Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микрокапсулы на основе природных полиэлектролитов для включения биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микрокапсулы на основе природных полиэлектролитов для включения биологически активных веществ"

На правах рукописи

Герстенбергер Мария Райнхардовна

МИКРОКАПСУЛЫ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова и в Институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (г. Потсдам, Германия).

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

кандидат

физико-математических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Российский химико-технологичекой университет им. Д.И.Менделеева

Защита состоится «¿»Л/ » июня 2004 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ имени М.В. Ломоносова (119831, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1). Автореферат разослан «_

¿г .» ,М-<КЛ_2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

С.Н.С., К.Х.Н. и /, Лютик А.И.

У Л-МЧПчк-

Василенко Иван Александрович Сухорукое Глеб Борисович

Варламов Валерий Петрович Василов Раиф Гаянович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Разработка и изучение новых надмолекулярных образований является одним из направлений бурно развивающихся нанотехнологий. К надмолекулярным образованиям относятся, в том числе, такие коллоидные частицы, как микрокапсулы, которые находят применение в различных областях прикладной химии, биохимии и фармакологии.

В 1998 году группой исследователей Института Макса Планка (Е. Donath et al) был предложен новый способ получения микрокапсул -послойная (Layer-by-Layer) электростатическая самосборка (Electrostatic Self-Assembly) противоположно заряженных ПЭ1 на коллоидных частицах микронных и субмикронных размеров. Данная технология позволяет получать микрокапсулы определенной формы и размера, зависящих от используемых матриц-ядер. Оболочка микрокапсул обеспечивает требуемые каталитические или аффинные свойства, стабильность, проницаемость, совместимость и регулирование высвобождения внутреннего материала капсулы.

Микрокапсулы, имеющие размер от нескольких десятков нанометров до микрометра, со стенками нанометровой толщины представляют как научный, так и технологический интерес, поскольку могут использоваться как новый перспективный тип микро- и наноконтейнеров для решения различных задач. В частности, включение белков и нуклеиновых кислот в многослойные пленки может найти применение в биотехнологии, например, в качестве средства доставки внутрь клеток ДНК и белка для получения вакцин и в генной терапии.

'Список использованных сокращений: АСМ - атомносиловая микро

биологически активные вещества, КМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, МФ-ядра - ядра из меламинформальдегида, ПЭ - полиэлектролиты, СЭМ - сканирующая электронная микроскопия, ТЭМ -трансмиссионная электронная микроскопия.

Данная технология микрокапсулирования, однако, до настоящего времени отрабатывалась только на микрокапсулах, состоящих из синтетических ПЭ. Получение при помощи послойной сборки микрокапсул на основе природных материалов не было описано и изучено.

В связи с этим, задачей нашей работы была разработка технологии получения микрокапсул на основе биополимеров.

Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им, М.В.Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» (регистрационный номер НИР: 1Б-5-866), а также в Государственном научном центре по антибиотикам по теме «Разработка новых лекарственных форм известных биологически активных веществ».

Часть работы выполнялась в Институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (Потсдам, Германия) в отделении «Поверхности», отделе «Полые капсулы» в группе «Полифункциональные микро- и нанокапсулы» под руководством к.ф.-м.н. Сухорукова Г.Б. в рамках программы «Софья Ковалевская», финансируемой фондом Александра Гумбольдта Министерства образования и исследований Германии.

Цель работы заключалась в разработке методов получения при помощи послойной сборки микрокапсул из биополимеров, перспективных для создания новых лекарственных форм и систем доставки макромолекул в клетки. Для успешной реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Подбор материалов и разработка способа получения микрокапсул из природных полимеров.

2. Изучение физико-химических свойств полученных микрокапсул.

3. Разработка методов визуализации микрокапсул.

4. Разработка способа получения микрокапсул, нагруженных белками и/или ДНК, и оценка эффективности включения таких микрокапсул в антигенпредставляющие клетки.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые получены микрокапсулы из биополимеров методом послойной адсорбции противоположно заряженных ПЭ.

Изучены различные физико-химические характеристики (размер, дисперсность, стабильность, проницаемость, возможность включения веществ различной природы (низко- или высокомолекулярных, гидрофильных или гидрофобных, положительно или отрицательно заряженных)) микрокапсул, полученных на основе различных ядер-матриц и состоящих из различных природных полисахаридов и пептидов.

Показана принципиальная возможность использования данной системы для транспорта биологически активных веществ внутрь клетки.

Разработанная технология микрокапсулирования позволяет получить стабильные, монодисперсные капсулы различного состава, размера и назначения. Данные микрокапсулы, нагруженные белками и ДНК, могут быть использованы для транслокации генетического материала в антигенпредставляющие клетки с целью создания вакцин против внутриклеточных патогенов (таких, как микобактерии туберкулеза, вирусы, токоплазма и т.д.). В этом случае антигенпредставляющие клетки способны активировать не только гуморальный иммунный ответ (то есть, продукцию антител), но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для эффективной элиминации зараженных патогеном клеток организма.

Благодаря технологии послойной сборки возможно совмещение в одном объекте нескольких свойств, что является большим преимуществом для получения систем направленной доставки лекарств (drug delivery systems).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Способ получения микрокапсул из природных полимеров на основе послойной адсорбции.

2. Свойства полученных микрокапсул.

3. Разработка метода визуализации микрокапсул с использованием рентгенографии и флуоресцентной спектроскопии.

4. Результаты включения белка и ДНК в микрокапсулы.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на летней школе Института Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей "Summerscool-2002" (Берлин, Германия, июль 2002), на I Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, октябрь 2002), на X Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, апрель 2003), на Международном конгрессе по нанотехнологиям "Nanomeeting-2003" (Минск, Беларусь, май 2003), а также на VIII Международном конгрессе по новым материалам и процессам «EUROMAT 2003» (8th European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes) (Лозанна, Швейцария, сентябрь 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, теоретической

части, экспериментальной части и выводов. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, содержит схем,_рисунков,_

таблиц, список цитируемой литературы включает_источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Разработка методов получения микрокапсул

Существующие методы микрокапсулирования имеют ряд недостатков, связанных с высокой полидисперсностью и большим размером частиц-носителей, а также неконтролируемой степенью загрузки активным компонентом. В 1998 году был предложен новый метод получения микрокапсул, основанный на поочередной адсорбции противоположно заряженных синтетических ПЭ на коллоидных частицах. В случае разрушения коллоидной - матрицы при условиях, в которых полимерная оболочка стабильна, образуется полая капсула определенного размера, формы и с требуемой толщиной стенки, обладающей необходимыми свойствами.

Для решения прикладных биотехнологических задач в настоящей работе было предложено использовать данную технологию для создания микрокапсул из биополимеров с различными способами включения БАВ.

1. Подбор полиэлектролитов

Необходимым условием образования капсульной стенки данной технологией является наличие заряда у используемых материалов. Такими являются как синтетические ПЭ, так и хитозан и его производные, белки, нуклеиновые кислоты, липиды, мультивалентные ионы и т.п.

В настоящей работе в качестве ПЭ, образующих капсульную стенку, были использованы биополимеры, представленные в таблице 1.

Таблица 1. Полиэлектролиты, использованные в качестве слоев

В качестве положительно заряженных ПЭ были использованы протамин сульфат (сальмин) (Prot) - полипептид, выделяемый из спермы лососевых рыб, имеющий молекулярный вес приблизительно 5 кДа, являющийся за счет большого содержания аргинина сильно щелочным поликатионным веществом; низкомолекулярный хитозан фирмы «Сигма», олигохитозан с молекулярным весом 4,5 кДа (o-Chit), предоставленный A. Bartkowiak (Институт полимеров Технического университета г. Щецин, Польша), являющийся продуктом химической деструкции коммерческого хитозана, а в качестве отрицательно заряженных ПЭ - натриевая соль

альгиновой кислоты (Л^) - полисахарид низкой вязкости, выделяемый из бурой водоросли Macrocystispyrifera, и натриевая соль декстран сульфата (Бех) - полисахарид, продуцируемый из сахарозы бактериями Leuconostoc mesenteroides с молекулярной массой 500 кДа.

Лекарственные препараты на основе указанных в таблице ПЭ внесены в действующие фармакопеи США, Европы и Российской Федерации и разрешены к применению.

2. Подбор матриц

Адсорбция противоположно заряженных ПЭ данной технологией осуществляется в водной суспензии на коллоидных частицах, имеющих поверхностный заряд. В качестве ядра для покрытия многослойными пленками могут быть использованы различные матрицы с размерами от 50 нанометров до нескольких десятков микрометров, такие как органические и неорганические коллоидные частицы, белковые агрегаты, биологические клетки и нанокристаллы лекарственных веществ.

В настоящей работе в качестве матриц для получения микрокапсул были протестированы сферические ядра диаметром более 2 мкм (для возможности наблюдения за процессом и соответственно разрешению конфокального лазерного сканирующего микроскопа) из меламинформальдегида, из карбоната кальция и карбоната марганца, из полимолочной кислоты и из сополимера молочной и гликолевой кислот (см. рис. 1) и из оксида кремния.

Ядра из оксида кремния обладают хорошей гомогенностью формы и размера, гладкой поверхностью, химически не активны, но растворяются в жестких условиях, при которых органические оболочки также разрушаются. Ядра из карбоната кальция с точки зрения биоразрушимости наиболее подходящие, но нестабильны и полиморфны, что обуславливает высокую полидисперсность. Кроме того, при нанесении альгинатного слоя на эти ядра наблюдается образование больших агрегатов, не поддающихся

разбиению при воздействии ультразвука, причиной чего, скорее всего, является гелеобразование.

Рисунок 1. СЭМ-изображения коллоидных частиц, использованных в качестве матриц

МФ-ядра во время растворения в соляной кислоте при рН 1,6 набухают и тем самым обуславливают разрушение стенки микрокапсул. Вторым их недостатком является склонность к нерегулируемому возникновению в присутствии полиэлектролитных сульфогрупп поперечных сшивок с аминогруппами, образующимися в меламинформальдегиде в результате гидролиза связи C-N-C и, соответственно, невозможности удаления остатков меламинформальдегида из капсулы (см. рис. 2).

Рисунок 2. СЭМ-изображение 12-слойных оболочек с неполностью растворенным МФ-ядроч

Ядра из полимолочной кислоты и из сополимера молочной и гликолевой кислот имеют большой разброс по размерам, кроме того, при растворении ядер соответствующей смесью растворителей, в состав которой входит ацетон, образованные на них оболочки разрушаются.

Таким образом, возникла необходимость поиска новых матриц, которые бы соответствовали следующим требованиям доступность сырья, относительная гомогенность формы, диаметр не менее 2 и не более 4 мкм, мягкие условия растворения, а также возможность полного удаления продуктов разрушения матрицы из микрокапсул. В группе «Полифункциональные микро- и нанокапсулы» нами были синтезированы частицы карбоната марганца и впервые использованы в качестве матриц для получения полых микрокапсул. Ядра были получены путем смешивания при комнатной температуре равных частей водных растворов МпБО.» (0,016 моль/л) и КНД-КЮз (0,16 моль/л), содержащих 0.5% этанола Добавление этанола приводит к получению монодисперсных шарообразных частиц определенного диаметра Промытые ацетоном и

высушенные на воздухе частицы, плотность которых составляет приблизительно 2 г/мл, хранятся в сухом виде при комнатной температуре.

3. Методы получения микрокапсул посредством послойной адсорбции В данной работе использовалась технология приготовления полых капсул, схема которой представлена на рисунке 3.

Рисунок 3. Схема получения полых капсул: (А) адсорбция отрицательно заряженного ПЭ (черный) на положительно заряженной поверхности коллоидной частицы; (В) адсорбция положительно заряженного ПЭ (серый) на поменявшей знак поверхностного заряда подложке; (С, D) последовательное повторение процедур А и В приводит к образованию структуры "ядро-оболочка"; (Е, F) растворение и удаление ядра, образование полой капсулы.

Нанесение слоев на коллоидные частицы осуществлялось двумя способами: 1) добавлением раствора с избыточной концентрацией ПЭ (удаление избытка осуществляется при помощи центифугирования или фильтрования во избежание образования полиэлектролитных комплексов в объеме); 2) добавлением раствора с соответствующей насыщенной адсорбции концентрацией ПЭ.

Первый способ требует наличия стадий отмывки несвязавшегося ПЭ. При центрифугировании в течение 10 минут с числом оборотов не более 5000 в минуту (во избежание образования агрегатов или разрушения

микрокапсул) возможно дальнейшее ресуспендирование действием ультразвука. Необходимо обратить внимание на обязательное проведение двукратной процедуры отмывки, аккуратное нанесение слоев и проведение щадящего поверхность ресуспендирования.

Способ фильтрования хорошо применим для получения больших объемов суспензий микрокапсул, его отличают также более мягкие условия образования капсул.

Из литературных данных известно, что используемые нами матрицы имеют положительный поверхностный заряд. Соответственно, первым слоем наносили полианион Alg, затем поликатион Prot. Для увеличения толщины стенки процедуру повторили трижды. В ходе экспериментов было установлено, что капсулы, содержащие менее 10 слоев, разрушаются в условиях растворения ядер. Однако, увеличение количества слоев не приводит к повышению стабильности микрокапсул, а обуславливает агрегацию и деструкцию капсул во время растворения ядра. Кроме того, недостатком альгината является гелеобразование, поэтому при дальнейшем нанесении использовали полианион Dex. Вследствие небольшого молекулярного веса, протамин только частично связывает отрицательные заряды длинной цепочки полисахарида, что приводит к нестабильности структуры. Для увеличения механической прочности капсул и выравнивания заряда многослойной пленки были также включены два слоя Chit. В случае, когда последним слоем является поликатион, наблюдается агрегация микрокапсул, таким образом, для увеличения монодисперсности суспензии последним слоем был нанесен декстран сульфат.

Карбонатные ядра были разрушены при уменьшении рН до 3.5 добавлением НС1 и удалены в процессе отмывки. Отсутствие атомов марганца в полученной водной суспензии полых микрокапсул было подтверждено исследованием элементного состава капсул, проведенного

при помощи рентгеноспекгрального анализа на основе метода энергетической дисперсии (EDX-детектор фирмы "Oxford instruments")

Рисунок 4. Микрофотографии полых (А1аФгоО-|/('Рех/Рго1'Ь/Рех-

капсул, полученные методами АСМ (сверху), ТЭМ и СЭМ (снизу)

В результате проведенной работы была получена 10%-ная водная суспензия стабильных монодисперсных полых микрокапсул диаметром 3 8±0 1 мкм, исследованная различными методами микроскопии (рис. 4)

Исследование свойств полученных микрокапсул

1. Исследование проницаемости стенок микрокапсул Одна из наиболее важных особенностей многослойных пленок -выборочная проницаемость для различных молекул. Проницаемость пленки зависит от толщины слоя, пористости, структуры, химического состава слоев и размера проникающих веществ. Несколько исследований в

этом направлении показали, что полые микрокапсулы, состоящие из 8 слоев натриевой соли поли(стиренсульфоната) и поли(аллил-амингидрохлорида), не пропускают макромолекулы, в то время как полярные низкомолекулярные вещества легко проходят через стенки

Проницаемость стенок и распределение заряда в микрокапсулах, полученных в данной работе, определяли по удерживанию таких низкомолекулярных флуоресцентных красителей, как отрицательно заряженные 6-карбоксифлуоресцеин (М 468), родамин В изотиоцианат (М 536) и положительно заряженные 6-карбоксиродамин (М 495) и 5,6-карбокситетраметилродамин (М430)

Рисунок 5. КМ-изображения в режиме фтуоресценции микрокапсул с родамином (слева) ( 525 нм) и 6-карбоксифлуоресцеином (справа) С_=48 8 нм)

При помощи конфокальной микроскопии (см рис. 5) было обнаружено, что внутреннее пространство капсул имеет слабый отрицательный заряд Скорее всего, это обусловлено переходом альгината, который наносится первым слоем, после растворения ядра внутрь капсулы Самое интенсивное свечение наблюдается в стенках капсул

2. Микрокапсулы для включения гидрофобных веществ

В современной фармакологии часто возникает необходимость солюбилизации и стабилизации гидрофобных лекарственных веществ, обладающих низкой биодоступностью. Одним из способов решения

данной проблемы может быть использование стенок капсул в качестве разделителя фаз. В настоящей работе была исследована возможность нагрузки полых капсул веществами, растворенными в гидрофобной среде.

Для визуализации микрокапсул последним слоем был нанесен протамин сульфат, конъюгированный с родамином. Затем полые капсулы были переведены в этанол многократным центрифугированием и ресуспендированием осадка в абсолютном этаноле.

В качестве гидрофобной среды было выбрано единственное растворимое в спирте масло - касторовое (rizinus oil), которое имеет плотность 0,96 г/мл. После инкубирования смеси маслохпирт (1:1) и спиртовой суспензии микрокапсул в ультразвуковой бане в течение 10 минут и дальнейшего испарения этанола (процедура была повторена многократно), была получена масляная суспензия полых микрокапсул.

Рисунок 6. КМ-изображение в режиме флуоресценции полых микрокапсул в масле

Исследование при помощи конфокальной микроскопии показали наличие масла, предварительно окрашенного родамином В, как во внешнем, так и во внутреннем пространстве капсул (см. рисунок 6), на основании чего можно сделать вывод, что микрокапсулы стабильны в масле, а их стенки проницаемы для гидрофобных растворителей.

Визуализация микрокапсул из биополимеров

Визуализация биологических микрообъектов, а также процессов, протекающих с их участием, является одной из актуальных задач современной биохимии и медицины. Для исследования микрокапсул из природных полимеров in vivo необходимо присоединить метку, не меняющую их свойств и позволяющую распознать микрокапсулы среди других биологических надмолекулярных структур.

1. Визуализация с использованием рентгеноконтрастных коллоидных частиц серебра

При исследовании процессов направленного транспорта лекарственных препаратов особый интерес представляет обнаружение путей доставки и мест их накопления в организме. Одним из методов визуализации для анализа таких процессов является рентгенография.

Полые микрокапсулы, состоящие из биополимеров, имеют рентгеноконтрастность, сравнимую с контрастностью физиологического раствора. Одним из способов увеличения контрастности капсул является их нагрузка рентгеноконстрастными веществами. В рентгенографии при внутривенном введении используются водные растворы различных производных трийодбензойной кислоты (содержание йода > 100мг/мл). Теоретическая оценка максимально возможной степени нагрузки капсул показала невозможность использования рентгеноконтрастных веществ на основе йода для визуализации микрокапсул.

В настоящей работе использовалось контрастирование микрокапсул при помощи коллоидного серебра. В 0,02 М растворе нитрата серебра инкубировались как микрокапсулы с ядром (с последующим растворением ядра), так и полые капсулы. Восстановление серебра осуществлялось двумя методами: быстрым восстановлением ионов серебра ацетальдегидом и медленным образованием частиц серебра под воздействием света. Осаждение серебра происходило преимущественно на стенках

полиэлектролитных капсул. Наилучшие результаты были получены при индукции светом суспензии микрокапсул с ядром (см. рис. 6).

РИСУНОК 6. ТЭМ-изображение (слева, в центре) и КМ-фотография полых микрокапсул с серебром (справа)

Рентгенологические исследования полученных образцов проводились на совместном предприятии «Гелпик» под руководством к.т.н. Мишкиниса Б.Я. на цифровом малодозовом флуорографе "Renex-Fluoro" (Россия). Устройство позволяет достигнуть разрешения 1000x1000 пикселей и пространственного разрешения, равного 1,6 пар линий на 1 мм.

Рисунок 7. Рентгеновский снимок суспензий микрокапсул. 1- урографин 60%; 2 - водная суспензия полых, содержащих серебро микрокапсул; 3 - водная суспензия содержащих серебро микрокапсул с ядром; 4 - водная суспензия не содержащих серебро микрокапсул

При сравнительном визуальном анализе рентгеновских снимков образцов (см. рисунок 7) можно сделать вывод, что контрастность осадка

капсул, содержащих серебро, в несколько раз меньше используемого в рентгенографии препарата урографина и в десятки раз больше рентгеноконтрастности не содержащих серебро микрокапсул.

2. Визуализация с использованием нанокристаллов, люминесцирующих в ближней ИК-области

Высокая поглощающая способность биомакромолекул (например, гемоглобина) чрезвычайно затрудняет флуоресцентный анализ. Для анализа процессов, протекающих в биологических объектах, особенно перспективным представляется так называемое «биологическое спектральное окно» в области 800-1100 нм, где поглощение как гемоглобина, так и воды является умеренно низким. Однако набор органических красителей, позволяющих визуализировать процессы в ближней ИК-области, сильно ограничен, кроме того, их отличает низкая стабильность и малые квантовые выходы.

Используемые в настоящей работе полупроводниковые люминесцирующие в ближней ИК-области нанокристаллы Н^Те, Сё^Те, стабилизированные тиолами, любезно предоставленные Гапоником Н.П. (Институт физической химии Гамбургского университета, Германия), лишены этих недостатков. Несмотря на относительно большие размеры (25 нм), делающие невозможной их «пришивку» к отдельно взятой молекуле, они обладают рядом уникальных свойств: стабильностью против деградации и «выцветания» в биологически активной среде при нейтральных и щелочных значениях рН, высоким соотношением сигнал/шум, узкими симметричными спектрами люминесценции и возможностью возбуждения в любой точке спектра с длиной волны меньше длины волны излучения.

<

.. £

<eo

800 1000 <200 1400 W a ve len g th Inm I

100 1000 1200 1400 W avelength [■■ |

Рисунок 9. Спектры фотолюминесценции (X^. = 500 нм) CdHgTe-(левый график) и HgTe- (правый график) нанокристаллов, полученные с исходного водного коллоида, используемого для инкапсуляции (—), и с инкапсулированных в микрокапсулы нанокристаллов (•■•). На вставке (справа вверху) приведен спектр поглощения воды.

Для инкапсуляции нанокристаллов (см. рис. 9) полые (А^Рго^зДОех/Рго^/Бех/СЬй'-микрокапсулы выдерживали в течение 1 часа в водном 0,2 М NaCl растворе, содержащем — 10 0 М нанокристаллов (в пересчете на Те), с последующей отмывкой. Спектры фотолюминесценции инкапсулированных нанокристаллов были зарегистрированы в фосфатном буфере через 5 часов после инкапсуляции.

3. Визуализация с использованием полупроводниковых нанокристаллов (quantum dots nanocrystals (QD NCs))

Химически синтезированные нанокристаллы полупроводников, называемые также коллоидными квантовыми точками, вызывают повышенный интерес как в качестве объектов фундаментальных исследований, так и с прикладной точки зрения. В последнее время все большее внимание уделяется биомедицинскому применению таких нанокристаллов, что основано на их уникальных люминесцентных

свойствах, определяемых квантово-размерным эффектом (quantum size effect). Действительно, сочетание узких спектральных линий фотолюминесценции с широкими, покрывающими коротковолновую часть спектра полосами поглощения делает возможным, например, многоцветное люминесцентное кодирование с использованием монохроматического источника возбуждения. Отметим, что указанный вариант кодирования, представляющий несомненный интерес как для комбинаторной биохимии, так и для биометок, сильно затруднен или практически невыполним при использовании органических красителей, у которых симметрия спектров фотолюминесценции и поглощения делает невозможным монохроматическое возбуждение одновременно нескольких (3 и более) спектрально разрешимых полос излучения.

Рисунок 10. КМ-изображение полых ШаТго^ Рех/РгсКУРех/СИк-

микрокапсул, нагруженных нанокристаллами CdTe (= 476 нм). Вставка: профиль фотолюминесценции

Профиль фотолюминесценции (см. рис. 10) указывает на предпочтительное накопление нанокристаллов в стенках капсул и частичное заполнение внутреннего пространства.

Включение в микрокапсулы белков и ДНК2

Для разработки эффективных вакцин против внутриклеточных патогенов требуется доставка белков патогена в цитоплазму антигенпредставляющих клеток, основными из которых являются дендритные клетки. В этом случае антигенпредставляющие клетки способны активировать не только гуморальный иммунный ответ (то есть продукцию антител), но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для эффективной элиминации зараженных патогеном клеток организма. Из существующих способов доставки белков и ДНК в клетки пригодными для создания вакцин остаются только липид-опосредованное введение белков или иммунизация «голой» ДНК. Эффективность этих методов остается очень низкой, так как липосомы в значительной мере удерживаются и деградируют в печени, а при иммунизации «голой» ДНК концентрации последней, попадающей в антигенпредставляющие клетки, слишком низки для индукции эффективного иммунного ответа.

Учитывая вышесказанное, актуальной представляется попытка использования в качестве средства доставки внутрь клетки ДНК и белка микрокапсул на основе природных ПЭ.

Для получения микрокапсул, нагруженных белком, нами были использованы в качестве положительно заряженных слоев - олигохитозан, в качестве отрицательно заряженных слоев - альгинат, а в качестве матрицы - ядра карбоната марганца диаметром 3,8 мкм. Для нагрузки использовали иммуноглобулин в мыши, коньюгированный с флуоресцеинизотиоцианатом (КОС-^в) (150 кДа). Так как суммарный заряд протеинов зависит от аминокислотного состава и рН раствора, были приготовлены микрокапсулы двух типов: в одном случае белок использовался как отрицательно заряженный слой, т.е. чередование слоя белка и ПЭ было следующим: ...о-СЬй/КГГС-^О/о-СЫ!.., а в другом

2 Данная часть работы проводилась в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН под руководством к.б.н. Марквичевой Е.А. и к.х.н. Свирщевской Е.В.

случае, протеин наносился между слоями полианионов (...А^ДТГС-^О/Л^...). Исходная концентрация белка в растворе, используемом для адсорбции, составляла 2 мг/мл. Супернатант собирали для оценки расхода белка спектрофотометрическим методом и использовали в дальнейшем нанесении. В обоих случаях было адсорбировано 16 слоев, 3 из которых составлял белок, а последним являлся отрицательно заряженный альгинат (рис. 11 А). После растворения ядра при рН<3 были сняты микрофотографии водной суспензии полученных полых капсул (рис. 11 В). В случае, когда белок наносился между слоями альгината, адсорбция протекала более полно, что говорит о положительном знаке суммарного заряда ИТС-^О в данных условиях.

Рисунок 11. КМ-изображения (в режиме флуоресценции) микрокапсул, нагруженных КГГС-^О, до растворения ядра (А); после растворения ядра (В); диаграмма, полученная методом проточной цитофлуорометрии после фагоцитоза капсул (С); КМ-изображение (в УФ-области) микрокапсул, нагруженных ДНК (Б).

После инкубации микрокапсул с антигенпредставляющими клетками наблюдали 5,8% светящихся клеток в популяции макрофагов и 10% - в популяции дендритных клеток, что свидетельствует о том, что клетки фагоцитируют полученные микрокапсулы с белком (см. рис. 11 С, выделенная область Ml соответствует 10%).

Следующим этапом работы было включение в микрокапсулы ДНК с целью получения адъювантов, обеспечивающих мягкие условия упаковки ДНК и биодеградацию в эндосоме, и исследования иммунной активности.

Для нагрузки капсул использовали фагмиду (5,4 тыс. п.о.) со встроенным под цитомегаловирусным промотором геном белка Asp f2 (37 кДа). Исходный раствор для адсорбции содержал 1 мкг/мл ДНК в воде.

Спектрофотометрическим методом было установлено, что ДНК в ходе приготовления микрокапсул не разрушается. Были получены стабильные 14-слойные полые микрокапсулы, в состав которых входило 4 слоя ДНК, включенных между слоями олигохитозана (см. рис. 11 D).

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения микрокапсул из альгината, протамин сульфата, декстрана и хитозана на основе послойной адсорбции противоположно заряженных ПЭ.

2. Проведен анализ существующих матриц для получения полых микрокапсул из природных полимеров, и синтезированы новые ядра из карбоната марганца.

3. Изучена проницаемость стенок полученных микрокапсул для низко-и высокомолекулярных соединений и гидрофобных растворителей.

4. Разработаны методы визуализации микрокапсул при помощи рентгеноконтрастных частиц серебра и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов.

5. Разработаны методы включения в микрокапсулы белков и ДНК, и исследован фагоцитоз таких капсул антигенпредставляющими клетками.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Gaponik N.P., Radtchenko I.L., Gerstenberger M.R., Fedutik YuA, Sukhorukov G.B., Rogach A.L. Labeling of Biocompatible Polymer Microcapsules with Near-Infrared Emitting Nanocrystals. // Nanoletters.-2003, V.3, N 3.- P.369-372.

2. Герстенбергер М.Р., Сухоруков Г.Б., Радченко И.Л., Тюрина О.П., Скляренко А. В., Василенко И. А. Новый метод получения биополимерных микрокапсул для создания лекарственных средств. // Материалы I Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития».- Москва, 14-18 октября 2002.- С. 54-55.

3. Герстенбергер М.Р., Гапоник Н.П., Сухоруков Г.Б., Василенко И.А. Изучение физико-химических свойств микрокапсул на основе биополимеров. // Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- Москва, 7-11 апреля 2003.- С. 596.

4. Герстенбергер М.Р., Радченко И.Л., Сухоруков Г.Б., Василенко И.А. Получение микрокапсул на основе биополимеров для создания лекарственных средств. // Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- Москва, 7-11 апреля 2003.- С. 596.

5. Герстенбергер М.Р., Сухоруков Г.Б., Василенко И.А., Швец В.И. Получение микрокапсул послойной адсорбцией биополимеров. // Ученые записки МИТХТ.- Выпуск 8.- 2003.- С. 41-44.

6. Rogach A.L., Gaponik N., Weller H., Radtchenko I.L., Gerstenberger M.R., Fedutik Y.A., Sukhorukov G.B. Microencapsulated Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Markers for Visible and Near Infrared. // 8th European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes.-1-5 September 2003.- Lausanne, Switzerland.- Published in the Web: http://www.euromat2003.fems.org/programme/.

Автор выражает благодарность к.х.н. Мироновой Е.В. за неоценимые консультации и поддержку в период выполнения работы.

Принято к исполнению 26/05/2004 Заказ № 242

Исполнено 27/05/2004 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

»t087f

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Герстенбергер, Мария Райнхардовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Послойная электростатическая самосборка (LbL ESA)

2. Покрытие коллоидных частиц микронных и субмикронных размеровИ)

3. Контролируемое осаждение на поверхности коллоидных частиц (SCP)

3.1. Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода SCP с образованием комплекса полиэлектролит/противоион

3.2. Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода SCP с добавлением осадителя

4. Получение полых полиэлектролитных капсул

5. Инкапсулирование макромолекул

5.1. Инкапсулирование при помощи регулирования проницаемости стенки

Регулирование проницаемости изменением значения рН

Регулирование проницаемости изменением полярности среды

5.2. Инкапсулирование предварительно осажденных макромолекул

5.3. Инкапсулирование макромолекул посредством метода SCP с последующим формированием внешней устойчивой оболочки

6. Проницаемость капсульной стенки для низкомолекулярных веществ

7. Физические процессы и химические реакции в ограниченном объеме капсул 30 7.1. Осаждение органических веществ исключительно во внутреннем объеме капсул

Осаждение рН-чувствительных веществ внутри капсул, модифицированных PSS

Одновременное осаждение разных веществ внутри капсул, модифицированных PSS

Осаждение плохо растворимых в воде веществ внутри капсул, модифицированных PSS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микрокапсулы на основе природных полиэлектролитов для включения биологически активных веществ"

Существует большое разнообразие как синтетических, так и природных полимерных систем для изучения контролируемого высвобождения биологически активных веществ и получения систем направленной доставки лекарств (DDS) [71]. Разработка и изучение новых надмолекулярных образований является одним из направлений интенсивно развивающихся нанотехнологий. К надмолекулярным образованиям относятся, в том числе, такие коллоидные частицы, как микрокапсулы, которые находят применение в различных областях прикладной химии, биохимии и фармакологии.

В 1998 году группой исследователей Института Макса Планка был предложен новый способ получения микрокапсул - послойная (Layer-by-Layer) электростатическая самосборка (Electrostatic Self-Assembly) противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидных частицах микронных и субмикронных размеров [31, 28]. Данная технология позволяет получать микрокапсулы определенной формы и размера, зависящих от используемых матриц-ядер. Оболочка микрокапсул обеспечивает требуемые каталитические или аффинные свойства, стабильность, проницаемость, совместимость и регулирование высвобождения внутреннего материала капсулы.

Микрокапсулы, имеющие размер от нескольких десятков нанометров до микрометра, со стенками нанометровой толщины представляют как научный, так и технологический интерес, поскольку могут использоваться как новый перспективный тип микро- и наноконтейнеров для решения различных задач. В частности, включение белков и нуклеиновых кислот в многослойные пленки может найти применение в биотехнологии, например, в качестве средства доставки внутрь клеток ДНК и белка для получения вакцин и в генной терапии.

Данная технология микрокапсулирования, однако, до настоящего времени отрабатывалась только на микрокапсулах, состоящих из синтетических полиэлектролитов. Получение при помощи послойной сборки микрокапсул на основе природных материалов не было описано и изучено. В связи с этим, представляется актуальной разработка технологии получения микрокапсул методом LbL ESA на основе биополимеров и изучение свойств полученных капсул.

Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» (регистрационный номер НИР: 1Б-5-866), а также в Государственном научном центре по антибиотикам по теме «Разработка новых лекарственных форм известных биологически активных веществ».

Часть работы выполнялась в Институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (Потсдам, Германия) в отделении «Поверхности», отделе «Полые капсулы» в группе «Полифункциональные микро- и нанокапсулы» под руководством к.ф.-м.н. Сухорукова Г.Б. в рамках программы «Софья Ковалевская», финансируемой фондом Александра Гумбольдта Министерства образования и исследований Германии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Микрокапсулирование - это процесс заключения различных веществ в микрокапсулы, надмолекулярные образования, представляющие собой емкость диаметром от сотен нанометров до нескольких микрометров.

Заключенное в микрокапсулу вещество защищено от внешних воздействий, что обуславливает перспективность применения микрокапсулирования в медицине. Варьируя в широких пределах материал микрокапсул, толщину стенок и другие характеристики, возможно четкое регулирование скорости высвобождения, места всасывания и фармакокинетики лекарственных веществ, что позволяет снижать их травмирующее влияние на слизистые в случае неинъекционных форм. Помимо этого, значительно снижается острая токсичность ряда веществ, повышается их стабильность, пролонгируется действие. Система позволяет связывать антитела с поверхностью микрокапсулы и за счет этого осуществлять адгезию последней к органу-мишени или клетке. Благодаря субмикронным размерам, микрокапсулы используются, к примеру, в противоопухолевых препаратах для химиоэмболизации цитостатиками [73].

В микрокапсульных препаратах можно совмещать реагирующие или несмешивающиеся друг с другом вещества, маскировать их неприятный запах и вкус. Также микрокапсулированием достигается "превращение" жидкостей в псевдотвердое состояние, т.е. в сыпучую массу, состоящую из микрокапсул с твердой оболочкой, заполненных, например, жидкими лекарственными веществами [74].

В зависимости от морфологических особенностей можно различить полые и сплошные микрокапсулы. В липосомах, состоящих из амфифильных молекул, внутренний объем и внешняя среда гидрофильны, в то время как стенки мембраны липофильны. Надмолекулярные образования, получаемые коацервацией гидрофильных, ионогенных полимеров, в большинстве своем, не имеют очерченного стенками внутреннего объема, активное вещество распределено равномерно по всему объему.

В 1998 году группой исследователей в институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей в Германии был предложен новый тип полифункциональных микрокапсул, состоящих из ядра и оболочки, способ получения которых позволяет конструировать как внутренний объем, который может отличаться от внешней среды, так и состав стенок.

Данный обзор посвящен этому новому перспективному нанотехнологическому методу микрокапсул про вами я, основанному на пошаговом формировании оболочки путем адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на различных матрицах микронных н субмикронных размеров. В нем рассматриваются недавно опубликованные работы по способам получения оболочек на различных коллоидных ядрах, изготовлению и свойствам полых капсул, регулирования проницаемости капсульной стенки и методам включения различных материалов в эти капсулы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Герстенбергер, Мария Райнхардовна

выводы

В результате проведенной работы:

1. Разработан новый метод получения микрокапсул из альгината, протамин сульфата, декстрана и хитозана на основе послойной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов.

2. Проведен анализ существующих матриц для получения полых микрокапсул из природных полимеров, и синтезированы новые ядра из карбоната марганца.

3. Изучена проницаемость стенок полученных микрокапсул для низко-и высокомолекулярных соединений и гидрофобных растворителей.

4. Разработаны методы визуализации микрокапсул при помощи рентгеноконтрастных частиц серебра и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов.

5. Разработаны методы включения в микрокапсулы белков и ДНК, и исследован фагоцитоз таких капсул антигенпредставляющими клетками.

Благодарности

Автор выражает благодарность руководителю группы «Полифункциональные микро- и нанокапсулы» Института Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (г. Потсдам, Германия) Г.Б. Сухорукову за оформление стажировки, руководство и помощь в освоении метода послойной адсорбции, а также его сотрудникам О. Тюриной, И. Радченко, А. Антипову, Д. Шеною и Р. Георгиевой за неоценимые консультации в проведении экспериментов.

Выражаю благодарность моим научным руководителям проф. Василенко И.А., Сухорукову Г.Б., а также Марквичевой Е.А., Скляренко А.В., Курочкиной В.Б., Вагановой О.А., Дубовским П.В. и С.И., Гапонику Н.П., Моя С. и Радченко И. за помощь в решении научных проблем и подачу новых идей, положенных в основу представленной работы.

Часть экспериментов была проведена при помощи и сотрудничестве Dr. Й. Хартмана (ТЭМ, СЭМ и EDX), к.х.н. Щукина Д. (СЭМ), А. Хайлиг (АСМ, КЛСМ), Феофанова А.В., м.н.с. группы оптической спектроскопии ИБХ РАН Шаронова Г.В. (KJICM), Добровольского Н.А. (рентгенография), Федутика Ю.А. (получение ядер из карбоната марганца) и к.х.н. Свирщевской Е.В. (проточная цитофлуориметрия, иммунная активность), которым я искренне признательна.

Выражаю искреннюю благодарность моей маме и сыну за терпение и понимание, а также к.х.н. Мироновой Е.В. за неоценимые консультации и поддержку в период выполнения работы.

8. Заключение

Суммируя вышесказанное, нельзя не отметить широкие возможности технологии послойной адсорбции полиэлектролитов на коллоидных частицах. Универсальность, простота и эксплуатационная гибкость - привлекательные особенности данной отрасли нанотехнологии. На рисунке 15 показаны возможные перспективные области применения данного способа микрокапсулирования.

Рисунок 15. Схематическое изображение многофункциональности микрокапсул

В сформированные полые оболочки можно ввести люминесцентные полупроводниковые наночастицы для идентификации, визуализации и обнаружения микрокапсул в исследованиях in vitro и in vivo. Инкапсулированные магнитные частицы позволяют воздействовать на микрокапсулы извне, в частности, при помощи магнитного поля возможна доставка таких капсул к определенной клеточной культуре/ткани. Микрокапсулы можно использовать как средство доставки лекарственных веществ или ферментов для ускорения специфических реакций внутри клетки. Внешняя стенка может быть функционализирована рецепторами или антителами для нацеливания на молекулярном уровне.

В качестве исходной матрицы для получения оболочек могут быть использованы органические и неорганические частицы, нанокристаллы лекарственных веществ, биологические клетки, белковые агрегаты, фактически, любые коллоидные частицы, размером от 50 нм до десятковмикрон. Оболочка также может быть составлена из разнообразных материалов.

Существует, по крайней мере, два подхода для формирования оболочек. В случае техники послойной адсорбции, необходимо наличие пары противоположно заряженных полиэлектролитов. Их чередуемая адсорбция приводит к образованию оболочки с определенной толщиной, композицией и, следовательно, такими свойствами, как избирательная проницаемость, контролируемая доставка и высвобождение заключенных БАВ, биодеградация, биосовместимость, стабильность. Другим способом является техника контролируемого осаждения полимеров на поверхности (SCP), с помощью которой возможно за один цикл нанесения получить оболочку толщиной в 20 полиэлектролитных слоев.

Выборочная проницаемость оболочки обуславливает возможное использование капсул в качестве микроконтейнеров для хранения и транспортировки макромолекул. По сравнению с достаточно хорошо изученными за последние 40 лет липосомами, многослойные капсулы из полиэлектролитов имеют более высокую стабильность. Кроме того, технология их получения предоставляет большие возможности для манипулирования внутренним объемом, размером, составом оболочек и т.д.

Различные способы включения макромолекул, приводящие к разной степени загрузки, составу и физико-химическим свойствам включаемых веществ также привлекают интерес со стороны биотехнологов. Так, многообещающим приложением этой технологии может быть изготовление полимерной оболочки на поверхности компактной формы ДНК для моделирования вирусов. Закрепление на поверхности оболочки рецепторов привело бы к возможности направленной доставки.

Кроме того, микрокапсулы, полученные LbL ESA, могут быть использованы в качестве микрореакторов, что является важной областью исследований в ферментативном катализе. Фундаментальные аспекты исследования этих капсул, представляющих уникальную систему для изучения химических и физических явлений в микронном и субмикронном масштабе, определяют направление исследований в прикладной химии и биологии.

На основании анализа литературных данных можно сделать вывод, что микрокапсулы, получаемые на основе описанной технологии, могут быть использованы для решения различных задач, стоящих перед современной биотехнологией. Эксплуатационная гибкость описанного микрокапсулирования стимулирует дальнейшее его исследование и развитие.

В литературе не описано получение микрокапсул из биополимеров, которые могли бы быть биосовместимыми. Применение на всех стадиях получения микрокапсул биосовместимых материалов расширяет возможности использования микрокапсул в медицинской биотехнологии.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Представленный обзор литературных данных свидетельствует о том, что нанотехнология является интенсивно развивающейся отраслью науки с многообещающими перспективами воплощения результатов исследований в практической деятельности.

Возможность создавать различные по составу и форме надмолекулярные структуры описанным способом микрокапсулирования стимулирует дальнейшее его исследование и развитие.

1. Разработка методов получения микрокапсул

Существующие методы микрокапсулирования имеют ряд недостатков, связанных с высокой полидисперсностью и большим размером частиц-носителей, а также неконтролируемой степенью загрузки активным компонентом [78]. В 1998 году был предложен новый метод получения микрокапсул, основанный на поочередной адсорбции противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов на коллоидных частицах. В случае разрушения коллоидной матрицы при условиях, в которых полимерная оболочка стабильна, образуется полая капсула определенного размера, формы и с требуемой толщиной стенки, обладающей необходимыми свойствами.

Для решения прикладных биотехнологических задач в настоящей работе было предложено использовать данную технологию для создания микрокапсул из биополимеров с различными способами включения БАВ.

1.1. Подбор полиэлектролитов

Необходимым условием образования капсульной стенки способом послойной адсорбции, как упоминалось в обзоре литературы, является наличие заряда у используемых материалов.

Задачей настоящей работы было получение микрокапсул на основе биополимеров, которые в дальнейшем могут быть использованы в качестве средств доставки БАВ. Понятие биосовместимости включает в себя биотолерантность и биоинертность. Одним из подходов получения «биосовместимых» микрокапсул является использование в качестве исходных компонентов веществ, разрешенных к применению в лекарственных препаратах.

Таким образом, из существующего в природе разнообразия заряженных полимеров, таких как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и т.п., в настоящей работе были использованы полимеры, лекарственные препараты на основе которых внесены в действующие фармакопеи США, Европы и Российской Федерации и разрешены к применению (см. таблицу 1).

В качестве положительно заряженного полиэлектролита впервые использовался протамин сульфат (Prot) - полипептид, выделяемый из икры лососевых рыб (сальмин). Данный гемостатик, являющийся одновременно слабым антикоагулянтом, используется в хирургии для нейтрализации свертываемости крови за счет образования стабильных комплексов протамин сульфата с гепарином [106, Т1.- стр. 476].

Примерно 67% аминокислотного состава протамина составляет аргинин, который делает его сильно щелочным поликатионным веществом с молекулярным весом приблизительно 5 кДа [101].

Оптимальные толщина слоя и равномерность покрытия были достигнуты при адсорбции протамина из раствора в концентрации 2 мг/мл, содержащего 0,5 М NaCl.

Кроме протамин сульфата в качестве поликатиона также использовался низкомолекулярный хитозан (Chit)- поли-Э-глюкозамин, получаемый из хитина [108, стр.656] путем 75-85%-ного деацетилирования. Этот уникальный биополимер, называемый многими веществом XXI века, активно исследуется в России последние десятилетия [109-112]. Хитозан используется в медицине как БАВ, обладающее гиполипидемическими свойствами [106, Т1.- стр.453-461].

Низкомолекулярный хитозан (вязкость по Брукфильду 1% раствора в 1% уксусной кислоте составляет 20-200 сантипуаз, плотность 0.22) растворим в разбавленных водных растворах кислот (рН < 6.5). Оптимальные толщина слоя и равномерность покрытия были достигнуты при адсорбции низкомолекулярного хитозана из раствора в концентрации 1 мг/мл, содержащего 0,5 М NaCl.

Чем меньше молекулярная масса хитозана, тем выше значение рН его раствора [110]. В экспериментах по включению белка в микрокапсулы использовался в качестве поликатиона олигохитозан (o-Chit) (MW 4437), предоставленный A. Bartkowiak (Институт полимеров Технического университета г. Щецин, Польша), являющийся продуктом химической деструкции коммерческого хитозана [60, 61]. Значение рН 0,2%-ного раствора олигохитозана в воде составляет приблизительно 4. Для того чтобы избежать растворения карбоната марганца, значение рН было доведено до 6 добавлением 2% NaOH.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Герстенбергер, Мария Райнхардовна, Москва

1. Her R. К. Multilayers of colloidal particles // J. Colloid Interface Sci. 1966,21 (6), 569-572

2. Lee H., Kepley L. J., Hong H. G., Akhter S., Mallouk Т. E. Adsorption of ordered zirconium phosphonate multilayer films on silicon and gold surfaces // J. Phys. Chem. 1988. - 92(9), 2597-2601

3. Decher G. and Hong J.-D., Build up of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: I.Consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles // Macromol. Chem., Macromol. Symp. 1991,46,321-327

4. Decher G., Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicomposites // Science 1997,277,1232-1237

5. Decher G., Lehr В., Lowack K., Lvov Y., Schmitt J., New composite films for biosensors: layer-by-layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA // Biosensors & Bioelectronics 1994,9,677-683

6. Lvov Y. M., Sukhorukov G. В., Protein Architecture: Assembly of Ordered Films by means of Alternated Adsorption of Oppositely Charged Macromolecules // Membr. Cell Biol. 1997,11,277-303

7. Sukhorukov G. В., Montrel M. M., Petrov A. I., Shabarchina L. I., Sukhorukov B. I., Multilayer films containing immobilized nucleic acids. Their structure and possibilities in biosensor applications // Biosensors & Bioelectronics 1996, 11,913922

8. Caruso F., Niikura K., Furlong D. N., Okahata Y., Assembly of alternating polyelectrolyte and protein multilayer films for immunosensing // Langmuir, 1997, 13, 3427-3433

9. Lvov Y., Decher G., Moehwald H. Assembly, structural characterization, and thermal behaviour of layer-by-layer deposited ultrathin films of poly(vynyl sulfate) and poly(allylamine) // Langmuir 1993,9,481-486

10. Kotov N. A. Layer-by-layer self-assembly: The contribution of hydrophobic interactions//Nanostructured Materials 1999, 12, 789-796

11. Cheung J. H., Fou A. F., Rubner M. F. Molecular Self-assembly of conductive polymers // Thin Solid Films 1994,244,985-989

12. Berndt P., Kurihara K., Kunitake T. Adsorption of poly(styrenesulfonate) onto ammonium monolayer on mica a surface force study // Langmuir 1992, 8,24862490

13. Hammond P. Т., Recent explorations in electrostatic multilayer thin film assembly // Current Opinion in Colloid & Interface Science 1999,4,430-442

14. Bertrand P., Jonas A., Laschewsky A., Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties // Macromol. Rapid Com. 2000,21,319-348

15. Lvov Y. M., Ariga K., Ichinose I., Kunitake T. Layer-by-layer Architecture of concavalin A by means of electrostatic and Biospecific Interactions // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995,22,2313-2314

16. Onda M., Lvov Y. M., Ariga K., Kunitake T. Sequential actions of glucose oxidase and peroxidase in molecular films assembled by layer-by-layer adsorption // Biotechnology and Bioengineering 1996,51, 163-166

17. Onda M., Lvov Y., Ariga K., Kunitake T. Sequential reaction and product separation on molecular films of glucoamylase and glucose oxidase assembled on an ultrafilters // J. Fermentation & Bioengineering 1996, 82, 502-506

18. Gao M., Richter В., Kirstein S., Moehwald H. Electroluminescence Studies on Self-assembled Films of PPV and CdSe nanoparticles // J. Phys.Chem. 1998, 102,40964103

19. Wang X. G., Balasubramanian S., Li L., Jiang X. L., Sandman D. J., Rubner M. F., Kumar J., Tripathy S. K. Self-assembled second order nonlinear optical multilayer azo polymer // Macromol. Rapid Com. 1997, 18,451-459

20. Stroeve P., Vasquez V., Coelho M. A. N., Rabolt J. F. Gas transfer in supported films made by molecular self-assembly of ionic polymers // Thin Solid films 1996, 285, 708-712

21. Von Klitzing R., Moehwald, H. Proton concentration profile in Ultrathin polyelectrolyte films // Langmuir 1995, 11,3554-3559

22. Krasemann L., Tieke B. Ultrathin self-assembled polyelectrolyte membranes for pervaporation//J. Memb. Sci. 1998, 150,23-30

23. Pommerening K., Ristau O., Rein H., Dautzenberg H., Loth F. Immobilization of proteins and cell fragments by use of a new method of microencapsulation // Biomed. Biochim. Acta 1983,42, 813-823

24. Pommqrsheim R., Schrezenmeir J., Vogt W. Immobilization of enzymes by multilayer microcapsules//Macromol. Chem. Phys. 1994, 195, 1557-1567

25. Keller S. W., Johnson S. A., Brigham E. S., Yonemoto E. H., Mallouk Т. E. Photoinduced charge separation in multilayer thin films grown by sequential adsorption of polyelectrolytes // J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 12879-12880

26. Chen T. Y., Somasundaran P. Preparation of novel core-shell nanocomposite particles by controlled polymer bridging // J. Am. Chem. Soc. 1998, 81 140-144

27. Somasundaran P., Chen T. Y., Sarkar D. A novel processing scheme for core-shell nano composites using controlled polymer adsorption // Mater. Res. Innovations 1999, 2, 325-327

28. Sukhorukov G. В., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A., Moehwald H. Layer-by-layer Self-Assembly of Polyelectrolytes onto Colloidal Particles // Colloids Surfaces A 1998, 137,253-266

29. Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S.A., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.I. and Mohwald H. Step-Wise Polyelectrolyte Assembly on Particle Surfaces A Novel Approach to Colloid Design // Polym. Advan. Technol. 1998, 9, 759-767.

30. Donath E., Sukhorukov G. В., Caruso F., Davis S. A., Moehwald H. Novel hollow polymer shells: fabrication, characterization and potential applications, Angewandte Chemie, International Edition 1998,37,2201-2205.

31. Caruso F. Hollow capsule processing through colloidal templating and self-assembly // Chem. Eur. J., 2000,6,413-419

32. Caruso F., Susha A. S., Giersig M., Moehwald H. Magnetic core-shell particles: Preparation of magnetite multilayers on polymer latex microspheres // Advanced Materials 1999, 11 950-953

33. Sukhorukov G. В., Donath E., Moya S., Susha A. S., Voigt A., Hartmann J., Moehwald. H., Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes // .^Microencapsulation 2000, 17, 177-185

34. Moya S., Donath E., Sukhorukov G. В., Auch M., Baeumler H., Lichtenfeld H., Moehwald H. Lipid coating on polyelectrolyte surface modified colloidal particles and polyelectrolyte capsules // Macromolecules 2000,33,4538-4544

35. Georgieva R., Moya S., Leporatti S., Neu В., Baumler H., Reichle C., Donath E., Moehwald H. Conductance and capacitance of polyelectrolyte and lipid-polyelectrolyte composite capsules as measured by electrorotation // Langmuir 2000, 16,7075-7081

36. Caruso F., Fiedler H., Haage K. Assembly of beta-glucosidase multilayers on spherical colloidal particles and their use as active catalysts // Colloid surface A 2000, 169,287-293

37. Schuler C., Caruso F. Preparation of enzyme multilayers on colloids for biocatalysis // Macromol. Rapid Com. 2000,21, 750-753

38. Donath E., Sukhorukov G. В., Moehwald H. Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules // Nachrichten aus Chemie Technik und Laboratorium 1999,47,400-405

39. Neu В., Voigt A., Mitloehner R., Leporatti S., Gao C. Y., Donath E., Kiesewetter H., Moehwald H., Meiselman H. J. and Baumler H. Biological cells as templates for hollow microcapsules // Journal of Microencapsulation, 2001 18(3): 385-395.

40. Caruso F., Wenjun Yang W., Dieter Trau D., Renneberg R. Microencapsulation of Uncharged Low Molecular Weight Organic Materials by Polyelectrolyte Multilayer Self-Assembly // Langmuir 2000, 16 (23), 8932-8936

41. Antipov A. A., Sukhorukov G. В., Donath E., Moehwald H. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayers capsules // J. Phys. Chem. B, 2001, 19(6), 2444-2448

42. Trubetskoy V. S., Loomis A., Hagstrom J. E., Budker V. G., Wolff J. A., Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles // Nucleic Acids Research 1999, 27,3090-3095

43. Finsinger D., Remy J. S., Erbacher P., Koch C., Plank C. Protective copolymers for nonviral gene vectors: synthesis, vector characterization and application in gene delivery // Gene Therapy 2000, 7, 1183-1192

44. Bobreshova M.E., Sukhorukov G.B., Saburova E.A., Elfimova L.I., Sukhorukov B.I., Sharabchina L.I. Lactate dehydrogenase in interpolyelectrolyte complex. Function and stability // Biophysics 1999,44, 813-820

45. Dudnik V., Sukhorukov G. В., Radtchenko I. L., Moehwald H. Coating of colloidal particles by controlled precipitation of polymers, Macromolecules 2001,34(7), 2329-2334

46. Radtchenko I. L., Sukhorukov G. В., Moehwald H. Incorporation of Macromolecules into Polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface controlled precipitation on colloidal particles // Colloids and Surfaces A, 2002, 202(2-3), 127- 133

47. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B., Gaponik N., Kornowski A., Rogach A.L., and Mohwald H. Core-shell structures formed by the solvent-controlled precipitation of luminescent CdTe nanocrystals on latex spheres // Advanced Materials. 2001. -13,1684-1687

48. Leporatti S., Voigt A., Mitloehner R., Sukhorukov G.B., Donath E. and Moehwald H. Scanning Force Microscopy Investigation of Polyelectrolyte Nano- and Microcapsule Wall Texture // Langmuir 2000,16(9), 4059-4063

49. Moehwald H., Lichtenfeld H., Moya S., Voigt A., Baeumler H., Sukhorukov G. В., Caruso F., Donath E. From Polymeric Films to Nanoreactors // Macromol. Chem. Makromol. Symposia, 1999, 145,75-8153