Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности митохондриального генома высших растений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности митохондриального генома высших растений"

РГр1ъ С сШЗй С К А Я АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ " 1 Институт цитологии и генетики

На правах рукописи УДК 576. 316; 577. 113. 4

ст:

КОНСТАНТИНОВ Юрий Михайлович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Клеточная биология - 03.00. 25

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Новосибирск 1993

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г.Иркутск

Официальные оппоненты-. доктор биологических, наук,

Н.Б.Христолюбова, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, В.В.Власов,

Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

доктор химических наук, Э.Г.Малыгин,

ВНИИ молекулярной биологии, п. Кольцове, Новосибирск

Ведущее учрекденив: Институт генетики и цитологии

АН Беларуси,-г. Минск

Защита состоится РХ^Х^Р* 1993 г. на С//?г/) ¿У/ »

заседании специализированного тавота по защите^диссё'ртаций на соискание ученой степени доктора наук ( Д-002.11.01 ) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

/. -

Диссертация в форме научного доклада разослана V ■ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Структурно-функциональная организация митохондриального гонома, входящего наряду с геномами ядра п хлоропластов в состав единой генетической системы растительной клетки, является одной из фундаментальных проблем современной клеточной биологии и генетики растений. Митохондриальный геном растений отличается от такового животных и дрожжей чрезвычайно большими размерами (200 - 2400 т.п.н.), наличием у многих высших растений (помимо митохондриальной хромосомы) набора субгеномных колец и плазмидоподобных ДНК (ппДНК), интенсивными процессами рекомбинации митохондриальной ДНК (мтДНК), толерантностью к включению ДНК внемитохондриального происхождения (Levings, 1983; Sederoif, levings, 1985; Dewey et al., 1986; Lonsdale, 1988; levings. Brown, 1989). С геномами митохондрий растений связаны такие практически ценнне свойства, как цитоплазматическая мужская стерильность, устойчивость к патотоксинам, адаптационная изменчивость (Levings et al., 1979, 1980; Laughnan, Gabay-Laughnan, 1983; Thomas, 1986).

Хотя в последние года достигнут значительный прогресс в исследованиях организации митохондриального генома растений, ряд важных в теоретическом и практическом отношении вопросов, связанных со структурой и функциями ДНК митохондрий требует своего разрешения. К их числу относятся:

- условия эффективного матричного биосинтеза нуклеиновых кислот в системе изолированных растительных митохондрий;

- особенности митохондриальных систем синтеза РНК и ДНК, определяемые генотипом растения;

- биохимические последствия нового вида посттранскрипционной модификации мРНК ("редактирования").в митохондриях растений;

- транспорт генетического материала в митохондрии;

- молекулярная биология ппДНК митохондрий растений и их возможная роль в общей генетической системе клетки;

- структурно-функциональные свойства мтДНК растений, важные с

точки зрения их использования в генно-инженерных и генетико-се-лекционных исследованиях.

При планировании и выполнении настоящей работы мы сделали основной упор на получении и комплексном исследовании митохонд-риальных систем биосинтеза РНК и ДНК высших растений, а также изучении возможностей научно-практического использования этих биосистем растительной клетки в молекулярно-биологических и ге-нэтико-селекционных исследованиях.

Цель и задачи работы. Недостаточность знаний структуры и функций митохондриального генома - одно из основных препятствий для создания новых форм сельскохозяйственных растений с улучшенной цитоплазмагической наследственность® на основе использования генно-инженерных и генетико-селекционных методов. Основной целью настоящей работы было изучение принципиальных особенностей организации митохондриального генома высших растений, связанных с начальными этапами реализации и копирования генетической информации этих органелл (транскрипцией и репликацией) и проблемой полиморфизма митоховдриальной ДНК. В задачи исследований входило:

1) разработка способов получения и исследование свойств системы синтеза РНК в изолированных растительных митохондриях;

2) выяснение особенностей ДНК-синтезирующей системы мито-1 хондрий высших растений;

3) исследование возможности использования метода самосборки протеолипосом в качестве подхода для изучения структурно-функциональной организации митохондриального генома;

4) исследование транслокации полинуклеотидного. материала в митохондрии растений на модели изолированных органелл;

5) выяснение взаимоотношений транскрипционной активности мтДНК и процесса окислительного фосфорилирования;

6) изучение влияния переокисления мембранных липидов на функционирование генетической системы митохондрий растений;

7) определение соотношений активностей синтеза РНК и ДНК в митохондриях разных растительных генотипов;

8) выяснение возможных биохимических последствий пост-

транскрипционной модификации мРНК ("редактирования") в растительных митохондриях;

9) исследование особенностей структуры и функций пцДНК растительных митохондрий.

Научная новизна результатов исследования. Автором впервые проведено комплексное экспериментальное исследование РНК- п ДНК-синтезируицей систем митохондрий высших растений. Исследованы условия получения и основные характеристики систем матричного синтеза РНК и ДНК в изолированных митохондриях разных линий и гибридов кукурузы. Установлено, что в системе изолированных гп-тохондрий видоспецифические наборы плазшдоподобных ДКК, наряду с митохондриальной хромосомой служат зф£октавшми генетические матрицами. Впервые показано существование реципрокной зависимости меаду активностями синтеза РНК и ДКК в изолированных митохондриях разных генотипов кукурузы. Разработан комплекс новых экспериментальных методов определения и оценки таких хозяйственно ценных признаков у растений как цитоплазматическая мужская стерильность и продуктивность на основе регистрации структурно-функциональных характеристик митохондриального генома.

Впервые установлена взаимосвязь процессов транскрипции митохондриальной ДНК и окислительного фосфорилирования в митохондриях растений. Продемонстрирована возможность сопряженности процессов окислительного фосфорилирования и синтеза РНК в митохондриях растений: при использовании в качестве предшественника синтеза РНК АИФ вместо АТФ показано увеличение скорости синтеза РНК ш огёапеНо, устраняемое добавлением ингибитора окислительного фосфорилирования - олигогащина.

Впервые проведено исследование влияния перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ) на активность генетических процессов в изолированных митохондриях растений. Показано изменение вида кинетических кривых синтеза РНК и ДНК в условиях активации переокисления липидов. Установлена особая роль вторичных продуктов ПОЛ типа малонового диальдегида в нарушении матричных функций мтДНК растений.

Разработан оригинальный метод изучения структурно-функцио-

нальной организации генома митохондрий, основанный на самосборке при гель-фильтрации солюбилизированного материала органелл через липофяльный сефадекс. Показано, что получаемые самосборкой про-теолипосомы ("митосомы") способны к осуществлению матричного синтеза РНК и ДНК со скоростями, сравнимыми с таковыми для ин-тактных органелл.

С целью разработки системы генетической трансформации митохондрий растений впервые проведено исследование условий транслокации и матричной активности чужеродного полинуклеотидного материала в интактных митохондриях кукурузы. Доказана возможность транслокации бактериальных векторных плазмид серии рви во внутреннее пространство изолированных митохондрий. Обнаружена матричная активность бактериальной плазмида в отношении синтеза ДНК в генетической системе интактных митохондрий растений.

Обнаружено, .что посттранскрипционная модификация мРНК (редактирование) является молекулярным механизмом образования высококонсервативных лейциновых повторов в аминокислотных последовательностях субъединиц 8 и 9 .АТФ-синтазы митохондрий растений энотеры, пшеницы и сорго.

В результате изучения структурно-функциональной организации плазмидоподобных ДНК (ппДНК) митохондрий кукурузы с разными типами ЦМС установлено, что они обладают свойствами автономного решшкона. На основе бактериальных ллазмидных векторов впервые получено два вида молекулярных зондов (полинуклеотидаый - реком-бинантная плазмида р2мБ2.1 и олигонуклеотидный - рекомбинантная плазмида рп^гктчб), нашедших применение в работах по изучению генетических функций линейных пцДНК и механизмов перестроек ми-тохондриального генома с участием этих дополнительных генетических элементов. Разработаны методические подхода для быстрого скрининга митохондриальных геномов растений, позволяющие проводить анализ внутривидового полиморфизма ппДНК у разных генотипов растений (линии на стерильной основе, гибриды). С использованием контекстного анализа и банка данных нуклеотидных последовательностей установлено, что линейные Б1 и 32 ппДНК митохондрий кукурузы включают участки неслучайной гомологии с последователь-

ностями пяти различных эукариотических вирусов (ретровируса птиц, флебовируса, вируса гриппа, вируса гепатита, вируса ЭУ40).

Теоретическая и практическая ценность. Основным результатом исследований явилась разработка й экспериментальная проверка оригинальной концепции митохондриальных генетических маркеров у высших растений, основанной на применении функциональных параметров митохондриального генома (активностей РНК- и ДНК-синтези-рующих систем) в изолированных органеллах в качестве альтернативных характеристик генотипа. Полученные сведения о структуре и матричной активности полиморфного набора ДНИ митохондрий высших растений могут быть использованы в дальнейшем в генно-инженерных работах при конструировании векторных систем для генетической трансформации митохондрий и в генетико-селекционных исследованиях для отбора генотипов с определенным типом цитоплазмы.

Открывается возможность применения реконструированной генетической системы митохондрий ("митосом") как в исследованиях структурно-функциональной организации митохондриального генома растений, так и в работах по генетическому конструированию растений методами генетической и клеточной инжэн&рии. В последнем случае разработанный способ самосборки мембранных частиц при гель-фильтрации солюбилизированного материала органелл через ли-пофильный сефадекс может быть использован для включения рекомби-яантных ДНК в мембранную систему митохондрий с целью ее последующего использования в качестве генетического вектора в опытах с растительными протопластами.

Результаты проведенного в работе исследования вопросов транслокации и матричной активности чужеродного полинуклеотидно-го материала в интактных растительных органеллах могут быть использованы при разработке системы генетической трансформации митохондрий растений. Полученные впервые данные о возможности транслокащи бактериальных^ плазмид в изолированные митохондрии, а также наличие в составе митохондриального генома . кукурузы и ряда других растений набора ппЛНК позволяет предполагать существование у растительных митохондрий специального механизма транслокации полинуклеотидов.

Разработаны и защищены авторскими свидетельствами два альтернативных способа оценки и определения потенциальной продуктивности у зерновых и зернобобовых растений, основанные на регистрации генетических характеристик изолированных митохондрий. Путем клонирования полинуклеотидаого и олигонуклеотидного материала в бактериальных плазмидных векторах получено два вида молекулярных зондов, которые могут быть использованы в исследованиях биологических функций гахННК и механизмов перестроек мито-хондриального генома с участием пцЦНК. В результате проведения рестрикционного анализа мтДНК растений разработан и защищен авторским свидетельством новый способ расщепления ДНК эндонуклеа-зами рестрикции типа II. Разработан и защищен авторским свидетельством метод быстрого электрофоретического анализа полиморфизма мтДНК растений, позволяющий проводить скрининг митохондри-альных геномов у большого числа генотипов.

Полученные на основе контекстного анализа линейных ппЦНК митохондрий кукурузы данные о их неслучайной гомологии с некоторыми вирусными последовательностями имеют значение для выяснения возможных эволюционных путей переноса генетического материала в митохондрии растений.

Результаты диссертационной работы используются при чтении спецкурса по генетической инженерии растений в Иркутском Государственном Университете. Разработанные методы и приемы анализа структуры и функций мтДНК находят применение в Биолого-почвенном институте ДВНЦ РАН (Владивосток), Лимнологическом институте СО РАН (Иркутск).

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 16-ой конференций Федераций Европейских Биохимических Обществ (Москва, 1984); всесоюзном научно-практическом семинаре "Новые методы изучения генома эукариот" (Владивосток, 1985); 5 съезде Всесоюзного биохимического общества (Киев, 1986); II Всесоюзном рабочем совещании "Теоретические исследования и банки данных по молекулярной биологии и генетике" (Новосибирск, 1986); 5 съезде ВОГИС (Москва. 1987); меадународной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); III

б

Всесоюзной конференции "Проблемы экологии Прибайкалья" (Иркутск,

1988); всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущаю, 1988, 1990); VIII двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск,

1989); республиканской научной конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989); vil Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990); международной конференции "Моделирование и компьютерные методы в молекулярной биологии и генетике" (Новосибирск, 1990); втором съезде ВОФР (Минск, 1990); втором всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990); всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды" (Иркутск, 1991); I Всесоюзном симпозиуме "Ковне мэтода биотехнологии растений" (Душою, 1991); российско-американском совещании по генетике развития кукурузы (Асиломар, (Ж, 1992); меадународном семинаре по генетике кукурузы (Колд Спринт Харбор, США, 1992).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в виде- 71 работы (том числе, 1 написанной в соавторстве монографии) в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура работы. Диссертация изловена в форме научного доклада^ Материалы, использованные в диссертации получены самостоятельно и в соавторстве с группой сотрудников Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН - Г.Н.Луценко, В.А.Подсосонным, Е.Л.Таусон, В.В.Зыковой, А.Ш.Арзиевым, М.В.Доренко , Г.Д.Назаровой, И.И.Стрельниковой, сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН М.И.Рившшым, И.Б.Рогозиным, сотрудником Краснодарского института сельского хозяйства А.С.Машненко-вым. Электронно-микроскопическое исследование митохондрий и реконструированной генетической системы этих органэлл выполнены совместно с сотрудниками лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (заведующий - член-корреспондент РАН Р.К.Саляев). Всем коллегам автор выражает свою искреннюю благодарность .

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основного генетического материала в исследованиях использованы инОредные линии и гетерозисные гибриды кукурузы, семена которых получены в Краснодарском НШСХ (Краснодар). Использованы также полученные и описанные А.С.Машненковым (Маш-н'енков, 1984) мутантные линии кукурузы: W64A air/ air ("воздушные корни" - airial roots), W64A wz/wz ("восковидный налет на семенах" - waxy), Сг25 02/02 ("мучнистый эндосперм" - opaque 2), Г6834- meg/meg ("уменьшенные эндосперм и зародыш" - minia-ture endosperm and germ), A344 3in/sin ("короткие мевдоузлия" - short internodes).

Для получения митохондрий использовались трехдневные этиолированные проростки кукурузы. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующей дополнительной очисткой центрифугированием в ступенчатом градиенте сахарозы. Проведение реакций биосинтеза РНК и ДНК в изолированных митохондриях осуществляли с использованием описанных нами ранее способов (Луценко и др., 1985; Konstantinov et al., 1987; Константинов и др., 19В8). Повторность опытов - трехкратная с тремя аналитическими повторностями. Обработку результатов экспериментов проводили методом параметрической статистики (Пло-хинский, 1961; Доспехов, 1979). Реконструкцию генетической системы митохондрий проводили методом самосборки мембранных частиц при гель-фильтрации солюбилизата митохондрий на колонке с сефадексом 1Н-20 (Константинов и др., 1990). Процедуры молекулярного клонирования плазмидоподобных ДНК митохондрий растений были аналогичны описанным в руководстве Маниатиса (Маниатис и Др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СИСТЕМ! СИНТЕЗА РНК МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ

1.1. Общая характеристика РНК-сингезирущей системы растительных митохондрий (1, 5, 6, 7, 19, 52).

Ключевой задачей начального' этапа исследований являлась разработка условий для осуществления эффективного матричного

синтеза РНК in organeiio в спстеш кзолировенпнх растительных. ГЕТтохондряЯ. Описаннке в етторатурэ условия ешхтэза PHIt 1л organelle» для кттохондр:^ птеотных организмов ' п некоторые представителей низших эукаряо? (Sayana, Eyer, 1963; №*3£iachi at al., 1972; Grant, Poulter, 1S73) ко гогли ÖHTь попользованы да.т гзгтохогщкй растений в езязз с метебостюешгя особэнпостпге этих органелл (Войнянсз, 1SQ7; Козстаяткнсв и др., 1909). По этой причине необходимо бях.о последовать у еловая, способствукггте тргнекршшш! ДНК в систекэ изолЕровепныг стгахепдрпа растений.

Критерием зф&зктизностз бпоелнтзза Hit в пзолироззлшх тохогщрзях растений слукяло определен:» чувствительного к ингибиторам транскрипция иопачения радноактавпсЗ ггзтзш лз прздпест-Ебнкика (3Н-Л>2, 32Р-ИЗ, 3Н-ЦГ0) в тасдотонерастворлмуи фракции митохондрий.

ПроЕэденноэ нами исследование показало, что ШС-спятаз'фуг^-сзя система изолировавшее шгаахоядрй кукурузы (Sea шауз ь.) обладает слздукцз.щ ссковшс.^: характеристика'.!!!:

- субстраты АТЭ, УТ®, ЦТФ. ГЮ

- чувствительность

к этидиум-брсмаду (1 ^ост/мл) +

к актиномищшу D (40 мкг/мл) +

к р^зншщяну (5 мкг/мл) +

- температурный оптимум ■ 30°С

- оптимум рН 7,2 - 7,5

- потребность в субстрате дыхания митохондрий +

- потребность в ионах Kg2+ +

- константа Мяхаэлиса для УТФ 7-17 мкМ

Высокая чувствительность синтеза мтРНК в изолированных ме:~ тохондриях к таюш ингибиторам транскрипции как бромистый эте:-дий, актиномицин в и рифамшщин свидетельствует о матричном характере этого процесса (рис.1). Мы установили, что включая метки в мтРНК является линейным, по крайней мэре, в течение 60 мин.

а» Ji21-1---1-1

| 0 5 10 15 20 2 Время инкубации (мин^

1 Рис.1. Влияние ингибиторов на синтез РНК митохондриями кукурузы. 1 - контроль; 2 - актино-мицин D (40 мкг/мл); з - бромистый ЭТИДИЙ (1 мкг/мл).

у

ВО

Тем не менее, специально проведенный нами анализ изменений генетических функций митохондрий, наступающих при хранении препарата изолированных органелл, показал, что определение кинетики синтеза ытРНК необходимо производить в течение первых зо мин. после выделения митохондрий.

В отсутствие немеченых экстрамитохондриальных рибонуклео-зидтрифосфатов (НТФ) в изолированных митохондриях кукурузы наблюдался незначительный уровень синтеза мтРНК, что, возможно, объясняется участием в реакции пула внутримитохондриальных НТФ. Процесс включения радиоактивного предшественника в мтРНК проявлял выраженную зависимость от наличия в среде трех немеченых НТФ, при этом наибольшим удельным вкладом в качестве предшественника обладал АТФ.

Таким образом, при подобранных нами экспериментальных условиях интактные энергизованные митохондрии кукурузы оказались способными к осуществлению эффективного матричного биосинтеза РНК. Имея такую функционирующую in vitro субклеточную систему, мы попытались использовать ее для изучения особенностей организации иитохондриальнсго генома высших растений.

1.2. Внутривидовые различия кинетики синтеза митохондриаль-ной РНК у растений (9, 19, 24, 26, 20, 33, 52).

Определение кинетики синтеза мтРНК препаратами митохондрий, полученными из различающихся по уровню приспособленности к действию экологических факторов генотипов кукурузы, позволило выделить две группы линий :

1) Митохондрии линий Ши. и А344+/+ синтезировали РНК с низкой скоростью;

2) Линия Сг25 и карликовый мутант АЭ44 в1п/з1п характеризовались высоким уровнем синтеза мтРНК.

При этом линии первой группы превосходят линии второй группы по урожайности зерна. Гибрид «64А х СГ25 занимал промеауточное положение по скорости транскрипции мтДНК. Полученные даникз позволили предположить существование негативной связи между скоростью транскрипции мтДНК и способностью генотипов поддерживать на постоянном уровне норму адаптивной реакции в широком диапазоне условий внешней среда.

1.2.1. Активность . РНК-синтезирупцих систем в митохондриях гетерозисных гибридов кукурузы (26, 33, 52).

В соответствии с нашим предположением о негативной связи уровня приспособленности организма с уровнем транскрипции мтДНК можно было ожидать, что в митохондриях гетерозисных гибридов кукурузы мтРНК синтезируется с низкой скоростью по сравнению с ин-бредными линиями.

С целью проверки данного предположения было проведено исследование кинетических параметров транскрипционной активности мтДНК в изолированных органеллах инбредных линий и гетерозисных гибридов кукурузы.

Мы установили, что средние значения скорости синтеза мтРНК в митохондриях исследованных гибридов действительно ниже таковых для митохондрий инбредных линий (табл.1). Возможное объяснение этому факту состоит в повышении числа транскрипционных матриц у гибридов, обусловленном высокой копийностьв митохондриального генома и/или увеличенным содержанием митохондрий в клетке. В целом полученные данные полностью подтверждают щюдположение о

isicKOM уровне синтеза мтРНК в шгохондриях гибридов.

Таблица 1

Кинетические характеристики синтеза РНК в изолированных ипохондриях линий и гибридов кукурузы

ч-

Включение -^Н-УТФ в кислотонерастворимуп Источник фракцию штохондрк2, 1йш/()дн1 мг белка)

митохондрий_

5 кнн . 10 мин 15 шн 20 ыин

Линии (10) 6909-1436 11701±1170 23774*4829 38323^11092 Гибриды (17) 6958*897 9764*897 12330±1143 18211-1674 Примечание: Удольная радиоактивность %-УТФ 370 ТБк/моль.

1.2.2. Транскрипция штохондриального генома у спонтанных и ждуцированных мутантов.кукурузы (19, 24, 52).

С целью изучения особенностей РНК-скнтезирукщах систем ми-:о;.у_1дркй кутаатных-форм кукурузы проведено сравнительное иссле-довакле кинетики синтеза РНК в митохондриях инбредных лшшй W64«l, СГ25, Г6ЭЭ4, A344 К мутантов 5764А air/air (воздушные корни), Ä'64i wr/wx (восковкдшй налэт на семенах), Сг25 02/02 (муч-икстиК эндосперм), Г6834 meg/meg (уменьшенные эндосперм и зароды:), A344 ein/sin (короткие мездоузлия). Для характеристики ак-Т1ГГЕССТИ синтеза мтРНК мутантов использовали отношение ' абсолэт-•:сИ активности синтеза РНК в митохондриях мутантных линий к та-коеой у соответствущих контрольных линий, несущих доминантные аллели генов. Оказалось, что в митохондриях проростков всех п. 'следованных кукурузных линий с рецессивными мутантныш аллеля-мч резко повышен уровень транскрипции мтДНК (табл.2).

Для исследованного набора мутантов кукурузы характерно налегли позитивной связи мэкду величиной фенотипического эффекта, обусловленного соответствующим рецессивным аллелем, и относительной и абсолютной активностями синтеза мтРНК.

Таблица 2

Характеристика активности синтеза мтРНК в изолированных митохондриях мутантов кукурузы

Относительная активность синтеза РНК в митохондриях Мутант _

5 мин 10 мин 15 мин 20 мин

А344 з1п/з!п 0,60 6,54 7,26 3,87

Г0834 meg/mzg 2,00 2,58 3,94 2,50

гс64а та/их 1,36 1,48 1,03 1,32

СГ25 02/02 1,31 1 ,47 1.06 1,86

Рассмотрение представленных данных по активности РНК-синте-зирущей системы митохондрий в исследованном растительном материале с точки зрения проявления этого признака у разных генотипов позволяет сделать следувдие заключения. Гибриды имеют меньшую среднюю величину скорости транскрипции митохондриальной ДНК по сравнению с линиями. Размах изменчивости этого признака в линиях значительно больше, чем в гибридах. Для подавляющего числа исследованных нами инбредных линий характерна высокая скорость синтеза мтРНК в митохондриях. В тех линиях кукурузы, где рецессивные аллели ядра находятся в гомозиготном состоянии, обнаруживается увеличенная скорость синтеза мтРНК в митохондриях. Величина прироста транскрипционной активности мтДНК зависит, по-видимому, от силы фенотипического действия аллеля и генетического фона.

1.3. Изучение характера связи между транскрипционной активностью ДНК митохондрий и продуктивностью растений (38).

С учетом важности генетических признаков, в кодировании которых принимают участие геномы хлоропластов и митохондрий (Негрук, 1987; Давыденко, 1989), представлялась оправданной попытка исследовать вопрос о взаимосвязи мекду генетическими характеристиками изолированных митохондрий и продуктивностью растений. На основании изучения кинетических параметров синтеза

мтРНК в изолированных митохондриях 74 линий и гибридов кукурузы т установили существование достоверной зависимости меаду уровнем транскрипционной активности ытДНК митохондрий определенного генотипа и величиной урожайности этого генотипа. Оказалось, что скорость синтеза РНК митохондриями связана отрицательной корреляционной зависимостью с урожайностью зерна (коэффициент корреляции равен -0,96 —0,99 ( Р < 0,01 ). На основе этих результатов мы разработали новый молекулярно-биологический способ оценки урожайности у зерновых и других сельскохозяйственных культур. Способ позволяет осуществлять в лабораторных условиях две важных для селекционного процесса процедуры: 1) оценку потенциальной продуктивности селекционного образца относительно генотипа-стандарта; 2) количественное определение потенциальной продуктивности образца с использованием экспериментальной кривой, характеризующей зависимость мевду активностью синтеза мтРНК в митохондриях 4-5 генотипов-стандартов и величиной урожайности этих генотипов. Отобранные с использованием такого способа новые растительные генотипы с увеличенной относительно стандарта урожайностью зерна могут быть далее включены в систему генетико-се-декционных испытаний по классической схеме, что в конечном итоге позволит значительно сократить сроки создания новых высокопродуктивных форм зерновых и зернобобовых культур.

2. ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ (15, 17, 27, 29, 36, 48, 52).

Исследование особенностей биосинтеза ДНК в интактных митохондриях кукурузы позволило заключить, что по некоторым характеристикам митохондриальная система синтеза ДНК растений не имеет принципиальных отличий от таковой, описанной ранее для животных митохондрий.

Система синтеза ДНК изолированных митохондрий кукурузы (Zea mays i.) имела следующие основные характеристики:

- температурный оптимум 30° с

- оптимум рН 7,5

- чувствительность к этидиум-брсмиду (2 мкг/мл) высокая

- потребность в субстрате дыхания митохондрий +

- потребность в ионах М§2+ +

- константа Михаэлиса для йАТФ 3-7 икМ В то те время принципиальной особенностью синтеза ДНК в

изолированных митохондриях проростков кукурузы было то, что матричную активность проявляли как высокомолекулярная или хромосомная ДНК, так и линейные и кольцевые плазмидоподобные ДНК разных размерных классов (рис.2).

А Б

Рис.2. Электрофоретический (А) и рэДиоавтографический (Б) анализ плазмидоподобных ДНК разных размерных классов из митохондрий кукурузы линии ?/6 4А с разными типами ЦМС. А1 - ЦМС С-типа; А2 - ШС Т-типа; АЗ - ШС й-типа; Б1 -ЦМС Т-типа; Б2 - ЦМС Б-типа; БЗ - ЦМС С-типа.

Анализ распределения радиоактивности во фракциях митохонд-

риалыюй ДНК после электрофореза в агарозном геле показал, что в условиях 1л уЗЛго в интактных митохондриях синтез ДНК происходит со значительной скоростью как во фракции высокомолекулярной ДНК, так и во фракциях плазмидоподобной ДНК. Мы установили, что скорость синтеза плазмидоподобных ДНК разных размерных классов, регистрируемая по включению 32Р-(1АТФ, может превышать соответствующую величину для хромосомной ДНК митохондрий кукурузы от 1,3 до 33 раз (табл.Э).

Таблица 3

Характеристика матричной активности ДНК разных размерных классов митохондрий кукурузы с'разными типами ЩЮ

Источник Размерный класс митохондриальной ДНК, т.п.н. митохондрий 1,9 2,3 5.4 6,4 вм мтДНН

w64a s-ТИП 13 14 2,2 1,3 1

w64a С-ТИП 9,6 10 - - 1

w64a Т-ТИП 33 - 1

w64atxcr25tb 5.2 6,3 - - ' 1■

Особенно значительное включение происходило в плазмиды размером 2,3 и 1,9 т.п.н., которые присутствуют во всех стерильных цитоплазмах и гибриде Краснодарский зоэТВ (W64AT х Сг25ТВ). Полученные нами данные о преимущественной репликации плазмиды 1,9 т.п.н. совпадают с результатами работы Смита и соавт. (Smith et al., 1987), в которой для клеток суспензионной культуры кукурузы линии "Black Mexican Sweet" установлен факт более высокой репли-кативной активности плазмиды 1,9 т.п.н. по сравнению с другими митохондриальными плазмидами при переносе клеток на свежую среду. В целом, полученные данные в системе синтеза ДНК in organelio свидетельствуют о существовании независимого контроля синтеза плазмидоподобных ДНК отдельных размерных классов в митохондриях высших растений.

2.1. Определение типа цитоплазмы у растений кукурузы с

использованием системы синтеза ДНК 1п ог^еНо (48).

Ванной областью исследований, в которой, на наш взгляд, продуктивно может быть использована ДНК-синтезируицая система изолированных растительных митохондрий, является молекулярно-би-ологическое изучение типов цитоплазматической мужской стерильности у кукурузы и других высших растений. Важно отметить, что способ изучения полиморфизма плазмидоподобных ДНК у генотипов с различными типами ДОС, основанный на радиоавтографическом анализе продуктов синтеза ДНК в митохондриях (рис.2), имеет определенное преимущество перед широко применяемым с этой Ее целью анализом структурной организации мтДНК. Такое преимущество обусловлено, в частности, возможностью идентификации активно функционирующих генетических матриц.

Исходя из полученных нами данных, ДНК-синтезирующая система изолированных растительных митохондрий является, перспективной модельной системой, пригодной как для изучения механизмов репликации растительной мтДНК, так и способов ядерной регуляции этого процесса. Кроме этого, ДНК-синтезирующая система митохондрий может быть использована в качестве генетического маркера в генети-ко-селекциошшх и биотехнологических исследованиях.

3.. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМ! МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ (8, 29, 40).

Разработка методов реконструкции митохсндриального генома высших растений приобретает в последние годы особое значение в связи с перспективами использования полинуклеотидного материала цитоплазматических органелл при конструировании растений методами генетической и клеточной инженерш? (Глеба, Сытник, 1982, 1984).

Нами исследована реконструкция РНК- и ДНК-синтезиругацей систем митохондрий кукурузы при гель-фильтрации солюбилизирован-ного холатом натрия материала этих органелл на колонке с липо-

сильным сефадексом ш-го. В получаемых в результате тасой процедуры протеолипосомах (митосомах) был зарегистрирован высокий уровень матричного синтеза РНК и ДНК (рис.3).

Вр€МЯ, МИН

Вместе с тем в использованном для самосборки супернатанте (150 ООО х §) биосинтез РНК не наблюдался, что позволяет сделать заключение о необходимости мембранных структур для протекания процесса транскрипции штохондриальной ДНК растений. Таким обра-

зом, в митосомах имелись все необходимые факторы для осуществления матричного биосинтеза нуклеиновых кислот. Электронно- микроскопическое исследование митосом выявило морфологическое сходство их мембран с мембранами интактных митохондрий.

Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет заключить о перспективности применения полученных методом реконструкции митосом как в исследованиях структурно-функциональной организации митохондриального генома растений, так, по-видимому, и в работах по конструированию растений методами генетической и клеточной инженерии. В последнем случае разработанный нами способ самосборки митосом может быть использован для включения рекомбинантшх ДНК в мембранную систему митохондрий с целью ее последующего использования в качестве генетического вектора в опытах с растительными протопластами.

4- ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТА ПОЛИНУШОТЩОВ В МИТОХОНДРИИ РАСТЕНИЙ (11, 15, 17, 21, 23, 27, 32, 35. 37, 44, 53).

Исследование транслокации нуклеиновых кислот в митохондрия высших растений приобретает в последние годы особую важность в связи с теоретически существующей возможностью клонирования ре-комбинантных ДНК в митохондриях и хлоропластах, а также использованием последних в опытах по генетическому конструированию растений путем слияния протопластов и субклеточных фрагментов (Глеба, Сытник, 1982; Геворкян и др., 1991).

Нами изучены вопросы транслокации ДНК бактериального и растительного происховдения в интактные митохондрии проростков кукурузы. Электрофоретмчаский и гибридизационный анализ ДНК митохондрий кукурузы, инкубированных с бактериальным плазмидакм вектором рВЮ27 с последующей обработкой ДНКазой, показал, что при данных условиях происходит эффективная транслокация плазмид-ной ДНК во внутреннее пространство органелл (рис.4). Установлено, что способностью проникновения внутрь митохондрий обладали лишь отдельные физические формы плазмидной ДНК.

Рис.4. Электрофоретический (А) и гибридазационный (Б) анализ ДНК контрольных и инкубированных с плазмидой рВЮ27 митохондрий кукурузы. 1 - Ре*;1 -фрагменты ДНК фага лямбда, используемые в качестве маркеров длины;' 2 - ДНК плазмиды рВЯ327; 3 - ДНК контрольных митохондрий; 4- - ДНК митохондрий, инкубированных с плазмидой рВ1?327; Б - радиоавтограф - результат гибридизации Слота А с плазмидой рвкэ27, меченой 32Р в реакции ник-трансляции. При инкубации обработанных плазмидой рВК322 митохондрий в условиях, благоприятствующих протеканию в них синтеза ДНК, зарегистрировано появление нескольких фракций 32Р-мвченой ДНК (рис.5). Электрофоретическая подвижность их соответствовала высокомолекулярной ДНК митохондрий, ковалентно-замкнутой форме плазмиды рВЛ322 и фракции плазмидоподобных митохондриальных ДНК. Использование бактериальной плазмиды в качестве матрицы для синтеза ДНК мигохондриальной ДНК-полимеразой в интакгных органеллах - дополнительное доказательство эффективной транслокации плаз-мидной ДНК во внутримитохондриальное пространство. При этом в митохондриальной системе определялась только ковалентно-замкну-тая форма плазмиды, что, по-видимому, отражает преимущественную транслокацию этой молекулярной формы плазмиды или предпочтитель-

ное по сравнению с остальными формами вовлечение ее в процесс митохондриального синтеза ДНК.

д

-23 7

2.3 1.98

9.5 6 7 4 3

(J La | г з

г

Рис.5. Электрофоретический (А) и радкоавтографический (Б) анализ ДНК контрольных и инкубированных с плазмидой pBR322 митохондрий кукурузы. 1 - ДНИ контрольных митохондрлй; 2 -ДНК митохондрий, инкубированных с плазмидой; 3 -'-ДНК плаз-миды pBR322. Справа указано положение Hind Ill-фрагментов ДНК фага лямбда, используемых в качестве маркеров; вм мтДНК. ппДНК - соответственно, высокомолекулярная и плзз-мидоподобная митохондриальная ДНК.

В целом, проведенные' нами исследования транспорта ДНК бактериальных векторных и рекомбинантных плазмид во внутреннее пространство изолированных митохондрий позволили установить, что экстрамитохондриальная ДНК hp только способна при определенных условиях проникать внутрь митохондрий, но может тэкке ;'нть использована в качестве генетической матрицы. Однако в случае исследования транслокации и матричной активности в отношении синтеза ДНК линейных S1 и S2 плазмидоподобных ДНК нам не удалось зарегистрировать проявления матричной" активности, что, вероятно,

объясняется потерей в процессе очистки плазмидоподобных ДНК ко-валзптно связанных с 5'-концами этих молекул терминальных белков, необходимых для их репликации.

Установленная наш возможность транслокацпи бактериальных плазадд в изолированные митохондрии, а такле наличие в составе клтохондрзального генома кукурузы и ряда других растений набора ППДЯК И автономно реплиЦЕрущихся РНК (Leaver, Gray, 1932; levingB, Brown, 1989} позволяют предполагать существование у растительных митохондрий специального механизма транслокации по-динуклеотвдов.

5. ПРОБЛЕМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ШТОХОВДРИАЛЪНОГО ГЕНСШ

5.1. Исслодовашэ взаимоотношений транскрипции митохонд-ртальноя ДНК и окислительного фосфорылирования (1, 2, 4» 12, 13, 14, 18, 25, 30, 52).

Изучение влияния различных ингибиторов окислительного фосфорилировання и цепи переноса электронов на кинетику синтеза итРНК в митохондриях показало, что все используемо ингибиторы шзывали заметное сншзкие активности синтеза РНК. Так, ингибитор окислительного фосфоршшрования на уровне транспорта адешш-нуклеотидов в митохондриях карбоксиатрактилозид в концентрации 0,5 мкМ вызывал почти 2-кратное снквэние скорости включения %-УТФ в кислотонерастворимую фракцию митохондрий.

Ингибировашю митохондрпальной цепи переноса электронов с помощью цианида калия приводило к еще более выраженному подавлению синтеза РНК. Снижение скорости синтеза РНК в митохондриях в ответ на добавление в инкубационную среду классического ингибитора окислительного фосфоршшрования олигошшдаа было на столь значительным и составляло в среднем ЗОЯ.

Неокиданные результаты получены при замене в реакционной среде синтеза РНК аденозинтрифэсфата на аденозиндифосфат. Уровень ДНК-зависимого синтеза РНК в митохондриях не только не уменьшался, но даг.з значительно возрастал при использовании АДФ вместо АТФ в качестве предшественника (табл.5).

Таблица 5

Синтез РНК в митохондриях кукурузы в условиях замены предшественника синтеза АТФ на АДФ в среде инкубации

Условия опыта

Включение Н-УТО в кислотонерастворкмуп Фракцию митохондрий, кмп /(мин мг белка)

5 мин

10 мин

15 кия

20 1ЯШ

Контроль (+АТФ)

-АТФ* АД®

-АТФ+АДФ+ 0лиг0м1щ;щ

6069-4-4-5 10763*863 19239-2045 44288*1103 10013*1246 16338-835 31042*757 49787*047

460*36

5951*168 17290*687 19876*194-0

В этом случае олигомицин обладал модана блокирувдим эффектом в отношения процесса транскрипции, что указывает на непосредственное вовлечение экстрамитохондриального АДФ после его фо сформирования в процесс биосинтеза мтРНК. Увеличение скорости синтеза мтРНК при использовании АДФ в качестве предшественника можно объяснить значительно более высоким сродством адениннуклэ-отидтранслоказы к АДФ по сравнению с АТФ. Полученные наш данные о значительной стимуляции синтеза мтРНК в изолированных митохондриях кукурузы при использовании в качестве предшественника АДФ вместо АТФ свидетельствуют о возможности функционального сопряжения двух систем.

5.2. Перекосное окисление липидов как фактор модификации генетических процессов в митохондриях (22, 31, 58). ■

Известно, что уровень свободнорадикального окисления мемб-

равных липидов, определяемый состоянием антиоксидантных систем эуквриотической клетки, изменяется в зависимости от физиологического состояния организма (Веселовский, 1982; Владимиров, Ар-чаков, 1972; Киров и др., 1982; Китлаев, 1982). При этом продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран могут вызывать структурные нарушения ДНК (?1е1;гоп1£го et а1., 1977; Рев1с1п, ЗЫуаЬота, 1986). Однако возможность функциональных нарушений ДНК митохондрий растений при протекании процессов ПОЛ в этих ор-ганеллах ранее нэ рассматривалась.

• С целью изучения возможных эффектов ПОЛ на активность генетических матриц митохондрий растений было исследовано влияние ферментативного и нефериентагивного ПОЛ в модельной системе изо-лированны?>митохондрий проростков кукурузы на кинетику матричного синтеза РНК и ДНК органеллами.

Мы установили, что индукция перекисного окисления в митохондриях кукурузы вызывает достоверное снижение активности мито-хондриальной системы синтеза РНК. При добавлении к митохондриям глутарового диальдегида с целью моделирования эффекта вторичных продуктов ПОЛ типа малонового диальдегида (МДА) глутароЕый ди-альдегид вызывал снижение скорости синтеза мтРНК на начальном участке кинетической кривой. При увеличении сроков инкубации митохондрии, обработанные глутаровым диальдвгидом, демонстрировали высокие скорости синтеза мтРНК, заметно превышающие таковые для контрольных митохондрий. Вопрос о причинах повышенного уровня транскрипции мтДНК в митохондриях, обработанных глутаровым ди-альдегидом, остается пока неясным. Нэ исключено, что в этом случае происходил некоординированный синтез мтРНК.

При изучении кинетики синтеза мтДНК в митохондриях кукурузы при активации ПОЛ ферментной и неферментной природы были получены принципиально сходные результаты (рис.6). В условиях протекания перекисного окисления форма кинетической кривой синтеза мтДНК претерпевала существенные изменения: первоначально в пределах ю- и 15-минутных интервалов наблюдалось увеличение скорости синтеза мтДНК, которое к 20 мин сменялось значительным торможением процесса.

Рис.6. Кинетика синтеза мтДНК з в митохондриях кукурузы при активации ферментативного и не-2 ферментативного пэрекисного окисления. 1 - контроль; 2 -система ферментативного ПОЛ; 3 - система неферментативного ПОЛ.

Зарегистрированное в этих экспериментах резкое снижение скорости синтеза мтДНК в конце го-минутного интервала, возможно, обусловлено как глубокими нарушениями матричных свойств ДНК митохондрий (двуцепочечные разрывы, интеркаляция МДА в полинуклео-тидную цепь), так и снижением активности или инактивацией ферментов нуклеинового обмена (главным образом, полимераз) вследствие образования в них межмслзкулярных сшивок типа оснований Шиффа.

Отметим, что установленные нами факты влияния ПОЛ на генетические процессы в'растительных митохондриях должны учитываться как при использовании митохондрий в опытах по генетической и клеточной инженерш растений, так и при изучении вопросов регуляции экспрессии митохондриальных генов в системе изолированных органелл.

5.3. Исследование соотношений активностей синтеза РНК и ДНК в митохондриях разных генотипов кукурузы (61).

Изучение взаимоотношений двух важнейших с точки зрения био-

генеза митохондрий юлекулярно-генетических функций - транскрипции и реплжации мтДНК - в митохондриях выспих растений мояэт дать ценную информацию об особенностях функциональной организации генома этих органелл. О возможности определенных взаимосвя-аэй мевду транскрипцией к репликацией в цитоплазматических орга-неллах эукариот свидетельствуют полученные на митохондриях млекопитающих данные о тоы, что инициация транскрипции ь-нпти к транскрипционная активация репликации н-нити осуществляются с одного и того сэ участка ДНК «йшпз е! а!.. 1935). В митохондриях дрокзай обнаружена РНН-полимараза, обеспечивающая, по все£ вероятности, синтез РНЕ-затравки для репликации мтДНК (оъгхвИт-яоп, ИаЫпсяЗЛг,, 1983',-

Кы провели исследование кинетики синтеза РНК и ДНК изолированными митохондриями разных инбредных линий и гибридов кукурузы. Регистрация кинетики синтеза РНК и ДНК в митохондриях пята, линий кукурузы в пределах 20-шнутного интервала показала, что для каждой инбредной линии характерно определенное соотношение активностей матричных процессов биосинтеза нуклеиновых кислот. Определение вида зависимости между характеристика-ус: лгатохондри-альных систем биосинтеза РНК и ДНК для всех изученных линнй показало существование отрицательной корреляционной связи мэзццу активностями этих систем (коэффициент корреляции -0,99).

При изучении синтеза нуклеиновых кислот в изолированных ми-тохоццриях девяти гибридов (рис.7) обнаружено, что параметры, характеризующие активность синтеза мтДНК и транскрипции итДНК, тага®, как и в случае линий, связаны между собой отрицательной корреляционной зависимостью (коэффициент корреляции -о,92).Таю»? образом, из полученных результатов следует, что в генетической системе митохондрий исследованного набора линий и гибридов кукурузы могут иметь место реципрокные взаимоотношения мевду активностями синтеза РНК и ДНК, проявляющиеся в случае отдельных генотипов в относительном преобладании одного из двух иегов матричной активности мтДНК.

электрофоре пиеской подвижности ппДНК разных размерных классов (Э1, Б2 и эз линейных митохондриальных плазмид) от концентрации детергента. Отметим, что анионный детергент холат натрия, обеспечивающий наиболее мягкие условия лизиса, является наиболее подходящим детергентом для достижения целей электрофоретического анализа и разделения молекул отдельных размерных классов пцДНК.

6.2. Матричная активность ппДНК разных размерных классов в системе интактных митохондрий (15, 27, 36, 48, 52).

Проведенные нами исследования матричной активности пцЦНК разных размерных классов в системе синтеза ДНК 1п ог^апеНо показали, что наиболее значительное включение радиоактивного предшественника (^Р-лЦТФ) происходило в плазмиды размером 2,3 и 1,9 т.п.н., которые присутствуют во всех стерильных цитоплазмах. Так, для Б-цитоплазмы оно в 14 раз, для С- в ю раз, а для Т- в 33 раза вшле у этих плазмид по сравнению с высокомолекулярной мтДНК (табл.3). Б-плазмида такяе более активно включали радиоактивно меченый сЩТФ, чем основная мтДНК. Многократное относительное превышение включения радиоактивности в кольцевую плазмиду размером 1,9 т.п.н. по сравнению с другими пцЦНК свидетельствует о высокой активности рэпликона и дает основание рекомендовать эту плазмиду для использования при конструировании генетических векторов для цитоплазмы злаковых растений.

б.з. Молекулярно-генеплеская характеристика линейных плазмид митохондрий кукурузы (41, 43, 45, 46, 56).

В общем наборе пШШК митохондрий кукурузы линейные S1 и S2 плазмиды представляют особый интерес для исследователей: наличие черт хромосомной организации-в виде теломерных пли теломеропо-добных участков ДНК у этих генетических элементов (Kemble, Thompson, 1982) делает эти молекулы особенно перспективными кандидатами на роль генетических векторов нового поколения (искусственных хромосом) для растений. Мы предприняли попытку

комплексного исследования молекулярно-генетических характеристик этих минихромосом митохондрий кукурузы с использованием методов молекулярного клонирования, субклеточной биологии и компьютерного анализа биополимеров с использованием баз данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

6.3.1. Получение гибридизационных зондов для исследования ыолекулярно-биологических функций Б1 и 32 плазмид (46, 53).

В результате молекулярного клонирования рестрикционных Pвt1-фрагментов Б2 ппДНК в бактериальном плвзмидном векторе рВЮ22 получена рекомбинантная плазмида ргя£2-1, несущая фрагмент размером 1435 п.н. Гибридазационный анализ методом дот-блот (КаГа-Ьов et а1., 1979) мтДНК разных видов растений (гороха, пшеницы, огурца, ячменя, томата, картофеля) и мтДНК кукурузы различных стерильных линий с использованием плазмида ргтБ2-1, меченой -^Р-аАТФ в реакции ник-трансляции, показал возможность использования этой плазмида в качестве гибридизационного зонда. Наличие или отсутствие гомологии ргп£2-1 с мтДНК линий кукурузы с разными типами ЦМС по данным гибридизационного анализа фактически служило дополнительным контролем в этих экспериментах,' поскольку эти данные подтверждают ранее установленный факт существования такой гомологии (Ьеузл^з et а1., 1980). При используемых условиях ДНК рекомбинантной плазмида рйпБ2-1 гибридизова-лась, хотя и в разной степени, с мтДНК гороха, томатов, пшеницы, огурца. Обнаружение гомологии Б2 ппДНК с митохондриальной ДНК других видов растений может свидетельствовать в пользу гипотезы экзогенного происхождения этих элементов митохондриального генома растений.

Для гибридизационного анализа концевых областей линейных ппДНК митохондрий кукурузы, являющихся предположительно участками связывания белков, наш был получен олигонуклеотидный зонд, структурной основой которого послужил участок совершенной гомологии длиной 16 п.н. в составе терминального инвертированного

повтора всех трех линейных митохондриальных плазмид (рис Э).

(истсттйтатасттттстсса ассгсасасаасататоаааас Рис.8. ДНК-последовательность синтетического олигонуклео-тида длиной 16 п.н., гомологичного линейным плазмидам митохондрий кукурузы. РвМ-сайты выделены жирным шрифтом.

Исследование ДНК нескольких рекомбинантных клонов методом дот-гибридизации с 52 ппДНК митохондрий кукурузы позволило установить, что они имеют соответствующую олигонуклеогидную вставку (рис.9) и могут быть использованы в качестве гибридизационного зонда.

Полученный нами олигонуклеотидннй зонд может найти применение при изучении процессов рекомбинации и возможного обмена генетическим материалом между органеллами с участием э-эписом митохондрий.

Ь Л?

Г 4

V г

1

V.

Рис.9. Гибридизация меченой ДНК нескольких рпгьгнмб клонов с эг плазмидой митохондрий кукурузы. 1-5, 7 - клоны, содержащие'олигонуклеотидную вставку; 8 - рВИ322 на Б2 (сигнал отсутствует).

С другой стороны такая генетическая конструкция может оказаться полезной в исследованиях отдельных участков линейных

плазкад митохондрий, в частности, оелок-связываюцих сайтов этого вида ДНК.

6.3.2. Контекстный анализ последовательностей si и S2 плазмид с использованием базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (43. 45, 56).

С использованием приемов контекстного анализа, реализованного в виде пакета прикладных программ "Контекст" для персональных ЭВМ (Соловьев, Рогозин, 1986) н банка данных нуклеотидных последовательностей установлено, что линейные si и S2 пцДНК включает учвстки неслучайной гомологии с последовательностями пяте различных эукариотических вирусов (ретровнруса птиц, флебо-Еируса, вируса гриша, вируса гепатита, вируса SV40). Размер участков токологии варьировал, в среднем, от бо до 130 нуклеотидных пар. Выявленные в нуклеотидных последовательностях вирусов участки гомологии входят, как правило, в состав функционально вагаых областей вирусных геномов (область рекомбинации ыэцду SV40 и геномом хозяина, ген гемагглотшвша, длинный концевой повтор и др.). Соответствующие участки в последовательностях ыитохондриальных ппДНК обнаруживаются в составе открытых рамок считывания. В составе участков гомологии имеются короткие олиго-нуклеотидаые сайты, наличие которых обычно характерно для областей ДНК с активно идущими процессами сайт-специфической рекомбинации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу представлений о более позднем эволюционном происхождении линейных эписом митохондрий кукурузы по сравнению с основной мтДНК.

si и s2 плазмида имеют область совершенной гомологии размером 1462 п.н., которая включает открытую рамку (0рс2) считывания (Sederofi, Levinge, 1985). йы осуществили поиск возможной гомологии белка, кодируемого 0РС2, с последовательностями базы данных "Swissprot" (release 17) и обнаружили, что этот белок имеет гомологах» с альфа-каталитической субъедишщей цАМФ-зависимой протеинкиназы быка и мыши (ЕС 2.7.1.37). При этом аминокислотная последовательность 0РС2 содержит з из 7 наиболее консервативных субдоменов, которые характерны для протеинкиназ эукариот (Peng, Kuog, 1991; Hants, 1991). Недавно было показано существование в

клетках млекопитающихДНК-зависимых протеинкиназ, которые, вероятно, играют существенную роль в регуляции транскрипции и репликации ДНН (bees-Miller, Anderson, 1989; Lees-Miller et al., 1990). Можно предположить, что 0РС2 кодирует подобную протеинки-назу, которая регулирует генетические функции S1 и S2 эписом кукурузы через фосфорилирование соответствующих белков. С 5'-концами si и S2 плазмид ковалентно связаны белки, которые, по-видимому , участвуют в инициации и репликации этих ДНК (Kemble, Thompson, 1982). Одной из возможных мишеней протеинкиназного действия могут быть, на наш взгляд, концевые белки, связанные с 5'-концами этих минихромосом.

;!АКШ7ЕН2 (11 , 31, 40, 45, 55, 57, 60)

Проведенное изучение ?гитохондриальных систем биосинтеза нуклеиновых кислот у высших растений отчетливо проявило перспективность использования функциональных характеристик генома изо-лфованных органелл как в молекул^рно-биологических, так и в ге-нетико-селекционшх исследованиях растений.

Изучение матричных функций молекул мтДНК разных размерных классов показало, что кольцевые и линейные плазмидоподобные ДНК, наряду с митохондриальной хромосомой, служат эффективными генетическими матрицами. Проявление свойств автономного репликона у митохондриальных плазмид в условиях in organello позволяет эффективно использовать ДНК-синтезирующую систему изолированных штохондрий для идентификации и исследования типов ДОС у кукурузы. Молекулярно-биологические особенности отдельных кольцевых и линейных митохондриальных плазмид кукурузы делают их перспективным исходным материалом для конструирования специальных генетических Еекторов для переноса генов в цитоплазматические органел-лы растений.

Впервые проведенное детальное исследование генотипических особенностей транскрипционной активности митохондриального генома у большого набора линий и гибридов кукурузы показало, что в митохондриях гетерозисных гибридов средняя скорость синтеза

мтРНК ниже, чем в митохондриях инбредных линий. Обнаружено также, что в митохондриях спонтанных и индуцированных мутантов кукурузы резко повышен уровень транскрипции митохондриальной ДНК. Исследование хатэактера зависимости мевду активностями синтеза РНК и ДНК в митохондриях разных генотипов кукурузы выявило наличие отрицательной корреляционной связи между двумя основными типами матричной активности митохондриального генома у этих растений. Существование такой связи между активностями систем синтеза РНК и ДНК митохондрий исследованного нами набора растительных генотипов позволило разработать и испытать в условиях эксперимента концепцию митоховдриальных генетических маркеров нового типа для молекулярно-генетических и генетико-селэкционных исследований у высших растений. Концепция основана на использовании функциональных параметров митохондриального генома (активностей синтеза двух основных типов генетических макромолекул митохондрий) изолированных органелл в качества альтернативных характеристик растительного генотипа.

В рамках проблемы функционирования митохондриального генома впервые проведено исследование влияния перекисного окисления ли-пидов на активность генетических процессов в изолированных митохондриях растений. Показано изменение вида кинетических кривых синтеза РНК и ДНК в условиях активации переокисления липидов, что позволяет сделать заключение о необходимости контроля анти-оксидантного статуса этих органелл в работах по молекулярной биологии и биотехнологии растений. Нельзя исключить, что и в условиях in vivo процесс перекисного окисления липидов в митохондриях, изменяющийся в зависимости от физиологического состояния организма и Действия факторов внешней среды, является одним из биохимических механизмов возникновения цитоплазматической изменчивости. На модели изолированных органелл доказана возможность сопряженности процессов окислительного фосфорилирования и синтеза РНК в растительных митохондриях: при использовании в качестве предшественника синтеза РНК АДФ вместо АТФ наблюдалось увеличение скорости транскрипции мтДНК, устраняемое добавлением ингибитора окислительного фосфорилирования (олигомицина).

В соответствии с соврененнкмз представлениями как транскрипционные, так я постгранскрипцпоппыэ процессы играю? зоягув роль в экспрессия митохондряальпого генома растений (?1ппо§ап, Вготп, 1990; вгъу эt а1., 1992). Тек, в последние годи установлено, что мРНК практически всех изученных в этом отно-шелж Со,яков растительных митохондрий подвергаются пост-тронскрипциенкоЗ ггодафзкащш (рвдактирспашэ), одам из вазянх неслздст2тЗ которой является земэна отдельных аминокислотвнх трпплвтоз з пэрзютсм чранскриптв (Огяу вt а1., 1992). Нам удалось показать, что редактирование нРйК в митохондриях растений является :.!ол<экулярнка юханаЕтеа обрззсвсэзл высскокснсерватив-гих „-е£шшогах повторов з сгиноклслостк последовательностях суСьэдпкгц г'зибрсшзых форантоз (АИ*-спнтгзы, цитоетоггоксидазн и ¿р.). Прэдголагазтся, что обнаруженный з гянбранпах Солках гетто-аондрзй растений Л9й.т!Н0Еай котив 1-19-ь обесггзчгваот болок-бел-копче взетаюдэйстгзя зтях пояяпептидоз з лшадюм :<атряксв мэмб-

гэдозана реконструкция PIS- да-сгзтезярукщх систем гатохондрий проростхоз кукурузы при гель-фиьтрацаи солвбвлязи-posaiiHoro детергентом материала этих органалл на колонке с липо-фхлышм сефадексом хн-20. В яолучге?5и: в результате такой процедур:-; протеолипоссмах (мнтосомах) зарегистрировал высокий уровень матричного синтеза РНК я ДНК. Полагаем, что метод самосборки является удобным методическим подходом как для изучения структурно-функциональной организации ютоховдрпального генома, так и для бкотехнолопиеских исследований по генетической трансформации внеядерных геномов.

С целью разработки системы генетической трансформации митохондрий впервые проведено исследование условий транспорта и матричной активности чужеродного полинуклеотидного материала в ин-тактных митохондриях растений. Доказана возможность транслокации бактериальных векторных плазмид серии pBR во внутреннее пространство изолированных органелл. Обнаружена матричная активность бактериальной плазмида в отношении синтеза ЛНК в генетической системе интактных митохондрий.

В целом, результаты проведенных в настоящей работе исследований структурно-функциональных особенностей митохондриального генома растений, демонстрирующие возможность манипуляций с генетическим материалом изолированных органелл (реконструкция генетических функций митохондрий в протеолипосомах, наличие свойств автономного репликона у митохондриальных плазмид, транслокация и матричная активность бактериальных векторных и рекомбинантных плазмид в системе изолированных митохондрий) создают фундамент для развития нового научного направления клеточной биологии растений: реконструкции внеядерных геномов.

ВЫВОДЫ

1. Основным результатом исследований явилась разработка и экспериментальная проверка оригинальной концепции митохондриальных генетических маркеров у высших растений, построенной на использовании функциональных параметров митохондриального генома (активностей РНК- и ДНК-синтезирукщих систем) изолированных органелл в качестве альтернативных характеристик генотипа. Одним из приложений такого подхода может быть использование ДНК-синте-зирущей система митохондрий для идентификации типов ЦМС у кукурузы.

2. Принципиальной особенностью систем биосинтеза нуклеиновых кислот изолированных растительных митохондрий является использование ими в качестве генетических матриц, наряду с высокомолекулярной хромосомной ДНК, видоспецифических наборов кольцевых и линейных плазмидоподобных ДНК, включающих перспективные с точки зрения конструирования генетических векторов для растительной цитоплазмы автономные репликоны.

3. Обнаружена отрицательная корреляционная связь между активностями синтеза РНК и ДНК в митохондриях разных генотипов кукурузы и других видов растений. Выявление такой особенности функционирования митохондриальных геномов позволяет использовать кинетические параметры синтеза РНК и ДНК в митохондриях в качестве альтернативных характеристик генотипа в генетико-селекци-онных и биотехнологических исследованиях.

4. Показано, что посттранскрипционная модификация мРНК (ре-, дактирование РНК) является молекулярным механизмом образования высококонсервативных лейциновых повторов в аминокислотных последовательностях субъединиц мэ мбрано связ анных ферментов митохондрий растений (АТФ-синтазы, НШ-дегидрогеназы, цитохромоксида-зы). Предполагается, что обнаруженные лейциновые повторы вида 1>-Х9-Ь ответственны за белок-белковые взаимодействия во внутренней мембране митохондрий.

5. В условиях активации перекисного окисления липидов в митохондриях растений наблюдаются значительные изменения формы кинетических кривых синтеза митохондриальных нуклеиновых кислот, обусловленные (1) сниаением транскрипционной активности мтДНК и (2) увеличением скорости синтеза мтДНК в начальный период с последувдим существенным торможением этого процесса относительно контрольного уровня.

6. ВпэрЕыэ показана возможность реконструкции РНК- и ДНК-сянтезирукщих систем митохондрий при гель-фяльтрации солюби-лизированного холатом натрия материала этих органелл на колонке с липофильным сефадексом. В реконструированной генетической системе органелл (митосомах) наблюдается относительно высокий уровень матричного синтеза РНК и ДНК, сравнимый по величине с таковым для интактных митохондрий кукурузы.

7. Впервые установлена возмокность транспорта чужеродного полинуклеотидного материала через внутреннюю мембрану интактных митохондрий растений. С использованием радиоавтографяческого анализа обнаружена матричная активность бактериальных векторных и рекомбинантных-плазмид в отношении синтеза ДНК в генетической системе изолированных митохондрий. Данная модельная система может быть использована для разработки системы генетической трансформации митохондрий.

8. Линейные и Э2 плазмидоподобные ДНК митохондрий кукурузы включают участки неслучайной гомологии с последовательностями пяти различных эукариотических вирусов (ретровируса птиц, флебовируса, вируса гриппа, вируса гепатита, вируса БУ40). Обнаруженные участки гомологии входят в состав функционально

ваших областей вирусных геномов и плазг-ащоиодобша ДНЕ кято-хондрий и насыцош коротка оошгонуклаютшшш сайшя:, ншшпэ которых типично для областей ДШ' с активно едоше.^ процессам сайт-спец»з8ачвокой рзко.:3;;н£Цкк.

9. Разработаны штодеческае подхода для получения высокоо-чаденшх лиаеУгкшс и кольцевик вжазмадоподобил ДНК кг кяоаавд-рий кукурузы. ЯспользоЕа'йз этих подходов делает еос^о^ныгл: 1) проведекиэ быстрого аналога ра»:оршх классов маз^адало^оОшл; ДНК; 2) получозхе ьатвркзла для цалэ2 рестрЕКщюипого анализа к молекулярного к£<щровааия шшшщоюдойеос ДНК.

ю. Проведано работа по колучешсз ковш: гШрдазэщ-ОЕнах зовдоз да есслэдовшшй ютохондраальиого г&ногга расч-зшй. В бактериальной плазздцюа векторе рБНЭ22 проклонирован Ре«-£раг-кент размером 1435 п.п. 82 лвваШоЗ шгаздида магоховдрЕЗ кукурузы. Полученная решкЭ'ЕНЕЕТная плазьэда р2т32-1 использована в качество голшуклеогидаого зонда в исследованиях особенностей структурной органнзацнн штохондрзального генома нескольких видов шсшх растений. Путем клонирования синтетического олигояук-леотида длиной 16 н.п. в бактериальной плазмяде рвюгг получен молекулярный зонд рялешчб для участка совершенное гомологии в составе терминального инвертированного повтора трах линейных ул-тохондриальных плазыид кукурузы. Результата экспериментов по дот-гнбридкзащш рокоиЗжактной плазквда рга1глШ16 с 82 плагмндой кукурузы позволяют заключить'о возмозиости ее применения. в качестве гибридкзанионного зонда.

ШЧаОЧГИЦЯЙЧЕШШ РАЗРАБОТКИ И РШШЩАЩШ Для прогнозирования потенциальной продуктивности новых селекционных образцов, получазъш метода;® отдаленной гибрпдиза-цяи, химического мутагенеза, генетической и клеточной инженерш, традиционной селекции предлагается на определенном этапе селекционной работы использовать лабораторные молекулярно-бкологи-ческие метода оценки и определения потенциальной урожайности растительных генотипов, основанные на определении генетических характеристик изолированных митохондрий испытываемого генотипа и генотипов-стандартов. Необходимая точность оценки признака уро-