Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетические взаимоотношения в роде Pisum L., реконструированные на основе генов гистона H1

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Филогенетические взаимоотношения в роде Pisum L., реконструированные на основе генов гистона H1"

На правах рукописи

ЗАЙЦЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В РОДЕ РШМЬ., РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ГИСТОНА Н1 '

Генетика- 03.02.07

005050469

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 * МАР 2013

Новосибирск- 2013

005050469

Работа выполнена в лаборатории генетики и эволюции бобовых растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Костерин Олег Знгельсович

Официальные оппоненты:

Гончаров Николай Петрович,

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН, заведующий сектором генетики пшениц Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Агафонов Александр Викторович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведупдай научный сотрудник лаборатории интродукции редких и исчезающих видов растений Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт обшей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «¿7\ /¿ЯПТ) 20 /3 г. на угреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, 10, т./ф. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Г'истон Ш является одним из основных компонентов хроматина эукариотической клетки. Он обеспечивает наднуклеосомную упаковку ДНК (Allan et al., 1980, 1986) и, в отличие от коровых гиетонов, проявляет значительную вариабельность, вплоть до внутривидового полиморфизма у некоторых организмов (Kosterin et al., 1994). В клетке гистон HI, как правило, представлен несколькими субтипами. Спектр пістона HI претерпевает существенные изменения в онтогенезе клетки (Cole, 1987), особенно в процессе ее дифференцировки. Так как гистон HI вовлечен в процессы компактизации хроматина и его вторичная структура близка структуре факторов транскрипции, этот белок часто рассматривается в контексте его влияния на регуляцию дифференциальной экспрессии генов (Ramakrishnan et al., 1993).

Ввиду своей высокой вариабельности, гистон HI может использоваїься как удобный объект для молекулярной филогении на микроэволюционном уровне. Поскольку в молекуле гистона HI гидрофильные домены эволюционируют с большей скоростью, чем гидрофобный (Ponte et al., 1998), первичная структура генов HI может применяться для оценки эволюционного расстояния в разных временных масштабах. Есть свидетельства важной роли изменчивости гистона НІ в процессах адаптивной эволюции. Установлено, что у насекомых существует корреляция между вариабельностью аминокислотной последовательности С-концевого домена гистона III в пределах отряда и числом современных видов в отряде, но не с эволюционным возрастом отряда, что свидетельствует об определенной адаптивной составляющей изменчивости гистона HI (Berdnikov et al., 1993a). В частности, установлено, что частота одного из аллелей субтипа 5 гистона HI гороха в региональных выборках коррелирует с суммарной температурой за вегетационный период (Berdnikov et al., 1993b).

Удобной моделью для изучения влияния структуры гистона НІ на фенотип и его роли в эволюционном процессе является горох (Piston L.), так как он имеет внутривидовой аллельный полиморфизм по всем субтипам гистона НІ, у него хорошо разработана частная генетика и он имеет короткое время генерации. На настоящий момент у гороха известно 7 неаллельных субтипов гистона HI, каждый из которых кодируется отдельным геном: ген Hisl, кодирующий гистон Н1-1, находится на 3-й хромосоме, ген His7 и тесно сцепленный кластер генов His(2-6) - на 6-й (Kosterin et al., 1994).

Горох является ценной сельскохозяйственной культурой, история возделывания которой насчитывает около 12 тысяч лет (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973). Кроме того, это один из классических объектов генетики. Вместе с тем, существует большое разнообразие диких форм гороха, произрастающих в Средиземноморье. Дикие популяции представляют особый интерес как материал для реконструкции происхождения культурных форм гороха, а также в качестве потенциальных доноров хозяйственно-ценных признаков для селекции.

В настоящее время таксономия рода Pisum достаточно запутана и несовершенна в связи с тем обстоятельством, что горох является преимущественно самоопылителем и его локальные популяции весьма отличны друг от друга Кроме того, этот род содержиг как дикие, так и культурные формы, причем некоторые формы были введены в культуру независимо (Vershinin et al., 2003). Культурные формы гороха отличаюгея большой

вариабельностью морфологических признаков, что также усложняет систематику этого рода.

Всеми современными исследователями признается выделение внутри рода Pisum L вида Pisum futvum Sibth. et Smith. Многие исследователи приписывают статус вида также локально культивируемому в Эфиопии и Йемене P. abyssinicum А. Вг., чего придерживаемся и мы. Что касается наиболее гетерогенного вида Pisum sativum L., то большинство авторов сходятся на том, что он объединяет все остальные формы гороха, дикие и культурные. Однако, в дальнейшем подразделении P. sativum на подвиды нет полного согласия.

Для изучения эволюционных отношений внутри рода Pisum L. мы построили филогенетические реконструкции по генам гистона HI HisS и His7, кодирующих соответственно субтипы HI-5 и HI-7. Нами также предпринята попытка филогеографического анализа диких популяций гороха на основании распределения комбинаций аллелей трех функционально не связанных молекулярных маркеров из трех клеточных геномов. Полученные данные позволили нам прояснить эволюционные взаимоотношения внутри рода Pisum L

Цели и задачи исследовании. Целью работы являлась реконструкция филогенетических взаимоотношений и фитогеографии в роде Pisum с использованием последовательности генов гисгона HI.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установление нуклеотидных последовательностей и изучение изменчивости генов HisS и His 7 у ряда представителей рода Pisum и реконструкция на этом основании филогении последних;

2. Сравнение между собой филогенетических реконструкций, выполненных на основе генов His5 и His7;

3. Изучение географического распределения и распространения в таксономических ipynnax гороха комбинаций вариантов пластидного и митохондриального CAPS-маркеров и элекгроморф белка SCA, сопоставление этих данных с филогенетическими реконструкциями;

4. Филогеографическая реконструкция истории возникновения и распространения диких и эндемичных культивируемых форм гороха;

5. Оценка информативности пластидного межгенного спенсера psbA-trnH как маркера для изучения эволюции рода Pisum L. и сравнение его с генами гисгона HI в <л-ношении информативности.

Научная новизна. Впервые гены линкерного гистона HI введены в филогенетический анализ на межвидовом и межпопуляционном уровнях и применены к сложному роду, включающему диких и культурных представителей. Этот филогенетический анализ дополнен детальным рассмотрением географического происхождения исследуемых дикорастущих форм, т.е. впервые для дикорастущего гороха был применен последовательный филогеографический подход.

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы углубляют представления о филогенетических отношениях диких сородичей важной

сельскохозяйственной культуры, что может способствовать их более эффективному использованию в селекции.

Показана перспективность генов гисгона HI для филогенетического анализа на внутривидовом уровне.

Личный вклад автора. Автор самостоятельно провел электрофоретический анализ га слона Ш и SCA, CAPS-маркеров у 12 образцов гороха, определение нуклеотидной последовательности гена His5 у 59 образцов гороха, гена His7 у 22 образцов гороха, пластидного межгенного спейсера psbA-trnH у 56 образцов гороха, а также обработку экспериментальных данных. Определение нуклеотидной последовательности гена tlts5 у 9 образцов гороха, анализ CAPS-маркеров и белка SCA у остальных 97 образцов выношен В. С. Богдановой и О. Э. Костериным.

Основные положении, иыноснмыс на защиту.

В Западном Средиземноморье внутри P. sativum subsp. elatius возникла особая эволюционная ветвь, эволюционные потомки которой затем мигрировали в Тавро-Кавказский регион и Малую Азию, где дали начало культурной ветви P. sativum subsp. sativum.

Ген His 5 субтипа Н1-5, в отличие от гена His7, может быть использован в качестве филогенетического маркера для реконструкции эволюционных взаимоотношений в роде Pisum L.

Последовательности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH специфичны для двух независимо введенных в культуру форм гороха - P. sativum subsp. sativum и P. abyssinicum.

Апробация. Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН в 2011 г., 2" Московской Международной конференции "Молекулярная филогенетика" (2010), Международной конференции но генетике растений «Геномика и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), 14й Конференции по молекулярной эволюции в Марселе (2010), IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клегки" (Звенигород, 2010), 16й Конференции но молекулярной эволюции в Марселе (2012).

Публикации. Материал диссертации представлен в 3 публикациях в зарубежных журналах, реферируемых в 1SI Web of Science, и в 6 тезисах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 95 источников (в том числе на иностранном языке 91). Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 26 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе использовались образцы гороха, полученные из коллекций Всероссийского института растениеводства (Санкт-Петербург), коллекции

Вейсбуллхольм (Ландскрона), центра Джона Иннеса (Норвич), а также собранные в природе О.Э. Костериным, Michelle Papazyan и Josep Vigo.

Выделение гистона HI. Гистон Hl выделяли из гомогенизированных тканей растения модифицированным методом Джонса (Johns, 1964). SCA выделяли экспресс-методом из семян (Smimova et al., 1992). Электрофорез проводили по методу Панима и Чокли (Panyim, Chalkley, 1969) с изменениями (Бердников, Горель, 1975)в 15%ПАЛГ.

Выщеление ДНК. ДНК выделяли из тканей растений литий-хлоридным методом (Bogdanova et al., 2010). Электрофорез проводили в 0,7-0,8% геле.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей образцов проводили в Межинсгитугском Центре Секвенирования. Компьютерный анализ полученных секвенограмм вьшолняли с помощью пакета программ Staden (Staden et ai, 1998).

Компьютерный анализ данных. Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществлялось с помощью пакета программ MEGA 5.1 (Tamura et al., 2011) и online-сервиса MultAIin (Corpet, 1988). Расчет эволюционных дистанций и построение филогенетических деревьев производились при помощи пакета npoipaMM MEGA 5.1 и MrBayes (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Филогенетические деревья были построены по кодирующим последовательностям (без интрона) генов His5 и His7 методами ближайших соседей, максимальной парсимонии, максимального правдоподобия и байесовским. При построении филогенетических деревьев в качестве внешней группы были использованы белок-кодирующие нуклеотидные последовательности генов Vavilovia formosa (единственный представитель монотипического рода, сестринского роду Pisum), ортологичных соответственно генам H is 5 и His7 гороха. Нуклеотидное разнообразие оценивали при помощи пакета программ DnaSPv5 (Librado, Rozas, 2009). Генеалогия аллелей гена His5 построена при помощи программы TCS (Clement et al., 2000). Детекцию рекомбинации в объединенных последовательностях His5 и His7 проводили при помощи пакета программ RDP5 (Martin et al., 2010) методами RDP, GENCONV, Chimaera, MaxChi, BootScan, SiScan и 3Seq.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ распределения комбинаций трех диморфных маркеров у диких и культурных форм гороха. Амплифицированная часть хлоропластпого гена rbcL составляет 1129 п.н. в длину. В ней либо содержится, либо отсутствует сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции yí-spLEI, которая разрезает ампликон на два фрагмента, приблизительно 800 п.н. и 300 п.н. длиной. Потеря сайта рестрикции связана с синонимичной нуклеотидной заменой С->Т в позиции 325 от начала праймера, использованного для амплификации (Kosterin, Bogdanova, 2008). Далее в тексте, вариант с наличием сайта рестрикции обозначен rbcL+, без - rbcL-,

ПЦР-продукт, амплифицированный с митохондриального гена coxl составляет примерно 1200 п.н. и либо содержит, либо лишен сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Psil, которая расщепляет ампликон на два фрагмента, размером приблизительно 260 и 940 п.н. Потеря сайта рестрикции связана с несинонимичной заменой С->А, которая приводит к замене остатка лизина на остаток глутамина (Kosterin et al., 2010).

Альбумин семядолей SCA представлен у гороха двумя электрофоретическими вариантами: SCAfn SCAS, содержащими 10 и 9 остатков лизина соответственно. Поскольку в примененных условиях электрофоретического разделения заряд белка определяется числом аминокислотных остатков аргинина, лизина и гистидина, разница в числе остатков лизина сказывается на электрофоретической подвижности варианта.

Мы обнаружили, что 32 из проанализированных образцов обладают комбинацией маркеров сох+, rbcL+, SCAf (условно названной комбинация А), 50 образцов имеют комбинацию сох-, rbcL-, SCAs (комбинация В), 13 образцов сох-, rbcL+, SCAf (комбинация С) и 9 - сох-, rbcL-, SCAf (комбинация D). Оставшиеся 6 образцов представляли собой остальные, редкие комбинации. Поскольку к носителям комбинации А относятся все исследованные представители P. fulvum и P. abyssinicum, а также многие дикие представители P. sativum subsp. elatius (13 из 46 исследованных образцов), можно сделать вывод, что комбинация маркеров А является плезиоморфным признаком, характерным для общего предка P. fulvum и P. sativum, хотя нельзя исключить, что предки P. fulvum и Р. sativum subsp. abyssinicum могли унаследовать лишь часть признаков из общего пула изменчивости, существовавшего до дивергенции этих линий. Комбинация С встречается только у диких P. sativum subsp. elatius (у 12 из 46 исследованных образцов). Комбинация D обнаруживается как у диких P. sativum subsp. elatius (3 образца), так и у культурных форм: Р. sativum subsp. sativum (2 образца из 39 исследованных) и P. sativum subsp. jomardii (все 4 исследованных образца) из Египта. Подавляющее большинство исследованных культурных P. sativum subsp. sativum имеет комбинацию В (37 образцов), многие дикие P. sativum subsp. elatius также несут эту комбинацию (12 образцов). Три образца (Ps008, Турция, L90, происхождение неизвестно, WL2123, Израиль) имеют редкое сочетание coxI+, rbcL-, SCAs, образец (VIR320*, Палестина) - сочетание coxI+, rbcL-, SCAf, образец WL805 - coxl-, rbcL+, SCAS, образец 82-20 coxI+, rbcL+, SCAs. По всей видимости, общий предок культурных Р. sativum subsp. sativum являлся носителем комбинации В. P. sativum subsp. jomardii мог бы представлять собой независимо одомашненную филетическую линию, либо являться результатом рекомбинации между представителем линии В и носителем SCAf.

На основании выявленного географического распространения комбинаций трех проанализированных маркеров (Рис. 1) мы предполагаем, что вид P. sativum вероятнее всего возник в Восточном Средиземноморье, где в настоящее время и встречаются два других вида рода Pisum: P. fulvum (Ближний Восток) и P. abyssinicum (Йемен и Эфиопия). Произрастающие в настоящее время в Южном Израиле достаточно разнообразные представители P. sativum до сих пор имеют предковую комбинацию А. По всей видимости, далее происходила экспансия комбинации А на запад, вероятно связанная с уменьшением уровня моря во время одного из плейстоценовых похолоданий. Реликтами этой экспансии могут являться реликтовые популяции островов Менорка, представители которых также несут комбинацию А. Вероятно, именно во время этой экспансии произошла потеря сайта рестрикции Psil в гене coxl, что привело к возникновению комбинации С, которая затем распространилась в центральном и западном Средиземноморье. Потеря сайта рестрикции AspYEl в гене rbcL дает начало комбинации D, носителей которой мы обнаружили в Египте, Турции, на Сицилии и, возможно, в Испании. Географической закономерности в распространении таких образцов не прослеживается, однако можно предположить, что

Рис. 1. Географическое распределение комбинаций А, В, С и D у диких представителей рода Pisum и культурных P. abyssinicum и P. sativum subsp. jomardii. Крупными кругами показаны представители диких P. sativum и P. sativum subsp. jomardii. P. fulvum и P. abyssinicum показаны кругами меньшего диаметра.

именно один из носителей комбинации D мог стать предком образцов, несущих комбинацию В, в результате аминокислотной замены в белке SCA, вызвавшей изменение его электрофоретической подвижности. Эта мутация, вероятно, произошла на территории Тавро-Кавказского региона, поскольку в Крыму, Грузии и Азербайджане встречены исключительно носители этой комбинации. В Малой Азии носители комбинации В встречаются совместно с носителями предковой комбинации А. Контрастные комбинации маркеров могут встречаться на одной территории благодаря тому, что горох размножается преимущественно самоопылением, вследствие чего интрогрессия между различными формами ограничена. Данные события имели место относительно недавно, скорее всего в позднем плейстоцене. За это короткое время весьма немногие мутации могли зафиксироваться в кодирующих генах, однако нам удалось обнаружить три легко регистрируемые мутации в трех разных генах, к тому же из разных клеточных геномов, которые отмечают некоторые важные точки в филогеографической истории рода Pisum. В то же время нельзя не отметить, что эти мутации представляют собой простую тест-систему для определения принадлежности той или иной формы гороха к одной из основных филетических линий рода.

Электрофоретический анализ гистона HI. По результатам электрофоретического анализа гистона HI у образцов гороха из коллекций Бен Зе'ев и Зохари и центра ДжонаИннеса были выявлены варианты субтипа HI-5, подвижность которых было трудно

—Vavilovia formosa

Pisum sativum subsp. elatius Pisum sativum subsp. sativum Pisum sativum subsp.jomardii Pisum sativum subsp. transcaucasicum Pisum abyssinicum Pisum fulvum

Рис. 2. Филогенетическое дерево N.1, построенное по нуклеотидным последовательностям гена Обозначена принадлежность образца к условным комбинациям трех упомянутых ранее маркеров: пластидного гЬсЬ, митохондриального сохI и ядерного БСА , все «редкие сочетания» обозначены буквой Я. Указаны значения Ьоо(з1гар-индексов в процентах.

классифицировать по сложившейся ранее номенклатуре (Berdnikov et al., 1993b; Kosterin et al., 1994). Оказалось, что эта номенклатура неплохо работает для культурного гороха, имеющего ограниченное разнообразие аллельных вариантов различных субтипов. Однако у диких образцов наблюдается большая изменчивость по элеюрофоретической подвижности отдельных субтипов, которая с трудом может быть разделена на дискретные варианты.

Определение нуклеотидной последовательности гена HisS. Нуклеотидные последовательности гена His5 были определены у 91 образца гороха, включающих представителей P. fulvum, P. abyssinicum, P. sativum subsp. elatius, P. sativum subsp.jomardii, P. sativum subsp. transcaucasicum и P. sativum subsp. sativum. Общая длина выравнивания составляет 789 п.н. Всего обнаружено 87 вариабельных позиций в нуклеотидных последовательностях и 45 в реконструированных аминокислотных. 10 из обнаруженных аминокислотных замен находятся в N-концевом домене, 6 в глобулярном и 29 в С-концевом. Среднее расстояние между последовательностями (по Джуксу-Кантору) составляет 0,015 (стандартная ошибка 0,002), расстояния лежат в диапазоне от 0,00 до 0,33.

Делеции и инсерции были обнаружены только в участке гена, кодирующем С-концевой домен. Идентичная инсерция 21 нуклеотцда найдена в последовательности IIis5 образцов 703 и L95 (оба P. fulvum). Делеция 18 п.н. обнаружена у образцов VIR3397, VIR6071, WL2140 и 702 (все P. fulvum). Делеция 15 п.н. в другом участке С-концевого домена найдена у образца VIR6560 (P. sativum subsp. sativum) из Таджикистана. Все обнаруженные инсерции и делеции потенциально способны влиять на силу взаимодействия этого домена с линкерной ДНК, поскольку все они изменяют количество заряженных положительно аминокислотных остатков в данном домене молекулы гистона.

Любопытно, что нуклеотидные последовательности, кодирующие медленный условный вариант 1 у образцов Ра014 (P. sativum subsp. sativum, культивируемый, Турция), Р016, VIR320*, VIR2514, VIR2524, VIR4014, а также полученные В. С. Богдановой (см. Bogdanova et al, 2005) частичные последовательности образцов VIR3971 (Россия, Кировская область), VIR3913 (Таджикистан, Памир) и VIR6135 (Греция), происходящих из разных регионов Евразии, идентичны, что свидетельствует об их недавнем общем происхождении. Частота данного условного варианта 1 субтипа HI-5 показала сильную отрицательную корреляцию с суммой температур вегетационного периода в широкомасштабном исследовании спектра гистона HI местных культурных образцов гороха Старого Света (Berdnikov et al., 1993). Наибольшей частоты этот вариант достигает в северных регионах и в горных регионах Центральной Азии. Идентичность нуклеотидных последовательностей соответствующего аллеля при изменчивости последовательностей аллелей, кодирующих более электрофоретически подвижные аллельные варианты, согласуется с предположением, что этот аллель распространился по ареалу примитивной культуры гороха не без участия естественного отбора в районах с холодным климатом.

Филогенетические деревья, построенные но последовательностям гена His5. На филогенетических реконструкциях, выполненных на основе первичной нуклеотидной последовательности гена His5 при помощи метода ближайших соседей (Рис. 2) присутствует две большие ветви. Первая объединяет представителей вида P. fulvum, диких P. sativum subsp. elatius из Израиля и центрального Средиземноморья в основном несущих комбинации

маркеров А и С, вторая - некоторых диких Р. sativum subsp. elatius, в основном происходящих из Тавро-Кавказкого региона, а также всех проанализированных культурных представителей P. sativum. Этот кластер образцов преимущественно несет эволюционно более молодые комбинации комбинации В и D, далее в тексте она будет упоминаться как «D-B ветвь».

Внутри первой из двух упомянутых основных ветвей P. fulvum, считающийся наиболее древней ветвью в роде Pisum, устойчиво образует отдельную ветвь на всех филогенетических реконструкциях, сделанных на основе гена His5. Группа, образованная дикими представителями P. sativum subsp. elatius с комбинациями А и С не очень хорошо структурирована В ней можно отметить несколько небольших ветвей, образованных носителями комбинаций А и С, в том числе и кластер, образованный представителями Р. abyssinicum. Образцы P. abyssinicum находятся внутри кластера с меньшей bootstrap-поддержкой (от 26% на дереве, построенном методом ближайших соседей до 38% на дереве, построенном методом максимальной парсимонии), в состав которого также входит большинство P. sativum subsp. elatius, несущих комбинацию С, происходящих из Центрального и Западного Средиземноморья.

Внутри D-B ветви первая дихотомия отделяет образцы Ps002, Р012 и JI1794 (75%) - все дикорастущие P. sativum subsp. elatius с комбинацией В, у последних двух последовательности His5 идентичны. Бен Зе'ев и Зохари (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973) относили JI1794 к так называемым 'северным humile\ имеющим кариотип как у культурного гороха. Объединяются ли эти две последовательности в отдельный кластер достоверно, зависит от метода построения дерева На реконструкциях методом максимального правдоподобия и байесовской он отсутствует, хотя от остального массива ветви эти три образца отделены совершенно однозначно.

Отличия в топологиях деревьев, построенных разными методами, незначительны. Ветвь дикорастущих P. sativum subsp. elatius, маркированных комбинациями А и С присутствует на деревьях, построенных методами ближайших соседей (см. Рис 2), максимальной парсимонии и байесовским, на реконструкции методом максимального правдоподобия ее нет. Дерево, построенное методом максимальной парсимонии, отличается от всех остальных деревьев положением внешней группы. На этой реконструкции она располагается ближе к ветви, содержащей образцы с комбинациями В и D. Реконструкцию методом максимального правдоподобия отличает автономное расположение кластера Р. abyssinicum, который, тем не менее, находится ближе к образцам из центрального Средиземноморья с комбинацией С, чем к образцам из Израиля с комбинацией А.

Данные филогенетических реконструкций вместе с результатами анализа трех маркеров из разных клеточных геномов (Kosterin, Bogdanova, 2008; Kosterin et al„ 2010) указывают на важное эволюционное событие, произошедшее внутри вида Р. sativum в его диком состоянии, а именно, на выделение большой группы, содержащей как часть диких, так и все культурные формы, имеющие комбинации маркеров D и В (далее в тексте «ветвь D-B »), в то время как остальных диких представителей Р. sativum можно назвать «базальной группой А-С».

Географическое распространение образцов, относящихся к основным ветвям, наблюдающимся на филогенетических реконструкциях, показано на Рис. 3. Ветвь Р. fulvum.

Рис. 3. Географическое распространение образцов диких и некоторых местных культивируемых форм гороха. Крупными кругами показаны представители диких P. sativum и P. sativum subsp .jomardii. P.fulvum и P. abyssinicum показаны кругами меньшего диаметра.

обнаруживается на территории Палестины (в широком смысле), представители ветви А-С распространены по всему Средиземноморью, в то время как образцы, относящиеся к эволюционно более молодой ветви B-D сконцентрированы в основном в Тавро-Казказском регионе. На севере Израиля сосуществуют представители всех трех основных ветвей

Культивируемый Р. sativum subsp. sativum несомненно возник в результате доместикации формы гороха, принадлежащей к ветви D-B. Однако, представители этого таксона не формируют отдельной ветви, а группируются вместе с дикими формами. Это может объясняться либо недостаточным филогенетическим сигналом от гена His5, либо вторичным обменом генами между дикими и культурными формами, принадлежащими к ветви D-B. В пользу последнего объяснения говорит то, что в ветви D-B на филогенетических реконструкциях присутствуют два представителя комбинации А и один -комбинации С, а также один представитель комбинации D внутри базальной группы А-С.

Определение нуклеотидной последовательности гена His7. Нуклеотидные последовательности гена His7 были определены у 56 образцов гороха. Общая длина выравнивания составляет 561 п.н. Длины участков гена, соответствующих N-концевому, глобулярному и С-концевому доменам равны соответственно 57, 204 и 297 п.н. (не учитывая стоп-кодон). Среднее расстояние между нуклеотидными последовательностями, расчитанное по методу Джукса-Кантору, составляет 0,013 (стандартная ошибка 0,003), расстояния лежат в диапазоне от 0,00 до 0,25.

Всего в нуклеотидных последовательностях обнаружено 44 вариабельных позиции (0,078 замен на сайт, для сравнения в том же наборе образцов по гену His5 выявлено 0,110 замен на нуклеотид), в реконструированных аминокислотных - 14 вариабельных позиций.

Из обнаруженных аминокислотных замен 12 находятся в С-концевом домене, 2 в глобулярном. Ни одна из нуклеотидных замен, приходящихся на С-концевой домен, не приводит к изменению заряда молекулы белкового продукта. В то же время, замена остатка гистидина на остаток тирозина в глобулярном домене образцов VIR4362 и WL1238 приводит к изменению заряда этого домена

Длина большинства последовательностей составляет 186 а.к. остатков. Делеции были обнаружены только в участке гена, кодирующем С-концевой домен. Делеция 9 п.н. обнаружена у образца JI1092 (P. sativum subsp. elatius). Делеция 24 п.н. в другом участке С-концевого домена найдена у образца WL1238 (P. sativum subsp. sativum).

Филогенетические деревья, построенные по последовательностям гена His7. Филогенетические деревья по нуклеотидным последовательностям гена His7 были построены на несколько меньшем наборе образцов гороха методами максимальной парсимонии и байесовским.

На дереве, построенном методом максимальной парсимонии с поддержкой выше 60% разрешаются только несколько небольших ветвей. Pisum fulvum образует отдельную ветвь, но со слабой поддержкой (29%) и два представителя этого вида (VIR6071 и 702) обнаруживаются вне этой ветви.

Байесовская реконструкция (Рис. 4) оказалась чуть более информативной. С апостериорной вероятностью 1 разрешились следующие ветви: 1) образцы P. fulvum, кроме VIR6071 и 702; 2) все P. abyssinicum: Л1876, VIR2759, VIR3567 и WL1446; 3) WL1238 и VIR4362, оба несущие одну и ту же замену, приводящую к изменению заряда глобулярного домена; образцы с идентичными нуклеотидными последовательностями; 4) СЕ1 и СЕ2, оба P. satvum subsp. elatius из Крыма; 5) PI344537, VIR7327; 6) JI1794, Ps008, VIR1851; 7)VIR320*, VTO249, VIR3424, VIR3439; 8) JI1094, JI1095, JI1096, JI3553. Кроме того, на байесовском дереве с апостериорной вероятностью 0,8 присутствует кластер образцов P. sativum subsp. elatius с комбинацией А из Израиля:711, 713, 714 и VIR320.

Рекомбинация между генами His5 и His7. По сравнению с реконструкциями, построенными по последовательностям гена His5, реконструкции, основанные на гене His7 дают гораздо меньшее разрешение. Мы попытались обнаружить следы рекомбинации в 56 объединенных последовательностях генов His5 и His7 при помощи пакета программ RDP4 методами RDP, GENCONV, Chimaera, MaxChi, BootScan, SiScan и 3Seq. Однако из семи методов детекции рекомбинации лишь три зафиксировали две рекомбинантные последовательности у двух образцов P. fulvum: 702 и VIR6071. Точки начала разрыва в последовательностях расположены между генами His5 и His7. Этого недостаточно для того, чтобы объяснить несовпадение топологий филогенетических деревьев.

Сравнение изменчивости генов His5 и His7. С помощью программы DnaSPv5 мы выполнили сравнение нуклеотидного разнообразия последовательностей генов His5 и His 7 на наборе, состоящем из 56 образцов, у которых было просеквенировано оба гена. Число различий между последовательностями в пересчете на число нуклеотидных позиций у генов His5 и His7 оказалось примерно одинаковым. Единственное значительное различие между этими генами наблюдается в значении доли несинонимичных замен на несинонимичную

I Pisum sativum subsp elatius I Pisum sativum subsp sativum Pisum sativum subsp. jomardii I Pisum sativum subsp. transcaucasicum Pisum abyssinicum Pisum fulvum

Vavilovia formosa PI344537 Сицилия PI344008 J12724 JI1095 JI1096 JI1094 J13553 VIR4014 721 P015 VIR2998 WL2123

Рис. 4. Байесовская реконструкция филогении, построенная по нуклеотидным последовательностям гена His7. Обозначена принадлежность образца к условным комбинациям трех упомянутых ранее маркеров: пластидного rbcL, митохондриального coxl и ядерного SCA , все «редкие сочетания» обозначены буквой R. Указаны значения апостериорной вероятности для ветвей, в скобках приведено стандартное отклонение этого значения.

позицию Ка, составившем 0,0106 для геиа Ihs5n в два раза меньше — 0,0051 - для гена His7. Значение ft=K(a)/K(s) для генов His5 и His7 составили соответственно 0,3553 и 0,1449, то есть в 2,5 раза больше для гена His5. Это различие также находит отражение в более высокой вариабельности аминокислотных последовательностей субтипа Н1-5. В одном и том же наборе 56 образцов мы обнаружили 27 вариантов аминокислотных последовательностей Н1-5 и всего 17 вариантов Н1-7. Кроме того, ни одна из 12 аминокислотных замен в субтипе HI-7 не приводит к изменению заряда С-концевого домена, хотя в случае субтипа Н1-5 таких замен наблюдается 7.

Отличительная особенность субгипа HI-7 заключается в том, что он активно экспрессируется только в растущих тканях и с возрастом его содержат« быстро уменьшается (Kosterin et al., 1994). Возможно, что первичная структура С-концевого домена этого субтипа определяет специфический характер взаимодействия HI-7 с ДНК и нуклеосомой, необходимый для регуляции экспрессии генов в активно делящихся клетках. Таким образом, на изменчивость гена His7, скорее всего, накладывается больше функциональных ограничений, чем на ген His5, который кодирует' один из группы субтипов со схожими свойствами, представленность которых в хроматине невелика (Kosterin et al., 1994). Изменчивость в последовательностях His7 может накапливался лишь в «разрешенных» позициях, что ухудшает филогенетический сигнал в небольшом эволюционном масштабе на межвидовом и межпопуляционном уровнях.

Анализ последовательностей пластид лого межгенного спенсера psbA-trnH у различных образцов гороха. С целью оценить, насколько информативен для изучения эволюционных взаимоотношений в роде Pimm L. может оказаться маркер, широко используемый в филогенетических исследованиях растений, мы пронализировали вариабельность последовательности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH. Нуклеотидные последовательности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH были определены у 19 образцов гороха, в т. ч. у представителей P. fulvum, P. abyssinicum-, Р. sativum subsp. claims (комбинации А, В, С н D, а также одна из редких комбинаций), Р. sativum subsp. sativum, P. sativum subsp. jomardii: VIR3439 (комбинация D); P. sativum sbsp. transcaucasicum: VIR3249 (комбинация В).

У исследованных образцов гороха спейсер psbA-trnH насчитывает лишь 2 полиморфные позиции при общей длине выравнивания 201 пл. Одна из обнаруженных в последовательностях psbA-tmH замен специфична для P. abyssinicum. Также интересно, что в последовательности psbA-trnH присутствует деления 8 нуклеогвдов, характерная для исследовшшых культурных форм гороха, независимо от того, являются ли они носителями комбинации В или D, в то время как у всех диких представителей рода данная деления отсутствует. В связи с этим независимое одомашнивание Р. sativum subsp. jomardii и P. sativum subsp. sativum маловероятно. ГГокольку носители комбинации В численно преобладают над формами, несущими комбинацию D, логично предположить, что предковой для обоих подвидов была комбинация В. Комбинацию маркеров D предок Р. sativum subsp. jomardii мог приобрести в результате переопыления с дикими носителями комбинаций А или С.

Спейсер psbA-trnH позволяет огличать P. sativum subsp. abyssinicum и культурные формы гороха, относящиеся к P. sativum subsp. sativum и P. sativum subsp. jomardi от

остальных представителей рода. В то же врет различить хорошо изолированные друг от друга виды P. fulvum и P. sativum при помощи этого маркера невозможно. Следовательно, пригодность psbA-trnH для молекулярного баркодинга представителей рода Visum ограничена.

ВЫВОДЫ

Проведенный впервые филогеографический анализ аллелей ядерного (SCA), пластидного (rbcL) и мигохондриального (сох/) генов у дикорастущих представителей рода Pisum L. свидетельствует о происхождении этого рода в Восточном Средиземноморье, проникновении особой эволюционной линии дикорастущих Pisum sativum (линия С) в Западное Средиземноморье и обратной миграции их потомков на восток, с образованием в Тавро-Кавказском регионе и Малой Азии производной линии В. Потомки линии В и были доместицированы, дав начало культурному подвиду P. sativum subsp. sativum.

Ген HisS одного из субтипов гисгона HI гороха достаточно изменчив и информативен для реконструкции филогении рода Pisum L. на меж- и внутривидовом уровне; тогда как изменчивость гена His7, кодирующего единственный субтип гисгона HI, специфичный для молодых тканей, сопоставима с изменчивостью His5, но в основном ограничена синонимичными заменами и не позволяет реконструировать филогению.

На филогенетических реконструкциях представителей рода Pisum на основе гена HisS субтипа 5 гистона HI выделяются три основных ветви: первая образована видом P. fulvum, вторая - P. abyssinicum и частью диких форм P. sativum, третья - остальными дикими формами и культурными представителями P. sativum, преимущественно постелями комбинации В.

Установлено, что электрофоретический вариант субтипа HI-5, частота которого в региональных выборках местных культивируемых форм гороха коррелирует с суммой температур вегетационного периода, кодируется идентичным аллелем HisS, что говорит о его недавнем широком распространении и репродуктивном успехе в регионах с холодным климатом - на севере России и в высокогорьях Центральной Азии.

Обнаружены аллели пластидного межгенного спейсера psbA-trnH, специфичные для культурных форм гороха: P. sativum subsp. sativum (делеция) и P. abyssinicum (нуклеошдная замена).

Список публикаций по теме диссертации

Kosterin, О. Е., Zaytseva, О. О., Bogdanova, V. S., Ambrose М. New data on three molecular markers from different cellular genomes in Mediterranean accessions reveal new insights into phylogeography of Pisum sativum L. subsp. elatuis (Beib.) Schmahl. // Genet. Resour. Crop Evol. 2010. V. 57. P. 733-739.

Zaytseva, O.O., Bogdanova, V.S, Kosterin, O.E. Phylogenetic reconstruction at the species and intraspecies levels in the genus Pisum (L.) (peas) using a histone HI gene. // Gene. 2012. V. 504. P. 192-202.

Kosterin, O.E., Bogdanova, V.S., Kechin, A.A., Zaytseva, O.O., Yadrikhinskiy, A.K. Polymorphism in a histone HI subtype with a short N-terminal domain in three legume species (Fabaceae,Fabaeae).//Mol Biol Rep. 2012. V. 39. P. 10681-95.

Зайцева, О.О., Костерин, О.Э., Богданова, B.C. Анализ филогенетических отношений культурных и диких представителей рода горох (Pisum L.) на основании нухлеотидных последовательностей генов гистона III. // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, 7-14 сентября 2009 г., Владивосток. Сборник тезисов с. 25.

Zaytseva, О.О., Kosterin, О.Е., Bogdanova, V.S. Phylogenetic relaionships of wild and clutivated peas as inferred from His5 gene sequences // 2nd Moscow International Conference "Molecular Phylogenetics" (MolPhy-2) May 18-21, 2010. Abstracts. P. 76.

Kosterin, O.E., Bogdanova, V.S, Zaytseva, O.O. Phylogeography of wild representatives of Pisum sativum L. // The International Conference Plant Genetics, Genomics and Biotechnology, June 7-10, 2010. Abstract book. P. 32.

Zaytseva, O.O., Kosterin, O.E., Bogdanova, V.S. Phylogenetic relationships of wild and cultivated peas as inferred from His5 gene sequences. //14th Evolutionary Biology Meeting and Marseilles, September 21 st - 24th, 2010. Abstract. P. 5.

Зайцева, O.O., Костерин, О.Э., Богданова, B.C. Анализ филогенетических взаимоотношений в роде Pisum I,. с использованием гена гистона HI // Тезисы IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки". 2010. Москва-Звенигород. С. 88-89

Zaytseva О.О., Kosterin, О.Е., Bogdanova, V.S. Histone HI subtype 5 and 7 genes differ in phylogenetic resolution in peas (Pisum L.). 16th Evolutionary Biology Meeting at Marseilles, September 18th-21th, 2012. P. 120.

Подписано к печати 12.02.2013 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 6

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцева, Ольга Олеговна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

на правах рукописи

ЗАЙЦЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

V

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В РОДЕ РШМЬ., РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ГИСТОНА Н1

03.02.07 - Генетика

О* Диссертация на соискание

00

^ ученой степени кандидата

^Г" со биологических наук

Ю тг

со 8

т— ^

О Я

СМ со

у см

^ Научный руководитель:

к. б. н. Костерин Олег Энгельсович

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.............................................5

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

Актуальность проблемы......................................................................................6

Цели и задачи.......................................................................................................8

Научная новизна..................................................................................................9

Научно-практическая ценность..........................................................................9

Личный вклад автора.........................................................................................10

Апробация..........................................................................................................10

Публикации........................................................................................................10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................11

Общие сведения о гистонах..............................................................................11

Структура молекулы линкерных гистонов Н1 иН5.......................................12

Глобулярный домен...........................................................................................13

Концевые домены...........................................................................................15

Функции гистона Н1 в клетке...........................................................................17

Неаллельная гетерогенность гистона Н1........................................................22

Субтипы гистона Н1 у млекопитающих......................................................24

Субтипы гистона Н1 у птиц..........................................................................26

Субтипы гистона Н1 у насекомых................................................................27

Горох в исследованиях изменчивости Н1.......................................................28

Структура рода Пзит Ь....................................................................................29

Основные проблемы систематики рода Ргзит Ь.........................................29

Попытки реконструкции филогенетических отношений в роде горох .... 32

Использование генов гистонов в качестве молекулярных маркеров............42

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................45

Объект исследования.........................................................................................45

Выделение гистона Н1......................................................................................50

Выделение ЭСА экспресс-методом..................................................................50

Электрофорез гистона HI и SCA.....................................................................50

Выделение ДНК из свежих тканей..................................................................51

Выделение ДНК СТАВ-хлороформным методом..........................................52

Электрофорез ДНК в агарозном геле..............................................................52

Праймеры............................................................................................................53

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)..............................................................56

Определение нуклеотидной последовательности ДНК.................................57

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции............................................58

Компьютерный анализ данных.........................................................................59

РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................................60

Анализ распределения комбинаций трех диморфных маркеров у диких и

культурных форм гороха...................................................................................60

Электрофоретический анализ субтипа 5 гистона HI.....................................63

Определение нуклеотидной последовательности гена His5.........................66

Определение нуклеотидной последовательности гена His 7.........................73

Филогенетические реконструкции на основании нуклеотидных

последовательностей.........................................................................................79

Филогенетические деревья, построенные по последовательностям гена

His5..................................................................................................................79

Дерево Neighbor-Joining.......................................................................79

Дерево Maximum Parsimony.................................................................83

Дерево Maximum Likelihood................................................................84

Байесовская реконструкция филогении.............................................86

Филогенетические деревья, построенные по последовательностям гена

His7..................................................................................................................88

Генеалогии аллелей генов His5 и His7.............................................................94

Рекомбинация между генами His5 и His7.......................................................96

Анализ последовательностей пластидного межгенного спейсера psbA-trnH у различных образцов гороха...........................................................................97

ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................99

Анализ распределения комбинаций трех диморфных маркеров у диких и

культурных форм гороха...................................................................................99

Электрофоретический анализ субтипов гистона HI у гороха в свете данных

секвенирования генов His 5 и His7.................................................................104

Анализ филогенетических реконструкций, основанных на нуклеотидной

последовательности гена His5........................................................................108

Анализ филогенетических реконструкций, основанных на нуклеотидной

последовательности гена His 7........................................................................117

Анализ последовательностей пластидного межгенного спейсера psbA-trnH

............................................................................................................................120

ВЫВОДЫ.............................................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................125

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотный остаток М - моль/л

п. н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

сМ - сантиморган

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

AFLP - amplification fragment length polymorphism, полиморфизм длины

амплифицированного фрагмента BSA - bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин CAPS - cleaved amplified polymorphic sequence, полиморфизм расщепления

продуктов рестрикции СТАВ - cetyltrimethylammonium bromide, бромид цетилтриметиламмония DTT - dithiothreitol, дитиотреитол

GH5 - globular domain of Н5, глобулярный домен гистона Н5 GH1- globular domain of HI, глобулярный домен гистона HI НТН - helix-turn-helix - спираль-поворот-спираль

RAPD - random amplified polymorphic DNA, полиморфизм неспецифично

амплифицированной ДНК RBIP - retrotransposon based incertion polymorphism, полиморфизм инсерций

ретротранспозонов RFLP - restriction fragment length polymorphism, полиморфизм длины

фрагмента рестрикции SCA - seed cotyledon albumin, белок семядоль

SSAP - sequence-specific amplification polymorphism, полиморфизм длины

специфичного продукта амплификации SSR - simple sequence repeat, простая повторенная последовательность

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Гистон HI является одним из основных компонентов хроматина эукариотической клетки. Он обеспечивает наднуклеосомную упаковку ДНК (Allan et al., 1980; Allan et al., 1986) и, в отличие от коровых гистонов, проявляет значительную вариабельность, вплоть до внутривидового полиморфизма у некоторых организмов (Kosterin et al., 1994). В клетке HI, как правило, представлен несколькими субтипами. Спектр гистона HI претерпевает существенные изменения в онтогенезе клетки, особенно в процессе ее дифференцировки (Cole, 1987). Так как гистон HI вовлечен в процессы компактизации хроматина и его вторичная структура близка структуре факторов транскрипции, гистон HI часто рассматривается в контексте его влияния на регуляцию дифференциальной экспрессии генов (Ramakrishnan et al., 1993).

Ввиду своей высокой вариабельности, гистон HI может использоваться как удобный объект для молекулярной филогении на микроэволюционном уровне. Поскольку в молекуле гистона HI гидрофильные домены эволюционируют с большей скоростью, чем гидрофобный, первичная структура генов HI может применяться для оценки эволюционного расстояния в разных временных масштабах. Есть свидетельства важной роли изменчивости гистона HI в процессах адаптивной эволюции. Установлено, что у насекомых существует корреляция между вариабельностью длины С-концевого домена гистона HI в пределах отряда и числом современных видов в отряде, но не с эволюционным возрастом отряда (Berdnikov et al 1993b), что свидетельствует об определенной адаптивной составляющей изменчивости гистона HI. В частности, установлено, что частота одного из

аллелей субтипа 5 гистона HI гороха в региональных выборках коррелирует с суммарной температурой за вегетационный период (Berdnikov et al., 1993а).

Удобной моделью для изучения влияния структуры гистона HI на фенотип и его роли в эволюционном процессе является горох {Pisum L.), так как он имеет внутривидовой аллельный полиморфизм по всем субтипам гистона HI, у него хорошо разработана частная генетика и он имеет короткое время генерации. На настоящий момент у гороха известно 7 неаллельных субтипов гистона HI, каждый из которых кодируется отдельным геном: ген Hisl, кодирующий гистон Н1-1, находится на 3-й хромосоме (в группе сцепления V), ген His 7 и кластер тесно сцепленных генов His(2-6) - на 6-ой (в группе сцепления II) (Kosterin et al., 1994).

Горох является ценной сельскохозяйственной культурой, история возделывания которой насчитывает около 12 тысяч лет (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973). Кроме того, это один из классических объектов генетики. Вместе с тем, существует множество разнообразных диких форм гороха, произрастающих в Средиземноморье. Дикие популяции представляют особый интерес как материал для реконструкции происхождения культурных форм гороха, а также в качестве потенциальных доноров хозяйственно-ценных признаков для селекции. В частности, известно, что вид P. fulvum является источником генов устойчивости к разным видам грибковых патогенов (Wroth, 1998; Fondevilla et al., 2007) и к гороховой зерновке (Clement et al., 2002).

В настоящее время таксономия рода Pisum достаточно запутана и несовершенна в связи с тем обстоятельством, что горох является преимущественно самоопылителем и его локальные популяции весьма отличны друг от друга. Кроме того, этот род содержит как дикие, так и культурные формы, причем некоторые формы были введены в культуру независимо (Vershinin et al., 2003). Культурные формы гороха отличаются

большой вариабельностью морфологических признаков, что также усложняет систематизацию внутри этого рода.

В настоящее время всеми исследователями признается выделение внутри рода Pisum L. вида Pisum fulvum Sibth. et Smith. Что касается наиболее гетерогенного вида Pisum sativum, то большинство авторов сходятся на том, что он объединяет все остальные формы гороха, дикие и культурные. Однако, в дальнейшем подразделении P. sativum на подвиды у исследователей нет полного согласия. Некоторые исследователи приписывают локально культивируемому в Эфиопии и Йемене подвиду Р. sativum subsp. abyssinicum (A. Br.) Govorov статус вида Pisum abyssinicum A. Br. Относительно подразделения диких форм P. sativum на подвиды также до сих пор не выработано единого мнения.

Для изучения эволюционных отношений внутри рода Pisum L. мы построили филогенетические реконструкции по генам гистона HI: His5 и His7, кодирующих субтипы HI-5 и HI-7, соответственно. Нами также была предпринята попытка филогеографического анализа диких популяций гороха, на основании распределения комбинаций аллелей трех функционально не связанных маркеров из трех клеточных геномов. Полученные данные позволили нам прояснить эволюционные взаимоотношения внутри рода Pisum L.

Цели и задачи

Целью работы являлась реконструкция филогенетических взаимоотношений и филогеографии в роде Pisum с использованием последовательности генов гистона HI.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установление нуклеотидных последовательностей и изучение изменчивости генов His5 и His 7 у ряда представителей рода Pisum и реконструкция на этом основании филогении последних;

2. Сравнение между собой филогенетических реконструкций, выполненных на основе генов His5 и His7;

3. Изучение географического распределения и распространения в таксономических группах гороха комбинаций вариантов пластидного и митохондриального CAPS-маркеров и электроморф белка SCA, сопоставление этих данных с филогенетическими реконструкциями;

4. Филогеографическая реконструкция истории возникновения и распространения диких и эндемичных культивируемых форм гороха;

5. Оценка информативности пластидного межгенного спейсера psbA-trnH как маркера для изучения эволюции рода Pisum L. и сравнение его с генами гистона HI в отношении информативности.

Научная новизна

Впервые гены линкерного гистона HI введены в филогенетический анализ на межвидовом и межпопуляционном уровнях и применены к сложному роду, включающему диких и культурных представителей. Этот филогенетический анализ был дополнен детальным рассмотрением географического происхождения исследуемых дикорастущих форм, т.е. впервые для дикорастущего гороха был применен последовательный филогеографический подход.

Научно-практическая ценность

Результаты данной работы углубляют представление о филогенетических отношениях диких родственников важной сельскохозяйственной культуры, что может способствовать более эффективному использованию диких представителей рода в селекции.

Показана перспективность генов гистона HI для филогенетического анализа на внутривидовом уровне.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно провел электрофоретический анализ гистона HI и SCA, CAPS-маркеров у 12 образцов гороха, определение нуклеотидной последовательности гена His5 у 59 образцов гороха, гена His7 у 56 образцов гороха, пластидного межгенного спейсера psbA-trnH у 19 образцов гороха, а также обработку экспериментальных данных.

Определение нуклеотидной последовательности гена His5 у 9 образцов гороха, анализ CAPS-маркеров и белка SCA у остальных 96 образцов выполнен В. С. Богдановой и О. Э. Костериным.

Апробация

Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН в 2011 г., 2й Московской Международной конференции "Молекулярная филогенетика" (2010), Международной конференции по генетике растений «Геномика и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), 14й Конференции по молекулярной эволюции в Марселе (2010), IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010), 16й Конференции по молекулярной эволюции в Марселе (2012).

Публикации

Материал диссертации представлен в 3 публикациях в зарубежных реферируемых журналах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общие сведения о гистонах

г

Гистоны - особый класс основных белков, одни из главных белковых компонентов хроматина эукариотических клеток. Различают пять типов гистонов - HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Также выделяют родственный HI гистон Н5, присутствующий в ядерных эритроцитах позвоночных животных. Н5 обеспечивает более плотную конденсацию хроматина, позволяя эритроцитам поддерживать небольшой объем. Для первичной структуры гистонов характерно высокое содержание остатков лизина и аргинина, а также отсутствие триптофана. По содержанию аминокислотных остатков гистоны подразделяются на три группы: аргинин-богатые (НЗ и Н4), умеренно лизин-богатые (Н2А и Н2В) и лизин-богатые (HI).

Гистоны обеспечивают нуклеосомный и наднуклеосомный уровни упаковки ДНК в хромосоме. Нуклеосома представляет собой коровую частицу - октамерный комплекс, в состав которого входят коровые гистоны -Н2А, Н2В, НЗ и Н4, а также взаимодействующий с коровой частицей участок ДНК, длиной 146 п. н. Наднуклеосомный уровень упаковки ДНК обеспечивает линкерный гистон HI, который связывается с линкерным участком ДНК (около 20 п. н.), разделяющим соседние нуклеосомы.

Коровые гистоны эволюционно стабильны и крайне консервативны -так, первичные структуры гистонов Н4 коровы, курицы и шпорцевой лягушки идентичны . Первичная структура линкерных гистонов, напротив, очень изменчива, настолько, что построение их консенсуса для разных видов невозможно (Wells, McBride, 1989).

Гистон HI играет роль как в поддержании структуры хроматина, так и в стабилизации положения нуклеосомы относительно двойной спирали ДНК, что находит отражение в структуре его молекулы.

Структура молекулы линкерных гистонов HI и Н5

В молекуле гистонов HI и Н5 выделяют 3 домена: центральный глобулярный домен с повышенным содержанием гидрофобных аминокислотных остатков, составляющий примерно 80 а. о. в длину, и не имеющие регулярной вторичной структуры положительно заряженные лизин-богатые N- и С-концевые домены (в среднем 25 и 100 а. о., соответственно) (Holde van, 1989).

При расщеплении хроматина под действием микрококковой нуклеазы образуется метастабильный промежуточный продукт - хроматосома, которая состоит из участка ДНК длиной около 165 п. н., обмотанного вокруг коровой частицы, и гистона HI. Дальнейшее расщепление микрококковой нуклеазой приводит к диссоциации HI и расщеплению дополнительных 20 п. н. ДНК. Участок ДНК длиной 146 п. н. остается защищенным от действия нуклеазы гистоновым октамером. В отсутствие HI хроматосома при расщеплении не образуется, что указывает на то, что гистон HI защищает эти 20 п. н. (Noll, Kornberg, 1977).

Так же как и нативный линкерный гистон, глобулярный домен гистона HI способен защищать упомянутые 20 п. н. ДНК. Показано, что при химической модифи�