Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК"

На правах рукописи

0034Э1955

Татаринова Ольга Николаевна

Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л 8 ФЕЗ та

Москва-2010

003491955

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательском институте физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России

Научные руководители:

доктор химических наук, доцент

Позмогова Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук (ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России)

Торховская Татьяна Ивановна

кандидат химических наук (РНЦ "Курчатовский институт")

Липкин Алексей Валерьевич

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « /О » мараа 2010 года в часов на

заседании Диссертационного Совета Д 208.057.01 при ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России по адресу: 119435, Москва, Малая Пироговская д. 1А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России

Автореферат разослан « 19» 2010 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Мурина М.А.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Одной из задач современной генотерапии является избирательная доставка в клетки чужеродного генетического материала. Это связано в первую очередь со спецификой его применения в качестве терапевтического агента. Уникальные адресующие свойства показаны для белковых переносчиков ДНК (Кыксот 2000; Шегек С., 2000), интерес к которым особенно возрос в связи с открытием новых перспективных свойств олигонуклеотидов (антисмысловые олигомеры, аптамеры, ДНК/РНК гибриды, 811ША и др.). Представленная работа развивает подход к конструированию самоорганизующихся белково-нуклеиновых молекулярных ансамблей, способных избирательно интернализо-ваться клетками-мишенями и обеспечивать взаимодействие нуклеиновой компоненты с внутриклеточными целями. Избирательность таких комплексов в отношении целевых клеток обеспечивается взаимодействием рецепторсвязывающего домена белковой компоненты с тканеспецифичными поверхностными рецепторами или рецепторами клеток-мишеней, а интернализация - рецептор-опосредованным эндоцитозом.

На сегодняшний день существуют различные подходы к формированию многофункциональных «^Щ

биополимерных структур. На рис. 1 А показана схема мультидоменного функционального комплекса, состоящего из лиганда, отвечающего за узнавание поверхности и обеспечивающего транспорт посредством рецептор-опосредованного эн-доцитоза, ДНК-

связывающего домена с

I Рецептор

Дополнительные домены

Рис. 1. Схема конструирования белок-нуклеиновых комплексов: А - мультидоменный рекомбинантный белок в комплексе с ДНК; Б - комплекс, состоящий из металлической наночастицы и адсорбированных на ее поверхности функциональных доменов белков и ДНК.

нуклеиновой компонентой или непосредственно ДНК (ковалентные ДНК-белковые конъюгаты) и возможных дополнительных доменов - эндосомолитиче-

ских единиц токсинов, сигнальных последовательностей и т.д. Другим подходом может служить конструирование функциональных комплексов на основе твердых платформ, например металлических наночастиц (рис. 1 Б). В этом случае все домены непосредственно сорбируются на поверхности за счет различных взаимодействий. Однако необходимо доказать, что при сорбции молекул их свойства сохранились, так, ДНК должна сохранять возможность к гибридизации, белки - сохранять структуру и т.д.

С точки зрения практической медицины особый интерес представляют активно пролиферирующие клетки - эмбриональные, стволовые и опухолевые, для которых характерна суперэкспрессия рецепторов факторов роста и альфа-фетопротеина (АФП) (Abelev G.I., 1971; Mizejewski G.J., 1985). АФП и его фрагменты успешно использовались ранее для создания средств направленной доставки антибиотиков в опухолевые клетки (Гороховец Н.В., 2006). Обнадеживающие результаты были получены и при in vitro испытаниях конъюгатов нативного АФП с тиофосфорильными антисмысловыми олигонуклеотидами, а также для комплексов полилизинового производного АФП, выделенного из ретроплацентарной сыворотки рожениц, с ДНК (Посыпанова, ГЛ., 2005).

Конструирование и исследование функциональных белок-нуклеиновых комплексов на поверхности металлических частиц является одним из направлений в поиске новых материалов, обладающих заданными функциональными свойствами, что является одной из актуальных задач нанотехнологии. В сравнении с ранее описанными платформами, наночастицы никеля обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилиро-ванные белки (Becerril, H., 2006, Лазарев, В.H., 2007), поэтому их использование в биосенсорах и диагностических системах представляет значительный интерес. Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.

Цель работы состоит в конструировании, получении и исследовании свойств функциональных нуклеопротеиновых комплексов, а также их ассоциатов с наноразмерными частицами никеля.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи.

1. Конструирование на основе альфа-фетопротеина новых белков-векторов, способных ассоциироваться с олигонуклеотидами, их аналогами, а также с плаз-мидной ДНК для избирательной доставки генетического материала в целевые клетки.

2. Получение экспрессирующих конструкций, штаммов-продуцентов ре-комбинантных белков, наработка целевых полипептидов, подтверждение их первичной структуры, исследование комплексообразования с ДНК и транспортных свойств полученных нуклеопротеиновых ассоциатов.

3. Исследование способности наноразмерных частиц никеля ассоциироваться с молекулами олигонуклеотидов и гистидинилированных белков, подтверждение целостности и функциональности биополимеров в составе комплексов с никелем.

4. Оптимизация методов ВЭЖХ-очистки олигонуклеотидов фосфодиэфир-ной, тиофосфорильной природы и несущих метки, а также антисмысловых олигонуклеотидов, таких как ТМО (telomere-mimic oligonucleotide, фрагмент теломер-ной ДНК, подавляющий экспрессию гена теломеразы), AS 1 (подавляющий экспрессию проонкогена С-тус) и др., структура которых затрудняет очистку по стандартным протоколам.

Научная новизна и практическая значимость. На сегодняшний день не существует универсальных избирательных систем доставки ДНК в целевые клетки. Высокий уровень интернализации чужеродного генетического материала достигается при использовании различных подходов, например липофекцией, но в данном случае речь не идет об избирательном транспорте. В то же время нет данных о том, какого количества трансформированных клеток необходимо добиться для достижения терапевтического эффекта, однако ряд экспериментов свидетельствует о том, что эффективной оказывалась трансформация лишь 5-10% пораженных клеток (Kay М.А., 2000). Использование механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза позволяет решить ряд проблем, связанных как с избирательностью доставки, так и с безопасностью его применения в целом. В представленной работе впервые получены 3 рекомбинантных белковых вектора на основе фрагмента альфа-фетопротеина. Экспонирование рецепторов АФП на поверхности клеток служит одним из надежных маркеров ряда опухолей (Abelev

G.I., 1971). Новые белковые векторы имеют 2-х доменную структуру: 1) рецепто-роспецифичный домен (фрагмент альфа-фетопротеина), отвечающий за узнавание комплекса определенной поверхности и обеспечивающий транспорт комплекса посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, 2) ДНК-связывающий домен, представленный различными олигокатионными последовательностями.

Показано, что полученные рекомбинантные белки самопроизвольно ассоциируются с олигонуклеотидами, олигонуклеотидными дуплексами и плазмидной ДНК с образованием стабильных комплексов, способных избирательно интерна-лизоваться клетками, несущими рецепторы АФП. Избирательность полученных нуклеопротеиновых комплексов подтверждена in vitro экспериментами с целевыми и рецептордефицитными (контрольными) клеточными культурами. Универсальность белковых векторов в отношении переносимого генетического материала подтверждена как исследованием взаимодействий белков с олигомерами, дуплексами и плазмидной ДНК, так и экспериментами по доставке с их помощью известных антисмысловых к таким ключевым генам канцерогенеза, как ген теломе-разы и С-тус, олигонуклеотидов тиофосфорильной природы. Полученные результаты важны для понимания механизмов образования и изучения взаимодействий молекулярных ДНК-белковых ансамблей. Новые белки могут стать универсальной основой для разработки эффективных высокоизбирательных ген-направленных противоопухолевых лекарств.

В настоящей работе на примере полученных новых рекомбинантных белков на основе АФП исследовано образование протеин-никелевых ассоциатов. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмер-ными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК с образованием стабильных комплексов. Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не дегради-рованы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, это создает основу для их использования, например, в системах селекции аффинных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых

биополимер-никелевых наноструктур - исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России (Москва, 12 ноября 2009 года), а так же в ходе следующих конференций: III Международная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007), IV Съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 1-й Международной научной школе Нано-2009 (Москва, 2009), Конференция молодых ученых НИИ ФХМ (Москва, 2009).

Публикации по теме диссертационной работы. По теме диссертации автором опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, результаты работы представлены на 5 конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах печатного текста, содержит 14 рисунков. Список литературы" включает 190 источников.

Материалы и методы.

Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

В работе были использованы клетки линии DU 145 (human prostate carcinoma), SCOV3 (ovarian carcinoma), наличие в которых рецепторов AFP подтверждали по взаимодействию с флуоресцентным AFP, и лимфоциты, а также бактериальные штаммы Е. coli DH5a (F- (p801acZAM15 A(lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 X- thi-1 gyrA96 relAl) (Life Technologies, Великобритания), B834 (DE3)(F- ompThsdSB(rB- mB-) gal dem met (DE3)) (Novagen, США), BL21 (DE3)pLysS (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dem X(DE3), pLysS, Cmr (Promega), плазмидные векторы pGEM-T/easy (Promega, США), pET-15b, pET-28b (Novagen, США), pRC-CMV (Invitrogen, США).

Наночасппщы никеля.

Наночастицы никеля (20 нм) получены в Институте энергетических проблем химической физики РАН, Россия.

Методы.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографах Waters, Agilent Chemstation 1100 Series в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония или 0,1 М триэтиламмоний ацетата на С16, С18 и С4 об-ращеннофазовых колонках. Хроматографию белков проводили с использованием FPLC систем Pharmacia (Швеция) или Agilent (США).

Электрофоретическое разделение олигонуклеотидов проводили стандартно в 20% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, ампликонов и плазмид в агарозном геле 2% и 1% соответственно, белков в 12% ПААГ.

Масс-спектры регистрировались на MALDI TOF-спектрометрах UltraFlex и MicroFlex (Bruker, США) с использованием стандартной стальной мишени (MSP polished steel, Bruker, США). В качестве матрицы при анализе олигонуклеотидной составляющей применяли 0,25 М раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, США). Для получения масс-спектров белков непосредственно с никелевых нано-комплексов последние дважды промывали 0,1 М раствором ацетата аммония в 1% ацетонитриле, водой и ресуспендировали в 0,022 М растворе матрицы (3,5-диметокси-4-оксикоричной кислоты, Aldrich, США), в 50% водном ацетонитриле, содержащем 0,1% трифторуксусной кислоты. Полученную суспензию наносили на мишень и высушивали на воздухе.

Синтез олигонуклеотидов.

Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали твердофазным амидофосфит-ным методом на автоматическом синтезаторе ASM (Россия) с использованием стандартных коммерческих реагентов в условиях модифицированных нами программ реакционных циклов. Для реакционных циклов с введением 3'-тиофосфорильных звеньев вместо стандартного окислителя, содержащего йод и воду, применяли свежеприготовленный 0,05 М раствор ЗН-1,2-бензодитиол-3-он-1,1 -диоксида (Glen Research, США) в ацетонитриле. Деблокирование и расщепление связи олигомера с носителем осуществляли с использованием стандартных процедур. Полученные препараты олигомеров анализировали методами ВЭЖХ,

MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), УФ-спектрофотометрией и электрофорезом в ПААГ.

Методы генетической инженерии.

Реакции кинирования, лигирования, рестрикции проводили с использованием коммерческих ферментов согласно протоколам производителей и другими стандартными методами.

Фрагменты ДНК из агарозного геля выделяли с использованием набора Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, США) согласно инструкции.

Трансформацию, культивирование штаммов Е.соИ, получение компетентных клеток и др. проводили согласно инструкции производителя.

Получение, выделение и очистка целевых рекомбинантных белков.

При работе с клеточными линиями использовали стандартные протоколы производителей.

Выделение и очистку белков проводили с помощью металло-хелатной аффинной и ионообменной хроматографий. Предварительно отмытые тельца включения, содержащие целевые полипептиды, разрушали дезинтегратором в буфере, содержащем гуанидин хлорид. После фракционирования хроматографией, фракции обессоливали и рехроматографировали. Концентрацию белка определяли по методу ВСА (ВСА-набор, Sigma США). Очищенный белок характеризовали элек-трофоретическим анализом в ПААГ и масс-спектрометрически.

Культивирование клеток.

В экспериментах использовали опухолевые клети человека линии DU145 и контрольные клетки. Клетки культивировали в пластиковых культуральных флаконах (Costar, Великобритания) в среде RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02. Клеточные культуры рассевали 2 раза в неделю и высевали в 12-луночные планшеты на покровные стекла или непосредственно в лунки за сутки до эксперимента.

Проточная цитофлуориметрия.

Клетки DU 145 и контрольные в логарифмической фазе роста отмывали дважды PBS (pH 7,4) и 2 часа инкубировали в среде DMEM (Sigma, США), не содержащей сыворотки. Далее клетки снимали с пластика и отмывали буфером

PBS. Комплексы белков PGA, PGA1 и PGAl-His с флуоресцентномеченными ТМО и TMS (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 4:1) в концентрации 200 нМ по олигонуклеотидам и 200-800 нМ по белку добавляли к суспензии клеток на холоду и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После окончания инкубации клетки снимали с пластика с помощью раствора 0,05% трипсина в растворе Версена (Sigma, США), промывали и ресуспендировали в PBS. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter, США), флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (Coherent), Хвшб 488 нм, 520 нм.

Флуоресцентная микроскопия.

Клетки DU 145 высевали на покровные стекла в 24-луночные планшеты за сутки до эксперимента. Комплексы белков с флуоресцентномеченными олиго-нуклеотидами (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 5:1) добавляли к клеткам на 24 часа в концентрации 200 нМ по олигонуклеотидам. Клетки отмывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом. Ядра клеток окрашивали флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США). Клетки заключали в мови-ол и анализировали флуоресценцию с помощью микроскопа Opton IM35 (Carl Zeis, Германия) при увеличении 400х с использованием фильтров: G450, FT510, LP515-565 - для FAM и G365, FT395, LP420 - для Hoechst. Визуализацию изображения осуществляли с помощью цифровой камеры DXM 1200 (Nikon, Япония).

Получение комплексов ДНК и белков с наночастицами никеля.

Суспензию 10-15 мг порошка наночастиц Ni в 1 мл 0,1 М серной кислоты встряхивали (1 ч, 20°С), обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 15 мин.), частицы отделяли центрифугированием или магнитной сепарацией. После удаления кислоты остаток промывали водой до нейтральной реакции. Подготовленные частицы никеля хранили в виде суспензии в 30% водном глицерине в среде гелия или аргона. Взвеси после встряхивания и ультразвуковой обработки были стабильны в течение 1-2 часов.

Для получения изотерм адсорбции олигонуклеотидов и белков из водных растворов наночастицами никеля в пробирки помещали аликвоты приготовленной взвеси, промывали PBS (pH 7,4) и добавляли равные объемы растворов оли-

гонуклеотидов или белков в 0,1 М PBS. Взвеси интенсивно встряхивали в течение оптимального времени, затем фиксировали изменение оптической плотности су-пернатанта (260 нм - для олигонуклеотидов, 280 - для белков 3D и PGA, 395 -для GFP). В случае FAM-содержащих олигомеров регистрировали изменение интенсивности флуоресценции (>.IIOTs=430 нм, Хисп=495 нм), для GFP - ^Возб=490 нм, 1НСП =512 нм. Молярную концентрацию образовавшегося комплекса рассчитывали по разности исходной и остаточной оптических плотностей растворов. Молярную концентрацию связанного белка рассчитывали по изменению оптической плотности с учетом коэффициентов молярной экстинкции белков, е (для 3D и PGA - с(2зо „„>=67400, для GFP - £(395 „«>=30000).

Получение комплексов ДНК-Ni и белок-Ni проводили аналогично.

Изучение взаимодействия Ni-GFP с ДНК-аптамерами Agfp 1 и Agfp2 проводили следующим образом: аликвоты взвеси ассоциатов Ni-GFP помещали в пробирки, промывали 0,1 М PBS (рН 7,4) и встряхивали с равными объемами растворов олигонуклеотидов dC30, Agfp 1 и Agfp2 (0,2-0,4 О.Е./мл). Оптическую плотность супернатантов измеряли через 2 часа при 260 нм.

Содержание работы.

Настоящая работа посвящена разработке подхода транспорта чужеродной ДНК в клетки с использованием природных механизмов рецептор-опосредованного эндоцитоза. Домен белкового вектора, отвечающий за интерна-лизцию всего комплекса в целевые клетки, можно рассматривать как модифицированный лиганд рецепторов клетки, который снабжен олигокатионной последовательностью, предназначенный для связывания с нуклеиновой компонентой.

Получение белок-нуклеиновых комплексов подразумевает под собой работу в нескольких направлениях, таких как конструирование белковой составляющей комплекса, дальнейшая наработка, очистка и подтверждение структуры, исследование комплексообразования и транспортных свойств, эксперименты in vitro по доставке комплексов в клетки, кроме этого получение олигонуклеотидов различной природы и флуоресцентномеченных олигонуклеотидов, а также исследование взаимодействия олигонуклеотидов и белков с поверхностью частиц никеля.

1. ДНК-компонента комплексов.

В качестве нуклеиновой компоненты в экспериментах были использованы как кольцевые молекулы плазмид, так и синтетические олигонуклеотиды. Однако использование любого деградируемого материала сталкивается с рядом проблем, касающихся интерпретации результатов. Чтобы избежать некорректных результатов, в работе были использованы не только фосфодиэфирные олигонуклеотиды, но и их идентичные по нуклеотидной последовательности тиофосфорильные аналоги. Последние устойчивы к биодеградации в биологических жидкостях и при этом сохраняют гибридизационные свойства. Кроме этого для визуализации ин-тернализации белок-нуклеиновых комплексов были использованы олигонуклеотиды с флуоресцентной меткой, в таких случаях применение природных аналогов олигонуклеотидов с FAM-меткой1 не дает однозначной оценки, так как, наблюдая за флуоресценцией, нельзя однозначно утверждать, что метка еще входит в состав молекул олигомеров, и делать выводы об ее транслокации. Поэтому в настоящей работе рассмотрены некоторые особенности получения тиофосфорильных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих флуоресцентные метки.

1.1. Синтетические фосфодиэфирные и фосфоротиоатные олигонуклеотиды.

В работе использовались олигонуклеотиды как в качестве нуклеиновой составляющей комплексов, так и для получения экспрессирующих конструкций, плазмид, а также как праймеры для полимеразноц цепной реакции (ПЦР) и сик-венса.

Среди модификаций сахаро-фосфатного остова, повышающих устойчивость олигонуклеотидов к биодеградации, наиболее подробно изучены особенности применения и метаболизм тиофосфорильных олигонуклеотидов, показана их перспективность использования в качестве антисмысловых последовательностей {Stein С.А., 1991; Agrawal S., 1995). В то же время известно, что тиофосфорильные олигонуклеотиды обладают некоторой системной токсичностью, это затрудняет их использование непосредственно при работе с живыми организмами. Однако необходимо иметь ввиду, что рабочие концентрации используемых в экспериментах олигонуклеотидов, в виду своей устойчивости к клеточным нуклеазам, могут быть значительно ниже.

FAM - 6-флуоресцеинил-б-карбоксиамидогексил

1.2. Флуоресцеитно.мечеиные олигонуклеотиды.

Широкое применение флуоресцентномеченные олигонуклеотиды получили из-за возможности визуализировать ряд процессов, происходящих с исследуемыми объектами. В представленной работе флуоресцентные производные олигонук-леотидов позволили получить данные об интернализации клетками искусственных нуклеопротеиновых комплексов, их внутриклеточной локализации и др. Кроме того, надежность и совершенствование методов получения высокоочи-щенных меченых олигонуклеотидов играет большую роль в создании комплексных диагностических наборов, которые позволяют одновременно анализировать содержание в пробе нескольких ДНК-мишеней (Probert W.S., 2004; Ram S„ 2005).

Было замечено, что особенности хроматографического поведения таких олигонуклеотидов затрудняют их очистку. Это обусловлено рядом причин, например склонностью к внутри- и межмолекулярной агрегации. Соотношение кон-формационных форм олигомера зависит от температурного режима хроматографии (рис. 2 А и Б) и зачастую различно для разбавленных и концентрированных растворов, и, как оказалось, профили аналитических и препаративных хромато-грамм могут содержать разные пики, т.е. условия хроматографии, найденные в аналитическом варианте, неэффективны для препаративной очистки (рис. 2 В).

При оптимизации ВЭЖХ методов очистки олигонуклеотидов фракции, соответствующие пикам на хроматограммах, собирали и исследовали с помощью MALDI TOF MS (лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия с участием матрицы), UV-VIS-спектрофотометрии, электрофоре-тического анализа в ПААГ и сравнивали эффективность их работы в соответствующих условиях Real-Time PCR.

в

Рис. 2. Хроматографические профили разделения (градиент ацетонитрила в 0,1М ацетате аммония) 5'-(6-РАМ)-37-тег-3'ВС2Н11 (А), 5'-НЕХ2-46-тег-3'-ОаЬ5у13(Б), 5'-(6-РАМ)-35-тег-З'-ВОШ (В) реакционных смесей олигонуклеотидного синтеза. Колонка С16Т4х250 мм, Диасорб, Россия (А и В); ЫиЫеснН 10x250 мм, Текпокгоша, Испания (Б).

Учитывая перечисленные свойства, для подбора условий хроматографиче-ской очистки олигонукпеотидов использовали реакционные смеси синтеза (в масштабе 0,1-0,2 мкмоль) олигомеров после удаления аммиака в вакууме, варьируя не только параметры градиента растворителей, но и температуры. Наиболее существенные для идентификации пиков данные приведены на рис. 2. Из сравнительного анализа профилей видно, что, например, 5'-(6-РАМ)-37-мер-3'-ВНр1 (рис. 2 А) эффективнее отделяется от примесей при 35°С, а 5'-5'-НЕХ-46-гпег-3'-ОаЬзу1 - при 55°С (рис. 2Б).

1.3. Использование в работе терапевтически значимых олигонуклеотидов.

1 В1аск Ьо1е диепсЬегз

2 4,7,2',4\5',7'-гексахлор-флуоресцеинил-6-карбоксиамидогексил

4-(диметиламино)азобетен-4'-сульфонил

В работе использовался широкий круг олигонуклеотидов, в том числе терапевтически значимых. Известно из литературы, что ТМО (telomeric mimic oligonucleotide) и его тиоаналог TMS ингибируют активность теломеразы (Sun D., 1997; Wang E.S., 2004), процесс происходит, по-видимому, за счет связывания их с каталитической белковой субъединицей белка, хотя точный механизм ингиби-рования теломеразной активности мимик-олигонуклеотидами не вполне ясен. Также в работе использовались хорошо изученные антисмысловые олигомеры к генам С-тус, Bcl-II и др. (Dias N.. 2002; Manoharan М., 2002; Kurreck J., 2003, Wang E.S., 2004), действие которых вызывает апоптоз опухолевых клеток. В работе были использованы фосфодиэфирные олигонуклеотиды, их тиоаналоги и несущие флуоресцентые метки олигонуклеотиды.

2. Рекомбинантные белковые векторы.

Наиболее перспективный, гибкий и доступный способ получения новых белков сегодня - это химико-ферментативный синтез гена, получение штамма-продуцента и биотехнологическая наработка рекомбинантного полипептида. Использование белковых векторов для доставки чужеродной ДНК в клетки рассмотрено в литературном обзоре настоящей диссертации.

Оригинальность белковых конструкций, полученных в настоящей работе (совместно с лабораторией биотехнологии ММА им. И.М. Сеченова), состоит в том, что в качестве рецептор-узнающего домена белок содержит фрагмент альфа-фетопротеина (3D), который обеспечивает взаимодействие всего комплекса в целом с рецепторами клеточной поверхности. Суперэкспрессия рецепторов АФП характерна для многих типов опухолевых клеток (Ницветов М.Б., 2005). Природный АФП, выделенный из ретроплацентарной сыворотки рожениц, и его реком-бинантный фрагмент (3D) зарекомендовали себя как эффективные адресующие агенты, обеспечивающие избирательность в отношении многих активно пролифе-рирующих клеток (Гороховец Н.В., 2006). Для создания на основе доступного рекомбинантного белка 3D белковых векторов-переносчиков ДНК его последовательность дополняли ДНК-связывающими фрагментами, в состав которых был введен известный мотив сигнала ядерной локализации (рис. 3). В ряде работ показано, что NLS-домен в составе белков не только способен удерживать ДНК, но и

придает кариофильность их нуклеопротеиновым комплексам (Keller M., 2003; Позмогова Г.Е., 2007).

2.1. Дизайн белковых векторов на основе альфа-фетопротеина.

Известно, что С-концевая модификация 3 D-фрагмента АФП не препятствует его связыванию с рецептором. Однако в ряде случаев именно N-концевое положение ДНК-связывающих последовательностей в составе векторов оказывалось предпочтительным (Uherek С., 2000; Kircheis R., 2002). Поэтому при создании новых белков были предусмотрены оба варианта расположения доменов. В составе PGA ЗО-фрагмент модифицирован по N-концу, а в составе PGA1 и PGAl-His - по С-концу (рис. 3). Кроме того, из состава белка PGA1 удален технологический (His)6 сайт, предназначенный только для увеличения эффективность металло-хелатной хроматографии. Схема строения белков-векторов PGA, PGA1 и PGAl-His на основе рецепторсвязывающего фрагмента АФП приведены на рис. 3.

MÎ

3D - фрагмент АФП 1-НННННН

NLS

PGA1: I 3D ■ фрагмент АФП IwPKKKKKKRKVrPPYAKKKKKRRl

PGAl-His: I 3D - фрагмент АФП ~l-WPkKKKKKR^VF.DPy^KKKKKRR|EHHHHHH

Рис. 3. Схематичное расположение функциональных доменов белковых векторов PGA, PGA1 и PGAl-His. NLS - фрагмент, отвечающий за связывание белка с ДНК, 3D - домен альфа-фетопротеина, ответственный за узнавание и связывание белка с AFP-рецепторами клеток, НННННН - полигистидиновый таг (His)û, предназначенный для выделения белка с помощью иминодиацетата сефарозы, заряженной ионами Ni(2+).

2.2. Получение белков PGA, PGA1 и PGAl-His.

Наработку белков с использованием штаммов-продуцентов E.coli проводили см. Материалы и методы. При выделении из биомассы рекомбинантных белков, содержащих полигистидиновую последовательность, в качестве альтернативы выделения с помощью иминодиацетате сефарозы, насыщенный ионами Ni(2+), использовали частицы никеля, как описано в работе (Лазарев В.Н., 2007). При выделении белка PGA1, последовательность которого не содержала олигогисти-дин, стадию с использованием металло-хелатной аффинной хроматографии пропускали и проводили сразу выделение ионообменной хроматографией. Такой подход увеличивал выход конечного белкового препарата при меньших временных и материальных затратах. Профиль элюции белка PGA приведен на рис. 4А.

Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, обессоливали и рехроматогра-фировали на той же колонке (рис. 4Б).

А Б

Рис. 4. Хроматографические профили разделения белка PGA ионообменной хроматографией из обогащенного концентрата (А - время удерживания 30-33 мин) и рехрома-тография фракций, содержащих целевой продукт (Б - время удерживания 19-21 мин). Колонка - Protein Рак DEAE 8HR (8 х 350 мм); линейный градиент буфера, содержащего NaCl, поток элюента - 1 мл/мин; УФ-детекция - 280 нм.

Очищенные белки характеризовали электрофоретическим анализом в ПА-

АГ (рис. 5 А) и масс-спектрометрически (рис. 5 Б).

А Б

200 --

-) I р, ^^^^

Рис. 5. Анализ чистоты полученного белкового препарата (белок PGA) А: 12% ПААГ (1 - маркер молекулярной массы, 2 - белок PGA после очистки), Б: масс-спектр белка PGA (М.м.роА=29025Да), полученный на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре UltraFlex II (Broker, Германия).

Первичную последовательность белков подтверждали методом масс-спектрометрического анализа их триптических гидролизатов. В результате были определены фрагменты последовательностей белков, совпавшие с идентифицированными пептидами (на 73% для белка PGA, на 82% для PGA1 и на 84% для PGAl-His).

3. Получение и исследование ассоциатов наночастиц никеля с олиго-нуклеотидами и гистидинилированными белками.

Наночастицы никеля способны избирательно связывать гистидинилирован-ные (His-tagged) белки, что стало основой технологии эффективного выделения последних из биомассы. Важно отметить, что сорбция белков носит обратимый характер, а очищенные полипептиды, например GFP (зеленый флуоресцирующий белок) и цитохром Р450 из Mycobacterium tuberculosis не теряли своих биологических свойств (Лазарев В.Н., 2007).

Возможность модификации поверхности частиц никеля делает их чрезвычайно привлекательными и перспективными для придания такой магнитной основе разнообразных заданных свойств, как совершенно новых, так и присущих уже известным наноструктурам (Chang-Cheng Y., 2007). Наночастицы никеля вполне могут стать связующим звеном в многокомпонентных полифункциональных конструкциях, содержащих как различные белки, так и белки в сочетании с ДНК.

В настоящей работе проводились исследования закономерностей взаимодействий наночастиц никеля с одноцепочечными фрагментами ДНК (ssflHK) различной длины и состава, в том числе с тиофосфорильными олигодезоксирибонук-леотидами, а также с гистидинилированными рекомбинантными белками. Цель такого исследования - показать, что молекулы белков, содержащие полигистиди-новые последовательности, могут обратимо сорбироваться на поверхности никеля, определить характеристики такой сорбции, а также доказать, что адсорбированные молекулы как минимум частично сохраняют свои конформационные свойства.

3.1. Взаимодействие поверхности частиц никеля с олигонуклеотидами.

Для того чтобы охарактеризовать общий процесс образования комплексов из биомолекул и наночастиц никеля, были использованы различные олигонуклео-тиды. Первоначально необходимо было изучить возможность и условия их адсорбции.

В результате ряда экспериментов показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК как фосфодиэфир-ной, так и тиофосфо-рильнойприроды с образованием ста бильных комплексов (рис. 6).

Анализ изотерм адсорбции ряда олиго-нуклеотидов свидетель-

—(1А30

-•-аао

-+- (1Ю0

-♦- ГЛМ-Т18

-Ч-Те1Р5

-Ж-Тио-Т15

-Х-Тно-Те1Р5

-*-Т30

1000

т

1200

600 N1, икг

Рис. 6. Изотермы адсорбции (20°С) серии олигонуклеотидов на поверхности частиц N1, С1 - общая концентрация олиго-нуклеотмда, С2 - концентрация комплекса №-ДНК.

ствует о зависимости параметров связывания олигомеров от их длины, нуклео-тидного состава и природы межнуклеотидных связей.

Важно было понять, какие оптимальные условия образования комплексов из биомолекул и металлических частиц. Было изучено влияние ряда параметров на процесс сорбции (рН, ионной силы буферного раствора и влияние имидазола, который вытесняет биополимеры с поверхности частиц за счет образования координационных связей с N0 и подобраны условия для сорбции.

3.2. Исследование функ-ционалъности адсорбированных фрагментов ДНК на поверхности наночастиц никеля. Известно, что непосредственная металлизация ДНК на поверхности металлических частиц способствует потере гиб-

400

Т30-.\Ч, мкг

Рис. 7. Изотермы адсорбции (20°С) ассоциатами с1Т30-№ комплементарного (с1А30) и некомплементарного (с1С30) олигонуклеотидов. С1 - суммарная концентрация олигонуклеотида, С2 - концентрация комплексов №-ДНК.

ридизационных свойств(ВесеггИ H.A., 2005). Поэтому были проведены эксперименты по гибридизации Ni-олигонуклеотидных комплексов и показано, что Ni-связанные олигомеры способны избирательно удерживать комплементарные последовательности. Для исследования взаимодействий адсорбированных на поверхности Ni олигонуклеотидов (на примере dT30) с их комплементарными фрагментами использовали комплементарный олигомер dA30 и отрицательный контроль dC30. По данным на изотермах видно, что происходит удерживание комплементарного олигомера dA30, в то время как сорбции некомплементарного dC30 почти не наблюдается (рис.7).

3.3 Сорбция гистидинилированных белков на поверхности частиц никеля.

В ходе работы было исследовано образование Ni-белковых ассоциатов. Частицы никеля модифицировали рядом белков, например рекомбинантными гис-тидинилированными GFP, 3D и PGA, далее определяли параметры сорбции. Были найдены четкие закономерности взаимодействия гистидинилированных белков с Ni. Изотермы, пред-ставленые на рис. 8, были получены, как описано выше. Показано, что Ni высокоэффективно связывал рекомбинантные гис-тидинилированные белки 3D (рецепторсвязывающий домен альфа-фетопротеина), полученный рекомбинантный PGA и GFP, что соответствует и литературным данным (Лазарев В.Н., 2007). По подсчетам, сделанным на основании анализа кривых ассоциации белков с частицами никеля, приведенных на рис. 8, удельная нагрузка белка достигала -10-20 молекул на частицу. Можно предположить, что белки образуют довольно плотное покрытие частиц, практически полностью модифицируя их поверхность. При этом сохраняется целостность (по данным масс-спектрометрии) и, вероятно, конформация белковой компоненты, поскольку

Рис. 8. Изотермы адсорбции (20°С) частицами Ni ре-комбинантных гистидинилированных белков GFP, 3D и PGA. С1 - суммарная концентрация белка, С2 -концентрация комплексов Ni-белок.

спектр флуоресценции СРР, высвобожденного из СРР-№ ассоциата обработкой 500 мМ раствором имидазола, соответствовал спектру исходного белка.

Некоторые взаимодействия биомолекул с металлическими поверхностями могут приводить как к потере конформационных свойств, так и к разрушению первичной структуры. В этой связи необходимо было подтвердить, что молекулы не подвергаются таким воздействиям.

Десорбированные белки и белки непосредственно на поверхности никеля исследовали методами МАЬ01 ТОР масс-спектрометрии, что позволило получать молекулярные характеристики органических доменов в составе ^-комплексов и подтвердить их целостность.

3.4. Взаимодействие Ш-йКР с ДНК-аптамерами А%[р1 и А^[р2. Важно было не только сохранить неизменной аминокислотную последовательность белковых молекул, но и их структурную организацию.

А Б

Рис. 9. А - Изотермы адсорбции (20°С) ассоциатов ОРР-№ с йРР-аптамерами А£Гр1 - 5'-АТССОССТСАТТАОСОАТАСТСАОААООАТ, А§Гр2 - З'-ССТСТТСЛОТТСТАТСаСТАТС ТСАССОТА и ёСзо. С1 - суммарная концентрация связанного и свободного олигонукпеотида, С2 - концентрация ДНК-№ комплексов; Б - изотермы адсорбции ассоциатов ОРР-№ с аптамерами Agfpl и Agfp2 за вычетом поправки на неспецифическое связывание.

Для получениия характеристик архитектуры белка вРР в составе протеин-N1 комплексов были использованы аптамеры к СИР (БшпИз К.К., 2003). В работе Йаи/и К. было найдено и описано 2 аптамера к белку, показано, что они имели различную степень сродства к белковой молекуле. Мы использовали оба олиго-

нуклеотида (Agfpl и Agfp2) для подтверждения функциональности адсорбированных белковых молекул. Изотермы представлены на рис. 9.

Стоит отметить, что при проведении экспериментов и анализе их результатов мы старались выявить и снизить вклад неспецифической сорбции аптамеров. Так, например, для экранирования (кепирования) поверхностей частиц никеля, не несущих белок, GFP-Ni ассоциаты выдерживали в растворе олигонуклеотида тио-Т]5 и промывали буфером. При этом (по данным флуоресцентного анализа супер-натантов) десорбции белка не наблюдалось. Природа погрешностей другого типа могла быть связана со слабыми неспецифическими взаимодействиями олигомеров с белковой компонентой ассоциата, поэтому при интерпретации данных мы учитывали и результаты контрольного опыта, например с олигомером <ЗСзо (рис. 9А).

В итоге были получены кривые насыщения, представленные на рис. 9Б. Оказалось, что аптамер Agfpl, как и в работе Stanlis К.К., значительно лучше (Кдасс.~300 нМ) ассоциировался с GFP-Ni в сравнении с Agfp2 (Кдисс. -700 нМ). Данные свидетельствуют о том, что по отношению к взаимодействию с аптаме-рами Agfpl и Agfp2 белок GFP в составе ассоциата с частицами никеля проявлял свойства, гомологичные свойствам несвязанного GFP.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в составе ассоциатов биополимеры могут частично или полностью сохранять функциональные свойства.

4. Комплексы белков с олигонуклеотидами и плазмидной ДНК.

Для исследования комплексообразования белков PGA, PGA1 и PGAl-His с молекулами ДНК были проведены эксперименты по торможению в геле. Известно, что в неденатурирующих условиях электрофореза в ПААГ подвижность комплекса белок-ДНК значительно отличается от подвижности свободных компонентов комплекса. Эксперименты по комплексообразованию были проведены с белком PGA1 и одноцепочечным фрагментом ДНК ss48, его дуплексом - ds 48 и плазмидой pRC-CMV (рис. 10). На рис. 10 четко наблюдается корреляция между существенным изменением подвижности ДНК, особенно в случае олигонуклеоти-дов (рис. 10 А и Б), и увеличением избытка белка. Наличие нескольких новых полос в электрофореграммах позволяет предположить, что в состав ассоциатов может включаться одна или несколько белковых молекул.

ss48 1 2 3

ДНК-белковые комплексы

ds48 1 2 3

t

g Плазмида pRC-CMV 1 2 3 4 5

ДНК-белковые комплексы

И Й

Олигонуклеотидный Олигонуклеотид дуплекс

Рис. 10. Электрофореграмма смесей флуоресцентномеченного олигонуклеотида (А), оли-гонуклеотидного дуплекса (Б) и плазмидной ДНК (В) с различными избытками белка РОА1.

А: водные растворы олигонуклеотида 5348 смешивали с раствором белка РвА1 до результирующей концентрации 8б48, равной 31 нМ и РОА1: 1) 0, 2) 6 мкМ, 3) 15 мкМ.

Б: водные растворы олигонуклеотидного дуплекса ёз48, смешивали с раствором белка РйА1 до результирующей концентрации дуплекса ск48 равной 31 нМ и РбА! 1) 0, 2) б мкМ, 3) 15 мкМ. Смеси анализировали с помощью электрофореза в 8% ПААГ (неденату-рирующие условия, сканер флуоресценции Туйюп АтегвИат \вт6 - 495 нм, ¡шсп. - 520 нм).

В: водные растворы плазмиды pRC-CMV смешивали с раствором белка PGA 1 до результирующей концентрации ДНК, равной 2,5 нМ и белка PGA1: 1) 0, 2) 2,5 мкМ, 3) 5 мкМ, 4) 10 мкМ, 5) 15 мкМ. Электрофоретическое разделение смесей проводили в 0,8% агаро-зе.

5. Транспортные свойства белков PGA, PAG1 и PGAl-His.

Исследование интернализации нуклеопротеиновых комплексов клетками проводили с использованием флуоресцентномеченных олигонуклеотидов. Для того чтобы убедиться в универсальности белковых векторов в отношении состава переносимой ДНК, использовали тиофосфорильные модифицированные (FTelP5, FAS1, FTMS) и вырожденный FN23T олигомеры.

Об избирательности в отношении клеток-мишеней свидетельствуют данные распределения флуоресценции целевых DU145 (рис. 11, кривые 1-6) и рецептор-дефицитных контрольных клеток (кривая 7) после их инкубирования с комплексами, состоящими из флуоресцентномеченных терапевтически значимых антисмысловых олигомеров и белков (PGA - кривые 1,4, 5, 6, 7, PGA1 - кривая 2, PGAl-His - 3).

Оказалось, что все белки образовывали транспортные комплексы, способные избирательно поглощаться клетками-мишенями. В то же время, в ряде экспериментов наблюдалось небольшое (5-15%) преимущество С-модифицированных белков PAG1 и PGAl-His (см. кривые 2-3).

На рис. 12 представлены микрофотографии опухолевых клеток линии DU145 через 24 часа инкубации со смесью флуоресцентномеченного тиофос-форильного олигонуклеотида FTMS и белка PGA. Отметим, что в приведенном эксперименте наблюдалась преимущественная локализация переносимой ДНК в области эндоплазматиче-ского ретикулума клеток.

А Б

Рис. 11. Кривые распределения флуоресценции клеток DU145 (кривые 1-6) и рецепторо-дефицитных клеток (кривая 7) после 1 часа инкубации с флуоресцентномеченными оли-гонуклеотидами в присутствии рекомбинант-ных белковых векторов. Комплексы с PGA -кривые 1, 4-7, с PGA 1 - 2 и с PGA-His - 3. Зависимости 2-7 получены для тиофосфориль-ных олигомеров: FN23T (кривые 2-4,7), Те1Р5 (5) и AS 1 (6); кривая 1 - для фосфодиэфирно-го олигонуклеотида FTMO.

В Г

» i .. Y • t". • :

Рис. 12. Флуоресцентные микрофотографии клеток линии DU145 (карцинома простаты) после инкубации в течение 24 часов в присутствии белка PGA и флуоресцентного оли-гомера FTMS (соотношение 3:1). А - зеленая флуоресценция олигомера FTMS, Б - голубая флуоресценция окрашенных Hoechst 33342 ядер, В - инверсионная фотография, Г - суперпозиция кадров А-В.

Таким образом, в результате работы были получены новые белковые векторы, способные образовывать устойчивые комплексы с одноцепочечными олиго-нуклеотдами, их дуплексами и плазмидной ДНК и избирательно доставлять генетический материал в целевые клетки.

В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, которые могут найти применение в разработке биосенсеров, диагностических систем, конструировании новых материалов, поиске аптамеров для различных белков и др.

Выводы.

1. С использованием оптимизированых методов ВЭЖХ-очистки (снижающих влияние эффектов самоассоциации) получен ряд антисмысловых олигонук-леотидов, в том числе снабженных флуорофорами (FAM, HEX), а также фрагменты ДНК для сборки генетических конструкций.

2. Методами химико-ферментативного синтеза и генетической инженерии получены новые рекомбинантные белки PGA, PGA1 и PGAl-His, несущие рецеп-торсвязывающий домен альфа-фетопротеина человека и олигокатионные последовательности.

3. Показано, что белки PGA, PGA1 и PGAl-His способны самопроизвольно образовывать с плазмидной ДНК, фосфодиэфирными и тиофосфорильными оли-гонуклеотидами стабильные транспортные комплексы.

4. Продемонстрирована избирательная доставка чужеродной ДНК в составе комплексов с белками PGA, PGA1 и PGAl-His в клетки, несущие рецепторы альфа-фетопротеина.

5. Показана способность наночастиц никеля ассоциироваться с гистидини-лированными рекомбинантными белками (на примере PGA, PGAl-His, 3D и белка зеленой флуоресценции) и с олигонуклеотидами с образованием стабильных комплексов. Найдено, что взаимодействие с наночастицами никеля не приводило к деструкции биополимеров. На примере двух конструкций продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля в качестве платформы для сборки многофункциональных нуклеопротеино-вых структур.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Зайцева М.А., Татарино-ва О.Н., Говорун В.М. Получение и свойства ассоциатов наночастиц никеля с ss-ДНК и белками. // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №5-6. С. 148-154.

2. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Веремеев К.Ю., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Петрунин Д.Д., Позмогова Г.Е. Влияние способов очистки олигодезоксирибонуклеотидных зондов на эффективность генодиагностики методом PCR в режиме реального времени. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008. Т. 145. №3. С. 275-280.

3. Татаринова О.Н., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Серебрякова М.В., Позмогова Г.Е.. Новые белковые векторы на основе фрагмента альфафетопротеина для направленного транспорта ДНК в опухолевые клетки. // Вестник РАМН. 2010. №1. С. 3-8.

4. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Позмогова Г.Е. Специфика обращено-фазовой ВЭЖХ олигодезоксирибонуклеотидных зондов для Real-Time PCR генодиагностики. // Тез. докл. III Межд. конф. "Фундаментальные науки - медицине". 2-8 сент. 2007. Новосибирск. С. 143.

5. Позмогова Г.Е., Татаринова О.Н., Смирнов И.П. Формирование нук-леопротеиновых ассоциатов на основе наночастиц никеля. // Сб. трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 2008. Новосибирск. С. 206.

6. Татаринова О.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е. Самосборка ассоциатов наночастиц никеля с олигодезоксирибонуклеотидами и гистидинилирован-ными белками. // Тез. докл. XV Межд. конф. ст., асп. и мол. уч. «Ломоносов», разд. «Биоинженерия и биоинформатика». 8-11 апр. 2008. Москва. С. 51.

7. Татаринова О.Н., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Позмогова Г.Е. Направленный транспорт олигонуклеотидов в опухолевые клетки с помощью белковых векторов на основе фрагмента альфафетопротеина. // Тез. докл. 1-й межд. науч. шк. Нано-2009. 29июня-4июля. 2009. Москва. С. 345-346.

Заказ № 66-а/01/10 Подписано в печать 29.01.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1.5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 ип-ш'.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Татаринова, Ольга Николаевна

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Системы невирусной доставки экзогенной ДНК в клетки-мишени для генотерапии (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

1.1. Понятие «генотерапия».

1.2. Направленный транспорт чужеродной ДНК.

1.3. Невирусная доставка ДНК в клетки.

1.3.1. Химические методы доставки ДНК в клетки.

1.3.2. Биохимические методы доставки ДНК в клетки.

1.3.3. Адресная доставка ДНК в клетки с использованием низкомолекулярных органических лигандов.

1.3.4. Применение углеводсодержаи^их лигандов.

1.3.5. Адресная доставка ДНК в клетки с использованием природных механизмов.

1.3.6. Белковые и пептидные лиганды.

1.3.6.1. Пептиды.22 >

1.3.6.2. Природные и рекомбинантные белки.

1.3.6.3. Использование zinc finger proteins для генотерапии.

1.4. Дизайн нуклеопротеиновых транспортных систем.

1.4.1. ДНК-связывающие домены.

1.4.2. Эндосомолитические домены.

1.4.3. Ядерный импорт.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

2.1.3. Белки и ферменты.

2.1.4. Наночастицы никеля.

2.2. Методы.

2.2.1. Синтез олигонуклеотидов.

2.2.2. Методы молекулярного клонирования.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.2.4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы.

2.2.5. Очистка полипептидов.

2.2.6. Культивирование клеток.

2.2.7. Исследование эндоцитоза белок-нуклеиновых комплексов в клетках DU145 с помощью проточной цитофлуориметрии.

2.2.8. Исследование эндоцитоза нуклеопротеиновых комплексов с помощью флуоресцентной микроскопии.

2.2.9. Получение комплексов биополимеров с наночастицами никеля.

2.2.10. Дополнительное программное обеспечение.

3. Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

3.1. ДНК-компонента комплексов.

3.1.1. Олигонуклеотидьг, несущие тиофосфорильные модификации.68 е

3.1.2. Особенности хроматографии модифицированных олигонуклеотидов.

3.2. Рекомбинантные белки для направленной доставки ДНК.

3.2.1. Белковые векторы-переносчики ДНК.

3.2.2. Структура рекомбинантных белковых переносчиков ДНК на основе фрагмента альфа-фетопротеина.

3.2.3. Получение белков PGA, PGA1 uPGAl-His.

3.2.4. Получение и исследование ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и гистидинилированными белками.

3.2.5. Комплексы белков с олигонуклеотидами и плазмидной ДНК.

3.2.6. Транспортные свойства белков PGA, PAG1 и PGAl-His.

4. ВЫВОДЫ.

5. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК"

Одной из актуальных задач современной генотерапии является избирательная доставка в клетки чужеродного генетического материала. Это связано в первую очередь со спецификой его применения в качестве терапевтического агента. Уникальные адресующие свойства показаны для белковых переносчиков ДНК [1, 2], интерес к которым особенно возрос в связи с открытием новых перспективных свойств олигонуклеотидов (антисмысловые олигомеры, аптамеры, ДНК/РНК гибриды, siRNA и др.). Представленная работа развивает подход к конструированию самоорганизующихся белковонуклеиновых молекулярных ансамблей, способных избирательно интернализоваться клетками-мишенями и обеспечивать взаимодействие нуклеиновой компоненты с внутриклеточными целями. Избирательность таких комплексов в отношении целевых клеток обеспечивается взаимодействием рецепторсвязывающего домена белковой компоненты с тканеспецифичными поверхностными рецепторами или рецепторами клеток-мишеней, а интернализация - рецепторопосредованным эн-доцитозом.

На сегодняшний день существуют различные подходы к формированию многофункциональных биополименых структур. В представленной работе были получены комплексы, составленные из ДНК и белка. Реком-бинантные мультидоменные белки обычно представляют собой модифицированные лиганды рецепторов клеток. На рис. 1 А показана схема мультидоменного функционального комплекса, состоящего из лиганда, отвечающего за узнавание поверхности и обеспечивающего транспорт посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, ДНК-связывающего домена с нуклеиновой компонентой или непосредственно ДНК (ковалентные белок-ДНК конъюгаты) и возможных дополнительных доменов - эндосомо-литических единиц токсинов, сигнальных последовательностей и т.д. Другим подходом может служить конструирование функциональных комплексов на основе твердых платформ, например металлических наноча-стиц (рис. 1 Б). В этом случае все домены непосредственно сорбируются на поверхности за счет различных взаимодействий. Однако необходимо доказать, что при сорбции молекул их свойства сохранились, так ДНК должна сохранять свои гибридизационные возможности, белки - сохранять структуру и т.д.

Рис. 1. Схема конструирования белок-нуклеиновых комплексов. А -мультидоменный рекомбинантный белок в комплексе с ДНК, Б - комплекс, состоящий из металлической наночастицы и адсорбированных на ее поверхности функциональных доменов - белков и ДНК.

С точки зрения практической медицины особый интерес представляют активно пролиферирующие клетки - эмбриональные, стволовые и опухолевые. Для этих типов клеток характерна суперэкспрессия таких рецепторов, как рецепторы факторов роста и альфафетопротеина (АФП) [3, 4]. Ранее была показана высокая избирательность векторов на основе полипептидных лигандов рецепторов факторов роста [5-10]. Однако основным недостатком такого подхода было то, что комплексы с ДНК сохраняли пролиферативную активность.

АФП и его фрагменты успешно использовались ранее для создания средств направленной доставки антибиотиков в опухолевые клетки [11]. Обнадеживающие результаты были получены и при in vitro испытаниях конъюгатов нативного АФП с тиофосфорильными антисмысловыми оли-гонуклеотидами, а также для комплексов полилизинового производного АФП, выделенного из ретроплацентарной сыворотки рожениц, с ДНК [5].

Задачей представленной работы являлось конструирование, получение и очистка рекомбинантных белков-переносчиков терапевтически значимого генетического материала в опухолевые клетки, сурперэкспресси-рующие рецепторы АФП, а также исследование их свойств. В качестве адресующего домена использовался рецепторсвязывающий домен АФП (3D). Для создания вектора-переносчика белковый лиганд (3D) был снабжен ДНК-связывающим доменом, обеспечивающий взаимодействие с ДНК любой последовательности и длины. Свойства такой новой транспортной молекулы могут существенно зависеть как от структуры, так и от положения этого домена в составе полипептида. В настоящей работе были получены рекомбинантные белки, состоящие из рецепторсвязывающего домена АФП, модифицированного по С- или N-концу олигокатионными ДНК-связывающими последовательностями и проведены их сравнительные исследования.

В задачи работы входило конструирование и исследование функциональных белок-нуклеиновых комплексов на поверхности частиц никеля. Это в первую очередь связанно с поиском новых материалов в том числе, обладающих заданными функциональными свойствами, что является одной из актуальных задач нанотехнологии. С использованием полученных на основе АФП рекомбинантных белков продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наноча-стиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур.

В сравнении с ранее описанными платформами, наночастицы никеля обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидиншшрованные белки [12, 13]. Поэтому их использование в биосенсорах и диагностических системах представляет значительный интерес. Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.

Цель работы состоит в конструировании, получении и исследовании свойств функциональных нуклеопротеиновых комплексов, а также их ассоциатов с наноразмерными частицами никеля.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. конструирование на основе альфа-фетопротеина новых белков-векторов, способных ассоциироваться с олигонуклеотидами и их аналогами, а также с плазмидной ДНК для избирательной доставки генетического материала в целевые клетки;

2. получение экспрессирующих конструкций, штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, наработка целевых полипептидов, подтверждение их первичной структуры и исследование комплексообра-зования с фрагментами ДНК и транспортных свойств полученных нуклеопротеиновых ассоциатов;

3. исследование способности наноразмерных частиц никеля ассоциироваться с молекулами олигонуклеотидов и гистидинилированных белков, подтверждение целостности и функциональности биополимеров в составе №-комплексов;

4. оптимизация методов ВЭЖХ-очистки синтетеических олигонуклеотидов фосфодиэфирной, тиофосфорильной природы и несущих метки, а также антисмысловых олигонуклеотидов, таких как ТМО (telomere-mimic oligonucleotide, фрагмент теломерной ДНК, подавляющий экспрессию гена теломеразы), AS 1 (подавлет экспрессию проонкогена С-шус) и др.

Научная новизна и практическая значимость. На сегодняшний день не существует универсальных избирательных систем доставки ДНК в целевые клетки. Высокий уровень интернализации чужеродного генетического материала достигается при использовании различных подходов, например липофекции, однако в данном случае речь не идет об избирательном транспорте. В то же время нет данных о том, какого количества трансформированных клеток необходимо добиться для достижения терапевтического эффекта. Ряд экспериментов свидетельствует о том, что эффективной оказывалась трансформация лишь 5-10% пораженных клеток [14]. Использование механизма рецепотор-опосредованного эндоцитоза позволяет решить ряд проблем, связанных как с избирательностью доставки, так и с безопасностью его применения в целом. В представленной работе впервые получены 3 рекомбинантных белковых вектора на основе фрагмента альфа-фетопротеина. Экспонирование рецепторов АФП на поверхности клеток служит одним из надежных маркеров ряда опухолей [3]. Новые белковые векторы имеют 2-х доменную структуру: 1) рецепторос-пецифичный домен (фрагмент альфа-фетопротеина), отвечающий за узнавание комплекса определенной поверхности и обеспечивающий транспорт комплекса посредством рецептор-опосредоанного эндоцитоза, 2) ДНК-связывающий домен, представленный различными олигокатионными последовательностями.

Показано, что полученные рекомбинантные белки самопроизвольно ассоциируются с олигонуклеотидами, олигонуклеотидными дуплексами и плазмидной ДНК с образованием стабильных комплексов, способных избирательно интернализоваться клетками, несущими рецепторы AFP. Избирательность полученных нуклеопротеиновых комплексов подтверждена in vitro экспериментами с целевыми и рецептордефицитными (контрольными) клеточными культурами. Универсальность белковых векторов в отношении переносимого генетического материала подтверждена как исследованием взаимодействий белков с олигомерами, дуплексами и плазмидной ДНК, так и экспериментами по доставке с их помощью известных антисмысловых к таким ключевым генам канцерогенеза, как ген теломе-разы и С-шус, олигонуклеотидов тиофосфорильной природы. Полученные результаты важны для понимания механизмов образования и изучения взаимодействий молекулярных ДНК-белковых ансамблей. Новые белки могут стать универсальной основой для разработки эффективных высокоизбирательных ген-направленных противоопухолевых лекарств.

В настоящей работе на примере полученных новых рекомбинантных белков на основе АФП исследовано образование протеин-никелевых ас-социатов. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмерными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами одно-нитевых ДНК с образованием стабильных комплексов. Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не деградированы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, это создает основу для их использования, например в системах селекции аффинных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур - исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Татаринова, Ольга Николаевна

4. ВЫВОДЫ.

1. С использованием оптимизированых методов ВЭЖХ-очистки (снижающих влияние эффектов самоассоциации) получен ряд антисмысловых олигонуклеотидов, в том числе снабженных флуорофорами (FAM, ВЕХ), а также фрагменты ДНК для сборки генетических конструкций.

2. Методами химико-ферментативного синтеза и генетической инженерии получены овые рекомбинантные белки PGA, PGA1 и PGAl-His, несущие рецепторсвязывающий домен альфа-фетопротеина человека и олигокати-онные последовательности.

3. Показано, что белки PGA, PGA1 и PGAl-His способны самопроизвольно образовывать с плазмидной ДНК, фосфодиэфирными и тиофосфориль-ными олигонуклеотидами стабильные транспортные комплексы.

4. Продемонстрирована избирательная доставка чужеродной ДНК в составе комплексов с белками PGA, PGA1 и PGAl-His в клетки, несущие рецепторы альфа-фетопротеина.

5. Показана способность наночастиц никеля ассоциироваться с гистидини-лированными рекомбинантными белками (на примере PGA, PGAl-His, 3D и белка зеленой флуоресценции) и с олигонуклеотидами с образованием стабильных комплексов. Найдено, что взаимодействие с наночасти-цами никеля не приводило к деструкции биополимеров. На примере двух конструкций продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля в качестве платформы для сборки многофункциональных нуклеопротеиновых структур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Татаринова, Ольга Николаевна, Москва

1. Uherek С., Wels W., DNA-carrier proteins for targeted gene delivery. Adv Drug Deliv Rev, 2000. 44(2-3): 153-66.

2. Rusconi S., Gene therapy in the world and in Switzerland. Schweiz Med Wochenschr, 1999. 129(46): 1769-78.

3. Abelev G.I., Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Adv Cancer Res, 1971. 14: 295-358.

4. Mizejewski G.J., Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to iso-forms, epitopes, and conformational variants. Exp Biol Med (Maywood), 2001. 226(5): 377-408.

5. Посыпанова Г.А., Киреева H.H., Макаров В.А., Использование алъфа-фетопротеина для адресной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки: сравнение двух конструкций. Вопр биол, мед и фарм хим, 2005(3): 15-20.

6. Посыпанова Г.А., Чувилин А.Н., Киреева Н.Н., Влияние стехиометрии комплексов теломерных олигонуклеотидов с белковым вектором PGEk на их антипролиферативную активность и интернетизацию клетками-мишенями. Мол биол, 2008.42(2): 1-9.

7. Позмогова Г.Е., Кнорре Д.Г., Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК. Вопр мед хим, 1998. 44(4): 331347.

8. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Адресованные белок-нукленновые комплексы для генотерапии. I. Конструирование нового белкового рекомбинант-ного переносчика. Нов лек преп, 2005(11): 66-71.

9. Kircheis R., Wightman L., Kursa M., Tumor-targeted gene delivery: an attractive strategy to use highly active effector molecules in cancer treatment. Gene Ther, 2002. 9(11): 731-5.

10. Li Z., Zhao R., Wu X., Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. Faseb J, 2005. 19(14): 1978-85.

11. Гороховец H.B., Дигтярь A.B., Луценко E.B., Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента алъфа-фетопротеина, его конъю-гат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей. Патент RU 2285537 С1, 2006.

12. Becerril Н.А., Ludtke P., Willardson B.M., DNA-templated nickel nanos-tructures and protein assemblies. Langmuir, 2006. 22(24): 10140-4.

13. Лазарев B.H., Филатова E.B., Левицкий C.A., Разработка метода очистки рекомбинантных белков с использованием наночастиц никеля. Рос нанотех, 2007. 2(5-6): 131-38.

14. Kay М.А., Manno C.S., Ragni M.V., Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia В patients treated with an AA V vector. Nat Genet, 2000. 24(3): 257-61.

15. Takakura Y., Nishikawa M., Yamashita F., Development of gene drug delivery systems based on pharmacokinetic studies. Eur J Pharm Sci, 2001. 13(1): 71-6.

16. Palu G., Bonaguro R., Marcello A., In pursuit of new developments for gene therapy of human diseases. JBiotechnol, 1999. 68(1): 1-13.

17. Navarro J., Oudrhiri N., Fabrega S., Gene delivery systems: Bridging the gap between recombinant viruses and artificial vectors. Adv Drug Deliv Rev, 1998. 30(1-3): 5-11.

18. Rubsam L.Z., Boucher P.D., Murphy P J., Cytotoxicity and accumulation of ganciclovir triphosphate in bystander cells cocultured with herpes simplex virus type 1 thymidine kinase-expressing human glioblastoma cells. Cancer Res, 1999. 59(3): 669-75.

19. Mann M.J., Morishita R., Gibbons G.H., DNA transfer into vascular smooth muscle using fusigenic Sendai virus (HVJ)-liposomes. Mol Cell Biochem, 1997. 172(1-2): 3-12.

20. Hart I.R., Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy. Semin Oncol, 1996. 23(1): 154-8.

21. Ghersa P., Gobert R.P., Sattonnet-Roche P., Highly controlled gene expression using combinations of a tissue-specific promoter, recombinant adenovirus and a tetracycline-regulatable transcription factor. Gene Ther, 1998. 5(9): 1213-20.

22. Diebold S.S., Lehrmann H., Kursa M., Efficient gene delivery into human dendritic cells by adenovirus polyethylenimine and mannose polyethylenimine transfection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): 775-86.

23. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(19): 88504.

24. Verma I.M., Weitzman M.D., Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem, 2005. 74: 711-38.

25. Kay M.A., Glorioso J.C., Naldini L., Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nat Med, 2001. 7(1): 3340.

26. Nicklin S.A., White S.J., Watkins S J., Selective targeting of gene transfer to vascular endothelial cells by use of peptides isolated by phage display. Circulation, 2000. 102(2): 231-7.

27. DeMayo F J., Tsai S.Y., Targeted gene regulation and gene ablation. Trends Endocrinol Metab, 2001. 12(8): 348-53.

28. Han S., Mahato R.I., Sung Y.K., Development of biomaterials for gene therapy. Mol Ther, 2000. 2(4): 302-17.

29. Nichol C., Kim E.E., Molecular imaging and gene therapy. J Nucl Med, 2001.42(9): 1368-74.

30. Duchler M., Pengg M., Schuller S., Somatic gene transfer into the lactating ovine mammary gland. J Gene Med, 2002. 4(3): 282-91.

31. Gottschalk U., Chan S., Somatic gene therapy. Present situation and future perspective. Arzneimittelforschung, 1998.48(11): 1111-20.

32. Rusconi S., Ceppi M., Vectors for Gene Delivery. Gene therapy of Rheumatoid Arthritis 2000: 1-23.

33. Wells D.J., Ferrer A., Wells K.E., Immunological hurdles in the path to gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. Expert Rev Mol Med, 2002. 2002: 123.

34. Kircheis R., Blessing Т., Brunner S., Tumor targeting with surface-shielded ligand—polycation DNA complexes. J Control Release, 2001. 72(1-3): 165-70.

35. Gao X., Kim K.S., Liu D., Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J, 2007. 9(1): E92-104.

36. Luo D., Han E., Belcheva N., A self-assembled, modular DNA delivery system mediated by silica nanoparticles. J Control Release, 2004. 95(2): 333-41.

37. Parker A.L., Newman C., Briggs S., Nonviral gene delivery: techniques and implications for molecular medicine. Expert Rev Mol Med, 2003. 2003: 1-15.

38. Huang R.Q., Qu Y.H., Ke W.L., Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine den-drimer. Faseb J, 2007. 21(4): 1117-25.

39. Liu F., Conwell C.C., Yuan X., Novel nonviral vectors target cellular signaling pathways: regulated gene expression and reduced toxicity. J Pharmacol Exp Ther, 2007. 321(2): 777-83.

40. Li D., Yu H., Huang H., FGF Receptor-mediated Gene Delivery using Ligands Coupled to Polyethylenimine. J Biomater Appl, 2007.

41. Pouton C.W., Seymour L.W., Key issues in non-viral gene delivery. Adv Drug Deliv Rev, 2001. 46(1-3): 187-203.

42. Wolff J.A., Naked DNA transport and expression in mammalian cells. Neu-romuscul Disord, 1997. 7(5): 314-8.

43. Beardsley Т., Working under pressure. Sci Am, 2000. 282(3): 34.46. von der Leyen H.E., Braun-Dullaeus R., Mann M.J., A pressure-mediated nonviral method for efficient arterial gene and oligonucleotide transfer. Hum GeneTher, 1999. 10(14): 2355-64.

44. Wells J.M., Li L.H., Sen A., Electroporation-enhanced gene delivery in mammaiy tumors. Gene Ther, 2000. 7(7): 541-7.

45. Yanez R.J., Porter A.C., Therapeutic gene targeting. Gene Ther, 1998. 5(2): 149-59.

46. Rakhmilevich A.L., Janssen K., Turner J., Cytokine gene therapy of cancer using gene gun technology: superior antitumor activity of interleukin-12. Hum Gene Ther, 1997. 8(11): 1303-11.

47. Evans V., Foster H., Graham I.R., Human apolipoprotein E expression from mouse skeletal muscle by electrotransfer of nonviral DNA (plasmid) and pseudo-typed recombinant adeno-associated virus (AAV2/7). Hum Gene Ther, 2008. 19(6): 569-78.

48. Tyagi R.K., Sharma P.K., Vyas S.P., Various carrier system(s)- mediated genetic vaccination strategies against malaria. Expert Rev Vaccines, 2008. 7(4): 499-520.

49. Sundararajan R., Nanoelectroporation: a first look. Methods Mol Biol, 2008. 423: 109-28.

50. Templeton N.S., Lasic D.D., New directions in liposome gene delivery. Mol Biotechnol, 1999. 11(2): 175-80.

51. Zhdanov R.I., Podobed O.V., Vlassov V.V., Cationic lipid-DNA complexes-lipoplexes-for gene transfer and therapy. Bioelectrochemistry, 2002. 58(1): 53-64.

52. Desigaux L., Sainlos M., Lambert O., Self-assembled lamellar complexes of siRNA with lipidic aminoglycoside derivatives promote efficient siRNA delivery and interference. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(42): 16534-9.

53. Abbasi M., Uludag H., Incani V., Further investigation of lipid-substituted poly(L-Lysine) polymers for transfection of human skin fibroblasts. Biomacro-molecules, 2008. 9(6): 1618-30.

54. Templeton N.S., Lasic D.D., Frederik P.M., Novel DNA:liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nature Biotechnol., 1997. 15 (3): 647-652.

55. Keller M., Harbottle R.P., Perouzel E., Nuclear localisation sequence tem-plated nonviral gene delivery vectors: investigation of intracellular trafficking events ofLMD andLD vector systems. Chembiochem, 2003. 4(4): 286-98.

56. Богданенко E.B., Свиридов Ю.В., Московцев A.A., Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии. Вопр Мед Хим, 2000. 46(3): 57-79.

57. Кривцов Г.Г., Жданов Р.И., Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углевод-содержащих векторов. Вопр Мед Хим, 2000. 46(3): 80-93.

58. Lis Н., Sharon N., Lectins: Carbohydrate-Specific Proteins That Mediate Cellular Recognition. ChemRev, 1998. 98(2): 637-674.

59. Gabius H.J., Endogenous lectins in tumors and the immune system. Cancer Invest, 1987. 5(1): 39-46.

60. Gabius HJ., Gabius S., Zemlyanukhina T.V., Reverse lectin histochemistry: design and application of glycoligands for detection of cell and tissue lectins. His-tol Histopathol, 1993. 8(2): 369-83.

61. Newell-Price J., King P., Clark A., The CpG Island Promoter of the Human Proopiomelanocortin Gene Is Methylated in Nonexpressing Normal Tissue and Tumors and Represses Expression Molecular Endocrinology, 2001. 15(2): 338348.

62. Demi L., Bojak A., Steck S., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): 10991-1001.

63. Fielding A.K., Chapel-Fernandes S., Chadwick M.P., A hyperfusogenic gibbon ape leukemia envelope glycoprotein: targeting of a cytotoxic gene by ligand display. Hum Gene Ther, 2000. 11(6): 817-26.

64. Myers K.A., Ryan M.G., Stern P.L., Targeting immune effector molecules to human tumor cells through genetic delivery of 5T4-specific scFv fusion proteins. Cancer Gene Ther, 2002. 9(11): 884-96.

65. Hofland H.E., Masson C., Iginla S., Folate-targeted gene transfer in vivo. Mol Ther, 2002. 5(6): 739-44.

66. Fernandes J.C., Wang H., Jreyssaty C., Bone-protective effects of nonviral gene therapy with folate-chitosan DNA nanoparticle containing interleukin-1 receptor antagonist gene in rats with adjuvant-induced arthritis. Mol Ther, 2008. 16(7): 1243-51.

67. Wagner E., Cotten M., Foisner R., Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(10): 4255-9.

68. Puis R., Minchin R., Gene transfer and expression of a non-viral polycation-based vector in CD4+ cells. Gene Ther, 1999. 6(10): 1774-8.

69. Nishikawa M., Takemura S., Yamashita F., Pharmacokinetics and in vivo gene transfer of plasmid DNA complexed with mannosylated poly(L-lysine) in mice. J Drug Target, 2000. 8(1): 29-38.

70. Mahato R.I., Takemura S., Akamatsu K., Physicochemical and disposition characteristics of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly(L-lysine). Biochem Pharmacol, 1997. 53(6): 887-95.

71. Reddy J.A., Dean D., Kennedy M.D., Optimization of folate-conjugated liposomal vectors for folate receptor-mediated gene therapy. J Pharm Sci, 1999. 88(11): 1112-8.

72. Choi Y.H., Liu F., Choi J.S., Characterization of a targeted gene carrier, lactose-polyethylene glycol-grafted poly-L-lysine and its complex with plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1999. 10(16): 2657-65.

73. Kim S.H., Jeong J.H., Мок H., Folate Receptor TargetedDeliveiy of Polye-lectrolyte Complex Micelles Prepared from ODN-PEG-Folate Conjugate and Cationic Lipids. Biotechnol Prog, 2007. 23(1): 232-237.

74. Benns J.M., Kim S.W., Tailoring new gene delivery designs for specific targets. J Drug Target, 2000. 8(1): 1-12.

75. Wu C.H., Sapozhnikov E., Wu G.Y., Evaluation of midticomponent non-viral vectors for liver directed gene delivery. J Drug Target, 2002. 10(2): 105-11.

76. Gharwan H., Wightman L., Kircheis R., Nonviral gene transfer into fetal mouse livers (a comparison between the cationic polymer PEI and naked DNA). Gene Ther, 2003.10(9): 810-7.

77. Csaszar A., Abel Т., Receptor polymorphisms and diseases. Eur J Pharmacol, 2001.414(1): 9-22.

78. Reiss M., TGF-beta and cancer. Microbes Infect, 1999. 1(15): 1327-47.

79. Nakagawa K., Ishizaki Т., Therapeutic relevance of pharmacogenetic factors in cardiovascular medicine. Pharmacol Ther, 2000. 86(1): 1-28.

80. Trepel M., Pasqualini R., Arap W., Chapter 4. Screeningphage-display Peptide libraries for vascular targeted peptides. Methods Enzymol, 2008. 445: 83106.

81. Booth P.J., Templer R.H., Meijberg W., In vitro studies of membrane protein folding. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2001. 36(6): 501-603.

82. Steen A., Buist G., Leenhouts K.J., Cell wall attachment of a widely distributed peptidoglycan binding domain is hindered by cell wall constituents. J Biol Chem, 2003. 278(26): 23874-81.

83. Rajendran M., Ellington A.D., In vitro selection of molecular beacons. Nucleic Acids Res, 2003. 31(19): 5700-13.

84. Lee J.F., Hesselberth J.R., Meyers L.A., Aptamer database. Nucleic Acids Res, 2004. 32(Database issue): D95-100.

85. Chen C.H., Chernis G.A., Hoang V.Q., Inhibition ofheregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(16): 9226-31.

86. Rajur S.B., Roth C.M., Morgan J.R., Covalent protein-oligonucleotide conjugates for efficient delivery of antisense molecules. Bioconjug Chem, 1997. 8(6): 935-40.

87. Manoharan M., Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002. 12(2): 103-28.

88. Стеценко Д.А., Арзуманов A.A., Коршун B.A., Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как антисмысловые агенты нового поколения. Мол биол, 2000. 34(6): 998-1006.

89. Зубин Е.М., Романова Е.А., Орецкая Т.С., Современные методы синтеза олигонуклеотидопептидов. Усп хим, 2002. 71(3): 273-301.

90. Basu S., Wickstrom Е., Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. Bioconjug Chem, 1997. 8(4): 481-8.

91. Турутин Д.В., Зацепин T.C., Тимченко M.A., Ковалентное присоединение фактора транскрипции NF-kB к ДНК-лиганду, содержащему 2'-сшъдегидную группу. Мол биол, 2002. 36(5): 877-879.

92. Mahat R.I., Monera O.D., Smith L.C., Peptide-based gene delivery. Curr Opin Mol Ther, 1999. 1(2): 226-43.

93. Richardson P.D., Kren B.T., Steer C.J., Gene repair in the new age of gene therapy. Hepatology, 2002. 35(3): 512-8.

94. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res, 2003. 31(11): 2717-24.

95. Martin M.E., Rice K.G., Peptide-guided gene delivery. Aaps J, 2007. 9(1): El 8-29.

96. Cristiano R.J., Roth J.A., Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor. Cancer Gene Ther, 1996. 3(1): 4-10.

97. Ivanova M.M., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Receptor-mediated transport of foreign DNA into preimplantation mammalian embryos. Mol Reprod Dev, 1999. 54(2): 112-20.

98. Sobolev A.S., Jans D.A., Rosenkranz A.A., Targeted intracellular delivery ofphotosensitizers. Prog Biophys Mol Biol, 2000. 73(1): 51-90.

99. Chan C.K., Jans D.A., Enhancement of MSH receptor- and GAL4-mediated gene transfer by switching the nuclear import pathway. Gene Ther, 2001. 8(2): 166-71.

100. Rosenkranz A.A., Lunin V.G., Gulak P.V., Recombinant modular transporters for cell-specific nuclear deliveiy of locally acting drugs enhance photosensi-tizer activity. Faseb J, 2003. 17(9): 1121-3.

101. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters. Cancer Res, 2006. 66(21): 10534-40.

102. Huang F., Khvorova A., Marshall W., Analysis of clathrin-mediated endocy-tosis of epidermal growth factor receptor by RNA interference. J Biol Chem, 2004. 279(16): 16657-61.

103. Li D., Yu H., Huang H., FGF Receptor-mediated Gene Delivery using Ligands Coupled to Polyethylenimine. J Biomater Appl, 2007. 22(2): 163-180.

104. Wu G.Y., Wilson J.M., Shalaby F., Receptor-mediated gene delivery in vivo. Partial correction of genetic analbuminemia in Nagase rats. J Biol Chem, 1991. 266(22): 14338-42.

105. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Ю., Характеристика моно-клональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека. Вопр биол, мед и фарм хим, 2001. 3: 19-25.

106. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Изучение экспрессии рецептора AFP в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода Иммунология, 2005. 26(2): 122-125.

107. Hsia J.C., Er S.S., Tan С.Т., alpha-fetoprotein binding specificity for ara-chidonate, bilirubin, docosahexaenoate, and palmitate. A spin label study. J Biol Chem, 1980. 255(9): 4224-7.

108. Dudich E., Semenkova L., Dudich I., alpha-fetoprotein causes apoptosis in tumor cells via a pathway independent of CD95, TNFR1 and TNFR2 through activation of caspase-3-like proteases. Eur J Biochem, 1999. 266(3): 750-61.

109. Mizejewski G.J., alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure. Proc Soc Exp Biol Med, 1997. 215(4): 333-62.

110. Sosnowski B.A., Gonzalez A.M., Chandler L.A., Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2). J Biol Chem, 1996. 271(52): 3364753.

111. Wels W., Moritz D., Schmidt M., Biotechnological and gene therapeutic strategies in cancer treatment. Gene, 1995. 159(1): 73-80.

112. Liao C.W., Hseu Т.Н., Hwang J., A target-specific chimeric toxin composed of epidermal growth factor and Pseudomonas exotoxin A with a deletion in its toxin-binding domain. Appl Microbiol Biotechnol, 1995. 43(3): 498-507.

113. Frederiksen K.S., Abrahamsen N., Cristiano R.J., Gene delivery by an epidermal growth factor/DNA polyplex to small cell lung cancer cell lines expressing low levels of epidermal growth factor receptor. Cancer Gene Ther, 2000. 7(2): 262-8.

114. Komuves L.G., Feren A., Jones A.L., Expression of epidermal growth factor and its receptor in cirrhotic liver disease. J Histochem Cytochem, 2000. 48(6): 821-30.

115. Bridges A.J., The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of tyrosine kinases. Curr Med Chem, 1999. 6(9): 825-43.

116. Fominaya J., Uherek C., Wels W., A chimeric fusion protein containing transforming growth factor-alpha mediates gene transfer via binding to the EGF receptor. Gene Ther, 1998. 5(4): 521-30.

117. Schmidt M., Vakalopoulou E., Schneider D.W., Construction and functional characterization of scFv(14El)-ETA a novel, highly potent antibody-toxin specific for the EGF receptor. Br J Cancer, 1997. 75(11): 1575-84.

118. Anzellotti A.I., Liu Q., Bloemink M.J., Targeting retroviral Zn finger-DNA interactions: a small-molecule approach using the electrophilic nature of trans-platinum-nucleobase compounds. Chem Biol, 2006. 13(5): 539-48.

119. Urnov F.D., Miller J.C., Lee Y.L., Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature, 2005. 435(7042): 646-51.

120. Nazari R., Joshi S., CCR5 as target for HIV-1 gene therapy. Curr Gene Ther, 2008. 8(4): 264-72.

121. Schols D., HIV co-receptors as targets for antiviral therapy. Curr Top Med Chem, 2004. 4(9): 883-93.

122. Perez E.E., Wang J., Miller J.C., Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol, 2008. 26(7): 808-16.

123. Кнорре Д.Г., Власов B.B., Клеточные мембраны как барьер при биологических применениях антисмысловых олигонуклеотидов, их производных и аналогов. Биоорг химия, 1992. 18(10-11): 1330-1340.

124. Шефлян Г.Я., Кубарева Е.А., Громова Е.С., Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. Усп хим, 1996. 65(8): 766-82.

125. Lechardeur D., Lukacs G.L., Intracellular barriers to non-viral gene transfer. Curr Gene Ther, 2002. 2(2): 183-94.

126. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L., Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. Adv Drug Deliv Rev, 2005. 57(5): 755-67.

127. Young J.L., Benoit J.N., Dean D.A., Effect of a DNA nuclear targeting sequence on gene transfer and expression of plasmids in the intact vasculature. Gene Ther, 2003. 10(17): 1465-1470.

128. Akuta Т., Eguchi A., Okuyama H., Enhancement of phage-mediated gene transfer by nuclear localization signal. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 297(4): 779-86.

129. Chan C.K., Jans D.A., Using nuclear targeting signals to enhance non-viral gene transfer. Immunol Cell Biol, 2002. 80(2): 119-30.

130. Hatefi A., Megeed Z., Ghandehari H., Recombinant polymer-protein fusion: a promising approach towards efficient and targeted gene delivery. J Gene Med, 2006. 8(4): 468-76.

131. Nishikawa M., Yamauchi M., Morimoto K., Hepatocyte-targeted in vivo gene expression by intravenous injection of plasmid DNA complexed with synthetic multi-functional gene delivery system. Gene Ther, 2000. 7(7): 548-55.

132. Chan C.K., Senden Т., Jans D.A., Supramolecular structure and nuclear targeting efficiency determine the enhancement of transfection by modified polylysines. Gene Ther, 2000. 7(19): 1690-7.

133. Plank C., Tang M.X., Wolfe A.R., Branched cationic peptides for gene delivery: role of type and number of cationic residues in formation and in vitro activity of DNA polyplexes. Hum Gene Ther, 1999. 10(2): 319-32.

134. Magin-Lachmann C., Kotzamanis G., D'Aiuto L., In vitro and in vivo delivery of intact ВАС DNA — comparison of different methods. J Gene Med, 2004. 6(2): 195-209.

135. Wagner E., Kircheis R., Walker G.F., Targeted nucleic acid delivery into tumors: new avenues for cancer therapy. Biomed Pharmacother, 2004. 58(3): 15261.

136. Wagner E., Cotten M., Mechtler K., DNA-binding transferrin conjugates as functional gene-delivery agents: synthesis by linkage of polylysine or ethidium homodimer to the transferrin carbohydrate moiety. Bioconjug Chem, 1991. 2(4): 226-31.

137. Chen T.Y., Hsu C.T., Chang K.H., Development of DNA delivery system using Pseudomonas exotoxin A and a DNA binding region of human DNA topoisom-erasel. Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 53(5): 558-67.

138. Cristiano R.J., Targeted, non-viral gene delivery for cancer gene therapy. Front Biosci, 1998. 3: D1161-70.

139. Paul R.W., Weisser K.E., Loomis A., Gene transfer using a novel fusion protein, GAL4/invasin. Hum Gene Ther, 1997. 8(10): 1253-62.

140. Sato Y., Yamauchi N., Takahashi M., In vivo gene deliveiy to tumor cells by transferrin-streptavidin-DNA conjugate. Faseb J, 2000. 14(13): 2108-18.

141. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res, 1997. 25(14): 27306.

142. Morris M.C., Chaloin L., Mery J., A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier. Nucleic Acids Res, 1999. 27(17): 35107.

143. Cartier R., Reszka R., Utilization of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems. Gene Ther, 2002. 9(3): 157-67.

144. Erbacher P., Zou S., Bettinger Т., Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res, 1998. 15(9): 1332-9.

145. Liu X., Howard K.A., Dong M., The influence of polymeric properties on chitosan/siRNA nanoparticle formulation and gene silencing. Biomaterials, 2007. 28(6): 1280-8.

146. Lou Y.L., Peng Y.S., Chen B.H., Poly(ethylene imine)-g-chitosan using EX-810 as a spacer for nonviral gene delivery vectors. J Biomed Mater Res A, 2008.

147. Manunta M., Nichols B.J., Tan P.H., Gene delivery by dendrimers operates via different pathways in different cells, but is enhanced by the presence of caveo-lin. J Immunol Methods, 2006. 314(1-2): 134-46.

148. Rafalski M., Ortiz A., Rockwell A., Membrane fusion activity of the influenza virus hemagglutinin: interaction of HA2 N-terminal peptides with phospholipid vesicles. Biochemistry, 1991. 30(42): 10211-20.

149. Veithen A., Raze D., Locht C., Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int J Med Microbiol, 2000. 290(4-5): 409-13.

150. Uherek C., Fominaya J., Wels W., A modular DNA carrier protein based on the structure of diphtheria toxin mediates target cell-specific gene delivery. J Biol Chem, 1998. 273(15): 8835-41.

151. Fominaya J., Wels W., Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system. J Biol Chem, 1996. 271(18): 10560-8.

152. Bremner K.H., Seymour L.W., Pouton C.W., Harnessing nuclear localization pathways for transgene deliveiy. Curr Opin Mol Ther, 2001. 3(2): 170-7.

153. Pouton C.W., Wagstaff K.M., Roth D.M., Targeted delivery to the nucleus. Adv Drug Deliv Rev, 2007. 59(8): 698-717.

154. Allen T.D., Cronshaw J.M., Bagley S., The nuclear pore complex: mediator of translocation between nucleus and cytoplasm. J Cell Sci, 2000. 113 ( Pt 10): 1651-9.

155. Kiseleva E., Goldberg M.W., Cronshaw J., The nuclear pore complex: structure, function, and dynamics. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2000. 10(1): 101-12.

156. Nair R., Carter P., Rost В., NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res, 2003. 31(1): 397-9.

157. Escriou V., Carriere M., Scherman D., NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Adv Drug Deliv Rev, 2003. 55(2): 295-306.

158. Ma H., Diamond S.L., Nonviral gene therapy and its delivery systems. Curr Pharm Biotechnol, 2001. 2(1): 1-17.

159. Collas P., Alestrom P., Nuclear localization signals: a driving force for nuclear transport ofplasmid DNA in zebrafish. Biochem Cell Biol, 1997. 75(5): 63340.

160. Bottger M., Zaitsev S.V., Otto A., Acid nuclear extracts as mediators of gene transfer and expression. Biochim Biophys Acta, 1998. 1395(1): 78-87.

161. Wagstaff K.M., Glover D.J., Tremethick D.J., Hi stone-mediated transduction as an efficient means for gene delivery. Mol Ther, 2007. 15(4): 721-31.

162. Wagstaff K.M., Fan J.Y., De Jesus M.A., Efficient gene delivery using reconstituted chromatin enhanced for nuclear targeting. Faseb J, 2008. 22(7): 223242.

163. Бергер В., Беккер X., P. Б., Органикум. Практикум по органической химии. 1979. 2: 353-377.

164. Vet J., Marras S., In Oligonucleotide synthesis: Methods and Applications. Humana Press, Totowa. N. J. Ed. Herdewijn P., 2004. 288: 273-290.

165. Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol, 1983. 166(4): 557-80.

166. Wittung P., Nielsen P.E., Buchardt O., DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. Nature, 1994. 368(6471): 561-3.

167. Анцыпович И., Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. Усп хим, 2002. 71(1): 81-96.

168. Dean D.A., Peptide nucleic acids: versatile tools for gene therapy strategies. Adv Drug Deliv Rev, 2000.44(2-3): 81-95.

169. Dias N., Stein C.A., Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. Mol Cancer Ther, 2002. 1(5): 347-55.

170. Herbert B.S., Pongracz K., Shay J.W., Oligonucleotide N3'->P5' phos-phoramidates as efficient telomerase inhibitors. Oncogene, 2002. 21(4): 638-42.

171. Лактионов П.П., Брыксин A.B., Рыкова Е.Ю., Исследование фармоки-нетики и стабильности в крови in vivo фосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. Вопр мед хим, 1999. 45(3): 170-177.

172. Tsourkas A., Behlke М.А., Bao G., Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res, 2002. 30(19): 4208-15.

173. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R., Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta, 2006. 363(1-2): 48-60.

174. Sun D., Thompson В., Cathers B.E., Inhibition of human telomerase by a G-quadruplex-interactive compound. J Med Chem, 1997. 40(14): 2113-6.

175. Wang E.S., Wu К., Chin A.C., Telomerase inhibition with an oligonucleotide telomerase template antagonist: in vitro and in vivo studies in multiple myeloma and lymphoma. Blood, 2004. 103(1): 258-66.

176. Kurreck J., Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur JBiochem, 2003. 270(8): 1628-44.

177. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Принципы создания белковых переносчиков ДНК. Новые производные эпидермального фактора роста человека для генотерапии. Бюлл эксперим биол и мед, 2007. Прилож. 2.: 87-93.

178. Ma X., Zheng W., Wang Т., Optimization and high-level expression of a functional GST-tagged rHLT-B in Escherichia coli and GM1 binding ability of purified rHLT-B. J Microbiol, 2006. 44(3): 293-300.

179. Rhie G.E., Jung H.M., Park J., Construction of cholera toxin В subunit-producing Vibrio cholerae strains using the Mariner-FRT transposon delivery system. FEMS Immunol Med Microbiol, 2008. 52(1): 23-8.

180. Бессчетнова И.А., Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Комплексы теломер-ных олигонуклеотидов d(TTAGGG)4 с новым рекомбинантным белковым вектором PGEk переносчиком нуклеиновых кислот в пролиферирующие клетки. Мол биол., 2006. 40(3): 489-496.

181. Becerril Н.А., Stoltenberg R.M., Wheeler D.R., DNA-templated three-branched nanostructures for nanoelectronic devices. J Am Chem Soc, 2005. 127(9): 2828-9.

182. Chang-Cheng Y., Chompoosora A., Rotello V.M., The biomacromolecule-nanoparticle interface. Nanotoday, 2007. 2(3): 34-43.

183. Stanlis K.K., Mcintosh J.R., Single-strand DNA aptamers as probes for protein localization in cells. J Histochem Cytochem, 2003. 51(6): 797-808.