Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наследования и свойства фракции гистона HI, специфичной для молодых тканей гороха (PISUM SATIVUM L. )

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Наследования и свойства фракции гистона HI, специфичной для молодых тканей гороха (PISUM SATIVUM L. )"

ьо

<=Г 22

О _ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

5 СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

иэ «•= и- X) О- »-

На правах рукописи УДК (575.116:633.358)+(577.112.823:582.736)

КОСТЕРИН Олег Энгельсович

НАСЛЕДОВАНИЯ И СВОЙСТВА ФРАКЦИИ ГИСТОНА Н1, СПЕЦИФИЧНОЙ ДЛЯ МОЛОДЫХ ТКАНЕЙ ГОРОХА (Р^им элТ1Уим ь.)

03.00.15 - Генетика'

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель - кандидат биологических наук

B.А. Бердников

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

C.И. Малецкий,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук О.В. Агафонова,

Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение - Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится 3 / _ 1995 г>

на заседании диссертационного совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

-----4/ ^¿u'é.——-

и

А.Д. Груздев.

Введение

Актуальность проблемы

Гистон HI является одним из главных белковых компонентов хроматина многоклеточных эукариот, который обеспечивает наднуклеосомный уровень его упаковки (Eissenberg et al., 1985; Fels enf eld & McGhee, 1986) И считается неспецифическим репрессором генной активности (Weintraub, 1985). В последнее время этот белок также рассматривается как один из факторов, участвунцих в регуляции • генов различными специфическими транс-активаторами конкурируя с ними за регуляторные сайты (Brown, 1984, Zlatanova, 1991 ) или прямо взаимодействуя с активаторами (Oikarinen, 1991).

Гистон HI, как правило, гетерогенен, то есть представлен несколькими неаллельными вариантами, состав и количественное соотношение которых далее в тексте мы будем обозначать термином спектр гистона HI. Этот спектр может варьировать в разных тканях и существенно изменяться в ходе онтогенеза, а также при клеточной дифференциации (см, например, Poccia, 1986; Lennox &,Cohen, 1988). Неоднократно высказывалось предположение, что наблюдаемые качественные и количественные изменения спектра гистона Hi могут влиять на транскрипционную активность хроматина или особенности его упаковки (Cole, 1987; Lennox & Cohen, 1988).

Вышесказанное позволяет предположить, что определенные изменения в молекуле гистона HI могут оказывать разностороннее влияние на фенотип организмов, а изменения во фракционном спектре HI могут быть ответственными за некоторые процессы, связанные с клеточной дифференцировкой.

В лаборатории экспериментального моделирования эволюционных процессов, руководимой В.А. Бердниковым (где выполнена и данная работа) получен ряд свидетельств в пользу влияния аллельных замещений в локусах гистона HI на фенотип организма и его приспособленность. (Бердников и др., 1984а; 19846; Berdnikov et al., 1992; 1993; Богданова и др., 1989; Bogda-nova et al., 1994). Часть этих данных была получена с использованием посевного гороха, который оказался прекрасным объектом для изучения влияния генов гистона HI на фенотип. Горох располагает аллельным полиморфизмом по всем семи фрак-

циям гистона Ш, обладая довольно хорошо разработанной частной генетикой при коротком времени генерации.

Настоящая работа посвящена исследованию изменчивости спектра гистона Н1 в разных органах и тканях растения и детальному исследованию одной из фракций, специфичной для молодых тканей.

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы было исследование специфичной для молодых тканей гороха фракции 7 гистона Н1. В работе были поставлены следующие частные задачи:

1. Изучение изменчивости спектра неаллельных вариантов гистона Н1 в разных органах гороха и преобразования этого спектра в ходе индивидуального развития растения и старения тканей.

2. Сравнительный анализ спектра гистона Н1 и его изменения при старении тканей у других видов бобовых.

3. Выявление аллельных вариантов фракции 7 гистона Н1, специфичной для молодых тканей,

4. Анализ географического рапспространения частот аллельных вариантов фракции 7 среди местных форм гороха в различных регионах Старого Света.

5. Локализация гена, кодирующего фракцию 7, на рекомби-национной карте гороха.

6. Создание серии тестерных линий гороха, несущих различные комбинации аллелей цепочки генов Н1в(2-б) -а - 1С -Швг - ыь группы сцепления 1.

Научная новизна и практическая ценность работы, в работе охарактеризованы изменения спектра гистона Н1 по мере роста и старения тканей посевного гороха. Исследования такого рода на растениях почти не проводились: изучались лишь изменения количественных соотношений фракций гистона Н1 у молодых проростков пшеницы (Биб^а et а1., 1979) и гороха Ша-пааоуа & Ко1еуа, 1989). Наиболее значимым изменением в спектре гистона Н1 по мере старения тканей гороха оказалось резкое уменьшение и исчезновение фракции 7. Фракция (или две фракции с близкой подвижностью) с таким же поведением в онтогенезе была выявлена и у всех других исследованных видов бобовых. Таким образом, данная работа открывает перспективы

исследования биологического значения количественных и качественных изменений спектра гистона HI на горохе, который является удобным лабораторным объектом с разработанной частной генетикой.

*

Генетические эксперименты по картированию гена фракции 7 и мутации ыь выявили ошибочность существовавшей рекомби-национной карты группы сцепления 1 гороха, а именно - отсутствие сцепления между двумя ее участками, несущими, соответственно, гены and. Публикация этих результатов повлекла за собой разделение группы сцепления 1 на два фрагмента в новой версии рекомбинационной карты гороха (Murfet, 1993; Wee&en et al., 1993). В этом состоит практическая ценность данной работы, так как создание надежных рекомбинационных карт необходимо для эффективной селекции сельскохозяйственных объектов. Практическую ценность представляют также созданные в ходе работы линии гороха, несущие различные комбинации аллелей генов His (2-6) , a, If, HSs7 и ыь, которые могут быть использованы для локализации новых генов группы сцепления 1. Эти лиши уже используются в лаборатории экспериментального моделирования эволюционных процессов ИЦиГ.

Апробация работы. Основные положения глав 3 и 5 данной работы были доложены на отчетной сессии института Цитологии и генетики СО АН СССР в 1992 г., материал главы 4 - представлен на стендовом сообщении сессии 1995 г.

Структура работы. Работа состоит из введения, пяти глав, первая из которых является обзором литературы, вторая описывает материалы и методы, третья, четвертая и пятая -полученные результаты, а также заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 источников. Работа изложена на 161 машинописных■страницах, содержит 10 рисунков и 16 таблиц.

Материалы и методы

Изучение изменчивости спектра гистона Hi в пределах растения проводилось на линиях WL6070 и WI1238. В анализ географического распространения аллельных вариантов фракции 7 гистона HI было вовлечено 798 образцов из коллекции ВИР. Кроме того, было проанализировано. 39 образцов дикорастущих форм посевного гороха. В генетических экспериментах были ис-

пользованы образцы ВИР-3971, ВИР-4871, ВИР-7094, сорт Tors-dag, тестерные линии Wbl02, WL1S38, Wbl393, WU688 и полученные в лаборатории экспериментального моделирования эволюционных процессов ИЦиГ линии Ь7, 6-14, RT-1, SGE и 0К7. Помимо посевного гороха, в работе проанализировано 22 вида растений из трибы Vicieae и 4 вида из других триб бобовых.

Гистон HI выделяли по методу Johns (1964) с модификациями (Розов, и др., 1986). Электрофорез проводился в 15« ПААГ, содержащем О,9 М уксусной кислоты и 8 М мочевины по методу Panyim & Chalkley (1969) в модификации Бердникова и Го-рель (1975). Гели окрашивали в 0,052-ном растворе' Кумасси R-250. Использовалось расщепление молекулы гистона HI по остаткам тирозина N-бромсукцинимидом (Sherod et al., 1974); при этом осуществлялся двумерный электрофорез, где второе направление велось в тех же условиях, но после расщепления указанным реагентом.

Оценка процента рекомбинации.по численностям фенотипи-ческих классов в потомстве гибридов F2 делалась с помощью метода максимального правдоподобия, с использованием компьютерных программ PLANT и cros, разработанных С.М. Розовым при участии автора. Соответствие наблюдаемых численностей фено-типических классов с теоретически ожидаемыми оценивалось с помощью критерия хи-квадрат. Для анализа статистической связи между качественными признаками применялся коэффициент связи и коэффициент ассоциации Дж. Юла г (Лакин, 1973).

Результаты и обсуждение

Большинство образцов гороха имеет семь фракций гистона HI, которые пронумерованы в порядке возрастания электрофоре-тической подвижности (рис. 1). Встречаются формы, не имеющие той или иной фракции. Каждая фракция имеет аллельные молекулярные варианты. Фракции 1-6 присутствуют во всех органах и тканях растения, тогда как фракция 7 исчезает из органов растения вскоре после того, как они перестают расти. Исследованию этой фракции и посвящена настоящая работа.-

На рис. 1 представлена электрофореграмма гистона HI, выделенного из равных навесок свежих.листьев гороха, взятых с каждого узла растения линии Wb6070, начиная от верхушечно-

го, еще не развернувшегося листа, до самого нижнего из живых листьев. Общее количество гистона Н1 падает по мере роста и последующего старения листа. При этом относительное содержание разных фракций гистона Н1 изменяется. Бросается в глаза то, что фракция 7, которая в верхушечном ■ узле интенсивнее фракции 6, фактически исчезает из листьев уже к пятому сверху узлу. С другой стороны, абсолютное содержание фракции 6 по мере старения листа снижается незначительно: в старых листьях она оказывается на втором месте по вкладу в общий Н1.

Изменчивость спектра гистона Н1 в других органах также сводится в основном к изменчивости содержания фракции 7. Она хорошо выражена в молодых, растущих или недавно прекративших рост органах: в верхушках боковых побегов, латеральных корней, в различных частях цветка (который, как транзиторный орган, не имеет старых тканей), в стенках растущих бобов, в молодых растущих корневых клубеньках, а также в молодых неопластических образованиях на стенках бобов, вызываемых в условиях теплицы геном Нр. С другой стороны, фракция 7 присутствует в очень незначительном количестве или вообще не выяв-+

2-

З'—^сэсзявз- ------ - —

72—» —

Рис. 1. Электрофореграмма гистона Н1, выделенного из 60 мг листьев растения гороха линии таи 238, расположенных последовательно на узлах с девятого (справа) по двадцать, седьмой (верхушечный узел, слева). Цифрами обозначены фракции Н1, надстрочными символами - их аллельные варианты.

ляется в зрелых, прекративших рост стеблях и корнях, в эпи-котиле и гипокотиле проростков к моменту распускания 4-5 узлов, в стенках бобов после того, как рост последних прекратился, в старых, нефункционирующих клубеньках.

Фракция 7 всегда отсутствует в сухих семенах. Она становится различимой на фореграммах препаратов, выделенных из зародышевого корешка в тот момент, когда он начинает удлин-няться, т.е. приблизительно через 12 часов после начала набухания, но совершенно не выявляется в семядолях, остающихся при растущем растении.

Помимо гороха, сравнение спектров Н1 в молодых и старых листьях было проведено у ряда других видов бобовых (рис. 2).

д

SE _

15 В *

е

+

к л

Рис. 2. Схемы электрофореграмм гистона Н1, выделенного из молодого верхушечного листа (левая дорожка в каждой паре) и зрелого листа (правая дорожка в каждой паре), а) Lathyrus clymenium, б) L. tingitanus, в) L. ochrus, г) l. tvberosus, д) L. aphaca, e) L. odoratus, ж) L. siIvestris, 3) L. pisiformis, и) L. Japorticus, к) Pisum sativum, л) Vicia silvatica, и) V. tenuiroli а, н) V. Taba, о) V. urtijuga, n) Lens cu-linaris, p) Hedicago satlva, c) Galega Orientale. Стрелкой обозначена фракция, количество которой резко уменьшается при старении листа, звездочка - зону гистонов Н2А и Н2В.

з

*

Анализировались в основном представители трибы Vlcieae (к которой принадлежит и горох). Кроме того, было изучено несколько представителей других триб: Arachis hypogeios (триба Hedysaereae), Clcer arletlnum (триба CJcereae), Phaseolus vulgaris (триба Phaseoleae), Galega orlentalls Lam. (триба Galegeae) и Medí cago sativa L. (триба Tri folleae). Спектры гистона HI у всех исследованных видов трибы Vlcieae весьма напоминают спектр посевного гороха: практически у всех наиболее интенсивной фракцией является самая медленная, имеется группа более мобильных фракций, близких по электрофоретичес-кой подвижности, и одна-три гораздо более подвижных фракции. Как правило одна из них - обычно наиболее электрофоретически подвижная - характеризуется тем, что ее содержание высоко в молодых листьях, а в старых листьях оно существенно уменьшается, либо эта фракция вообще перестает выявляться. У некоторых однолетних видов Lathyrus такая фракция является второй ПО ПОДВИЖНОСТИ. У L. odoratus, L. tuberosus, L. sativus (не показано) и Vicia unljuga подобное поведение демонстрируют две равновыраженные фракции с очень близкой подвижностью. Спектры гистона Hi у представителей других триб бобовых существенно отличаются от спектра гороха (рис. 3 р, q), однако в них всегда имеется высокоподвижная фракция, присутствующая в молодых листьях и исчезащая в старых, скорее всего - фракция гистона HI, гомологичная фракции 7 у гороха.

Если скрестить две формы гороха, имеющие различную подвижность той или иной фракции гистона Hi, в том числе и фракции 7, то у гибридов F1 обнаруживаются оба варианта этой фракции примерно в равных количествах, а растения из потомства F2 демонстрируют менделевское расщепление фенотипов, что свидетельствует о моногенном наследовании каждой из фракций. Такие данные опубликованы для фракций 1-6 (Розов и др., 1986), для фракции 7 они получены в настоящей работе.

У подавляющего большинства форм гороха фракция 7 гистона Hi представлена одним из трех аллельных вариантов, четко различающихся по электрофоретической подвижности и обозначаемых далее как 71, 72 и 73 (варианты пронумерованы в порядке возрастания электрофоретической подвижности), причем второй встречается много чаще двух других. Кроме того, были

найдены варианты, незначительно отличающиеся по подвижности от 72, которые мы будем называть субвариантами 7г. Оказалось что варианты 71 и 73 имеют три точки, чувствительные к расщеплению н-бромсукцинимидом по остаткам тирозина, находящимся в центральном домене молекулы. Образующиеся при расщеплении по каждой из них фрагменты варианта 73, содержащие С-терминальный домен молекулы, мигрируют в геле быстрее соответствующих фрагментов варианта 71 (рис. 3). Это свидетельствует о том, что различия между вариантами находятся в С-терминальном домене молекулы. В то же время вариант 72 и его субварианты дают только два фрагмента, идентичные по подвижности первому и третьему фрагменту варианта 71. Следовательно, участок молекулы, обуславливающий различия в подвижности между вариантами 72 и 71, лежит в ы-концевом домене, а средний остаток тирозина в глобулярном домене молекулярного варианта 7г либо замещен на остаток иной аминокислоты, либо недоступен для реагента. Нами было проанализировано 16 образцов ВИР, имеющих вариант 71, 70 - вариант 72, 13 - субварианты 72 и 56 - вариант 73 и при этом не найдено ни одного исключения иг приведенного правила.

Ранее В.А.Бердниковым с соавторами (1984; Вегс1п1коу et а!., 1994) на основе коллекции ВИР было предпринято широкомасштабное исследование географического распространения ал-лельных вариантов фракций 1-6 гистона Н1 у форм гороха, которые культивируются местным населением в разных регионах Старого Света. В настоящей работе было проведено аналогичное исследование фракции 7. Каждый образец был представлен в анализе одним растением. Образцы были сгруппированы в региональные выборки таким образом, чтобы каждая выборка содержа-

а ь с д

Рис. 3. Электрофореграмма про- »¿¡[.ч.^.ша.'^.цз

дуктов частичного расщепления аллельных вариантов фракции 7 гистона Н1 гороха ы-бромсукцин-имидом. а) 73; Ъ) 72; с) замед- ~ _ _

ленный субвариант 72; а) 75.

Большие стрелки - нативный Н1, Г ~

малые - его фрагменты. *

- а -

ла не менее 30 образцов. Всего исследовано 839 образцов.

Подавляющее большинство образцов гороха почти во всех региональных выборках имеют вариант 72 (рис. 4). Субварианты варианта 72 встречаются редко (2% образцов), вариант 71 имеет довольно высокую встречаемость лишь в Северо-Восточной Европе, на Урале, на Кавказе и среди образцов из Северной Африки. Частоты этих вариантов не демонстрируют каких-либо закономерностей. Наибольший интерес представляет географическое распределение частот быстрого варианта 73, обнаруженного у 12,2$ образцов суммарной выборки. Наибольшую частоту он имеет в выборке Пиренейского полуострова (41,0$). В Западной и Центральной Европе частота его убывает, в следупдих далее' на юго-восток регионах - на Апеннинском и Балканском полуостровах, в Малой Азии и Палестине и, затем, на Кавказе она продолжает уменьшаться. Во всех остальных регионах, кроме Индии, частота варианта 73 крайне низка. Таким образом, она

Рис.4. Частоты вариантов 71 и 73 в выборках образцов, происходящих из различных регионов Старого Света: 1 ) Пиренейский п-ов; 2) Западная Европа; 3) Центральная Европа; 4) Северо-Восточная Европа; 5) бассейн Днепра и юг России; 6) Бассейн Волги; 7) Урал и Западная Сибирь; 8) остальная Сибирь и Монголия; 9) Китай и Дальний Востьк; 10) Средняя Азия; 11) Афганистан; 12) Индия и Непал; 13) Кавказ и Закавказье; 14) Малая Азия; 15) Балканский и Апеннинский п-ова; 16) Палестина и Магриб; 17) Эфиопия. В левом верхнем углу приведена диаграмма, соответствующая суммарной выборке.

убывает по мере удаления от крайнего запада Европы. Данную закономерность нарушает Индия, где этот вариант составляет 25,6$. Частоты вариантов фракции 7 гистона НЗ не проявляют закономерностей, которые говорили бы о том, что эти варианты подвергались действию естественного отбора.

Было замечено, что вариант 73 имеют как правило формы гороха, несущие рецессивный аллель гена а. Ген а находится в той же хромосоме, что и ген Н1 я7 фракции 7 гистона Н1, и проявляет генетическое сцепление с ним (см. ниже). Оказалось, что в суммарной выборке и в региональных выборках, где вариант 7Э имеет заметную частоту (выше 30$), кроме выборок Пиренейского полуострова и Западной Европы, связь между 7Э и а оказывается статистически значимой. В выборке Пиренейского полуострова связь между ними отсутствует (коэффициент Дж. Юла г равен 0,31 при ошибке 0,16), в выборке Западной Европы - малодостоверна (г=0,37±0,15). Была изучена также связь варианта 73 с галлотипами фракций 3-6 гистона Н1. (Гаплотип кодируется тесно сцепленными генами, обозначенными как сложный локус ш я(2-е 1 в группе сцепления }, формульные обозначения введены в работе Бердникова и др. (1988)). Среди носителей варианта 73 гаплотипы, не описываемые формулой 1x21 (здесь х обозначает любой аллель), встречаются значительно реке (10%), чем в общей выборке (37,5$). В суммарной выборке и в выборках Центральной Европы и Кавказа связь между вариантом 73 и галлотипами 1x21 статистически значима.

По-видимому, вариант 7Э возник в Западной Европе, возможно, именно на Пиренейском полуострове. Там он существовал продолжительнее время и вошел в равновесие с аллелями сцепленного с ним гена а, а его носители имели гаплотипы группы 1x21, как и подавляющее большинство гороха в данном регионе. По остальной территории Старого Света он распространился позднее вместе с какими-то формами гороха, имеющими аллель а и гаплотип группы 1x21.

Нами было проанализировано 39 образцов дикорастущих форм посевного гороха. В четырех случаях (в группе Р.в. е1а-Нив - р.я. вупасит) был найден вариант 71, все остальные образцы имели вариант 72 или его субварианты.

Ранее было показано, что у гороха пять генов, кодирую-

щих фракции 2-6 гистона HI, тесно сцеплены, а сам кластер находится на хромосоме 1 приблизительно в 4 Л кроссинговера от гена а. В то же время ген фракции 1, обозначенный Hisi, расположен на хромосоме 5 приблизительно в 10 сМ от гена ti В настоящей работе ген Hls7, кодирующий фракцию 7, был локализован на хромосоме 1.

Сцепление между генами His7 и His 12-6) было замечено в двух скрещиваниях: в FS от скрещивания L7 х WL1238 (всего 43 растения) и в анализирующем скрещивании (WL1393 х WL1688) х W11393 (всего 174 растения), процент рекомбинации оценен в них, соответственно, как 15,5±4,3 и 20,7±3,0. Для локализации гена His7 были проведены два специальных анализирующих скрещивания: ((индивидуальное растение Г2 WL1393xWl/l688) х WL102) X WL102 (всего 505 растений) и (ВИР-7094 х Wbl02) х WL102 (всего 142 растения). Численности генотипических классов, полученные в первом из них, приведены в таблице 1. В обоих скрещиваниях получен идентичный порядок генов и близкие рекомбинационные дистанции • (верхняя цифра относится к первому скрещиванию, нижняя - ко второму):

HI s 12-6)_а_1 í_Hls7

6,5±1,1 8,3±1,2 22,2±1,9

7,Ctt2,2 9,9±2,5 23,9±3,6

14,1±1,6 1б,5±3,6

26,5±2,2 28,2±3,8

27,5±2,0 29,6±3,8

В первое скрещивание оказалась вовлечена реципрокная транслокация с точкой разрыва в 10,9t2,2£ от гена Т1 в хромосоме 5, не затрагивающая хромосомы 1; растения во втором скрещивании имели- нормальный кариотип.

Недавно была выделена доминантная мутация TVt, ассоциированная с точкой разрыва реципрокной транслокации, находящейся в. 8$ рекомбинации от гена а в хромосоме 1 (Gorel et al., 1994). Она проявляется в раннем и плотном закручивании усиков, а в гомозиготе резко снижает жизненность растения. Для локализации Twt относительно гена His7 было проведено

Таблица 1

Численности генотипических классов по генам Н18(2-б), а, 1Г и Н1б7 в потомстве анализирующего скрещивания ((растение Г2 «'Ы393хи,1бав) х тог) х \шог. Растение Г2 имело гаплотип 1323 фракций 3-6 гистона Н1, аллели А, ьг, аллельный вариант 73 фракции 7; тестерная линия даыог - гаплотип 1221, аллели а, 1Га, вариант 72.

His(2-6) а If His7

73/7z 7z/72

1323/1121 Л/а Lf/ira 164 44

lfa/lfa 4 14

а/а ЬГ/lf 0 1

ira/ita 8 12

1121/1121 А/а Lf/lf 7 4

lfa/lfa 0 1

а/а Lf/lf 16 5

lfa/lfa 46 179

хг * р 0,24 " >0,6 1,67 >0.1 1,05 >0,3 0,33 >0,5

* Оценка отклонения численностей генотипов по каждому из генов от теоретически ожидаемого соотношения 1:1. Для всех генов отклонения статистически недостоверны.

анализирующее скрещивание ((индивидуальное растение F2 Sprin.t2 Twt х ВИР-3953) х (индивидуальное растение ?2 WL1393 х WL1688)) х WL102. Всего было получено 107 растений, на основании расщепления фенотипов были вычислены следующие ре-комбинационные отношения:

His (2-6)_а_ Twt _His7

10,3*2,9 9, 4±2,8 19,б±3,8

15,9±3,5 "

23,4±4,1 _____

Несмотря на то, что исследуемый участок хромосомы разорван транслокацией, рекомбинационные отношения между геном И1в7 и генами ^/ísí2-б^ и а оказались близкими к полученным в предыдущих скрещиваниях. Расстояние Н15(2-б)-а оказалось несколько больше, но и эти различия недостоверны и=1,39; Р>0,1).

В соответствии с существовавшими к 1992 году (когда были получены описанные выше результаты картирования) вариантами рекомбинационной карты гороха, груша сцепления 1 включала в себя около двух десяков генов, довольно равномерно заполнявших ее от гена а до гена 1. При этом на карте 1992 Г. (№ее!еп et а1., 1992) в 17 сМ от гена 1Г и в 24 сМ от гена а помещен ген <*, определяющий присутствие/отсутствие и характер антоцианового кольца в основании прилистников. На предшествующих вариантах карты порядок этих трех генов был таким же. Отсюда следует, что мы должны были бы с необходимостью обнаружить сцепление между генами И1в7 и Для выяснения их рекомбинационных отношений были проведены четыре анализирующих скрещивания, в которых в сумме было получено потомство из 584 растений. Неожиданно во всех четырех скрещиваниях сцепления между этими генами не наблюдалось.

Выяснилось, что традиционное отнесение генов а и <1 к одной группе сцепления восходит к работе Н. ЬатргесЫ; (1956) и основывается на непосредственом дигибридном наследовании этих двух генов. Корректный пересчет приведенных в ней данных с помощью метода максимального провдоподобия для случая криптомерии показал, что все приведенные скрещивания (за исключением одного, возможно, включавшего хромосомную перестройку) не дают оснований для вывода о сцеплении данных генов. В той же работе (ЬагоргесМ, 1956) бесхлорофилльная мутация аи (аигеа) была картирована между генами а и <*, однако пересчет данных показал, что они не свидетельствуют о сцеплении генов аи и а. Другие основания для помещения генов а и с в одну и ту же группу сцепления в литературе отсутствуют.

Недавно С.М. Розовым была получена новая мутация гороха, обозначенная ыь (Ьи1ЬозиБ) (исходная линия - зство), которая проявляется в гомозиготе в суженном основании листочков, суженных прилистниках и в той или иной степени вздутом стебле у проростков. В потомстве Т2 от скрещивания БОЕвО

x WL1238 (всего 76 растений) было обнаружено сцепление генов ыь и His7, составляющее I9,9±5,04i. Для точного картирования были предприняты два скрещивания: ВИР-3971 х SGE80 и ОК7 х SGE80, в которых рекомбинационные отношения между генами устанавливались на основании численностей фенотипичечских классов в потомстве F2 (всего 663 растений в первом скрещивании и 123 растения - во втором). На основании этих скрещиваний были получены следующие сегменты карты:

Hi s (2-6)_Hi s7_ЫЬ

28,1±1,5 17.6±1,6

ВИР 3971xSGE80 ' 3б,3±2,2

His (2-6)_а___Hls7_ЫЬ

13,6±3,3 33,0±5,0 18,7±3,8

35,6±4,0

0K7xSGE80 . " 33,8*7,9 ~

_____

Кроме того, в обоих скрещиваниях родители различались аллелями гена а, однако его сцепления с ни с одним из приведенных выше генов не наблюдалось. В данном случае ш имеем цепочку из сцепленных генов a-His7-bib, протянувшуюся в сторону предполагавшегося местонахождения гена d, но так и не обнаружили признаков его сцепления ни с одним из генов цепочки. . Таким образом, ген ыь на данный момент оказывается крайним маркером в грурпе сцепления 1. На основании представленных данных Linkage Commetee принял решение разорвать группу сцепление 1 на два фрагмента в последней версии карты (Murfet, 1993; Weeden et al.„ 1993).

Проведенные в данной работе эксперименты по генетическому картированию позволяют, с помощью программы Jolnmap (Stam, 1993), построить следующий обобщенный фрагмент карты одного из фрагментов группы сцепления 1:

His (2-6) a 1С His7 ЫЬ

7,6±1,0 8,6±1,1 22,6±1,7 18,0±1,4 %

(Общий объем проанализированного потомства составляет 2136 растений. Скрещивание с участием гена Twt исключено, так как в нем данный район разорван транслокацией)

При картировании генов His7 и Ь1Ъ в нашем распоряжении оказались растения, несущие различные комбинации аллелей этих и ряда других генов. Из потомства некоторых таких растений были получено 11 линий, маркированных тем или иным сочетанием аллелей генов группы сцепления 1. Эти линии используются для картирования новых генов в указанной группе сцепления.

Выводы

1. Охарактеризован спектр неаллельных вариантов гистона HI в разных органах посевного гороха и его изменения по мере роста и старения тканей. Показано, что спектр включает семь фракций HI, из которых самая быстро мигрирующая в электрофорезе фракция 7 присутствует лишь в молодых тканях.

2. Спектры гистона HI 23 видов бобовых растений из трибы vi-cieae имеет большое сходство со спектром посевного гороха: они имеют одну или две высокоподвижные в электрофорезе фракции HI, специфичные для молодых тканей. Спектр гистона HI четырех представителей других триб семейства бобовых довольно сильно отличается, но также включает специфичную для молодых тканей фракцию гистона HI.

3. Выявлено три четко различающихся в электрофорезе аллель-ных варианта фракции 7 (71, 72 и 73) и несколько редко встречающихся субвариантов с незначительными отличиями по подвижности от варианта 72. Установлено, что молекулы вариантов 71 и 7Э имеют три точки, чувствительные к расщеплению N-бромсукцинимидом, а молекула варианта 72 и его субвариантов - две таких точки.

4. В ходе анализа 839 форм гороха из коллекции ВИР, автохтонных для различных регионов мира, было установлено, что подавляпцее большинство из них (80%) имеет вариант 2 фракции 7 гистона HI. В географическом распределении частот редких вариантов 71 и 73 не прослеживается каких-либо закономерностей, свидетельствующих о их биологической значимости. Вариант 7Э несет более 10$ образцов в выборках Западной Европы и

Средиземноморья, его доля максимальна в выборке Пиренейского полуос трова (41,2%).

5. Ген фракции 7 гистона HI гороха, His7, локализован на генетической карте группы сцепления 1 в 22,6±1,7 процентах кроссинговера от гена if в направлении от гена а.

6. Мутация ыь картирована в группе сцепления 1 в 18,0±1,4 процентах кроссинговера от гена His?, так что последовательность проанализированных локусов на генетической карте выглядит следующим образом:

His(2—6) - а - If - Hls7 - ЫЬ.

7. Не обнаружено генетического сцепления между геном d и генами Hts7 и ыь, что ставит под сомнение адекватность существовавшей рекомбинационной карты группы сцепления 1 гороха. Полученные результаты, в сочетании с критическим анализом литературных данных, показали необходимость разбиения бывшей группы сцепления 1 на два независимых фрагмента.

9. Создано И линий гороха, имещих различные сочетания аллелей генов His(2-6), a, if и Hls7 (одна из линий несет также маркер ыь), которые могут быть полезны для локализации мутаций в одном из двух фрагментов бывшей первой группы сцепления.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kosterin, O.E. Mapping of the third locus for histone H1 genes in peas. // Pisum Genetics. - 1992 - Vol. 24 - P. 56-59

2. Kosterin, O.E. Genes a and d may not be in the same linkage group. // Pisum Genetics. - 1993 - Vol. 25 - P. 23-26

3. Kosterin, O.E., and S.M.Rozov. 1993- Mapping of the new mutation bib and the problem of integrity of linkage group 1. // Pisum Genetics. - 1993 - Vol. 25 - P. 27-31

4. Kosterin O.E. Chromosomal rearrangement in line Wb1393. // Pisum Genetics. 1993 - Vol. 25 - P. 71.

5. Kosterin, O.E., V.S. Bogdanova, F.l. Gorel, S.M. Kozov, Yu.A. Trusov, V.A. Berdnikov. Histone H1 of the garden pea (Pisum sativum L. )j composition, developmental changes, allelic polymorphism and inheritance. 11 Plant Science. - 1994 - Vol. 101 - P. 189-202.