Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и характеристика генов, вовлеченных в регуляцию биосинтеза клеточной стенки дрожжей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пакайзер, Анна Николаевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Клеточная стенка дрожжей".

1. Строение и функции клеточной стенки.

2. Структура и биосинтез хитина.

3. р-глюканы клеточной стенки.

3.1 Биосинтез р1,6-глюканов.

3.2 Биосинтез р1,3-плюканов.

4. Маннопротеины клеточной стенки.

4.1 Модификации белков клеточной стенки в путях секреции.

4.1.1 Импорт в эндоплазматический ретикулум.

4.1.2 jV-гликозилирование.

4.1.3 0-гликозилирование.

4.1.4 Особенности гликозилирования белков в клетках Hansenula polymorpha.

4.1.4. Присоединение гликозилфосфатидилинозитола.

4.2. Транспорт маннопротеинов к клеточной стенке.

4.3. Механизмы встраивания белков в клеточную стенку.

5. Регуляция биосинтеза клеточной стенки. РКС-каскад.

5.1 Протеинкиназы РКС-каскада.

5.2 Регуляция РКС-каскада.

5.3 Мишени действия протеинкиназ РКС-каскада.

5.3.1 Белки, участвующие в биосинтезе клеточной стенки.

5.3.2 Актиновый цитоскелет.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и характеристика генов, вовлеченных в регуляцию биосинтеза клеточной стенки дрожжей"

Дрожжи являются одним из наиболее удобных и часто используюемых объектов современной генетики. С одной стороны, эти микроорганизмы относятся к низшим эукариотам и имеют характерную компартментализованную внутриклеточную структуру, что позволяет использовать их в качестве модельного эукариотического организма. С другой стороны, у дрожжей получены представительные коллекции мутантных штаммов, несущих охарактеризованные мутации по различным генам, так что в зависимости от экспериментальных задач при помощи скрещивания можно получать штаммы с заданной комбинацией мутантных локусов. К настоящему времени расшифрованы последовательности всех генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, что сильно упрощает работу как с этим организмом, так и с дрожжами других видов. Наконец, дрожжи нетребовательны к условиям культивирования и быстро растут. В последние годы благодаря изучению, в основном, дрожжей S. cerevisiae, было получено много информации, касающейся клеточного морфогенеза. Несмотря на внешнюю простоту дрожжевой клетки, механизмы, определяющие форму клетки, ее размер и полярность, оказались общими для дрожжей и высших эукариот.

Размер и форма дрожжевых клеток определяются, в основном, клеточной стенкой, жесткой структурой, окружающей клетку. Наличие клеточной стенки характерно для клеток растений, бактерий и грибов. Изучение строения и формирования клеточной стенки представляет интерес по двум причинам. С чисто академической точки зрения, поскольку эта структура определяет форму клеток, она является удачной моделью для изучения клеточного морфогенеза. Механизмы, регулирующие биосинтез клеточной стенки, оказываются напрямую связаны с такими фундаментальными клеточными процессами, как рост, деление, секреция, ответ клетки на стресс. Поэтому многие гены, контролирующие биосинтез клеточной стенки дрожжей, имеют гомологов в клетках млекопитающих. С практической точки зрения, клеточная стенка, будучи характерной особенностью грибов и бактерий (в том числе и паразитов животных и человека), может служить отличной мишенью для разработки антибактериальных и противогрибковых препаратов. Кроме того, недавно изучение строения клеточной стенки дало g неожиданный биотехнологический выход. Открытие механизмов "заякоривания" собственных белков дрожжей в клеточной стенке позволило иммобилизовать на ней и гетерологичные белки, используя затем такие штаммы для создания оральных вакцин (иммобилизация антигенов), систем очистки белков (иммобилизация антител, взаимодействующих с нужным белком), систем очистки воды от тяжелых металлов (иммобилизация белков, связывающих тяжелые металлы). Изучение регуляции биосинтеза клеточной стенки дрожжей возможно, прежде всего, путем получения мутантов с нарушенной клеточной стенкой, клонирования соответствующих генов и изучения влияния данных мутаций как непосредственно на структуру и состав клеточной стенки, так и на другие клеточные процессы, такие как ионный гомеостаз, секреция белков, чувствительность клетки к различного рода стрессам и т. д. Предлагаемая работа посвящена изучению двух новых генов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки, один из которых клонирован из генома классического объекта генетики - S. cerevisiae, а другой - из генома метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Клеточная стенка дрожжей".

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Пакайзер, Анна Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Мутация ssu21 S. cerevisiae приводит к дефектам клеточной стенки, в частности, к уменьшению содержания в клеточной стенке маннопротеинов.

2. Сверхсекреторный фенотип мутанта ssu21 обусловлен дефектами клеточной стенки и осмотической нестабильностью клеток.

3. Клонирован ген SSU21, кодирующий белок, локализованный на мембране вакуоли.

4. Мутация ори24 Н. polymorpha приводит к нарушениям структуры и функции клеточной стенки, что может быть обусловлено нарушениями N-и 0-гликозилирования секретируемых белков.

5. Клонирован ген OPU24, кодирующий ГДФ-манноза пирофосфорилазу Н. polymorpha.

6. Сверхсекреторный фенотип мутанта ори24 не является следствием ослабленной клеточной стенки, а связан с нарушениями процессов задержки/деградации белков вэндоплазматическом ретикулуме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В предлагаемой работе представлено детальное изучение двух мутантов дрожжей, ssu21 S. cerevisiae и ори24 Н. polymorpha, способных к сверхсекреции урокиназы человека. Было показано, что обе мутации приводят к нарушениям структуры и функции клеточной стенки. Было установлено, что в случае мутанта ssu21 дефекты клеточной стенки и связанные с ними осмотическая нестабильность и лизис клеток являлись причиной сверхсекреции урокиназы. Увеличение секреции урокиназы клетками мутанта ори24, как было выяснено, не определяется ослаблением клеточной стенки, и оба феномена являются независимыми следствиями нарушения гликозилирования белков.

В ходе работы были клонированы два новых гена, участвующих в биосинтезе клеточной стенки дрожжей. Было показано, что ген SSU21 S. cerevisiae является жизненно важным для клеток. Мутация в этом гене приводит ко множеству фенотипов, связанных с дефектами клеточной стенки: аномальной морфологии, чувствительности клеток к различным агентам, взаимодействующим с компонентами клеточной стенки или нарушающим осмотическую стабильность клетки, снижению скорости роста и т. д. Было выяснено, что дефекты клеточной стенки, обусловленные мутацией ssu21, выражаются, прежде всего, в уменьшении количества маннопротеинов; в том числе, было установлено уменьшение содержания в клеточных стенках мутанта одного из мажорных белков - р-глюканазы Bgl2p. Было показано, что снижение количества маннопротеинов в случае мутанта ssu21 не сопровождается дефектом гликозилирования секретируемых белков. В ходе работы также были выявлены фенотипы мутанта ssu21, указывающие на взаимодействия SSU21 с РКС-каскадом, в том числе, была продемонстрирована синтетическая летальность мутаций ssu21 и Apkcl. Белок, кодируемый геном SSU21, бьш локализован на мембране клеточной вакуоли путем наблюдения флуоресценции химерного белка Ssu21p-EGFP.

Ген OPU24 Н. polymorpha, как было установлено, кодирует белок с высокой степенью гомологии ГДФ-манноза пирофосфорилазам дрожжей S. cerevisiae и С. albicans. Как было продемонстрировано в данной работе, мутация этого гена приводит к нарушениям N- и 0-гликозилирования секретируемых белков, позволяя

103 предположить, что ген OPU24 кодирует ГДФ-манноза пирофосфорилазу Я. polymorpha. Было показано, что мутация ори24, как и мутации, затрагивающие гены, кодирующие ГДФ-манноза пирофосфорилазу в случае других видов дрожжей, приводит к нарушению строения клеточной стенки. В работе был также выявлен связанный с этой мутацией сверхсекреторный фенотип, не описанный ранее для мутантов с дефектами ГДФ-манноза пирофосфорилазы. Поскольку дрожжи Я. polymorpha в последнее время часто используются для продукции белков млекопитающих, а гликозилирование белков оказывает большое влияние на их свойства, клонирование гена, участвующего в процессах гликозилирования в клетках этого организма, имеет значение и для биотехнологии.

Использованный в работе подход, связанный с изучением сверхсекреторных мутантов дрожжей, позволяет находить новые гены, участвующие в различных процессах, определяющих клеточный морфогенез, в частности, в процессах секреции и биосинтеза клеточной стенки. Исследование сверхсекреторных мутантов может оказаться перспективным и для выявления генов, осуществляющих общую регуляцию этих процессов. В настоящее время в лаборатории молекулярной генетики с помощью этого подхода изолировано еще два гена Я. polymorpha, мутация одного из которых, как и ори24, влияет и на секрецию белков, и на биосинтез клеточной стенки, а другого - по-видимому, только на секрецию. Кроме того, ведутся исследования взаимодействий гена SSU21S. cerevisiae с другими генами, которые помогут прояснить его роль в биосинтезе клеточной стенки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пакайзер, Анна Николаевна, Москва

1. Amberg D. С. (1998). Three-dimensional imaging of yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell 9, 3259-3262.

2. Antonsson В., Montessuit S., Friedli L., Payton M. A. and Paravicini G. (1994) Protein kinase С in yeast. J. Biol Chem. 269,16821-16828.

3. Ballou С. E. (1970). A study of the immunogenicity of three yeast mannans. J Biol Chem 245,1197-1203.

4. Ballou С. E. (1990). Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with non-conditional protein glycosylation defects. Methods Enzymol 185,440-470.

5. Ballou L., Cohen R. E. and Ballou С. E. (1980). Saccharomyces cerevisiae mutants that make mannoproteins with a truncated carbohydrate outer chain. J. Biol. Chem. 255, 5986-5991.

6. Ballou L., Hernandez L. M., Alvarado E. and Ballou С. E. (1990). Revision of the oligosaccharide structures of yeast carboxypeptidase Y. Proc Natl Acad Sci USA 87,3368-3372.

7. Banuett F. (1998). Signalling in the yeasts: an informational cascade with links to the filamentous fungi. Micr Mol Biol Rev 62,249-274.

8. Barbet N. C., Schneider U., Helliwell S. В., Stansfield I., Tuite M. F. and Hall M. N. (1996). TOR controls translation initiation and early G1 progression in yeast. Mol Biol Celll, 25-42.

9. Batiza A. F., Schulz Т., and P. H. Masson. (1996). Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol Chem. 271,23357-23362.

10. Blagoeva J., Stoev G. and Venkov P. (1991). Glucan structure in a fragile mutant of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7,455-461.

11. Blobel G. and Dobblrstein B. (1975). Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed or unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J. Cell Biol. 67, 835851.

12. Blobel G. and Dobblrstein B. (1975). Transfer of proteins across membranes. П. Reconstitution of functional rough microsomes from heterologous components. J. Cell Biol. 67, 852-862.

13. Boone C., Sommer S. S., Hensel A. and Bussey H. (1990). Yeast KRE genes provide evidence for a pathway of cell wall P-glucan assembly. J. Cell Biol. 110, 18331843.

14. Bretscher A., Dress В., Harsay E., Schott D. and Wang T. (1994). What are the basic functions of microfilaments? Insights from studies in budding yeast. J Cell Biol 126, 821-825.

15. Brodsky J. L. and McCracken A. A. (1997). ER-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topologically restricted events came together. Trends Cell Bioll, 151-156.

16. Brown J. L. and Bussey H. (1993). The yeast KRE9 gene encodes 0-glycoprotein involved in cell surface P-glucan assembly. Mol. Cell. Biol. 13,6346-6356.

17. Brown J. L., Kossaczka Z., Jiang B. and Bussey H. (1993). A mutational analysis of killer toxin resistance in Saccharomyces cerevisiae identifies new genes involved in cell wall (l-> 6)-beta-glucan synthesis. Genetics 133, 837-849.

18. Briza P., Ellinger A., Winkler G. and Breitenbach M. (1988) Chemical composition of yeast ascospore wall. The second outer layer consists of chitosan. J. Biol. Chem. 263,11569-11574.

19. Buehrer В. M. and Errede B. (1997). Coordination of the mating and cell integrity mitogen-activated protein kinase pathways in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 17,6517-6525.

20. Bulawa С. E. (1993). Genetics and molecular biology of chitin synthesis in fungi. Ann.

21. Rev. Microbiol. 47,505-534.

22. Cabib E. and Farkas V. (1971). The control of morphogenesis: an enzymatic mechanism for the initiation of septum formation in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68,2052-2056.

23. Cabib E., Bowers B. and Roberts R. L. (1983). Vectorial synthesis of a polysaccharide by isolated plasma membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. 80,3318-3321.

24. Cabib E. and Duran A. (1975). Simple and sensitive procedure for screening yeast mutants that lyse at nonpermissive temperatures. J. Bacteriol. 124,1604-1606.

25. Cabib E., Sburlati A., Bowers B. and Silverman S. J. (1989). Chitin synthase I, an auxiliary enzyme for chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol 108,1665-1672.

26. Cabib E., Drgonova J. and Drgon T. (1998). Role of small G proteins in yeast cell polarization and wall biosynthesis. Annu Rev Biochem 67,307-333.

27. Camirand A., Heysen A., Grondin B. andHerscovics A. (1991). Glycoprotein biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Isolation and characterization of the gene encoding a specific processing a-mannosidase. J Biol Chem 266, 1512015127.

28. Caras I. W., Weddell G. N., Davidz M. A., Nussenzweig V. and D. W. Jr. Martin. (1987). Signal for attachment of a phospholipid membrane anchor in decay accelerating factor. Science 238, 1280-1293.

29. Caras I. W. and Weddell G. N. (1989). signal peptide for protein secretion directing glycophospholipid membrane anchor attachment. Science 243, 1196-1198.

30. Cardenas M. E. and Heitman J. (1995). FKBP12-rapamycin target TOR2 is a vacuolar protein with an associated phosphatidylinositol-4 kinase activity. Embo Journal 14, 5892-5907.

31. Carlson, M. and Botstein, D. (1982). Two differentially regulated mRNAs with different 5' ends encode secreted and intracellular forms of yeast invertase. Cell 28, 145-154.

32. Castro О., ChenL. Y., Parodi A. J. and Abeijon C. (1999). Uridine diphosphate-glucose transport into the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae: In vivo and in vitro evidence. MolBiol Cell 10, 1019-1030.

33. Chaffin W.J., Stocco D.M. (1983). Can J Microbiol. 29,1438-1444.

34. Conzelmatin A., Fankhauser C. and Desponds C. (1990). Myoinositol gets incorporated into numerous membrane glycoproteins of Saccharomyces cerevisiae; incorporation is depend on phosphomannomutase (SEC53). EMBO J 9,653-661.

35. Conzelmann A., Puoti R. L., Lester L. and Desponds C. (1992). Two different types of lipid moieties are present in glycosyl phosphatidylinositol-anchored membrane proteins of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 11,457-466.

36. Costello L. C. and Orlean P. (1992). Inositol acylation of a potential glycosyl phosphoinositol anchor precursor requires acyl coenzyme A. J Biol Chem 267, 8599-8603.

37. Costigan C., Gehrung S. and Snyder M. (1992). A synthetic lethal screen identifies SLK1, a novel protein kinase homolog implicated in yeast cell morphogenesis and cell growth. Mol. Cell, Biol. 12, 1162-1178.

38. Dallies N., Francois J. and Paquet V. (1998). A new method for quantitative determination of polysaccharides in the yeast cell wall. Application to the cell wall defective mutant of the Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14,1297-1306.

39. Dekker L. V. and Parker P. J. (1994). Protein kinase С a question of specificity. Trends Biochem Sci 19,73-77.

40. De Nobel J. G„ Klis F. M., Priem J., Munnik T. and Van Den Ende H. (1990). The glucanase-soluble mannoproteins limit cell wall porosity in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 6,491-499.

41. De Nobel J. G. and Lipke P. N. (1994). Is there a role for GPIs in yeast cell wall assembly? Trends Cell Biol. 4,41-45.

42. Divecha N. and Irvine R. F. (1995). Phospholipid signalling. Cell 80,269-278.

43. DodouE. and TreismanR. (1997). The Saccharomyces cerevisiae MADS-box transcription factor Rlml is a target for the Mpkl mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol 17,1848-1859.

44. Drgonova J., Drgon Т., Tanaka K., KollarR., Chen G. C., Ford R. A., Chan C. S., Takai Y. and Cabib E. (1996). Rholp, a yeast protein at the interface between cell polarization and morphogenesis Science 272,277-279.

45. Eglund, P. T. (1993). The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annu. Rev. Biochem. 62,121-138.

46. Fleet G. H. and Manners D. J. (1976). Isolation and composition of an alkali-soluble glucan from the cell walls of Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 94, 180-192.

47. Fonzi W. A. (1999). PHR1 and PHR2 of Candida albicans encode putative glycosidases required for proper cross-linking of beta-1,3- and beta-l,6-glucans. JBacteriol 181, 7070-7079.

48. Gascon S., Neumann N. P. and Lampen J. O. (1968). Comparative study of the properties of the purified internal and external invertases of yeast. J Biol Chem 243, 1573-1577.

49. Gentzsch M., Immervoll T. and Tanner W. (1995) Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae: the protein O-mannosyltransferases Pmtlp and Pmt2p function as heterodimer. FEBS-Lett. 377,128-130.

50. Gentzsch M., Strahl-Bolsinger S. and Tanner W. (1995). A new Dol-P-Man:protein O-D-mannosyltransferase activity from Saccharomyces cerevisiae. Glycobiology 5, 77-82.

51. Gentzsch M. and Tanner W. (1996). The PMT gene family: protein 0-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is vital. EMBO J15, 5752-5759.

52. Gerber L. D., Kodukula K. and Undenfriend S. (1992). Phosphatidylinositol glycan (PIG) anchored membrane proteins. J Biol Chem 267,12168-12173.

53. Goldman R. C., Sullivan P. A., Zakula D., and Capobianco J. 0. (1995). Kinetics of beta-1,3 glucan interaction at the donor and acceptor sites of the fungal glucosyltransferase encoded by the BGL2 gene. EurJBiochem 227,372-378.

54. Grinna L. S. and Tschopp J. F. (1989). Size distribution and general structural features of TV-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast 5: 107-115.

55. Gray J. V., Ogas J. P., Kamada Y., Stone M., Levin D. E. and Herskowitz I. (1997). A role for the Pkcl MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae in bud emergence and identification of a putative upstream regulator. EMBO J. 16,49244937.

56. Hamburger D., Egerton M. and Riezman H. (1995). Yeast Gaalp is required for attachment of a completed GPI anchor onto proteins. J Cell Biol 129,629-39.

57. Harsay E. and Bretscher A. (1995). Parallele secretory pathways to the cell surface in yeast. J Cell Biol 131,297-310.

58. Hartland R. P., Vermeulen C. A., Klis F. M., Sietsma J. H. and Wessels J. G. H. (1994) The linkage of (l-3)-(3-glucan to chitin during cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 10, 1591-1599.

59. Hashimoto H., Sakakibara A., Yamasaki M. and Yoda K. (1997). Saccharomyces cerevisiae VIG9 encodes GDP-mannose pyrophosphorylase, which is essential for protein glycosylation. J Biol Chem 272,16308-16314.

60. Helliwell S. В., Schmidt A., Ohya Y. and Hall M. N. (1998). The Rhol effector Pkcl, but not Bnil, mediates signalling from Tor2 to the actin cytoskeleton. Curr Biol 8, 1211-1214.

61. Hernandez L. M., Ballou L., Alvarado E., Tsai P. K. and Ballou С. E. (1989). Structure of the phosphorylated N-linked oligosaccharides from the mnn9 and mnnlO mutants of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 264,13648-13659.

62. Herscovics A. and Orlean P. (1993). Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7, 540-550.

63. Hiramatsu R., Horinouchi S. and Beppu T, (1991). Isolation and characterization of human pro-urokinase and its mutants accumulated within the yeast secretory pathway. Gene 99,235-241.

64. Hohmann S. (1997). Shaping up: the response of yeast to osmotic stress. In Hohmann S. and Mager W. H.(Eds), Yeast Stress Responses, R.G. Landes Company, Austin, pp. 101-146.

65. Hong Z., Mann P., Brown N. H., Tran L. E., Shaw K. J., Hare R. S. and Di Domenico B. (1994). Cloning and characterization of KNR4, a yeast gene involved in (l,3)-beta-glucan synthesis. Mol Cell Biol 14,1017-25.

66. Horvath A., Sutterlin C., Manning Krieg U., Mowa N. R. and Riezman H. (1994). Ceramide synthesis enhances transport of GPI-anchored proteins to the Golgi apparatus in yeast EMBO J13,3687-36.

67. Jacoby J. J., Nilius S. M. and Heinisch J. J. (1998). A screen for upstream components of the yeast protein kinase С signal transduction pathway identifies the product of the SLG1 gene. Mol Gen Genet 258, 148-155.

68. Jakob C. A., Burda P, Roth J. and Aebi M. (1998). Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol 142, 1223-1233.

69. Jiang В., Sheraton J., Ram A. F. J., Dijkgraaf G. J. P., Klis F. M. and Bussey H. (1996). CWH41 encodes a novel endoplasmic reticulum iV-glycoprotein involved in P-1,6-glucan assembly. J. Bacteriol. 178:1162-1171.

70. Kalebina T. S., Rudenskaya G. N., Selyakh I. O., Khodova О. M., Chestukhina G. G., Stepanov V. M. and Kulaev I. S. (1988) Serine proteinase from Bacillus brevis: lytic action an intact yeast cells. Appl Microbiol Biotechnol 28, 531-536.

71. Kamada Y., Jung U. S., Piotrowski J. and Levin D. E. (1995). The protein kinase deactivated MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae mediates a novel aspect of the heat shock response. Genes Dev. 9,1559-1571.

72. Kamada Y„ Qadota H., Python C. P., Anraku Y., Ohya Y. and Levin D. E. (1996). Activation of yeast protein kinase С by Rhol GTPase. J Biol Chem 271, 91939196.

73. Kang H. A., Sohn J.-H., Choi E.-S., Chung В. H„ Yu M.-H. and Rhee S. K. (1998). Glycosylation of human ai-antitrypsin in Saccharomyces cerevisiae and methylotrophic yeasts. Yeast 14,371-381.

74. Kapteyn J. C., Montijn R. C., Dijkgraaf G. J. P., Van Den Ende H. and Klis F. M. (1995). Covalent association of (3-1,3-glucan with p-l,6-glucosylated mannoproteins in cell walls of Candida albicans. J. Bacteriol. 177,3788-3792.

75. Karpova T. S. McNally J. G., Moltz S. L. and Cooper J. A. (1998). Assembly and function of the actin cytoskeleton in yeast: relationship between cables and patches. J Cell Biol 142,1501-1517.

76. Kessler G. andNickerson W. J. (1959). Glucomannan-protein complexes from cell walls of yeasts. J Biol Chem 234,2281-.

77. Ketela Т., Green R., and Bussey H. (1999). Saccharomyces cerevisiae Mid2p is a potential cell wall stress sensor and upstream activator of the PKC1-MPK1 cell integrity pathway. JBacteriol 181,3330-3340.

78. Kilker R. D., Saunier В., Tkacz J. S. and Herscovics A. (1981). Partial purification from Saccharomyces cerevisiae of soluble glucosidase which removes the terminal glucose from the oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2. J Biol Chem 256,5299-5303.

79. Klebl F. and Tanner W. (1989). Molecular cloning of a cell wall exo-beta-l,3-glucanase from Saccharomyces cerevisiae. JBacteriol 171,6259-6264.

80. Klis F. M. (1994). Review: cell wall assembly in yeast. Yeast 10, 851-869.

81. Knop M., Hauser N. and Wolf D. H. (1996). iV-glycosylation affects endoplasmic reticulum degradation of a mutated derivative of carboxypeptidase ysc Y in yeast. Yeast 12, 1229-1238.

82. Kollar R, Petrakova E., Ashwell G., Robbins P. W. and Cabib E. (1995). Architecture of the yeast cell wall: the linkage between chitin and P(l,3)-glucan. J. Biol Chem. 270,1170-1178.

83. Kopecka M., Pfaff H. J. and Fleet G. H. (1974). Demonstration of a fibrillar component in the wall of the yeast Saccharomyces cerevisiae and its chemical ctructure. J. Cell Biol 62,66-76.

84. Korn E. D. and Northcote D. H. (1960). Physical and chemical properties of polysaccharides and glycoproteins of the yeast cell wall. Biochem J 75,12-.

85. Kowalski J. M., Parekh R. N. and Wittrup K. D. (1998). Secretion efficiency in Saccharomyces cerevisiae of bovine pancreatic trypsin inhibitor mutants lackingdisulfide bonds is correlated with thermodynamic stability. Biochemistry 37,12641273.

86. Kuranda M.J. and Robbins P.W. (1991). Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 266,19758-19767.

87. Lee K.S., Irie K., Gotoh Y., Watanabe Y., Araki H., Nishida E., Matsumoto K. and Levin D. E. (1993). A yeast mitogen-activated protein kinase homolog (Mpklp) mediates signaling by protein kinase C. Mol. Cell. Biol. 13,3067-3075.

88. Lee K. S. and Levin D. E. (1992). Dominant mutations in a gene encoding a putative protein kinase (BCK1) bypass the requirement for a Saccharomyces cerevisiae protein kinase С homolog. Mol. Cell. Biol. 12,172-182.

89. Leidich S. D., Drapp D. A. and Orlean P. (1994). A conditionally lethal yeast mutant blocked at the first step in glycosyl phosphatidylinositol anchor synthesis. J Biol Chem 269,10193-10196.

90. Levin D. E. and Bartlett-Heubusch E. (1992). Mutants in the S. cerevisiae PKC1-gene display a cell-cycle-specific osmotic stability defect. J Cell Biol. 11,1221-1229.

91. Leidich S. D. and Orlean P. (1996). Gpil, a Saccharomyces cerevisiae protein that participates in the first step in glycosylphosphatidylinositol anchor synthesis. J Biol Chem 271,27829-27837.

92. Levin D. E., Fields F. O., Kunisawa R., Bishop J. M. and Thorner J. (1990). A candidate protein kinase С gene, PKC1, is required for the S. cerevisiae cell cycle. Cell 62, 213-224.

93. Maerkish U., Reuter G., Stateva L. I. and Venkov P. (1983) Mannan structure analysis of the fragile Saccharomyces cerevisiae mutant VY1160. Int J Biochem 15,13731377.

94. Manners D. J., Masson A. J. and Patterson J. C. (1973). The structure of a P-1-3-D-glucan from yeast cell walls. Biochem. J. 135,19-30.

95. Mazur P. and Baginsky W. (1996). In vitro activity of 1,3-beta-D-glucan synthase requires the GTP-binding protein Rhol. J Biol Chem 271,14604-14609.

96. Mazur P., Morin N., Baginsky W., el-Sherbeini M., Clemas J. A., Nielsen J. B. and Foor, F. (1995). Differential expression and function of two homologous subunits of yeast 1,3-beta-D-glucan synthase. Mol Cell Biol 15, 5671-5681.

97. Mazzoni C., Zarov P., Rambourg A. and Mann C. (1993). The SLT2 (MPK1) MAP kinase homolog is involved in polarized cell growth in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 123, 1821-1833.

98. McConville M. J. and Ferguson, M. A. J. (1993). The structure, biosynthesis and function of glycosylated phosphatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukaryotes. Biochem J. 294,305-324.

99. Meaden P., Hill K., Wagner J., Slipetz D., Sommer S. S. and Bussey H. (1990). The yeast KRE5 encodes a probable endoplasmatic reticulum protein required for (1-6)-j3-D-glucan synthesis and normal cell growth. Mol. Cell. Biol. 10:3013-3019.

100. Menon А. К. and Stevens V. L. (1992). Phosphatidylethanolamine is a donor of the ethanolamine residue linking a glycosylphosphatidylinositol anchor to protein. J Biol Chem 267,15277-15280.

101. Mirstein C., Brownlee G. G., Harrison Т. M. and Mathews M. B. (1972). A possible precursor of immunoglobin light chains. Nature 239, 117-120.

102. Mondesert G., Clarke D. J. and Reed S. I. (1997). Identification of genes controlling growth polarity in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae: a possible role of iV-glycosylation and involvement of the exocyst complex. Genetics 147, 121-134.

103. Mrsa Y., Klebl F. and Tanner W. (1993). Purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae BGL2 gene product, a cell wall endo-beta-l,3-glucanase. J Bacterial 175,2102-2106.

104. Mrsa V., Ugarkovic T. and Barbaric S. (1992). Binding of Saccharomyces cerevisiae extracellular proteins to glucane. Arch Biochem Biophys 296,569-574.

105. Novick P. and Botstein D. (1985). Phenotypic analysis of temperature-sensitive yeast actin mutants. Cell 40,405-416.

106. Paravicini G., Cooper ML, Friedli L., Smith D. J., Carpentier J. L., Klig L. S. and Payton M. A. (1992). The osmotic integrity of the yeast cell requires a functional PKC1 gene product. Mol. Cell Biol 12,4896-4905.

107. Parekh R. N. and Wittrup K. D. (1997). Expression level tuning for optimal heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Prog 13, 117-122.

108. Philips J. and Herskowitz I. (1997). Osmotic balance regulates cell fusion during mating in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 138,961-974.

109. Posas F., Camps M. and Arino J. (1995). The PPZ protein phosphatases are important determinants of salt tolerance in yeast cells. J. Biol Chem. 270,13036-13041.

110. Posas F., Casamayor A. and Arino J. (1993). The PPZ protein phosphatases are involved in the maintenance of osmotic stability of yeast cells. FEBS Lett. 318, 282-286.

111. Qadota H., Python C. P., Inoue S. В., Arisawa M., Anraku Y., Zheng Y., Watanabe Т., Levin D. E. and Ohya Y. (1996). Identification of yeast Rholp GTPase as a regulatory subunit of 1,3-beta-glucan synthase. Science 272,279-81.

112. Ram A. F., Brekelmans S. S., Oehlen L. J. and Klis F. M. (1995). Identification of twocell cycle regulated genes affecting the beta 1,3-glucan content of cell walls in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 358,165-70.

113. Ram A. F. J., Wolters A., Hoopen R. T. and Klis F. M. (1994). A new approach for isolating cell wall mutants in Saccharomyces cerevisiae by screening for hypersensitivity to calcofluor white. Yeast 10, 1019-1030.

114. Rajavel M., Philip В., Buehrer В. M., Errede B. and Levin D. E. (1999). Mid2 is a putative sensor for cell integrity signaling in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19,3969-3976.

115. Reggiori F., Canivenc-Ganzel E. and Conzelmann A. (1997). Lipid remodeling leads to the introduction and exchange of defined ceramides on GPI proteins in the ER and Golgi of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 16, 3506-3518.

116. Robinson A. S., Hines V. and Wittrup K. D. (1994). Protein disulfide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology (NY) 12,381-384.

117. Roemer T. and Bussey H. (1991). Yeast p-glucan synthesis: KRE6 encodes a predicted type П membrane protein required for glucan synthesis in vivo and for glucan synthase activity in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 11295-11299.

118. Roemer T. and Bussey H. (1995). Yeast Krelp is a cell surface (^-glycoprotein. Mol. Gen. Genet. 249,209-216.

119. Roemer Т., Delaney S. and Bussey H. (1993). SKN1 and KRE6 define a pair of functional homologs encoding putative membrane proteins involved in beta-glucan synthesis. Mol Cell Biol 13,4039-4048.

120. Romanos M. A., Scorer C. A. and Clare J. J. (1992). Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 8,423-488.

121. Roncero C. and Duran A. (1985). Effect of Calcofluor white and Congo red on fungal wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. J. Bacteriol 163, 1180-1185.

122. Rudolph H. K., Antebi A., Fink G. R., Buckley С. M., Dorman Т. E., LeVitre J., Davidow L. S., Mao J.-i. and Moir D. T. (1989). The yeast secretory pathway isperturbed by mutations in PMR1, a member of a Ca2+ ATPase family. Cell 58, 133145.

123. Sakai A., Shimizu Y. and Hishinuma F. (1988). Isolation and characterisation of mutants which show an oversecretion phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 119,499-506.

124. Saunier В., Kilker R. D., Tkacz J. S., Quaroni A. and Herscovics A. (1982). Inhibition of iV-linked complex oligosaccharide formation by 1-deoxynojirimycin, an inhibitor of processing glucosidases. J Biol Chem 257,14155-14161.

125. Sburlati A. and Cabib E. (1986) Chitin synthase II, a presumptive participant inseptum formation in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol Chem. 261,15147-15152.

126. Schmidt A., Bickle M., Beck T. and Hall M. N. (1997). The yeast phosphatidylinositol kinase homolog TOR2 activates RHOl and RH02 via the exchange factor ROM2. Cell 88,531-542.

127. Schmidt A., Kunz J. and Hall M. N. (1996). TOR2 is required for organization of the actin cytoskeleton in yeast. Proc Natl Acad Sci US A 93, 13780-13785.

128. Schultz L. D., Tanner J., Hofmann K. J., Emini E. A., Condra, J. H., Jones R. E., Kieff E. and Ellis R. W. (1987). Expression and secretion in yeast of a 400-kDa envelope glycoprotein derived from Epstein-Barr virus. Gene 54,113-123.

129. Shaw J. A., Mol P. C., Bowers В., Silverman S. J., Valdivieso M. H., Duran A. and Cabib E. (1991). The function of chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle. J Cell Biol 114,111-123.

130. Shaw J. A., Mol P. C., Bowers В., Silverman S. J., Valdivieso M. H., Duran A. and Cabib E. (1991) The function of chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle. J. Cell Biol. 114,111-123.

131. Shematek E. M., Braatz J. A. and Cabib E. (1980). Biosynthesis of the yeast cell wall. I. Preparation and properties of p-(l->3)glucan synthetase. J. Biol Chem. 255, 888894.

132. Shimizu J., Yoda K. and Yamasaki M. (1994). The hypo-osmolarity-sensitivephenotype of the Saccharomyces cerevisiae hpo2 mutant is due to a mutation in PKC1, which regulates expression of p-glucanase. Mol Gen. Genet. 242, 641-648.

133. Shimma Y., Nishikawa A., bin Kassim В., Eto A. and Jigami Y. (1997). A defect in GTP synthesis affects mannose outer chain elongation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 256,469-480.

134. Sipos G., Puoti A. and Conzelmann A. (1995). Biosynthesis of the side chain of yeast glycosyl phosphatidylinositol is operated by novel mannosyltransferases located in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. J Biol Chem 270,1970919715.

135. Smith, R. A., Duncan, M. J. and Moir, D. T. (1985) Heterologous protein secretion from yeast. Science 229: 1219-1224.

136. Sommer Т., and Wolf D. H. (1997). ER-degradation: reverse protein flow of no return. FASEBJ11, 1227-1233.

137. Strahl-Bolsinger S., Gentzsch M. and Tanner W. (1999). Protein 0-mannosylation. Bioch Bioph Acta 1426,297-307.

138. Suzuki K., Ichikawa K. and Jigami Y. (1989). Yeast mutants with enhanced ability to secrete human lysozyme: isolation and identification of a protease-deficient mutant. Mol. Gen. Genet. 219,58-64.

139. Takeda J., Miyata Т., Kawagoe K., Iida Y., Endo Y., Fujita Т., Takahashi M., Kitani T. and Kinoshita T. (1993). Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell 73, 703711

140. Те Heesen S., Janetzky В., Lehle L. and Aebi M. (1992). The yeast WBP1 is essential for oligosaccharyl transferase activity in vivo and in vitro. EMBO J. 11,2071-2075.

141. Te Heesen S., Knauer R., Lehle L. and Aebi M. (1993). Yeast Wbplp and Swplp form a protein complex essential for oligosacchaiyl transferase activity. EMBO J. 12, 279-284.

142. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. (1979). Electrophoretic transferof proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350-4354.

143. Vallier L. G. and Carlson M. (1994). Synergistic release from glucose repression bymigl and ssn mutations in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 137,49-54.

144. Verna J., Lodder A., Lee K., Vagts A. and Ballester R. (1997). A family of genes required for maintenance of cell wall integrity and for the stress response in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA 94,13804-13809.

145. Vossen J. H., Ram A. F. J. and Klis F. M. (1995). Identification of SPT14/CWH6 as the yeast homologue of hPIG-A, a gene involved in the biosynthesis of the GPI anchors. Biochim BiophysActa 1243,549-551.

146. Waddle J. A., Karpova T. S., Waterston R. H. and Cooper J. A. (1996). Movement of cortical actin patches in yeast. J Celt Biol 132, 861-870.

147. Wang C., Eufemi M., Turano C. and Giartosio A. (1996). Influence of the carbohydrate moiety on the stability of glycoproteins. Biochemistry. 35,7299-7307.

148. Warit S., Wamsley R. and Stateva L. (1998). Cloning and sequencing of the Candida albicans homologue of SRBJ/PSA1/VIG9, the essential gene encoding GDP-mannose pyrophosphorylase in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol 144,24172426.

149. Watanabe M., Chen C.-Y. and Levin D. E. (1994). Saccharomyces cerevisiae PKC1 encodes a protein kinase С (PKC) homolog with a substrate specificity similar to that of mammalian PKC. J. Biol. Chem. 269, 16829-16836.

150. Watanabe Y., Irie K. and Matsumoto K. (1995). Yeast RLM1 encodes a serum response factor-like protein that may function downstream of the Mpkl (Slt2) mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol 15, 5740-5749.

151. Yamochi W„ Tanaka K., Nonaka H„ Maeda A., Musha T. and Takai Y. (1994).

152. Growth site localization of Rhol small GTP-binding protein and its involvement in bud formation in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 125,1077-1093.

153. Yip C. L., Welch S. K„ Klebl F., Gilbert Т., Seidel P., Grant F. J. O'Hara P. J. and

154. MacKay. V. L. (1994). Cloning and analysis of the Saccharomyces cerevisiae MNN9 mdMNNl genes requires for complex glycosylation of secreted proteins. Proc. Natl Acad. Sci USA 91,2723-2727.

155. В заключение мне хотелось бы отметить некоторые важные обстоятельства и поблагодарить людей, имевших отношение к выполнению данной диссертационной работы.