Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина в Methylobacillus flagellatum

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина в Methylobacillus flagellatum"

Министерство экономики РФ. Государственный научно-исследовательс кий институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

ВАСИН ВИТАЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

БИОСИНТЕЗА БИОТИНА В МЕТНУЮВАСШиЗ ПАСЕЫАТиМ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории генетики метилотрофов Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, проф. Ю.Д. Цыганков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. А.И. Негрусов кандидат биологических наук Т.А. Воейкова

Ведущая организация - Институт биохимими и физиологии микроорганизмов РАН.

Защита состоится 1998 г. в час. на заседай

диссертационного совета при Государственном научно-исследовательш институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адрес 113545, Москва, 1-ый дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ генетика.

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

Введение

Актуальность темы. В работе рассмотрена организация и регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина в метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum.

Метилотрофы представляют собой таксономически неоднородную группу микроорганизмов, способных использовать восстановленные формы одноуглеродных соединений в качестве источника углерода и энергии.

Бактерии, утилизирующие С1-соединения, обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофами. Главным образом это -способность расти на простых средах, используя относительно дешевые и доступные субстраты (например, метанол), удовлетворительные ростовые характеристики и качество биомассы (для кормовых целей). Интерес могут представлять следующие процессы с использованием метилотрофов: крупнотоннажная наработка биомассы; получение метаболитов (органических кислот, витаминов, аминокислот, пигментов, полисахаридов и т.д.); применение метилотрофов в качестве хозяев для экспрессии гетерологичных генов. Реализация описанных процессов требует всестороннего, в том числе генетического изучения метилотрофов.

Выбор объекта данного исследования обусловлен следующими факторами. По сравнению с другими метилобактериями, Methylobacillus flagellatum имеет некоторые преимущества: повышенный температурный оптимум роста, использование энергетически наиболее выгодного пути ассимиляции С1-соединений, биохимическая изученность, отсутствие фагов, разработанные генетические методы работы вплоть до успешной экспрессии гетерологичных генов и получения rech.- мутантов

Молекулярно-генетическая информация об облигатных метилотрофах в настоящее время весьма ограничена, в связи с этим представляет интерес сравнение функционирования некоторых клеточных процессов у метилобактерий и других микроорганизмов. В качестве модельной системы изучалась регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина. Изучение генов биосинтеза биотина М. flagellatum также важно для создания возможных штаммов-продуцентов биотина на основе клонированных 6/о-генов данной бактерии.

Наиболее полно данная группа генов изучена в Е. coli, показано, что в биосинтез биотина вовлечены 6 генов, 5 из них (bioA, bioB, bioF, bioC и bioD) организованы в оперон и их транскрипция регулируется биотипом. Транскрипция оперона осуществляется с двух дивергентно ориентированных промоторов, локализованных между генамим bioA и bioB, последовательность промоторов, частично перекрывается оператором, который представляет собой последовательность с двойной симметрией.

Детальный механизм регуляции транскрипции активно изучается и в настоящее время.

Данная работа, в части, связанной с изучением организации bio-оперона, является развитием работы проводимой в лаборатории генетики метилотрофов, в ходе которой были клонированны гены биосинтеза биотина М. ßagellatum, определена нуклеотидная последовательность 6/оВ-гена, а также частично нуклеотидная последовательность остальных 6/о-генов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение организации, а также регуляции экспрессии биотинового оперона М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи.

Определение полной нуклеотидной последовательности всех bio-генов М. flagellatum и прилегающих к ним областей. Анализ последовательности.

Локализация сигналов транскрипции и трансляции.

Установление факта регуляции транскрипции bio-

оперона.

Локализация сайта связывания с возможным репрессором.

Определение условий репрессии биотинового

оперона.

Конструкция векторов для эффективной экспрессии bio-генов в М. flagellatum и Е. coli.

Научная новизна н практическая значимость Определена организация генов биосинтеза биотина у метилотрофной бактерий, изучены основы механизма регуляции экспрессии этих генов. Изученный механизм регуляции ¿/о-оперона во многом отличается от соответствующего механизма у Е. coli. Созданы вектора для эффективной экспрессии генов биосинтеза биотина в широком спектре Грамм-отрицательных бактерий.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (159 наименований) и содержит 21 рисунок и 12 таблиц. Объём работы - 80 страниц.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на:

6-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Флореция, Италия, 1993) и

7-ом Международном сиппозиуме "Микробный рост на С-1 соединениях" (Варвик, Англия, 1993), а также на семинаре Секции генетики микроорганизмов Ученого Совета при ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (1998).

Результаты и обсуждение

1. Уточнение нуклеотидной последовательности генов Ыо¥, ЫоН, ЫоС, ЫоТ) и ЫоА, определение нуклеотидной последовательности областей, прилегающих к й/о-кластеру и её анализ.

К началу данной работы была определена полностью нуклеотидная последовательность гена ЫоВ и 80 % последовательности остальных Ыо-генов (рисунок 1). На первом этапе представлялось необходимым полностью определить нуклеотидную последовательность 6/о-кластера, а так же граничащих с ним областей.

1 т.п.н

BamHl Bgl2 Smal

Pstl Sac2

Sal

i

NrulBspll9 BamHl

_l_I_1

Pstl Espl

Sphl Nrul

L_J_!_1

ЫоВ bioF bioH bioC bioD orfl

bioA

Рисунок 1. Тонкими стрелками показано направление секвенирования с соответствующих матриц. Большие стрелки показывают расположение bio-генов, а i а к же вероятные рамки считывания, найденные при анализе последовательности.

Нуклеотидная последовательность фрагментов BamHI-Bspll9 и Sphl-i-spl, учитывая результаты полученные ранее, была определена по двум цепям. В результате анализа полученной нуклеотидной последовательности удалось уточнить аминокислотные последовательности генов bio¥, bioH, /»«С, bioD и ЫоА.

При поиске гомологии с известными белковыми последовательностями Л/'оЛ-ген проявил максимальную гомологию к соответствующему гену В. sphaericas (49 % идентичных аминокислот), а гены bioD и bio? оказались наиболее близки к генам Е. coli (43 % и 38 %) и S. marcescens (44 % и 36 %). Интересный результат был получен при поиске генов, гомологичных ЫоС и ЫоН генам. Обнаружилось, что кроме аналогичных генов Е. coli (34 % для ЫоН и 34 % для ЫоС) и S. marcescens, 6/оН-ген гомологичен группе генов гидролаз, а 6/оС-ген - генам метилтрансфераз. Учитывая, что функция ЫоН и ЫоС генов неизвестна, данные по гомологии этих генов с генами гидролаз Ii метилтрансфераз, соответственно, важны для изучения биохимических эеакций, в которых участвуют продукты этих генов.

Проводился поиск открытых рамок считывания (ORF) в областях юграничных с Ь/о-кластером. До гена Ь/оВ-гена не было найдено ни одной 3RF, тогда как после 6/о-кластера обнаружено две рамки считывания.

расположенных непосредственно одна за другой и ориентированных в противоположном направлении относительно bio-генов. Одна из них (ORF1) в высокой степени (60%) гомологична продукту гена ргоА, следовательно, мы имеем достаточные основания предположить, что 6/о-оперон граничит с генами биосинтеза пролина, что в свою очередь согласуется с данными по картированию этих генов на хромосоме.

В работах по изучению треонинового оперона, а также reck- гена М flagellatum отмечалось, что сигналы транскрипции и трансляции М. flagellatum сходы с соответствующими последовательностями Е. coli, а следовательно, промоторная область М. flagellatum должна быть близка классическому консенсусу промотора Е. coli (TTGACa(16..18n)TatAaT).

Поиск последовательности гомологичной консенсусу проводился перед Ь/оВ-геном и привёл к следующим результатам. Было найдено 6 последовательностей, из них только одна находится в непосредственной близости от начала Ь/оВ-гена; четыре другие расположены на расстоянии 440-697 от начала гена и одна - 17 пар после начала гена. Максимально соответствует консенсусу последовательность на расстоянии 413 нуклеотидов от начала гена, более того, перед ней находится "AT"- богатая область с отношением "AT" к "GC" как 3/1. Таким образом, наиболее вероятно, именно эта последовательность является промотором 6/о-оперона.

Известно, что сайт оператора в 6/о-опероне Е. coli представляет собой последовательность с двойной симметрией. Исходя из этого, проводился поиск последовательностей, которые могли бы участвовать в механизме регуляции транскрипции, а именно прямые и инвертированные повторы. В результате поиска было найдено три сайта с выраженной двойной симметрией. Первый из них расположен в начале гена ЫоВ и включает 12 симметричных нуклеотидов. Следующий сайт находится непосредственно перед ¿/оН-геном, его образуют 15 симметричных нуклеотидов (Рисунок 26). И последний - за 6/о-опероном, в его состав входят 13 нуклеотидов (Рисунок 2в). Указанные последовательности показаны на рисунке 2. В непосредственной близости от вероятных промоторов ни одной подобной последовательности обнаружено не было, в то время как у Е. coli саш оператора перекрывается с двумя разнонаправленными промоторами.

a. t tt tt tgtg 6. g

1086 5' q qq q ctqaggac g 5' atq aaqatgtccaqc а

1129 3' с cc с qaeteetq с 3' tac ttctacaqqtcq t

g cg cg ttat g t

в. te

5' ccctgcaatcct g 3' gqqacgttaqga t cg

Рисунок 2. Поиск сайтов с двойной симметрией

401 411 421 431 441 451 461 471

EW -35 -10 +1

tttrtqatcaqatqtaaatqqattgttgtcttqqcgcttqacaaqatataatccacctttaaattccattttcatatcat 481 491 501 511 521 531 541 551

ggctaccaaaaccatcactgccaagcagcagatgcgggcagcacaaagctttcccttcttctctagccttgcaatagtga

"Hindlll

561 571 581 591 601 611 621 631

ttccaqtattgattcctttttggattgctgcctccatctttgcctattgctccattgccaatcatccctgtacgcgagtc 641 651 661 671 681 691 701 711

tgcgaatatcttgtgcctgcaggctatcgattctatggattgatgggggcgttggtggtgctactcaatttcagctccaa

"Pstl "Clal ....

"¿1 731 741 751 761 771 781 791

catqgcaggctgggtaggcgtagggatgatctcgccttgatcatatgggagtcagcatgctggtgatcgtcccgctgggg

. "Ndel . "SphI. SOi 311 821 831 841 851 861 871

Jbi.cS -

ÏW -35 -10 SD M

tqcgcgacdtactqcgagcgcgcagggagccatggcaqqatttaaccatcaagaca^ataagtcaqagaggacagcatg

"Ncol .... "SphI 881 891 901 911 921 931 941 951

RDSVIDIRGLDRVQRARVQAKEEAPKR cqaqactcaqtqattqacatacqcqqccttqaccqtqtccaacqtgcaagqqtgcaqqcqaaqgaagaaqcqccaaaacq 961 971 981 991 1001 1011 1021 1031

WSVDDIVALFELPFSDLMHRAQSVHRE ctggagtgtggatgatattgtggcattgttcgagttgccattttcagatctgatgcacagggcacagtccgtgcatcgcg

"Bglll . . ANruI

Рисунок 3. Нуклеотидная последовательность обасти перед 6/оВ-геном.

2 Локализация старта Ä/oB-гена.

Из анализа последовательности видно, что ген 6/оВ может начинаться с метионинового кодона в позиции 878 (Рисунок 3), а также с gtg-кодона в позиции 968 (Рисунок 3). Более того, выравнивание аминокислотной последовательности BioB-гена А/. flagellatum с последовательностями BioB генов Е. coli и других микроорганизмов, показало, что продукт гена bioB М. flagellatum, начинающийся с метионина в позиции 878 имеет выступающий N-конец длинной 21 а.к. относительно белка Е. coli. При этом область гомологичная белку Е. coli начинается с 31-ой аминокислоты, а общая гомология двух аминокислотных последовательностей достигает 78%.

Для того, чтобы установить начало гена, проверяли способность комплементировать соответствующую мутацию у М. flagellatum и Е. coli авух вариантов Ь/оВ-гена, а именно, гена, начинающегося с atg-кодона в позиции 878 и укороченного варианта гена. В результате обнаружилось, что, з М flagellatum функционально активен только белок, начинающийся с иетионина, чей atg-кодон располагается в позиции 878 (рисунок 3), и ^ответственно, с этой же позиции начинается ¿/оВ-ген М. flagellatum. С другой стороны в Е. coli активны два варианта фермента и, по всей

видимости, N-конец биотинсинтазы не оказывает решающего влияния на её активность в Е. coli.

3 Анализ суммарной РНК.

Для анализа использовали дикий штамм М. flagellatum MFK1, выросший в минимальной среде или в среде с добавкой биотина или детиобиотина. Ниже показаны ауторадиографы гибридизации блотта с соответствующими зондами: к участку ДНК Sall-BamU\ с фрагментом bioC-гена (Рисунок 4, а.) и к участку ДНК Nru\-Pstl с фрагментом гена ЫоА (Рисунок 4, Ь.). Как видно из рисунка 4 а), полосы на дорожках номер 1 и 3 практически совпадают. При этом первая полоса (5 т.п.и.) приблизительно соответствует размеру биотинового оперона. На дорожке номер 2, в отличие от соседних, полосы 5 и 4,2 т.п.н. отсутствуют, при этом интенсивность двух следующих полос также снижена по сравнению с дорожками 1 и 2.

Рисунок 4. а). Аугорадиограф гибридизации с зондом к участку ДНК Sci'l-ßamHl с фрагментом 6/оС-гена. На дорожку 1 нанесён препарат РНК из культуры, выросшей в минимальной среде, дорожка 2 - РНК из культуры, выросшей в минимальной среде с биотипом и дорожка 3 - РНК из культуры выросшей, в минимальной среде с детибиотином. Количество суммарной РНК, нанесённой на каждую дорожку, равно (около 15 мкг). Ь). Аугорадиограф гибридизации с зондом к участку ДНК Nru\-Pst\ с фрагментом ЫоА-гена. В качестве маркера использован препарат ДНК фага X, обработанный рестриктазой //;>iD3.

Учитывая этот факт, а также то обстоятельство, что на каждую дорожку наносилось одинаковое количество суммарной РНК, можно сделать вывод, что транскрипция биотинового оперона регулируется биотином (10 мкг/мл в культуральной среде). Наличие других полос, отличных от 5 т.п.н., по нашему мнению, можно объяснить либо ранней терминацией транскрипции, либо специфической деградацией мРНК. На это указывает то обстоятельство, что интенсивность этих полос также зависит от присутствия

биотина в среде. Согласно рисунку 4 Ь) транскрипт 6/оА-гена соответствует размеру 1,6 т.п.н. Транскрипция этого гена не регулируется биотином.

4. Локализация промотора н сайта оператора, используя плазмиды с рекомбнпантными bioB-lacZ- генами.

Используя плазмиды, несущие различные варианты состыкованных bioB-lacZ- генов, предпологалось локализовать промотор, а также возможный сайт оператора. Была собрана серия конструкций (pNBZl, pNCZl, pNCZ2 и pNCZIA) на основе репликона мультикопийной плазмиды RSF1010. Данная плазмида является вектором широкого круга хозяев и стабильно поддерживается как в Е. coli так ив M. flagellalum. Все эти конструкции несут ген ß-галактозидазы lacZ, который состыкован с началом 6/оВ-гена М. ßagellatum таким образом, что трансляция этих генов осуществляется в одной рамке считывания. При этом сигналы инициации транскрипции и трансляции расположены только перед ¿/оВ-геном.

В плазмидах pNBZl pNCZl и pNCZIA гены состыкованы по сайту Bgl2 па расстоянии 44 а.к. от начала 6/оВ-гена, область перед началом гена на данных плазмидах последовательно укорочена по сайтам BamHI, Pstl и Sphl. На плазмиде pNCZ2 гены состыкованы по сайту Muri 1 (160 а.к. от начала гена), фрагмент перед стартом гена ЫоВ ограничен сайтом Pst 1.

При культивировании штаммов М. ßagellatum, несущих данные конструкции, определяли активность ß-галактозидазы. Для штамма с плазмидой pNCZl А было показано, что активность ß-галактозидазы неотличима от контрольного бесплазмидного штамма, и следовательно, как и ожидалось, сигналы инициации транскрипции и трансляции расположены перед сайтом Sphl, совпадающим с началом 6/оВ-гена. В штаммах с плазмидами pNCZl и pNCZ2 активность ß-галактозидазы оказалась приблизительно на одном уровне (в 20-25 раз превышающий уровень контрольного штамма), тогда как, в штамме с плазмидой pNBZl уровень активности оказался в 20 раз выше по сравнению с предыдущими штаммами. Из этих данных следует, что первый промотор (РьмО локализован между сайтами Pstl и Sphl. Таким промотором может быть последовательность в непосредственной близости от начала гена. Кроме того, между сайтами BamHI и Pstl локализован второй промотор (Ры0г) и эффективность транскрипции с этого промотора в 20 раз выше по сравнению с первым.

Также было показано, что экспрессия гена ß-галактозидазы в данных штаммах практически не зависит от присутствия биотина в среде. Только для штамма с плазмидой pNBZl было показано, что в присутствии 10 мкг/мл биотина в среде активность ß-галактозидазы снизилась в 1.3 раза. Этот факт объясняется тем, что большое число копий плазмиды несущей описанную

конструкцию может оказать влияние на механизм регуляции 6/о-оперона за счёт титрования гипотетического репрессора. При этом активность р-галактозидазы может оставаться неизменной при изменении концентрации биотина в среде.

С другой стороны в этом случае мы можем наблюдать увеличение продукции биотина за счет дерепрессии биотинового оперона на хромосоме. Исходя из этого, измеряли продукцию биотина в штаммах с плазмидами рЫВ21, рЫС21, рЫС22 и рЫС21Д. Ни одна из этих глазмНд не содержит ни один целый ген биосинтеза биотина, поэтому биосинтез биотина обусловлен исключительно экспрессией 6/о-оперона на хромосоме. В результате было обнаружено, что только штамм с плазмидой рЫВ21 имеет уровень продукции, отличающийся от штамма дикого типа; продукция биотина в этом штамме возросла в 5,5 раз. На основании полученных данных можно сделать вывод, что, наиболее вероятно, регуляция оперона осуществляется по принципу репрессии, при этом сайт оператора локализован между сайтами рестрикции Ват\\\ и .

5. Определение точки начала транскрипции

Точку начала транскрипции определяли методом наращивания праймера. После локализации основного промотора опыт был проведён с использованием праймера комплементарного последовательности в позиции 528-552 (Рисунок 3). Результаты представлены на рисунке 5.

Рисунок 5. Результать. определения старта транскрипции методом достройки праймера. Использовали праймер, комплементарный последовательности в позиции 522-546 (рисунок 2) - 5' gcaaggctagagaagaagggaaagc 3'.

С помощью того же праймера определяли нуклеотидную

последовательность прилегающей области. Соответствующие пробы использовали в ■ качестве маркера размера фрагментов (дорожки Т, С, G и А). Дорожки 1 и 3 - для реакции использована РНК из штамма MFKl::pBI01. В качестве контроля использовали РНК из штамма Е. coli TGI (дорожка 2). Дорожка 4 - проба получена, используя РНК из штамма М. flagellatum MFK1. В нижней части рисунка показан участок последовательности в

непосредственной близости от промотора. Точками обозначен старт транскрипции.

Таким образом, транскрипция ¿/оВ-гена и всего Ь/о-оперона М. jlagellatum начинается с цитозина или тимина в позиции 457 или 458, или на расстоянии 5-6 нуклеотидов от начала ТААТАТ-бокса. Иначе говоря, промотором является последовательность, с началом в позиции 423 (Рисунок 3).

6. Изучение условий репрессии А/оВ-оперона в штаммах с интегрированными в хромосому bioB-lacZ- конструкциями.

Для детального рассмотрения вопросов, связанных- с регуляцией биотинового оперона, необходимо тестирование описанных выше bioB-lacZ конструкций в системе, где они были бы представлены одной копией на клетку, т.е. требовалось интегрировать эти конструкции в хромосому.

Была создана серия суицидных векторов на основе плазмиды pBR325 с CoIEl репликоном. Эти плазмиды не способны поддерживаться в M flagellation. Как видно из рисунка 6 плазмиды pBZM2 и pBZM3 отличаются точкой стыковки генов 6/оВ и lacZ. Как отмечалось ранее, между сайтами BglII и Muni при анализе нуклеотидной последовательности найден инвертированный повтор.

а). |1 тпн|

PBR325

Ь/'оВ - /ас2 Ь). ! 0.5 тгн (

ВатН\

Р Ыо2

Km b/'oHCD mob oriT

Psil Spftl Bg/ll Muni Pbio 1.

Ap

pBZM2

pBZM4

pBZM3-

bioB

b/'oB

lacZ

МИИИИМЧ

bioB

lacZ

mmmsmsm

Ыо В !асХ

Рисунок 6. а). Общая схема конструирования плазмид рВ2М2, рВ2МЗ и рВ2М4. Клонированные последовательности биотинового оперона М. flagellatum представлены как светлые прямоугольники, тёмным цветом выделена последовательность 1асЪ-гена, серым - ген устойчивости к канамицину из плазмиды риС4К и тонкой линией выделена нуклеотидная последовательность вектора рВ11325. Ь). Схемы каждой из описанных выше плазмид.

*- рестрикционная карта области перед геном 6юВ; ?Ыо\ и ?Ыо2 - вероятные промоторы; ¡. г. - инвертированный повтор. Стрелками показаны гены ЫоВ и 1асЪ.

Кроме того, сообщалось, что регуляция транскрипции б/о-оперона в Е. coli осуществляется, в том числе и на уровне ранней терминации транскрипции. Исходя из этого, предпологапось проверить влияние участка с инвертированным повтором на эффективность экспрессии ß-галактозидазы.

В отличие от плазмиды pBZM3, в плазмиде pBZM4 область перед геном bioB ограничена сайтом Pstl и не включает промотор РЫо2- С помощью данных конструкций планировалось подтвердить оценку относительной эффективности двух промоторов, сделанную ранее.

За /acZ-геном во всех конструкциях располагается ген устойчивости к канамицину из плазмиды pUC4K и вслед за ним находится группа 6/о-генов (¿/оН, bioC и bioD). Так же на всех векторах находятся mob и опТ участки из плазмиды RP4, необходимые для переноса векторов из штамма Е. coli S17-1 в М. ßagellatum.

После переноса векторов в клетку М. ßagellatum возможны два события. Во-первых, плазмида может интегрироваться в хромосому целиком вследствие рекомбинации гомологичных областей на плазмиде и хромосоме. Во-вторых, вследствие двух последовательных актов рекомбинации по двум гомологичным областям в хромосому может интегрироваться фрагмент bioB-lacZ - KmR - bioHCD. В результате интеграции плазмид должны получиться штаммы с фенотипом KmR, ApR, Bio* и LacZ* в первом случае, и во втором случае - с фенотипом KmR, Aps, Bio' и LacZ*.

Из штамма Е. coli S17-1 плазмиды были переведены в М. ßagellatum MFK1 методом конъюгативного переноса. Отбор проводили по маркеру устойчивости к канамицину. В результате данного опыта было отобрано 1520 клонов каждого типа. LacZ фенотип определяли по цветной реакции на минимальных чашках с IPTG при росте культуры в течении 2 и б суток. Кроме этого проверяли устойчивость к ампициллину и способность расти на среде без биотина.

В результате было обнаружено, что все полученные клоны обладали фенотипом KmR, ApR и Bio+. При этом, если клоны, полученные в результате интеграции плазмид pBZM2 и pBZM3, показали четкую цветную реакцию на вторые сутки на чашках с IPTG (в случае с плазмидой pBZM2 реакция была более выражена), то клоны с интегри-рованной плазмидой pBZM4 показали слабую реакцию и только на 6 сутки. В обоих случаях в качестве контроля выступал бесплазмидный штамм М. ßagellatum MFK1.

На основании этих данных можно сделать вывод, что в данных условиях для клеток штамма М. ßagellatum MFK1 процесс интеграции цело? плазмиды был более предпочтительным.

1

Биотин (мкг/мл)

- MFKi24 -MFKi25 -MFKi26 -MFKi21 -MFKi22 -MFKi23 -MFKi35 -MFKi36 -MFKi37 -MFKi31 -MFKi32 -MFK'33

Рисунок 7. Влияние биотина на экспрессию р-галактозидазы при культивиро-вании в течение 4,5 часов. Показаны результаты тестирования штаммов MFKi2l-26 и MFKi31-36. Ночные культуры, выросшие на M9ml среде в отсутствии биотина, разводили в 10 раз, после чего культивировали в пробирках в M9ml среде с различными концентрациями биотина и без него. Рост при 42°С в течение 4,5 часов. Активность Р-галактозидазы определялась согласно (Miller 1972) как активность* клетка"' *мин*'.

1 2 3

Биотин (мкг/мл)

- MFKi24 -MFKi21 -MFKi22 -MFKi35 -MFKi36 -MFKi37

Рисунок 8. Влияние биотина на экспрессию Р-галактозидазы в ночной культуре. Показаны результаты тестирования штаммов MFKi21-26 и MFKi3l-36. Культуры росли в пробирках на М9ш1 среде с различными концентрациями биотина и без него при 42°С в течение 16 часов. Активность Р-галактозидазы определялась согласно (Miller 1972) как активность*клетка"'*мин"'.

3

На следующем этапе определяли активность ß-галактозидазы при разных условиях культивирования клеток. Оценивали влияние двух параметров: концентрации экзогенного биотина и времени культивирования. Из всех полученных клонов было выбрано по 6 клонов каждого типа. Штаммы, полученные после интеграции плазмид pBZM2, pBZM3 и pBZM4, были названы как MFKi21-26, MFKi31-36 и MFKi41-46 соответственно.

Параллельно со штаммами MFKi21-26 и MFKi31-36 также тестировались штаммы MFKi41-46, однако, в данных условиях показанный ими уровень активности ß-галактозидазы оказался столь низок, что практически не отличался от контрольного (штамм MFK1: 0-1,5 ед.). Учитывая этот факт, а также данные из графика на рисунке 7, можно сделать вывод, что активность ß-галактозидазы для данных штамов в 20 раз меньше по сравнению с активностью этого фермента у штаммов MFKi31-36, что согласуется с данными о активности Pbloi промотора.

Из графика на рисунке 9 видно, что в нулевой точке активность ß-галактозидазы у штаммов MFKi21-26 в два раза выше, чем у штаммов MFK.i31-36, при этом форма зависимости активности ß-галактозидазы от биотина для штаммов двух типов практически совпадает. Однозначно объяснить этот факт по результатам данного опыта нельзя. С одной стороны, на эффективность экспрессии /acZ-гена может влиять вероятная "шпилечная" структура мРНК между сайтами Bgl2 и Мип\ (Рисунок 2а). С другой стороны нельзя исключить того, что транслируемые с bioB-lacZ-генов искусственные белки обладают разной ферментативной активностью вследствие разных последовательностей на N-концих. Данный вопрос требует дальнейших исследований.

Изменение активности ß-галактозидазы в зависимости от концентрации биотина в среде (Рисунки 7 и 8) подтверждает, что экспрессия биотинового оперона в А/. flagellatum регулируется биотином. При этом, зависимость эффективности экспрессии bio-оперона от экзогенного биотина отличается для культур, находящихся на разных стадиях роста. Так, для 4,5 часовой культуры штаммов MFKi21-26 активность ß-галактозидазы линейно снижается в 6-7 раз с увеличением концентрации биотина от 0 до 4 мкг/мл. В ночной же культуре данных штаммов при изменении концентрации биотина ог 1 до 2 мкг/мл активность ß-галактозидазы снижается в 4-5 раз. Если рассмотреть характер изменения активности ß-галактозидазы при культивировании 4,5 часа и 16 часов (Рисунки 7 и 8), то видно, что если в первом случае форма кривой близка к линейной, то во втором кривая имеет сигмоидную форму

Кроме того, из полученных данных видно, что концентрация биотина в среде, необходимая для репрессии 6/о-оперона, на два или три порядка превышает соответствующую концентрацию биотина для Е. coli.

Таким образом, пять генов биосинтеза биотина bioB, bioF, й/оН, bioC и bioD организованы в оперон. Транскрипция ещё одного гена bioA происходит независимо. Основным промотором является последовательность с координатами 423-452 (Рисунок 3), при этом транскрипция начинается с цитозина или тимина в позиции 457 и 458. Транскрипция регулируется биотипом, при этом форма данной зависимости отличается для культур, находящихся на разных стадиях роста. Оператор локализован на участке последовательности в пределах 660 пар оснований, и отнесён от начала гена bioB, как минимум на 320 нуклеотидов. В отличие от аналогичных последовательностей у Е. coli и В. subtilis этот участок не содержит каких-либо инвертированных повторов.

Показано, что помимо основного существует ещё один промотор, он локализован между сайтами Pstl и Sphl на участке ДНК в 200 нуклеотидов. Исходя из анализа данной последовательности, таким промотором может быть последовательность на расстоянии 50 п.н. от начала 6/оВ-гена. Эффективность этого промотора в 20 раз ниже по сравнению с основным промотором, кроме того, транскрипция с этого промотора не регулируется биотином.

7. Продукция биотина при экспрессии А/о-генов в составе искусственных векторов в Е. coli и М.ßagellatum.

Учитывая полученные данные об организации генов биосинтеза биотина в М. ßagellatum, определяли зависимость продукции биотина в клетке от уровня экспрессии ¿/о-генов. В качестве модельной системы была выбрана регулируемая экспрессия 6/о-генов М. ßagellatum в Е. coli. Для начала, был выбран ген bioB, этот ген является первым в кластере 6/огенов М. ßagellatum , а его продукт биотинсинтаза - последним ферментом в цепи биосинтеза биотина. Отмечалось, так же, что именно эта стадия является лимитирующей в биосинтезе биотина.

Была сконструирована плазмида на основе ColEI репликона - pLBIOB, ген bioB на этой плазмиде находится под контролем lac промотора. Таким образом, экспрессия гена bio В в штамме Е. coli TGI с плазмидой pLBIOB может регулироваться добавлением в культуральную среду IPTG.

Кроме того, необходимо было определить в первом приближении условия культивирования соответствующие максимальной продукции биотина в клетке. Также изучали влияние таких параметров как присутствие в среде антибиотика, маркер устойчивости к которому несёт плазмида, время индукции, а также концентрация индуктора е среде.

На рисунке 9 показано, что для Е. coli TGI с плазмидой pLBIOB продукция биотина достигает максимального значения при индукции после трёх часов роста разведённой культуры, причем уровень продукции

биотина при концентрации индуктора 2 мг/л выше в 1,5 раза, чем при концентрации индуктора, равной 20 мг/л, и достигает 560 нг/мл.

-1 -2' -з;

"4,

-5 -6

3 6 Время роста (ч)

Рисунок 9. Зависимость продукции биотына от времени индукции и концентрации индуктора.

Штамм Е. coli TGI с плазмидой pLBlOB культивировали в среде М9 с добавками: казаминовые кислоты - 0.1 %, ампициллин 100 мкг/мл и детиобиотин 10 мкг/мл. Так же в среду для части проб добавляли IPTG. Культуры росли при 37°С. (1) - ночная культура выросшая в присутствии IPTG (20 мкг/мл); (2) - ночная культура выросшая без IPTG; (3) - после разведения ночной культуры (2) в 100 раз в среду добавлен 1PTG (20 мкг/мл); (4) - в культуру (5) добавлен 1PTG (20 мкг/мл) через 3 часа роста: (5) -после разведения ночной культуры (2) в 100 раз рост в среде без IPTG; (6) - в культуру (5) добавлен IPTG (2 мкг/мл) через 3 часа роста.

С другой стороны, для того, чтобы оценить степень экспрессии bioB-гена проводили SDS-PAGE электрофорез грубых лизатов клеток культур, выросших в присутствии разных концентраций индуктора (IPTG), и проверяли наличие белка соответствующего размеру продукта гена bioB (около 37 KDa).

Рисунок 10. SDS-PAGE электрофорез грубых лизатов клеток культур, выросших в присутствии разных концентраций индуктора (IPTG).

На двух крайних дорожках нанесены маркеры молекулярного веса. Препараты нанесены следующим образом: дорожка 1 - Е. coli TGI; дорожка 2 - штзмм Е. coli TGl::pLBIOB, среда без индуктора; 3 -штамм Е. coli TGl::pLBIOB, 2 мкг/мл IPTG в среде; 4-7 - . штамм Е. coli TGl::pLBIOB, 20 мкг/мл IPTG в среде, нанесены поспедовательные

разведения пробы. Размер белка, который соответствует доминирующей полоске на дорожке 7, оценён как 37 KDa.

# # ш

щщ т

ш <м

3 4 S е 7

«Ц6в.О

На рисунке 10 показано, что при максимальной индукции (10 мг/ мл 1РТО) в клетке присутствует белок с молекулярной массой около 37 КОа в количестве 20% от всего клеточного белка и мы вправе предположить, что он является продуктом гена ЫоВ. При концентрации индуктора соответствующей максимальной продукции биотина данный белок практически не различим. Таким образом, максимальная экспрессия ЫоВ-гена не соответствует максимальной продукции биотина в клетке.

Данные на рисунке 10 относятся к культуре, которая росла в присутствии ампициллина. Чтобы оценить устойчивость плазмиды штамм культивировали в течении суток без антибиотика с добавлением индуктора и без него. Было показано, что в случае индукции Л/оВ-гена доля клеток с плазмидой снижается до 55%, при этом в случае роста без индукции эта доля составляет 78%. Таким образом, при повышении степени экспрессии 1ена биотинсинтазы увеличивается частота сегрегации плазмиды.

Следующим шагом стало создание конструкции для экспрессии всех Ью-генов, а именно ЫоВ, Ыо¥, ЫоУ\, ЫоС, ЬюО и ЫоА. Для совместной и координированной экспрессии шесть 6/о-генов были организованы в искусственную оперон-подобную структуру. Гены ЫоВ и ЫоА были состыкованы согласно рисуноку 11.

асе ->

О I V Э V Ь И о

,,ltattgtgagtgtattgtggcagtgaggaagtatttcaataccttgaaqrtgccgctgtacacatcatgctggcaaataaattcc

ЫсА ->

МТТЗЫАБЬЬ

ataccttgtcaggtactaagtaqcgcggtgtcaqccatлgactctaqaqqaqqattcatl^caacqaqtaacqcctccctgctq

АХЬа1

Рисунок 11. Схема стыковки генов ЫоО и ЫоА.

РСЯ-фрагмент, полученный с праймеров к началу и концу ЫоА-гена состыкован концом гена ЫоО. В нижней части рисунка показан праймер к началу ¿/оА-гена, одчеркиванием выделены нуклеотиды, комплементарные последовательности лонированного 6/оА-гена. Таким образом, перед ЫоА- геном располагается скусственная ЗО-последователыюсть. Праймер к концу гена ЫоА catgaggtaccgtgctc.

Гены были собраны на основе репликона вектора широкого круга озяех ГУБНОЮ под контролем /ас-промотора. Данный промотор был ыбран, так как было показано, что гяс-промотор является "сильным" ромотором в М. flagellatum. В результате была получена плазмида рЫСЬ2 рисунок 12). Для сравнения была создана аналогичная плазмида, но только одним 6/оВ-геном, плазмида названа рЫТВ1. Каждая плазмида несёт гены стойчивости к ампициллину и стрептомицину.

Полученные плазмиды тестировались как в Е. coli так и в М. ßagellatum. В штамме Е. coli TGI определяли продукцию биотина при условии регулируемой транскрипции bio-генов. Кроме того, штаммы культивировали в двух средах. Первая - среда М9 с глюкозой и казаминовыми кислотами; вторая - богатая среда PC (состав в подписях к рисунку 13). Результаты культивирования штамма Е. coli TGI с плазмидами pNCL2 и pNTBl в PC среде приведены на рисунке 13.

Xho_l (14760), ХЪа_1(14520) Bamlli (14277 Лее J(13655)

Sail (13226) AccJ (13225)

lisp 1191 (12376)

SacJ (11376) XhoJ (11276) SacJ (11076) EcoRI (10876; XliuJ(10476) Bgl2 (10176)

Bamlll (IU022

Dral (9226)'

Sac_l (211)

NolJ (1674) ScaJ (1880) ScaJ (1978)

(3577)

Рисунок 12. Схема плазмиды pNCL2. В нижней части рисунка показана область tac промотора и начала ЫоВ-гена. Подчеркнуты "-35" и "-10" блоки промотора, жирным шрифтом выделена SD-

последователыюсть, метиониновый кодом выделен заглавными буквами.

Eta 1 (7520)

-35 -10 +1

ttactccccatccccctqttgacaattaatcatcqqctcqtataatgtgtgqaattqtqaqcqqataac ЫоВ MRDSVIDI

aatttcacacaqqaaacaggatccccgggtaccgaggaggacatATGcgagactcagtgattgacatac /4BamHIASmaI"KpnI "Ndel

Из рисунка видно, что пик конверсии из детибиотина в биотин для плазмиды рЫТВ1 достигается при концентрации 1 мкг/мл 1РТО и равен 9.5 мг/мл. Для штамма с плазмидой рЫСЬ2 измеряли продукцию биотина, в данном случае пик был менее выражен и сдвинут в сторону меньших концентраций индуктора, при этом максимальная продукция составила 4.5 мг/мл (0,5 мкг/мл 1РТС). Результаты полученные для плазмиды рМТВ1 хорошо согласуютя с аналогичными данными по регулируемой экспрессии гена биотинсинтазы В. $ркаег1сия в Е. соИ.

ю

Рисунок 13. Зависимость продукции биотина от концентрации индуктора.

2

о

о

5

IPTG мкг/мл

10

15 20

—♦—pNTB1 -*-pNCL2

Ночные культуры штаммов Е. coliTGX с плазмидами pNTBl и pNCL2 разводили в 100 раз и культивировали в пробирках 3 ч. в PC-среде (глицерин 20 г/л, пептон 50 г/л, казами-новые кислоты 20 г/л, К2НР04 1 г/л, KCI 0.5 г/л, MgS04 0.5 г/л, FeS04 0.01 г/л и MnS04 0.01 г/л) при 37°С после чего добавляли IPTG и культивирование продолжали ещё в течение 21 ч. В случае со

'4

штаммом Е. co/í TGl:pNTB 1 в

среду был добавлен детибиотин 100 мкг/мл.

Как отмечалось ранее, штаммы также культивировались в среде М9 с казаминовыми кислотами и глюкозой, при этом форма зависимости сохранялась, а максимальные значения по продукции биотина (TGl:pNCL2) и по конверсии детибиотина в биотип (TGI .pNTBl) составили 0,3 и 0,5 мкг/мл соответственно. Как и следовало ожидать, данные для штамма с плазмидой pNTBl оказались близки к аналогичным данным для плазмиды, где ген 6/оВ-находится под контролем /ас-промотора (pLBlOB).

В штамм дикого типа М. flagellatum MFK1 плазмиды pNTBl и pNCL2 были переведены методом коньюгативного переноса из штамма Е. coli TG1::R751. В данном случае проверяли продукцию биотина, а также конверсия детибиотина в биотин при условии конститутивной транскрипции bio-генов с /ас-промотора на плазмидах pNTBl и pNCL2. Для сравнения тестировали ещё одну плазмиду (pNCLl), в которой все гены биосинтеза биотина, как и в случае плазмиды pNCL2, собраны в единый кластер, однако транскрипция осуществляется с нативного Pbiol-промотора. Штаммы культивировали в среде, адаптированной для продукции биотина (M9ml) в течение суток.

Как видно из таблицы 1, максимальную продукцию показал штамм MFKl::pNCL2 (все 6/о-гены под контролем tac промотора). В случае штамма MFKl::pNCLl, степень экспрессии bio-генов оказалась недостаточной. Для штамма MFKl::pNCLl этот факт вполне согласуется с полученными ранее данными, согласно которым Pbiol промотор является "слабым" промотором. Максимальную конверсию детиобиотина в биотин для штамма MFK1 наблюдали в случае плазмиды pNTBl.

Таблица 1_

и. Штаммы Продукция биотина в среде (мкг/мл)

без детиобиотина с детиобиотином 50 мкг/мл

1 MFK1 ::pNCLl 0,11 0,25

2 MFK1 ::pNCL2 0,62 1,1

з MFK1 ::pNTBl 1,5

4 MFKacl ::pNCL2 1,4 3,1

Ночные культуры штаммов разводили в 10 раз и культивировали в пробирках в течение 24 часов в среде М9ш1 при 42°С.

Кроме того, продукцию биотина определяли в штамме М. flagellatum, устойчивом к ацидомицину, несущем плазмиду pNCL2. Ацидомицин является структурным аналогом биотина и известно, что существует строгая корреляция между устойчивостью к ацидомицину и повышенной продукцией биотина. Данный штамм (MFKacl) был получен после НТГ-мутагенеза штамма MFK1 и последующего отбора на среде с ацидомицином. Штамм устойчив к 3 мг/мл ацидомицина, тогда как штамм дикого типа устойчив к 0,5 мг/мл. Результаты тестирования данного штамма с плазмидой pNCL2 представлены в таблице 1, пункт 4. Как видно из таблицы, штамм MFKacl::pNCL2 показал максимальный результат, продукция биотина составила 1.4 мкг/мл, а конверсия детибиотина в биотин 3,1 мкг/мл.

Таким образом, при транскрипции генов биосинтеза биотина с tac-промотора в составе мультикопийной плазмиды продукция биотина в штамме М flagellatum MFK1 возросла в 600 раз относительно штамма диког о типа, а в случае штамма, устойчивого к ацидомицину, в 1500 раз.

Тем не менее, уровень продукции биотина в штаммах М. flagellatum оказался ниже по сравнению с аналогичными штаммами Е. coli. Здесь максимальный уровень продукции биотина был в 4500 раз выше относительно бесплазмидного штамма. По всей видимости, разница в продукции биотипа штаммами М. flagellatum и Е. coli связана с тем обстоятельством, что М. flagellatum способен рости только на миниральных средах с метанолом. Аналогично, штаммы Е. coli продуцируют биотин на "богатой" среде в 10 раз лучше, чем на минеральной среде М9 с добавками глюкозы и казаминовых кислот.

В свою очередь, зависимость продукции биотина в штаммах Е. coli от степени экспресии bio-генов показала, что максимальные значения достигаются лишь при частичной дерепрессии /ас-промотора.

Выводы

1. Уточнена нуклеотидная последовательность кластера 6/о-генов, и ЫоА -гена М. flagellatum, определена нуклеотидная последовательность прилегающих к кластеру областей. Таким образом, получена полная нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомы: фрагмента (6.2 т.н.п.) с генами 6/oBFHCD и фрагмента (1.7 т.н.п.) с геном ЫоА. Проведён анализ полученной последовательности.

2. Показано, что транскрипция 6/о-оперона может осуществляться с двух промоторов. Промоторы локализованы. Эффективность транскрипции с промотора Р/,,,,2 как минимум в 20 раз выше по сравнению с промотором

P.w

3. Установлено, что транскрипция с промотора Р(,ш2 регулируется биотипом.

4. Сайт связывания с репрессором локализован в пределах участка ДНК размером 600 п.н.

5. Определены условия репрессии bio-оперона. В присутствии 2 мг/мл биотина эффективность транскрипции 6/о-генов снижается в 10 раз.

6. Созданы вектора для эффективной экспрессии генов биосинтеза биотина в М. flagellatum и в Е. coli.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ilya G. Serebriiskii, Vitaly М. Vassin, Yuri D. Tsygankov. Two new members of the Bio В superfamily: cloning, sequencing and expression of bioB genes of Methylobacillus flagellatum and Corynebacterium glutamicum. Gene, 1996, 175: 15-22

2. I. Serebrijski, V. Vassin and Y. Tsygankov. Cloning, characterization and sequencing of bioF, bioH, bioC, bioD and bioA genes from Methylobacillus flagellatum. Microbiology, 1998, (in press).

3. I.G. Seredrijski, V.M. Vassin, Yu.D. Tsygankov. Cloning and characterisation of the Methylobacillus flagellatum genes involved in the biotin biosynthesis. B83, 7th International Symposium On Microbial Growth on CI Compounds. Warwick 1992.

4 V. Vassin, I. Serebrijski, Yu. Tsygankov. Characterization and

sequencing bio genes from Methylobacillus flagellatum. WE 167, Sixth European Congress On Biotechnology. Firenze, 1993.

5. Васин B.M., Цыганков Ю.Д. Организация генов биосинтеза

биотина в Methylobacillus flagellatum. Конференция "Проблемы Микробиологии и Биотехнологии", Минск, 1998.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати ¿f,>H. ? 8 Заказ 494. Тираж 100

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васин, Виталий Михайлович, Москва

¿"/-'Ж- 3 /¿у9

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Васин Виталий Михайлович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

БИОСИНТЕЗА БИОТИНА В МЕТНУЬОБАС1ЬЬ¿75" ПАСЕНА ТОМ

03.00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, проф. Цыганков Ю. Д.

Москва - 1998

Оглавление

Введение 4

Обзор литературы 8

1 Классификация метилотрофных бактерий. Генетика 8

метилотрофов.

2. Гены биосинтеза биотина у М 10

3. Роль биотина в метаболизме. 11

4. Биосинтез биотина у различных микроорганизмов. 12

5. Продукция биотина. 17

6. Количественное определение биотина. 20

Материалы и методы 22

1. Штаммы бактерий, фаги и плазмиды, использованные в работе. 22

2. Методы работы с бактериями и фагами. 25

3. Манипуляции с ДНК и РНК. 27

4. Анализ внутриклеточных белков. 28 Результаты и обсуждение 29

1. Уточнение нуклеотидной последовательности генов Ыо¥, ЫоН, 29

ЫоС, ЫоХУ и ЫоА, определение нуклеотидной последовательности областей, прилегающих к Ыо-кластеру и её анализ.

1.1 Определение нуклеотидной последовательности. 29

1.2 Анализ нуклеотидной последовательности. 31

2 Локализация старта ¿/оВ-гена. 35

3 Анализ суммарной РНК. 38

4. Локализация промотора и сайта оператора, используя 40

плазмиды с рекомбинантными bioB-lacZ- генами.

5. Определение точки начала транскрипции Ыо-оперона. 46

6. Изучение условий репрессии А?"о-оперона в штаммах с 48

интегрированными в хромосому bioB-lacZ- конструкциями.

7. Экспрессия генов биосинтеза биотина у М. flagellatum MFK1. 54

Заключение.

8. Продукция биотина при экспрессии ¿/о-генов в составе 56

искусственных векторов в Е. coli и М. flagellatum.

8.1 Экспрессия bioB-гена М. flagellatum в Е. coli. 56

8.2 Конструирование вектора для координированной 59

экспрессии всех Ыо-генов М flagellatum в Е. coli.

8.3 Конструирование векторов для экспрессии bio-генов в М. 62

flagellatum.

8.4 Продукция биотина при экспрессии ¿/о-генов в составе 67

искусственных векторов в М. flagellatum. Выводы 70

Список литературы 71

Список сокращений

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

а.к. - аминокислоты

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

DEPC - диэтилпирокарбонат

KDa - килодальтон

IPTG - изопропил-Р-О-тиогалакгозид

ORF - открытая рамка считывания

PAAG - полиакриламидный гель

PCR - полимеразная реакция амплификации

SD - последовательность Шайна-Дельгарно

SDS - додецилсульфат натрия

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактозид

Введение

В работе рассмотрена организация и особенности экспрессии генов биосинтеза биотина в метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum.

Метилотрофы представляют собой таксономически неоднородную группу микроорганизмов, способных использовать восстановленные формы одноуглеродных соединений в качестве источника углерода и энергии.

Бактерии, утилизирующие С1-соединения, обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофами. Главным образом это - способность расти на простых средах, используя относительно дешевые и доступные субстраты (например, метанол), удовлетворительные ростовые характеристики и качество биомассы (для кормовых целей). Интерес могут представлять следующие процессы с использованием метилотрофов: крупнотоннажная наработка биомассы; получение метаболитов (органических кислот, витаминов, аминокислот, пигментов, полисахаридов и т.д.); использование некоторых уникальных ферментов метилотрофов в биотрансформации и очистке сточных вод; применение метилотрофов в качестве хозяев для экспрессии гетерологичных генов [111].

Выбор объекта данного исследования обусловлен следующими факторами. По сравнению с другими метилобактериями, Methylobacillus flagellatum имеет некоторые преимущества: повышенный температурный оптимум роста, использование энергетически наиболее выгодного пути ассимиляции С1-соединений, биохимическая изученность, отсутствие фагов, разработанные генетические методы работы вплоть до успешной экспрессии гетерологичных генов и получения г ее А- мутантов.

Реализация описанных процессов требует всестороннего, в том числе генетического изучения метилотрофов.

Молекулярно-генетическая информация об облигатных метилотрофах в настоящее время весьма ограничена, в связи с этим представляет интерес сравнение функционирования некоторых клеточных процессов у метилобактерий и других микроорганизмов. В качестве модельной системы изучали регуляцию экспрессии генов биосинтеза биотина.

Наиболее полно данная группа генов изучена в Е. coli, показано, что в биосинтез биотина вовлечены 6 генов, 5 из них (bioA, bioB, bioF, bioC и bioD) организованы в оперон и их транскрипция регулируется биотином.

Большой интерес представляет и сам биотин. Производят его, как известно, химическим синтезом. Этот синтез сложен и сопровождается образованием стереоизомерных продуктов. Получение биотина микробиологическим способом явно предпочтительнее. Однако на сегодня из-за недостаточно высокого уровня синтетической активности, микроорганизмы не используются для получения биотина. При этом работы направленные на создание штаммов продуцентов биотина продолжаются.

Таким образом, изучение ¿ш-генов и их регуляции в М. flagellatum важно для создания возможных штаммов-продуцентов биотина на основе клонированных генов данной метилотрофной бактерии.

Данная работа, в части, связанной с изучением организации 6/о-оперона, является развитием работы проводимой в лаборатории генетики метилотрофов, в ходе которой были клонированы гены биосинтеза биотина М. flagellatum, определена нуклеотидная последовательность 6/оВ-гена, а также частично нуклеотидная последовательность остальных i/ü-генов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение организации, а также регуляции экспрессии биотинового оперона М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи.

Определение полной нуклеотидной последовательности всех Ыо-генов М. flagellatum и прилегающих к ним областей. Анализ последовательности.

Локализация сигналов транскрипции и трансляции Ьго-оперона.

Установление факта регуляции транскрипции бш-оперона.

Локализация сайта связывания с возможным репрессором.

Определение условий репрессии биотинового оперона.

Конструирование векторов для эффективной экспрессии bio-генов в М. flagellatum и Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость

Показана организация генов биосинтеза биотина у метилотрофной бактерии М. flagellatum, определена нуклеотидная последовательность ¿/о-генов, изучены основы механизма регуляции транскрипции этих генов. Изученный механизм регуляции транскрипции Ыо-оперона во многом отличается по сравнению с Е. coli. Созданы вектора для эффективной экспрессии генов биосинтеза биотина в широком спектре Грамм-отрицательных бактерий.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (162 наименований) и содержит 21 рисунок и 12 таблиц. Объём работы - 85 страниц.

Апробация работы

Результаты исследования были цредставлены на: 6-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Флоренция, Италия, 1993) и 7-ом Международном симпозиуме "Микробный рост на С-1 соединениях" (Варвик, Англия, 1993), а также на семинаре Секции генетики микроорганизмов Ученого Совета при ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (1998).

Обзор литературы.

1. Классификация метилотрофных бактерий. Генетика метилотрофов.

К метилотрофам относятся организмы, способные использовать в качестве источников углерода и энергии соединения, содержащие один или более атомов углерода, не связанных углерод-углеродной связью, ассимилирующие углерод путём фиксации формальдегида [113]. К этой группе относят также автотрофные организмы, способные использовать в качестве источника углерода и энергии С-1 соединения и ассимилирующие СО2 [113]. Метилотрофные бактерии представляют обширную и гетерогенную по составу группу микроорганизмов. Их можно классифицировать по нескольким принципам: 1) спектру субстратов, пригодных для роста; 2) способности расти на метане; 3) пути ассимиляции С-1 соединений.

По питательным потребностям метилотрофные бактерии делятся на обли-гатные метилотрофы, способные расти только на одноуглеродных субстратах и факультативные метилотрофы, способные утилизировать как С-1, так и полиуглеродные субстраты. В свою очередь, облигатные метилотрофные бактерии подразделяются в соответствии со способностью утилизировать метан [113].

Существует две специфические последовательности реакций позволяющие ассимилировать С-1 соединения - это сериновый цикл и рибулозомонофосфатный цикл. Третья последовательность реакций не является специфичной для метилотрофов, и представляет собой рибулозобисфосфатный цикл.

В соответствии с приведённой классификацией М. Аа^е11а1ит относится к облигатным метилотрофам, которые неспособны утилизировать метан. М. flagellatum потребляет только метиламин и метанол в качестве источника углерода и энергии. При этом он использует для ассимиляции С-1 соединений

рибулозомонофосфатный цикл в его КДФГА/ТА варианте (с участием 2-кето-З- --. дезокси-6-фосфоглюконат-альдолазы и трансальдолазы) [110].

Основное внимание в генетике метилотрофов было уделено генам ответственным за метаболизм С-1 соединений. В первую очередь это гены окисления метанола, а также гены ферментов участвующих в ассимиляции одноуглеродных субстратов.

Сообщалось, что клонированы и секвенированы гены окисления метанола из факультативного метилотрофа Methylobacterium extroques AMI, четыре из них организованы в оперон moxFJGI, первый ген тохF кодирует 66 KDa субъединицу метанолдегидрогеназы [112]. Аналогичные гены клонированы и из облигатной метилотрофной бактерии Hyphomicrobium methylovorum GM2, здесь обнаружен кластер генов mxaFJGIRSA, первый также соответствует альфа-субъединице метанолдегидрогеназы [134]. Из того же микроорганизма клонированы гены, кодирующие ферменты серинового цикла ассимиляции формальдегида, такие как серинглиоксилатаминотрансфераза [123], серингидросиметилтрансфераза [127] и гидроксипируватредуктаза [139]. Ген малил-КоА-лиазы, относящийся к тому же циклу реакций, клонирован из факультативного метилотрофа Methylobacterium extroques AMI [108].

Сообщалось о клонировании гена iso-1, относящегося к электрон-транспортной цепи окисления метанола / метиламина из штамма облигатного метилотрофа Methylomonas sp. J, показано, что экспрессия гена регулируется комплексной системой регуляции контролирующей окисление метанола или метиламина [133].

Несколько работ опубликовано по генам биосинтеза аминокислот в метилотрофах. А именно, генам гомосериндегидрогеназы (horn) и треонинсинтазы

(thr) из Грамм-отрицательного облигатного метилотрофа Methylobacillus glycogenes [128,129].

Большая работа по изучению М. flagellatum была проведена в лаборатории генетики метилотрофных бактерий института ГНИИ генетика. Получена обширная коллекция мутантов по генам С-1 метаболизма, биосинтеза аминокислот и витаминов, г ее А' мутантов. Построена генетическая карта микроорганизма [131]. Клонированы и охарактеризованы гены утилизации метиламина (таи) [120], биосинтеза треанина (horn и thr) [126] и PQQ (pqqDGC) [121], гесА-ген [122]. Ни в одном из описанных случаев регуляции генной экспрессии не было обнаружено. Кроме того, были клонированы гены биосинтеза биотина М. flagellatum [2].

2. Гены биосинтеза биотина у М. flagellatum

В лаборатории генетики метилотрофных бактерий института ГНИИ Генетика была получена представительная коллекция мутантов по генам биосинтеза биотина, мутанты охарактеризованы, идентифицированы и картированы на хромосомной карте [2]. Все данные мутанты обладают одной интересной особенностью, они растут в присутствии биотина, концентрация которого в тысячу раз превышает аналогичную концентрацию для bio' мутантов Е. coli.

Клонированы 6 генов биосинтеза биотина М. flagellatum, из них гены bio А, ЫоВ, bioY\ bioR и bioD кодируют белки, способные функционально замещать соответствующие активности в мутантах Е. coli Bio'. Ген ЫоС М. flagellatum не комплементирует соответствующую мутацию в Е. coli, однако гомология аминокислотных последовательностей генов двух бактерий достигает 50 % [2]. Кроме того, полностью определена нуклеотидная последовательность гена bioB и частично - генов bioD, bioV, bioll bio А и bioC. Структурная организация белка BioB

аналогична организации соответствующих белков других бактерий, а его аминокислотная последовательность проявляет значительную гомологию (64% для Е. соИ) с этими белками [2].

Установлено, что гены ¿/оВРНСО организованы в оперон, для них показан полярный эффект, транскрипция ещё одного гена Ъ юА [2] осуществляется независимо.

Полностью нуклеотидная последовательность Ыо-генов определена в данной работе, проведён её анализ, выявлены особенности экспрессии генов.

3. Роль биотина в метаболизме.

В настоящее время хорошо известно, что биотин как компонент ферментов, участвующих в реакциях карбоксилирования, необходим для нормальной жизнедеятельности всех живых существ, независимо от сложности их организации.

Роль биотина как катализатора реакций карбоксилирования определяет его участие в синтезе широкого круга соединений, в частности в биогенезе С4-соедине-ний, в том числе аспарагина, глюконеогенезе, синтезе высших жирных кислот из ацетата, синтезе разных классов липидов, синтезе пуринов и нуклеиновых кислот.

Таким образом, различные стороны метаболизма клетки оказываются прямо или косвенно зависящими от биотина. Одна из важных функций, на которую опосредованно влияет биотин, и которая, в свою очередь, определяет течение многих процессов обмена - это проницаемость клеточной стенки и мембран. Это влияние связывают [1] с его участием в синтезе липидов. Влияя на проницаемость и зависящие от нее процессы экскреции и поглощения многих соединений, биотин оказывается фактором, регулирующим целый ряд биосинтетических процессов.

Примером этому может служить процесс синтеза аминокислот, в частности глутаминовой кислоты.

4. Биосинтез биотина у различных микроорганизмов.

Биотин синтезируется широким спектром микроорганизмов и растений, в тоже время некоторые организмы неспособны его синтезировать, и нуждаются в нём. Большинство работ по изучению биосинтеза биотина было выполнено, используя микроорганизмы. Впервые и наиболее детально процесс биосинтеза биотина был изучен в Е. соИ (Рисунок 1). Была определена следующая последовательность реакций: пимелил-КоА 7-кето-8-аминопеларгоновая

кислота (КАПК) —> 7,8-диамино-пеларгоновая кислота (ДАПК)—> дети-биотин -» биотин [30,]. Три фермента вовлечены в процесс биосинтеза, это -КАПК синтаза (Ыо¥) [56,96,81], ДАПК аминотрансфераза (ЫоА) [96] и детибиотин-синтаза (ЫоВ) [40, 5, 4]. Три соответствующие реакции

продемонстрированы с участием

В. sphaericus Е. coli

Пимелиновая Неизвестный

к-та предшественник

КоА bioC, bioH

Г Jf^

О II

II С- SCoA пимелил-КоА

СН2(СН2)4СООН

Алании— bioF

ПЛФ

h2n о 1 II 7-кето-8-

НС—с 1 1 аминопелар-гоновая

Н3С СН2(СН2)4СООН кислота

SAM - ЫоА

ПЛФ

h2n nh2 1 1

1 1 HC—С 1 1 Диамино-пеларгоновая

Н3С СН2(СН2)4СООН кислота

НСОз" - ßioD

АТФ,Mg"

О

/ \

HN NH | I

1 1 НС—с Детибиотин

1 1 Н3С СН2(СН2)4СООН

донор- BioB

серы

О

/ \

^ РШ 1 1

1 1 НС-С Биотин

1 1 Н2С СН(СН2)4СООН

\ /

S

Рисунок 1. Биосинтез биотина.

очищенных ферментов. Так 7-кето-8-аминопеларгоновая кислота синтезируется из пимелил-КоА с участием L-аланина и пиридоксальфосфата (ПЛФ). В следующей реакции аминогруппа с Б-аденозил-Ь-метионина (SAM) переносится на КАПК с образованием 7,8-диамино-пеларгоновой кислоты, ПЛФ также участвует в этой реакции. В свою очередь детибиотин синтезируется в присутствии бикарбоната и йонов Mg++ из ДАПК, реакция сопровождается гидролизом АТФ.

Ещё два гена вовлечены в биосинтез пимелил-КоА у Е. coli это - bioH и bioC [30], их функция остаётся до сих пор не выясненной. В тоже время, для В. sphaericus было показано [82], что пимелил-КоА образуется непосредственно из пимелиновой кислоты и КоА, реакция полностью охарактеризована. Таким же образом эта реакция протекает и у высших растений, что было показано на примере Lavandula vera L [7].

Детальный механизм последней реакции с участием биотинсинтазы, продукта гена ЫоВ, неизвестен. Эта реакция не была продемонстрирована в системе с участием очищенных ферментов.

Проводились работы по изучению данной реакции, используя бесклеточные экстракты Е. coli с клонированным геном биотинсинтазы. Сообщалось [47], что необходимыми факторами кроме детибиотина являются: фруктоза-1,6-бисфосфат, Fe++, Б-аденозил-Ьметионин, NADPH и КС1. Кроме того, показано [48], что кроме биотинсинтазы в реакции участвует флаводоксин и как минимум, ещё один белковый фактор

В другой работе отмечалось, что скорость реакции зависит от концентрации детибиотина, цистеина, 8-аденозил-1-метионина и аспарагина. Используя HPLC анализ реакционной смеси бы�