Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ организации генов утилизации метиламинаоблигатной метилотрофной бактерии METHYLOBACILLUS FLAGELLATUM

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ организации генов утилизации метиламинаоблигатной метилотрофной бактерии METHYLOBACILLUS FLAGELLATUM"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ УТИЛИЗАЦИИ МЕТИЛАМИНА ОБЛИГАТНОЙ МЕТИЛОТРОФНОЙ БАКТЕРИИ Met.hylobacill.us Па§е11а1иш

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ч.

ГАК ЕВГЕНИЙ РОДИОНОВИЧ

Москва - 1995

Работа выполнена в ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Цыганков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов доктор биологических наук И. И. Толсторуков

Ведущая организация: Институт Биохимии и Физиологии

Микроорганизмов РАН

Защита состоится '¿¿¡¿¿-Ър-с 1995 г. в/Ч часов

на заседании Специализированного совета Д 098.12.01. при ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан ИО^^-А- 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук и / В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Метилотрофы, т.о. микроорганизмы, способные утилизировать восстановленные Форш ' одноуглеродных соединений, привлекают повышенное внимание как перспективные объекты для промышленного применения. Использование легкодоступных одноуглеродных соединений, в частности метанола, как субстрата в крупномасштабных процессах культивирования является наиболее рентабельным экологически чистым и позволяет получать продукты различного' назначения. Другой важный аспект применения метилотрофов в промышленности связан с их способностью осуществлять биотрансформации, благодаря наличию уникальных ферментов первичного окисления С} - соединений, которые могут найти применение при очистке сточных вод и в химическом синтезе . Наконец, метилотрофы могут служить основой для создания генноинженерных штаммов-продуцентов аминокислот, витаминов, а также гетерологичных белков. Нет сомнений, что внедрение метилотрофов в микробиологическую практику открывает широким перспективы для развитя промышленности бактериального синтеза. Реализация описанных процессов требует всестороннего генетического и биохимического изучения метилотрофов. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены на изучении генов первичного окисления С-1 соединений.

Одной из наиболее интенсивно изучающейся у метилотрофов является система утилизации первичных аминов и метиламина в частности . Окисление аминов широко распространенный процесс находимый у эука-риот и прокариот. Окисление аминов микроорганизмами играет важную роль в биогеохимических циклах С! соединений в биосфере. К настоящему времени накоплена информация по молекулярной организации генов утилизации метиламина (таи). у Факультативно метилотрофных организмов. Однако Несмотря на достигнутый в последнее время значительный прогресс в изучении системы утилизации метиламина у факультативных метилотрофов отсутствуют данные об организации таи генов у облигатных метилотрофов, ' остаются нерешенным целый ряд вопросов, как то, регуляция паи генов, каким образом в действительности осуществляется биосинтез ТОО. Е этой связи представляет интерес изучение таи генов,из облигатных метилотрофов. Сравнение полученных данных с уже известными, несомненно, углубит наше'.понимание механизмов окисления метиламина метилотрофными бактериями.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение системы утилизации метиламина у облигатного метилотрофа МеЫуЬоЬасШиз fla.gella.twn. .'"

- г -

Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:

-клонирование гена таиА, кодирующего малую субъединицу;ме-тиламиндегидрогеназы.

-локализация гена шил на клонированном фрагменте хромосомы и определение нуклеотидной последовательности структурной и прилегающей области гена таиЛ. -клонирование участка хромосомы, содержащего другие гены mau кластера и прилегающие области.

-определение частичной нуклеотидной последовательности клонированного участка хромосомы . локализация таи генов • и определение типа организации mau кластера, -определение нуклеотидной последовательности структурной области генов azu и orf-1, обнаруженных в 3' и 5' областях mau кластера.

-изучение работы промотора mau генов в Е. coli и М. flagel-•latum.

-получение нитрозогуанидиновых мутантов, неспособных расти на метиламине, фенотипическая характеристика и комплемен-тационный анализ полученных мутантов для определения природы мутаций.

-получение инсерционных мутантов по генам ог/-1, azu, mauN "и их фенотипическая характеристика для выяснения их роли в функционировании таи системы у М. flagellatum.

Научная новизна и практическая значимость работы. В числе первых генов: облигатных метилотрофных бактерий клонированы гены утилизации метиламина (таи), определена полная нуклеотидная последовательность генов таиА и таиЬ и частичная генов таиГ, юаиВ, шаиЕ, шаиБ, шаиС, таиМ, таиМ. Построена генетическая карта кластера таи генов. Получены и охарактеризованы метиламиновые мутанты облигат-ного метилотрофа в числе них два регуляторных. Впервые для мети-лотрофов клонирован ген азурина и определена его полная нуклеотидная последовательность^'На основе изучения свойств сконструированного мутанта по гену аги сделан вывод о его участии г ЭТЦ для ме-тиламиндегидрогеназы. Полученная информация по организации таи генов и коллекция охарактеризованных мутантов может служить основой для следущего этапа работы-изучения биосинтеза ТТО. Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение.

материалы и методы, результаты и обсуждение, список литературы (97 наименований). Содержит 15 рисунков и 2 таблицы. Объем работы стр. Апробация работы.Результаты исследований были представлены на 6-ой и 7-ой Международных конференциях Международных конференциях "Микробный рост на Ct соединениях" ( Геттинген, ФРГ, 1989; Варвик, Великобритания, 1992), 3 конференции ученых ГНИИ Генетика 1995г, семинаре отдела молекулярной генетики ГНИИ Генетика (1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение химически индуцированных- метиламиновых мутантов М. flagellatum.

Для отбора метиламиновых мутантов использовали обогащение цик-лосерином и карбенициллином после мутагенеза нитрозогуанидином как описанно Миллером . Ввиду более "высокой природной устойчивости М. flagellatum к этим антибиотикам", концентрация циклосерина была увеличена до 0.4М, карбенициллина до 1мг/мл, и они использовались совместно. Учитывая, что время удвоения М.flagellatum составляет 2 часа время обогащения увеличивали до 15 часов. Для того, чтобы исключить отбор мутантов, являющихся потомством одного, проводили несколько независимых экспериментов. Для мутагенеза использовали штамм MFK-51, ауксотрофный по метионину и устойчивый к рифампици-ну. В результате отобрали 62 мутанта, растущих на метаноле и не растущих на метиламине. Однако только 18 из них устойчиво наследовали данный фенотип с частотами--реверсии меньшими, чем 10"8, они были использованы для дальнейшей работы.

2. Клонирование гена таиА, кодирующего малую субъединицу №етила-миндегидрогеназы М. flagellatum.

Сравнение известной полной аминокислотной последовательности малой субъединицы метиламиндегидрогеназы из Methylobacterlum ех-torquens AMI и частичной - из Thyobacillus versutus, а также иммунологические данные позволили сделать вывод о высокой консервативности полипептидов малых субъединиц МАДГ метилотрофов. Для клонирования гена малой субъединицы МАДГ из М. flagellatum синтезировали олигодезоксинуклеотид длиною 26 нуклеотидов к С-концевой части белка с 64-кратной вырожденностью, базирующиеся на известной аминокислотной последовательности белка MauA М. cxtorqucncc AMI . Он имел следующий состав:

GAA\G GAT\C GAT\C GCG\C ATG ACG\C TAT\C CAT\C TG

C: 64

Glu Asp Asp Ala Met Thr Туг His Cys

Олигонуклеотид использовали в качестве зонда в гибридизациях с хромосомой М. flagellatum, расщепленной рестриктазами EcoRI, Ват-HI, Pstl. Hindlll, SalGI. Олигонуклеотид гибридизовался с хромосомой М. flagcllatum, в каждом случае с одной полосой. Наименьший фрагмент хромосомной ДНК, с которым гибридизовался С-концевой оли-годезоксинуклеотид был Hindlll фрагмент, размером около 4.5 тпн. Для клонирования таиЛ конструировали частичный банк генов М. flagellation. Хромосомную ДНК М. flagcllatum расщепляли рсстриктазой Hindlll, фракционировали в градиенте сахарозы. Фракции, содержащие фрагменты размером от 4 до 5 тпн, лигировали с линеаризованной по Hindlll сайту плазмидой pUC19, лигированной смесью трансформировали штамм Е. coli TGI. Полученные 900 белых колоний банка генов гибридизовали с С-концевым олигодезоксинуклеотидом и было найдено 14 'Позитивных колоний. Плазмидная ДНК из 10 клонов была выделена и после обработки рсстриктазой Hindlll определили размер вставки, который составлял 4.5 тпн .

Расщепленную Hindlll плазмидную ДНК гибридизовали с С-концевым олигодезоксинуклеотидом. Результаты показали, что зонд гибридизу-ется с клонированным Hindlll фрагментом. Плазмиду обозначили PGAK4.

Была построена предварительная рестрикционная карта Hindlll фрагмента. Для локализации шаиА гена проводили гибридизацию обработанной различными рестриктазами плазмидной ДНК pGAK4 с С- концевым олигодезоксинуклеотидом. Ген'локализовали внутри Hindlll-Smal фрагмента размером 0.9 тпн.

3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена таиА.

' Для определения нуклеотидной последовательности гена гааиА была построена подробная рестрикционная карта Hindlll-Smal области, клонированного на плазмиде pGAK4 фрагмента. На рис. 1 представлена рестрикционная карта и стратегия сиквенса. Нуклеотидную последовательность определяли методом Сэнгера На рис. 2 представлена полная нуклеотидная последовательность гена mauЛ.

таи А

н

М

М Е

о.иь

Карта фрагмента ДНК, содержащего ген таиЛ. Стрелками

Н-Н1псЛИ. М-Мип1, Б-Р;па1. Е-ЕЬе!

Рис. 1

показана стратегия сиквенса.

3.1 Анализ структурной области гена таиЛ.

Обнаружена открытая рамка считывания, протяженностю 558 пн (рис 2) которая кодирует полипептид с молекулярной массой 20 2о7 Д Продукт этого гена гомологичен белкам МаиА Других бактерии • . Для поиска сигнальной последовательности использовалась программа геЮИАЬ в пакете РССЕИЕ . так как белок МаиА является периплазма-тическим. Идентифицирована лидерная последовательность необычно большой длины - 58 аминокислот и имеющая несколько положительно заряженных аминокислот вблизи предполагаемого сайта узнавания сигнальной пептидазы . Расположение сайта узнавания сигнальнои пети-дазы хорошо согласуется с данными о молекулярной массе белка МаиА и с гомологиями с другими МаиА белками (рис.3) . В образовании кофактора ТТО. участвуют два триптофана, обозначенные # на (рис.2 )

3.2 Сравнение известных аминокислотных полипептидов.

последовательностей МаиА

последовательность

В настоящее время известна аминокислотная МаиА полипептидов из Methylobacterium extorquence AMI (МаиАа MW 20

11 ,,21 31 , 41, ,,,51 ^ 61

юъг.сс^аагсэсЕге' ^гза^за^^Сь'ьЁ'сс

61 71 81 91 101 111 121

, м к нас заза1 аг. £гааа

121 121 141 1Б1 161 171 161

К N Т В ,£\ 0 3 б 1-Е к Ь А" к, К Т А 3 К Т 2 аазззгасзз'е'аи^гагхсгр:^

ШхГаЬ Согаааасаае« ссе- и згСгТШ^^асС!?!?^?^^?^ иГ^С

* КвЧ V з л р241 4;

етасгтаг н егесгх! 1е^сг сагссИ: г ¡гссс.

241 251 261 271 261 291 301

, I Ь Р у 0 Н Р й Н М N Е А Н А Е Т £ 3 у 5;

идта^ссз^гетгзесесс^

аасеао^ссзссх асс г збс^.^Сдг ■I * сс^сао

<5ГИ 01 -1 001 0<Э-| ОД-1 '-Ц-1

тв К г*Б , У ¥ГР о "то р к 3, , с .v? б. 8;

Е'ассс^сссг ■г са^аасд-схааг •¿зссд,5а

^ с 5 т1и в л с о ч1 с в ¡рз i т41| с р 421 101 сагге^ сззг г к £сазс1хе1 сгЬ гас&г^ есв-Егг ЕГ2т± с1г г г-зсзЬс^ ег-сс!

т ГI. 5 З.Д1? N р471 о е.481 ш

ддссйдт: нх Сг_ сд-асадсег! I еаагхаССса! с^хI саасазацх1 аегт содсх £ССз

481 491 501 511 521 551 541

ь Т.. У, I I А У £' Г/ , С о Э К ц Т., С. б Р...С N. 145 сааас! гагсгда1ав'се'1 а1.СЕ-1 ¡таиМ г ЕТ г ^азгсаЕ'асг г ЕГ£ дзг сгг г есааг

16Е

ос1

ь4'1 5ы ьь1 571 ьы с

.с У N v а 5, Е и р у .¥, к р ё .г n н в ] у йтсвхв'ааоесгса^т ешс^ ссаггсх зъсгассаеаат 11 аасаасе-зсз? оет.с асце асГГ §-8аГ|?£ сЭсаогсраад^сса^ а£с£гегс1сзззи£^££с1:ег 'агсзд-

601 61л 691 Р41 651 6

,#..с £ и а о n о. а ц ' т // т у ,3 Р 1 у " 182

LC№c?ccвacaзcв'atffcca^,s■эccLS0cat о^сас^ЕСиссссьгаьсзхс

661 К |71 681 691 701 711 721 ^

с-сзгт

721 - . . ,731 , 741, . 751 761 , , /,'71 7:31

аг^ассасаааасаеа^ш^азбйасаеЕс 781. . 791 . 801 , 811

Рис. 2-,Нуклеотидная последовательность гена тшиА и первичная структура белка МаиА. Триптофаны, образующие ГШ, отмечены #

084), Рагасоссиэ denitri/icans (МаиАр, Ш 20 393) , МеМу1орНу1и$ зр. (МаиАи, Ш 20 237), Ме^угоЬасШиз Па^еИсИит (МааА1,

Ш1 20 174) и ГгоЬасШиБ уегзиШэ (МаиАь Ш 20 358). Степень гомологии между МаиАк и МаиАа, МаиАр , МаиАн. МаиА1, составляет 6655. 66%, 85%, 66% соответственно. Результаты общего выравнивания аминокислотных последовательностей этих.белков показаны на рис.3. .

a. MLGKSOFDDLFEKMSRKVAGHTSRRGFIGRVGTAVAGVALVPLLPVDRftGRVS-RANA' ь с d е

а

b. ADAPAGTDPRAKWVPQDNDIQACDYWRRCSIDGNICDCSGGSLTNCPPGTKLATASKV i с. AGPAEGVDPRAKWQPQDNDIOACDVKRHCSIDGNICDCSGGSLTNCPPGTKLATASWV

d. —rrkgvlgregykpookdpkscdtmrhcsidcfltcdccggsltscppgtelspsswv

e. at-t-gnltrsgfkpqdkdpkacdywrhctidgnlcdccggtltscppgsslspssт

a. ascynptdkqsylisvrdccganvsgrcacuitegelpvyrpefgndiiucfgaedda

b. ascynptdgqsyliayrdccgynvsgrcpclntegelpvyrpefandii ¿CFGAEDDA

c. ASCYNPTDGOSYLIAYRDCCGYNVSGRCPCLNIEGELPVYRPEFANDII hCFGAEDDA Л. ASCFNPGDGQTYLIAYRDCCGKQTCGRCNCVNVQGELPVYRPEFNNDIVhCFGADNDA е. ASCYNPGDQQTYLIAYRDCCGKQTCGRCNCVNTQGELPVYRPEFNNDIVWCFGADNDA

a. mtyhctispivgkas

b. mtyhctispivgkas

c. mtyhctispivgkas

d. MTYHCTVSPIVGKAS

e. mtyhctispivgkas

. mlgnfrfddmveklsrrvagqtsrrsvigktgtamlgiglvpllpverrgrvs-rana*

. mlgnfrfddmveklsrrvagrts^gaigrlgivtagaaltollpvdrrgrvs-rana«

. hkkntgfdsgieklarktasktgrr5figkl6gflvgsali.pllpvdrrgrmn-eaha*

. mkxdtgfdskieklarttasktgrrgfigrlggflvgsallpllpvdrrsrlggevqa'

. ae-sag-dprgkwkpqdndvqscdywrhcsidgnicdcsggsltscppgtklasss wv

Рис.3 Сравнение известных аминокислотных последовательностей MauA. а. М.. extorquens AMI b. P. denitrificans с. Т. versutus d. M. flagellatum e. Methytophilus sp. W3A1 Звездочками показан сайт узнавания сигнальной пептидазы. Триптофаны, образующие TTQ итализированы

Все MauA белки имеют две необычных особенности. Они содержат недавно открытый новый кофактор. - называющийся TTQ, который синтезируется из двух триптофанов полипептидной цепи, и они имеют необычную лидерную последовательность. Лидерные последовательности у всех белков^малых субъединиц значительно длиннее, чем обычные лидерные последовательности, и похожи между собой , особенно в положительно заряженной области около участка узнаваемого сигнальной пептидазой. Лидерная последовательность MauA сильно замедляет транслокацию сквозь мембрану Е.coli . Роль необычной лидерной последовательности пока неизвестна возможно она участвует в синтезе кофактора или служит внутримолекулярным шапероном.

Хотя все малые субъединицы высоко гомологичны, аминокислотная последовательность MauAk и MauAw отличаются от MauAa,MauAt и МаиАр . Наибольшее отличие в лидерных последовательностях, а также MauAk и MauA,, имеют семь дисульфидных связей вместо шести. Следует также отметить, что MauAa, MauAt, MauAp используют в качестве акцептора электронов медьсодержащий белок амицианин. MauAw использует цитох-ром. ситуация с Mauk будет обсуждена ниже. M. flagcllatum и Methy-lophillus sp. W3A1.филогенетически родственны, так как все известные штаммы этих родов принадлежат к ß подгруппе протеобактерий . M. extorquence AMI P. déni trificans и T. Vcrsutus с другой стороны принадлежат к й подгруппе протеобактерий . Большая гомология аминокислотных последовательностей малых субъединиц МАДГ M.flagellatum и Methlophillus sp. W3A1 является , очевидно , отражением их филогенетического родства .

4. Клонирование 5* области перед геном mau/1, содержащей гены mau кластера.

Для клонирования участка хромосомы, содержащего гены таи кластера конструировали второй частичный банк генов M. flagellatum. HindiIl-Pstl фрагмент плазмиды pGAK4 размером 2600 нп гибридизова-ли с хромосомой М.flagellatum, расщепленной различными рестрикта-зами для того чтобы построить карту 5' области гена maa4. Зонд гибридизовался с Pstl фрагментом хромосомы размером 8.5-9.0 тпн, содержащим следовательно 5'область перед геном mauA размером 6.0-6.5 тпн. Для конструирования банка использовали вектор рНКЗЮ. Фракционированные в агарозном геле Pstl фрагменты хромосомной ДНК M. flagellatum размером 8-9 тпн лигировали с обработанной этой же рестриктазой плазмидной ДНК pRK310. После трансформации в штамм Е.coli DH5A и отбора полученные 500 белых колоний гибридизовали с

изолированным из агарозы и предварительно помеченным с Hindi-II-PstI фрагментом . После гибридизации было получено 38 позитивных колоний. Из 10 положительных колоний была выделена плазмидная ДНК, во всех случаях она несла одинаковый HindiII фрагмент размером 8.5 тпн. Проверка рестрикционной карты показала что все вставки имели в своем составе Hindlll-Pstl фрагмент размером 2.6 тпн, что свидетельствовало о клонировании 5' области перед геном таиА. Этот вывод был подтвержден после повторной гибридизации выделенной плазмидной ДНК с зондом. Плазмиду была обозначена pGAK2.

4.1 Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, содержащих гены таи кластера.

Для изучения организации кластера mau генов М. fläge1 latum определяли частичную нуклеотидную последовательность клонированных на плазмидах pGAK4 и pGAK2 соответственно Hindlll фрагмента размером 4.4 тпн и Hindlll-Pstl фрагмента размером 6.0 тпн. Стратегия сек-венирования базировалась на использовании полных и частичных сик-венсов уже изученных кластеров mau генов из других организмов , при этом было сделано допущение на основании уже имеющейся информации о высокой гомологии белков MauA, MauD, MauG М. flagellatum и Methylophylus sp. W3A1, что организация таи кластеров у этих организмов также весьма похожа. При этом области между генами и достаточно длинные для определения гомологии аминокислотных последовательностей 5' и 3'-концевые участки mau генов секвенировались по двум цепям, остальные участки читались по одной цепи. Было обнаружено 9 открытых рамок считывания, все они транскрибировались в одном и том же направлении с геном тшА. Номера для доступа для определенных нуклеотидных последовательностей таи кластера М. flagellatum в GenBank-L37426, L37427, L37428, L37429, L37433, L37434, L37435, L37436. На основании сравнения аминокислотных последовательностей клонированных генов из М. flagellatum с аминокислотными последовательностями mau генов таи кластеров из М. methitotrophus W3A1 и М. extorquence AMI была построена генетическая и физическая карты таи кластера М. flagellatum.

4.2 Организация кластера таи генов Н. flagellatum. Сравнение таи кластеров метилотрофов.

Физическая и генетическая карта таи кластера М. flagellatum показана на рис.4. Он состоит из 9 генов, расположенных в порядке mauFBEDAGLM. Известны полные нуклеотидные последовательности таи

pGak2

— aa

Z. — л ' ' g о^ • 5- с « «

~ ю ,, , ® tftr 2 ' :uj ' z w w л

t_i_Li___i_l"t< i t_LiLJ

t ..

: 'I t

3 :1 ™—i;::::" imiv.'aw-t ;;;г-ц ' u i;m l/—г r-ott-nj i

orf-l tnauF imuB ' mauE - rnauO пишЛ mouG mauL mnuM mau N diy

pGak4

pGak6

pGak?

pGakll__pGak60

pGakS_

pGakR

Рис. 4 Физическая и генетическая карты mau кластера М. flagellatum:a. рестрикционная карта PstI фрагмента pGAK2 b. рестрикционная карта HindiII фрагмента pGAK4. Стрелки под картой показывают места инсерции гена Ктг. с. генетическая карта mau кластера, несеквенированные или секвенированные по одной цепи участки показаны пунктиром, d. плазмиды, использованные для комплементации мутантов.

кластеров двух организмов: факультативного метилотрофа М, eztorqu-ence AMI и ограниченно факультативного метилотрофа М. mehtylotrop-hus W3A1 (за исключением гена таи!!), а также частичная нуклеотид-ная последовательность таи кластеров двух факультативно автотроф-ных бактерий : P. denitri/icans и Т. versutus. Генетические карты таи кластеров этих организмов представлены на рис.5.

Melhylobacillus fhgellatumKT

сн-

mtuO tntuA ттО

'M$thy!ophilus sp. W3A1

! Methylobacterium extorquens AM1

' Pkracoccvs tienitrificans

Thiobacillus versutus

miuf

чэ'-'-^шс

-у/?Л • H-H ■ !IH II I-:.

maud mauf tnaoO mauA m auG mtul m*t1 mauO

m»u3 mavE m»vQ тыл mtuC mauJ rmuO тлд тял-' тюн

t:

D0--

-•сн Изо

mrjF mauS mauf таи0 maiM mavC таиJ

CH-ЮО

m»ud тыл mtuC mnk>

orr-l

tftelarjl* tubunit

of IT* MAOH

t* smal! »ubumt vnlcyanln oiC-л MAOH

-membrane protein» -eywpi*vnic proteins

Рис.5 Генетические карты таи кластеров метилотрофов

Все они имеют значительное сходство между собой. Идентифицированы гены, кодирующие малую субъединицу метиламиндегидрогеназы -mauЛ, большую субъединицу метиламиндегидрогеназы - mauB и амициа-нин - тиС, являющийся облигатным компонентом электронтранспортной цепи' у бактерий а подгруппы протеобактерий. На основании компьютерного анализа было предсказано, что белки MauF, MauE, MauN являются мембранными полипептидами, MauB, MauD, MauA, MauC, MauG, MauL, MauM являются периплазматическими белками, MauJ единственный белок из mau кластера оказался цитоплазматическим. Сравнение аминокислотных последовательностей показало высокую степень гомологии соответствующих mau белков, причем эквивалентные таи полипептиды из факультативных метилотрофов более похожи друг на друга, чем на соответствующие белки из М. flagellatum и М. methylotrophus W3A1 , и соответственно наоборот . Так процент гомологии для секвениро-ванных участков полипептидов MauF из М. flagellatum и М. metylot-горbus W3A1 составляет 64%, для MauB-61%, МаиЕ-52%, MauD-58%, Ма-иА-85%, MauG-65%, MauL-45%. МаиМ-70% . Соответственно MauF, MauB, MauD, MauE, MauA, MauG, MauL;'MauM, MauN из H. flagellatum и M. extorquencc AMI имеют 48%. 46%, 38%, 22%, 66%, 55%, 32%, 53%, 31% гомологии. Эти данные отражают филогенетическое родство, так как роды Methylobacillus и Mcthylophylus принадлежат к в подгруппе протеобактерий. а факультативные метилотрофы к а подгруппе . Вместе с тем ряд особенностей mau кластера являются консервативными у всех представителей этих, филогенетически различных групп: полипептиды MauF и MauE являются трансмембранными белками, MauM все имеют четыре FeS кластера, MauA-все имеют необычные лидерные последовательности, MauB, MauM, MauG имеют обычные лидерные последовательности и лидерная последовательность у MauD лишена положительно заряженных аминокислот. На основании свойств Май белков, предсказанных с помощью компьютерного анализа; и свойств мутантов по этим генам в настоящее время предложена гипотеза о функциях таи генов в процессе созревания и сборки метиламиндегидрогеназы.

Все таи кластеры у факультативных метилотрофных бактерий-М.ех-torquence AMI, Г. versutus и P. denitri/icans, принадлежащих к а подгруппе протеобактерий, имеют в своем составе гены таиС и rnauJ, расположенные непосредственно за геном mauЛ, кодирующим малую субъединицу метиламиндегидрогеназы. Ген таиС идентифицирован, как кодирующий медьсодержащий белок амицианин, функция гена mauJ неизвестна. Показано, что у факультативных метилотрофов амицианин является облигатным компонентом электротранспортной цепи при росте

на метиламине . Ограниченно факультативные.метилотрофы не синтезируют медьсодержащих белков и используют в качестве акцептора электронов с MADH цитохром типа с . Соответственно таи кластер М. methylotrophus W3A1 не содержит таиС и mauJ генов. С другой стороны в М. /tagetlatum было обнаружено два типа медьсодержащих белков, один из которых, вероятно, являлся амицианином. Поэтому, отсутствие генов таиС и mauJ на их привычном месте явилось в определенной степени сюрпризом.

4.3 Анализ 5' области перед геном mauF.

Анализ нуклеотидной последовательности 5' области, расположенной перед первым геном таи кластера - mauF обнаружил наличие открытой рамки считывания, длиною 603 нп, способной кодировать полипептид в 200 аминокислот с молекулярной массой 21 706 дапьтон, .и расположенной на расстоянии 450 нп от начала mauF. Ген транскрибируется в том же направлении, что и mau кластер и получил название orf-1. Между ог/-3 и rnauF были обнаружены 4 шпилечные структуры, они обладают сравнительно низкой свободной энергией образования и не напоминают р-независимые терминаторы Е. coli.

5. Изучение промоторной области таи кластера.

Нуклеотидная последовательность 5'- области перед стартом гена mauF была проанализирована на предмет поиска промотора с помощью программы DNASUN . основанной на методе "обобщенного портрета. Программа ориентирована на поиск в данной последовательности структур, проявляющих большее сходство (согласно выбранным критериям) с промоторами Е.соti, чем'альтернативные структуры этой последовательности. Под промоторами £.coli здесь и далее подразумеваются промоторы, узнаваемые б-субъединицей РНК-полимеразы . С помощью данной программы промотора выявлено не было. С целью выяснить, содержит ли 5' область перед геном mauF промотор, Nacl-Nacl фрагмент ДНК размером 440 нп, содержащий в своем составе 304 нп 5' области перед геном mauF клонировали в плазмиду pUC19, а затем переклонировали в соответствующей ориентации между сайтами HindiII и BamHl плазмиды широкого круга хозяев pAYC37 . Генетическая конструкция вектора позволяет избирательно клонировать" в своем составе промоторы прямым отбором на селективной среде. Клонирование промоторной последовательности сопровождается выражением устойчивости к стрептомицину. Итоговая плазмида была названа pGAKP.' Клетки Е. coli. содержащие плазмиду не приобретали устойчивость к стрептомици-

ну даже в присутствии в среде метиламина, что свидетельствовало о том, что .предполагаемый промотор Ртаи не функционирует в Е. coli. Плазмиду pGAKP конъюгацией переводили в М. flagcllatum. Клетки М. flagellatum, содержащие плазмиду pGAKP приобретали высокую устой-чивисть к стрептомицину в. концентрации до 5 мг/мл, в то время, как штамм М. flagcllatum без плазмиды не растет на чашках с концентрацией стрептомицина 0. 3 мг/мл. Клетки М. /tagetlatum с плазмидой, содержащей Ртаи в противоположной ориентации также не приобретали устойчивость к стрептомицину. Это свидетельствует о том, что клонированный фрагмент действительно содержит в своем составе промотор Ртаи. Устойчивость к стрептомицину возникала при выращивании М. flagellatum на.средах, содержащих, как метиламин, так и метанол, что свидетельствует о конституитивной экспрессии с Ртаи в этих условиях. ■Это, вероятно, объясняется тем, что плазмида pAYC37 является многокопийной и присутствует в клетке в количестве от 10 до 12 копий, и при этих условиях природная регуляция нарушена. Так как активность MADH позитивно регулируется метиламином, отсутствие экспрессии с Pmau в Е. coli вероятно объясняется отсутсвием позитивного регулятора. , .

Промоторы таи кластеров из М. extorquence и М. mcthylotrophus W3A1 также вели себя .сходным образом - отсутствие экспрессии в Е. coli и конституитивная экспрессия в гомологичном хозяине. Для определения точной последовательности промотора таи кластера М. ftaget latum необходимы дальнейшие исследования.

6. Клонирование гена azu.

Предварительное определение нуклеотидной последовательности плазмиды pGAK5, содержащей в своем составе 3'-область таи кластера, находящуюся за геном mauN,, показало наличие открытой. рамки считывания на расстоянии 137нп от терминирующего кодона гена rnauN. транскрибирующейся в противоположном таи кластеру . направлении.Поиск в GenBank показал, что секвенированный участок может кодировать полипептид, имеющий высокую степень гомологии с медьсодержа-.щщи белками, называющимися азуритами. Показано, что азурины присутствуют в ряде метилотрофов л и могут участвовать в переносе электронов от метиламиндеридрогеназы.

6.1 Определение нуклеотидной-последовательности гена azu.

Для определения полной нуклеотидной последовательности гена azu ■ Pmt-HindHI фрагмент плазмиды pGAK5 размером 1тпн был субклониро-

ван на плазмиду pUC19. Полная нуклеотидная нуклеотидная последовательность гена azu представлена на рис. 6.

6.2 Анализ структурной области гена azu. Сравнение аминокислотных последовательностей азуринов.

■ Ген азурина имеет длину 444 нп, стартовый кодон ATG. терминирующий кодон ТАА, кодирует полипептид из 148 аминокислот молекулярной массой 15 875 дальтон. С помощью подпрограммы PSIGNAL программы PCGENE локализована предполагаемая лидерная последовательность длиною "Л 8 аминокислотных остатков. На расстоянии бнп от стартового кодона-находится последовательность GGA. которая может служить SD последовательностью. В настоящее время известна аминокислотная последовательность для ряда азуринов . Результат выравнивания аминокислотной последовательности азуринов из M. flagellatum, A. de-nitrificans, P. aerunginosa приведен на рис. 7 .

6.3 Анализ области, расположенной между генами azu и таиМ.

Анализ нуклеотидной последовательности между генами mauN и azu при помощи программы PCGENE обнаружил наличие шпилечной стуктуры с энергией образования -20.6 ккал/моль, имеющей сходство с сигналом терминации рис.6. Наличие сигнала терминации в 3' области, расположенной за mau кластером, промотора перед геном mauF свидетельствует о том, что таи гены организованы в оперон.

7. Характеристика нитрозогуанидиновых таи мутантов M. flagellation 7.1 Комплементационный анализ таи мутантов H. flagellatum.

Чтобы определить природу полученных таи мутантов был проведен их комплементационный анализ. С этой целью Pstl фрагмент плазмиды pGAK2 размером 8.5 тпн и HindiII фрагмент плазмиды pGAK4 размером 4.5 тпн, которые содержали все гены mau кластера и соседние области, были субклонированы в плазмиду широкого круга хозяев pRK310 таким образом, чтобы клонированные таи гены транскрибировались с lac промотора. Плазмиды были сконструированы так, чтобы отличить мутации в каждом таи гене и обозначены pGAK2, pGAK4, pGAK6, pGAK7, pGAKl1, pGAK60, pGAKS, pGAKR. pGAK2 содержала весь PstI фрагмент размером 8.5 тпн и, следовательно, гены orf-1 mauFBEDAGLM'. pGAK4 содержала HindiII фрагмент размером 4.5 тпн и гены mauD'ÂGLHN azu. pGAK6 содержала. HindlII-Nsil фрагмент из pGAK4 и гены mauD'ÂO'. pGAK7 являлась результатом делеции pGAK4 по сайтам рестрикции EcoRV-Pmtl и содержала гены mauD'AGL'N' azu. pGAKll содержала

AACCTTKmXCTTAATTCCCACCMTCCC'^TCTGC^

ссспажксАССААттстггсссАгасггелАтетатсс^

м

aatcaa^l jt-j-i-i ji^cctcccattcatteccaccattocagcct^rnxaaccaacra к о ь 1j alafiptiaaaashcevilvs a c.d smafwtrsidi

kscxeftvhfakt-g taskachchnwvlarsadvndlaka

gtkla\gccgccatagacaagaacticattchkcraac^ccccra3cgiattgccatacaccccccttxta33cog^

veagidxnfippndpxvlaytplvggcektsvtfkpsil сАтахх^огсстаститтстАстсх^сттсазлтгмттс

dgesyspycspafhsfhmrgtvklvd*

__* It R V I T I G

тас^тсстдсогасстмтссл^

FS К ClDLKHAbAeTACODLCAGCXTeDOHTVTIIAICLSVV сАдс^ггтосслсотссласттатсосллгахосслс^

ccggtcctccag 5' 9fil ccccaocacgtc 3*

Рис. 6 Нуклеотидная последовательность гена azu . Шпилечная структура подчеркнута одной чертой. SD последовательность - двумя лидерная последовательность итализирована

а WIAKATZ^LTVIi5AA5XPVXAA-QCEATIESNDAMQYNLKEMVVDKSCKQFTVHLKHVGKMAKVAMGHNWVLT Ь WRWObLi^AZiAFXPrXAAAASNCEVNVSAGDSMAFNTRSIDIPKSCKEFTVNFAHTGTASKAGMGHNWVLA С' MLi^^reLiSLLSAPLIAA-ECSVDIQGNDQMQFNTNAITVDKSCKQFTVNLSHPGNLPKNVMGHNliVLS

а KEADKQGVATDGMNAGLAQDYVKAGDTRVIAHTKVIGGGESDSVTFDVSKLTPGEAYAYFCSFPGHWAMM

Ь RSADVNDLAKAGVEAGIDKNFIPPNDPRVLAXTPLVGGGEKTSVTFKPSILKDGESYSFYCSFAFHSFMM -С TAADMQGWTDGHASGLDKDYLKPDDSRVIAHTKLIGSGEKDSVTFDVSKLKEGEQYMFFCTFPGHSALM

а KGTLKLSN

Ь RGTVKLVD

с KGTLTLK

Г1 '•

Рис.7 Сравнение аминокислотных последовательностей азуринов . из а. A. denitrificans. b. М. flagellatum, с. P. aeruginosa. • Идентичные аминокислоты отмечены двойными точками, консерва- . тивные замены-одиночными. Предсказанные лидерные последовательности итализированы

Pstl-BamHI фрагмент из pGAK2 и гены orf-1 mauFB'. pGAK60 содержала Pstl-HincII фрагмент pGAKl и гены mauM'N azu. pGAKS содержала ffin-cll-Smal фрагмент плазмиды pGAK2 и гены ma- uB'EDAG'. pGAKR содержала HincII-EcoRV фрагмент Pstl фрагмента размером 8.5 тпн и гены таиВ'Е (см.рис.4) .

Эти плазмиды переводили в каждый mau мутант при помощи трехро-дительского скрещивания . Селективнным маркером являлась устойчивость к тетрациклину , плазмидой помощником pRK2013 , частота скрещивания составляла Ю-2 -10"3 . По 100 трансконъюгантов из каждого скрещивания проверяли на способность расти на метиламине. Во всех случаях все трансконъюганты имели единый фенотип: либо Маи+ либо Май-. Трансконъюганты отобранные после переноса плазмиды pGAKS в мутанты КТ-10. КТ-24, КТ-26, КТ-32 не удавалось пересеять, т.к. их рост был очень затруднен. Поэтому в случае этих мутантов не удалось точно определить природу повреждений: они оказались либо паиЕ либо mauD. Вероятно эти затруднения связаны с воздействием продуктов генов таиЕ и mauD присутствующих в трансконъюгантах в большем количестве копий . Сконструированные плазмиды также не позволяли различить мутации в гене таиЕ и в гене orf-1, но в этом случае был получен инсерционный мутант гена orf-1 (см. ниже). Комплементационный анализ позволил точно определить природу мутаций во всех мутантах (табл.1) за исключением двух-шаи-18 и mau-19 эти мутанты не комплементировались известными таи генами и, очевидно, они имеют повреждения в неизвестных генах. Из 16 идентифицированных мутантов по одному имели повреждения в таиЛ и таим, по два -в таиВ и в та- uF. по три в mauG и mauL и четыре являлись ma-uD/E. Не было обнаружено нитрозогуанидиновых мутантов по генам та-uN, azu. orf-1.

7.2 Фенотипическая характеристика mau мутантов.

Af. flagallatum может использовать только метанол и метиламин в качестве источника углерода . Чтобы определить, какие амины может использовать эта бактерия в качестве источника азота, в среду М9, приготовленную без азота, добавляли метанол, как источник углерода, и этиламин, этаноламин, диметиламин, n-пропиламин, триметила-мин в качестве источника азота. Все они, кроме триметиламина могли служить источником;азота М.flagollatum. Проверяли также способность, полученных НГ мутагенезом мутантов использовать, перечисленные выше амины, в качестве источника углерода и/или азота. Все мутанты были способны использовать метиламин,этиламин, этаноламин.

Таблица ^ Свойства химически индуцированных ¡паи мутантов М. fläge 1 latum

Мутант Комплементация плазмидамк Активность Присутствие Окраска Природа'

pGAK MADH субъединиц на квиноны мутаций

£ 4 6 7 11 60S R большая малая

дикий тип 87 ++ ++ ++

КТ-2.1(шаи-11) + + + + 0 ++ + ++ - mauA

КТ-Е.9(гааи-19) 0 - - - неизЕест!

КТ-2.18(шаи-18) - - - - 0 - - - неизвест*

КТ-З(таи-З) + - - - - 0 ++ ++ ++ mauB

КТ-5(шаи-5) + + - + 0 ++ ++ ++ mauG

КТ-8(шаи-8) + - - 0 + + ++ mauF

КТ-10(таи-10) + - - - 0 ++ + ++ mauD/E

КТ-13(таи-13) - + - - 0 ++ ++ ++ mauM

КТ-24(таи-24) + - - - 0 ++ + ++ mauD/E

КТ-£'5 (таи-25) + + - + 0 ++ ++ ++ mauG

КТ-26(таи-26) + - - - 0 ++ + ++ mauD/E

КТ-32(таи-32) + - - - 0 ++ • + ++ mauD/E

КТ-5б(таи-56) + + - - 0 ++ ++ ++ mauL

КТ-61(таи-61) + + - - 0 ++ ++ ++ mauL

КТ-78(тай-78) + + - + 0 ++ ++ ++ mauB

КТ-79(таи-79) + - - - - - - 0 ++ ++ ++ mauB

КТ-85(тзи-85) + + - - 0 ++ ++ ++ ■ mauL

КТ-86(таи-86.) + - - + 0 + + ++ mauF

со

I

Для комплементации:+ комплементация;- отсутствие комплементации Для субъединиц:++ кол-ео соответствует дикому типу;+ кол-во уменьшено Активность МАДГ дана в нмольхминх(мг белка)-1

отсутствие

диметиламин и n-пропиламин в качестве источника азота . Скорость роста мутантов на аминах, как источнике азота , была идентичной скорости роста дикого типа. Это свидетельствует о наличии у М.flagellatum добавочной системы окисления аминов. В настоящее время показано, что факультативный метилотроф Methylobacterium ех-torquens AMI также имеет добавочную систему окисления аминов . С другой стороны филогенетически близкий ограниченно факультативный метилотроф Methylophylus methylotrophus W3A1 не имеет такой системы. •

Для дальнейшей характеристики мутантов изучались следующие свойства: присутствие активности MADH, присутсвие большой и малой субъединиц MADH в экспериментах иммуноблотинга и присутствие кви-нона в малой субъединице, используя специфическую окраску на кви-ноны. Известно, что у ряда метилотрофных бактерий наличие метанола в ростовой среде репрессирует активность ыетиламиндегидрогеназы даже, ссли природный индуктор этого фермента - метиламин присутствует в среде . Концентрация метанола 2%. обычно используемая для выращивания М.flagellatum практически полностью ингибирует синтез MADH в присутствии 0.4% метиламина. Однако при выращивании на среде. содержащей 0.5% метанола и 0.4% метиламина достигается частичная дерепрессия метиламиндегидрогеназы. Эта концентрация ростовых субстратов использовалась для измерения активности MADH в мутантах. Все мутанты не имели активности метиламиндегирогеназы (таб.1). Чтобы определить синтезируется ли большая и малая субъединицы в мутантах были поставлены эксперименты иммуноблотинга грубых экстрактов мутантов с антителами против целого белка для идентификации большой субъедицы, и против малой субъединицы для идентификации малой . Малая и большая субъединицы присутствовали в экстрактах всех мутантов, кроме таи-18 и таи-19, в которых отсутствовали обе субъединицы. Соотношение между количеством большой и малой субъединц различалось в разных штаммах. В мутанте КТ2.1 и КТ10,24,26,32 количество малой субъединицы было пониженным по сравнению с количеством большой в контроле. В мутантах КТ-86 и КТ-8 обе субъединицы присутствовали в меньшем количестве, чем в диком типе , но соотношение между большой и малой субъединицей было, таким же как; и в контроле ( таб.1 ).

Недавно был предложен метод специфического окрашивания квинол-ротеинов. Было показано что этот метод позволяет окрашивать малую субъединицу MADH после переноса ее на нитроцеллюлозную мембрану из денатурирующего полиакриламидного геля. В клеточных экстрактах му-

тантов окрашивалось несколько полипептидов в том числе и полипептид с молекулярной массой около 14 КД, что соответствует малой субъединице MADH. Единственным исключением были мутанты KT-18 и КТ-19, где малая субъединица отсутствовала. Следует отметить невысокую чувствительность метода, что не позволяет делать, выводы о сравнительном количестве окрашивающегося полипептида в остальных мутантах.

7.3 Сравнение фенотипов таи мутантов М. flagellation и М. extorqu-ens AMI.

Изучение фенотипа мутантов имеет большое значение для выяснения функций mau генов. К настоящему времени не существует химически индуцированных мутантов по каким-либо таи генам, кроме мутантов М. flagollatum. В лаборатории М. Lidstrom получены инсерционные мутанты по всем гена},! mau кластера М. extorquens и инсерционный мутант по гену таиЛ М. methylotrophus W3A1, используя технологию одноступенчатого обмена маркера. Проводилась фенотипическая характеристика мутантов и на основании их фенотипа и компьютерного анализа нуклеотидной последовательности таи генов была предложена модель функционирования таи генов. Функция МаиВ, МаиА. .МаиС-ясна, они являются структурными компонентами таи системы; соответственно большой и малой субъединицей MADH и амицианином-акцептором электронов. МаиА имеет необычную лидерную последовательность, которая консервативна во всех пяти известных метиламиндегидрогеназах. Очевидно это связано с присутсвием простетической гуппы TTQ. Предложено две возможных функции ..для лидерной последовательности: 1. задержка транспорта в периплазму«МаиА, препятсвуя котрансляционной транслокации, обеспечивая окисление первого триптофана до трипто-филквинона; 2. действие в качестве внутримолекулярного шаперона и поддерживание необходимой конформации полипептида после трансляции до тех пор, пока он не транслоцируется в периплазму. : МаиЕ и MauD, вероятно, вовлечены в обеспечение стабильности малой субъединицы метиламиндегидрогеназы,так как в мутантах по генам mauE и mauD отсутствовала малая субъединица, большая субъединица присутствовала в слегка уменьшенном количестве. Так как МаиЕ, как предсказано на основании анализа нуклеотидной последовательности, является мембранным белком, вероятно он функционирует на стадии транспорта МаиА в периплазму. MauD имеет лидерную последовательность, не содержащую положительно заряженных аминокислот,

что приводит к замедлению транслокации сквозь мембрану . Вероятно MauD может участвовать в поддержании конформации MauA не только в цитоплазме и в процессе транслокации, но и в периплазме.

Мутанты по гену mauF не имели MauA имели пониженное количество МаиВ, сам MauF, как предсказанно является мембранным белком, поэтому он также может участвовать в процессе транспорта МаиА через мембрану.

Мутанты по генам mauG и mauL содержали малую и большую субъединицы метиламиндегидрогеназы в нормальном количестве, но не имели активности MADH. MauG имела гомологию с цитохром с пероксидазой из Pseudomonas sp. . Пероксидазы могут замыкать ароматические кольца.

Поэтому, скорее всего MauG обеспечивает образование связи между триптофилквиноном и триптофаном. Функция MauL не ясна, но на основании сходства свойств мутантов по mauG и mauL делалось предположение об участии MauL в замыкании TTQ.

Мутанты по генам таиМ и maul! М. extorquens AMI имеют активную MADH. МаиМ и MauN имеют наибольшую гомологию с ферредоксинами из Methanosarcina barceri и Dcsut/ovibrio desulfuricans соответственно , следовательно, их возможная роль - продуцирование пероксид для пероксидазной реакции. Возможно, что эти функции у М. extorquens могут осуществляться изоферментами, вследствие чего мутанты по таиМ и mauN способны расти на метиламине.

В связи с вышеизложенными данными большой интерес представляет сравнение фенотипов мутантов М. flagellatum и М. extorquens AMI (учитывая тот факт, что структурные части аналогичных таи генов из этих организмов имеют высокую гомологию) . При помощи комплемента-ционного анализа не удалось точно определить природу мутантов mau-10, таи-24, таи-26, таи-32( см. разд.7.2 ) . Эти мутанты являются мутантами по гонги.! mauD или таиЕ. Они имеют пониженное количество малой субъединицы, что вполне согласуется с предложенной функцией генов mauD и таиЕ. В мутантах по гену mauF-mau-86 и mau-8 понижено содержание как большой, так и малой субъединицы, что также согласуется с данными по М. extorquens. Следует отметить что во всех мутантах, которые удалось закомплементировать, в том числе и по гену таиЛ , присутствует большая и малая субъединицы MADH. что связано очевидно с тем, что при мутагенезе нитрозогуанидином могут возникать не только нонсенс, но и миссенс мутации при которых синтезируется белок в пониженном количестве или неспособный нормально функционировать,что приводит к мутантному фенотипу.' Важным представляется факт, что мутант М. flagellatum по гену таиМ не содержит

активной MADH и не способен расти на метиламине, ..то есть функция белка МаиМ является облигатной в таи системе М. flagellftum, ,в отличие от,$. extorquens AMI.

У двух мутантов: mau-19 и mau-18, . которые не комплементирова-лись фрагментом ДНК, содержащим весь таи кластер, отсутствовала полностью, как малая так и большая субъединицы MADH. Так как таи система позитивно регулируется присутсвием аминов, то вероятно эти мутанты имеют повреждения в регуляторных генах, что и приводит к отсутствию синтеза полипептидов МаиА и МаиВ.

8. Конструирование инсерционных мутантов по генам or/-l, mauW и azu.

Поскольку среди нитрозогуанилиновых мутантов не оказалось мутантов по генам mauN, orf-1, и azu, чтобы получить информацию о их функционировании было решено получить мутанты по этил генам, используя метод одноступенчатого обмена маркера. При этом канамици-новую кассету из плазмиды pUC4K встраивали в гены по сайтам рестрикции показанным на рис . Вставки кассеты в которых транскрипция гена aph осуществлялась в том же направлении, что и генов mauN, orf-1, azu использовались для дальнейшей работы. Конструкции с му-тагенезированными генами клонировали в суицидный вектор pAYC61 (azu и orf-1) и PSUP2021 (mauN) и вводили в хромосому М. flagella-tum после конъюгации и отбора на чашках с метанолом и канамицином. Приблизительно 90-95% проанализированных трансконыогантов имели фенотип KmrApsTcs или KmrAp'3Cms в случае pSUP2021, что.свидетельствовало о прохождении двойного кроссинговера.

Хромосомную ДНК из этих мутантов и из дикого типа выделяли и гибридедзовали с канамициновой кассетой в качестве зонда. Во всех случаях'наблюдалось увеличение веса фрагмента в мутантной хромосоме на Г. 4 тпн, подтвекждающее вставку кассеты в соответствующий фрагмент хромосомы.

8.1 Изучение"свойств инсерционных мутантов по генам orf-1, mauN, azu. ,.>г. ' . "Г ,

Полученные' инсерционные 'мутанты перекалывали на среду, содержащую метиламин.'* Все ода были способны раяти на этой среде, нос различной скоростью роста.. Возможно этот факт объясняет то, что среди нитрозогуанидиновых мутантов не оказалось мутантов по этим генам. Мутант по гену ог/-1 (306а-1) имел ту же скорость роста, что и дикий тип, поэтому его не использовали для дальнейшего изу-

чения. Мутант по гену azu (305с-1) рос значительно более медленно на чашках с метиламином, чем дикий тип и мутант по гену mauN (80-2). Поэтому были измерены скорости роста для каждого из них. Кроме того измеряли активность метиламиндегидрогеназы в мутантах. Выращенные на метаноле культуры инокулировали с разведением 1:150 в жидкую среду с метанолом или метиламином как источником углерода для измерения скорости роста. Все три штамма имели близкие скорости роста на метаноле: м=0.105 для дикого типа, м=0.115 для мутанта 80-2 и м=0.127 для мутанта 305с-1. Скорости роста на метиламине дикого типа и мутанта 80-2 были одинаковыми: м=0.073. Однако скорость роста мутанта 305с-1 была ■ более, чем в два раза ниже м=0.034. В добавок мутант по гену azu имел лаг период после переноса со среды с метанолом на среду с метиламином на 20-30 часов более длительный, чем у дикого типа или мутанта 80-2. Активность метиламиндегидрогеназы в диком типе и в мутантах 80-2 и 305с-1 составляла 87, 69. и 80 нмольхминх(мг белка)"1 соответсвенно.

Таким образом изучение- мутанта 306а-1 показало, что ген ог/-1 не принимает никакого участия в окислении метиламина. Мутант по гену mauN имеет такуе же скорость роста на метиламине, как и дикий тип. и сходен по своим свойства.! с аналогичным мутантом M. extorquons AMI.

Наиболее интересные результаты были получены при изучении ин-серционного мутанта M. flagellatum по гену azu. Известно, что у большинства метилотрофов-■ акцептором электронов для МАДГ является амицианин. Сообщалось ранее, что M. flagellatum содержит амицианин , однако при определении нуклеотидной последовательности кластера таи генов, гена амициашна не было обнаружено на своем "привычном" месте. С другой стороны сразу за таи кластером мы обнаружили ген азурина. Азурин акцептор электронов для MADH у некоторых облигат-ных метилотрофов. Наши данные показывают, что мутант по гену азурина способен расти медленно на метиламине, хотя он имеет практически нормальную активность метиламин дегидрогеназы. Эти данные свидетельствуют о том, что азурин является частью электронтранс-портной цепи для MADH при росте M. flagellatum на метиламине. Однако азурин не является облигатным компонентом ЭТЦ, и.способен замещаться альтернативным электронным акцептором, что обеспечивает медленный неэффективный рост на метиламине. Этим акцептором может являться цитохром типа с или другой купредоксин, найденный в этом штамме , что согласуется с результатами, полученными для организма 4025 . В этом метилотрофе МАДГ может использовать амицианин или

цитохром с как акцептор электронов в зависимости от количества меди в среде. В настоящее время получен кристаллический комплекс МАДГ с амицианином известны и выяснены структурные детали их взаимодействия . Если . как позволяют предположить наши данные, азурин является непосредственным акцептором электронов' для метиламинде-гидрогеназы И. flagollatum , то интересно получить и сравнить аналогичные данные для комплекса МАДГ - азурин

вывода

1. Клонирован и физически охарактеризован ген таиД, кодирующий малую субъединицу метиламиндегидрогеназы облигатного метилотрофа М. flagellatum.

2. Клонированы гены mauF, таиВ, mauE, mauD, mauG, mauL, mauM, mauN, участвующие в утилизации метиламина II. flagellatum и образу-' ющие таи кластер.

3. Полностью определена нуклеотидная последовательность гена таиА и mauL и частично генов mauF, mauB, mauE, таиD, mauG, mauM, mauN. Установлен порядок расположения генов в mau кластере, проведено сравнение с организацией аналогичных кластеров из факультативных и ограниченно факультативных метилотрофов. Показана высокая гомология соответствующих таи генов между собой.

4. Получена коллекция mau мутантов облигатного, метилотрофа М. flagellatum. Проведен комплементационный анализ и идентифицированы мутации в генах mauF, muß, mauE/D, таиА, mauG, maul, mauM. Два мутанта не комплементировалйсь известными генами mau кластера и являлись регуляторными. Проведен фенотипический анализ мутантов и сравнение с фенотипами таи мутантов факультативных метилотрофов.

5. Клонирован ген azu, кодирующий азурин. Полностью определена нуклеотидная последовательность гена azu.

6. Сконструированы и охарактеризованы инсерционные мутанты по генам mauN и azu. Показано участие азурина в ЭТЦ при росте М. flagollatum на метиламине.

7. Изучена промоторная область mau кластера и исследована экспрессия с Pmau в Е. coli и М. flagellatum.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

iv .

1. Gak. E.R., Chistoserdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Mutants of Me-

thylobacillus flagellatum defective in catabolism of methylamine. Abstr. of 6th Intern. Simposium on Microbial Growth on CI Compounds. Gottingen. 1989, P417.

2. Gak, E.R., Chlstoserdov, A.Y.. Tsygankov, Y.D., Bolotin, A.P. Cloning and sequencing of gene for small subunit of methylamine dehydrogenase from Methylobacillus flagellatum. Abstr. of 7th Intern. Simposium on Microbial Growth on CI Compounds. Warwick, 1992.

3. Gak, E.R., Chistoserdov, A. Y., Lidstrom, M.E. 1995. Cloning, sequencing, and mutation of a gene for azurin in Methylobacillus flagellatum KT. J. of Bacteriol. 177:4575-4578.