Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces Cerevisiae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces Cerevisiae"



Ява

»•Ч

т™ / :) о О;

академия ссср

институт шшлотю" вшопш

На правах рукописи

МОКЗУНОВ Сергей Петрович

УД{ 577,21

ЭКСПРЕССИЯ ГЕТЕРСШ0П1ЧМ ГЕНОВ В ДРОШХ ЗАССНАПОИУСЕЗ СЕаЕУ131АЗ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических неук

Москва - ¡983

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Института молекулярной биологии All СССР,

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор К.Г.Скрябин

\

Официальные оппоненты: \

доктор биологических наук- В.М.Луэиков кандидат биологических наук И.П.Арман

Ведупая организация: Институт цитологии АН СССР,

Защита диссертации состоится 1988 года

в часов на заседании Специализированного Ученого совета

Д 002.79.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32.■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН ССОР.

Автореферат разослан "¿¿У" гО^ 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук1

-г т.

■■=. -.,., ,. дуальность Темы. Развитие методов генетической инжене-

'и—е.рта^йивучение механизмов экспрессии генов позволяет в настоящее время ставить и успешно решать задачу синтеза в клетках микроорганизмов важных для медицины и сельского хозяйства белков и пептидов. В последние года в биотехнологии наряду с E.coli стали широко использоваться низшие эукариоты - дрожжи Saooharonyoea cerevisiae. Успехи биохимического и генетического изучения дрожжей, разработка эффективных методов молекулярного клонирования позволили создать дрожжевые штаммы, продуцирующие человеческие штерфероны / Singh et al.» 1984; Bitter et al., 1934; Egan et al. ,1985/, инсулин / ТЫт et al. , 1986/, эпидермальний фактор роста / Brake et al. , 1984/, ннтерлей-кин-2 / Miyajina et al. , 1985/, прохимозин теленка / Mellor et al. , 1983; Smith et al. , 1985/ И другие гетеро-логичные белки. Способность клеток дрожжей осуществлять ряд характерных для эукариот этапов посттрансляционной модификации, процессинг и секрецию белков в ряде случаев позволяет получать целевые белки в "зрелой" и биологически активной форме. Перспективным представляется использование дрожжей s.cerevisiae как продуцентов гидрофобных вирусных белков для производства безопасных противовирусных вакцин / Valenzuela et al. , 1982; liiyanohara et al., 1983; Hitzeman et al. , 1983, 1986/. Сходство процессов секреции у дрожжей и у высших эукариот, заключающееся в транспорте секретируемого белка за пределы клетки с отщеплением и-концевой сигнальной ("лидерной") последовательности, определяет возможность использования секреторного пути дрожжей для выведения синтезируемого чужеродного белка в куль-туральную среду /Hitzeman et al., 1983; Bitter et al., 1984} Wood et al., 1985; Smith et al., 1985/.

Однако, несмотря на многообразие проводимых исследований, многие факторы, определявшие эффективность экспрессии чужеродных генов в дрожжах в эффективность секреции синтезированного белкаг-про-дукта, остаются недостаточно изученными. В связи с этим выяснение закономерностей синтеза и секреции чужеродных белков дрожжевой клеткой, оптимизация системы экспрессии для s.cerevisiae является актуальной биотехнологической задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось конструирование векторов экспрессии для s.oerevisine , их использование для исследования закономерностей экспрессии генов сшатотропина человека и белка оболочки вируса гепатита Б в клетках рекомбинантных штаммов дрожжей, а также изучение закономерностей секреции дрожжевой клеткой чужеродного белка на примере со-матотропина человека.

В задачи исследования входило:

- получение набора делеционных производных регулируемого дрожжевого промотора ИЮ5, включающих как б'-петранслируемую область гена, так и сигнальную последовательность секреции;

- конструирование "кассет экспрессии" гена соматотропина человека на основе регуляторных элементов гена Ш05, тестирование и исследование закономерностей экспрессии "зрелого" соматотропина,

а также его секреции как с собственным лидерным пептидом, так и с лидерным пептидом кислой фосфатазы дрожжей;

- конструирование "кассет экспрессии" гена главного и среднего белков оболочки (поверхностного антигена) вируса гепатита В под контролем различных дрожжевых промоторов: PHOS, adhi, gpdi,-- тестирование и сравнение эффективности экспрессии в различных полученных штаммах.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получен набор делеционных вариантов промотора гена ИЮ5 S.cerevisiae ,

на основе которых сконструирован ряд "кассет экспрессии" различных вариантов гена соматотропина человека, в том числе содержащих ген "зрелого" ссматотрошна, ген пре-соматотропина, а также ген "зрелого" соматотропина, состыкованный с регуляторной последоваг-тельностью секреции дрожжевого гена ЕН05. Показано, что клетки дрожжей, трансформированные сконструированными плазмидами, продуцируют соответствующие варианты сшатотрошна человека. При наличии в составе конструкции сигнальной последовательности секреции (лидерного пептида) как гомологичной (FH05), так и гетерологичной для дрожжей (лидерный пептид соматотропина), первичный белковый продукт вовлекается в секреторный путь дрожжей, процессируется и секретируется в культуральнуи жидкость. В процессе работы выявлен ряд закономерностей этого процесса.

Сконструированы "кассеты экспрессии" гена главного белка обол едки вируса гепатита В под контролем промоторов дрожжевых генов ЕН05, ADH1 , GPD1 . Показано, что клетки дрожжей, трансформированные сконструированными плазмидами, продуцируют различные количества поверхностного антигена вируса гепатита В, причем мульти-мерная форма этого белка составляет до 0,07?? от суммарного белка дрожжей. Проведено клонирование среднего белка оболочки вируса гепатита В путем выделения и клонирования в ранее полученные конструкции ргеЗ(2) -участка. Получение штаммов дрожжей, продуцирующих главный и средний белки оболочки вируса гепатита В, осуществлялось в рамках темы 3.03. МНТК "Еиоген" "Разработать способ получения и организовать производство вакцины на основе поверхностного антигена вируса гепатита В".

Апробация. Материалы диссертации докладывались на X Международном специализированном симпозиуме по дрожжам /Варна, 1985/, на Международном симпозиуме стран СЭВ "Экспрессия гетерологичных генов в микроорганизмах" /Веймар, 1986/, на 8-см Двустороннем

симпозиуме СССР - Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" Л1осква, 1986/, на 7-ом Двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Организация и функционирование эукариотического генома" /Гейделъберг, 1987/, а также на Конкурсе молодых ученых ЖБ АН СССР.

Объём диссертации. ]1иссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и включает рисунков и ty таблиц. Список литературы содержит наименований.

РЕЗУЛЬТАТА И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Клонирование регуляторншс элементов гена репрессибельной КИСЛОЙ фоофатазы S.cerevisiae.

Первым этапом работ по конструированию дрожжевого вектора экспрессии было клонирование фрагментов ДНК дрожжей, несущих промотор и терминатор транскрипции гена репрессибельной кислой фоофатазы - РН05. Выбор был обусловлен тем, что указанный ген находится под контролем сравнительно сильного промотора, уровень транскрипции с которого регулируется концентрацией фосфатов / Meyhack et al. , 1982/. При выращивании дрожжей на средах с низким содержанием неорганического фосфата транскрипция гена РН05 возрастает в десятки раз и количество белка-продукта достигает 5% суммарного белка дрожжей. N -концевая последовательность белка кислой фоофатазы представлена "лидерной" последовательностью из 17 аминокислот, обеспечивашей транспорт атого белка в периплазму дрожжевой клетки и в среду культивирования, где обнаруживается ДО 3<Ж продуцируемой клеткой фоофатазы /HRgenauer-Teapis etal 1984/. Таким образом, использование промотора гена РН05 позволяет создавать системы экспрессии с эффективным регулируемым синтезом и секрецией чужеродного белка.

Промотор гена Й-Ю5 бил выделен в виде BamHI-EeoRV фрагмента величиной 649 п.н. из плазмиды рЗЯ322/рН03,5/HID3 , содержащей полный ген РН05 /меуЬаск et v.l. , 1982/, и клонирован в плазмиде рЗР.322 по соответствующим сайтам. Указанный фрагмент включал в себя 541 п.н. 5'-иетранслируемой области гена с регуляторными последовательностями, ТАТАТАА последовательностью и точками инициации транскрипции, а также 108 п.н. кодирующей чаете гена, в тш числе вси последовательность "лидерного" пептида. Серия плазмид, содержащих делеционше варианты промотора РН05, была получена путём раскрывания полученной плазмидн по EcoEV сайту, обработки нуклеазой Bal 31 . "пришивки" ЕсоМ »линкеров и субклонирования полученных BamHI-EcoRi фрагментов. Как показат анализ первичной структуры, точки делеций в полученных наш плазмидных монах располагались в области между стартом транскрипции и АТГ-кодоном, а тагосе в пределах области, кодирую-ией сигнальный пептид кислой фосфатазы /рис Л/.

Делеционные варианты, содержатоге цремотор с интактными точками инициации транскрипции (-56, -31, -18, -12), были использованы в дальнейшей работе для стыковки с последовательностями чужеродных генов, имеющими собственный интдааторный АТГ-кодон и часть 5'-нетранслируемой последовательности. Изменяя с помощью различных делеционных вариантов промотора расстояние между точкой инициации транскрипции и АТГ-кодонда чужеродного гена, можно надеяться обнаружить влияние этого параметра на уровень экспрессии чужеродного гена и, в конечном счете, подобрать наилучшее сочетание.

Особый интерес представляет делеционные варианты промотора, 3*-конец которых расположен в пределах и непосредственно за последовательностью, кодирующей лидерный пептид. Используя в этом

С Т r»AüTCQAQÜT1 АОТАТ (ЭОС: 1 TCft 1С ТСТС

.»в -Н -12 -4-1-2

1

ЛАА ТСТ Ol Т OTT TAT ТСА А Т Т Т ТА > у» aar v«) v«i tyr aar i> l «• l

ОЬ» О* .i.4

W 4 I 4 1

Га i - r - ftf т тг* г г гя га r~ г— лл-t « i ■ o O" v

acc qc т тс т г те о с с йат auo'üa r

ACC AT T CCC T t A UQr: thf Ii ■ ч t. «u oi у

Рис.1. Делеционные варианты промотора ИЮ5. Приведена часть последовательности промотора и кодирующей части гена, стрелками указаны положения синтетических ЕсоЩ -линкеров, присоединенных к З'-концам делеций. Указаны также положения основных и минорных точек инициации транскрипции ) и сайта отщепления сигнального пептида ( ♦ ) /Ва^;а ег а1. , 1984/.

случае для подстыковки к промотору гены гетералогичных секретиру-емых белков, можно получить различные варианты гибридной последовательности для лидерных пептидов. Это открывает возможность изучения специфических механизмов секреции белков дрожжевой клеткой.

В качестве терминатора транскрипции, специфичного для дрожжей, был использован 3»-концевой Sau3AI~Pstl фрагмент гена FH05 величиной 373 п.н. Фрагмент был выделен из плазмида, содержавшей полный ген РН05 и клонирован в полилинкере векторной плаз-мида pEMBL8 по BcmHi и Pstl сайтам.

'¿. Экспрессия гена соматотропина человека в клетках s.cerevigiao и закономерности секреции сомато-тропина человека клетками дрожжей

Полученный нами набор делеционных вариантов промотора РН05 был использован для конструирования и изучения эффективности "кассет экспрессии", где под контролем этих вариантов промотора находились различные делеционные производные гена сшатотропина человека. Природный человеческий соматотролин состоит из 191 аминокислотного остатка и образуется путём отщепления 26-членного сигнального пептида от молекулы прегорлона в ходе секреторного процесса. Ранее в отделе генетической инженерии КПЗ АН СССР были получены штаммы е. coli , эффективно продуцирующие соматотропин человека, Эти работы послужили основой для наших исследований по анализу экспрессии сшатотропина в полученных рекшбинантных штаммах дрожжей.

Первая стадия экспериментов по конструированию "кассет экспрессии" гена сшатотропина человека состояла в стыковке соответствующих. вариантов данного гена, подученных П.М.Г^бцовым и соавторами, с терминатором транскрипции дрожжевого гена РН05. Терминатор выделяли в виде Хаа1-и±п.с1Х11фрагмента из полученной ранее плазми-до pPH05term и клонировали по указанным сайтам в плазмидах, содержащих различные делеционные варианты гена соматотропина человека. Таким образом, были получены ялазмида, в которых непосредственно за стол-кодоном гена соматотропина через Xmal сайт был встроен терминатор транскрипции гена РН05 в правильной ориентации.

На второй стадии экспериментов полученные конструкции в виде EcoRi-Hindin фрагментов объединяли с соответствующими вариантами промотора гена Ш05 ( EamHl-EcoRl фрашенты) в составе дрожжевого эписомного вектора ГЕр1з / Broach et аа. , 1979/. Различ-

ные "кассеты экспрессии" гена соматотропина были получены путём трёхкомпонентного лигирования указанных фрагментов с вектором Шр13 » раскрытым по сайтам ЗатНХ и Hindiix . Общая схема полученных векторов экспрессии представлена на рис.2а. В ходе работы были сконструированы следующие плазмиды:

I/ YEpPH05(-l2)/hGH , содержащая промотор РН05 без АТГ-ко-дона (-12) и ген "зрелого" соматотропина с инициирующим кодовом;

2/ XEpPH05(-1S)/pre-hGH, УЕрРН05t-31)/pre-hGH , Содержащие промотор РН05 без АТГ-кодона (-18, -31) и ген прегормона с собственны:.! лидернш пептидом и б'-нетрэдслируемой последовательностью величиной 45 п.н.;

3/ УЕрРН05(*54)/МШ(+8) и YEpPH05(+54)/hGH(+1l), содержащие промотор РН05 с собственной последовательностью лидерного пептида (+54) и укороченный ген "зрелого" соматотропина без трех либо без четырех N-концевых аминокислот;

4/ YEpPH05(+43)/bGH(-i2) , содержащая промотор Ш05 с частью последовательности собственного лидерного пептида (+43) и делеционный вариант гена прегормона с последовательностью четырех последних аминокислот лидерного пептида прегормона.

Строение всех перечисленных сконструированных нами плазмид было подтверждено результатами электрофореза гидрсдизатов этих плазмид несколькими рестриктазаыи. Схема стыковки последовательностей промотора гена FH05 и вариантов гена соматотропина в составе векторов экспрессии представлена на рис.3.

Полученными плазмидагли трансформировали штамм дрожжей AH2I6 ( а 1еи2 Ъ1вЗ pho3,5 ) / Meyhack et al. , 1982/. Отобранные Leu* трансформанты (по пять изолированных клонов) выращивали в жидкой селективной ужв -среде до начала стационарной фазы, после чего равные аликвоты промытых клеток высевали в богатую Ypd -сре-

а

3

тшг

В ЕР В№/В) РН

I —и

5Н05 ген НВвАв «Н05

рг АПН1

ганэ

Рис.2. Схемы векторов для экспрессии в дрожжах генов соматотропина человека и поверхностного антигена вируса гепатита В.

а - "кассета экспрессии" гена соматотропина; б - "кассета экспрессии" гена поверхностного антигена

вируса гепатита В; -- учаСТКИ рВН322;

ЩЩ - участки дрожжевой 2 мкм-плазмида /репликатор/;

У/////А - области гена ЬЕиг дрожжей /селектируемый маркер/.

Обозначения сайтов рестриктаз: Е - ЕооШ, В - ВатН1, Р - Рв-И, X - Хша1, Р - Рга1.

PHOSt-irm.SH +!

met phe pro thr ite pre CTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAAÎTctagiattet itg TTC CCA ACC ATT CCC ...

PHD51-IB)/рге-ЬБИ

met

CTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGctaqaittcgitc6ATCCTGTGGACAGCTCACCTAGCTGCA ATG PHD"(-31>/pre-hGH

nit ill thr g 1 y

CTCATGAGAATAAGAACAACAAct«gi»ttcgitcGATCCTGTGGACAGCTCACCTA6CTSCA ATG GCT АСА GGC -20 -10 ser irg thr ter leu leu leu ila phe gly leu leu cys leu pro trp leu gin glu g 1 у ТСС CGG АСЕ ТСС CTG ПС CTG GCT TTT GGC CTG CTC TEC С TE CCC ÎGG CTT САА GAG GGC -1 M

ter Di phe pro thr ile pro

AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC .........

PH05(+54)/hGH(+11)

i»st phe lys ter vil v»l tyr TCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGA6CAAGCAAATTCGAGATTACCA ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT -10 -1 +1 <«5>

ter lie leu >1« il* ter leu iU itn il« gly ltu glu phe tyr vil pro

TCA ATT TTA GCC БСТ TCT TTG GCC AAT GCA GET cta gii ttc tit gTT CCC .........

Рис.S. Схема стыковки последовательности промотора гена ЕН05 и вариантов гена соматотропина в составе векторов экспрессии.

Цифрами в скобках при обозначении кассет экспрессии указано расстояние от места присоединения линкера /строчные буквы/ до АТГ-кодона промотора. Цифры над кодирующими областями обозначают положения аминокислот по отношению к местам отщепления сигнальных пептидов.

ду, из которой был удален неорганический фосфат. Выращивание в втих условиях продолжали в течение 20 часов (S-8 генераций). Белковые экстракты клеток дрожжей, полученные по методу Лайонс и Нельсона / Lyons, Helsen , 1984/, и препараты белков из среды культивирования анализировали методом электрофореза в денатурирующем полиакрилашщном геле с последующим иммуноблоттингом, используя поликлональные антитела к соматотрояину человека и меченый

тос

I белок А золотистого стафилококка. Полученные радиоавтографы приведены на рис.4.

12 3 456? 89 10 II 12

-к л е т к и-1 1-с р е д а

Рис.4. Пммуноблоттинг разделенных в денатурирующем ПМГ экстрактов клеточных белков /I - 6/ и препаратов культуральной среды /7 - 12/ дрожжевых штаммов, продуцирующих ссыато-тропин.

Авторадаограмма нитроцеллюлозных фильтров, обработанных антителами к соматотропину и белком А золотистого стафилококка, меченым йодом-125: 3, 8 - АН216/УЕрРН05(-12)АсН;

1, 11 -АН216/ХЕрРН05(+54)/1ЮН(+11); 12 -АЛ216/УЕрРН05(+54)/110Н(+8); 4, 5, 7 -АН216/УЕрРН05(-31)/рге-ЬОН; б, 9 -АН21б/УВрРНО^(-1В2/пгв-йаН;

2, 10 - гипофизарныи иен ' (I мкг-0,5 мкг соответственно).

Оценку количества сшатотропина, синтезируемого полученными штаммами, проводили иммуноферментным методом, а также путём счёта радиоактивного излучения 1^25 соответствующих участков нитроцеллюлозных фильтров на у-счётчике. Результаты юяяунсферментного определения количества соматотропина в гомогенатах клеток полученных штаммов и в культуральной среде представлены в таблице I.

Как следует из радиоавтограмм и данных иммуноферментного анализа, все проанализированные рекомбинантные штаммы дрожжей проду-

Таблица I.

Уровень синтеза и секреции соматотропина человека различными рекомбинантными штаммами дрожжей

Тип трансформанта Содержание соматотропина, мг/л

клетки среда оба.прод.

АН216/YDpРЯ05(-12)/hGH 2,28 (96,6/?) 0,09 (3,4g) 2,37

AH2l6/YEpFH05(+54>/hGH(-»e) (84,3*) 0,22 (15,7%) 1,39

АН216/УЕрРН05(-31)/рге-ьаН 0,47 (75,2$) 0,16 (24,«?) 0,63

даруют имцунореактивный соматотропин.

Полученные данные позволяют сделать следующие основные выводы о характере экспрессии гена соматотропина в зависимости от структуры промотора и лидерной последовательности:

- наиболее эффективен синтез "зрелого" безлидерного соматотропина - до 2,3 мг/л внутри клетки;

- синтез прегормона с лидером РН05, а также с гибридным лидером в 2 - 4 раза более эффективен, чем синтез прегормона с собственным лидером и достигает 50$ (до 1,17 мг/л внутри клетки) количества, продуцируемого при отсутствии лидера;

- при синтезе соматотропина как с лидером FH05 и с гибридным лидером, так и с собственным лидером, внутриклеточная форма соматотропина представлена преимущественно прегормоном.

Таким образом, обнаружены существенные различия в уровне экспрессии соматотропина человека при использовании разных вариантов "кассет экспрессии". По-видимому, при экспрессии гена "зрелого" соматотропина, когда конструкция 5»-нетранслируемой области гена была максимально приближена к интактной для промотора ГН05, пояу-

- IS -

чей максимально возможный для промотора PI105 в сочетании с используемым векторш уровень внутриклеточного синтеза соматотро-пина. Сходные результаты были получены Хитцеманом / Hitzemon, Leung , 1983/ при экспрессии гена "зрелого"сог,1атотропина человека под контролем сильного дрожжевого промотора PGK1 - О, Б мг/л на Aggg=I» тогда как в наших исследованиях - 2,28 мг/л при

А660 = или МГ//л 1за Л660=

Наличие в составе конструкции последовательности лидерного

пептида, как гомологичного, так и гетеролопгчного для дрояжей, приводит к снижению внутриклеточной и общей продукции соматотро-пина, особенно значительному при использовании собственного лидерного пептида соматотропина человека - в 4 - 8 раз в зависимости от используемой конструкции. Наиболее вероятной причиной этого снижения в обоих случаях является вовлечение чужеродного белка в секреторный путь дрожжей. Ьто мнение подкрепляется последниш данным! ряда авторов: при использовании лидерного пептида чужеродного белка продукция целевого белка падает в 2-25 раз. Б частности, при экспрессии соматотропина человека с собственным лидерным пептидом наблюдается падение уровня синтеза соматотропина до 1/6 /Hitzemari, Leung , 1983/ - 1/25 / Tokunaga et al. , 1985/ ОТ уровня экспрессии "зрелого" соматотропина. В перечисленных случаях авторы обращают внимание на неблагоприятный для дрожжей кодо-новый состав лидерных пептидов. Нам, однако, кажется предпочтительным объяснение, приведенное выше.

В напей работе четко прослеживается влияние на уровень экспрессии структуры 5'-нетранслируемой области гена: приближение к оптимальному для промотора РН05 расстояния между точкой инициации транскрипции и инициаторным АТГ-кодонсм экспрессия?емото гена позволило более чем в 2 раза поднять уровень экспрессии прегормона с собственным лидерным пептидом (сравнение производилось путём

счёта у-излучешш соответствующих участков нитроцеллюлоэного фильтра после иммуноблоттинга).

Наиболее любопытными оказались данные о характере секреции соматотропина, полученными рекомбинантными штаммами дрожжей:

- гетерологичная для дрожжей сигнальная последовательность секреции (лидерный пептид) соматотропина человека правильно узнаётся аппаратом секреции и до 25$ синтезируемого в клетке прегор-мона процессируется и секретируется наружу из клеток;

- в нашем случае узнавание компонентами секреторного аппарата гомологичной сигнальной последовательности гена КЮ5 в составе гибридного белка с сшатотрошшш, по-видимому, затруднено, в результате чего затруднён транспорт через мембрану и процессинг такого белка - в среде обнаруживается 15% синтезирующегося соматотропина, причем в процессированной форме - примерно половина этого количества (см. рис.4). Главной причиной накопления непро-цессированной формы как внутри клеток, так и в культуральной среде, по-видимому, является низкая скорость отщепления лидерного пептида дрожжевой сигнальной пептидазой, что можно объяснить особенностями аминокислотной последовательности в участках стыка лидерного пептида FH05 и соматотропина. По-видимому, на эффективность секреции и процессинга чужеродного белка в дрожжевой клетке может влиять не только структура лидерной последовательности (которая в данном случае не изменена), но, как нам представляется, и общая конформация белковой молекулы, существенная, например, для взаимодействия с сигнальной пептидазой. Однако нельзя полностью исключить и альтернативного объяснения, которое в сходном случае (экспрессия и секреция лрскимозина теленка и соматотропина быка под контролем регуляторных элементов секреции дрожжевых генов suca и РН05) предлагают Смит и соавторы /Smith et al. , 1985/. Предполагается, что секреторный путь дрожжей, в который вовлекается

гетерологичнш"; белок, имеет ограниченную емкость, т.е. в норме секретироваться может лишь определенное максимальное количество белка независимо от количества предшественника, синтезированного в клетке.

При экспрессии гена "зрелого" соматотропина в кулътуральной среде также неожиданно был обнаружен "зрелый" гормон в количестве до 3,4$ от синтезированного в клетке. Дальнейший анализ, включавший в себя определение активности в культуральной среде несекрети-руешх цитоплазматических ферментов, в частности, ¿¿-глюкозидазы и пирофосфатазы позволил установить, что выход в среду такого количества соматотропина нельзя объяснить неспецифическим лизисш клеток в процессе роста культуры. Отмеченный факт является в настоящее время предметом отдельного исследования.

3. Экспрессия гена белка оболочки /поверхностного антигена/ вируса гепатита В в клетках БаосЬаготусез оегеу1е1ае.

Если соматотропин человека является примером белка, который эффективно синтезируется рекомбинантными штаммами Е.сои , то белок оболочки (поверхностный антиген - НВаДг ) вируса гепатита В относится к разряду сильно гидрофобных белков, которые в указанной системе синтезируются крайне неэффективно - прежде всего вследствие токсичности белка для клетки-хозяина. Указанный вирус вызывает серьёзное заболевание человека, создание экономичной и безопасной вакцины против которого - одна из важных задач генетической инженерии в нашей стране. В этой связи представляет интерес как сравнение эффективности экспрессии генов соматотропина и НВв-Дв в дрожжах при использовании гомологичных конструкций, так и получение дрожжевых штаммов, эффективно продуцирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. 1&бор дрожжевой системы экспрессии был обусловлен тем, что в клетках дрожжей и высших животных возможна самосборка из мономера НВэА^ мультимерных вирусоподобных частиц.

обладавши протективными свойствами при введении в организм человека. Белок же, введенный в виде мономера, не вызывает образования противовирусных антител.

На первой этапе наш были предприняты попытки экспрессии гена главного бежа оболочки вируса гепатита В под контролем регу-ляторных элементов дрожжевого гена FH05, полученных ранее. Ген главного белка оболочки ( HBsAg ) вируса гепатита В субтипа adyw был выделен из плазмиди pHBV13o /Gough .Murray , 1985/ в виде XhoI-BamHX фрагмента, включавшего 27 п.н. б'-нетранслируемой области гена (в геноме вируса это часть последовательности среднего белка оболочки), кодирующую область гена главного белка оболочки величиной 678 п.н. и З'-иетранслируемую область гена величиной 550 п.н. После "пришивки" синтетического EcoRl -линкера на 5'-конец указанный фрагмент был клонирован в полученной ранее плазмиде pPH05term по сайтам рестриктаз EcoRl и BamHl . Полученная конструкция, включавшая ген HBsAg и состыкованный с ним по ВсшН! сайту терминатор гена FH05, была использована в виде ЕсоК1~Н1псШ1фрагмента для трёхкомпонентного лигирования с BamHI-EooRI фрагментом ДЖ промотора гена НГО5 (делеционные варианты -18, -31, -36) и вектором YEp13 , раскрытым по сайтам BamHl и Hindlll. Строение сконструированных плазмид было подтверждено результатами электрофореза гидролизатов этих плазмид несколькими рестриктаэами. Схему вектора экспрессии см. на рис.26.

В целях повышения уровня синтеза HBsAg была проведена работа по оптимизации структуры гена. Путем расщепления рестриктазой Hhal и обработки нуклеазой S1 было удалено 23 п.н. (из 27) 5'-не-транслируемой области гена. После пришивки синтетических EcoRl-линкеров состава ЦЦГААТТЩГ и гидролиза рестриктазами EcoRl и Drai полученный EcoRX-Dral фрагмент клонировали на плазмиде pPH05term по сайтам EooRI и BamHl , причем "липкий" BamHl -ко-

нец был превратен в "тупой" путём достройки фрагментом Клёнова для лигирования с "тупым" концом, образованным рестриктазойигаХ. В полученной таким образом конструкции терминаторный фрагмент ИЮ5 следовал непосредственно за стоп-кодоном гена HBsAg , причем стоп-кодон ТАА, располагавшийся в сайте расцепления Drai , при клонировании был преобразован в ТГА за счёт стыковки с BamHi сайтом. Структура 5'-конца полученной конструкции и стыка Bral/BamHi была подтверждена путём определения первичной структуры ЩШ. по методу Максама-Гклберта. Полученную конструкцию использовали в виде ЕсоЯХ-ШлсИИфрагмента для трёхксмпонентного лигирования с вектором XEp13/BamHI/HindIII и промоторными ВашН1--EcoRl фрагментами дрожжевых генов PH05(-I2), adh1 и gfdi . Промотор гена adh1 содержался в плазмиде padh921 /Hitzenan et al., 1981/ в виде Bamiil-EcoRiфрагмента величиной 1500 п.н. Ген gpd1, соответствующий гену, содержащемуся в плазмиде pgap491 /Holland J., Holland ы. , 1979/, был клонирован из банка генов дрожжей и про-моторный фрагмент величиной 630 п.н, после ряда процедур субклонирования был предоставлен вам И.В.Карпычевым.

Структура полученных плазмид была подтверждена результатами электрофореза гидролизатов этих плазмид несколькими рестриктазами. Нуклеотидная последовательность участков стыка промоторов FH05, adh1 и gpd1 с геном hbaagпоказана на рис.5.

В настоящее время известно, что наряду с главным белком оболочки вируса гепатита В в той же рамке считывания могут синтезироваться 2 более тяжелых белка, инициирующихся с двух АТГ-кодонов, предшествующих основному. Средний белок оболочки, начинавший синтезироваться со второго АТГ-кодона, включается в состав вирусных частиц наряду с главным белком и несет в N-концевой части рецеп-торную область, которая, по-видамсму, отвечает за адсорбцию вируса

РНК » > «

CATGASAATAA6&ACAACAACAAMAGA6C«A6CMATTCSAGATHCCA ATE TU ... РН05Ы8>/Н>»

CAT6ASAATAA6AACAACAACAAATA6AGCAAScUg»»Ucq»tTCSAS6AÏTSSSSACCCTSCSCTSAAt ATE SAG PHD5l-I!)/H8s

CAT6ABAATAASAACAACAct»)»lUcQ«UC6A6GATTEE66ACCnEC6nBAAC AI6 6AS ... РН051-ЗШНВ«

CATSA6AATAA6AACctigaittcgitTCSASSATTSSSSACCCTSCSCTGAAC ATS SAG ... РШ5(-12)/ИВ»

CATGAGAATAAGAACAACAACAAfrïAEA6CAAGCAAATctiguUmSAAC ATE SAG ... SPD « «

TTTTAAAACACCAASAACTTASTTTCSAATAAACACACATAAATAAACAAA ATS ... EPD'Hit

TTTTAAAACACCAASAACTTAETT7CGAcctgtïUcicicaUuciigutUqqBAAC ATE GAE ... GPD/prtS2-HBs

TÎÎTAAAACACCAASAACTTASTTTCSAcctgc«K«»cJt»miai»lttcC «TS CAS ... AUW • «

TSCACAATATTTCAASCTATACCAAECATACAATCAAHATCTCATATACA ATS ... ADHl/HB»

rSHCAATA?TTCAASCTATACCAASCATACAATCAACTATCTC«i)iittct;SAAC ATS SAG ...

Рис.5. Нуклеотидная последовательность участков стыка дрожжевых

промоторов РН05/ -18, -31, -36/, ADH1 И GPD1 С геном HBsAg.

Строчными буквами указаны положения EcoRi-линкеров, использованных при клонировании. Звездочками отмечены положения сайтов инициации транскрипции в интактной последовательности промоторов.

на клетках печени / Persing et al., 1985, Michel et al. , 1985/. Предполагают, что антигенная детерминанта, локализующаяся в данной области, как иммунизирующий антиген , обладает высокими протектив-ными свойствами.

Нагл удалось клонировать указанную область вирусного генома (называемую ргеЗ(2}-областью), используя в качестве исходного BamHI-Peti фрагаент вирусной ДНК из плазмиды рНВУЧЗО . Нужный фрагмент получали путём частичного гидролиза исходного фрагмента

рестриктазой BspRi с последующим гидролизом рестриктазой Xbal и клонировали в полученной ранее плазмиде рНВз-ипо ЕсоШи хъа1 сайтам, причем EcoRi-конец был "затуплен" путём достройки фрагментом Клёнова для лигирования с "тупым" BspRi-концом фрагмента. Полученную конструкцию, содержавшую в результате ген среднего белка оболочки /ргеЗЭ +s/ и терминатор ИЮ5, вводили в векторную плазмиду уер 1 зпод контроль промотора gpdi по той же схеме, что и ранее полученные конструкции. Структура полученной плазмида была проверена путём гидролиза несколькими рестриктазами.

Всеми указаннишз плаэмидэми трансформировали штамм дрожжей АН22 ( a leu2 his4 can1 cir+ ) / Miyanohara et al. , 1983/. Изолированные клоны-трансформанты дрожжей культивировали на селективной ив -среде в течение суток, затем клетки отмывали и переносили на бесфосфатную ypd-среду, где продолжали культивирование в течение 20 часов. Клетки, осажденные из культуральной среда, разрушали механически с помощью стеклянных бус в рвз -буфере с добавлением тритона Х-100 и ингибитора протеаз - фенилметилсульфонилфторида. Содержание мультимерной формы HBsAg в полученных экстрактах определяли иммунсшвдически "двойным антительным сэндвич-методсм" с использованием наборов реагентов фирмы " Ortho-diagnostica" (США). Концентрацию в экстрактах суммарного клеточного белка определяли по методу Брэдфорда /Bradford, 1976 /. Ыонсмерную форму HBsAg выявляли с помощью электрофореза по Лапши, с последующим окрашиванием геля серебром.

Как следует из полученных данных, уровень экспрессии гена HBsAg в различных сконструированных "кассетах экспрессии" различался более чем на порядок /см. табл.2/.

При .использовании промотора гена FH05 и первоначального варианта гена HBsAg наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в случае YEpPH05(-3l)/HBs, то есть когда не изменена последова-

Таблица 2

Уровень синтеза нввАе рекомбинантными шташами дрожжей

Тип трансформанта

Содержание HBuAg ,мкг/г белка

AH22/YEpPH05(-36)/НВв AH22/YEpPH05(-31)/НВв АН22/¥ЕрРН05(-1В)/НВа AH22/YEpPH05(-12)/HBs-Ii AH22/YEpADH1/НВз-N AH22/XBpGPD1/HBs-H АН22/ХЕр GPD1/preS(2)+НВв-Я

60 180 120 650

420

320

230

Приведены усредненные данные, полученные при анализе не менее 5 независимых траясформантов каждого'типа

тельность в точке инициации транскрипции и расстояние между этой точкой и АТГ-кодоном близко к оптимальному для промотора Ш05. Однако максимальный синтез обеспечивала плазмида УЕрРН05(-12)/HBs-N, в которой при наличии наиболее оптимальной для FH05 структуры 5»-нетранслируемой области мРНК была удалена протяженная З'-не-транслируемая область гена нваАв, В этом случае выход HBsAg достигал 0,05-0,07$ от суммарного белка дрожжей, что соответствует результатам, полученным другими авторами при использовании ЕН05 промотора. Оказалось, что уровень синтеза главного белка оболочки ( HBsAg) вируса гепатита В в гомологичных конструкциях под контролем плазмид ХЕрADH1 /нвв-н и YBpGPDi/HBs-ir не превышал значений, полученных для плазмида YEpPH05(-12)/HBs-H , несмотря на использование во вторсы случае мощного промотора гена Gral. Область инициации транскрипции мШК гена HBaAg, кодируемая указанными плаз-мидами, была близка по структуре к соответствующим последователь-

ностям интактных генов аш1 и йргп . Возможно, ограничение уровня синтеза связано не с транскрипцией гена НВвАй , а с эффективностью трансляции из-за внесенных при клонировании изменений в структуру лидерного участка мЕНК.

Наши данные показывают, что уровень синтеза в гомологичной конструкции среднего белка оболочки /ргеЭ(2)+з / вируса гепатита В сравнительно низок, что по-видимому, связано с меньшей устойчивостью белка к протеолизу в дрожжевой клетке. Однако последние исследования ряда авторов показывают, что это затруднение преодолимо путем модификации гена /Tujiвam е* а!., 1986/.

Следует отметить, что использованный метод иммуноферментного анализа позволяет детектировать лишь мультимерную форму нвзАз, которая составляет в дрожжах до 5% от Есего синтезируемого пввАе / щ^гетап е-ь а1., 1985/. Оставшаяся часть присутствует в виде мономера, ассоциированного с клеточными мембранами. Этот белок может быть экстрагирован в присутствии зпз и уЗ-2-меркаптоэтанола, выявляется на электрофореграмме при окраске серебром. В отличие от нваАе , выделенного из крови носителей, дрожжевой НВвА& не гликозилнрован.

В заключение отметим, что несмотря на различия в физико-химических свойствах двух экспрессируешх белков (растворимый салато-тропин человека и сильно гидрофобный НВаАд ), уровень их синтеза в рекомбинантных штаммах дрожжей примерно одинаков и составляет 0,5-1,5$ от суммарного белка дрожжей. Эти результаты согласуются с данными ряда зарубежных авторов по экспрессии генов ссматотропи-на человека и НЕаАй , а также некоторых других эунариотических белков.

В !1 В О Д 1.1

1. Клонированы регуляторнне элементы гена FH05 S.cerevisiae. Получен набор делеционных вариантов промотора гена кислой фосфа-тазы, на основе которых сконструированы векторы экспрессии для дрожжей.

2. Получены штаммы S.csrevisiae , экспрессируюшие ген сала-тотропина человека. Изучены закономерности синтеза и секреции соматотропина в полученных штаммах дрожжей в зависимости от структуры промотора и природа сигнальной последовательности секреции.

3. Продемонстрирована возможность процессинга предшественников соматотрошша в клетке s.cerevisiae , как при использовании сигнальной последовательности самого соматотропина, так и сигнальной последовательности секреции кислой фосфатазы, с последующим экспортом зрелого соматотропина в культур альную среду дрожжей.

4. Получены штаммы s.cerevisiae , синтезирующие главный и средний белки оболочки вируса гепатита В под контролем промоторов генов РН05, ADH1 И GPDI S.cerevisiae.

5. На примере соматотропина человека и HBsAg исследовано влияние структуры б'-нетранслируемой области мРНК на экспрессию гетералогичных генов в дрожжах. Показана важность сохранения интактной структуры лидерной последовательности мЕНК для эффективной гетерологичной экспрессии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБШЖОВАПЯ К ПО TE.IE ДИССЕРТАЦИИ:

1. Скрябин К.Г., Циоменио Л.Б., Порзунов С.П., Карпычев И.В., Дупашин В.В., сиьдаров L1.A., Рубцов П.М., Кулаев И.С., Баев А.А. "Синтез и секреция гормона роста человека у дрожжей Saccharorayces cereviciac" . - Биотехнология, 1987, т.З, J,' 3,

с • 312—31 ci.

2. ильдаров М.А., Порзунов С.П,, Карпычев И.В., Скрябин К.Г., Василенко О.В., Свешников П.!.!., Северин Е.С., Ерантл 3.,

Ланг X., Росслер X., Розенталь 3. "Синтез поверхностных антигенов вирусов в дрожжах. - Биотехнология, 1987, т.З, 3, с.319-324.

3. Скрябин К.Г., Ыльдаров 1,1.А., Карпычев К.В., ¡Лорзунов С.П., Рубцов П.гЛ., Циоменко А.Б., Кулаев И.С., Баев А.А. "Экспрессия гетерологичних генов в дрожжах. 8-й Двусторонний симпозиум СССР-Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот". Тезисы докладов. И., 1986, с.20.

4. Eldarov М.А., Morzunov S.P., Rubtsov P.M., Parsadanyan a.S., Tziomenko A.B., Kulaev I.S., Skryabin K.G., Bayer A.A. Expression of the human growth hormone gene in yeast. - 2 International

..Specialized Symposium on Yeast. Abstracts. Varna (Bulgaria), 1985, p.81.

■5. Eldarov LI.A., Tziomenko A.B., Karpychev I.V., Morzunov S.P.,

TChernov B.K., Rubtsov P.M., Kulaev I.S., Skryabin K.G., Bayev A.A, Synthesis and secretion of mammalian proteins in yeast. - Severnth German-Soviet Symposium "Organization and Punotion of the Eucaryotic Genome". Abstracts. Heidelberg (PKG), 1987, p.1.