Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ организации генов биосинтеза треонина облигатной метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ организации генов биосинтеза треонина облигатной метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum"

РГ6 од

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ' ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

МАРЧЕНКО Георгий Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ТРЕОНИНА ОБЛИГАТНОЯ МЕТИЛОТРОФНОЙ БАКТЕРИИ МеЬЬу1оЬасИ1иБ ПавеНаШп

03. 00. 07 - микробиология 03. 00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории генетики метилотрофных бактерий Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М. К Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Цыганков Е Д.

доктор биологических наук Нетрусов А. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Каменева С. В.

доктор биологических наук, Троценко Ю. А.

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН

Защита состоится "Я Г" 1993 г. в 15ч. ЗОмин.

на заседании специализированного совета Д 053. 05.66 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899,Москва, Ленгоры, биологический факультет, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. К Ломоносова.

Автореферат разослан 24 мая 1993 г. Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат биологических наук Е Ф. Пискунков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Облигатные метилотрофные бактерии используют цля роста в качестве источника энергии и углерода только одноугле-родные субстраты или соединения, содержащие более одного атома углерода, но не имеющие С-С связей. Достигнутые успехи в изучении 5иохимических путей окисления, ассимиляции С-1 соединений тесно связаны и с развитием биотехнологии. Использование легкодоступных эдноуглеродных соединений, в частности метанола; как субстрата в крупномасштабных процессах культивирования является наиболее рентабельным, экологически чистым и позволяет получать продукты раз-яичного назначения. Нет сомнений, что внедрение облигатных метилотрофов в микробиологическую практику открывает широкие перспективы для развития промышленности бактериального синтеза. Несмотря та достигнутые успехи в изучении биохимии облигатных метилотрофов, з генетическом отношении они остаются малоизученными объектами. Данные по клонированию и изучению генов метилотрофов получены, "■лавным образом, на факультативных организмах, и в настоящее время усилия исследователей сосредоточены на изучении генов первичного жисления Cl - соединений. В этом направлении молено ожидать значительных успехов в ближайшем будущем. Что касается генов общего метаболизма, то представленные в литературе данные носят отрывочный сарактер и, в основном, описывают принципиальную возможность комп-юментации мутаций Е. coli. Нет оснований ожидать существенных от-гачий в функционировании генетического аппарата метилотрофов и хо-юшо изученных в генетическом отношении гетеротрофных бактерий -Г. coli, Б. subtil is. Тем не менее остается открытым вопрос по >рганизации биосинтетических генов метилотрофных бактерий, нет данных о молекулярных механизмах их регуляции, отсутствует инфор-<ация по оперонным структурам. Желание ответить на некоторые из »тих вопросов определило наш интерес к пути биосинтеза треонина )блигатной метилотрофной бактерии М. flagel latum. Выбор данного ¡иохимического пути для исследования сделан на основании ряда при-шн. Во-первых, к началу выполнения настоящей работы была накоплена шформация относительно биохимических превращений в пути биосинтеза этой аминокислоты на уровне работы ферментов и их регуляции. Зо-вторых, эксперименты по переносу хромосомы в коньюгационных ¡крещиваниях показали, что, по крайней мере, три из пяти генов би->синтеза треонина могут выражаться в клетках Е. coli. В-третьих,-в штературе накоплено достаточно информации по молекулярной органи-¡ации генов биосинтеза треонина у различных микроорганизмов, вклю-¡ая дрожжи. Эти данные, в сравнении с полученными, несомненно, бу-

- г -

дут представлять интерес и в эволюционном аспекте. Кроме того, ра бота по конструированию штамма-продуцента треонина на метаноле яв ляется актуальной и, безусловно, наряду с использованием методо селекции и мутагенеза, требует развития генноинженерной методоло гии.

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследовани являлось изучение организации и функционирования генов биосинтез треонина у облигатной метилотрофной бактерии М. flagellatum.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

- клонирование индивидуальных генов биосинтеза треонина;

- физическое картирование и локализация генов на клонировании фрагментах хромосомы;

- изучение экспрессии генов в Е. col i под собственными и гетероло гичными регуляторными элементами, идентификация продукто экспрессии;

- определение нуклеотидных последовательностей структурных и при легающих областей генов hom, thrC, и fchrß;

- изучение работы промоторов индивидуальных генов в клетках Е. col и U. flagellatum;

- гибридизация суммарных мРНК метилотрофа с клонированными фраг ментами ДНК для проверки оперонной организации генов;

- анализ нуклеотидных и белковых последовательностей с известным последовательностями генов и белков, выполняющих схожие функции

- локализация существенных доменов в первичных структурах фермен тов, конструирование новых измененных форм гена гомосериндегид рогеназы с целью снятия ретроингибирования конечным продуктом;

- создание эффективной искусственной оперонной структуры с генам биосинтеза треонина;

- конструирование удобных векторных систем для работы в Грамотри цательных бактериях.

Научная новизна и практическая значимость работы. В числе первы генов анаболических путей метаболизма облигатных метилотрофов кло нированы четыре гена биосинтеза треонина М. flagellatum - ask hom, thrC, tñrB. В отличие от энтеробактерий показана оперонна организация только двух генов - hom и thrC. Локализован промотор ный участок оперона и изучена его работа в клетках Е. coli и М flagellatum. Определена полная нуклеотидная последовательное, структурных и прилегающих областей генов hom, thrC и t/irB. Локали зованы активные центры ферментов и генноинженерными методами полу чены формы мутантного гена гомосериндегидрогеназы, кодирующеп

- з -

фермент, нечувствительный к ретроингибированию. Показана новая форма гена fchrB у облигатного метилотрофа, кодирующего принципиально иную гомосеринкиназу в сравнении с ферментами других изученных микроорганизмов. Предложена модель функционирования кофер-мент-евязывающего домена гомосериндегидрогеназы, обеспечивающая взаимодействие фермента с обоими НАД-Н2 и НАДФ*Н2 кофакторами. Сконструирована искусственная оперонная структура с тремя генами биосинтеза треонина, отвечающая требованиям эффективной экспрессионной системы для грамотрицательных бактерий. Создан ряд удобных векторных плазмид широкого круга хозяев различного назначения. На основе ряда особенностей функционирования генетического аппарата, данных по нуклеотидным последовательностям 5S и 16S рРНК л сравнения аминокислотных последовательностей известных гомосе-риндегидрогеназ, треонинсинтаз и гомосеринкинаэ выдвинуто предположение о формировании вида М. flagellatum на поздних этапах эволюции эубактерий. Полученная информация по организации и функцио-мровании генов биосинтеза треонина М. flagellatum вместе с сознанными генетическими конструкциями представляют собой основу следующего этапа работы - конструирования штамма-продуцента треонина га метаноле.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разде-тов: введение, материалы и методы, результаты и их обсуждение '4 главы), выводы, приложение, список литературы (142 наименова-шя). Содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Объем работы ... - стр.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых "Биотехнология: эксперимент, теория, фактика" (Кандалакша, 1989), 6-ой и 7-ой Международных конферен-даях "Микробный рост на С1-соединениях" (Геттинген, ФРГ, 1989; Зарвик, Великобритания, 1992), 6-ом Международном симпозиуме по •енетике промышленных микроорганизмов GIM-90 (Страсбург, Франция, 990), Всесоюзной конференции "Биохимия и физиология метилотрофных мкроорганизмов" (Пущино, 1986), семинаре кафедры микробиологии ГУ им. М.В. Ломоносова (1993), семинаре отдела молекулярной гене-ики ЕНИИГенетика (1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

Клонирование генов биосинтеза треонина flagellatum.

Стратегия клонирования генов биосинтеза треонина облигатного ме-тилотрофа основьгоалась на комплементации соответствующих мутаци* Е. col i гибридными фазмидами на основе вектора JipSL5 из банка гено! М. flagellatum. Для клонирования гена аспартаткиназы, первого фермента в пути биосинтеза треонина, использовали штамм Е. coli GT14, лишенный всех трех активностей фосфорилирования аспартата. Фазмид-ные ДНК, выделенные из четырех независимых клонов Ap-R,Thr+, имел! одинаковый рестрикционный профиль и содержали EcoRl-фрагмент хромосомы метилотрофа размером 10.5 тпн. Гибридизацией по Саузерн; подтверждено происхождение клонированного фрагмента из генома М. flagellatum. Построена подробная рестрикционная карта изучаемоп участка ДНК и субклонирован на плазмиде pUC19 наименьший фрагмен' с функциональным геном ask (рис.1). Независимо от ориентации lac промотора вектора активность аспартаткиназы сохранялась, что сви детельствует об экспрессии гена в Е. coli со своих регуляторны областей. Комплементационный анализ различных мутантных штаммов £ coli показал, что другие гены биосинтеза треонина отсутствуют н клонированном фрагменте ДНК в составе фазмиды JlpASKl.

Поиск гена треонинсинтазы (thrC) в банке генов осуществляли п комплементации мутации в гене thrC Е. coli GT28. Фазмиды с наи меньшим общим фрагментом ДНК - 10. 3 тпн, несущие ген thrC метилот рофа, обозначили JlpTHRC (рис.1). Эта фазмида комплементировала мутации в генах гомосериндегидрогеназ штамма Е. coli Gif102. Мута ция по гену гомосеринкиназы Е. coli не комплементировалась. Пост роена подробная физическая карта клонированного фрагмента хромосо мы, и гены horn, thrC локализованы на расстоянии 50 - 100 н (рис. 1). Обе мутации в Е. col i комплементировались независимо о ' ориентации 1ас-промотора вектора pUC19. Эти данные дали основани предположить наличие собственных регуляторных элементов у каждог из генов и рассматривать их как две независимые генетически структуры, тесно сцепленные на хромосоме М. flagellatum. Последук щие эксперименты не подтвердили этого предположения.

Для клонирования гена гомосеринкиназы (thrB) использовали де штамма Е coli с мутациями по этому гену - АВ2463 и GT25. Фазмщ ные ДНК из клонов Ap-R,Thr+ по рестрикционному профилю были рас пределены на несколько групп. Все группы содержали общи EtoRI-фрагмент ДНК, размером 4.1 тпн. Физическое картирование, де леционный анализ и субклонирование позволили локализовать thrB re M. flagellatum в составе фрагмента ДНК, размером 1200 нп (рис.1).

>V4

•isk _

В ✓ к к

n ipASK (1Ш|

LJ ' \

pASK3 (l.)tb) ApTHRC (11 kb) 1

V^ctjE. H g s К s в

E.-f L, ■

pTHRCl H 2kb)

E/ E £ JpTHRB <Tkb>

pTHRC5 (2.«tb|

Л01

pHOM 12 (i.üb)

pTHRÜb |Ub)

JJduJd partial digest, hgase Sa P ? s.i

pTMRB9 (2kb|

*

Iii]I nudea i I¡gast Sa Sa

tliri

pTHRBlO (I 1 kbt

Рис. 1 Схема клонирования генов биосинтеза треонина К flagellatum.

В - ВаяШ, Н - Hindi II, Е - EboRI, К - Ярл1, Р - fVull, S - 5рЫ, Sa - Sau3A.

1 2 A3 Ч

Г

Рис.2 Авторадиограмда белсов, штамла Е. coli АВ2463.

А - экспрессия генов

how и thrC. 1 - pTHRCl, 2 - pTHRC5, 3 - рН0Ш2, 4 - pUC19.

синтезированных в макси-клетках

Б - экспрессия гена thrB.

1 - pUC19,

2 - pTHRBlO

iL Определение относительных размеров продуктов генов thr€, hom и thrB в системе макси-клеток.

Для экспрессии генов в системе макси-клеток была разработана методика работы с штаммом £ coli АВ2463. Относительная молекулярная масса белков - продуктов генов thrC, hom и thrB, составила 51-52; 47-48 и 20-21 кД, соответственно. На рис. 2 представлен радиоавтограф [35-S3-белков, продуцируемых в системе макси-клетон штамма АВ2463 с плазмидами pTHRCl,pTHRC6,pHCM2B, pTHRBlO и pUC19.

3i_ Определение и анализ нуклеотидной последовательности участка хромосомы с генами hom и thrC.

Для определения нуклеотидной последовательности изучаемого участка хромосомы построена подробная рестрикционная карта HiixllII-Pael области клонированного фрагмента на фазмиде ^pTHRC. На рис. 3 представлена физическая карта участка и отображена стратегия определения нуклеотидной последовательности по модифицированной методике Сенгера на автоматическом секвенаторе ДНК фирмы "Applied Biosystems" модель 370А. Реакции секвенирования проводили по наи' более современной методике "cycle sequencing" на термальном циклическом амллификаторе. Полная нуклеотидная последовательность этого участка приведена на рис. 4.

•ô li h h !з.8(гпн)

Рис. 3 Рестрикционная карта и стратегия определения нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК M. flagellatum с генами Лота и thrС

3.1 Анализ структурной части гена hom.

Анализ всех открытых рамок считывания (орс) показал, что только две из них могут кодировать полипептиды с молекулярной массой более 40 кД. opcl, протяженностью 1314 пн с инициирующим ATQ кодоном в положении 566 и стоп-кодоном ТАА в положении 1877, кодировала полипептид с молекулярной массой 46620 Д. Данные экспериментов в макси-клетках и результаты комплементационного анализа дали основание заключить, что opcl кодирует ген гомосериндегидрогеназы.

1) 21 31 41 51 61 71 81 Al

tracagagcatagaoeacxAtgteEoeoceaijuHttiAj^HttAtgca^ Etcaag0c<MaetrtgE0ctgt30ctrtttCBCtc»*teatcc»aM

308 318 328 338 348 358 368 378 388

407 417 427 437 447 457 467 477 487

ttaooctaattgoH^ta^amttacogp.^.aefacagcaocatcai^

506 516 526 536 546 556 666 576 586

-3S -m MKPINVGLLG 10

aaagcgcejt^Ecatt^ac^tt^ütgtcectggAca^frttgaataaagc^

605 615 625 635 645 655 665 675 685

G T V G ¡^J^J^^j^J^ ^ Iüü 43

704 714 724 734 744 754 764 774 784

RNLELARKVTAGQVDVTDDAFAVVADPS I D 1 V 76

лшхштлталлттсяосзхаиашгмсв^^ OOCAQCATOGACATCGT

803 813 823 833 843 853 863 873 883

EL IGGCTVARELVMKA I EHGKHVVTANKGL I A 109 rCGAGCTGATCGGCQQCTTGCACTCTCGCACQCGAATTGCTGATGAAGOCGATCGAACAÏGœ

902 912 922 932 942 952 962 972 982

HGNEIFAAAQQKGV1VAFEAAVAGGIPI IKAV 142 rGOtf3GCTJWCGAGATTTTTQOCÖ3DQCQCAGC!AGAiUÄGGGTGATOGTTQtnTTTGA^^

1001 1011 1021 1031 1041 1051 1061 1071 1081 EGLAANR 1 EV I AG I I NGTT NF I LSEMREKALA175 XGiraXCTGGCraXTUODETATC&AGT^

1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 ADVLKEAQRLGYAEADPTFDVEGVDAAHKLMI 208 rTGCTGATGTGCTi^AQGAGQroCAGCQOCTGGQCTATQCCBAÛQODGAOCDG^^

1199 1209 1219 1229 1239 1249 1259 1269 1279 AAIGFGI'PMQFDKAYVEGISKLDSID 1 R Y A E E 241

гмстосллггшсппетлтссслАшжлтсо^^

1298 1308 1318 1328 1338 1348 1358 1368 1378 GYRVKLLG I TKRTSQGVELRV HPTL I PEKRL 1 274 ГОООСТАгаГВ1СААОСТ(ХГГТВОС>ПАаХАОСОСАСЕЛаОСА^^ rCDGAAAAGOQDCTGAT

1397 1407 1417 ' 1427 1437 1447 1457 1467 1477 NVNGAMNAVLVKGDAVGPTLYYGAGAGAEPTA 307 ХААТШОиОВваЯСЖГСМТВОВШЭТШ^

1496 1506 1516 1526 1536 1546 1556 1566 1576 AVVAD I VDVTRTHTTDVHQRVPHLAFQPDQLV 340 mXGTQOT3G<nUTATTGn£«CCTA/№Q(XCAC№

1595 1605 1615 1625 1635 1645 1655 1665 1675 LP I LA 1 GEVSSAYYLRVRAVDKPGVLADVT R I 373

оттаооитшгаоилтооосышгсАамсот

1694 1704 1714 1724 1734 1744 1754 1764 1774 GDRQ I S 1 DAMIQKEPQEGEDQAD I I ILTHVTA406 imnGAOm№ATTTCGATTIUTC»CMTGATIX№AAAGAACC^

1793 1803 1813 1823 1833 1843 1853 1863 1873 KNMDDAIAAIEALPAISGSVTRLRMEELSR* 437 kQUGAAMTOUTCAaœATnrrarATCGA^^

BpullCKI

1892 1902 1912 1922 1932 1942 1952 1962 1972

. ,__ __ MRYISTRGQSPAQSFTE 17

igaaaggrttj^M^^ngcagtt^gcctgiatcarttgtgccATGAGATATAm

1991 2001 2011 2021 2031 2041 2051 2061 2071 LLGGLAPDGGLYLPEQYPQFSQDELNAMRGMH 50

~ШГГ~ ' Pael

2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 RDLAFTILSRL1DD1PAAAADLRAI 1DKTYRA 83

2189 2199 2209 2219 2229 2239 2249 2259 2269 VYAYARAGQNAEDITPTLKLEDDLYLLSLSNG 116

2288 2298 2308 2318 2328 2338 2348 2358 2368 T LAFKDMAMQLLGNLFEYMLAQKGET IN 1 L G A 149 iACOCTGQCaTTtUAQGACATGDCGATÍX^tinamGQ^^

£377 2387 2337 2407 2417 2427 2437 2447 2457 2467 thrC TSGDTGSAAEYAMRGKQGVKVFMLSPYQKM ER ACna3QQlGAC7iaiCTTCTQCTGOQGAAIAai}W

2476 2486 2436 2506 2516 2526 2536 2546 2556 2566

thrC QTAQIVSLQDDN1YN1AVKGVFDÜCQDIVKAV CAGACTGC33CAGAnGTC>QCXTrGCAGGATGACAATATTTAC>ATATCGCD(TrCAAGGGOOT

2575 2585 2595 2605 2615 2625 2635 2645 2655 2665

thrC NDHAFKAKNK I GAVNS INVARVAAQVVYYFKG AATGAn>T(TiniakAGGCAAAGAAC>AGATmaCDCACTAAACTCCATtU^

2674 2684 2694 2704 2714 2724 2734 2744 2754 2764 thrC FAVTADNAQRVSFAVPSGNFGNVCAGH I A R M M

тттосаясжгаиж^тсоослоахшсАсслтспхстсст

2773 2783 2793 2803 2813 2823 2833 2843 2853 2863 thrC LP 1 AKLVVATNENDVLDEFFKTGV Y R P R 6 S A H

2872 2882 2892 2902 2912 2922 2932 2942 2952 2962 thrC YHTSSPSMD1SKASNFERFVFDLVGRYAAKVR TAC»tf»CCTOCÄGraTT(X»TGG*TAmO^

2971 2981 2991 3001 3011 3021 3031 3041 3051 3061 thrC LWGKVDAGGSVDLNEGGWFAKVADYGFVSGSS CTGTQOQOCJU^GCn'AGATGCIMCTOQCAiXI^OGACCTCMTGAAGGCGGnGGTTTGCIIAAGCT 1Itil U1CCOQCAOCAQC/

3070 3080 3090 3100 3110 3120 3130 3140 3150 3160 t hrC HANGMQTIRVTHERYGVTIDTHTADGLKVALE

3169 3179 3189 3199 3209 3219 3229 3239 3249 3259 thrC RRAGI PMLVLET ALPAKFEDA I VEALGQKPNA OjCAQGGCGGGCATTODGATGCTiCTACITGAAAOOGnnTGOCGGCCAAATTOG^

3268 3278 3288 3298 3308 3318 3328 3338 3348 3358 thrC TAWRLGSLPQRFEVMEADVAA I KQF 1 VEHV*

ACABCCTGGAGOCrTGGAAGCCrGDESCAÜUUL'l 11 bAGSTGATBGAGGCOGATinHSDCGCTATCAAGCAlirTCATTSrOGAGCATGrTtgatcEi

3367 3377 3387 3397 3407 3417 3427 3437 3447 3457 orfX MKVYHOLMRHVLEQGHKKEDRTGTGTLSVF e^CEE^TGAAQGTCTATCACIjACITGATGCDOCACCTACT0GAGCAGGOCCACAAGAAiJlAAGAO[^^

3466 3476 3486 3496 3506 3516 3526 3536 3546 3556 огГХ YQMRFDLSEGFPLLTTKKVHLNAI IHELLVFL TAOCAGATtiUJUl I0GA0CTGT00BAGGQU11 lUXLMGCTGAOCÄOCAAGAAGEnTCACCTGAATGOCATTATTt^TGAOCrGCTCTGGTTTTTGC

3$6S 3575 3585 3595 3605 3615 3625 3635 3645 3655 о гГХ GSTNIAYLKENGVTIWDEWADAEGNLGPVYGY GGCACTACCAACATTQCCTAOCTC^AQGAAAACGGCtrrGAOC^TCrQGGAOGAirrQQGCGGATGCCGAGQ(IlAA(CT

3664 3674 3684 3694 3704 3714 3724 3734 3744 3754 огГХ WRNWPKPDGGH I DQ I SEV I AA I K5NPDSRRL I TGGCQCAATTGGCCCAAACTOGATTOAGGOCATATUGATCAGATCAGCGAAGTGAT^ Muni

3763 3773 3783

ОгГХ SAVNVADV TCCQCATQGAATtJTCGCCtiATGTT

Рис. 4 Нуклеотидная последовательность Pael-HincII участка хромосом) iL flagellatum с генами horn и thrC.

Аминокислотные последовательности белков приведены в однобуквенном коде. Области -10 и -35 предполагаемого промотора обведены рамкой В межгенном участке генов how и thrC подчеркнуты инвертированная (снизу) и повторяющаяся последовательности (сверху) ДНК. Подчеркнуты последовательности сайтов рестрикции, использованные в конструировании искусственной оперонной структуры (пояснения в тексте).

Кроме того, аминокислотная последовательность данного полипептида имела высокую степень гомологии с известными гомосериндегидрогена-зами других бактерий (рис. 7).

3. 2 Анализ структурной части гена thrC.

орс2 имела максимальную протяженность 1425 пн от ATG кодона в положении 1930 до стоп-кодона TGA в 3358 положении и могла кодировать полипептид массой 52028 Д. Однако мы не обнаружили последовательности Шайна-Дальгарно (SD) перед инициирующим кодоном. Теоретически ген мог транслироваться со второго метионинового триплета в положении 2065. В этом случае перед ATG кодоном находилась SD-последовательность и масса белка составляла 47219 Д. Выравнивание известных аминокислотных последовательностей треонинсинтаз выявило у них значительную гомологию. Причем последовательности грамположительных бактерий хорошо выравнивались от второго метионинового остатка в последовательности метилотрофа. Ферменты £. coli, 5. marcescens и дрожжей имели добавочные N-концевые последовательности, гомологичные между собой и последовательностью Ai. flagellatum. (рис.8). Генноинженерными методами мы доказали, что 48 N-концевых аминокислотных остатка треонинсинтазы метилотрофа необходимы для функционирования фермента, и, следовательно, истинным инициирующим кодоном (в клетках Е. coli) является триплет ATG в положении 1930.

3. 3 Анализ участков ДНК, прилежащих к генам hom и thrC.

За 7 нп перед ATG кодоном гена hom обнаружен триплет GAA, который может служить "слабой" областью Шайна-Дальгарно. Комплементацион-ный анализ и клонирование 5'-нетранслируемой области гена (раздел 4) предположили наличие промоторного участка в пределах 200 нп. Наиболее вероятным промотором следует считать последовательность TcGgCA(-35)-17Hn-TAcAAg(-10) (рис.4). Оба блока имеют по 4 совпадающих нуклеотида с каноническим промотором, узнаваемым в клетках Е. coli холоферментом РНК-полимеразы ff-70. Между стоп-кодоном ТАА гена hom и старт-кодоном гена thrC находится 50 нп. Анализ вторичной структуры ДНК в этой области выявил необычную последовательность. 26 нуклеотидов могут образовывать шпилечную структуру со стеблем в 10 и петлей в 6 нуклеотидов. Более того, последовательность из 11 нуклеотидов, начинающаяся с петли шпильки, повторяется через 5 нуклеотидов с делецией в один нуклеотид (рис. 4). Такая структура дает основание предполагать наличие регуляторного участка в 'межгенной области ДНК. Эксперименты по субклонированию гена thrC с различными по длине 5'-концевыми участками выявили промо-

торную последовательность гена треонинсинтазы именно в пределах 50 нп этой области ДНК. Действительно, мы обнаружили здесь почти каноническую последовательность блока -35 - 1881-TTGAgA-1886, но выраженной последовательности блока Прибнова на расстоянии 14-20 нп не нашли. Кроме того, перед инициирующим кодоном гена отсутствовала и SD - последовательность.

Через 12 нуклеотидов от TGA кодона гена tftrC расположен триплет ATQ, который может являться первым формилметиониновым кодоном неи-дентифицированного полипептида. Перед ним локализована SD-последовательность ■ - GGAG и метиониновый остаток в положении 3373 открывает орсХ (рис.4). 138 N-концевых аминокислотных остатков предполагаемого полипептида не имели выраженной гомологии с известными последовательностями белков, участвующих в биосинтезе аминокислот аспарагинового семейства. Эксперименты по трансляционному слиянию с геном lacZ' подтвердили наличие орсХ

4. Изучение промоторных областей генов hom и thrC.

Результаты комплементационного анализа позволили сделать вывод об экспрессии клонированных генов в Е. coli со своих регуляторных областей. Для клонирования последовательностей, содержащих индивидуальные промоторы, использовали вектор широкого круга хозяев pAYC37. Генетическая конструкция вектора позволяет избирательно клонировать в своем составе промоторные последовательности прямым отбором на селективной среде. Наличие ряда уникальных сайтов рестрикции перед SD-последовательностью гена aph (аминогликозидфосфот-рансфераза) обеспечивает разнообразие в стратегии клонирования. Для анализа предполагаемого промотора гена hom фрагмент ДНК, ограниченный сайтами SauЗА (347 - 773, рис.4), клонировали по Bantil сайту вектора pAYC37. Промоторной областью гена thrC послужил фрагмент ßpul 1021(1870) - Pael(2077) (рис.4). Плазмидные ДНК из клонов, устойчивых к 20 мкг/мл стрептомицина (Sm), обозначили соответственно pPHD37 и pPTS37. В качестве контроля использовали плазмиды pAYC37 и pAYC32, обеспечивающую клеткам устойчивость к Sm за счет экспрессии гена aph с "слабого" промотора гена тетрацикли-нового репрессора плазмиды pBR322. Конструкции переводили в штамм М. Hagel latum и методом реплик переносили на возрастающие концентрации Sm. Максимальный уровень устойчивости клеток к антибиотику оценивали по способности штаммов формировать колонии на третьи сутки. Результаты экспериментов приведены на рис. 5. Контрольная плазмида pAYC37 в Е. coli обеспечивала клеткам устойчивость к 3 мкг/мл Sm. В М. flagellatum максимальный уровень устойчивости повышался в 10 раз. Теоретически возможен слабый фоновый уровень

Sou3A(20) Sou3A(445) EcoRV(1430)

ATG^ hom.

II Sau3A

Рое1(174в) (Hin dill)

pPHD37

BamHI/SouJA BomHI/SauJA

\

ATG thrC

EccRV+Hlndlll

BamHI(kl)/ERV

pPTS37

ATG

aph.

=S-

ATG

aph.

pAYC37 (Sm мм/мл] pAYC32 [Sm м/ma) pPHD37 ¡5m MW/MA) PPTS37 (Sm ют/ma)

E.coli 3 100 100 150

M.flagel. 30 1300 1800 100

Рис. 5 Клонирование промоторных последовательностей генов torn и thrC Ы. flagellatua. (Пояснения в тексте)

устойчивости за счет экспрессии aph гена с дальнего промотора Rep-onepoHa вектора, а более высокую устойчивость метилотрофа к Sm можно объяснить дефектами в транспортной системе М. riagellatum. В Е. coli самой эффективной конструкцией оказалась плазмида pPTS37, несущая промоторную область гена thrC. Однако в клетках M.flagel-latum этот промотор практически не выражался, что дает основание считать эту последовательность "ложным промотором" и предположить, что РНК-полимеразы метилотрофа более требовательны к структурам промоторов, чем у Е. coli. Промоторные участки генов horn и тетра-циклинового репрессора в клетках Е. coli обеспечивали равный уровень экспрессии гена aph. В метилотрофном штамме первый промотор работал на 30% эффективнее. Результаты позволили сделать заключение об истинной локализации промоторного участка гена horn в пределах 200 нп 5'-концевой нетранслируемой области и предположить, что оба гена биосинтеза треонина в клетках М. riagellatum транслируются с одной полицистронной мРНК. Возможность регуляции предполагаемого оперона проверялась по сравнению уровней устойчивости к антибиотику при добавлении в среду ингибируклцих рост концентраций различных аминокислот аспарагинового семейства. Корреляции между присутствием в ростовой среде какой-либо аминокислоты или их смесей с уровнем устойчивости клеток к стрептомицину не наблюдалось. Этот факт не исключает механизма регуляции оперона по типу репрессии и может объясняться многократным увеличением на многоко-пийной плазмиде операторного участка.

- 12 -

5. Характеристика РНК - транскриптов.

В литературе отсутствуют данные по организации генов у облигатных метилотрофов. Для подтверждения наших результатов, свидетельствующих в пользу оперонной организации hom-thrC генов, проведены работы по Норсерн-блот-гибридизации. Тотальную мРНК, выделенную из штаммов U. flagellatum и Е. coli TGI, после электрофоретического разделения переносили на два отдельных нейлоновых фильтра. Один из них гибридизовали с меченым фрагментом ДНК гена horn, другой - гена fchrC. Данные гибридизации представлены на рис. 6. Результаты свидетельствуют о транскрипции обоих генов в М. flagellatum в виде одной продолжительной полицистронной мРНК. Размер транскрипта соответствует 8-9 тпн, следовательно, в состав данного оперона должны входить еще несколько генов С ген). Наличие орсХ, расположенной непосредственно за геном fchrC, подтверждает полученные данные.

Рис. 6 Авторадиограмса Норсерн-блог--гибридизации суммарной мРНК, выделенной из клеток к. flagellatum.

А - гибридизация с геном hom, Б - гибридизация с геном thrC.

1 - мРНК Е. coli,

2 - мРНК М. flagellatum.

аминокислотных последовательностей гомосериндегидрогеназ.

Сравнение известных аминокислотных последовательностей гомосериндегидрогеназ (ГД) В. subtilis, С. glutamicum, E.coli (ГД1 и ГДП), 5. marcescens (ГД1) и М. flagellatum показало высокую степень гомологии между ферментами бактерий отдаленных таксономических групп (рис.7). В отличие от изученных гомосериндегидрогеназ, фермент ме-тилотрофа может использовать в качестве кофактора как молекулу НАДФ-Hj, так и НАД*Н2. Это свойство имеют и некоторые другие дегид-рогеназы М. flagellatum. По-видимому, это связано с особенностями энергетического метаболизма облигатных метилотрофов. В отличие от гетеротрофных микроорганизмов, цикл трикарбоновых кислот у М. flagellatum разомкнут и источником восстановительных эквивалентов служат реакции окисления глюкозо-6-фосфата и ключевого интер-медиата диссимиляционного цикла 6-фосфоглюконата. В условиях, когда уровень восстановленных пиридиннуклеотидов достаточен для

А i г

г 1

6;_ Сравнение известных

Б

1. EKRIGLVLFtKSJIffiRWLELFAREQSTLSARTGFEFVLAGVVDSRRSLLSYDGLDASRALAFFNDEAVEQDEESLFLWMRAHPYDDLVVLDVTASQQLA (555)

2. DQVIEVFVIGVGGVG3ALLEQLKRQQSWLKNKH-IDLRVCGVANSKALLTNVHGLNLENWQEELAQAKEPFNLGRLIRLVKEYHLLNPVIVNCTSSQAVA (561)

3. DQVIEVFVIGVG3VGGALIEQIYRQQPWLKQKH-1DLRVCGIANSRVMLTNVHGIALDSWRDALAGAQEPFNLGRLIRLVKEYHLLNPVIVDCTSSQAVA (561)

4. MKAIRVGLLGLGTVGE6VVK11QDHQDKLMHQVGCPVTIKKVLVKD-LEKKRE-VDLPK— EVLTTEVYDVIDDPDVDVVIE------VIGGVEQT----( 86)

5. MKPINVGLLGIGTVGGGTYTVLTRNQEEIARRAGRPIAITRVADRN-LELARK-VTA— GQVDVTDDAFAVVADPSIDIWE------LIGGCTVA-----( 86)

6. GSAVGI ALLiFGT VGTEVMRLMTEYGDELAHRIGGPLEVRGIAVSD-1SKPREGV- APE— L- LTEDAFALIEREDVDI WE------VIGGIEYP-----(100)

*' ! ** I *!!!!*! ! ! ',***!!

1. DQYLDFA-SHGFHVISANKLAGASDSNKYRQIHDAFEKTGRHWLY-NATVGAGLPINHTVRDLIDSGDTILSISGIFSGTLSWLFLQ-FDGSVPFTELVD (652)

2. DQYADFL- REGFH WTPNKKANTSSMDYYHQLRYAAEKSRRKFLY- DIN VGAGLPVIENLQNLLNAGDELMKFSGILSGSLSYI FGK-LDEGM3FSEATR (658)

3. DQYVDFL-ADGFHVVTPNKKANTSSMNYYQQLRAAAAGSHRKFLY-DTNVGAGLPVIENLQNLLNAGDELVRFSGILSGSLSFIFGK-LDEGLSLSAATL (658)

4. KQYLVDALRSKKHVVTANKDLMA----VYGSELLAEAKENGCDIYFEASVAGGIPILRTLEEGLSS-DRITKMMGIVNGTTNFILTKMIKEKSPYEEVLK (181)

5. RELVMKAIEHGKHVVTANKGLIA----LHGNEIFAAAQQKGVIVAFEAAVAGGIP11KAVREGLAA-NRIEWIAGIINGTTNFILSEMREKALAFADVLK (181)

6. REVVLAALKAGKSVVTANKALVA----AHSAELADAAEAANVDLYFEAAVAGAIPVVGPLRRSLAG-DQIQS VMGIVNGTTNFILDAMDSTGADYADSLA (195)

* *****!** * *** ! I !

1. QAWQQGLTEPDPRDDLSGKDVSRKLVILAREAGYNIEPDQVRVESLVPA- HCEGGSIDHFFENGDELNEQMVQRLEAAREM3LVLRY-----VARFDANG ( 746)

2. LAREMBYTEPDPRDDLSGMD VARKLLILARETGRELELADIEIEPVLPAEFN AEGDVAAFMANLSQLDDLFAARVAKARDEGKVLRY-----VGNIDEDG (753)

3. QARANGYTEPDPRDDLSGMDVARKLLILAREAGYKLELSDIEVEPVLPPSFDASGDVDTFLARLPELDKEFARNVANAAEQGKVLRY-----VG1IDE-G (752)

4. EAQDLGFAEADPTSDVEGLDAARKMAILARL-GFSMNVDLEDVKVKGISQITDEDISF----------------SKRLGYTMKLIGI-----AQRDGSKI (259)

5. E AQRLGYAE ADPTFD VEGVDAAHKLMIL AA I - GFGIPMQFDKAIVEGISKLDSIDIRY----------------AEELGYRVKLLGI-----TKRTSQGV (259)

6. EATRLGYAEADPT ADVEGHDAASKAAI LAS 1 - AFHTRVT ADDV YCEGI SN ISAADIEA----------------AQQAGHTIKLLAICEKFTNKEGKSAI ( 278)

* I ! I * I * *** ** ! *| !

1. KARVGVEAVREDHPLASLLPCDNVFAIESRWYRDNPLVIRGPGAGRDVTAGAIQSDINRLAQLL (809)

2. VCRVKIAEVDGNDPLFKVKNGENALAFYSHYYQPLPLVLRGYGAGNDVTAAGVFADLLRTL-SWKLGV (820)

3. RCKVRIEAVDGNDPLYKVKNGENALAFYSRYYQPLPLVLRGYGAGNDVTAAGVFADLLRTL-SWKLGV (819) I * I !

4. EVSVQPTLLPDHHPLSAVHNEFNAVYVYGEAVGE—TMFYGPGAGSMPTATSVVSDLVAVMKNMRLGVTGNSF-VGPQYEKNMKSPSDIYAQQFLRIHVK (356)

5. ELRYHPTLIPEKRLIANVNGAMNAVLVKGDAVGP--TLYYGAGAGAEPTASAVVADIVDVTRTHTTDVHQRVPHLAFQPDQLVDLPILAIGEVSSAYYLR (357)

6. SARVHPTLLPVSHPLASVNKSFNAIFVEAEAAGR--LMFYGNGAGGAPTASAVLGDVVGAARNK---VHGGR---APGESTYANLPIADFGETTTRYHLD (370)

* * ! ! ! ! л i * * * lili** * ! ! ! ! а! *

.\EIVIVTHHTSHADFSDILQNLNDLEVVQEVKSTYRVEGNGW3 (433)

4. ----DEVGSFSKITSVFSERGVSFEKILQL-PIKGHDEL

5. VRAVDKPGVLADVTRILGDRQISIDAMIQKEPQEGED-Q

6. MDVEDRVGVLAELASLFSEQGISLRTIRQEE— RDDD-

AD111LTHVTAEKNMDDAIAAIEALPAISGSVTRLRMEELSR ( 437) №L I VVTHSAL^DLSRTVELLKAKPVVKAINSVIRLERD (445)

Рис. 7 Сравнение известных аминокислотных последовательностей гомосериндегидрогеназ.

1. - ГДИ £. col i ; 2. - ГД1 Ecoli; 3. - ГД1 S. maree see ns; 4. - ГД E subtil i s; 5. - ГД M. fl age 1 latum-, 6. -ГД С. glutamicum. Обведен участок предполагаемого домена аллостерического ингибирования. Выделены глициновые остатки, формирующие кофермент-связывающий участок, ^-идентичные аминокислотные остатки;'- заменяемые (I-L-V-M;D-E; R-K; S-T; F-Y).

со

* ! ! * I **! **! * * I ! * *

S. с ( 1)MPNASQVYRSTRSSSPKTITFEEAIIQGLATDGGLFIPPTIPQVDQATLFNDW5KLS--FQDLAFAIMRLYIAQEEIPDADLKDLIKRSYSTFRSDEVTPLV

e. с (1) mklynl-kdhne-qvsfaqavtqglgknqglffphdlpefsl-teidemlkld— fvtrsakilsafig-deipqeileervraafa------fpapv

S. m (1) MKLYNL- KDHNE- QVSFAQAIKQGLGKQQGLFFPLDLPEFEL- TE IDHLLEQD- - FVTRSSRI LSAF I G- EEVPETALKKRVQAAFE------FPAPV

M. f (1) MRYI ST RGQSPAQ- SFT EILLGGLAPDGGLYLPEQYPQFSQ- DELNAMRGMH— YRDLAFTILSRLI—DD IPAADLRA11DKT YRRADVYAYARAG

B.s (1) ■ MWKGLIHQYKEFLP— VT-----DQTPALTL— HEGNTPLI H- LPKLSE—

В. 1 Cl) MYKGLLKQYASYLP— VN-----EKTPD VSL— MEGNTPLIPLLNISK—

! ** *** ! ! ! I *!!*** | ! I ! ! * ! !

S. c(101) QNVTQDK------ENLHILELFHGPTYAFKDVALQFVGNLFEYFL-QRTNANLPEGEKKQITVVGATSGDTGSAAIYGLRGKKDVSVFILYPTGRISPIQ

E. c( 85) ANVES---------DVGCLELFHGPTLAFKDFGGRFMAQMLTHIAGDK-----------PVTI LTATSGDTGAAVAHAFYGLPNVKVVILYPRGKISPLQ

S. m (85) AKVTD---------DVSCLELFHGPTLAFKDFGGRFMAQMLAEVAGEQ-----------PVTILTATSGDTGAAVAHAFYGLKNVRVVILYPQGKISPLQ

M. f( 92) QNAEDITPTLKLEDDLYLLSLSNGPTLAFKDMAMQLLGNLFEYMLAQK-------GE-1TINILGATSGDTGSAAEYAM?GKQGVKVFKLSPYQK}^RFQ

B.s( 40) QLGI----------ELHVKTEGVNPTGSFKDRGM- VMAVAKAKEEG-------------NDTIMCASTGNT- SAAAAAYAARANMKCIV11PNGKIAFGK

B. 1( 40) QLGV----------QLYGKYEGANPTGSFKDRGM-VMAVAKAKEEG-------------SEA11CASTGNT - SASAAAYAARLGMKC11VIPEGKIAHGK

! ! * ** *! I * *! ! * * I****!*!

S. c(194) EEQMTTVPDENVQTLSVTGTFDNCQDIVKAIFGDKEFNSKHNVGAVNSINVAR1LAQKÎT YYFYSFFQATNGKDSKKVKFVVPSGNFGDILAGYFAKKM3L

E. c(173) EKLFCTLGG-NIETVAIDGDFDACQALVKQAFDDEELKVALGLNSANSINISRLLAQICYYFEAVAQLPQETRNQ-LVVSVPSGNFGDLTAGLLAKSLGL

S. m( 173) EKLFCTLGG-NIHTVAIDGDFDACQALVKQAFDDQELKDALHLNSANSINISRLLAQICYYFEAVAQLPQEARNQ-LVISVPSGNFGDLTAGLLAKSLGL

M. f(184) TAQMFSLQDDNIYNIAVKGVFDDCQDIVKAVSNDHAFKAKNKIGAVNSINWARVAAQVVYYFKGYFAVTADNA-QRVSFAVPSGNFGNVCAGHIARMMGL

B.s(121) LAQAVMYGAE— 11AIDGNFDDALKIVRSIС------EKSPIALVNSVNPYRIEGQKTAAFE----VCEQLGEAPDVLAIPVGNAGNITAYWKGFKEYH

B.1(121) LAQAVAYGAE—IISIEGNFDDALKAVRNIA------AEEPITLVNSVNPYRIEGQKTAAFE----1CDQLQNAPDVLAIPVGNAGNITAYWKGFCEY-,

s. c(294) pieklaidtnendiLdrflksglyersdkva--atlspamdilissnferllwyldheylangddlkageivnnwfqelktngkfq-vdksiiegaskdf£

E. c(272) PVKRFIAATNVNDTVPRFLHDGQWSPKA— TQATLSNAMDVSQPNNWPR-VEELFRRKI---------------VQ-LKELG-YAAVDDE---------,

S. m( 272) PVKRFIAATNANDTVPRFLTSGQWQPHA— TVATLSNAMDVSQPNNWPR-VEELFRRKV---------------VQ- LKELG- HAAVSDE---------

M. f(284) PIAKLVVATNENDVLDEFFKTGVYRPRGSANTYHTSSPSMDISKASNFERFVFDLVGR-DAAKVRELW3KVDAGGSVDLNEGGWFAKVADYGFVSG----

B. s(205) E— KN—GTGLPK- MRGFEAEG-----AAAIVRNE VIENPE- TI AT - AIR-----1GN- PASWDKAVKAAEESNGKI DE--------VTDDEIL------

B. 1(205) E—KEK-GYKKPR- IHGFEAEG-----AAA IVKGH VIEEPE- TI AT - AIR-----1 GN- PASWSYAVEAAEQSHGEI DM--------VSDEEIL------

1 1 1 ' '

S. c(391) TSERVSNEETSETIKKIYESSVNPKHYILDPHTAVGVCATERLIAKDNDKSIQY-1SLSTAHPAKFADAVNNALSGFSNYSFEKDVLPEELKKLSTLKKK

E. c( 342) TTQ--------QTMRELKE-----LGYTSEPHAAVAY----RAL-RDQLNPGEYGLFLGTAHPAKFKESV- EAI LG------ETLDLPKELAERADLPLL

S. m( 342) TTK--------DTMRELAE-----LGYISEPHAAIAY----RAL-RDQLQEGEFGLFLGTAHPAKFKESV-EAILG------QELPLPKALALRAELPLL

M. f(378) SSNHANGM—QTIRVTHER----YGVTIDTHTADG-LK-V-AL— EQRRAGIPMLVLETALPAKFEDAIVEALGQKPN-------ARTAWRL-GSLPQR

B. s(277) —HA-----YQLIA----RVEGVFAEPGSCASIAGVLKQVKSG— EIPK-GSKVVAVLTGN-GLKDPNT—AVDI------------SEIKPV-TLPTD

B. 1(277) —HA-----YRLLA----KT EGVFAEPGSN ASL AGVIKH VESG— KI KK- GET V V A VLTGN- GLKDPDI--AIS-------------SNQLDIASVSND

S. c(490) LKFIERADVELVKNAIEEELAKMKL. Рис.8 Сравнение известных аминокислотных последовательностей

Е. с(410) SH-NLPADFAALRKLMMNHQ. треонинсинтаз.

S. ш(410) SH-TLPASFGELRKFLM3LPA. S. с-S. œrevisiae-, E.c-E.coli; S. m-S. marcescenc; M. f-M. flagellatunr,

M. f(459) FE-VMEADVAAIKQFIVEHV. B. s-fi subtil js; B. 1-fir. lactoferrrentum.

B. si 339) EDSILEYVKGAARV. I - заменяемые аминокислоты ( I-L-V-M; D-E; R-K; S-T; F-Y),

R 1 ! ТРПТк'ПН Ik'RV ТКЛ7 * - тпгогтятииние яшгагагир ипти

биосинтетических реакций в клетке, активность 6-фосфоглюконатде-гидрогенааы подавляется. Такая система обеспечивает распределение углерода метанола между диссимиляционной и ассимиляционной ветвями рибулезомонофосфатного цикла. Таким образом, у М. ПаёеПаЬит функционирует строгий контроль за внутриклеточным уровнем восстановительных эквивалентов, который и определяет выбор между двумя процессами: синтезом в клетке и, следовательно, быстрым ростом культуры или диссимиляционным путем, в котором формальдегид "сжигается" до углекислоты и восполняется пул НЩФ)-^. Возможность осуществления дегидрогеназных реакций, связанных с биосинтетическими процессами в клетке, при участии двух кофакторов, несомненно, является эволюционным достижением и обеспечивает облигатному мети-лотрофу в условиях жесткого лимита по восстановительным эквивалентам хорошие ростовые характеристики.

В числе первых стала известна нуклеотидная и, соответственно, аминокислотная последовательность дегидрогеназы с двойной специфичностью. Мы сосредоточили внимание на молекулярных механизмах взаимодействия кофакторов с апоформой фермента. Известно, что для взаимодействия пиридиннуклеотидных коферментов с дегидрогеназами необходимы определенные условия формирования первичной и вторичной структуры кофермент-связывающего домена. В работах Виеренга и Хофстинга приведен анализ аминокислотных последовательностей большинства известных НАД-Н2- и ФАД - зависимых дегидрогеназ и установлено расположение "значимых" аминокислотных остатков. По аналогии с такими участками, мы локализовали функциональные домены в известных гомосериндегидрогеназах и предложили наиболее вероятную, на наш взгляд, модель взаимодействия фермента М. Иа^еНаЬит с двумя кофакторами. Учитывая строгую специфичность взаимодействия ни-котинамидного кольца пиридиннуклеотидов с коферментсвязывающим участком и жесткость скелета молекулы НАД( Ф) • Н2, мы предполагаем, что выбор между связыванием одного из коферментов определяется конформационными изменениями фермента в участке связывания с аде-нозиндифосфатным компонентом НАД( Ф) • На (рис. 9). Таким образом, одна из конформационных форм активного центра формирует площадку для взаимодействия с НАД»Н,, и, по аналогии с другими НАД-Нг-зависимыми дегидрогеназами, предполагается, что карбоксильная группа аспараги-новой кислоты (0-44) обеспечивает специфичность фермента, участвуя в образовании водородной связи с 2' -ОН-группой адениновой рибозы. Гуанидиновая группировка остатка аргинина (вероятно (?-41) будет являться катионным центром, образующим солевой мостик с пиро-фосфатной частью кофактора. При изменении конформационного состояния апофермента, вероятно, происходит такое преобразование, в ре-

NH,

Рис. 9 Модель взаимодействия Гофидишгуклеотидньи коферментов

с гомосермндегндрогеназой iL flagellatum.

А - связьшание НАД'Цг; Б - связывание с НАДФ-Н2.

зультате которого формируется иная площадка, с которой может связываться молекула НАДФ • Н2. Наиболее вероятными функциональным* группами, определяющими связьшание этого кофермента, являются гуа-нидиновые группировки остатков аргинина в положениях 31(32) и 35. Первая из них будет взаимодействовать с пирофосфатной частью кофаь тора, вторая - с фосфатной группировкой адениновой рибозы НАДФ-Hj.

Особый интерес представляет и механизм аллостерического ингиби-рования активности гомосериндегидрогеназ высокими концентрациями треонина в клетке. Ключом в поиске регуляторных участков ферментоЕ послужили аминокислотные последовательности энтеробактерий. У Е. col i и S. imrcescens ГД I и 11 кодируются дистальными цистронами бифункциональных генов. Белки, кодируемые генами fchrA, являются бифункциональными и, кроме гомосериндегидрогеназной, имеют и аспартаткиназную активность. В работе Козна показано, что обработка химотрипсином бифункционального комплекса АК1-ГД1 Е. coli приводила к инактивации аспартаткиназной активности, при этом гомосе-риндегидрогеназная активность сохранялась и не ингибировалась треонином. При выравнивании известных аминокислотных последовательностей гомосериндегидрогеназ было отмечено, что ферменты энтеробактерий лишены 100-110 С-концевых аминокислотных остатков в сравнении с монофункциональными ферментами других бактерий (рис.7). Мы предположили, что функциональный домен, ответственный за аллосте-рическое ингибирование АК1-ГД1 энтеробактерий, расположен вне

.последовательности ГД, а у монофункциональных ферментов он расположен в добавочной С-концевой части. Аминокислотные остатки С-конца гомосериндегидрогеназ В. subtilis, С. glutamicum и M. flagellatum имеют высокую гомологию и хорошо выравниваются относительно друг друга. Более консервативной является центральная область, в которой можно определить характерный для всех трех ферментов участок. Он состоит из четырех последовательно расположенных гидрофобных аминокислот, полярного треонина, положительно заряженного гистидина и, с интервалом в три аминокислотных остатка, отрицательно заряженной глютаминовой кислоты. Сходные участки мы локализовали и в центральной части аминокислотных последовательностей АК1-ГД1 Е. coli и S. marcescens. Ниже представлены предполагаемые участки последовательностей известных ферментов, участвующих в регуляции активности.

* : : : : * *

ГД в. subtil is (391) A E - - I V I V T H h T S E a D

ГД м. flagellatum (396) A D - - I I I L Г H v T a E k n

ГД с. glutamicum (406) A R - - L I V V T H t-J a 1 E s D

AKI- ГД1 Е. coli (342) A R i s V V L I T Q S S r* J3 E Y S

AKI- ГД1 S. marcescens (342) A g i s V V L I T Q S S f Л E Y О О

7\_ Олигонаправленный мутагенез гена Уют с целью получения формы гомосериндегидрогеназы со снятым ретроингибированием.

При изменении теоретически предсказанного участка, участвующего в регуляции активности ГД М. flagellatum, следовали принципу, что замена должна приводить к изменению заряда аминокислотного остатка. Используя 28-членный олигонуклеотид с одной стабильной и одной вырожденной заменой и методологию ПСР, были получены две мутантные формы гена ГД. В ГДМ гидрофобный лейцин L-401 заменен на положительно заряженный аргинин (R), в ГДЬ2 введена дополнительная замена: полярный треониновый остаток 402 заменен на гидрофобный изо-лейцин (I). Конструкции с мутантными генами horn-ml и horn-пй переводили в штамм Е. coli GIF102, лишенный активностей ГД1 и II. Результаты измерений активностей в клеточных лизатах показали, что оба гена кодируют ГД, нечувствительную к ингибированию треонином. Таким образом, мы получили экспериментальное подтверждение локализации участка аллостерического ингибирования треонином у гомосериндегидрогеназ в описанной выше С-концевой области. Мы предполагаем, что небольшие по размерам нс-полярные четыре аминокислотных остатка формируют гидрофобную область для взаимодействия фермента с молекулой треонина. Внедрение положительно заряженной гуанидино-вой группировки аргинина в этот участок полипептидной цепи приво-

дит к изменению участка связывания, и молекула треонина не може1 взаимодействовать с ферментом.

8. Сравнение аминокислотных последовательностей треонинсинтаз (ТС Известны нуклеотидные последовательности треонинсинтаз пяти мик роорганизмов: S. œrevisiae, Е. coli, S. marcescens, В. subtilis : В. lactofern&ntum. Сравнение аминокислотных последовательносте. показало высокую степень гомологии этих белков (рис.8). Существуе' предположение, что ТС, сериндегидратаза и треониндегидратаза имею общего эволюционного предшественника, который являлся пиридоксаль-фосфат-зависимым ферментным комплексом и обладал тремя активностя ми. Если принять эту точку зрения и допустить, что в процессе эво люции происходит формирование трех отдельных ферментов с узко] специализацией, то аминокислотная последовательность современны ферментов может служить определенным показателем степени дивергенции микроорганизмов от общего предшественника. Анализ показал, чт(

известных треонинсинтаз.

треонинсинтазы грамотрицательных бактерий и эукариота, в отличи« от грамположительных бактерий, имеют добавочные И-концевые 48 - 55 аминокислот. Наиболее высокая степень гомологии была обнаружена 2 представителей энтеробактерий - 87% (рис.10), грамположительных микроорганизмы имели также высокий показатель - 77. 3%, несмотря не то, что они представляют отдаленные таксономические группы. Гра-мотрицательные бактерии имели большую степень гомологии с дрожжами, чем с грамположительными, более того, треонинсинтазы метилот-рофной бактерии и дрожжей оказались наиболее гомологичными.

Облигатные метилотрофные бактерии являются уникальным объектом I

икробиологии. До настоящего времени нет их общепринятой классифи-ации, и обсуждается вопрос, являются ли они таксономически обособ енной группой. Нет однозначного ответа, была ли способность ути-изировать С-1 соединения приобретена единожды в ходе эволюции или озникала и утрачивалась неоднократно? Среди метилотрофных бакте-ий только в группе аэробных грамотрицательных эубактерий обнару-ены формы, облигатно использующие одноуглеродные соединения в РМФ ути, и маловероятно, что такие микроорганизмы будут обнаружены реди грамположительных эубактерий и, тем более, среди архебакте-ий или эукариот. Немногочисленные представители облигатных мети-отрофов по биохимическим, морфологическим и цитологическим приз-акам представляют обособленную группу прокариот. Кроме того, дан-ые сравнения нуклеотидных последовательностей 5S и 16S рРНК поз-оляют утверждать, что эта группа занимает отдаленное филогенети-еское положение от метанокисляющих бактерий и, тем более, от классических" факультативных метилотрофов с сериновым или рибуло-омонофосфатным циклом ассимиляции формальдегида. Таким образом, □лее вероятным следует считать независимое формирование ветви об-игатных метилотрофов в эволюции метилотрофных бактерий. Для отве-а на вопрос, кто мог являться их предшественниками, необходима эполнительная информация, и, возможно, в дальнейшем сравнение минокислотных последовательностей треонинсинтаз, наряду с такими ревними белками, как ферредоксины и полимеразы нуклеиновых кислот, эможет выяснить эволюционный путь этой группы. Нет сомнений, что лвергенция грамотрицательных и грамположительных бактерий прои-эшла на ранних этапах эволюции. Наши данные по сравнению амино-яслотных последовательностей треонинсинтаз согласуются с этим по-эжением. Более высокая гомология ТС M. flagellatum с дрожжевой чем ферментами бактерий ставит перед нами ряд вопросов и требует до-злнительных исследований. На рис. 11 отображена схема преобразова-

.. 5. cerevisiae

63. 5%

фи доке ал ы^сфат-зависимый лльтиферментннй комплекс ..

... M. flagellatum

........ Энтеробактерии 87%

... Грамположительные бактерии 73. 3Z

1с. 11 Изменение аминокислотных последовательностей треонинсинтаз в эволюции микроорганизмов.

(По данным сравнения первичных последовательностей треонинсинтаз шести микроорганизмов.)

ний предполагаемого ферментативного комплекса в эволюции микроор ганизмов.

Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена thrE Комплементационный анализ позволил локализовать ген thrB М. Па gellatum на Sau3A фрагменте ДНК, размером 1200 нп (рис.1). Вставк беспромоторного гена cat по уникальному сайту рестрикции XhoI поз волила определить направление транскрипции thrB гена, экспрессиру ющегося в клетках E.coli со своего промоторного участка. На рис.1 представлена подробная физическая карта этого фрагмента ДНК отображена стратегия определения нуклеотидной последовательности.

SouJA EccRV Sou3A Sou ЗА Ehel Eco72l PoeL Ehel OH ColSt

Poel Xhd EcoRV PaelBamHI

PTHR10 I 1 11 ■ I ■ -L

!=£>-----

100нп ,

. Рис. 12 Рестрющионная карга Сегмента ДНК IL flagellation с геном thrB и стратегия определения нуклеотидной последовательности.

9.1 Анализ структурной части гена thrB.

Обшдя длина клонированного участка ДНК M. flagellatum с геном thr составила 1230 нп (рис.13). Обнаружена единственная opcl стоп-кодоном ТАА в положении 1185, способная кодировать протяжен ный полипептид. Если допустить, что инициирующий формилметиони кодируется триплетами ATG или GTG, то наиболее вероятным стартовы кодоном, определяющим размер полипептида в соответствии с данным макси-клеток (рис.2), является кодон ATG в положении 639. Пере ним за 5 нп находится SD-последовательность - AAGG, и масса пред полагаемого полипептида составит 20. 740кД. Однако эксперименты п субклонированию фрагментов ДНК, образованных в результате направ ленных (5'-3') делеций от EfcoRV сайта (166, рис.13), дали основа ние считать инициирующим кодоном необычный триплет TTG в положени 186. На расстоянии 6 нп перед ним расположена "сильная" SD-после довательность AAGGAG, имеющая шесть совпадающих нуклеотидов с ка ионической последовательностью прокариот. Таким образом, разме структурной части гена гомосеринкиназы составляет 1002 нп, и о кодирует полипептид в 333 аминокислоты с молекулярной массо 37. 095 кД. По-видимому, трансляция мРНК с кодона UUG и определяе очень низкий уровень экспрессии гена в клетках К coli, достаточ ный лишь для комплементации мутации. В системе макси-клеток мы н

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Sau3A EcoRV SD fM T S S Q 5

tcgggaaecCTttagtggq^aattrttaactgcctt^

199 209 219 229 2$9 " 249 259 269 279 289

PSQVFQKFSMSVFTTVSFEQMQQWLKGYDLGEL38 ААОТТССГЛШГТТТТС^ииШТГТСТАТСТаШАТТ^^

298 308 318 328 338 348 358 368 378 388

LDLQGIASGITNTNYFVTTDNGRYVLTLFEEHS71 TGCnTGACCTGCAAGGGATOfflGTCAGGCATCU^

397 407 417 427 437 447 457 467 477 487

AEELPNFLDLMTHLAERG I PCPHPVKNNAGRAL 104 CTGCGGAAeASITroraUUTmCT^

496 506 516 526 536 546 556 566 576 586

GELNGKPAALVSCLAGRSLDNPMPQHCAA I GEV 137 TGGGCXIAGCTGAACEGCAAGODDGCDGCCCTCGT

595 605 615 625 635 645 655 665 675 685

LARMHIAGASFKAGMSNLRGQEWRIATAAKVAP 170 TGCTTGGCSCSCATGCATAnSCAGGGGCATCATTCAAGBC^eeC^TGAaCAAOCT

694 704 714 724 734 744 754 764 774 784 I

FLDEENHRMLDAQLEFERTFDTRRLPRGVIHAD 203

(лиалешавлБшимосла^АШЛвБю^

793 803 813 823 833 843 853 863 873 883

LFRDNVLMDGDKVGGV I DFYY ACHDALLYD I A I 236 ACCrraTTCS3BACAACGTGCTGATGGACBGIE^

892 902 912 922 932 942 952 962 972 982

AVNDWCVNADCTLDAVRVRAFLDAYHA I RPLTG 269 TTGCEmBAADBACTBGreCEreAATettE^^

991 1001 1011 1021 1031 1041 1051 1061 1071 1081

EEHAAWPGMLRVAAMRFCVSRLNDLYFPQAGEL 302 (ЮБААБАвецтаосяалБвотевац:^^

1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180

THAKDPAYFERILKHSIAAREQILAVWVNAH* 333 ТБАСЕКАТВССААБ6АТ(Х£ВСС7ГАТТТСБАОС^

1189 1199 1209 1219 1229

ctctctatgtctggctatcacateaatatgocBBcecc^B8

Рис. 13 Нуклеотндная последовательность фрагмента хромосомы к. flaeellatua с геном СЛгВ.

Аминокислотная последовательность приведена в однобуквенном коде. Последовательности -10 и -35 предполагаемого промотора обведены рамкой. Указаны рестрикционные сайты, использованные в работе (пояснения в тексте). Последовательность Шайна-Дальгарно (SD) подчеркнута.

обнаружили кодируемого белка соответствующего размера. Можно предположить, что в клетках Е. coli (возможно и в М. flagellatum) происходит дополнительная трансляция мРНК с инициирующего кодона AUG(639). В литературе описаны аналогичные случаи "ложной" трансляции мРНК. Механизм инициации белкового синтеза на кодоне UUG до конца не ясен, и, по данным на 1990 г. , известно только 10 таких генов. Предполагается, что в кодон-антикодоновом взаимодействии с мРНК участвует Т-петля тРНКГ, а не антикодоновая А-петля как при обычной инициации трансляции с AUG или GUG кодонов. Десять известных генов вместе с UUG нуклеотидами имели от 4 до 6 нуклеотидов комплементарных Т-петле (3'-UAAAC7T-5') тРНКГ. В гене thrB М. flagellatum нуклеотид А, следующий за триплетом UUG (рис.13), также может участвовать в спаривании с Т-петлей.

9. 2 Анализ 5'-концевого участка гена thrB.

Субклонирование гена гомосеринкиназы с различными по размерам 5'-концевыми участками позволили локализовать промоторную последовательность в прилегающих к TTG кодону 160 нп. Наиболее вероятный промотором гена следует считать последовательность 13-ТТТТСА-18 (-35 блок) и 35-ТТАААТ-40 (блок Прибнова). Блоки разделены между собой 16 нп и имеют по 4 совпадающих нуклеотида с каноническим промотором, узнаваемым о-70 субъединицей РНК-полимеразы Е. coli. I 36 нп перед инициирующим кодоном TTG обнаружена протяженная па-линдромная последовательность (рис.13). Мы предполагаем, что этот участок может выполнять роль операторной последовательности, контролирующей уровень транскрипции гена

10. Сравнение аминокислотных последовательностей гомосеринкиназ.

Известны аминокислотные последовательности гомосеринкиназ сему микроорганизмов: E.coli, S. marcescens, Calothrix sp.PCC, B.subti-lis, B. lactofermentum, C. glutamicum и S. cerevisiae. Несмотря he отдаленное таксономическое положение, их ферменты имеют высокук степень гомологии. В наиболее консервативных участках обнаруженс совпадение до 12 аминокислотных остатков, и такие области равномерно распределены по всей длине последовательностей. Нам не удалось обнаружить аналогичные участки в гомосеринкиназе М. flagellatum. Сравнение с аминокислотными последовательностями известных не сегодняшний день полипептидов выявило некоторую гомологию с ферментами, относящимися к группе протеинкиназ. Таким образом, можнс предположить, что гомосеринкиназа метилотрофа представляет инук эволюционную группу киназ, неизвестных до настоящего времени.

10. Конструирование искусственной оперонной структуры с генами thrB, horn, thrC.

Природная организация генов биосинтеза треонина у М. flagellatum не обеспечивает их высокий уровень экспрессии. Во-первых, эксперименты по изучению промоторной области оперона позволяют отнести данный промотор к разряду "слабых". Во-вторых, перед геном thrC. не обнаружена SD-последовательность, а перед геном horn она имеет только три- нуклеотида, комплементарных 3'-концевому участку 16S-pPHK. Необычно структурированные межгенные области предполагают наличие регуляторных механизмов в экспрессии thrC и thrB генов. Кроме того, ген horn кодирует гомосериндегидрогеназу, чувствительную к превышающим "норму" концентрациям треонина в клетке. Используя методы генетической инженерии, мы сконструировали искусственную оперонную систему с тремя генами биосинтеза треонина -thrB,hom-rr2,thrC. На рис.14 представлена схема конструирования оперона и приведена нуклеотидная последовательность межгенных участков. Преимущества в выражении генов искусственного оперона заключаются в следующем: 1) гены транскрибируются с "сильного" 1ас-промотора, расположенного в 115 нп от первого гена, и для подбора оптимальных условий экспрессии можно контролировать уровень транскрипции оперона. lac-промотор может быть заменен на любую другую регуляторную последовательность; 2) все гены оперона имеют "сильные" последовательности Шайна-Дальгарно; 3) в опероне отсутствуют структурированные межгенные последовательности; 4) стоп-ко-дон гена гомосериндегидрогеназы . перекрывается стартовым кодоном гена треонинсинтазы. Такая структура имеет преимущества при трансляции полицистронной мРНК; 5) орсХ, расположенная непосредственно за thrC геном, образует трансляционное слияние с lacZ' геном вектора. Эта система позволяет определять эффективность экспрессии всего оперона; 6) ген гомосериндегидрогеназы заменен на мутантный ген Лот-т2, кодирующий фермент, нечувствительный к ретроингибированию.

Pael

mh2

ATG Ьектсра pNGM130K

Muni

0pu11O2l TAA

" pMUN130

"Hindlll " ^ — ' '

Plac

Bpui 1021 ,кл«нои-Hindiii .КленоЬ+Hindlll (большие wq^irn)^?*^ (меньший фрагмент) _

"""TG А

7Клонирс6оние МиЫфрагменпа r \fci*i/Huni

Po«i _ с геном tftrC/V по ЬЛЮаоту 0-,1О7|1 Plaç

. „ Клониробание CecRi-Ncd фрагмента

Pkie с геном thrB по EeoPI-Sm« рН4Т4-130

homhS

pHDh3TS19 ~„oa/ÄOI 7atg/tga

thrCIV

TGA

PI oc

fM thrB * AAGGAGaggggcTTG/ACC/= ==ta SD1

[лтс/тОА

thrCIV TGA

EeoRI/Munl

fM hom-m2

tcccatggGGAGagaacctgaATG/° SD2

L T(S) R(R) +G +T +A

CTG/ACT/AGA/GG T/AC C/GCA/tga thrCIV

ATG/AGA/TAT= =

' tga

ro

Pur" 11 №na кпиптинтиина уртпчтвпппт гаюпою г» рвпяии t hrfl hna thrf!

ВЫВОДЫ.

1. Клонированы четыре гена биосинтеза треонина облигатной мети-потрофной бактерии М. flagellatum В отличие от энтеробактерий, только гены hom и thrC сцеплены на хромосоме. Гены ask и fchrB расположены в других участках генома.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомы с генами hom, fcbrC и fchrB.

3. Показана оперонная организация генов hom и thrC.

4. Выявлен участок связывания с коферментами в аминокислотной тоследовательности гомосериндегидрогеназы. Предложена модель взаимодействия фермента с кофакторами НАД-Н2и НАДФ-Н,.

5. Локализован участок аллостерического ингибирования треонином з аминокислотных последовательностях известных гомосериндегидроге-1аз. Получена форма гена hcw-ml(m2), кодирующая фермент, не-}увствительный к ретроингибированию.

6. Показана возможность использования аминокислотных последова-'ельностей треонинсинтаз в оценке филогенетических взаимоотноше-1ий микроорганизмов.

7. Сравнение аминокислотных последовательностей гомосеринкиназ юзволяет отнести фермент М. flagellatum к обособленной группе ки-1аз, неизвестных до настоящего времени.

8. Сконструирована искусственная оперонная структура с генами :ЬгВ, hom, thrC, отвечаюнря требованиям высокоэффективной 1Кспрессионной системы.

9. Сконструирован ряд векторных плазмид широкого круга хозяев.

ШСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

. S. Y. Shilova, G.N. Marchenko, A. Y. Chistoserdov, Y. D. Tsygankov. Threonine biosynthesis in Methylobacillus flagellatum: regulation and genes cloning. Abstr. of 6th Intern. Symposium on Microbial Growth on CI Compounds. Gottingen, 1989, pp. 447.

. Y. D. Tsygankov, M. V. Gomelsky, G.N. Marchenko, I. G. Serebri jski. Genetics of methylotrophs. In: Proceedings 6th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Strasbourg, 1990, pp. 645-656.

i. G. N. Marchenko, Y. D. Tsygankov. Genes for threonine biosynthesis in Methylobacillus flagellatum. Abstr. of 7th Intern. Symposium on Microbial Growth on CI Compounds. Warwick, 1992,