Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова

На правах рукописи

Бородина Татьяна Николаевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ВЫХОДОМ БЕЛКОВ, ДНК И ДРУГИХ БИОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03 00 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степи кандидата химических наук

Москва-2008

003170204

Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

доктор химических наук

Марквичева Елена Арнольдовна

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

доктор химических наук, профессор Клячко Наталья Львовна

Ведущая организация

Российский химико-технологический университет им Д И Менделеева

Защита состоится "18" июня 2008 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и ЮА Овчинникова РАН по адресу 117997 ГСП-7, Москва В-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан "16" мая 2008 года

Ученый секретарь

специализированного совета --—.________

доктор физико-математических

В А Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сегодня трудно назвать область науки или производства, где микро- и нанотехнологии не нашли бы своего применения или эффективность их использования не была бы очевидна или принципиально доказана Нанобиотехнологии все более широко используются в биотехнологии и биомедицине В биомедицине особое внимание уделяется нано- и микрокапсулам Это связано с тем, что микрокапсулирование позволяет

- защитить биологически активные вещества (БАВ), такие как витамины, антибиотики, ферменты, вакцины и др о г окисления под воздействием внешней среды,

- разделить реагирующие между собой биоактивные компоненты в составе одного лекарственного препарата,

- обеспечить пролонгированный выход БАВ или его высвобождение в нужный момент времени,

- придать микрокапсулированным продуктам новые физические свойства

Микрокапсулы используются как микроконтейнеры при разработке новых эффективных форм лекарств с пролонгированным и/или контролируемым высвобождением активных компонентов (белков, в том числе ферментов, пептидов, гормонов, различных антигенов, ДНК, РНК и тд) Благодаря возможности варьировать размер, структуру и физико-химические свойства микрокапсул, их можно применять в качестве систем доставки противоопухолевых и противомикробных препаратов, а также в генной терапии

В настоящее время существует большое количество методов микрокапсулирования, однако далеко не все из них могут быть предложены для биомедицинских целей из-за достаточно жестких способов получения микрокапсул (использование повышенных температур, органических растворителей и других токсичных веществ, снижающих активность микрокапсулированных БАВ)

С этой точки зрения весьма перспективной является технология послойной (Ьауег-Ьу-Ьауег (ЬЬЬ)) адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов (ПЭ) на неорганических коллоидных микрочастицах Метод ЬЬЬ является простым

и универсальным подходом с точки зрения выбора как ПЭ, так и спектра веществ, которые можно инкапсулировать Для получения микрокапсул с помощью данной технологии не требуется трудоемких методов полимерной химии Кроме того, использование этого метода позволяет выполнять микрокапсулирование в физиологических условиях (температура, рН), что особенно важно при работе с лабильными биоактивными соединениями Метод ЬЬЬ был разработан для формирования ПЭ микрокапсул на основе небиодеградируемых небиосовместимых синтетических полимеров, которые невозможно было использовать для создания систем доставки БАВ Поэтому нам представлялось интересным предложить спектр биосовместимых биодеградируемых ПЭ для формирования мембраны микрокапсул Кроме того, биодеградируемые микрокапсулы позволяют решить еще одну интересную и актуальную задачу, а именно - создание новых препаратов (инкапсулированных БАВ, терапевтических агентов и др ), время выхода которых можно регулировать путем контролируемого разрушения мембран микрокапсул с использованием соответствующих ферментов

Целью работы являлось получение полиэлектролитных микрокапсул на основе биосовместимых биодеградируемых полимеров с иммобилизованными в них биоактивными соединениями (белками, в частности ферментами, ДНК, экстрактами лекарственных растений), время выхода которых можно контролировать, исследование свойств таких микрокапсул и возможности применения 'в биомедицине, в частности для репарации тканей

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи

1 Предложить и оптимизировать методы включения биоактивных соединений (химотрипсин, проназа, ДНК, экстракты подорожника и календулы) в СаСОз микрочастицы

2 Выбрать биодеградируемые ПЭ для формирования мембран на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция и на их основе методом ЬЬЪ получить микрокапсулы

3 Исследовать возможность контропируемой биодеструкции микрокапсул в резучьтате действия ферментов изнутри и снаружи

4 Изучить активность биоактивных соединений (на примере инкапсулированного химотрипсина)

5 Исследовать кинетику выхода биоактивных соединений (ДНК, химотрипсина, экстрактов подорожника и календулы) при ферментативной деструкции ПЭ микрокапсул

6 Продемонстрировать возможность использования микрокапсул с инкапсулированными в них экстрактами подорожника и календулы для репарации тканей в модели язвы желудка (крысы)

Научная новизна. Впервые получены биодеградируемые ПЭ микрокапсулы с включенными в них БАВ, выход которых можно обеспечить путем ферментативной деструкции мембраны микрокапсул Показано, что биодеградацию микрокапсул можно осуществлять как в результате действия фермента изнутри (в случае его включения в микрокапсулы вместе с БАВ), так и снаружи (путем обработки микрокапсул раствором фермента) При этом время выхода инкапсулированного БАВ можно регулировать путем изменения концентрации фермента Впервые продемонстрирована система с двумя инкапсулированными компонентами, одним из которых является БАВ (ДНК), а другим - фермент, который инициирует деструкцию микрокапсул Была исследована кинетика выхода инкапсулированных биоактивных соединений в результате разрушения микрокапсул под действием ферментов Впервые изучен эффект микрокапсул на основе природных полисахаридов с включенными в них экстрактами подорожника и календулы на процесс репарации тканей т vivo Показано, что препараты микрокапсул способствуют ускоренному заживлению язвы желудка в модели на крысах Практическая значимость работы Полученные в работе биодеградируемые ПЭ микрокапсулы могут быть использованы как основа для создания новых эффективных препаратов с контролируемым выходом БАВ Показано, что с использованием микрокапсул из природных полисахаридов с включенными в них экстрактами лекарственных растений могут быть получены новые препараты для терапии ран

Апробация работы Результаты диссертации были представлены на следующих конференциях II съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 2004), II научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), III съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 2005), Научно-практическая конференция «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), VIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006), VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), XV Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2007), XV Международный симпозиум по биоинкапсулированию (Вена, 2007), III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и получен 1 патент Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, а также списка литературы, включающего 132 источника Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включая 5 таблиц и 39 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Основные принципы конструирования биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул 1.1. Метод получения микрокапсул на основе микрочастиц карбоната

кальция

Формирование микрокапсул осуществляли методом LbL адсорбции противоположно заряженных ПЭ на макропористых сферических СаСОз микрочастицах Основы метода были ранее разработаны в институте Макса Планка

МР1К0 (г. Гольм. Германия). Данная технология позволяет совместить в себе преимущества метода сорбции БАВ в пористой неорганической матрице (при этом количества сорбированных БАВ могут быть значительно выше, чем в других процессах капсулирования) и формирования на этой матрице мультислойной полимерной мембраны, которая позволяет не только пролонгировать высвобождение БАВ, но и регулировать время его высвобождения.

На рис 1 представлены использованные в работе СаСО? микрочастицы (средний диаметр 4,5 мкм), макропористая структура которых позволяет сорбировать в них БАВ.

Рис. 1. Фотографии СаСОз микрочастиц при различном увеличении (а. б). Сканирующая электронная микроскопия.

Включение БАВ в СаСОз микрочастицы проводили двумя методами: сорбцией и соосаждением (рис. 2). В первом случае включение БАВ обеспечивается его физической сорбцией в порах заранее сформированных СаСОз матриц (рис. 2 А). В методе соосаждения формирование карбонатных микрочастиц происходит при взаимодействии хлорида кальция и карбоната натрия с одновременным включением в них БАВ (рис. 2 Б).

Эффективность включения методом соосаждения часто выше, чем при сорбции. Вероятно, это можно объяснить тем, что при формировании микрочастиц в присутствии БАВ происходит распределение капсулируемого вещества во всем объеме карбонатной матрицы, а при физической сорбции - преимущественно на ее поверхности.

Для получения микрокапсул карбонатные ядра с иммобилизованным БАВ поочередно инкубировали в растворе положительно или отрицательно заряженного ПЭ (рис. 3). При этом если первым наносили поликатион, на следующем этапе проводили адсорбцию полианиона (рис. 3, стадии 1-3). Данную процедуру последовательно повторяли до образования шести- или семислойной мембраны на

поверхности карбонатных ядер, так как для получения стабильных после удаления матрицы микрокапсул необходимо нанесение минимум 6 слоев ПЭ.

Раствор БАВ 3

^э о Сорбция

СаС1.

Раствор БАВ э

2 + 0° %о"

Рис 2. Способы включения БАВ в СаСОз микрочастицы: сорбцией (А) и соосаждением (Б)

Соосаждение^

На следующем этапе карбонатную матрицу растворяли путем добавления к полученным микрочастицам хелатирующего агента (ЭДТА), который при взаимодействии с ионами Са обеспечивает образование растворимых солсй, легко диффундирующих через ПЭ мембрану (рис. 3, стадия 5). Таким образом, были получены полые микрокапсулы, содержащие БАВ (рис. 3, стадия 6). В качестве модельных БАВ в данной работе были использованы химотрипсин, ДНК и водорастворимые экстракты подорожника и календулы.

1. 2.

СаС03 микрочастицы Адсорбция первого

с иммобилизованным ПЭ (поликатиона) БАВ

РЙ

Адсорбция полианиона

6.

Полые ПЭ микрокапсулы с включенными в них БАВ

Растворение ядра

Формирование ПЭ мембраны !_Ы адсорбцией

Рис. 3. Схема получения микрокапсул с включенными в них БАВ методом послойной адсорбции

Таким образом, основное преимущество метода послойной адсорбции по сравнению с традиционно используемыми технологиями заключается в том, что процесс включения БАВ происходит в физиологических условиях, что позволяет

минимизировать потери биологической активности в процессе получения микрокапсул

1.2. Подходы к биодеструкции микрокапсул

Задачами микрокапсулирования БАВ является его защита от быстрого разрушения в организме и обеспечение постепенного (контролируемого) высвобождения В большинстве существующих методов микрокапсулирования выход инкапсулированного БАВ достигается за счет его диффузии через мембрану микрокапсул В данной работе предложен новый подход, основанный на высвобождении БАВ за счет ферментативного разрушения (биодеградации) полимерной мембраны микрокапсул

В последние годы изучению проницаемости мембраны микрокапсул с целью обеспечения выхода инкапсулированно1 о вещества уделяется особое внимание Так, ранее было показано, что проницаемость и деструкцию ПЭ микрокапсул можно регулировать, воздействуя на них физическими методами (магнитным полем, ультразвуком, лазерным излучением), а также химическим путем (изменением температуры, рН или ионной силы окружающей среды) Предложенный в работе подход к биодеструкции компонентов мембраны под действием ферментов является, на наш взгляд, перспективным, так как ферменты широко представлены в организме человека и животных, при этом различные ферменты локализованы в разных местах организма С этой точки зрения ПЭ микрокапсулы представляют особый интерес, так-как, варьируя состав их полимерной мембраны, можно тем самым, с одной стороны, защитить инкапсулированные БАВ от нежелательного разрушающего действия ферментов, а с другой - обеспечить доставку и выход инкапсулированного БАВ, например, в определенных участках желудочно-кишечного тракта

Разрушение микрокапсул может быть достигнуто в результате действия фермента изнутри или снаружи (рис 4) Как видно из рис 4 А, совместная иммобилизация фермента и БАВ в карбонатную матрицу с последующим нанесением слоев ПЭ позволяет создать систему, при растворении ядра которой происходит разрушение мембраны микрокапсул под действием фермента изнутри, 41 о приводит к выходу БАВ в окружающую среду Высвобождение

инкапсулированного компонента также может быть достигнуто при разрушении компонентов мембраны в результате внешнего действия фермента (рис. 4 Б).

-БАВ

д ____00

<~^>^Растворение ядра ''-чСЗХС^^ Выход БАВ из

ведет к выходу микрокапсул происходит в 4

фермента и БАВ результате ферментативной. _

внутри микрокапсул деградации мембраны ® >.

микрокапсул © £ /

____о V

1 Действие фермента извне О ?! *** приводит к дефадации

мембраны, что способствует выходу инкапсулированного БАВ

Рис. 4. Схема высвобождения инкапсулированного БАВ в результате ферментативной деструкции мембраны микрокапсул

Таким образом, были предложены два способа ферментативной деструкции полимерных мембран микрокапсул (изнутри и извне). Для получения биосовместимых биодеградируемых микрокапсул в данной работе был исследован целый спектр биосовместимых ПЭ, способных формировать мембрану микрокапсул.

1.2.1. Выбор полиэлектролитов В качестве биодеградируемых полимеров для получения микрокапсул были предложены полипептиды, полисахариды и их смеси. Были выбраны: поли-Ь-аспарагиновая кислота (РАвр), поли-Ь-аргинин (РА^), поли-Ь-орнитин (РОгп), поли-Ь-глутаминовая кислота (Р01и), поли-Ь-лизин (РЬЬ), альгинат натрия (А1§), сульфат декстрана (СД), %-каррагинан (Кар) и модифицированный хитозан (четвертичные аммониевые основания хитозана) (Хит). В табл. 1 приведены возможные комбинации противоположно заряженных ПЭ, которые были исследованы в работе с целью получения ПЭ комплексов на поверхности СаССЬ микрочастиц.

Выбор данных ПЭ был обусловлен как широким применением их в медицине и фармацевтической промышленности, так и возможностью использования различных

ферментов для их биодеструкции Следующим этапом был поиск ферментов для разрушения ПЭ мембраны

Таблица 1

Комбинации полимеров для формирования ПЭ чикрокапс) л

Полимеры Состав мембраны

Полипеплиды РА^/РАвр

РОгп/РС1и

Полисахариды Кар/Хит

По липе птиды/по лисахариды РША1ё

РАгё/СД

1.2.2. Выбор ферментов для разрушения мембраны микрокапсул

В данной работе были предлол<ены следующие ферменты трипсин, пепсин, проназа, декстраназа Было исследовано их действие на мембраны микрокапсул, состав которых представлен в табл 1 Выбор фермента, способного расщеплять полимерную мембрану микрокапсул, определяется составом этой мембраны

Так, для разрушения мембран микрокапсул, содержащих в своем составе РЬЬ и РАг», был предложен трипсин, катализирующий гидролиз пептидных связей в данных полимерах Для микрокапсул на основе других потипептидов была предложена проназа, которая, являясь неспецифическим ферментом, обладает широким спектром гидролитического действия по отношению к полипептидам

В случае микрокапсул на основе СД и РАщ была использована декстраназа Известно, что глюкозидные связи в СД гидролизуются под действием специфического фермента декстраназы Действительно, наблюдения с помощью конфокального микроскопа показали, что при инкубации в присутствии данного фермента микрокапсулы (СД/РАг§)3СД, мембрана которых была сформирована из 4 слоев СД и 3 слоев РАг§, разрушаются Далее с целью изучения ферментативной деструкции данных микрокапсул под действием фермента изнутри декстраназа была включена в СаСОз матрицы методом соосаждения Однако наблюдения показали, что в результате соосаждения с декстраназой карбонатные ядра и, соответственно, микрокапсулы, сформированные на их основе, приобретают неправильную

(несферическую) форму Вероятно, это связано со специфическими свойствами декстраназы Данное обстоятельство значительно осложняло проведение дальнейших экспериментов, поэтому на следующем этапе объектом исследования были выбраны микрокапсулы на основе полипептидов, которые разрушали проназой

2. Получение и исследование микрокапсул на основе полипептидов с включенной в них ДНК 2.1. Включение ДНК в PAsp/PArg микрокапсулы

Методом соосаждения (рис 2 Б) в карбонатную матрицу были включены совместно модельный фермент - проназа (Roche, Германия) и модельное БАВ -ДНК (Type IV from herring testes, Sigma, Германия) Выбор в качестве биоактивного компонента ДНК был обусловлен тем, что проназа не проявляет гидролитической активности по отношению к ДНК, и, следовательно, совместная иммобилизация данных веществ без изменения их свойств допустима

Эффективность включения ДНК и проназы составила 95% и 70%, соответственно Концентрацию ДНК в супернатанте определяли методом спектрофотомерии при длине волны 260 нм, а количество проназы - по методу Брэдфорд

Полученные микрочастицы были использованы для формирования (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул методом послойной адсорбции 4 слоев PAsp и 3 слоев PArg Формирование ПЭ мембраны на поверхности СаСОз микрочастиц контролировали путем измерения Z-потенциала поверхности (рис 5)

PArg

PAip

Этапы нанесения ПЭ

поли-Ь-аспарагиновой кислоты и поли-Ь-аргинина на поверхности микрочастиц карбоната кальция

Рис 5 Изменение Z-потенциала при постойной адсорбции

Изменение заряда поверхности от -35mV (последний слой PAsp) до +20 mV (последний слой PArg) и наоборот, было отмечено после каждого этапа адсорбции ПЭ

Растворение ядра осуществляли при 30°С, как описано ранее (рис 3) При этом проназа активизировалась и начинала разрушать компоненты мембраны микрокапсул, инициируя таким образом выход инкапсулированной ДНК Поскольку проназа проявляет протеолитическую активность при температуре 30-40°С, образцы хранили при температуре 4°С до начала проведения эксперимента Выхода инкапсулированных компонентов при этом отмечено не было, что свидетельствовало о стабильности (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул

Таким образом, методом LbL были получены биодеградируемые микрокапсулы с высоким содержанием инкапсулированных компонентов ДНК и проназы

2.2 Исследование деструкции полипептидных микрокапсул под действием

проназы

Наблюдения за деструкцией (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул проводили с использованием конфокальной лазерной ("Leica TCS SP", Leica, Германия) и атомно-силовой микроскопии (Nanoscope III Multimode, Digital Instruments Inc , США)

Было изучено время деструкции (PAsp/PArg^PAsp микрокапсул в зависимости от количества инкапсулированной проназы С этой целью были сформированы микрокапсулы с одинаковой концентрацией ДНК (28,5 мг/мл микрокапсул), но различными концентрациями проназы Были получены три типа микрокапсул

1) с низкой концентрацией (НК) фермента-4,6 мг/мл,

2) со средней концентрацией (CK) проназы - 12,3 мг/мл,

3) с высокой концентрацией (ВК) фермента - 20 мг/мл

Время биодеструкции образцов с НК, CK и ВК проназы оценивали по уменьшению числа микрокапсул Подсчет числа микрокапсул проводили через определенные промежутки времени с использованием конфокальной лазерной микроскопии (программное обеспечение "Igor Pro") Результаты позволили определить кинетику уменьшения числа микрокапсул для каждого из трех типов Микрокапсулы с ВК проназы растворялись очень быстро после удаления

карбонатной матрицы (в течение 1-2 сек). Образец с СК фермента полностью разрушался через 160 мин, а в случае НК проназы время деструкции микрокапсул достигало 38 час. Как и ожидалось, микрокапсулы без фермента (контроль) не подвергались разрушению в течение всего времени эксперимента.

На рис. 6 А-С представлены фотографии микрокапсул с СК концентрацией проназы до и после растворения карбонатной матрицы под действием ЭДТА, полученные с помощью конфокальной микроскопии. Для лучшей визуализации микрокапсул использовали РАг§-ФИТС. Видно, что после инкубации в течение 90 мин при комнатной температуре практически все микрокапсулы растворились (рис. 6 С). Растворение микрокапсул сопровождалось снижением интенсивности флуоресценции (рис. 6 В), которая практически полностью отсутствовала через 90 мин (рис. 6 С).

I; ^ _ _ л ') #ь

Рис. 6. Микрофотографии (PAsp/PArg-FITC)зPAsp микрокапсул в процессе ферментативной деструкции. Конфокальная лазерная микроскопия (А-С). Атомно-силовая микроскопия (Э-Р). (А) Микрочастицы с концентрацией проназы 12,3 мг/мл до растворения ядра, микрокапсулы на их основе через 5 (В) и 90 минут (С) после удаления карбонатной матрицы.

(О) Контрольный образец (без проназы) и микрокапсулы с концентрацией фермента 12,3 мг/мл через 5 (Е) и 60 минут (Р) после удаления карбонатной матрицы.

Морфологию поверхности микрокапсул в процессе их биодеструкции изучали методом атомно-силовой микроскопии (рис 6 D-F) Исследование показало

- Спустя 60 минут после инкубации поверхность микрокапсул характеризовалась наличием многочисленных трещин и расколов

- Средний размер микрокапсул уменьшился с 4,5 до 2,5 мкм сразу после растворения ядра Вследствие очень быстрого протекания данного процесса, микрокапсулы с проназой, не изменившие размер, не могут быть охарактеризованы с помощью силовой микроскопии В контрольном образце (без проназы) размер микрокапсул не изменился (рис 6 D)

- Толщина микрокапсул (данный параметр был изучен путем сжатия и фиксирования микрокапсул на подложке), содержащих проназу и ДНК, возросла с 26 нм (контроль) до 156 нм (рис 6 D, Е) Видимо, увеличение толщины микрокапсул происходило вследствие заполнения микрокапсул инкапсулированными проназой и ДНК Дальнейшее уменьшение толщины микрокапсул до 112 нм (рис 6 F) можно объяснить постепенным выходом инкапсулированных компонентов из микрокапсул в результате ферментативной деструкции образцов

Таким образом, методами конфокальной и атомно-силовой микроскопии было показано, что разрушение (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул происходило в результате ферментативной деструкции полимерной мембраны

2.3. Исследование кинетики выхода ДНК из микрокапсул Микрокапсулы с СК и НК проназы инкубировали при комнатной температуре, что способствовало активации протеолитической активности фермента

Из рис 7 видно, что в случае микрокапсул с СК проназы более 90% инкапсулированной ДНК высвобождалось в течение 2,5 час При этом ее выход осуществлялся в два этапа. Начальный этап характеризовался резким увеличением концентрации ДНК в растворе (77% за 30 мин), затем происходил постепенный выход оставшейся в микрокапсулах ДНК в течение еще 2 час Для микрокапсул с НК фермента наблюдали значительное увеличение времени выхода ДНК на начальном этапе (78% за 6 час) При этом более 90% ДНК было обнаружено в

супернатанте через 30 час В контрольном образце (без проназы) выхода ДНК не наблюдали

.о

о" 120

-♦-Е --О-

--П-

20

-О

Рис 7 Кинетика выхода ДНК из микрокапсул, содержащих

12,3 мг/мл(Ч) и 4,6 мг/мл(п) проназы Контрольный эксперимент

микрокапсулы без проназы (Ж) Приведены данные трех независимых экспериментов

о

10

40

Время, ц

Анализ полученных результатов показал, что высвобождение ДНК из (РАвр/РА^зРАяр микрокапсул происходило несколько быстрее, чем их деструкция Данное обстоятельство указывало на то, что на начальном этапе наблюдали выход ДНК через трещины и поры в мембранах микрокапсул в результате их ферментативного разрушения По нашему мнению, последующее замедление данного процесса связано с постепенным разрушением внутреннего ПЭ комплекса, сформированного ДНК и оставшимися фрагментами мембраны микрокапсул

Была исследована кинетика выхода ДНК из микрокапсул и показано, что характер кривой выхода определяется, как и ожидалось, концентрацией проназы Продемонстрировано, что время выхода ДНК из микрокапсул можно задавать путем варьирования концентрации проназы

Таким образом, были получены биодеградируемые микрокапсулы с включенными в них модельным ферментом (проназой) и модельным БАВ (ДНК) и продемонстрировано, что их совместное включение позволило создать систему с пролонгированным контролируемым высвобождением БАВ

3. Получение и исследование микрокапсул на основе полипептидов и полисахаридов с включенным в них белком 3.1. Включение химотрипсина в А^/РЬЬ микрокапсулы

В качестве модельного БАВ белковой природы для микрокапсулирования использовали химотрипсин Выбор данного фермента определялся тем, что

химотрипсин широко применяется в медицинской практике и часто используется в качестве классического объекта при изучении иммобилизации ферментов, так как его активность легко тестировать.

Микрокапсулы на основе полипептида РЫ и полисахарида А^

были получены путем послойной адсорбции 3 слоев А^ и 3 слоев Р1Х на поверхности карбонатных микрочастиц с последующим растворением карбонатной матрицы. Включение фермента в микрочастицы СаСОз проводили методом сорбции в порах (рис. 2 А), а количество инкапсулированного белка определяли спектрофотометрически (280 нм).

На рис. 8 представлены фотографии микрочастицы СаСОз (А) и ПЭ микрокапсулы, полученной на ее основе (В). Видно, что после растворения СаСОз ядра микрокапсулы сохраняют как форму, так и размер. Это важно, так как в процессе работы было замечено, что в некоторых случаях «осмотический шок», имеющий место при растворении матрицы, покрытой оболочкой из ПЭ комплекса, приводил к увеличению размера образовавшихся микросфер, их деформации и даже разрушению.

Рис. 8. Микрофотографии СаСОз микрочастицы, покрытой 6 слоями ПЭ до растворения (А), в процессе растворения (Б) и микрокапсулы, полученной на ее основе (В). Конфокальная лазерная микроскопия.

Показано, что эффективность капсулирования зависела от соотношения матрица: белок. Так, при инкубации химотрипсина (5 мг/мл) с 50 и 100 мг СаСОз микрочастиц, сорбция составила 31% и 80% от исходного количества белка, соответственно.

Таким образом, метод включения химотрипсина в ПЭ микрокапсулы обеспечивает высокую эффективность капсулирования фермента. Далее была исследована активность инкапсулированного химотрипсина.

3.2. Исследование активности инкапсулированного химотрипсина

Известно, что инкапсулирование ферментов может приводить к снижению их активности. При получении микрокапсул БАВ особенно важно, чтобы инкапсулированное вещество сохраняло свои биологические свойства после иммобилизации. В данной работе активность инкапсулированного (ИнХ) и нативного химотрипсина (НХ) определяли по скорости гидролиза низкомолекулярного субстрата - этилового эфира 1\т-бензоил-Ь-тирозина (БТЭЭ). Анализ результатов гидролиза БТЭЭ НХ и ИнХ (рис. 9) показал, что ИнХ практически полностью сохранял свою активность после микрокапсулирования (86% по сравнению с НХ).

" =

в £ П} С

Ч 5а

Н £ К К

3 *40

г

о

л

Рис. 9. Активность химотрипсина до (1) и после деструкции (А%/Р1Х)з микрокапсул раствором трипсина с концентрациями 10" 4М (2) и !0"бМ (3). За 100% принимали активность нативного фермента. Приведены данные трех независимых экспериментов.

Из рис. 9 видно, что после выхода химотрипсина из микрокапсул, его активность практически не изменилась и составила 82% и 85% после деструкции микрокапсул 10"4М и 10" М растворами трипсина по сравнению с НХ, соответственно.

Таким образом, метод включения белка (химотрипсина) в ПЭ микрокапсулы обеспечивал сохранение активности инкапсулированного компонента. При этом были получены стабильные микрокапсулы, в которых активность фермента сохранялась в течение не менее 2 месяцев.

3.3. Исследование кинетики выхода химотрипсина из микрокапсул С помощью оптической микроскопии было показано, что в результате инкубации в растворе трипсина (А^/РЬЬ)з микрокапсулы растворились в течение 1 час. В контрольном эксперименте (без трипсина) данного эффекта не наблюдали.

На следующем этапе было экспериментально исследовано действие раствора трипсина на полученные микрокапсулы и показано, что время выхода инкапсулированного химотрипсина зависело от концентрации трипсина (рис. 10). В случае концентрации трипсина 10~4М более 90% инкапсулированного химотрипсина было обнаружено в супернатанте через 70 мин, а при концентрации данное

время составило 600 мин.

Показано, что ферментативное разрушение (Alg/PLL)3 микрокапсул под действием трипсина обеспечивает выход инкапсулированного БАВ (химотрипсина). При этом время выхода химотрипсина определяется концентрацией фермента, разрушающего мембраны микрокапсул.

Таким образом, исследование in vitro ферментативной деструкции (Alg/PLL)3 микрокапсул показало, что предложенный метод может быть использован для получения биодеградируемых микрокапсул на основе смеси полипептидов и полисахаридов, которые можно разрушить извне путем обработки ферментом (в данном случае трипсином). Варьируя концентрацию фермента, можно пролонгировать время выхода инкапсулированного БАВ.

4. Получение и исследование микрокапсул на основе полисахаридов с включенными в них БАВ лекарственных растений

4.1. Включение экстрактов подорожника и календулы в Хит/Кар микрокапсулы

Календула лекарственная (Calendula officinalis L.) и подорожник большой (Plantago major) относятся к широко известным лекарственным растениям.

Рис. 10. Кинетика выхода химотрипсина в растворы с различными концентрациями трипсина: Ю^М ( ) и 10"6М (♦). Контрольный эксперимент -без трипсина (А). Приведены данные трех независимых экспериментов.

100 :>iü ХШ 400 500 600 700

Время, МИН

Препараты на основе экстрактов календулы и/или подорожника используются в качестве средств, обладающих противовоспалительным, антисептическим, бактериостатическим эффектами, например, в гастроэнтерологии, при терапии ран В работе для микрокапсулирования были выбраны водорастворимые экстракты подорожника и календулы (ЭПК) (1 1 масс), предоставленные ФГУП «ГНЦ«НИОПИК»

Для изучения возможности использования ПЭ микрокапсул в качестве эффективных форм доставки лекарственного компонента к пораженному участку, в частности для заживления ран, были получены (Хит/Кар)4 микрокапсулы на основе полисахаридов Хит и Кар Выбор данных полимеров был обусловлен как их биосовместимостью, так и широким использованием для создания лекарственных препаратов Более того, следует отметить, что Хит обладает антимикробной активностью, активизирует макрофаги, усиливает пролиферацию фибробластов, что открывает дополнительные перспективы его использования при разработке форм доставки ранозаживляющих компонентов

Включение ЭПК в СаСОз матрицы проводили методом соосаждения (рис 2 Б) Эффективность инкапсулирования составила ~ 65% Концентрацию ЭПК в суиернатанте определяли методом спектрофотомерии при длине волны 326 нм Из литературных данных известно, что в ЭПК присутствует большое количество биофлавоноидов, которые поглощают в данной области спектра Так, из листьев подорожника разными исследователями было выделено 15 соединений этого класса, в экстракте календулы методом ВЭЖХ было определено порядка 14 биофлавоноидов

Таким образом, были получены (Хит/Кар)4 микрокапсулы с включенными в них БАВ (ЭПК) На следующем этапе была исследована кинетика выхода ЭПК из микрокапсул

4.2. Исследование кинетики выхода ЭПК нз мнкрокапсул

В литературе представлены данные по биодеградированию хитозана с помощью протеолитических ферментов, в частности пепсина Микрокапсулы (Хит/Кар)4 инкубировали в растворе искусственного желудочного сока (ИЖС)

(рН 1,2; концентрация пепсина 10 М). Из рис. 11 видно, что на начальном этапе инкубации (в течение первого часа) в супернатанте было обнаружено более 50% инкапсулированного ЭПК. Затем было отмечено замедление скорости выхода БАВ в раствор ИЖС.

Было показано, что при увеличении концентрации пепсина интенсивность выхода ЭПК увеличивалась. Так, в присутствии 10"4М пепсина в течение 3 час наблюдали 85% выход ЭПК, а при уменьшении концентрации фермента до 10'6М за это же время в растворе было обнаружено около 60% экстрактов.

Рис. 11. Кинетика выхода смеси экстрактов подорожника и календулы (1:1 масс.) из (Хит/Кар)4 микрокапсул в растворе ИЖС (рН 1,2; концентрация пепсина 104М)

Можно предположить, что в данных условиях помимо кислотного гидролиза протекает неспецифический гидролиз хитозана пепсином.

Таким образом, была изучена кинетика выхода ЭПК в раствор ИЖС и показано, что время выхода можно регулировать варьированием концентрации пепсина.

4.3. Исследование возможности использования Хит/Кар микрокапсул для

репарации тканей

На следующем этапе для исследования возможности использования (Хит/Кар)4 микрокапсул с ЭПК для репарации ткани в модели язвы желудка у крысы были проведены эксперименты in vivo (совместно с группой проф. С.М.Струковой Биофака МГУ). Для этого группе опытных животных под наркозом апплицировали ледяную уксусную кислоту на серозную оболочку желудка (1x1 см2). Через два часа после операции в желудок через катетер вводили микрокапсулы с ЭПК в 0,5% растворе альгината натрия. Контрольным животным вводили микрокапсулы без ЭПК. Степень заживления ран определяли:

• по изменению площади раны,

• с помощью гистологических исследований образцов грануляционной ткани, взятых из раны на третий и седьмой дни после ранения

Известно, что процесс ранозаживления включает в себя три фазы воспаление, пролиферацию и созревание грануляционной ткани Обычно фаза воспаления длится около 3-х дней, стадия пролиферации завершается к 7-10-му дшо после ранения Фаза воспаления характеризуется присутствием большого количества макрофагов и других клеток (нейтрофилов, лимфоцитов), принимающих участие в остром адаптивном ответе организма Для фазы пролиферации характерно резкое увеличение количества пролиферирующих фибробластов (продуцирующих коллаген и другие структурные компоненты, участвующие в процессе репарации ткани), а также образование сосудов в грануляционной ткани (ангиогенез) Фибробласты можно наблюдать в ране уже на 3-ий день после ранения, однако на 7-ой день их количество достигает максимального значения

Исследование динамики заживления язвы показало, что на 3 сутки эксперимента в опытных группах животных площадь язв уменьшалась на 65,6%, а на 7 сутки - на 49,7% по сравнению с контрольной группой животных

В первой серии экспериментов проводили гистологический анализ срезов образцов ткани, взятой в очаге язвообразования на 3 сутки после операции, когда быстрая экссудативно-воспалитепъная фаза завершается и начинается процесс формирования грануляционной ткани (рис 12) У животных контрольной группы среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы (62,3±1,5%) и макрофаги (36,3±1,2%) На фоне массивной инфильтрации нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, отека, неравномерного полнокровия сосудов в контрольной группе были выявлены только единичные фибробласты (1,3±0,32%) (рис 12 В)

У животных опытной группы наблюдали увеличение (по сравнению с контролем) фибробластов (10,7±1,7%), что свидетельствовало о начале второй фазы (пролиферации) (рис 12 Б) В опытной группе содержание нейтрофилов было в 2 раза ниже, а фибробластов в 8 раз выше, чем в контроле Таким образом, у

животных, получавших микрокапсулы с ЭПК, отмечено более раннее наступление фазы пролиферации.

Рис. 12. Морфологические изменения подслизистой оболочки желудка у крыс на 3 сутки эксперимента (п=6). Окраска гематоксилином и эозином (х400). А - Контрольная группа (введение пустых микрокапсул). Подслизистый слой разрушен, преобладают нейтрофилы.

Б - Опытная группа (введение микрокапсул с ЭПК). В подслизистом слое наблюдается рыхлая

соединительная ткань, преобладают макрофаги.

В - Содержание клеток (%) на 3 сутки язвообразования в контрольной и опытной группах: □ - нейтрофилы, макрофаги, (ЩИ - фибробласты. *р<0.05 по сравнению с контролем.

Контрольная группа

Опытная группа

Рис. 13. Морфологические изменения подслизистой оболочки желудка у крыс на 7 сутки эксперимента (п=6). Окраска гематоксилином и эозином (х400). А - Контрольная группа (введение пустых микрокапсул). В подслизитой оболочке желудка видны единичные коллагеновые волокна, преобладают макрофаги.

Б - Опытная группа (введение микрокапсул с ЭПК). В подслизистой оболочке видны коллагеновые волокна, преобладают макрофаги и фибробласты. В - Содержание клеток (%) на 7 сутки заживления язв в контрольной и опытной

Шппах: □ - нейтрофилы, - макрофаги, 111ш1 - фибробласты. *р<0.05 по сравнению с контролем.

Во второй серии экспериментов анализировали срезы образцов ткани, взятой в очаге язвообразования на 7 день после операции (рис. 13). Как видно из рис. 13 Б, в грануляционной ткани опытных животных преобладают ориентированные фибробластические элементы, около которых выявляется рыхлая сеть

Контрольная группа Опытная группа

межклеточного матрикса Отмечено статистически достоверное снижение количества нейтрофилов (на 14,7%), а также увеличение количества фибробластов (на 9,6%) (по сравнению с контрольной группой) (рис 13 В)

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что использование микрокапсулированных ЭПК при экспериментальной язве ускоряло пролиферацию фибробластов и формирование коллагеновых волокон, что способствовало ускоренному процессу заживления повреждений подслизистой желудка Мы полагаем, что на основе полученных микрокапсул могут быть созданы новые эффективные препараты для терапии ран с контролируемым выходом биоактивного соединения

ВЫВОДЫ

1 Предложены и оптимизированы два метода (сорбция и соосаждение) включения биоактивных соединений (химотрипсин, проназа, ДНК, экстракты подорожника и календулы) в СаСОз микрочастицы

2 Подобраны биодеградируемые полиэлектролиты (поли-Ь-аспарагиновая кислота, поли-Ь-аргинин, поли-Ь-лизин, альгинат натрия, сульфат декстрана, х-каррагинан и модифицированный хитозан) для формирования мембран на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция и на их основе методом LbL получены микрокапсулы с высоким содержанием капсулируемого вещества (не менее 95%, 75% и 65% в случае ДНК, белка и смеси экстрактов подорожника и календулы, соответственно)

3 Показано, что биодеградируемость микрокапсул можно обеспечить путем их обработки ферментами изнутри (в случае совместного инкапсулирования фермента и БАВ) или снаружи путем обработ ки микрокапсул раствором фермента При этом выбор фермента определяется составом полимерной мембраны, а время выхода БАВ можно регулировать, варьируя концентрацию фермента

4 Исследована кинетика выхода ДНК, инкапсулированной совместно с проназой, из (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул в модели in vitro Показано, что время выхода ДНК

можно регулировать от нескольких минут до нескольких часов путем варьирования концентрации фермента

5 Изучена активность химотрипсина, инкапсулированного в (Alg/PLL)3 микрокапсулы, и показано, что фермент сохраняет не менее 86% от активности нативного

6 Показано, что кинетика выхода химотрипсина из (Alg/PLL)3 микрокапсул в результате их обработки раствором трипсина (10 и 10 iVl) зависела от концентрации последнего При концентрации трипсина Ю^М более 90% инкапсулированного химотрипсина было обнаружено в супернатанте через 70 мин, а при концентрации 10 6М - через 600 мин

7 Исследована кинетика выхода экстрактов подорожника и календулы из (Хит/Кар)4 микрокапсул в модели in vitro (искусственный желудочный сок) Продемонстрировано, что при увеличении концентрации пепсина с 10"6 до 10~4М количество вышедшего из микрокапсул ЭПК увеличивалась с 60% до 85% за 3 час

8 Изучена возможность использования (Хит/Кар)4 микрокапсул с инкапсулированными в них экстрактами подорожника и календулы для репарации тканей и показано, что они ускоряют заживление язвы желудка в модели на крысах

Автор выражает благодарность проф ¡Кунижеву С М (Ставропольский государственный университет) за помощь в выборе темы диссертации и постоянный интерес к работе, проф Сухорукову Г Б за возможность выполнения части экспериментов в институте Макса Планка МР1КО (г Гольм, Германия) и Университете королевы Марии <ЗМЬТЬ (г Лондон, Англия), проф Румшу Л Д и д-ру Кгей О за полезные дискуссии и помощь в работе

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах

1 Borodina Т., Markvicheva Е , Kumzhev S , Mohwald Н, Sukhorukov G, Kreft О Controlled release of DNA from self-degrading microcapsules Macromol Rapid Commun, 2007,28, 1894-1899

2 Бородина TH, Румш ЛД, K\ннжсв CM, Сухорукое ГБ, Воронцов ГН, Фельдман БМ, Марквичева ЕА Полиэтектротитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ Биомедицинская химия, 2007, 53(5), 557-565

3 Бородина Т Н , Румш JIД, Кунижев С М , Сухоруков Г Б , Ворожцов Г Н, Фельдман Б М , Русанова АВ, Васильева ТВ, Струкова СМ, Марквичева ЕА Включение экстрактов лекарственных растений в биодеградируемые микрокапс}лы Биомедицинская химия, 2007, 53(6), 662-671

4 Кунижев С М, Бородина Т.Н , Воробьева О В , Денисова Е В , Андрусенко С Ф Способ получения микрокапсул Патент № 2316390 Положительное решение от 28 06 2007 Выдан 10 02 2008

5 Кунижев С М Бородина Т Н Разработка способов доставки БАВ к клеточным системам организма человека с помощью микрокапсулирования Материалы Второго съезда общества биотеч'нологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 13-15 октября, 2004), Тезисы докладов, стр 37-38

6 Бородина Т Н, Ковальков В И Биотехнология получения микрокапсулированного эргокальциферола с целью профилактики рахита Тезисы научно-практической конференции «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 22-23 июня, 2005), Тезисы докладов, стр 15

7 Бородина Т Перспективы использования микрокапсулированных биологически активных веществ в медицине II научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 12-14 сентября, 2005), Тезисы докладов, стр 5

8 Бородина ТН Разработка биотехнологии получения наностр*, ктуриро ванных биологически активных веществ Материалы Третьего съезда общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 25-27 октября, 2005), Тезисы докладов стр 34

9 Кунижев С М, Бородина Т Н, Найденова Г А, Алиева Э Р Разработка способа микрокапсулирования БАВ 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - на> ка XXI века» (П5 щино, 18-22 апереля, 2005), Тезисы докладов, стр 339

10 Бородина ТН Микрокапсулирование БАВ VIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химическои биологии и биотехнологии» (Москва, 7-10 февраля, 2006), Тезисы докладов, стр 88

11 Бородина Т Н , Кунижев С М , Румш Л Д, Марквичева Е А Иммобилизация ферменгов в полиэлектролитные микрокапсулы VI симпозщм Химия протеолитических ферментов (Москва, 23-25 апреля, 2007), Тезисы докладов, стр 164

12 Markvichcva Е А , Stashevskaya К S , Borodina Т N , Rusanova А V , Strukova S М , Kosacheva Т Р , Feldman В М , Vorozhtsov GN , Rumsh L D Biodegradable microparticles/microcapsules and application for tissue repair XV International conference 'New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology" (Gurzuf, Ukraine May 31-9 June, 2007), Proceedings, pp 308-309

13 Borodina T, Rumsh L, Kunizhev S , Sukhorukov G, Kreft O, Markvicheva E Enzyme-mediated disintegration of polyelectrolyte microcapsules loaded with DNA and proteins XV International workshop on Bioencapsulation (Vienna, Sept 6-8, 2007), Proceedings (4 pages), talk S7-4

14 Markvicheva E, Borodina T, Rumsh L, Kreft O, Sukhorukov G Biodegradable pohelcctrolytc microcapsules loaded with vanous therapeutic agents for biomedical applications XV International workshop on Bioencapsulation (Vienna, Sept 6-8, 2007), Proceedings (4 pages), P3-13

15 Бородина ТН., Румш ЛД, Кунижев СМ, Сухоруков ГБ, Марквичева ЕА Полиэлектролитные биодеградир} емые микрокапсулы с растительными экстрактами на основе коллоидных микрочастиц карбоната кальция III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 24-28 июня, 2008), Тезисы докладов

Подписано в печать 14 мая 2008 г

Формат 60x90/16

Объем 1,5 п л

Тираж 100 экз

Заказ № 140508128

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес 117292, г Москва, ут Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тет 740-76-47, 125-22-73 http //'www univerpnnt ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Бородина, Татьяна Николаевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация методов иммобилизации биологически активных веществ.

1.2. Липосомы.

1.3. Микрокапсулы.

1.3.1. Основные преимущества и недостатки процесса микрокапсул ирования.

1.3.2. Полимерные материалы для микрокапсулирования биологически активных веществ.

1.3.3. Методы микрокапсулирования биологически активных веществ.

1.3.3.1. Физические методы микрокапсулирования.

1.3.3.1.1. Напыление в псевдоожиженном слое.

1.3.3.1.2. Микрокапсулирование экструзией.

1.3.3.1.3. Микрокапсулирование путем конденсации паров.

1.3.3.2. Химические методы микрокапсулирования.

1.3.3.2.1. Микрокапсулирование поликонденсацией.

1.3.3.2.2. Метод полимеризации.

1.3.3.2.3. Дубление мембран микрокапсул.

1.3.3.3. Аэрозольный метод микрокапсулирования.

1.3.3.4. Физико-химические методы микрокапсулирования.

1.3.3.4.1. Методы эмульгирования.

1.3.3.4.2. Микрокапсулирование в расплавы.

1.3.3.4.3. Высушивание распылением.

1.3.3.4.4. Методы основанные на простой и сложной коацервации.

1.4. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом послойной адсорбции.

1.4.1. Интерполиэлектролитные комплексы.

1.4.2. Интерполиэлектролитные комплексы для микрокапсулирования биологически активных веществ.

1.4.3. Подбор полиэлектролитов для формирования микрокапсул.

1.4.4. Технология послойной адсорбции полиэлектролитов.

1.4.5. Формирование полых микрокапсул.

1.4.6. Полиэлектролитные микрокапсулы как способы доставки биологически активных веществ.

1.4.6.1. Инкапсулирование высомолекулярных биологически активных веществ.

1.4.6.2. Некоторые подходы к регулированию выхода биологически активных веществ из микрокапсул.

1.4.6.2.1. Ферментативная деструкция полиэлектролитных микрокапсул.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений"

Сегодня трудно назвать область науки или производства, где микро- и нанотехнологии не нашли бы своего применения или эффективность их использования не была бы очевидна или принципиально доказана. Нанобиотехнологии все более широко используются в биотехнологии и биомедицине. В биомедицине особое внимание уделяется нано- и микрокапсулам. Это связано с тем, что микрокапсулирование позволяет:

- защитить биологически активные вещества (БАВ), такие как витамины, антибиотики, ферменты, вакцины и др. от окисления под воздействием внешней среды;

- разделить реагирующие между собой биоактивные компоненты в составе одного лекарственного препарата;

- обеспечить пролонгированный выход БАВ или его высвобождение в нужный момент времени;

- придать микрокапсулированным продуктам новые физические свойства.

Микрокапсулы используются как микроконтейнеры при разработке новых эффективных форм лекарств с пролонгированным и/или контролируемым высвобождением активных компонентов (белков, в том числе ферментов, пептидов, гормонов, различных антигенов, ДНК, РНК и т.д.). Благодаря возможности варьировать размер, структуру и физико-химические свойства микрокапсул, их можно применять в качестве систем доставки противоопухолевых и противомикробных препаратов, а также в генной терапии.

В настоящее время существует большое количество методов микрокапсулирования, однако далеко не все из них могут быть предложены для биомедицинских целей из-за достаточно жестких способов получения микрокапсул (использование повышенных температур, органических растворителей и других токсичных веществ, снижающих активность микрокапсулированных БАВ).

С этой точки зрения весьма перспективной является технология послойной (Ьауег-Ьу-Ьауег (ЬЬЬ)) адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов (ПЭ) на неорганических коллоидных микрочастицах. Метод ЬЬЬ является простым и универсальным подходом с точки зрения выбора как ПЭ, так и спектра веществ, которые можно инкапсулировать. Для получения микрокапсул с помощью данной технологии не требуется трудоемких методов полимерной химии. Кроме того, использование этого метода позволяет выполнять микрокапсулирование в физиологических условиях (температура, рН), что особенно важно при работе с лабильными биоактивными соединениями. Метод ЬЬЬ был разработан для формирования ПЭ микрокапсул на основе небиодеградируемых небиосовместимых синтетических полимеров, которые невозможно было использовать для создания систем доставки БАВ. Поэтому нам представлялось интересным предложить спектр биосовместимых биодеградируемых ПЭ для формирования мембраны микрокапсул. Кроме того, биодеградируемые микрокапсулы позволяют решить еще одну интересную и актуальную задачу, а именно - создание новых препаратов (инкапсулированных БАВ, терапевтических агентов и др.), время выхода которых можно регулировать путем контролируемого разрушения мембран микрокапсул с использованием соответствующих ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение полиэлектролитных микрокапсул на основе биосовместимых биодеградируемых полимеров с иммобилизованными в них биоактивными соединениями (белками, в частности ферментами, ДНК, экстрактами лекарственных растений), время выхода которых можно контролировать; исследование свойств таких микрокапсул и возможности применения в биомедицине, в частности для репарации тканей.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Предложить и оптимизировать методы включения биоактивных соединений (химотрипсин, проназа, ДНК, экстракты подорожника и календулы) в СаСОз микрочастицы.

2. Выбрать биодеградируемые ПЭ для формирования мембран на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция и на их основе методом ЬЬЬ получить микрокапсулы.

3. Исследовать возможность контролируемой биодеструкции микрокапсул в результате действия ферментов изнутри и снаружи.

4. Изучить активность биоактивных соединений (на примере инкапсулированного химотрипсина).

5. Исследовать кинетику выхода биоактивных соединений (ДНК, химотрипсина, экстрактов подорожника и календулы) при ферментативной деструкции ПЭ микрокапсул.

6. Продемонстрировать возможность использования микрокапсул с инкапсулированными в них экстрактами подорожника и календулы для репарации тканей в модели язвы желудка (крысы).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бородина, Татьяна Николаевна

выводы

1. Предложены и оптимизированы два метода (сорбция и соосаждение) включения биоактивных соединений (химотрипсин, проназа, ДНК, экстракты подорожника и календулы) в СаСОз микрочастицы.

2. Подобраны биодеградируемые полиэлектролиты (поли-Ь-аспарагиновая кислота, поли-Ь-аргинин, поли-Ь-лизин, альгинат натрия, сульфат декстрана, %-каррагинан и модифицированный хитозан) для формирования мембран на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция и на их основе методом LbL получены микрокапсулы с высоким содержанием капсулируемого вещества (не менее 95%, 75% и 65% в случае ДНК, белка и смеси экстрактов подорожника и календулы, соответственно).

3. Показано, что биодеградируемость микрокапсул можно обеспечить путем их обработки ферментами изнутри (в случае совместного инкапсулирования фермента и БАВ) или снаружи путем обработки микрокапсул раствором фермента. При этом выбор фермента определяется составом полимерной мембраны, а время выхода БАВ можно регулировать, варьируя концентрацию фермента.

4. Исследована кинетика выхода ДНК, инкапсулированной совместно с проназой, из (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул в модели in vitro. Показано, что время выхода ДНК можно регулировать от нескольких минут до нескольких часов путем варьирования концентрации фермента.

5. Изучена активность химотрипсина, инкапсулированного в (Alg/PLL)3 микрокапсулы, и показано, что фермент сохраняет не менее 86% от активности нативного.

6. Показано, что кинетика выхода химотрипсина из (Alg/PLL)3 микрокапсул в результате их обработки раствором трипсина (10" и 1(ПМ) зависела от концентрации последнего. При концентрации трипсина 10"4М более 90% инкапсулированного химотрипсина было обнаружено в супернатанте через 70 мин, а при концентрации 10"6М - через 600 мин.

7. Исследована кинетика выхода экстрактов подорожника и календулы из (Хит/Кар)4 микрокапсул в модели in vitro (искусственный желудочный сок). Продемонстрировано, что при увеличении концентрации пепсина с 10"6 до Ю^М количество вышедшего из микрокапсул ЭПК увеличивалась с 60% до 85% за 3 час.

8. Изучена возможность использования (Хит/Кар)4 микрокапсул с инкапсулированными в них экстрактами подорожника и календулы для репарации тканей и показано, что они ускоряют заживление язвы желудка в модели на крысах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность следующим коллегам:

-Проф. д.техн.н. |С.М.Кунижеву| (Ставропольский государственный университет) за помощь в выборе темы диссертации, продолжительный интерес и неоценимую поддержку;

-Проф. Г.Б.Сухорукову за помощь в оформлении стипендии DAAD и FEBS и предоставление возможности выполнения части экспериментов в институте Макса Планка MPIKG (г. Гольм, Германия) и Университете королевы Марии QMUL (г. Лондон, Англия), а также сотрудникам MPIKG T.Mauser, Д.Андреевой, Д.Щукину, А.Скиртачу и Д.Разюк за неоценимые консультации при проведении экспериментов;

-Д-ру O.Kreft за помощь при выполнении экспериментов по капсулированию ДНК и подачу новых идей, положенных в основу диссертационной работы; -Проф. Л.Д.Румшу за неоценимые консультации и поддержку в период выполнения части работы с использованием химотрипсина и растительных экстрактов;

-Проф. С.М.Струковой за сотрудничество при исследовании эффективности микрокапсул in vivo на модели язвы желудка у крысы,

-A.Heilig за помощь в освоении атомно-силовой микроскопии, а также всем сотрудникам лаборатории Полимеры для биологии за постоянную помощь и доброжелательное отношение;

Особую благодарность автор выражает научному руководителю Е.А.Марквичевой за возможность проведения работы под ее внимательным руководством, помощь в проведении экспериментов, своевременные и полезные дискуссии при обсуждении полученных результатов, а также помощь при написании данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Бородина, Татьяна Николаевна, Москва

1. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. - М.: Мир, 1988, 215с.

2. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ.- Вопр. мед. химии, 1999, т.45, №1, с. 3-13.

3. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. (Ред. Л. М. Чайлахян) М.: Наука, 1986, 240с.

4. Бабак В.Г. Коллоидная химия в технологии микрокапсулирования. (Ред. Т.В. Мамонтова) 4.1. Свердловск: Изд-во Урал. Ун-та, 1991, 171с.

5. Солодовник В.Д. Микрокапсулирование. (Ред. Г.М. Медников)- М.: Химия, 1980,216с.

6. Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф. Микрокапсулирование физиологически активных веществ и их применение в медицине. М.: Итоги науки и техники, 1986, Сер. Биотехнология, т.6, с.6-52.

7. Штильман М.И. Полимеры в биологически активных системах. -Соросовский образовательный журн., 1998, т.4, №5, с. 48-53.

8. Lameiro М.Н., Lopes A., Martins L.O., Alves P.M., Melo E. Incorporation of a model protein into chitosan-bile salt microparticles. Int. J. Pharm., 2006, v.312, №1, p. 119-130.

9. Grenha A., Seijo В., Remunan-Lopez C. Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery. Eur. J. Pharm. Sci., 2005, v.25, № 4-5, p. 427-437.

10. Lambert G., Fattal E., Couvreur P. Nanoparticulate systems for the delivery of antisense oligonucleotides. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2001, v. 47, № 1, p. 99-112.

11. G. De Rosa, Quaglia F., M. La Rotonda, Besnard M., Fattal E. Biodegradable microparticles for the controlled delivery of oligonucleotides. Int. J. Pharm., 2002, v. 242, № 1-2, p. 225-228.

12. Hattori Y., Maitani Y. Folate-linked lipid-based nanoparticles for targeted gene delivery. Curr. Drug. Deliv., 2005, v. 2, № 3, p. 243-252.

13. Lu L., Yaszemski M.J., Mikos A.J. TGF-ßl Release from Biodegradable Polymer Microparticles: Its Effects on Marrow Stromal Osteoblast Function. The Journal of Bone and Joint Surgery, 2001, v. 83, p. 82-92.

14. Березин И.В., Клячко H.JI., Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987, 157с.

15. Афанасьев А.Г. Химия за рубежом (Применение микрокапсул: обзор с примерами). М.: Знание, 1985, 48с.

16. Piskin Е. Biodegradable polymers as biomaterials. J. Biomater. Sei. Polym. Ed., 1995, v. 6, №9, p. 775-795.

17. K.Y. Win, S. Feng. Effects of particle size and surface coating on cellular uptake of polymeric nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials, 2005, v. 26, p. 2713-2722.

18. Thies C. Microencapsulation of food ingredients. (Ed. by Per Vilstrup) -Leatherhead publishing, 2001, 270p.

19. Shahidi F., Han X.-Q. Encapsulation of food ingredients. Critical Reviews in food science and nutrition, 1993, v.33, № 6, p.501-547.

20. Nawar W.W. Lipids./ In. Fennema O, Food Chemistry. New York: Marcel Dekker, 1996, p.225-320.

21. Тимофеев Б.А. Профилактика лекарственных осложнений у сельскохозяйственных животных.- М.: Росагропромиздат, 1989, 160 с.

22. Williams D.F., Zhong S.P. Biodeterioration/biodegradation of polymeric medical devices in situ. International Biodeterioration & Biodegradation, 1994, v.95, p. 95130.

23. Sommerville G.R. USA Patent 3 015 128, 1962.

24. Luzzi L., Palmieri A. An overview of pharmaceutical applications./ In. Biomedical applications of microencapsulation (F. Lim, Ed.). Florida: CRC Press, 1984. p.1-18.

25. Chang T.M.S. Artificial Cell Biotechnology for Medical Applications. Blood Purif., 2000, v.18, p.91-96.

26. Lim F. Microencapsulation of living cells and tissues-theory and practice./ In: Biomedical application of microencapsulation (F. Lim ed.). Florida: CRC Press, 1984, p.137-154

27. Чанг T.M.C. Полимеры в медицине. (Ред. Платэ Н.А.) Пер. с англ. М.: Мир, 1969, 240с.

28. Chang T.M.S. Enzymes Immobilized by Microencapsulation Within Spherical Ultrathin Polymeric Membranes. J. Macromol. Sci. A, v. 10, № 1-2, p.245-258.

29. Speiser P. Microencapsulation by coacervation, spray encapsulation and nanencapsulation./ In. Drugs and Pharmaceutical Science (Ed. Nixon J.R.) N.Y.: Marcel Dekker, 1976, p. 1-20.

30. Robbis R.C., Thomas J.J., Cadle R.D. Aerosol particle encapsulation by simultaneous condensation and polymerization J. Coll. Sci., 1963, v. 18, № 5, p.483-485.

31. Langer G., Yamate G. Encapsulation of liquid and solid aerosol particles to form dry powders. J. Coll. Interface Sci., 1969, v.29, № 3, p.450-455.

32. Vert M., Schwach G., Engel R., Coudane J. Something new in the field of PLA/GA bioresorbable polymers. J. Control. Release, 1998, v. 53, p. 85-92.

33. Kim C.K., Yoon Y.S., Kong J.Y. Preparation and evaluation of flurbiprofen dry elixir as a novel dosage form using a spray-drying technique. Int. J. Pharma, v. 120, p.21-31.

34. Green B.K., Schleicher L. Oil-containing microscopic capsules and method of making them /USA Patent 2800457, 1957.

35. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов. ВМС, 1994. т. 36. № 2, с. 183-197.

36. Biesheuvel P.M., Stuart М. А. С. Electrostatic Free Energy of Weakly Charged Macromolecules in Solution and Intermacromolecular Complexes Consisting of Oppositely Charged Polymers. Langmuir, 2004, v. 20, p. 2785-2791.

37. Зезин А.Б. Кооперативные реакции между полиэлектролитами и полиэлектролитные комплексы. Диссертация докт. хим. наук., М.: МГУ, 1977, 370С.

38. Зезин А.Б., Луценко В.И., Рогачева В.Б. Кооперативное взаимодействие полиэлектролитов в водных растворах. ВМС А, 1972, т. 14, №4, с. 772-779.

39. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов. Успехи химии, 1982, т. 51, №9, с. 1447-1483.

40. Зезин А.Б., Рогачева В.Б., Комаров B.C., Разводовский Е.Ф. Образование амидных связей в полиэлектролитных комплексах. ВМС А, 1975, т.17, №12, с. 2637-2643.42. http://www.xumuk.rU/encyklopedia/2/3526.html

41. Алюшин М.Т., Ли В.Н., Алексеев К.В. и др. Полимеры в фармации. (Ред. А. И. Тенцова, М. Т. Алюшин) М.: Медицина, 1985, 254с.

42. Платэ Н. А., Васильев А. Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986, 296с.

43. Tiourina О.Р., Sukhorukov G.B. Multilayer alginate/protamine microsized capsules: encapsulation of a-chymotrypsin and controlled release study.- Inter. J. of pharm., 2002, v. 242, № 1-2, p.155-161.

44. Sukhorukov GB, Donath E, Moya S, Susha AS, Voigt A, Hartmann J, Mohwald H. Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes. J Microencapsul., 2000, v. 17, № 2, p. 177-185.

45. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E., Mohwald H. Polyelectrolyte complexes and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. -Biomacromolecules, 2002, v. 3, № 3, p.579-590.

46. Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Получение и характеристика полиэлектролитных частиц с белком. Биохимия, 2004, т. 69, №7, с.930-936.

47. Платэ Н.А. Полимеры для медицины. Наука в СССР, 1986, № 1, с.2-9

48. Синтетические полимеры медицинского назначения: Тез. докл. VII всесоюз. симпоз. (Ред. Л. И. Валуев). Минск: Университетское, 1985, 114с.

49. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. (Ред. Т.Н. Сергеева) М.: Наука, 1984, 261с.

50. Iler R.K. Multilayers of colloidal particles. J. Colloid Interface Sci.,1966, v.21, № 6, p. 569-594.

51. Hammond P.T. Recent explorations in electrostatic multilayer thin film assembly, Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 1999, v.4, № 6, p. 430-442.

52. Decher G.; Schlenoff J.B. Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials. Wiley-VCH, Weinheim, 2003, p.14-69.

53. Decher G. Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicomposites. -Science, 1997, v. 277, p. 1232-1237.

54. Gao M.Y., Richter В., Kirstein S. and Mohwald H. Electroluminescence studies on self-assembled films of PPV and CdSe nanoparticles. J. Phys. Chem. B, 1998, v. 102, №21, p. 4096-4103.

55. Gao M.Y., Gao M.L., Zhang X., Yang Y., Yang B. and Shen J.C. Constructing PbI2 Nanoparticles into a Multilayer Structure Using the Molecular Deposition (Md) Method. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994, v. 24, p. 2777-2778.

56. Feldheim D.L., Grabar K.C., Natan MJ. and Mallouk T.E. Electron transfer in self-assembled inorganic polyelectrolyte/metal nanoparticle heterostructures. J. Amer. Chem. Soc., 1996, v. 118, № 32, p. 7640-7641.

57. Schmitt J., Decher G., Dressick W.J., Brandow S.L., Geer R.E., Shashidhar R. and Calvert J.M. Metal nanoparticle/polymer superlattice films: Fabrication and control of layer structure. Adv. Mater., 1997, v. 9, № 1, p. 61-66.

58. Kotov N.A. Layer-by-layer self-assembly: The contribution of hydrophobic interactions. Nanostructured Materials, 1999, v. 12, p.789-796.

59. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A., Möhwald H. Colloids Surfaces A, 1998, v. 137, p.253-266.

60. Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.l., Möhwald H. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: a novel approach to colloid design. Polym. Adv. Technol., 1998, v. 9, № 10-11, p.759-767.

61. Peyratout C.S., Dähne L. Tailor-Made Polyelectrolyte Microcapsules: From Multilayers to Smart Containers. Angew. Chem. Int. Ed., 2004, v. 43, № 29, p.3762-3783.

62. Gao C., Moya S., Donath E., Möhwald H. Melamine Formaldehyde Core Decomposition as the Key Step Controlling Capsule Integrity: Optimizing the Polyelectrolyte Capsule Fabrication. Macromol. Chem. Phys., 2002, v. 203, № 7, p.953-960.

63. Dejugnat C., Sukhorukov G.B. pH-Responsive Properties of Hollow Polyelectrolyte Microcapsules Templated on Various Cores. Langmuir, 2004, v.20, № 17, p.7265-7269.

64. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B., Möhwald H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. -Colloids Surfaces A, 2003, v. 224, № 1-3, p.175-183.

65. Adalsteinsson T., Dong W.-F., Schönhoff M. Diffusion of 77 000 g/mol Dextran in Submicron Polyelectrolyte Capsule Dispersions Measured Using PFG-NMR. J. Phys. Chem. B, 2004, v. 108, № 52, p.20056-20063.

66. Itoh Y., Matsusaki M., Kida T., Akashi M. Preparation of Biodegradable Hollow Nanocapsules by Silica Template Method. Chem. Lett., 2004, v. 33, № 12, p. 15521553.

67. Köhler K., Shchukin D.G., Möhwald H., Sukhorukov, G.B. Thermal Behavior of Polyelectrolyte Multilayer Microcapsules. 1. The Effect of Odd and Even Layer Number. J. Phys. Chem. B, 2005, v.109, № 39, p.18250-18259.

68. Sukhorukov G.B., Volodkin D.V., Günther A.M., Petrov A.I., Shenoy D.B., Möhwald H. Porous calcium carbonate microparticles as templates for encapsulation of bioactive compounds. J. Mater. Chem., 2004, v. 14 , p.2073-2081.

69. Antipov A.A., Sukhorukov G.B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Adv. Colloid Interface Sei., 2004, v. Ill, № 1-2, p.49-61.

70. Sukhorukov G.B., Brumen M., Donath E., Möhwald H. Hollow Polyelectrolyte Shells: Exclusion of Polymers and Donnan Equilibrium. J. Phys. Chem. B, 1999, v. 103, p. 6434-6440.

71. Ibarz G., Dähne L., Donath E., Möhwald H. Smart Micro- and Nanocontainers for Storage, Transport, and Release. Adv. Mater., 2001, v. 13, p. 1324-1327.

72. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B., Leporatti S., Khomutov G B., Donath E., Möhwald H. Assembly of Alternated Multivalent Ion/Polyelectrolyte Layers on

73. Colloidal Particles. Stability of the Multilayers and Encapsulation of Macromolecules into Polyelectrolyte Capsules. J. Colloid Interface Sei., 2000, v. 230, p. 272-280.

74. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B, Möhwald H. Incorporation of macromolecules into polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface controlled precipitation on colloidal particles. Colloids Surfaces A, 2002, v. 202, p. 127-133.

75. Dähne L., Leporatti S., Donath E., Möhwald H. Fabrication of Micro Reaction Cages with Tailored Properties. J. Am. Chem. Soc., 2001, v. 123, p. 5431-5436.

76. Qiu X., Donath E., Möhwald H. Permeability of Ibuprofen in Various Polyelectrolyte Multilayers. Macromol. Mater. Eng, 2001, v. 286, p. 591-597.

77. Caruso F., Yang W., Trau D. Renneberg, R. Microencapsulation of Uncharged Low Molecular Weight Organic Materials by Polyelectrolyte Multilayer Self-Assembly. Langmuir , 2000, v. 16, p. 8932-8936.

78. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Möhwald H. Sustained Release Properties of Polyelectrolyte Multilayer Capsules. J. Phys. Chem. B, 2001, v. 105, p. 2281-2284.

79. Дарбре А. Практическая химия белка. M.: Мир, 1989, 621с.

80. Lvov Y., Antipov A.A., Mamedov A., Möhwald H., Sukhorukov G.B. Urease Encapsulation in Nanoorganized Microshells. Nano. Lett., 2001, v.l, p. 125-128.

81. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Leporatti S., Radtchenko I.L., Donath E., Möhwald H. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control. Colloids Surfaces A, 2002, v. 198-200, p. 535-541.

82. Sukhorukov G.B., Antipov A.A., Voigt A., Donath E., Möhwald H. pH-Controlled Macromolecule Encapsulation in and Release from Polyelectrolyte Multilayer Nanocapsules. Macromol. Rapid Commun., 2001, v. 22, p. 44-46.

83. Dejugnat С., Halozan D., Sukhorukov G.B. Defined Picogram Dose Inclusion and Release of Macromolecules using Polyelectrolyte Microcapsules. Macromol. Rapid Commun., 2005, v. 26, p. 961-967.

84. Tong W., Gao C., Mohwald H. Stable Weak Polyelectrolyte Microcapsules with pH-Responsive Permeability. Macromolecules, 2006, v. 39, p. 335-340.

85. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Leporatti S., Radtchenko I.L., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2002, v. 198, p. 535-541.

86. El-Hashani A., Toutianoush A., Tieke B. Layer-by-layer assembled membranes of protonated 18-azacrown-6 and polyvinylsulfate and their application for highly efficient anion separation. J Phys Chem В., 2007, v. 111, № 29, p. 8582-8588.

87. Skirtach A.G., Antipov A.A., Shchukin D.G., Sukhorukov G.B. Remote Activation of Capsules Containing Ag Nanoparticles and IR Dye by Laser Light. -Langmuir, 2004, v. 20, p. 6988-6992.

88. B.G. De Geest, Vandenbroucke R.E., Guenther A.M., Sukhorukov G.B., Hennink W.E., Sanders N.N., Demeester J., Stefaan C. De Smedt Intracellularly degradable polyelectrolyte microcapsules. Adv. Materials, 2006, v. 18, p. 1005-1009.

89. Itoh Y., Matsusaki M., Kida Т., Akashi M. Enzyme-Responsive release of encapsulated proteins from biodegradable hollow capsules. Biomacromolecules, 2006, v. 7, p. 2715-2718.

90. Васильев A.E. Химия и технология высокомолекулярных соединений. -Итоги науки и техники, М.:ВИНИТИ, 1981, с. 3-119.

91. Maurer P.N., Pinchuk P. In: Nucl. Acids Immunol.: Proc. Symp. (1967)/Ed. O.J. Plescia. N.Y.: Spring-Verl., 1968, p.301-308; Chem. Abstr., 1970, v.73, 118587.

92. Escorcia F.E, McDevitt M.R, Villa C.H, Scheinberg D.A. Targeted nanomaterials for radiotherapy. Nanomed. 2007, v. 2, № 6, p. 805-15.

93. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. (Ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова). М.: Наука, 2002, 368с.99. http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/19500/dextranasedextrans.gif

94. R.A.A. Muzzatelli, M. Tetbojevich, A. Cosani. Chitin Enzymology. Ed. Italy, Atec Edizioni, 1996, v.2, p. 69-82.101. http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/19500/chitosanasechitosan.gif

95. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия (пер. с нем.) (Ред. П.Д. Решетов, Т.И. Соркина). М.: Мир, 2000, 469с.103. http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/trypsin.gif

96. Bradford М.М. Analytical Biochemistry. 1976, v. 72, p. 248-252.

97. Wortington Enzyme Manual. Worthington Biochemical Corporation, USA, p. 97-105, p. 288-289

98. Okabe H.S., Roth J.L.A., Pfeiffer C.J. A method for experimental, penetrating gastric and duodenal ulcers in rats. Observations on normal healing. Amer. J. Digestive Disease, 1971, v. 16, № 3, p. 277-284.

99. Роговин 3. А. Химия целлюлозы. M.: Химия, 1972, 520с.

100. Volodkin D.V., Petrov A.I., Prevot M., Sukhorukov G.B. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation. Langmuir, 2004, v. 20, p. 3398-3406.

101. Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. Protein Encapsulation via Porous СаСОз Microparticles Templating. Biomacromolecules, 2004, v. 5, p. 19621972.

102. Petrov A.I., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B. Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation: A Tool for Protein Encapsulation. Biotechnol. Progr., 2005, v. 21, p. 918-925.

103. Lu Z.H., Prouty M.D., Guo Z.H., Golub V.O., Kumar C., Lvov Y.M. Magnetic switch of permeability for polyelectrolyte microcapsules embedded with Co@Au nanoparticles. Langmuir, 2005, v. 21, № 5, p. 2042-2052.

104. Shchukin D.G., Gorin D. A., Mohwald H. Ultrasonically induced opening of polyelectrolyte microcontainers. Langmuir, 2006, v. 22, № 17, p. 7400-7404.

105. Colfen H. Qi L. A Systematic Examination of the Morphogenesis of Calcium Carbonate in the Presence of a Double-Hydrophilic Block Copolymer. Chem. Eur. J., 2001, v. 7, № l,p. 106-116.

106. Guo J., Severtson S.J. Application of Classical Nucleation Theory To Characterize the Influence of Carboxylate-Containing Additives on CaCC>3 Nucleation at High Temperature, pH, and Ionic Strength. Ind. Eng. Chem. Res., 2003, v. 42, p. 3480-3486.

107. Meldrum F.C., Hyde S.T. Morphological influence of magnesium and organic additives on the precipitation of calcite. J. Crystal Growth, 2001, v. 231, p. 544 -558.

108. Orme C.A., Noy A., Wierzbicki A., McBride M.T., Grantham M., Teng H.H. Formation of chiral morphologies through selective binding of amino acids to calcite surface steps. Nature, 2001, v. 411, p. 775 -779.

109. Manoli F. and Dalas E. Spontaneous precipitation of calcium carbonate in the presence of ethanol, isopropanol and diethylene glycol. J. Crystal Growth, 2000, v. 218, p. 359 -364.

110. Raz S., Weiner S., Addadi L. Formation of high magnesian calcites via an amorphous precursor phase: possible biological implications. Adv. Mater., 2000, v. 12, p. 38-42.

111. Shen F.H., Feng Q.L., Wang C.M. The modulation of collagen on crystal morphology of calcium carbonate. J. Crystal Growth, 2002, v. 242, p. 239-244.

112. Yang L., Guo Y., Ma X., Hu Z., Zhu S., Zhang X., Jiang K. Cooperativity between pepsin and crystallization of calcium carbonate in distilled water. J. Inorg. Biochem., 2003, v. 93, p. 197-203.

113. Hardikar V.V., Matijevic E. Influence of ionic and nonionic dextrans on the formation of calcium hydroxide and calcium carbonate particles. Colloids Surf. A, 2001, v. 186, p. 23 -31.

114. Naka К., Tanaka Y., Chujo Y. Effect of anionic starburst dendrimers on the crystallization of СаСОЗ in aqueous solution: size control of spherical vaterite particles. Langmuir, 2002, v. 18, p. 3655 -3658.

115. Машковский М.Д Лекарственные средства. M.: Медицина, 1993, т. 2, 685с.

116. Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании./В кн. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. М.: Наука, с. 315

117. Шарова О.В., Куркин В.А. Флавоноиды цветков календулы лекарственной. Химия растительного сырья, 2007, т. 1, с. 65-68.

118. Олейников Д.Н., Samuelsen A.B., Танхаева JI.M. Подорожник большой (PLANTAGO MAJOR L). Химический состав и применение. Химия растительного сырья, 2007, т. 2, с. 37-50.

119. Vishu Kumar A.B., Tharanathan R.N. A comparative study on depolymerization of chitosan by proteolytic enzymes. Carbohydrate Polymers, 2004, v. 58, p. 275

120. Tao H., Wei W., Mao Y., Zhang S., Xia J. Study on Degradation Characteristics of Chitosan by Pepsin with Piezoelectric Quartz Crystal Impedance Analysis Technique. Analytical sciences, 2005, v. 21, p. 1057-1061.

121. Vishu Kumar A.B., Varadaraj M.C., Gowda L.R., Tharanathan R.N. 391 Biochem. J., 167-175.

122. Kumar B.A., Varadaraj M.C., Tharanathan R.N. Low Molecular Weight Chitosan-Preparation with the Aid of Pepsin, Characterization, and Its Bactericidal Activity. Biomacromolecules, 2007, v. 8, № 2, p. 566-572.

123. Il'ina A.V., Varlamov V.P. Effect of the Degree of Acetylation of Chitosan on Its Enzymatic Hydrolysiswith the Preparation Celloviridin G20kh. Applied biochemistry and microbiology, 2003, v. 39, № 3, p. 239-243.327.283.