Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.Cerevisiae

Кузьменко, Антон Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.Cerevisiae
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.Cerevisiae"

005534012

На правах рукописи

-Ь 1

Кузьменко Антон Викторович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ТРАНСЛЯЦИИ ДРОЖЖЕЙ

5. СЕШУМАЕ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

3 ОКТ 2013

005534012

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в Институте технологии Тартуского университета (Эстония).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Колб Вячеслав Адамович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук, лаборатория механизмов биосинтеза белка, ведущий научный сотрудник,

Дмитриев Сергей Евгеньевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, отдел химии и биохимии нуклеопротеидов, лаборатория регуляции синтеза белка, старший научный сотрудник.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Защита состоится 24 октября 2013 г. в 12-00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 1119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан 23 сентября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

Каменский Пётр Андреевич,

кандидат химических наук

Гаврилюк Василий Васильевич.

Актуальность проблемы

Митохондрии эукариотических клеток существуют на протяжении более одного миллиарда лет, возникнув от предковой а-протеобактерии, близкой к современной Rickettsia prowazekii. Отголоском эндосимбиотического происхождения митохондрий является их собственный геном, а также аппарат его реализации и поддержания. В ходе продолжающегося по сей день двустороннего взаимодействия с ядерным геномом клетки-хозяина многие митохондриальные гены были перенесены в ядро, однако небольшая их часть осталась в составе ДНК органеллы. Трансляция митохондриальных матричных РНК осуществляется собственным, уникальным аппаратом биосинтеза белка и требует тонкой координации работы ядерного и митохондриального геномов.

На сегодняшний день многие аспекты процесса митохондриальной трансляции остаются изученными в недостаточной степени. Во многом это связано с тем, что полностью функциональную систему митохондриальной трансляции, способную к синтезу на природных матрицах, до сих пор не удалось реконструировать in vitro ни в одной лаборатории мира. Тем не менее, несмотря на всевозможные трудности, за последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в нашем понимании феномена биосинтеза белка в митохондриях.

В своих основных чертах система митохондриальной трансляции построена по прокариотическому плану и специализирована на синтезе крайне гидрофобных полипептидов, закодированных в составе ДНК органеллы. Процесс сложным образом организован на двумерной поверхности внутренней мембраны в области крист и не зависит от электрохимического потенциала. Основной тенденцией в эволюции митохондриальных рибосом была редукция сегментов рибосомальных РНК малой и большой субъединиц, сопровождающаяся высоким темпом изменения и перестройки белковых компонентов. В разных группах

организмов этот процесс шёл в соответствии с метаболической специализацией клетки, что привело к появлению наблюдаемого сегодня разнообразия миторибосом. Несмотря на это, все консервативные элементы рРНК, входящие в состав функционального ядра органеллы, сохранились.

Стадия инициации митохондриальной трансляции характеризуется, пожалуй, наибольшим количеством отличий от аналогичного этапа в бактериальных клетках. В последние годы стало ясно, что эти отличия проявляются как на механистическом уровне, так и на уровне набора белковых факторов, участвующих в данном процессе. Наше внимание привлёк процесс инициации трансляции в митохондриях дрожжей, поскольку именно у данной группы эукариот он отличается от прокариотической системы в наибольшей степени. Во-первых, до сих пор не понятен механизм, при помощи которого стартовый кодон мРНК позиционируется в Р-сайте миторибосомы пекарских дрожжей. Во-вторых, сахаромицеты обладают наибольшим количеством специфических белковых активаторов, абсолютно необходимых для инициации трансляции митохондриальных мРНК. В-третьих, в дрожжевых митохондриях не был обнаружен один из квазиуниверсальных белковых факторов инициации трансляции в органеллах, а именно фактор инициации 3 (1РЗт1:). С уверенностью можно заявить, что без ГРЗпй невозможна эффективная работа аппарата трансляции. В данной работе мы предприняли попытку найти ранее неидентифицированный ШЗпй дрожжей 5. сегеу1$1ае.

Цель работы и основные задачи исследования

Целью данной работы являлся поиск, идентификация и функциональная характеристика третьего фактора митохондриальной трансляции дрожжей Еасскаготусеъ сегеУ1з1ае.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Поиск белков-кандидатов на роль митохондриального фактора инициации трансляции 3 (IF3mt) пекарских дрожжей методами in silico.

2. В случае обнаружения белков-кандидатов - экспериментальное подтверждение выполнения ими функции IF3mt.

3. Функциональная характеристика IF3mt пекарских дрожжей:

a. в гетерологической системе in vitro

b. в контексте живой клетки (in vivo).

Научная новизна: В рамках настоящей работы был впервые идентифицирован митохондриальный фактор инициации трансляции 3 (IF3mt) пекарских дрожжей - белок Aim23p. Охарактеризована функциональная активность Aim23p в гетерологической системе in vitro с 70S рибосомами Е. coli. Исследования эффекта делеции по гену AIM23 в системе in vivo позволили обнаружить интересный дефект роста клеток при отсутствии IF3mt. Оказалось, что удаление Aim23p приводит к замедлению скорости роста клеток на начальном этапе при переходе на утилизацию несбраживаемых источников углерода, причиной которого является временная потеря мембранного потенциала. При более тщательном анализе данного феномена был обнаружен ранее не охарактеризованный механизм, позволяющий клеткам пекарских дрожжей адаптироваться к отсутствию митохондриального фактора трансляции и восстанавливать Д\|/. Было показано, что важную роль в данном процессе играет белок Тша19р, повышение количества которого является обязательным условием описанной выше адаптации клеток. Удаление Aim23p необычным образом сказывается на митохондриальной трансляции, приводя к нетипичной разбалансировке биосинтеза белка.

Теоретическая и практическая ценность: В работе получены новые данные, проливающие свет на фундаментальные механизмы процесса митохондриальной трансляции. Эти данные впоследствии могут быть

использованы для создания системы митохондриальной трансляции in vitro, что, в свою очередь, крайне важно для разработки унифицированной технологии оценки митохондриальной токсичности антибиотиков, которая в настоящее время отсутствует.

Апробация работы: Результаты диссертации были представлены на заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ, а также на следующих конференциях: конференция ЕМВО «Синтез белка и контроль трансляции» (Хайдельберг, Германия, 7-11 сентября 2011 года) российско-французская конференция «Химия в молекулярной биологии» (Москва, Россия, 17-18 декабря 2011 года); конференция «Митохондрии в жизни, смерти и болезнях» (Ираклион, Греция, 9-13 мая 2012 года); конференция Gordon Research Conference «Митохондрии и хлоропласты» (Смитфилд, США, 8-13 июля 2012 года).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, материалов российских и международных конференций - 3.

Структура и объем работы: Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 152 ссылки. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы и 25 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Aim23p — ортолог митохондриального фактора инициации трансляции 3

Основным препятствием на пути поиска гомологов IF3 в митохондриальных системах является высокая степень дивергенции данного

фактора. По этой причине мы решили провести систематический виртуальный поиск с применением чувствительного алгоритма РБЫЛаБЪ а в качестве запроса использовали последовательность ШЗпй делящихся дрожжей ЗсЫгоБассЪаготусея ротЬе. Среди обнаруженных полипептидов наше внимание привлёк белок представителей группы Басскготус^еБ -А1т23р, у БассНаготусея сеге^шьае кодируемый открытой рамкой считывания УЛЛ31с. А1ш23р был обнаружен в составе митохондриального протеома дрожжей в ходе глобального скрининга. Согласно данным крупномасштабного полногеномного исследования, делеция по гену А1М23 приводит к серьёзным дефектам дыхания, что указывает на важную роль данного белка в функционировании митохондрий. На момент начала нашей работы белку А1ш23р не приписывалось никаких специфических функций. Анализируя первичную последовательность А1т23р, мы выяснили, что для него характерно типичное для всех описанных к данному моменту членов семейства ШЗ обогащение остатками положительно заряженных аминокислот, что свидетельствует о возможном взаимодействии данного белка с отрицательно заряженными молекулами РНК. Ещё одно косвенное подтверждение участия А1т23р в функционировании митохондрий — наличие предсказываемого с высокой вероятностью (83.9%) №концевого сигнала митохондриальной локализации. Согласно полученным данным, этот сигнал в случае А1ш23р имеет длину 32 аминокислотных остатка. Во всех дальнейших экспериментах в качестве функциональной формы белка мы использовали именно эту версию А1ш23р, лишённую транзитного пептида.

Доказательство митохондриальной функции А1т23р

На первом этапе работы было решено проверить, как клетки дрожжей 5. сегеуи/ае ведут себя в отсутствии гена А1М23, и тем самым подтвердить его митохондриальную функцию.

Рост клеток 5. сегеч1$1ае на средах с несбраживаемыми источниками углерода (глицерин, глицерин/этанол, лактат) является важным показателем

нормального функционирования митохондрий, так как энергетические эквиваленты при их утилизации получаются только лишь посредством окислительных процессов в митохондриях.

К нашему удивлению, клоны штамма А1М23Д оказались способными к росту на среде с несбраживаемым источником углерода, что не вполне согласуется с данными, приведёнными в литературе к тому моменту (Рис. 1).

Рис. 1. Фенотип клонов дикого типа и с делецией по гену AIM23 на среде YPGly после 4 дней роста при 30°С. Мутантные клоны отмечены знаком *

Было замечено, что клетки с делецией по гену AIM23 растут хуже, чем клетки дикого типа: пророст клеток без мутации становится видимым уже на второй день, а мутантных клеток - лишь на четвёртый (данные не представлены) Мы проанализировали характер роста обоих штаммов на различных «дыхательных» средах полуколичественным методом. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.

Действительно, штамм AIM23A проявляет значительную задержку в росте на средах с несбраживаемыми источниками углерода по сравнению со штаммом дикого типа. Видимые колонии мутантного штамма наблюдаются лишь на четвёртый день эксперимента, в то время как у дикого типа они вполне заметны уже на второй день. Тем не менее, на четвёртый день культивирования клетки штамма А1М23Д начинают догонять в росте клетки дикого типа. При этом мы не наблюдали отличия в скорости роста между рассматриваемыми штаммами на среде YPD, содержащей 2% глюкозы

(данные не представлены). А1М23Д

YPGly

А1М23Д

YPP

Рис. 2. Фенотипы штаммов с делецией по гену AIM23 (AIM23AJ и дикого типа (WT) на средах YPGly и YPP через 2, 3 и 4 дня роста при температуре 30°С. Цифры между панелей указывают значение ODeoo в нанесённых разведениях

Чтобы подтвердить гипотезу о том, что Aim23p является ни чем иным как IF3mt, мы решили провести эксперимент по функциональной комплементации гена AIM23 в системе in vivo. В качестве «эталонных» были выбраны гены, кодирующие IF3 Е. coli, а также IF3mt S. pombe и Н. sapiens. Соответствующие дрожжевые штаммы (А1М23Л_рЕс, AIM23A_pSp и AIM23A_pHs) были получены путём трансформации штамма Y21294 соответствующими плазмидами с последующей индукцией споруляции, разделением тетрад и отбором нужных клонов. У полученных мутантных штаммов был проанализирован характер роста на дыхательной среде YPGly. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 3. Хорошо видно, что присутствие в клетках с делецией по гену AIM23 человеческого IF3mt, ортолога Aim23p из митохондрий делящихся дрожжей и, в меньшей степени, эубактериального фактора приводит к восстановлению митохондриальной функции, что выражается в сопоставимой с диким типом скоростью роста на среде с несбраживаемым источником углерода. Как и прежде, мы не наблюдали видимого отличия в скорости роста между рассматриваемыми штаммами на среде YPD (данные не представлены). Полученные результаты

полностью подтверждают гипотезу о том, что Ацп23р функциональным эквивалентом 1НЗгти в клетках 5. cerevisiae.

является

0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001

А1М23Д

А1М23Д_рЕс А1М23Д_рНз

А1М23Д_р5р А1М23Д WT

Рис. 3. Фенотипы штаммов А1М23А, А1М23АА1М23А_рН8, А1М23А_рЕс и дикого типа (\¥Т) на среде УРй1у через 2 и 3 дня роста при температуре 30°С. Цифры над панелями указывают значение ОО^оо в нанесённых разведениях

Физиологические эффекты, вызываемые делецией по гену А1М23

Мы решили подробнее разобраться с тем, что происходит с митохондриями Я. сегет81ае в момент перехода к утилизации несбраживаемых источников углерода. Было решено проанализировать мембранный потенциал митохондрий, а также измерить дыхание клеток штамма А1М23Д в сравнении с диким типом. Мембранный потенциал оценивали при помощи флуоресцентной микроскопии клеток, обработанных родамином 123 (Рис. 4В), и проточной цитометрией клеток, окрашенных ОЮС6 (Рис. 4С). Родамин 123 - это катионный липофильный флуоресцентный краситель, который распределяется вдоль внутренней

2 дня 3 дня

0.1 0.01 0.001

3 дня

митохондриальной мембраны пропорционально Д\|/. Отсутствие мембранного потенциала ведёт к утрате сигнала флуоресценции красителя. На рисунке 4В показана типичная картина, наблюдаемая в подавляющем большинстве образцов: в клетках штамма А1М23Д сигнал флуоресценции родамина 123 не детектируется, но в тоже время присутствие ШЗпй 5. ротЬе восстанавливает сигнал до уровня, сопоставимого с диким типом. ВЮСб - это представитель липофильных карбоцианинов, специфически окрашивающий энергизованные митохондрии в низких концентрациях. Результаты проточной цитометрии (Рис. 4С) полностью подтверждают данные флуоресцентной микроскопии: средняя интенсивность флуоресценции в клетках А1М23Д на один порядок ниже, чем в диком типе и примерно на полпорядка ниже, чем в штамме А1М23Д_р8р.

Для того, чтобы оценить эффективность клеточного дыхания, мы измерили скорость поглощение клетками кислорода полярографическим методом при помощи электрода Кларка (Рис. 4А). Базальный уровень клеточного дыхания в штаммах А1М23Д и А1М23Д_р8р примерно в два раза ниже по сравнению с диким типом (Таблица 1). Добавление к образцам разобщающего агента ИССР (карбонилцианид-4-трифторметоксифенил-гидразон) позволяет оценить максимальную скорость потребления кислорода в данных условиях, как это наблюдается в случае дикого типа. Оказалось, что клетки штамма А1М23Д практически не реагируют на стимуляцию БССР, в то время как клетки А1М23Д_рБр демонстрируют данный ответ. Крайне любопытной оказалась реакция клеток с делецией по гену А1М23 к ингибированию цианистым калием. В норме данный агент вызывает полную остановку дыхания, что и наблюдается в случае клеток дикого типа и штамма А1М23Д_р8р. Однако скорость поглощения кислорода клетками А1М23Д остаётся практически неизменной. Это говорит о том, что истинное дыхание наблюдается лишь в случае дикого типа и штамма А1М23Д_р8р. Числовые результаты измерения клеточного дыхания представлены в Таблице 1.

DIC FL

100 200 300

time, min

* в

с 100

10 10 FITC-A

Рис. 4. Влияние делеции по гену AIM23 на митохондриальную функцию in vivo. (А) Скорость поглощения клетками кислорода, измеренная при помощи электрода Кларка; (В) Флуоресцентная микроскопия клеток, окрашенных родамином 123; (С) Проточная цитометрия клеток, окрашенных DiOCó; DIC - дифференциальный интерференционный контраст, FL -канал флуоресценции

Таблица 1. Скорости поглощения кислорода клетками Б. сегеу'тае (пикомоль/мин на 106 клеток) в различных условиях.

Условия WT AIM23A AIM23A_pSp

Норма 49 26 29

FCCP 92 29 58

KCN 2 18 2

Итак, делеция по гену AIM23 приводит к практически полной диссипации Д\|/. При отсутствии разницы потенциалов на внутренней митохондриальной мембране нарушается работа электрон-транспортной цепи и синтез АТФ, необходимый клеткам для роста на средах с несбраживаемыми источниками углерода. Это приводит к серьёзному дефекту дыхания. Экспрессия IF3mt делящихся дрожжей S. pombe в значительной степени нивелирует наблюдаемые нарушения, что в очередной раз подтверждает результаты эксперимента по комплементации AIM23 in vivo.

Характеристика Aim23p in vitro

Одной из характерных особенностей митохондриальных факторов инициации трансляции 3 является их способность стимулировать сборку инициаторного комплекса на малой субъединице при наличии в системе мРНК и IF2mt:GTP, что в свою очередь определяется активной диссоциацией рибосом на составляющие субъединицы. Мы решили проверить, способен ли Aim23p стимулировать развал рибосом на субъединицы. Ввиду отсутствия рабочего протокола выделения миторибосом из дрожжей, а также в связи со сложностями, связанными с выделением 55S частиц из печени быка или свиньи, мы решили провести эксперименты в гетерологической системе, используя в качестве модели 70S рибосомы Е. coli. Необходимо отметить, что активность инициаторных факторов в таких условиях непредсказуема: к примеру, экспериментально показано, что IF3 Е. coli проявляет активность на

55S рибосомах, a IF2 - нет. В то же время, IF2mt вполне активен на эубактериальных рибосомах. Результаты нашего эксперимента показаны на Рис. 5В. Оказалось, что даже 20-кратный молярный избыток Aim23p не приводит к сколь-либо заметной диссоциации рибосом, в то время как 10-кратный излишек бактериального фактора стимулирует полный развал 70S рибосом на большую и малую субъединицы. В качестве контроля показан профиль необработанных бактериальных рибосом. Тот факт, что Aim23p не проявляет активности по отношению к прокариотической рибосоме, можно объяснить двумя причинами: либо Aim23p не способен связываться с 30S субъединицей per se, либо из-за отличий в физико-химических свойствах 70S рибосом от миторибосом Aim23p не проявляет своей активности. В связи с этим мы попытались ответить на вопрос, способен ли Aim23p специфически связываться с малой рибосомальной субъединицей Е. coli. Как видно из Рис. 5А, Aim23p сходит с колонки в той же фракции, что и малая 30S субъединица. Аналогичная картина наблюдаетсяи в случае эубактериального IF3.

1F3 + 30S

IF3

Aim23 + 30S

Aim23

Q О

IF3 30S

2 3 4 Fraction nr

С о <o

Ф g

s i-

untreated

Aim23 (1:20)

|-Aim23{1:10)

- IF3 (1:10)

top

g g g bottom

Рис. 5. Aim23p частично активен в гетерологической системе с 70S рибосомами. Связывание Aim23 с малой рибосомальной субъединицей (А) и диссоциация 70S рибосом (В). Untreated - отрицательный контроль (необработанные белками 70S рибосомы); top -верхняя часть градиента; bottom — нижняя часть градиента; fraction nr - номер фракции.

В отсутствие малой субъединицы оба инициаторных фактора задерживаются на колонке и элюируются позднее. Таким образом мы установили, что Aim23p специфически связывается с 30S субъединицей прокариот, но в то же время не способен активно стимулировать диссоциацию 70S рибосом.

Клетки с делецией по гену AIM23 адаптируются к росту на средах с несбраживаемыми источниками углерода

Нас заинтересовал феномен задержки роста клеток с делецией по гену AIM23 на средах с несбраживаемыми источниками углерода. Мы предположили, что в данной ситуации имеет место некий адаптационный механизм, который позволяет клеткам обходится без IF3mt.

Известно, что нарушения митохондриальной функции приводят к тому, что в клетке запускаются особые механизмы, направленные на устранение появившихся дефектов, в частности, на перестройку метаболизма клетки, компенсирующую митохондриальную недостаточность. На данный момент описано несколько подобных сигнальных каскадов, однако наиболее изученным и часто встречающимся из них является так называемый ретроградный ответ (RTG response). В результате включения данного механизма происходит активация транскрипции целой группы ядерных генов, кодирующих ряд ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот и других метаболических путей. Классическим признаком включения ретроградного ответа является повышение уровня экспрессии пероксисомальной изоформы цитратсинтазы CIT2.

Мы решили проверить, не является ли ретроградный ответ причиной наблюдаемой нами адаптации. С этой целью методом количественного ПЦР-анализа было проведено сравнение уровня экспрессии маркерного гена CIT2 в клетках дикого типа и штамма AIM23A. Результат оказался довольно неожиданным: уровень экспрессии CIT2 в штамме AIM23A примерно на 10% ниже по сравнению с диким типом (данные представлены ниже, на Рис. 11). Последние исследования свидетельствуют о том, что именно диссипация Дц/

служит своего рода спусковым механизмом и активирует ретроградный ответ. Полученные нами ранее результаты указывают на резкое падение Д\|/ при отсутствии в геноме функционального аллеля AIM23. Судя по всему, ретроградный ответ не задействован в процессе адаптации клеток с делецией по гену AIM23; вместо этого в данном случае используются какие-то иные механизмы.

В литературе описано множество случаев, когда нарушения в компонентах аппарата митохондриальной трансляции или системы поддержания митогенома дрожжей приводили к весьма интересному феномену: увеличению репликационной продолжительности жизни - RLS (от англ. Replicative Life Span). Термин RLS относится к количеству дочерних клеток, получаемому в ходе делений материнской клетки до момента старения. Мы решили проанализировать RLS в штамме AIM23A в сравнении с диким типом. Как оказалось, в обоих штаммах количество делений, после которого половина клеток сохраняет жизнеспособность, одинаково и приблизительно равно 25 (Рис. 6).

Совокупность полученных результатов указывает на то, что при переключении метаболизма на несбраживаемые источники углерода в клетках штамма AIM23A имеет место некий ранее не охарактеризованный механизм, помогающий дрожжевой клетке адаптироваться при отсутствии IF3mt.

Присутствие в среде глюкозы подавляет экспрессию большой группы генов, в том числе закодированных в митохондриальной ДНК. Данный феноменполучил название «глюкозная репрессия». Интересно, что в зависимости от конкретного генотипа различные штаммы дрожжей по-разному реагируют на смену источника углерода. В частности, штамм BY4743, на основе которого создана коллекция делетационных мутантов EUROSCARF, содержит аллельный вариант митохондриальной ДНК-полимеразы, ассоциированный с увеличенной частотой возникновения клеток с фенотипом «petite».

divisions

Рис. 6. Анализ RLS в клетках дикого типа (чёрный) и штамма AIM23A (красный). По оси ординат - процент жизнеспособных клеток; по оси абсцисс - количество делений.

Мы решили проверить, зависит ли эффект делеции по гену AIM23 от генотипа штамма. В качестве альтернативного штамма был выбран D273-10В, который отличается низкой частотой возникновения р°- и р~-клеток, а также относительной устойчивостью к глюкозной репрессии. Был определён фенотип полученного мутантного штамма (AIM23A_DAU1) в сравнении с диким типом на средах с несбраживаемыми источниками углерода (Рис. 7). Оказалось, что на всех тестируемых «дыхательных» средах клетки штамма AIM23A_DAU1 демонстрируют тот же дефект на начальной стадии роста, что и клетки штамма AIM23A. При этом оба штамма ведут себя одинаково на среде YPD.

Суммируя вышесказанное, мы неизбежно приходим к выводу о независимости дефекта, наблюдаемого при отсутствии Aim23p в клетках S. cerevisiae, от конкретного генетического окружения штамма. Более того, феномен глюкозной репрессии, по-видимому, не является первостепенной причиной подобного нарушения митохондриальной функции.

A WT A WT A WT A WT

YPD YPGly YPP YPEt

Рис. 7. Фенотипы штаммов А1М23А_рА1Л (А) и дикого типа (№Т) на среде УРО. УРЫу, УРР и УРЕ1 через 2 (48И) и 3 (72И) дня роста при температуре 30°С. Цифры справа от панелей указывают значение О£>боо в нанесённых разведениях.

Несмотря на то, что все предыдущие попытки разобраться в механизмах адаптации клеток с делецией по гену AIM23 не дали желаемого результата, мы предприняли попытку выяснить, экспрессия каких генов кардинально меняется при отсутствии AIM23. Наш выбор пал на метод 2D-DIGE (от англ. 2D Difference In-Gel Electrophoresis). Суть данного подхода заключается в том, что белки общеклеточных лизатов двух сравниваемых образцов количественно метятся двумя разными флуоресцентными красителями, после чего смешиваются в соотношении 1:1 и подвергаются разделению методом 2D-PAGE. Полученный гель сканируют на приборе, который последовательно считывает сигнал флуоресценции каждого красителя, после чего накладывают полученные изображения друг на друга и анализируют. На рисунке 8 в качестве примера представлено типичное совмещённое изображение одного из трёх проанализированных гелей.

Рис. 8. Совмещённое изображение, полученное методом Ю-йЮЕ.

Белки штамма А1М23А помечены Су5 (красный), а дикого типа - СуЗ (зелёный); обозначен сигнал от Тта19р

Количество некоторых белков сильно отличается в мутантном штамме по сравнению с диким типом как в меньшую, так и в большую сторону. Была предпринята попытка идентифицировать белки в заинтересовавших нас областях геля методом масс-спектрометрии. К сожалению далеко не все полипептиды в вырезанных участках были опознаны ввиду технических сложностей, связанных с подготовкой образцов. Наше внимание привлёк белок Тта19р, количество которого в клетках с делецией по гену А1М23 в 11 раз превосходит таковое в клетках дикого типа (см. Рис. 8). Из литературы известно, что этот полипептид ассоциирован с цитоплазматическими рибосомами, а также перемещается к наружной митохондриальной мембране в условиях окислительного стресса. Мы решили проверить гипотезу о том, что Тта19р является обязательным фактором роста клеток с делецией по гену А1М23 на средах с несбраживаемыми источниками углерода. С этой целью мы решили сконструировать штаммы 5. сегеушае с делецией по гену ТМА19 и одновременной делецией по генам А1М23 и ТМА19 и определить фенотип этих штаммов при росте на дыхательных средах. Результаты

эксперимента представлены на рисунке 9.

ТМА19Л ТМА19ДА1М23Д

А1М23Д WT

Рис. 9. Фенотипы штаммов A1M23/S., ТМА19А, TMA/9AAIM23&. и дикого типа (WT) на среде YPGly через 2 и 3 дня после посева при температуре 30°С

Из рисунка хорошо видно, что клетки с двойной делецией растут на среде YPGly заметно хуже штамма AIM23A. При этом скорость роста клеток с делецией по гену ТМА19 не отличается от таковой в случае дикого типа. Следовательно, продукт гена ТМА19 является необходимым компонентом механизма адаптации клеток AIM23A при росте на «дыхательных» средах.

В конечном счёте мы решили проанализировать, как отсутствие в митохондриях IF3mt отражается на трансляции закодированных в митогеноме белков. Для этого продукты митохондриальной трансляции были специфически радиоактивно помечены in vivo в присутствии ингибитора цитоплазматической трансляции - антибиотика циклогексимида. Результаты электрофоретического разделения продуктов митохондриальной трансляции представлены на рисунке 10.

2 дня 3 дня

ДД ТМА19Л Д+рЕс Ä_pHs А1М23Д WT

^цди, .___ шят -Atp8/Atp9

Рис 10. Радиоавтограф электрофоретического разделения радиоактивно меченных продуктов митохондриальной трансляции in vivo.

Положение закодированных в митогеноме белков приведено слева; A_pHs - штамм AIM23A_pHs; А_рЕс - штамм AIM23A jpEc; АД — штамм AIM23ATMA19A

Оказалось, что делеция по гену AIM23 приводит к весьма интересному феномену: вместо предполагаемого падения общего уровня трансляции, которое можно было ожидать при удалении из системы квазиуниверсального фактора инициации трансляции, наблюдается нарушение стехиометрии стационарного распределения продуктов митохондриальной трансляции. Особого внимания заслуживает следующий момент: количество некоторых белков в штамме AIM23A увеличено, а других - уменьшено в сравнении с диким типом. Это хорошо прослеживается в случае цитохрома Ь, а также субъединиц 8 и 9 АТФ-синтазы. Присутствие в клетках аналогичных факторов из Е. coli и митохондрий человека приводит к ожидаемому восстановлению баланса трансляции. Наблюдаемую картину, помимо прямого эффекта отсутствия Aim23p на процесс трансляции, можно объяснить изменением количества различных мРНКмт вследствие такой

делеции. Чтобы проверить этот вариант развития событий, мы сравнили уровень экспрессии генов СОХ1 и СОВ в штамме А1М23Д в сравнении с диким типом (Рис. 11).

Рис. 11. Уровень экспрессии генов в клетках штамма AÍIM23A в сравнении с диким типом.

По оси ординат показан относительный уровень экспрессии; среднеквадратичное отклонение рассчитано по результатам трёх независимых экспериментов; С1Т2 -перокисомальнаяизоформацитратсинтазы, COXI - субъединица I цитохром с-оксидазы, CYTb - цитохром b

Оказалось, что относительный уровень экспрессии СОВ менее чем на 20%

превышает норму, что, безусловно, не может объяснить наблюдаемую в

случае цитохрома b разницу по количеству белка. Количество мРНКмт гена

COXI в штамме А1М23Д примерно на 15% ниже, однако на уровне белка

никакой существенной разницы мы не заметили.

Мы предполагаем, что удаление АГМ23, приводящее к нарушению

стехиометрии основных субъединиц реакционных центров комплексов цепи

переноса электронов, может стать причиной образования губительных для

клетки активных форм кислорода (ROS, от англ. Reactive Oxygen Species). В

подобной ситуации окислительного стресса белок Тта19р, как было

отмечено ранее, перемещается к внешней митохондриальной мембране,

способствуя адаптации клеток к повышенному уровню ROS. В результате

нормализуется дыхание и восстанавливается способность клеток расти на средах с несбраживаемыми источниками углерода.

ВЫВОДЫ

1. Белок Aim23p является третьим фактором инициации трансляции в митохондриях дрожжей S. cerevisiae — дефекты митохондриальной функции клеток, вызванные его отсутствием, компенсируется гетерологической экспрессией генов таких же факторов из митохондрий других организмов.

2. Белок Aim23p частично активен как фактор инициации трансляции в бактериальной системе: он эффективно связывается с 30S субъединицей Е. coli, но не способен стимулировать диссоциацию целой бактериальной рибосомы на субъединицы.

3. Митохондриальная функция клеток дрожжей, лишённых гена AIM23, нарушена только на начальной стадии роста. По прошествии этого периода митохондриальная функция восстанавливается. Такая адаптация не связана ни с одним из типичных путей компенсации дефектов митохондриальной функции.

4. Делеция гена AIM23 ассоциирована с примерно 10-кратным увеличением количества цитозольного белка Тша19р. Клетки дрожжей, лишённые одновременно генов AIM23 и ТМА19, содержат практически нефункциональные митохондрии. Таким образом, адаптация клеток к отсутствию белка Aim23p заключается в повышении количества белка Тта19р.

5. Делеция гена AIM23 ассоциирована с крайне нетипичными дефектами митохондриальной трансляции: одних митохондриальных белков становится меньше, в то время как количество других значительно увеличивается.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Atkinson G. С., Kuzmenko A.. Kamenski P., Vysokikh М. Y., Lakunina V., Tankov S., Smirnova E„ Soosaar A., Tenson Т., Hauryliuk V. Evolutionary and genetic analyses of mitochondrial translation initiation factors identify the missing mitochondrial IF3 in S. cerevisiae. II Nucleic Acids Research. 2012. V.40(13). P. 6122-6134 (равный вклад в работу двух первых авторов).

2. Кузьменко А. В.. Левицкий С. А., Виноградова Е. Н., Аткинсон Д., Гаврилюк В., Зенкин Н., Каменский П. А. Биосинтез белка в митохондриях. //Биохимия. 2013. Т.78. №8. С. 1093-1107.

3. Kuzmenko A.. Atkinson G. С., Levitskii S., Zenkin N., Tenson Т., Hauryliuk V., Kamenski P. Mitochondrial translation initiation machinery: Conservation and diversification. // Biochimie. 2013. DOI: 10.1016/j .biochi.2013.07.024.

Тезисы:

1. G. Atkinson, P. Kamenski, V. Lakunina, A. Kuzmenko. T. Tenson, V. Hauryliuk. The comings and goings of mitochondria ltranslation initiation factors. // Тезисы докладов конференции EMBO «Синтез белка и контроль трансляции», Хайдельберг, Германия. 2011. С. 80.

2. A. Kuzmenko. P. Kamenski, G. Atkinson, V. Lakunina, Е. Smirnova, А. Soosaar, Т. Tenson,V. Hauryliuk. The new translation initiation factor in yeast mitochondria: dry and wet identification. // Тезисы докладов российско-французской конференции «Химия в молекулярной биологии». Москва. 2012. С. 9.

3. G.C. Atkinson, A. Kuzmenko. P. Kamenski, M.Y. Vysokikh, V. Lakunina, S. Tankov, E. Smirnova, A. Soosaar, T. Tenson, V. Hauryliuk. Evolutionary and genetic analyses of mitochondrial translation initiation factors identify the missing mitochondrial IF3 in S. cerevisiae. II Тезисы докладов конференции «Митохондрии в жизни, смерти и болезнях», Ираклион, Греция. 2012. С. 184.

Заказ № 65-А/09/2013 Подписано в печать 19.09.2013 Тираж 75 экз. Усл. пл. 1.2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maiUzak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузьменко, Антон Викторович, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи 04201362528 УДК 547.963.32.02

Кузьменко Антон Викторович

Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей »У. сегеушле

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат биологических наук П.А. Каменский кандидат химических наук В.В. Гаврилюк

Москва 2013 г

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.......................................................................................................................5

Введение..........................................................................................................................................7

Обзор литературы..........................................................................................................................9

Современные представления о митохондриальной трансляции..............................................9

Общие особенности биосинтеза белка в митохондриях..........................................................................................9

Инициация трансляции в митохондриях.......................................................................................................................19

Общая характеристика.................................................................................................................19

Митохондриальные факторы инициации трансляции.............................................................23

Стадия элонгации трансляции в митохондриях.........................................................................................................27

Общая характеристика.................................................................................................................27

Митохондриальные факторы элонгации трансляции...............................................................28

Терминация трансляции и рециклинг в митохондриях........................................................................................31

Трансляционные активаторы сахаромицетов............................................................................................................35

Общие принципы.........................................................................................................................35

Активаторы трансляции цитохром оксидазы............................................................................36

Активаторы трансляции цитохрома Ь........................................................................................37

Активатор трансляции Уаг1р......................................................................................................37

Активаторы трансляции субъединиц АТФ-синтазы................................................................38

Материалы и методы ..................................................................................................................39

Материалы.......................................................................................................................................................................................39

Приборы и расходные материалы..............................................................................................39

Растворы.......................................................................................................................................40

Коммерческие наборы ................................................................................................................41

Программное обеспечение .........................................................................................................42

Штаммы микроорганизмов.........................................................................................................42

Питательные среды.....................................................................................................................42

Карты плазмид и шатл-векторов, использованных в ходе работы ........................................44

Олигонуклеотиды, использованные в ходе данной работы ...................................................46

Методы...............................................................................................................................................................................................47

Поиск последовательностей и филогенетический анализ.......................................................47

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)........................................................................................48

Количественный ПЦР анализ (qPCR)........................................................................................49

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле в нативных

условиях........................................................................................................................................50

Очистка фрагментов ДНК после ПЦР и других ферментативных реакций..........................50

Переосаждение нуклеиновых кислот этиловым спиртом........................................................50

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование.............................................51

Электропорация клеток Е. coli....................................................................................................51

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli ........................................................................52

Химическая трансфекция клеток S. cerevisiae .........................................................................53

Электропорация клеток S. cerevisiae .........................................................................................54

Выделение фракции, обогащенной плазмидной ДНК, из клеток S. cerevisiae .....................55

Выделение геномной ДНК из клеток S. cerevisiae...................................................................55

Выделение фракции тотальной РНК из дрожжей....................................................................56

Синтез к ДНК................................................................................................................................56

Определение фенотипов штаммов дрожжей............................................................................56

Споруляция, деление тетрад и определение типа спаривания...............................................57

Измерение поглощения клетками кислорода...........................................................................58

Определение количества р° клеток в популяции .....................................................................58

Измерения мембранного потенциала........................................................................................59

Мечение продуктов митохондриальной трансляции in vivo ..................................................59

Диссоциации 70S рибосом Е. coli...............................................................................................60

Связывание Aim23p с 30S субъединицей рибосом..................................................................61

Окрашивание митохондриальных нуклеоидов при помощи DAPI .......................................61

Анализ репликационной продолжительности жизни (RLS)....................................................62

Результаты и обсуждение...........................................................................................................63

Aim23p - ортолог митохондриального фактора инициации трансляции 3................................................63

Доказательство митохондриальной функции Aim23..............................................................................................65

Физиологические эффекты, вызываемые делецией по генуА1М23................................................................71

Делеция по гену AIM23 не приводит к увеличению частоты возникновения клеток с фенотипом

«petite»................................................................................................................................................................................................74

Характеристика Aim23p in vitro...........................................................................................................................................75

Клетки с делецией по гену AIM23 адаптируются к росту на средах с несбраживаемыми источниками углерода..............................................................................................................................................................79

Выводы.........................................................................................................................................88

Благодарности .............................................................................................................................89

Список цитируемой литературы.................................................................................................90

Приложение ...............................................................................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AG° - приращение свободной энергии; А - ангстрем (10'13 м);

ATP - adenosine triphosphate, аденозинтрифосфат;

СОВ - cytochrome b, цитохром b;

СОХ - cytochrome oxidase, цитохромоксидаза;

CSM - complete suplement mixture, полная синтетическая основа для дрожжей;

DAPI - дигидрохлорид 4,6-диамидино-2-фенилиндола;

DiOC6 - 3,3'-дигексилоксакарбоцианин;

DTT - дитиотрейтол;

EF - elongatio factor, фактор элонгации;

EST - expressed sequence tags;

FCCP -карбонилцианид-п-трифторметокси-фенилгидразон; GDP - guanidine diphosphate, гуанозиндифосфат; GDPNP - негидролизуемый аналог гуанозинтрифосфата; GTP - guanidine triphosphate, гуанозинтрифосфат; IF - initiation factor, фактор инициации;

Kd - dissociation constant, равновесная константа диссоциации;

MTS - mitochondrial targeting signal, сигнал митохондриальной локализации;

NADH - nicotinamide adenine dinucleotide, никотинамидадениндинуклеотид;

NMR - nuclear magnetic resonanse, ядерный магнитный резонанс;

OE-PCR - overlap extension polymerase chain reaction, полимеразная цепная реакция с

удлинением перекрытия;

ORF - open reading frame, открытая рамка считывания; PAS - polipeptide accesable site; PBS - phosphate buffered saline;

PES - polipeptide exit site, канал выхода растущего пептида;

PMSF - phenylmethanesulfonylfluoride, фенилметилсульфонилфторид;

PPR - pentatricopeptide repeat, пентатрикопептидный мотив;

RF - release factor, фактор

rpm - revolutions per minute, обороты в минуту;

RRF - ribosome recycling factor, фактор рециклинга рибосом;

SDS - sodium dodecylsulfate, натрия додецилсульфат; Tris - трисаминометан;

TTC - triphenyltetrazolium chloride, хлорид трифенилтетразолия; YNB - yeast nitrogen base, дрожжевая азотистая основа; а.о. - аминокислотный остаток; МДа - мегадальтон;

мРНКмт - матричная митохондриальная рибонуклеиновая кислота; мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота; нт - нуклеотид;

НТО - нетранслируемая область;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота;

тмРНК - «транспортно-матричная» рибонуклеиновая кислота;

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ВВЕДЕНИЕ

Клетки всех эукариотических организмов, за исключением ряда паразитических форм, содержат митохондрии. Эти органеллы обеспечивают клетки энергией в процессе окислительного фосфорилирования, участвуют в синтезе жирных кислот, гема и железосерных кластеров, а также в запрограммированной клеточной смерти. Согласно общепринятой концепции эндосимбиоза, митохондрии произошли на ранних этапах эволюции от а-протеобактерии, близкой к современной Rickettsia prowazekii [1]. С течением времени, в ходе постоянного взаимодействия с ядерным геномом многие митохондриальные гены были перенесены в ядро, однако небольшая их часть осталась в составе ДНК органеллы. Трансляция митохондриальных матричных РНК (мРНКмт) осуществляется собственным аппаратом биосинтеза белка и требует тонкой координации работы ядерного и митохондриального геномов.

На сегодняшний день многие аспекты процесса митохондриальной трансляции остаются изученными в недостаточной степени. Во многом это связано с тем, что систему митохондриальной трансляции, способную к синтезу на природных матрицах, до сих пор не удалось реконструировать in vitro ни в одной лаборатории мира. С другой стороны, на основе ранних работ по изучению характеристик седиментации митохондриальных рибосом и их РНК-компонентов вкупе с данными по чувствительности к антибиотикам было сделано предположение о сходстве процесса трансляции в митохондриях с таковым у бактерий [2-4]. После этого в научном сообществе сформировалась точка зрения, согласно которой дальнейшие эксперименты в данном направлении могли бы только подтвердить уже известные науке факты. Однако, как стало очевидно при более детальном рассмотрении, процесс трансляции в митохондриях имеет ряд отличительных особенностей, не характерных ни для аналогичной системы в цитоплазме эукариотических клеток, ни для клеток бактерий и архей [5,6 ].

которые абсолютно необходимы для трансляции митохондриальных мРНК [7]. Помимо этого, в дрожжевых митохондриях не был обнаружен один из квазиуниверсальных белковых факторов инициации трансляции в органеллах, а именно фактор инициации 3 (IF3mt). В то же время, в научной литературе не описано ни одного примера эффективной работы аппарата инициации трансляции в отсутствие данного фактора.

В связи с этим, целью данной работы являлся поиск, идентификация и характеристика третьего фактора митохондриальной трансляции дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

2. В случае обнаружения белков-кандидатов - экспериментальное подтверждение выполнения ими функции IF3mt.

3. Функциональная характеристика IF3mt пекарских дрожжей:

a. в гетерологической системе in vitro

b. в контексте живой клетки (in vivo).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ТРАНСЛЯЦИИ

Общие особенности биосинтеза белка в митохондриях

Геном митохондрий (митогеном), несмотря на универсальность выполняемой им генетической функции, демонстрирует довольно высокую степень вариации по форме, размеру и фактическому генному содержанию [8]. К примеру, самая короткая описанная на сегодняшний день линейная молекула митохондриальной ДНК (мтДНК), обнаруженная у принадлежащего к филуму Apicomplexa паразитического простейшего Plasmodium falciparum (5966 п.о.), кодирует, помимо коротких фрагментов большой и малой рибосомальных РНК (рРНК), всего лишь три полипептидные цепочки: субъединицы I и III цитохром с-оксидазы и цитохром b [9]. В человеческой кольцевой мтДНК (16 569 п.о.) содержится 22 гена транспортных РНК (тРНК), 13 генов, кодирующих белки, а также гены 12S и 16S рРНК; в то же время, превышающий его по размеру в 22 раза митохондриальный геном Arabidopsis thaliana (366 924 п.о.) содержит информацию о всего лишь 32 белковых макромолекулах и неполном наборе тРНК [10, 11]. Такая диспропорция объясняется необычайно большим количеством (>80%) некодирующих последовательностей в мтДНК А. thaliana по сравнению с большинством простейшими и млекопитающими, у которых гены следуют непосредственно друг за другом или разделены всего несколькими нуклеотидами [12]. Темп эволюции митохондриальных геномов крайне высок, что частично объясняется повышенной частотой возникновения мутаций в связи с недостаточно эффективной системой репарации, а также близостью к образующимся у внутренней мембраны активным формам кислорода (ROS, от англ. Reactive Oxygen Species) [13]. Ещё одна любопытная черта организации митогеномов - это гетероплазмия, то есть возможность присутствия в составе органеллы нескольких копий мтДНК с разными нуклеотидными последовательностями. Данное свойство особенно важно с точки зрения развития заболеваний, связанных с нарушением митохондриальной функции. В этом случае,

проявление симптомов наблюдается только тогда, когда мутация накопится в определённом количестве молекул мтДНК.

Важной особенностью трансляции в митохондриях является отклонение от стандартного генетического кода. К примеру, у позвоночных животных один из трёх стоп-кодонов - UGA - соответствует триптофану, a AUA - метионину вместо изолейцина. В митохондриях довольно часто используются альтернативные триплеты в качестве стартового кодона: AUA {Homo, Bos), AUU {Homo, Mus), AUC {Mus) и GUG {Coturnix, Gallus). Согласно данным транскриптомного анализа, набор стоп-кодонов в митохондриях различных групп организмов варьирует в широких пределах: от двух у Chlorophyceae (UAA, UGA) до 7-12 неканонических вдобавок к UAG у нематод и плоских червей [14]. Для митохондрий дрожжей также характерна смена значения кодонов, начинающихся с CU, с лейциновых на треониновые [15].

Транскрипция в митохондриях практически всех эукариот происходит при участии односубъединичного фермента из семейства ТЗ/Т7 фаговых РНК-полимераз, инициирующих синтез на коротких (порядка 8-10 нуклеотидов) промоторных областях, непосредственно примыкающих к точке старта транскрипции +1 со стороны, предшествующей кодирующей части [16]. Тем не менее, для эффективной инициации необходим дополнительный белковый фактор, имеющий много общего с членами эубактериалыюго семейства а-факторов. В случае дрожжей было показано, что данный белок (Mtfl) остаётся в комплексе с митохондриальной РНК-полимеразой (Rpo41) вплоть до включения тринадцатого нуклеотида в растущую цепь митохондриальной мРНК [17]. Примечательно, что в in vitro системе с частично расплавленным или отрицательно суперспирализованным промотором митохондриальная РНК-полимераза оказалась способной инициировать синтез мРНКмт без помощи Mtfl [18].

Продуктом транскрипции в митохондриях в общем случае является полицистронный первичный транскрипт [16, 19, 20]. Дальнейший процессинг, согласно модели «тРНК-пунктуации», происходит при эндонуклеолитическом выщеплении последовательностей тРНК, разделяющих кодирующие белки рамки считывания [21]. Так, в человеческих митохондриях существует 11 мРНК: 9 моноцистронных и 2 бицистронных с перекрывающимися рамками считывания, а у S. cerevisiae каждый из 8 полипептидов считывается с отдельной мРНК, за исключением

субъединиц а и 8 АТФ-синтетазы FoF4 типа, формирующих бицистронный транскрипт и находящихся под контролем общего промотора [22]. Все митохондриальные мРНК лишены кэп-структуры, но довольно сильно отличаются друг от друга по другим характеристикам у разных групп организмов. Так, в человеческих митохондриальных мРНК отсутствуют длинные 5'- и З'-нетранслируемые области (НТО), но при этом они полиаденилированы [22]. С другой стороны, у Saccharomyces cerevisiae зрелые транскрипты обладают длинными НТО с обоих концов, предположительно содержащими важные в регуляторном плане элементы вторичной структуры, и вообще лишены поли(А)-тракта [23-25]. Судя по всему, это отражает принципиальную

Информация о работе

Кузьменко, Антон Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.Cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы