Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика генов тРНК в митохондриальном геноме VICIA FABA

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика генов тРНК в митохондриальном геноме VICIA FABA"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ._УНИВЕРСИТЕТ имени М. & ЛОМОНОСОВА_.

Биологический факультет

На правах рукописи

КОЖЕМЯКИН Александр Витальевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ тРНК В ЫИТОХОНДРИАЛЬНОМ ГЕНОМЕ V 1С IА РАВА.

03.00.12 - Физиология растений 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и клеточной инженерии ордена Трудового Красного Знамени Института физиологии растений им. К А. Тимирязева АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Е И. Негрук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

К Л. Клячко

кандидат биологических наук. К С. Энтелис

Ведущая организация - Институт молекулярной

биологии АН СССР

Защита диссертации состоится 1991 Г. В

часов на заседании Специализированного совета К 053.05.14 при Мэс ковском Государственном Университете им. М. Е Ломоносова по адрес! 119899, Москва, Ленинские горы, ИГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук (У 0. Г. Полесская

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Известно, что все физиологические про-{есеы, происходящие в клетке, детерминированы генетическим материалом слетки. Невозможно воссоздать цельную картину функционирования организма, не зная,каков генетический потенциал клетки и как он реали-»уется на тех или иных этапах жизнедеятельности организма или при стрессовых условиях. Клетки высших растений имеют две внеядерные генетические системы-митохондриальную и хлоропластную. Обе системы уникальны и отличаются от генетической системы ядра Для нормального развития растения необходимо эффективное взаимодействие между гремя генетическими системами. Изменения в генетической информации или в способе взаимодействия трех органелд могут сопровождаться глубокими физиологическими эффектами, отражающимися на фенотипе растения.

Из трег клеточных геномов наиболее хорошо изучен хлоропластный геном. Этому способствовали небольшие размеры хлоропластного генома и его сходство с прокариотическими генетическими системами. Мито-хондриальные геномы высших растений изучены значительно хуже в силу своих огромных размеров и физической гетерогенности. В настоящее время в митохондриальном геноме высших растений охарактеризованы гены рРНК, найдены и секвенированы несколько генов рибосомных белков, а также ряд генов тРНК.

Несмотря нд огромные размеры,митохондриальные геномы высших растений не кодируют полный набор тРНК, необходимый для белкового синтеза. Некоторые тРНК кодируются ядерным геномом и импортируются из цитоплазмы в митохондрии.

Бее известные к настоящему времени митохондриальные гены тРНК растений распадаются на два отдельных, класса. Одна группа имьзт 65-80% гомологии с эубактериальными и хлоропластными тРНК и, как предполагают, произошла от эубакгериальных эндосимбионтов , которые

дали начало митохондриальному геному растительных и других эукарио-тических клеток. Другая группа генов тРНК родственна (более 9CZ гомологии) с генами тРНК хлоропластов. Эти хлоропластоподобные гены представлены в случайных хлоропластных последовательностях, которые внедрились в ыитохондриальный геном в ходе эволюции. Такие последовательности широко распространены и располагаются случайно в митохондриальной ДНК. Имеются свидетельства, что хлоропластоподобные гены транскрибируется в митохондриальном геноме и их транскрипты процессирушся до зрелых тРНК.

То обстоятельство, что в митохондриальной трансляции принимают участие тРНК, кодируемые в разных клеточных компартментах и различные по своему эволюционному происхождении,делает ее великолепной моделью для изучения взаимодействия геномов трех клеточных орга-недл.

В связи с изложенным представляется актуальным исследование генов тРНК,кодируемых непосредственно митохондриалънымн геномами, а также организации генов тРНК в митохондриальном геноме высших растений.

Дель к задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование организации генов тРНК в митохондриальном геноме кормовых бобов (Vtoia faba). В ходе работы решались следующие задачи: 1) С помощью гибридизационных методов определить число генов тРНК,кодируемых митохондриальныы геномом кормовых бобов. 2) Локализовать гены тРНК в клонированных участках митохондриального генома V. faba. 3) Построить генетические и рестриктные карты участков мтДНК, кодирующих тРНК. 4) Определить общие принципы организации генов тРНК в митохондриальном геноме высших растений на примере V. faba.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы в митохондриальном геноме кормовых бобов обнаружено и локализовано 13 ге-

нов тРНК, четыре из них являются хлоропластоподобными генами, а остальные- собственно митохондриальными генами тРНК. Три гена тРНК впервые обнаружены в митохондриальном геноме двудольного растения. . Построены генетические и рестриктные карты участков мтДНК V. faba, содержащих гены тРНК. В результате проведенной работы выяснено, что гены тРНК в митохондриальном геноме кормовых бобов не организованы в специфические кластеры,характерные для митохондриальных геномов животных и грибов и рассеяны по всему митохондриальному геному. 06-нарукено два новых гена тРНК в хлоропластном геноме V. faba.

Научно-практическая ценность работа Полученные результаты являются вкладом в изучение организации митохондриальных генов высших растений. Ланные, касаюеиеся генов тРНК.были использованы для построения генетической карты митохондриального renoua V. faba В работе впервые исследована организация генов тРНК в митохондриальном геноме двудольного растения.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре ( Шсква, 1989), ка X двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Организация и экспрессия геномов эукариот и прокариот"( Киев, 1990), на IV Международном конгрессе по митохондриальному геному высших растений (Итака, США, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы, список которых приводится.

Объем работы. Диссертационная работа излохвна на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов. Иллюстративный материал включает 32 рисунка и 9 таблиц. Список литературы содержит' 225 источников, в том числе 218.иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы семена кормовых бобов сорта " Рус ские черные". Митохондриальную и ядерную ДНК выделяли из этиолиро ванных проростков. Для этого бобы проращивали в темноте при температуре 20" С в течение 6 дней. Хаоропластную ДНК выделяли из листьев веленых растений,выращенных на свету в течение 18-20 дней при температуре 2СРС и длине дня 16 часов. В зависимости от требований эксперимента мгДНК выделяли двумя методами: либо с применением равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия, либо несколько модифицированным методом фенольнсй депротеинизации tSynenki R.et al. 19783.-

Выделение плазмидной и космидной ДНК осуиэствляли по методу Birnboim.Doly,1979. В некоторых случаях космидную ДНК выделяли по методу Lonsdale et al. ,1984. Фрагменты ДНК элюировали из легкоплавкой агарогы по Maniatts et al. ,1984, а также при. помощи модифицированного метода замораживания и оттаивания СSmith.19801. Скрининг ре-комбинантных плавмид,трансформацию клеток Е.coll, обработку ДНК эн-донуклеазами рестрикции. Southern-гибридизацию, приготовление радиоактивно меченных зондов, электрофорез и датирование ДНК проводили по стандартным методикам (Manlat is et al. ,19843.

В качестве зондов тРНК были исподьэоваш синтетические олиго-нуклеотиды,гомологичные консервативным областям митохондриальных тРНК (Зонды любезно предоставлены др. Я. tí. Гриненбергером, Ин-т мох биологии растений, Страсбург).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Гибридизационный анализ игДНК кормовых бобов с помощью зондов тРНК.

Точное число генов тРНК, кодируемых митохондриальными геномами высших растений, пока не известно. Наиболее хорошо исследованы мито-хондриальные гены тРНК у двух представителей однодольных растений-пшеницы и кукурузы. Набор генов тРНК в митохондриальных геномах одно- и двудольных растений, по-видимому, различается [ Izuchi S. ,et al., 1990]. Сейчас уже известны три тРНК: TPHKPhe, TPHKCys и TPHKGly, имеющие различные первичные структуры в митохондриальных геномах двудольных и однодольных растений [Joyce Р., 1989; Sangare A. .et al. 1990],

Одна из задач этой работы заключалась в определении набора генов тРНК в митохондриальном геноме Vtcia faba, относительно уже известных митохондриальных генов тРНК высших растений. Для этой цели ыы использовали 18 синтетических олигонуклеотидных зондов, гомологичных консервативным областям митохондриальных генов тРНК, первичные структуры которых известны. При гибридизации мтДНК V. faba, обработанной рестриктазами BamHI и Xbal с радиоактивно мечеными зондами 13 из 18 зондов дали положительный сигнал с мтДНК Из 13 обнаруженных таким образом генов 4 являются хлоропластоподобными: trrdtë, trnN, trnW и trnH. Остальные девять - trnMl, trnS (GCU), trnP, trnD, trnE, trnY. trnQ, trnG и trnK - собственно митохондриальными генами. Гены trnP, trnD и trnQ ранее были обнаружены только в митохондриальных геномах однодольных растений. То обстоятельство, что мы обнаружит три этих гена в митохондриальном геноме V. faba, свидетельствуют о том, что эти гены присутствуют также в митохондриальных генойах двудольных растений.

Как было показано недавно [Weber F. ,et al 1Ра0], в митохондриях картофеля происходит модификация TPHKMetl (CAU) в тРНКПе (L*AIH,

Таблица 1. Размеры рестриктных фрагментов митохондриальной и хлороп-ластной Д№ Vicia ГаЬа,содержащих гены тРНК.

1 t Ген 1 ¡1 1 l 1 i ..........i Гомологичен 1|r гену 1|s или тРНК I 1 ...... .........- 1 1 Размер фр-та | мтДНК (тпн) 1 Размер фр-та хпДНК (тпн)

BamHl Xbal 1 BamHI Pstl

|trn№ 1 1С AU 1 кг. кукурузы! 43 8а 7 1 - 1

jtrnKE (bfct) ICAU 95 3.8; 8в 20; 2.41 3.5 13(Р5)

ItrnS (Ser) IGCU -//- 68 8а 8.5 1 - 1

ItrnS (Ser) IGGA от, Oenoth. 99 - j H 10(Р6)

ItrnS (Ser) IUGA мт. пшеницы 74 - 1 - j

ItrnP (Pro) IUGG -//- 75 0.7; 8а 6.7; 8.51 - 1

jtrnD (Asp) IGUC мт. кукурузы 70 1.2; 6; 8а 8.5; 5.5' - 1

ItrnE (Glu) IUUC мт. сои 65 вв 2.4 ( - 1

ItrnN ( Asn) IGUU мт. пшеницы 92 3,8 20 1 2.5; 6 н 1

itrnY (Tyr) IGUA мт. кукурузы 69 3.8 20 1 - 1

ItrnV (Trp) ICCA мт.тРНК Ph. 98 1,85 2.4 1 3 35(Р1) 1

ItrnH (His) IGUG хл. кукурузы 100 5 14; 8; 4| а5 н 1

ItrnQ (Gin) IUUG мт. пшеницы 75 3 6.5 1 - 1

ItrnK (Lys) IUUU мт. кукурузы 72 5 6 t - 1

ItrnQ (Gly) IGCC мт. люпина 73 8 2,7 .| и 13(Р5) 1

ItrnC (Cys) IGCA мт. кукурузы 98 - - 1 6.5 20(Р2) 1

ItrnFl(Phe) IGAA мт. тРНК Ph. 75 - 1 - 1

|trnF2( Phe) i. ...... .. ___ IGAA i....... мт. пшеницы ..... 98 ............ ______...1 5.1 13(Р5) 1 ........ i

Ph. -Phaseolus vulgaris - Нет сигнала при гибридизации, н - Размер фрагмента не определен.

() - В скобках даны обозначения фрагментов по рестриктной карте хлоропласт но го генома V. faba Г Ко К. , et al, 19843.

однако поскольку пока не иаьестно. происходит ли такая модификация в митохондриях других растений,мы не стали иэнять традиционного названия гена ЬгпМ1.

Пять генов: ЬгпБ (ООА), ЬгпЭ (ША), ЬгпС, 1гпГ1 и ипГС отсутс-вух)т в митохондриальиом геномэ V. ГаЬа (Табл.1). Из них нас особенно заинтересовал ген ипП. Зонд к этому гену был синтезирован на основании первичной структуры тРНКРпе то митохондрий фасоли С Ма-

rechal et al. ,1985b]. В митохондриальном геноме фасоли такой ген пока не обнаружен. Не обнаружен такой ген и в митохондриальных геномах пвеницы и кукурузы. Не исключена возможность, что этот ген кодируется ядерным геномом, а TPHRPhe импортируется в митохондрии. Ыи провели гибридизацию зонда trnFl с ядерной ДНК V. faba, обработанной рестриктазой BawHI. Положительный сигнал отсутствовал и в данном случае. Возможно несколько объяснений подобной ситуации: либо набор генов тРНК в митохондриальных геномах различается дал» в пределах одного семейства я тогда гены TPHKPhe имеют различную первичную структуру у фасоли и кормовых бобов, либо ген trnFl кодируется ядерным геномом, но мы не смогли обнаружить этот ген при гибридизации зонда с ядерной ДНК V. faba вследствие ее огромных раз даров.

2. Организация генов тРНК в митохондриальном геноме горновых бсооз.

2.1 Картирование мгДНК кормовых бобоз.

Кроме определения набора генов тРНК в митохондриальном геномэ Y. faba в задачу этой работы входило исследование структурной организации генов тРНК. Для этой цели необходимо было построить генетические карты участков мтДНК, содержащих гены тРНК. Эта задача выполнялась в рамках более обдай задачи по картированию митохондри-ального генома V. faba. проводимой в наией лаборатории. Вся работа проводилась в несколько этапов. На первом этапе зонды тРНК гибриди-зовали с косьмдными клонами из библиотеки мтДНК (Библиотека получена Эейналовым O.A.). Далее космиды, дающие положительный сигнал при гибридизации с каким-либо из зондов тРНК, обрабатывали рестриктаза-ш BarnHI и Xbal и повторно гибридиаовали с зондом, для определения размера фрагмента, содержащего ген тРНК и построения рестриктной карты космиды. Нз последнем этапе те или иные г.осмиды, содержащие обвяе участки,состыковывались в более протяженные группы сцепления.

В результате проведенной работы нам удалось построить генетические и рестриктные карты нескольких участков ыитохондриального генома V. faba. Все белоккодирующие гены и гены рРНК локализованы на картах мтДНК Зейналовым 0. А. Мы приводим здесь эти данные, во-первых, для более легкой ориентации при описании организации генов тРНК, а во-в орых, митохондриальные генетические маркеры необходимы, особенно когда речь идет о хлоропластоподобных генах тРНК, чтобы не возникало сомнений относительно митохондриального происхождения клонированной ДНК.

2.2 Анализ космидных клонов.

Космидная библиотека мтДНК V. ГаЬа.с которой проводилась работа, включала 200 произвольно отобранных космил, названных cmVfl-200. Рекомбинантные клоны были подучены на основе вектора рНС79 и содержали вставки мтДНК размером 35-45 тпн.

Пэсле того как была проведена гибридизация космидной библиотеки со всеми 18 зондами тРНК, все космиды,дающие положительный сигнал, были распределены на группы, содержащие определенные гены тРНК. Пять зондов, которые не дали положительный сигнал с переварами ытДНК, не давали сигнал и с космидными клонами мтДНК V. faba.

Далее с помощью Саузерн-гибридизации космид, обработанных рест-риктазами BamHI и Xbal с зондами тРНК, были определены размеры субфрагментов, содержащих гены тРНК. Поскольку при конструировании биб-- лиотеки была использована методика достройки липких концов с последующим дотированием, размеры рестрикгных фрагментов, содержащих гены тРНК, либо соответствовали размерам фрагментов, определенных с помощью гибридизации переваров мтДНК (субфрагмент расположен внутри / клонированного участка), либо отличались от последних (фрагмент связан с вектором). Такое несоответствие потребовало дополнительных

анализов для определения размера фрагмента,содержащего ген тРНК в данной космиде. Анализы включали гибридизацию космидных переваров с вектором рНС79 для определения фрагментов, связанных с вектором, кроме этого мы использовали двойные перевары космидных клонов рест-риктазами: BamHI, Xbal, Sali и Pstl.

Уже на этом этапе работы стало очевидно, что некоторые гены тРНК в митохондриальном геноме V. faba не организованы в кластеры, а рассеяны по митохондриальному геному. Это прежде всего относится к генам, которые были локализованы в космидах,не содержащих каких-либо других генетических маркеров, как,например, trnP (космиды cmVf86 И 167), trnD (космиды cmVf3; 43 и 89), trnK (космида cmVf60) и trnH (космида cmVf92). А также к генам тРНК,локализованным в одной и той яе кос миде, но в разных рестриктных фрагментах (Табл.2).

Таблиц .2 Размеры (тпн) рестриктных фрагментов, содержащих гены

тРНК в некоторых космидах.

cmVf 63 | cmVf 60 | cmVf 93

cmVf 76

Ген

BamHI I Xbal | BamHI) Xbal I ВаяйП Xbal I BarrHIl Xbal

trnP | 0.7 J 20* 1

trnW | l.S | 20* |

trnQ |3 I 6.5 |

trnK | | |

trnH | | I

I | 5 | 8 | 3* | 14 1.2 | 5.5 | 5* | 20* | 8 I 8.5

5 I 5* |

5* | 20* I 8

8.5

trnD

* Звездочка указывает фрагменты,связанные с вектором.

äraP

tгай tJuB «лвШ

mflf traS <sst sigiÄ «гвЕ yrsSS «raB tnsS

tS_,1J¡i те „1 . ,„Г» 63. 7-5 , м , 10 .*.»,, ЗЛ , S ,

esaWm__■ , «aVM?____.

_-

1__emvtss

етУ119

■VICO

S5 48 «i 69 ЯП t20 MOnw

Рис. 1 Рестрияная карта по рестрикгаэе Xbal участка китохондриаль-тй 2НК V. faba, Пкфра указывает размеры ХЬаЬфрагкентов (тпн). Вккзу указана рвкомьинан^ныэ »юсшды, покрывающие данный участок.

ста1в+3 »гп*7 1гвв

а 8Л 1Л2Л 4.« 2.4 6.5 к? 9.3 12

СП./132

Ркс.2 Рестриктная карта участка митохондриальной ДНК V. ГаЬ& Цифры указывают размеры ХЬа!-фрагментов (тпн). Внизу указаны рекомбн-нантные космиды,покрывающие данный участок.

После того, как были построены рестриктные карты рекокбинантньш космид, а также рестриктные карты нескольких протяженных участков етДКК V.ГаЬа.ыы точно определили местонахождение генов тРНК (Рис.1; 2; 5; 6) Проведенное картирование подтвердило, что гены тРКК: 1гпК, 1гпУ. ЬгпО. 1гпН и по одной копии генов ЬгпР и ЬгпО в иитохоидрч-ааьном геноме V. ГаЬа не расположены в специфических кластерах и рассеяны по геному.

Особое внимание при анализе было уделено косыидаи, одердащкн хлоропластоподобные гены тРНК. Большинство из них содержало мкто-хондриальные генетические маркера И только одна косизда сиУГ92, содерштая 1гпН, не имела других генетических маркеров. 2.3. Организация генов тРНК в 8 тпн ВашН1-фрагменте. Особый интерес вдавая у нас ВаггШ-фрагмент размером 8 тпи (8з а табл. 1). Гкбриднэационный анализ показал, что этот фрагмент содержит 4 гена тРНХ, а ®гэюю: tгnШ, итпР, 1гпБ и trnD. Подобного сочетания генов тРНК до сих пор не было обнаружено в штохондряаль-ных геномах высших растений.

I 'ЛК

А

(га Ш (гп8 )пГ Ьг>0 еох!

ВВ ИХ В П Н В

П п. гч I I * г—1 . I . I п! п стг<

1пР

В н

I ,1

в

Рис.3 Рестриктные карты 8тпн ВаяН!-фрагмента (А) к 0,7 тпи Ваяй!-фрагмента (Б) митохондриального генома V.ГаЬа. Сайты рестрикции обозначены: В-ВатШ; Е-Есой!; Н-Н1п<Ш1; Х-ХЬа1.

в в вв и «пв» Б Си в

1 ■ " I—I .1 » «

1гаФ

ы

0}|0«е

Б

Рис.4 Рестриктные карты 3 тпн ВатН1 -фрагмента хлоропластног генома (А) и 1,8 тпн ВашН1-фрагмента митохондриального геном (Б) У.ГаЬа. В - ВатН1; Е - Есо(?1; М - Муа1; Ве - В^П; Вс Всп1.

Мы субклонировали 8 тпн BamHI-Фрагмент из космиды cmVfl79 в 1лазмидный вектор pUC18 и провели его рестрикционное и генетическое сартирование в составе рекомбинантной плазмиды ртВ8 (Рис. ЗА). Как южно видеть на рестриктной карте этого фрагмента,гены тРНК распо-южены на всем протяжении фрагмента и не образуют специфических «астеров.

2.4 Общая организация генов тРНК в митохондриальном геноме Vicia faba.

Как было показано для митохондриальных геномов пшеницы и куку-эузы CGrienenber^er J. M. et al., 19873, гены тРНК не образуют специфических генных кластеров, характерных для митохондриальных геномов «квотных и грибов, и рассеяны по всему геному.

При проведении гибридизационных анализов мы обнаружили в мтДНК кормовых бобов три рестриктных фрагмента, содержащих несколько газов тРНК, которые могли быть организованы в генный кластер. Это 2,4 гпн Xbal-фрагмент и два BamHI-фраг^нта, размером 8 и 3,8 тпн (Taû-сица 1>. Xbal- фрагмент размером 2,4 тпн содержит гены trnM2 и trnE. ВатН1-фрагмент размером 3,8 тпн (20 тпн ХЬаЬфраг-

¡4?нт) содержит вторую копию гена trnMS, а также гены trnN и tmY (Рис.1). Фрагменты со сходной организацией генов тРНК были обнару-кены в митохондриальных геномах сои и фасоли, где эти гены располо-кены на расстоянии 300-1000 пн друг от друга tVlntz et al., 1988; Btrd Sh. et al., 19891. Учитывая определенное сходство в оганизации генов тРНК в митохондриальных геномах двудольных растений ГJzuchi 5. et al., I990d), мы полагаем, что в митохондриальном геноме Vicia ГаЬа эти гены тРНК также не кластрированы. Анализ генов в 8тпн BairHl- фрагменте показа», что гены тРНК расположены отдельно друг от друга на всем протяжении фрагмента. Учитывая все вышесказанное.

мы считаем, что гены тРНК в митохондриальном геноме кормовых бобов не образуют специфических кластеров и, подобно генам тРНК пшеницы н кукурузы, рассеяны по всему геному. В то же время мы не обнаружили какого-либо сходства во взаиморасположении генов тРНК в митохондри-альных геномах кукурузы и V. faba.

2. 5 Копийность генов тРНК в митохондриальном геноме V. faba.

Известно, что некоторые гены тРНК могут присутствовать в нескольких копиях на митохондриальную хромосому (master chromosoma). Причем эти гены могут находится либо в составе протяженных повторов. как,например, гены trnM, trnD, trnP, trnN и trnE в 14 тпн инвертированном повторе митохондриального генома кукурузt [Grienenberger J. И et al. ,1987), либо повтор может включать толькс кодирующую последовательность гена и ближайшие фланкирующие участки, как в случае двух копий гена trnP в митохондриальном геноай пиеницы [Joyce P. and Gray М. ,1987). О копийности генов тРНК в кя-тохондриальньк геномах двудольных растений ничего не известно.

Как можно видеть из таблицы 1, четыре гена тРНК - trnKE, trnP, trnH и trnD при гибридизационноы анализе переваров мтДНК давали положительные сигналы в нескольких рестриктных фрагментах. Это заставило нас предположить, что упомянутые гены представлены нескольким копиями в митохондриальном геноме V. faba Нам удалось построил рестриктную карту по рестриктазе Xbal участка митохондриального генома V. faba протяженностью около .140 тпн и локализовать на ней дв; копии гена trntffi на расстоянии около 50 тпн друг от друга,и две копии гена trnD на расстоянии около 80 тпн друг от друга. Исходя к; того, чтб одна копия trnXE находится в 2.4 тпн ХЬа1-фрагменте, который, кроме этого гена,содержит ген trnE,можно утверждать, что размер повтора, содержапего ген trniS, не превызает 2. 4 тпн.

Улоролластолодобные гены trnM2 были найдены в митохондриаль-ных геномах кукурузы tSangare et al.. 1989], сои и арабидопсиса [Wintz H., et al., 1988]. Причем y кукурузы и сои, как было показано, эти гены присутствуют в одной копии на митохондриальный геном. Таким образом,копийность генов тРНК в митохондриальный геномах может различаться у растений дата в пределах одного семейства. Вели придерживаться гипотезы, что инсерция хлоропластной последовательности. содержащей ген trnM2 в митохондриальный геном,произошла на ранних стадиях эволюции, до разделения двудольных и однодольных растений [Wintz H et al., 1988), тогда надо полагать, что дупликация этого гена в митохондриальном геноме V. ОЬа-более позднее эволюционное событие.

Нам не удалось точно ответить на вопрос о копийности гена trnD з митохондриальном геноме V. faba. Две копии trnD мы локализовали на расстоянии около 80 тпн друг от друга (Рис.1 и ЗА). Размер повтора, содержащего эти гены,находится в пределах 1,2 тпн. Возможно, что в митохондриальном геноме кормоьых бобов существует третья копия гена trnD в BamHI-фрагменте размером 6 тпн.

Первую копи» гена trrvP мы локализовали в 8 тпн ВапШ-фраг менте (8.5 тпн Xbal-фрагмент) (Рис.1). Шсле того как 8 тпн ВатН1-фраг-мент был субклонирован га космиды cmVflTg и была построена его рес-трнктная и генетическая карта, стало ясно, что первая копи.я гена trnP расположена между ге- зш trnS и trnD в HtndII¡-фрагменте размером 0.7 тпн (Рис.ЗА). Вторая копия гена trnP в 6.7 тпн Xbai фрагменте была локализована в нескольких участках митохондриального генома и имела различное окружение (Рис.5). В случае космиды cmVfl67 это были ген сохIII и orflBS, а в случае космиды cmVf86 химерный ген coxIl-orfl82. По-видимому, эти участки мгДНК принадлежат к различным типам митохондриального генома Y. faba [Зейнадов О. А. ,19913.

coxJII огПв2 troP

, 18_13.5 и 11.3 I 6.7 ,

t_cmVtl67_,

U

coxU-orfl»2 IrnP

11.5 i 6.7 i 12_, 9.3

emVlM

Рис.5 рестртсгные карты по рестрикгазе Xbal двух участков ш тохондриального генома V. faba, соддержащих ген trnP i про клонированных в космидах cmVfl67 и cmVf86. Цифры указывают размер Xbal-фрагментов в тпн.

Несмотря на то, что мы не локализовали обе копии trnP на одной рес-триктной карте, вполне очевидно, исходя из различного генетического окружения, что ген trrP представлен двумя копиями на основную мито-хондриальную хромосому в обоих типах митохондриального генома.

Ыы субклонировали 0.7 тпн ВалШ-фрагменты, включающие вторую копию гена trnP из космид cmVfl67 и cmVf86 в плазмидный вектор pUCl8 и провели рестрикционное картирование двух рекомбинантных плазыид,названных рВ167 и рбЗб. Оказалось, что в обоих случаях ген trnP расположен в ндентичшх рестриктных фрагментах (Рис. ЗБ). Как мижно видеть на рестриктной карте фрагмента, ген trnP находится внутри 330 пн Hind III-EcoRI-субфрагмента. Повтор, включающий две копии гена trnP в 0,7 и 8 тпн BamHI-фрагментах. такт,! образом, заключен в пределах 330 пн и, возможно, включает Hind III caflr (Рис.3).

Как было показано в недавней работе [Joyce P., et al., 1988], юявление двух копий гена trnP в митохондриальном геноме пшеницы :вязано с внутригеномной сайтспецифической рекомбинацией и последу-шей амплификацией химерной последовательности и ее фиксацией в митохондриальном геноме. Поскольку размер повтора,содержащего ген тпР в митохондриальном геноме V. faba,примерно равен размеру пов-ора в митохондриальном геноме пшеницы, и,кроме этого, недалеко от |ДНого из генов trnP в митохондриальном геноме V. faba находится хлорная последовательность coxII-orfl82 (Рис.5), вполне вероятно, что 'двоение гена trnP в обоих случаях произошло с помощью одного меха-:изма.

Хлоропластоподобный ген trnH мы обнаружили в трех космидах -:mVf76, cmVf92 и cmVf93 (Рис.6). Космиды cmVf93 и cmVf76 содержат в Ьа1-фрагментах вместе с геном trnH две копии гена atpA (Зейналов А.. 1991]. В космиде cmVfg2 не обнаружено других генетических вркеров, кроме гена trnH. Как можно видеть на рис. 6,ген trnH распо-¡ожен в различных л о размеру рестриктных фрагментах, но в одинаковы генетическом окружении (космиды cmVf93, cmVf76). С другой сто-оны.космида cmVf35, содержащая та же гены, что и космиды cmVf93 и mVfTS, не содержит ген trnH (Рис.1). Такая ситуация возможна,если ен trnH фланкирует рекомбинационно активный повтор, вклстающий ген .tpA. В результате рекомбинаций, происходящих по этому повтору, ген гпН оказывается в различных по размеру Xbal-фрагментах. Рекомбина-ионные перестройки, по-видимому, не затрагивают BamHI-фрагмент, одержащий trnH, и его размеры таким образом либо не изменяются, ли-о изменения незначительны и визуально не различимы при гибридиза-ии. Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что ген trnH представлен дной копией на основную митохондриальную хромосому и находится в частке, флатеирующем ре комбинационно активный повтор.

trnP trnS

trnO «'PA traH 8.3 ,5.2, , « , 14 _cmvrn

troP trnS

trnlll traD »tpA troll „ 6 , 8.5 ,5.2. , >4 ,_craV(76

Рис. б Рестриктные карты по рестриктазе Xbal двух участков ми-тохонкриального генома V. faba, содержащих ген trnH j проклонированных в космидах cmVf93 и cmVf76. Цифры указывают размер ХЬаЬфрагментов в тпн.

3. Гибридизационный анализ хлоропласткой ДНК кормовых бобов.

В хлоропластном геноме табака, полная первичная последовател ность которого известна,обнаружено 37 генов тРНК CShinozaki е ai. ,1986]. В хлоропластном геноме V. faba с помогаю гибридизационно го анализа с меченьыми тРНК было ло!сализовано 25 генов тРН CMubumblla et al. ,1984].

Одновременно с гибридизационныы анализом ьггДНК мы гибридкзовал зонды тРНК с BaniiI, Pstl и Sall-переварамн хлоропластной ДН V. faba. Анализируя результаты гибридизации, мы установили, что вс сигналы соответствует ранее обнаружении генам тРНК. Кроме этого, и локализовали два новых гена тРНК. Это ген TPHKCys (GCA), который ы обнаружили в 20 тпн Pstl-фрагменте (фрагмент Р2 на рестрюсгной кар те хлоропл^стного генома V. faba [Ко К., et al, 1984]). Иге TPHKSer (GGA), который мы локализовали в 10 тпн Pst I-фрагмент (фрагмент Рб на рестрютной карте хлорспластнсго генома).

4. Сравнительный анализ митохондрмального и хлоропдастного фрагментов содержащих ген тРНКТгр.

Как было показано, митохондриальная и хлоропластная тРНКТгр фа-оли (Phaseolus vu 1 gratis) очень сходны по своей первичной структуре имеют 98Х гомологии С Maréchal L ,et al. ,1985). Хлоропластоподоб-ый ген тРНКТгр в митохондриях кукурузы находится в 2,3 тпн лицевой плазмиде вместе с геном тРНКРго, в то время как у всех ближних одственников кукурузы эти гены расположены в главной митохондри-льной хромосоме CLeon Р.et al. ,19891. То обстоятельство, что 2,3 пн плазмида имеет 170 лн инвертированные повторы на своих концах, елает ее сходной с транспозонами бактерий и не исключена возмож-ость транспозиции этой плазмиды в различные участки митохондриаль-ой ДНК.

Хлоропластоподобный ген trnW в митохондриальном геноме V. faba ыл локализован нами в 2.4 тпн ХЬа1-фрагменте между генами trnQ и гп18+5 (Рис. 2). В хлоропластном геноме V. faba ген trnW, как былз оказано ранее, расположен в 35 тпн Pstl-фрагменте рядом с геном sbE tMubumbila et al. ,1984), Мы провели сравнительный рестриктный нализ последовательностей,содержащих гены trnW из хдоропластного и итохондриального генома V. faba. Ддя этого 1,85 тпн BairHI фрагмент, эдеряащий митохондриальн1,й ген trnW, был суСклонирован из космиды mVfS2 в плазмидный вектор pUC18. Полученная таким образом рекомби-знтная космида ртВ37 была далее использована для картирования 1.85 amHI-фрагмент а.

Для рестрикционного картирования участка хлоропластной ДНК.со-гряааего ген trnV, были получены BamHI и PstI-библиотеки хлори опасной ДНК V. faba. С помощью гибридизации с зондом trnW ыы обнаругиош

несколько клонов, содержащих вставку хлоропластной ДНК с геном tmW. Мы провели рестриктный анализ рекомбинантной плазмиды pcBlOl, содержащей вставку хлоропластной ДНК размером Зтпн. На рис. 4 представлены рестриктные карты двух ВашНЬфрагментов из митохондриального и хлоропластного геномов, содержащие гены trnV. Сравнительный анализ двух последовательностей показывает, что участков протяженной гомологии в этих фрагментах нет. По-видимому, последовательность хлоропластного происхождения в митохондриальном геноме V. faba включает в себя только кодирующий участок гена и, возможно, ближние фланкирующие последовательности. Такая картина характерна для хло-ропластоподобных генов тРНК, которые транскрибируются в митохондриях.

ВЫВОДЫ

1. В митохондриальном геноме V. faba обнаружено к локализовано 13 генов тРНК, 9 из них собственно митохондриальные гены - trnMl, trnS(GCU), trnP, trnD, trnE, trnY, trnQ, trnK, trnG; a остальные четыре: trnM2, trnN, trnH и trnW - хлоропластоподобные гены тРНК

2. Гены trnP, trnD и trnQ впервые обнаружены и локализованы в митохондриальном геноме двудольного растения.

3. Гены trnS(QGA), trnS(UGA), trnC, trnFl и trnF2 не обнаружены в митохондриальном геноме Vicia faba

4. Шстроены рестриктные карты по рестриктазе Xbal нескольких участков митохондриального генома Vicia faba,на которых ло-кализбваны гены тРНК.

5. Гены тРН" в митохондриальном геноме V. faba не образуют специфических кластеров и рассеяны по всему геному.

6. Не обнаружено какого-либо сходства во взаимной организации ге-

нов тРНК в митохондриальных геномах кукурузы и кормовых бобов.

7. Гены trnM2, trnD и trnP представлены в митохондриальном геноме V. faba несколькими копиями.

8. В хлоропластном геноме V. faba локализовано два новых гена тРНК: trnC (ОСА) в 20 тпн Pstl-фрагменте и trnS GGA) в 10 тпн Pstl фрагменте.

9. Хлоропластная последовательность, содержащая ген trnW в митохондриальном геноме V. faba,включает только кодирующую последовательность гена и, возможно, ближайшие фланкирующие участки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зейналов О. А. .Кожемякин А. Е .Негрук Е И. Особенности структурной организации митохондриального генома Vicia faba // Тезисы докладов Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, стр. 97. Звенигород, 1989.

2. • Кожемякин (В.,, Зейналов 0. А., Йэгрук В. И. Характеристика генов тРНК в.митохондриальном геноме V. faba // Физиология растений, 1991, Т. 38, N 4,

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ тРНК 3 МГГОХОпДРИАЛЬНОА! ГЕНОМЕ VICIA FABA. и (Автореферат)

Подписано к печати 10.06.91 Формат 60x90 I/I6 1,5 п.л. 7ч.изд.л. 1,3 Тирая 100 Заказ 723_

Ротапринт ,\1АСИ(ВТУЗ-ЗШ1), 109280, Москва, Автозаводская, 16

¿ШЕМЯКИН АЛЕКСАНДР ВИТАЛЬЕВИЧ