Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Митохондриальный геном Pisum sativum L. при стрессе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Губайдуллин, Марат Ирекович, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ОТДЕЛ БИОХИМИИ И ЦИТОХИМИИ

УДК 576.575.13

Губайдуллин Марат Ирекович

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ PISUMSATIVUML. ПРИ СТРЕССЕ

(Специальность 03.00.12. - Физиология растений)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.н. А.Г.Мардамшин

Уфа-1999

ВВЕДЕНИЕ 4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Типы реакций высших растений на стресс на молекулярном уровне 7

1.2. Митохондрии растительной клетки 14

1.2.1. Структура и количество митохондрий в клетке 14

1.2.2. Особенности митохондрий растений 15

1.2.3. Митохондрии растительной клетки при стрессе 18

1.3. Митохондриальный геном высших растений 19

1.3.1. Кольцевые и линейные митохондриальные ДНК 20

1.3.2. Низкомолекулярные митохондриальные ДНК 23

1.3.3. Модели организации митохондриального генома высших растений 29

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33

11.1. Характеристика объекта 33

11.2. Выращивание гороха посевного при солевом

стрессе (NaCl) 33

11.3. Выращивание гороха посевного при аноксии 34

11.4. Культивирование клеток in vitro 34

11.5. Выделение митохондриальной ДНК методом феноль-ной депротеинизации 35

11.6. Электрофоретическое разделение митохондриальной ДНК в агарозном геле 37

11.7. Расщепление митохондриальной ДНК рестрицирую-щими эндонуклеазами 38

11.8. Электроэлюция митохондриальной ДНК в агарозном геле 39

11.9. Обработка митохондриальной ДНК РНКазами А и H 39

II. 10.Расщепление митохондриальной ДНК изошизомерами

Mspl и Hpall 40

II. 11.Реактивы 40

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42 III. 1. Митохондриальный геном гороха посевного при

солевом стрессе 42

111.2. Митохондриальный геном клеток гороха, культивируемых in vitro 54

111.3. Митохондриальный геном гороха при аноксии 66

111.4. Метилирование цитозина в митохондриальной ДНК гороха 70

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77

S

ВЫВОДЫ 79

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 80

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В последнее время митохондрии привлекают все большее внимание физиологов растений, молекулярных биологов, биофизиков, генетиков. Это объясняется той ролью, которую митохондрии играют в жизнедеятельности клетки и организма в целом, а также тем, что с митохондриальным геномом растений связаны такие практически важные признаки, как устойчивость к патотоксинам и цитоплаз-матическая мужская стерильность (ЦМС).

К настоящему времени достаточно подробно исследованы митохондриальные геномы дрожжей и млекопитающих. Структурно-функциональная организация этого генома у растений до сих пор не ясна. Имеющиеся эксперментальные данные не позволяют отдать предпочтение ни одной из доминирующих моделей организации митохондриального генома растений. Одна из них предполагает наличие активных рекомбинационных процессов в митохондриях растений, согласно другой - в этой органелле может меняться только копийность предсуществовавших классов кольцевых молекул.

Изменчивость митохондриального генома растений была показана при сравнительном анализе митохондриальной ДНК (мтДНК) целых растений и клеток, культивируемых in vitro, а также фертильных растений и растений с признаком ЦМС [Small et al., 1987; Lonsdale, 1989]. Однако эти данные укладываются в рамки каждой из этих гипотез. Поэтому необходимо привлечение новых модельных систем для углубления представлений об организации митохондриального генома растений in vivo.

Исходя из вышесказанного целью настоящей работы является исследование вариабельности структурной организации митохон-

дриального генома растений при действии различных стрессовых факторов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать стабильность митохондриального генома гороха посевного при выращивании растений в 0.6%-ном растворе NaCl.

2. Провести сравнительный анализ митохондриального генома целых растений и различных линий каллусной ткани гороха посевного.

3. Изучить реакцию митохондриального генома гороха посевного на действие первичной аноксии.

Научная новизна. Показано, что при действии 0.6%-ного раствора NaCl в течение 40 суток, 3-х суточной аноксии и 6-месячного культивирования клеток in vitro митохондриальный геном гороха посевного не меняет своей структурной организации. Однако при выращивании растений гороха на 0.6%-ном растворе NaCl наблюдается увеличение содержания мтДНК на 38-40%, а также возрастает число ошибок при биосинтезе мтДНК, проявляющееся в увеличении в ней количества рибонуклеотидов, ковалентно связанных с дезоксирибонуклеотидами.

Установлено, что в мтДНК гороха посевного содержится 5-метилцитозин, количество и местоположение которого в мтДНК не меняется при солевом стрессе и культивировании клеток in vitro, что свидетельствует о стабильности структурной организации митохондриального генома.

Практическая ценность. Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшем изучении роли митохондрий при адаптации растений к действию стрессовых факторов. Разработанные подходы могут быть использованы при анализе молекулярных механизмов адаптации галофитов к засолению, растений, обладающих различной устойчивостью к аноксии при росте в бескислородной среде.

Апробация. Основные положения диссертационной работы представлены на международном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996), 2-м международном симпозиуме "Стресс и ассимиляция неорганического азота" (Москва, 1996) и симпозиуме "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Благодарности. Автор сердечно благодарит научного руководителя к.б.н. Айрата Габидулловича Мардамшина за помощь при работе над диссертацией, а также коллег Р.Д.Валиеву, К.Р. Зиякаеву, A.M. Загидуллина, к.б.н. И.В. Максимова, к.б.н. А.Р. Мустафину за помощь при выполнении работы.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Г.1. Типы реакций высших растений на стресс на

молекулярном уровне

Устойчивость растений к действию стрессовых факторов обеспечивается различными механизмами, которые связаны с разным уровнем структурной организации растений от молекулярного до организменного.

Типы реакций растительных клеток на стресс различаются в зависимости от действия конкретных факторов, а также от вида растений и его устойчивости к данным факторам.

Растительная клетка при действии теплового шока индуцирует синтез белков теплового шока (БТШ). Они консервативны в эволюционном плане и широко распространены от бактерий до растений и млекопитающих [Vierling, 1990; Kuznetsov, Roshehupkin,1994]. Их функции не совсем ясны, хотя уже известно, что белки теплового шока участвуют в сохранении структур других белков в процессе биосинтеза и в процессах правильной сборки белковых комплексов в митохондриях, хлоропластах и цитоплазме [Vierling, 1990; Georgopoulos, Welch, 1993; Gatenby, Viitanen, 1994]. Под последним подразумевается скручивание полипептидной цепи в трехмерные структуры, перенос белков через мембраны митохондрий и эндоплазматического ретикулума, ассоциация субъединиц в олигомеры [Cuezva et al., 1993; Georgopoulos, Welch, 1993; Gatenby, Viitanen, 1994]. Такие белки называются шаперонами.

При действии теплового шока у многих видов растений происходит синтез нескольких групп новых белков с различными молекулярными массами. Так, белок с молекулярной массой 18 кДа был охарактеризован у ряда видов растений [Lee et al., 1995]. Белок теплового шока у риса (Oryza sativa) представляет собой полипептид, состоящий из

160 аминокислотных остатков. Этот белок гомологичен белкам теплового шока Peahsp 18.1 и Peahsp 17.9 гороха {Pisum sativum), Whtspe 58 пшеницы (Triticum aestivum), Soyhsp 17.5E сои (Glycine max) и Athhsp 17,6 арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) на 71.3%, 66.9%, 69.1%, 66.9% и 66.9%, соответственно [Lee et al., 1995]. Белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа обнаружен у кукурузы и арабидопсиса [Кравец и др., 1995; Lee, Schoffl, 1996]. При этом, наряду с белком с молекулярной массой 70 кДа, в клетках кукурузы синтезируется также БТШ с молекулярной массой 60 кДа. По-видимому, эти белки могут синтезироваться и при действии на растения холодового шока [Кравец и др., 1995]. При ингибировании синтеза белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа у арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) синтез белка теплового шока с молекулярной массой 18 кДа продолжается, что свидетельствует о разных функциях этих белков в растениях [Lee, Schoffl, 1996].

Белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа кодируется ядерным геномом и обнаруживается в митохондриях ряда растений. Считается, что его синтез происходит постоянно, а при действии теплового стресса уровень синтеза этого белка увеличивается в несколько раз [Georgopolus, Welch, 1993].

При действии теплового шока в матриксе митохондрий гороха посевного был обнаружен белок теплового шока с молекулярной массой 22 кДа [Lenne, Douce, 1994]. Этот белок не является тканеспецифичным и его количество составляет 1-2% от массы всех белков. Авторы считают, что он защищает клетки от перегрева.

Помимо классических белков теплового шока с молекулярными массами 18-22 и 60-70 кДа в растениях, по-видимому, могут существовать и высокомолекулярные белки теплового шока. Так, у арабидопсиса {Arabidopsis thaliana) при тепловом шоке увеличивается

синтез белка с молекулярой массой 91 кДа, имеющего отчасти сходство к АТФ-связывающему домену БТШ-70 [81:огогЬепко е! а1., 1996].

Другой, наиболее изученной системой, является ответ растений на холодовой стресс. Были выявлены холодовые белки с различными молекулярными массами у разных видов растений, синтез которых происходит как при холодовом стрессе, так и при холодовой адаптации. Отличие холодового стресса от холодовой адаптации заключается в том, что медленное понижение температуры (холодовая адаптация) позволяет растению в достаточной мере осуществить синтез холодовых белков. Благодаря этому эффекту растение выдерживает более низкие температуры. Холодовые белки выполняют ряд функций. Одна из них-функция криопротектора, которая не позволяет образоваться льду в клетках растений. Подобные белки обнаружены также в крови арктических рыб и имеют аланинбогатые повторы [Аванов, 1990]. Ряд холодовых белков участвует в метаболизме клеток и отвечает, по крайней мере, за накопление свободного пролина и изменение состава аминокислот в растительных клетках. Аминокислота пролин также является криопротектором [Аванов, 1990]. Кроме того, ряд холодовых белков участвует в метаболизме жирных кислот, что приводит, по-видимому, к увеличению в мембранах ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидэтаноламина [8то1епзка, Кшрег, 1977; НотаЛ е1 а1., 1980].

Существенную роль в адаптации к холоду у растений играет абсцизовая кислота (АБК). Наиболее подробно действие абсцизовой кислоты изучено у арабидопсиса (АгаЫ^рзгя гкаНапа) [Уаша§исЫ-ЗЫпогаЫ, 8Ыпогак1, 1995]. Показано, что она активизирует два гена в ядерном геноме, которые кодируют белки, синтезирующиеся в ответ на действие холодового и солевого стрессов. Один из этих генов, обозначенный гс129А, также активизируется низкими температурами. В

свою очередь, синтез абсцизовой кислоты индуцируется холодом, засухой или солевым стрессом. При закаливании растений Solarium, commersonii при 2°С содержание АБК в листьях увеличивается в 2.5 раза, что индуцирует синтез новых полипептидов, которые, в свою очередь, позволяют выдерживать листьям растений морозы до -12°С [Chaudler, Robertson, 1994].

Эффект действия солевого стресса (NaCl) зависит от солеустойчивости самого растения. Если оно является галофитом (солеустойчивым), то в растительных клетках имеются генетически детерминированные механизмы защиты от интоксикации солями. Суть их заключается в защите постоянства внутренней среды клеток, так называемого ионного гомеостаза. Эти процессы определяются метаболизмом клеток, которые нейтрализуют неблагоприятное действие ионов Na+, и процессами ионного транспорта [Балнокин, Строганов, 1985; Niu et al., 1995]. Необходимость поддержания во внутренней среде клеток низкого уровня NaCl связана с тем, что многие ферменты неустойчивы к высокой концентрации солей [Greenway, Munns, 1980]. Пределы солеустойчивости, по-видимому, закреплены в геноме [Балнокин, Строганов, 1985]. У галофитов при увеличении концентрации соли в среде увеличивается активность Н-АТФаз, Са-АТФаз, РМ-АТФаз [Perez-Prat et al., 1992; Niu et al., 1993; Ayala et al., 1994], которые способны выводить ионы Na+ из клеток. У водоросли Dunaliella, являющейся галофитом, обнаружен индуцируемый солью белок с молекулярной массой 60 кДа [Fisker et al., 1994], отвечающий за связывание ионов Na+.

Когда растительные клетки не в состоянии поддержать свой ионный гомеостаз, происходит пассивное поступление ионов Na+ из среды в клетку и внутриклеточная концентрация Na+ увеличивается. То есть, солеустойчивые растения отличаются от несолеустойчивых только

более высоким барьером поступления ионов из среды в клетки. С увеличением концентрации соли в растительных клетках начинается перестройка систем метаболитических путей с целью адаптации к стрессу. Этот процесс приводит к накоплению в растительных клетках свободного пролина в результате ингибирования хлористым натрием пролиноксидазы [2Ью-Х1аг^, Уп^, 1992; КЬоёагу, 1992; БИисШакег е! а1., 1993], к количественным изменениям состава белков в мембранах клеток [Ооос11аск е1 а1., 1995; Нигктап, Тапака, 1996], а также к появлению новых белков с неизвестными функциями [Доскалюк и др., 1992] и новых матричных РНК [Капш£оро1, 1987; ,\^ппсоу е1 а1., 1989].

На примере гороха посевного показано, что при действии солевого стресса (ЫаС1) увеличивается синтез РНК в хлоропластах [Алина, 1990], содержание ядерной ДНК [Кабанов и др., 1973]. В зародышах ячменя наблюдается увеличение двухядерных клеток [Котовская и др., 1993]. Авторы утверждают, что увеличение числа ядер является одним из механизмов повышения функциональной активности клеток в условиях засоления.

При действии хлористого натрия у гороха посевного показано увеличение активности митохондриальной супероксиддисмутазы [МигШу а1., 1995]. Этот фермент катализирует реакцию окисления, где субстратами являются активные ионы-радикалы О2" и НО", которые способны вызывать повышенное окисление ненасыщенных жирных кислот в митохондриях, что может привести к нарушению функционирования этих органелл.

Наряду с реакциями высших растений на солевой стресс на молекулярном уровне в работе Ф. Каримова и соавт. [1993] было сделано заключение о различной устойчивости сортов хлопчатника к засолению на уровне регуляции систем целого растительного организма.

Таким образом, установлено, что при действии солевого стресса в растительных клетках происходят изменения синтеза РНК, белков и активности ряда ферментов. По-видимому, большая часть этих процессов связана с необходимостью защиты постоянства внутренней среды клеток растений.

Адаптация высших растений к гипоксии (недостаток кислорода) и аноксии (полное отсутствие кислорода) может быть осуществлена на молекулярном, клеточном уровнях, а также на уровне целого организма [Вартепетян, 1985]. В зависимости от степени и характера устойчивости к аноксии высшие растения подразделены на три основные категории. Во-первых, это "истинно" устойчивые к аноксии растения, способные существовать в условиях полного исключения кислорода из среды (прорастающие семена риса). Во-вторых, это растения со свойствами "кажущейся" устойчивости с избеганием анаэробиоза благодаря транспорту кислорода из аэрируемых органов (взрослые растения риса, гигро- и гидрофиты). Третью группу составляют растения с невыраженными признаками "истинной" или "кажущейся" устойчивости (большинство культурных растений) [Вартепетян, 1985]. Так, в проростках пшеницы происходит снижение растворимости "тяжелой" фракции хроматина и возрастает количество лабильно связанных с ДНК белков в течение 1-3 суток, а у риса в период от 3 до 7 суток [Войцековская и др., 1993]. Анаэробные условия способны менять экспрессию генов растений. Так, при действии аноксии в проростках кукурузы уже через 90 мин в клетках происходит синтез 20-ти анаэробно-специфических белков, основная масса которых участвует в гликолизе [Sachs, 1995]. Синтез анаэробных белков и их гликолизирование наблюдается и в проростках риса, которые, возможно, играют важную роль в адаптивных процессах, связанных с функционированием мембран [Reggiani et al., 1990]. При возникновении недостатка кислорода в

клетках кукурузы происходит усиление сплайсинга РНК, что приводит, в частности, к синтезу анаэробного варианта глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [Kohner et al., 1996].

При недостатке кислорода происходит также изменение активности ряда ферментов, меняется их количество [Edvera, 1992]. Причина такого ответа, вероятно, связана с необходимостью обеспечения клеток достаточным количеством АТФ. Такие изменения выявлены у алкогольдегидрогеназы, пируватдекарбоксилазы, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы [Edvera, 1992].

Таким образом, установлено, что недостаток кислорода вызывает в растительных клетках изменения синтеза РНК, �