭ, заключающийся в последовательной инактнвации олигомеров фермента.

8. На основании результатов расчета констант скоростей прямой реакции инактивации нейраминидазы, показано, что при увеличении концентрации ПСС-8 и ПАА (6 кДа) происходит увеличение скорости инактивации фермента.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Контаров H.A. Изучение вирусингибирующего действия бораадамантана в отношении вируса гриппа / Юминова Н.В., Контарова Е.О., Артюшенко C.B., Бадаев Н.В., Зверев В.В.// Инфектология. — 2009. - Т.!. — №.2. — С.35-36.

2. Артюшенко C.B. Математический анализ эффективности элиминации кори в России / Контаров H.A., Юминова Н.В., Зверев В.В. // Инфектология. — 2010. - Т.2. — №.3. — С.49.

3. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паротита и краснухи в России / Контарова Е.О., Артюшенко C.B., Зверев В.В., Сидоренко Е.С. // Научно - практическая конференция Вакцинопрофилактика, проблемы и перспективы развития 28 октября 2010 г.Пермь. -С.148-152.

4. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори эпидемического паротита и краснухи: проблемы и реалии / Контарова Е.О., Сидоренко Е.С., Бадаев Н.В., Контаров H.A., Артюшенко C.B., Зверев В.В. // Материалы научно -практической конференции «Вакцинология 2010 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» 9-10 ноября 2010 г.Москва. - С.133.

5. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паратита и краснухи: задачи, проблемы и реалии. /Контарова Е.О., Бадаев Н.В., Артюшенко C.B. //Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2011. -№8.

_ С.40-44.

6. Артюшенко C.B. Влияние полиэлектролитов на инфекционность вируса кори / Контаров H.A., Юминова Н.В.; Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2011. — № 4.

С.36-40.

7. Артюшенко C.B. Изучение взаимодействия полистиролсульфоната со степенью полимеризации 8 и полиаллиламина с бислойными липидными мембранами. / Контаров H.A., Юминова Н.В. // Биофизика. - 2011. - Т.56. -№6 - С.995-998.

Подписано в печать 19.10.2011 г. Тираж 110 экз. Заказ № 2865 О] печатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07. факс (495) 621-70-09 \v\vw.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артюшенко, Сергей Владимирович

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Полиэлектролиты.

1.1.1. Основные свойства полиэлектролитных комплексов.

1.1.2. Основные свойства белок - полиэлектролитных комплексов.

1.1.3. Применение синтетических полиэлектролитов в биотехнологии.

1.2. Вирус кори.

1.3. Вирус гриппа.

1.3.1. Классификация вирусов гриппа.

1.4. Химиотерапия кори и гриппа.

1.5. Круговой дихроизм.

1.5.1. Плоско, циркулярно и эллиптически поляризованный свет.

1.5.2. Круговой дихроизм, эллиптичность и дисперсия оптического вращения.

1.6. Спектроскопия.

1.6.1. Абсорбционная спектроскопия.

1.6.2. Ультрафиолетовая и видимая спектральные области.

1.6.3. Спектрофотометры для измерений в УФ- и видимой областях.

1.6.4. Абсорбционная спектроскопия белков в УФ области.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1 Вирусы.

2.2. Полиэлектролиты (ПЭ).

2.3. Спектры флуоресценции и кругового дихроизма.

2.4. Титрование вирусов.

2.5. Статистическая обработка.

2.6. Получение вирусных белков.

2.7. Бислойные липидные мембраны.

2.8. Коэффициент поверхностного натяжения.

2.9. Цитотоксичность препаратов.

2.10. Оценка выживаемости клеток.

2.11. Определение 1С50.

2.12. Определение активности нейраминидазы вируса гриппа волны 549 нм с соответствующим контролем.

2.13. Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ комбинированным методом

Диксона и Лайнуивера-Берка.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование токсичности используемых полиэлектролитов.

3.2. Изучение влияния ПЭ на инфекционность вирусов кори и гриппа.

3.3. Изучение влияния ПЭ на физико-химические свойства бислойной липидной мембраны.

3.4. Изучение ингибирования нейраминидазы (14) ПЭ ПСС-8 и ПАА.

3.5. Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ ПСС-8 и ПАА (6 кДа).

3.6. Изучение кинетики инактивации нейраминидазы вируса гриппа после взаимодействия с ПСС-8 и ПАА.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов ингибирующего действия полиэлектролитов в отношении парамиксо - и ортомиксовирусов"

Известно, что ряд веществ обладает повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов [8]. Одними из таких веществ являются полиэлектролиты (ПЭ) - полимеры, в состав молекул которых входят группы, способные в растворе к ионизации. Известно, что ПЭ обладают повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов. Также известно, что некоторые ПЭ обладают выраженным иммуностимулирующим действием в отношении Т- и В-лимфоцитов [15]. Однако, на данный момент практически ничего не известно о влиянии используемых в работе ПЭ на вирусные белки и вирусную оболочку. В ряде работ [62,63] указывается на наличие у определенных ПЭ антимикробной активности и вирусингибирующего действия в отношении вируса простого герпеса 1 типа, но отсутствует подробное описание механизмов наблюдаемых явлений. В нашей работе было изучено взаимодействие ПЭ с поверхностными антигенными белками и вирусной оболочкой, а также противовирусная активность полиэлектролитов в отношении вирусов гриппа и кори.

Грипп — высококонтагиозное вирусное заболевание людей, птиц и млекопитающих. Грипп обладает уникальными инфекционными свойствами, а именно склонностью к крупным вспышкам (эпидемиям и даже пандемиям), и является единственной инфекцией, вызывающей в последние столетия пандемии. Гриппозные пандемии характеризуются глобальным распространением болезни с поражением всех возрастных групп населения. В России на грипп и

ОРВИ ежегодно приходится 90% регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных, из них 45-60% дети).

Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет 5

87% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. В течение 2005-2011 гг. выявлены изменения в эпидемиологии гриппа животных. Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Новый штамм вируса гриппа А/Н^/СаНГогшаЛМЛ^ впервые выделен весной 2009 года в Калифорнии и Мексике. Быстрое распространение нового вируса послужило причиной объявления Всемирной организацией здравоохранения VI фазы развития пандемии. На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были, отмечены случаи заболевания гриппом, вызванным пандемическим вирусом Н^! - 2009 [71]. Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся антигенным разнообразием вируса гриппа. Поэтому при появлении нового штамма необходимо заниматься созданием новой вакцины, что экономически невыгодно.

В связи с этим появление нового класса препаратов с вирусингибирующим действием на полиэлектролитной основе может решить данную проблему за счет его сочетанного воздействия как на вирусные антигенные белки вне зависимости от подтипов гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (И), так и на фосфолипидную мембрану вирионов, липидный состав которых практически не изменяется в процессе эволюции вирусов.

Корь — острое, высококонтагиозное, антропонозное вирусное заболевание, распространяющееся воздушно-капельным путём, и проявляющееся общей интоксикацией, характерной макулопапулёзной сыпью на коже, катаром верхних дыхательных путей и коньюктив. Восприимчивость к кори всеобщая, контагиозный индекс составляет 95-96%. Заболеваемость наиболее высока в детском возрасте. В довакцинальный период корь была распространена б повсеместно и являлась одной из основных причин смертности детей раннего возраста. В настоящее время в России реализуется программа элиминации кори и уровень заболеваемости этой инфекцией низок. Вместе с тем отмечается немало случаев заболеваний среди подростков и взрослых лиц, особенно в регионах Африки, их доля в общей заболеваемости высока. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется до 30 млн. случаев заболевания корью, из которых более 500 тыс. заканчиваются летальным исходом [30].

Одновременной элиминации кори во всех 6 регионах мира не произойдёт [29]. Еще в течение 7-15 лет в Европейском, Американском, Тихоокеанском и других регионах мира будет существовать серьёзная опасность заноса на эти территории неэндемичных диких штаммов вируса кори и возможно, возникновение вспышек этого тяжелого вирусного заболевания особенно среди взрослого населения. В этой связи, разработка новых химиопрепаратов, основой которых являются ПЭ, будет способствовать повышению эффективности методов лечения вирусных инфекций, за счёт комплексного, одновременного воздействия ПЭ на антигенные белки и вирусную мембрану, приводящая к инактивации вируса.

Цель исследования

Задачи исследования

4. Количественный анализ противовирусной активности ПЭ по отношению к вирусам гриппа и кори.

Научная новизна

Впервые изучено влияние ПЭ полистиролсульфоната (ПСС) с различными степенями полимеризации и полиаллиламина (ПАА) с молекулярными массами 6 и 8 кДа на инфекционность различных штаммов вирусов гриппа и кори. Показано выраженное вирусингибирующее действие ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори, характеризующееся достоверным снижением инфекционного титра вирусов. Определён диапазон нетоксических концентраций для ПСС-8 - 1-40 мМ, и ПАА (6 кДа) - 1-40 мкМ, с 1С50 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно. Впервые для оценки воздействия ПЭ на структурно-функциональные состояния 8 антигенных вирусных белков были использованы методы кругового дихроизма и белковой флуоресценции. Для изучения изменения физико-химических параметров вирусной мембраны после взаимодействия с используемыми в работе ПЭ впервые в качестве экспериментальных моделей были использованы плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ). Определены константы скорости инактивации нейраминидазы ПСС-8 и ПАА. Определен тип ингибирования нейраминидазы указанными ПЭ. Выявлены возможные механизмы вирусингибирующего действия ПЭ на поверхностные вирусные белки и фосфолипидную мембрану вирионов.

Практическая значимость работы

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Артюшенко, Сергей Владимирович

Выводы:

1. Выявлено выраженное ингибирующее действие полиэлектролитов ПСС-8 и ПА А (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори. Показано, что снижение противовирусной активности связано с уменьшением подвижности ПЭ в растворе при увеличении их степени полимеризации и молекулярной массы.

3. Рассчитаны средние значения ГС50 для ПСС-8 и ПАА (6 кДа) равные 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно.

6. Выявлен неконкурентный тип ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ со средней константой ингибирования К 1 = 1,6 ± 0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К 1 = 1,7 ± 0,085 мМ' для ПСС-8

7. Определён возможный механизм инактивации нейраминидазы гриппа ПЭ, заключающийся в последовательной инактивации олигомеров фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артюшенко, Сергей Владимирович, Москва

1. Ануфриева Е.В., Панарин Е.Ф., Паутов В.Д., Семисотнов Г.В., Соловский М.В. Изучение межмолекулярного взаимодействия в водных растворах полимеров и поверхностно-активных веществ. // Высокомолек. соед. А. 1977. Т.19. № 6. С.1329-1335.

2. К. Холмберг, Б. Йёнссон, Б. Кромберг, Б. Линдман Поверхностно активные вещества и полимеры в водных растворах // М.: Бином. 2007.513с

3. Гуляева Г.А., Полетаева O.A., Калачов A.A., Касаикин В.А., Зезин А.Б. (1976) Изучение водорастворимых полиэлектролитных комплексов образованных полиакрилатом натрия и 5,6-ионен бромидом // Высокомолекулярные соединения 18, 2800 — 2805.

4. Изумрудов В.А., Зезин A.B., Кабанов В.А. (1986) Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов белков с полиэлектролитами // Доклады Академии Наук 291, 1150— 1153.

5. Автореферат канд. диссертации Стогова С.В., Москва, 2010.

6. Изумрудов В.А., Зезин A.B., Кабанов В.А. (1986) Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов белков с полиэлектролитами // Доклады Академии Наук 291, 1150— 1153.

7. Изумрудов В.А., Нуркова Т.Ю., Зезин А.Б., Кабанов В.А. (1987) Влияние длины цепи полианионов на направление и кинетику межполиэлектролитных реакций обмена // Высокомолекулярные Соединения 29, 474 — 478.

8. Дурденко E.B. Температурная стабильность лактатдегидрогеназы в комплексе с анионным полиэлектролитом полистиролсульфонатом / Е. В. Дурденко // Биофизика. 2010. - Т. 55, N4.-С. 594-604

9. Зезин А.Б., Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. //Успехи химии и физики полимеров. М.: Химия. 1973. С.З.

10. Изумрудов В.А., Ортега Ортиз О., Зезин А.Б., Кабанов В. А. (1996) Температурозависимые обратимые переходы полианионов в полиэлектролитных комплексах // Доклады Физ.-Хим. 349, 190— 192.

11. Кабанов В.А., Мустафаев М.И., Блохина В.Д., Агафьева B.C. (1980) Конкурентные взаимодействия фракций сывороточных белков при комплексообразовании с поликатионами // Молекулярная Биология 14, 64 —75.

12. Касаикин В.А. Полимер-коллоидные комплексы. // Дис. д.х.н. М.: МГУ. Хим. фак-т. 1988.

13. Харенко O.A., Харенко A.B., Калюжная Р.И., Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы — новые водорастворимые макромолекулярные соединения. //Высокомолек. соед. А. 1979. Т.21. №12. С.2719.

14. Литманович A.A. Композиции на основе поликомплексов: получение, модификация, взаимодействие с дисперсиями // Дисс. д.х.н. М.: МГУ. Хим.факультет. 1996.

15. Хаитов P.M., Некрасов A.B., Лыткина И.Н., Иванова A.C., Пинегин Б.В. О влиянии вакцинопрофилактики на уровни заболеваемости гриппов и ОРЗ // Журнал микробиологии, 1998, № 3, с.40-43. 3.

16. Марголин A.JI., Шенчук С.Ф., Изумрудов В.А., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов В.А. (1985) Белок-белковые взаимодействия в системах содержащих синтетические полиэлектролиты // Доклады Академии Наук 284, 997—1101.

17. Харенко О.А, Харенко A.B., Калужная Р.И., Изумрудов

18. B. А., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. (1979) Нестехиометрические полиэлектролитные комплексы — новые водорастворимые макромолекулярные компоненты // Высокомолекулярные Соединения 21, 2719—2725.

19. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов. // Успехи химии. 1982. Вып.9.1. C. 1447-1483.

20. Бронич Т.К. Реакции замещения в многокомпонентных полиэлектролитных системах. // Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ. 1986.

21. Юминова Н.В. Научные основы совершенствования вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита. // Автореферат.дис., док.наук., М., 1998, с.44.

22. Колышкин В.М. Некоторые аспекты транспортировки и хранения МИБП в системе «Холодовой цепи». / Колышкин В.М., Балдин С.Ю., Ночевный В.Т. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. № 5. С. 59-63.

23. Юминова Н.В. Проблемы вакцинации взрослых против кори. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Юминова Е.О. // Главврач. 2004. № 12.-С. 101-104.

24. Костинов М.П. Клиническое течение поствакцинальногопериода при введении отечественной дивакцины симмуномодуляторами. / Соловьева И.Л., Куссельман А.И., Микава

25. Е.И., Костинов М.П., Калманова В.П., Лукачев И.В., Юминова Н.В.,83

26. Колышкин В.М. // «Иммунокоррекция вакцинального процесса у лиц с нарушенным состоянием здоровья». Под ред. М.П.Костинова. М. МдВ.2006. -С. 86-101.

27. Юминова Н.В. Программа элиминации кори и снижениязаболеваемости эпидемическим паротитом: серомониторингнаселения. / Колышкин В.М., Александер С.К. Россошанская Н.В.,84

28. Жданов В.М., Фадеева JI.JI. Корь. В кн.: Вирусы и вирусные заболевания. Науч. обзор., М., 1964, с. 168-190.

29. Тарос JI.IO., Смородинцев A.A. / В кн.: Проблемы ликвидации кори. // Л., 1968, с.49-67.

30. Тарос Л.Ю. Опыт непосредственного выделения вируса кори на однослойных культурах почечной ткани морских свинок и фибробластах куриных эмбрионов. // Вопр.вирусол., 1963, № 3, с.316-322.

31. Выявление генома вируса кори в лимфоцитах периферической крови больных хроническим и острым гломерулонефритом./ H.H. Богомолова. Н.М. Чаплыгина, А.И. Атаулоханов и др. // Молек. генетика, микробиол. и вирусол., 1990,10, с.26-27.

32. В.Ф. Учайкин. Руководство по инфекционным болезням у детей. // М.: ПЮТАР-МЕД, 2001, с.193-207.

33. Постовит В.А. Детские капельные инфекции у взрослых. //Л.: Медицина, 1982, с.208.

34. Анисимова З.П., Живарева А.И., Сухарев В.М. Клиника современной кори. // Педиатрия, 1977, № I, с. 13-15.

35. Корягин В.Н. Особенности течения капельных инфекций у пзрослых. // Клин мед., 1982, № 8, с.76-80.

36. Зверев В.В., Маркушин С.С., Юминова Н.В. Корь. // С.Петербург, 2004, с.110.

37. Постовит В.А. Детские капельные инфекции у взрослых. // С.-Петербург, Теза, 1997, с.391.

38. Алтынбекова С.А., Кусельман А.И., Яковенко Э.И. Клннико-иммунологичсские особенности современной кори // Здравоохранение Казахстана, 1984.9, с.66-68.

39. Юминова Н.В., Краснова В.П., Ляшенко В.А. Иммунизируюшая и иммуномодулируюшая активность вируса кори в очагах коревой инфекции // Вопр. Вирусологии., М., 1996, № 3, с.141-141.

40. Иммунологические показатели у детей, находящихся в очагах коревой инфекции. /Н.В. Юминова В.П. Краснова, Н.В. Глазкова и др. // В сб.; Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных инфекции, т. I, М., 1996, с.90-94.

41. Кингсбери Д.У. Орто- и парамиксовирусы и их репликация. В кн.: Вирусология. В 3-х томах/ под ред. Б.Филдс, Д.Найпа. // М.: Мир, 1989. Т.2. - С. 446-486.

42. Кингсбери Д.У. В кн.: Вирусология. В 3-х томах/ под ред. Б.Филдс, Д.Найпа.//М.: Мир, 1989. Т.1. - С. 128- 145.

43. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: ГЭОТАР - Иедиа, 2005. - 356 с.

44. Киселев О.И., Исаков В.А., Шаронов Б.П., Сухинин В.П. Патогенез тяжелых форм гриппа // Вестн. РАМН. 1994. - №9. -С.32-36

45. Колобухина JI.B. Новые стандарты лекарственной терапии гриппа//РМЖ. 2005. - №21. - С. 1429-1431.

46. Слепушкин А.Н., Львов Д.К., Маринич И.Г. и др. Эпидемиологические особенности гриппа последних лет // Вопр. Вирусол. 1998. - №2. - С.59-62.

47. Федякина И.Т., Ямникова С.С., Галегов Г.А., Львов Д.К. Действия специальных противовирусных препаратов на репродукцию вирусов гриппа птиц А/Н5, изолированных в России // Вопр. Вирусол. 2005. - №4. - С.35-37.

48. Исаков В. А., Сельков С. А. и др. Современная терапия вирусных инфекций. Руководство для врачей // СПб.; М., 2004. — С. 53-55, 61-62.

49. К.Г. Гуревич Профилактика сезонных острых респираторных вирусных инфекций // Биомедицинский журнал Medline.ru. — 2001. — Т. 2. — С. 212—214.

50. Крейтис, М. Техника липидологии / М. Крейтис. М.: Мир, 1975. - С. 258-286.

51. Казанцев П., Матковский В. Справочник по инфекционным болезням // М.: Медицина, 1979. — С. 46-50.87

52. Сергеев А.Н., Сафатов А.С., Генералов В.М. и др., Высокопатогенный грипп птиц за рубежом и в России : стратегии борьбы и профилактики. // Проблемы особо опасных инфекций, 2006 г., Т.91, стр.5-10.

53. Учайкин В.Ф., Диагностика, лечение и профилактика гриппа и острых респираторных заболеваний у детей, М., 2004 г., 14с.

54. Осидак JI.B., Дриневский В.П., Ерофеева М.К., и др., Грипп как проблема 21 века // Детские инфекции, 2004 год, №5, стр.54-57.

55. Онищенко Г.Г., Шестопалов А.М., Терновой В.А., и др., Изучение высокопатогенного H5Ni вируса гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири // ЖМЭИ, 2006, №5, стр.47-54.

56. Сердюк И.Н., Методы в молекулярной биофизике, Т.1, Москва, 2010 г.

57. Березин И.В., Клесов А. А., Практический курс химической и ферментативной кинетики, МГУ, 1976 г.

58. Stoll S., Chodanovski P. Polyelectrolite adsorption on an oppositely charged spherical particle. Chain rigidity effects // Macromolecules. 2002. V.35. P. 9556-9562.

59. Baes C. F., Messmeur R. E. The Hydrolysis of Cations // London-Sydney. Wiley-Intersci. 1976. 489p

60. Baker JR. Jr., Bielinska A.U., Kukovka-Latallo J. F., Dendrimer-mediated cell in vitro // Methods Mol Biol. 2004. - V.245. -P. 67-82.

61. Measles./ D.A.F. Robenson, E.C. Guy, S.L. Zhang et al. // Lancet, 1987, 2, 8549, 9-11.

62. Acute measles in patients with and without neurological involvement: distribution of measles virus antigen and RNA./ T.K. Mocnch, D.L. Griffin, C.R. Obriccbt ct al. // J.lnfecl.Dis., 1988, 158:433442.

63. Degree and lenht of viremia in adults with measles./ D.N. Fortal, S. Aaranes, J. Blanding et al. // J.Infect.Dis., 1992, 166:421-424.

64. Mon H., Muller A.H., Klee I.E. Intelligent colloidal hybrids via reversible pH-induced complexation of polyelectrolites and silica nanoparticles. // J. Americ. Soc. 2003. №125 p.3712-3713.

65. Aekermann, H.-W., Dibow, M.S. Viriuses of procariotes // V.l. General properties of bacteriofages. CRC Press Boca Raton Fl. 1987. -P.151-154

66. Chen H., Deng G., Li Z. et al. The evolution of H5N, influenza viruses in ducks in southern China // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004.-Vol. 101. P. 10452-10457.

67. Hirai H., Chawanaya H., Toshima N. // J. Chem. Soc. Jpn. 1984. P. 1027 and Kobunshu Ronbunshu. 1986. V.43. P.161.

68. Clerk J., Fuller F., Bishop D. Tick-borne viruses structurally similar to orthomyxoviruses // Virology. 1983. Vol. 127. - P. 205-219.

69. De Jong M. D., Hein T.T. Vian influenza A // J. Clin. Virol. -2006. Vol. 35.-P. 2-13.

70. Thompson W.R. (1947) Bacteriol, Rev., 11,115.

71. Bachhammer H.M., Petzold G., Lunkwitz K. Salt effect on formation and properties of interpolyelectrolites complexes and their interactions with silica particles. // Langmuir. 1999. V.15. p.4306-4310.

72. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. FI5N1 influenza: a protean pandemic threat // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. -P. 8156-8161.

73. Guan Y., Shortridge K. F., Krauss S., Webster R. G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the «internal» genes of H5N1 viruses in Hong Kong // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P.9363-9367

74. Dautzerbeg H. In "Physical chemistry of polyelectrolites" Radevat. Ed.: M. Derer. N.Y. 2001.

75. Thalberg K., Lindman B., Bergfeldt K. Phase behavior of systems of polyacrylate and cationic surfactants. // Langmuir. 1991. V.7. P.2893-2898.

76. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza 1 viruses in the 1957 and 1968 pandemics //J. Viriol. 1989. - Vol. 63. - P.4603-4608.

77. Mueller P., D.O. Rudin, //Nature 217, 713 (1968).90

78. Stevens J., Corper A.L. Basler C.F., et al. Structure of the uncleaved human Hl hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus // Science. 2003. - Vol.21. - P.1744-1748.

79. Litmanovich A.A., Polyakova Ye.V., Papisov I.M. Phase Separation in Polymer-Particle-Solvent Sistem. // 2 International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems". Book of Abstracts. P 030. S -Pb. 1996.

80. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses // Microbiol. Rev. — 1992. — Vol. 56. -P.152-179.

81. Koopmans M, Wilbrink B., Conyn M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands // Lancet. — 2004. — Vol. 393. -P. 587-593.

82. Oxvord J.S., Hockley D.J. Ortomyxoviridse. In: Animal virus structure // London, 1987. P. 213-232.

83. Semple A.B. Epidimiology of the influenza epidemic in Liverpool in 1950-1951 // Proc. R. Soc. Med. 1951. - Vol.44. - P. 794796.

84. Walters J.H. Influenza 1918: the contemporary perspective // Bull. NY Acad. Med. 1978. Vol. 54. - P. 855-864.

85. Shien J.Y. and Glatz C.E. (1994) Precipitation of proteins with polyelectrolytes: role of polymer molecular weight. Macro molecular Complexes in Chemistry and Biology 16, 272-284.

86. Kirsh Yu.E., Pavlova N.R., Kabanov V.A. Europ. Polymer I., 1977, v. 10, p. 739.

87. Dubas S., Farhat T.R., Schienott I.B. Multiple membranes from "True" polyelectrolyte multilayers // J. Am. Chem. Soc. 2001. V.123. p.5368-5369.

88. Cohen Stuart M.A., Scheutjens J.M.H.M., Fleer G.J.J. Polymer Sei., 1980, v. 18,. № 3, p. 559.

89. Niks M., Otto M. 1990. Towards an optimized MTT assay. // J. Immunol. Meth. 130: 149—151.

90. Pergushov D.V., Remizova E.V., Feldthuzen Y., Zezin A.B. Miller A.H., Kabanov V.A. // J. Phys. Chem. 2003. V.107. p 8043-8046.

91. Hoffman A.S., Lewis R.W., Michaels A.S. Polymer Preprints, 1969, v. 10, p. 916.

92. Sheehan J.C, Hess G.P.J. Amer. Chem. Soc, 1955, v. 77, № 6,p. 1067.

93. Khorana H.G. Chem. Revs, 1953, v. 53, № l,.p. 145.

94. Lehn, J.-M. Supramolecular Chemistry / J.-M. Lehn. N.Y.: VCH, 1995.-271 p.

95. Lysenko EA, Chelushkin PS, Bromch TK, Eisenberg A, Kabanov VA, and Kabanov A V Formation of Multilayer Polyelectrolyte Complexes by Using Block Ionomer Micelles as Nucleating Particles //J Phys Chem B 2004 V 108 № 33 P 12352- 12359

96. Lowry O., Rozenbrouch N., Barr A., and Randall R., // J. Biol. Chem. 193,265 (1951).

97. Lysenko EA, Chelushkin, PS, Bromch, TK, Eisenberg, A, Kabanov, VA, Kabanov, A V Soluble Nanoparticles From Block Ionomer Micelles and Oppositely Charged Complexatmg Agents // Polym Prepr 2004 V 45, №2 P 244-245.

98. Zaikov G.E., Malkanduev Yu.A., Khashirova S.Yu., Esmurziev A.M., Martynenko A.I., Sivova L.I., Sivov N.A. Synthesis and potential radical copolymerization of new monomers based on diallylguanidine // J.Appl. Pol. Sei., 2004. V. 91. - P. 439-444

99. Sivov N.A., Khashirova S.U., Martinenico A.I., Popova N.I., Kabanova E.Yu. Biocide and toxic properties of polymers on the base ofvinil and diallyl monomers // European Polymer Congress. Moscow, 2005. June 27-july 1.-Ref5880.

100. Khashirova S.Y., Malkanduev Yu.A., Esmurziev A.M. Modificanion of cellulose by biocidal polyelectrolyte // Journal of Balkan Tribological Association. Vol. 14. -№ 1. - 2008. - P. 102-106.

101. Macknight, W.I. Self-assembled polyelectrolyt surfactant complex in nanoaqueous solvents and in the solide state / W.I. Macknight, E.A. Ponomarenko, D.A. Tirrell //Acc. of Chem. Res. 1998. V.31. №12. P.781-788.

102. Khashirova S.Y., Sivov N.A., Malkanduev Yu.A., Popova N.I., Zhansitov A.A., Taov O.A. Peculiarities of Radical Polymerization Reactions of Acrylate Guanidines // Modern Tendencies in Organic and Bioorganic Chemistry. Chapter 31. - 2008. - P. 353-358.

103. Sato T., Ruch R. Stabilisation of colloidal dispersion by polymer adsorption / New-York, 1980, p.50.

104. Mahy B. Virology a practical approach / UK, 1988.

105. Butteworth P. // J. Biochem. Biophys. Acta, 289, 251,1972

Информация о работе

Артюшенко, Сергей Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Изучение механизмов ингибирующего действия полиэлектролитов в отношении парамиксо - и ортомиксовирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы