Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности окислительного метаболизма облигатной метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum кт

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности окислительного метаболизма облигатной метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum кт"

^Гс&КоА&ИЙ УНИВЕРСИТЕТ им.ЛОМОНОСОВА

2 9 МАЙ ЦЩЮГИЧЕСКИЙ факультет

На правах рукописи УДК 576 . 8; 577 . 158

ДИНАРИЕВА Татьяна Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА ОБЛИГАТНОЙ МЕТИЛОТРОФНОЙ БАКТЕРИИ

Methylobacillus flagellatwn кт

Специальность: 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1995 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

A.И. Нетрусов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B.К. Плакунов

кандидат биологических наук, В.Ю. Арцатбанов

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино).

-ап

Защита состоится " 15 " июня 1995 г. в 15 часов на заседании специализированного совета Д 053-05.66 в Московском университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 15 мая 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время метилотрофы все больше привлекают внимание как потенциальные продуценты практически важных физиологических-активных веществ - аминокислот, витаминов, полисахаридов, витаминов, цитохрома с и некоторых ферментов. Широкая субстратная специфичность метанолдегидрогеназы позволяет использовать ^мобилизованные клетки метилотрофных бактерий для промышленных 5иотрансформаций. Очевидно, что индустриальному применению должно предшествовать всестороннее изучение штаммов-продуцентов, в том числе доследование их окислительного метаболизма и его регуляции. В тоследнее время усилия ученых были сосредоточены, главным образом, на 1зучении ферментов первичного окисления С^-соединений и механизмах их ззаимодейбтвия с физиологическими акцепторами электронов. Напротив, зтроенин терминального участка дыхательной цепи метилотрофных 5актерий и влиянию условий культивирования на характер его функционирования в современной литературе уделено мало внимания. Объектом настоящей работы служил облигатный метилотроф ¡еЩ1оЪасШиз е1Шт КТ, который рекомедован для промышленного ^пользования как продуцент ряда аминокислот, витаминов, а также ^терологичных белков. В последние годы успешно ведутся работы по [зучению генетики первичного окисления Ы.?1сще1Шт КТ (^-соединений [ синтеза клетками целого ряда аминокислот. На основе этого штамма '.конструирована эффективная векторная система для внедрения и кспрессии чужеродных генов. В то же время практически ничего не звестно о природе и составе компонентов дыхательной цепи '.ркщеИсЛт КТ, о влиянии внешних факторов на их синтез и ктивность. Желание восполнить этот пробел во многом определило цель астоящей работы.

ель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование собенностей окислительного метаболизма облигатной метилотрофной актерии КТ в разных условиях выращивания.

Для осуществления поставлено!! цели решали следующие задачи:

- изучение строения метанолоксидазной системы и ее регуляции в условиях периодического и непрерывного культивирования;

- изучение процесса трансформации клетками 1,2-пропандиола в лактат;

- изучение строения метиламиноксидазной системы;

- исследование строения терминального участка дыхательной- цепи в зависимости от условий культивирования;

- кинетический анализ реассоциации СО с оксидазами. .

Научная новизна работы. Впервые у облигатного метилотрофа изучена регуляция синтеза компонентов ЭТЦ концентрацией метанола в среде. Впервые установлено, что синтез азурина регулируется координирований с метанолдешдрогеназой (МДГ) дерепрессией при низкой концентрации метанола в среде. Впервые у облигатного метилотрофа, не утилизирующего метан", обнаружена разветвленная дыхательная цепь с двумя терминальными оксидазами. Впервые обнаружена метилотрофная бактерия с двумя цитохром-с-оксидазами о-типа в. дыхательной цепи. Впервые у метилотрофной бактерии проведен кинетический анализ оптических изменений, индуцированных лазерным флвш-фотолизоы СО-комплексов восстановленных мембранных белков.

"Практическая значимость работы. Данные, получение в работе, дополняю! сведения по энергетике одноуглеродного метаболизма в целом. Результаты исследований могут служить основой для направленной культивирования облигатного метилотрофа, рекомендованного дл; промышленного применения, а также для разработки способов улучшенш его ростовых характеристик. Данные по конверсии 1,2-пропандиола I лактат могут быть использованы для промышленной биотрансформацш спиртов иммобилизованными клетками облигатных метилотрофов с целы получения органических кислот.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 6-ом I

7-ом международных симпозиумах ".Микробный рост на С1-соединениях1

(Геттинген, Германия, 1989; Варвик, Великобритания, 1992), 7-о1 2

Европейской конференции по биоэнергетике (Хельсинки, Финляндия, 1992), 22-ой встрече Федераций европейских биохимических обществ (Стокгольм, Швеция, 1993) и на заседании кафедры микробиологии биологического факультета МГУ (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы (181 наименований), содержит 30 рисунков и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ "

В работе использовали штамм облигатного метилотрофа, описанный ранее (Говорухина и др., 1987; Клецова и др., 1987). Культуру выращивали на минеральной среде с метиламином или метанолом при 37°.

МДГ очищали в две стадии: ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацией на Superóse í. Молочную кислоту определяли ензимагическим методом с лактатдегидрогеназой. 1,2-Пропандиол определяли спектрофотометрически по количеству образовавшегося формальдегида (Nash, 1953) при восстановлении спиртом периодата натрия. Спектры поглощения растворимых-и мембранных фракций записывали, используя регистрирующий двухлучевой спектрофотометр. Скорости поглощения кислорода клетками и мембранами измеряли полярографическим методом при 42°. Кинетические константы определяли по начальным скоростям реакций методом двойных обратных координат. Фотовозбуждение СО-комплексов цитохромов осуществляли с помощью неодимового лазера при комнатной температуре. Накопление и обработку данных проводили по пакету программ, разработанных к.б.н. АХ Драчевым (Ин-т физико-химической биологии им. Белозерского). Кинетические кривые были представлены в виде суммы нескольких экспонент со значениями т (t^e) при помощи программы DISCRETE (Provencher, 1976).

з

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСЩШЕ 1. Окисление метанола у М./Ще1Шт КТ

1.1. Очистка и свойства метанодцегидрогеназы из И./.ЩеЛаШ КТ

Метанолдегидрогеназа (МДГ) представляет собой начальное звено в системе окисления метанола у метилотрофов. Фермент был очищен в 4 раза из периплазматической фракции И^ЩеХШт КТ с выходом 41$. Данные электрофореза в денатурирующих условиях и изоелектрофокусирования свидетельствуют о гомогенности полученного препарата. Изучение ряда физико-химических свойств очищенного фермента показало, что МДГ М.ДсщеТШит КТ имеет относительную мол. массу нативного фермента - 120 кДа, мол/ массу а-субъединицы - 54 кДа, высокую изоточку (8,4) и высокий оптимум рН в присутствии ФМС (9,5). Таюш образом, изучаемый метилотроф содержит "классическую" МДГ, характерную.для грамотрицательных бактерий.

1.2. Переносчики электронов у M.flagellatm КТ

Спектральный анализ выявил присутствие растворимых щтохромов с у ¡¡..flagellatm КТ. Растворимые цитохромы с делили анионообменной хроматографией на две фракции, очевидно, соответствующие цитохромам с^ и Сц других метилотрофных бактерий. В дополнение к • растворимым цитохромам с клетки ранней логарифмической фазы из среды с метанолом содержали голубой белок типа азурина.

Разностные спектры мембран M.flagellatm КТ обнаружили цитохромы с- и Ь-типа (рис. 1). Минимум поглощения при 432 нм в области у-полосы на СО-разностном спектре является характеристикой цитохрома о, возможно, обладающего оксидазной функцией. Приведений спектральный профиль не зависел от возраста клеток и субстрата культивирования M.flagellatm КТ. Исследование пиридиновых производных гемохромогенов не выявило присутствия гемов А и Б в мембранах M.flagellatm КТ.

416 427

-1- |---1-1

400 500 600 700

Длина волны, км

Рис. 1. Спектральная характеристика' мембран M-./lngcllatm КТ из выращенных в присутствии метанола клеток. Разностный (—) и СО-разностный (—-) спектры поглощения.

1.3. Влияние скорости роста культуры на метанолоксидазную систему

Влияние скорости роста на активность и синтез метанолоксидазной системы изучали у M.flagellatw КТ, выращенной1 при фиксированных значениях (1 0,15 и 0,55 ч в лимитированной метанолом культуре. Результаты исследований представлены в таблице 1.

' Ранее было показано, что синтез МДГ изучаемого метилотрофа регулируется дерепреесией при низких скоростях роста в лимитированной метанолом культуре (Chistoserdova et al.r 1991). Наши "данные подтверждают это наблюдение (табл. 1). Однако скорость поглощения кислорода целыми клетками' M.flagellatw КТ в присутствии метанола не коррелировала с изменением ферментативной активности МДГ. Отсюда следует, что МДГ не является лимитирующим звеном в аэробной цепи окисления метанола у tt.flagella.tm. КТ. Аналогичное- наблюдение было сделано ранее для МДГ MethylopMlus methylotrophus (Greenwood а.

Jones, 1986). Уровень растворимых и мембранных цитохромов с, как и в случае МДГ, снижался с увеличением скорости разбавления культуры. Клетки о низкой скорость роста содержали дополнительный переносчик электронов - азурин. Регуляция синтеза азурнна координирований с МДГ свидетельствует о его принадлежности метанолоксидазной системе M.flagellatwn KT.

Таблица '1

Влияние скорости роста на метанолоксидазную систему M.flagellatm KT

Характеристика

¡1=0,15 ч

■1

Д=0,55 ч

-1

Скорость окисления клетками метанола -1 —1

(нмоль 02' мин *мг бежа) ■

Активность МДГ -в растворимых фракциях -1 -1

фракциях (нмоль-шн >мг белка)

Количество мембранного цитохрома с (шоль-мг-1. белка)

Количество растворимого цитохрома с (пмоль-мг""' белка)

Количество азурина (пмоль'мг-1 белка)

331.8

166.9 214,0 470,6

46,9

292.7 18,9

154.8 123,3

0,0

2. Трансформация 1,2-пропандиола в молочную кислоту покоящимися. клетками М./ЩеПсйш КТ

Очищенная МДГ не окисляла 1,2-пропандиол, однако клетки

обнаружили дыхательную активность в присутствии етого опирта.

По-видимому, исследуемый метилотроф содержит в периплазме

регуляторный М-белок, повышающий сродство МДГ к 1,2-пропандиолу.

М./Ще1Шт КТ, в отличие от розовых факультативных метилотрофов,

не способен использовать 1,2-пропандиол в качестве ростового

субстрата. Бозможно, это связано с отсутствием у него

а-кетоглутаратдегидрогеназы, участвующей в ассимиляции этого спирта.

Энзиматическим методом было установлено, что продуктом окисления б

I,2-пропандиола является екскретируемая клетками №.{1(ще11аХт КТ молочная кислота. По всей видимости, эта конверсия идет с промежуточным образованием лактальдегида, последующее превращение которого в лактат может осуществлять альдегиддегидрогеназа, обнаруженная в'периплазме у данного метилотрофа (СМвТювеМоуа е!

II., 1991)-. Динамика накопления лактата при инкубации покоящихся

меток М./ЩеЪШит КТ в присутствии 1,2-пропандиола приведена на

-1 -1

же. 2. Значение У„.„п для этого процесса составляло 3 ммоль-ч • г мзке

5елка. Такая биотрансформация демонстрирует возможность получения

органических кислот, используя широкую субстратную специфичность МДГ I дефекты в метаболических путях у облигатных метилотрофов.

Рис. 2. .Динамика потребления 1,2-пропандиола и образования молочной кислоты покоящимися клетками М./Ще1Шт КТ из среды с метанолом. Концентрация бежа в инкубационной среде составляла 1,7 мг/мл. Уровни 1,2-пропандиола (□) и молочной киелоты (Д).

3. Окисление метиламина-у M.flagellatvm КТ

При культивировании M .flagellation КТ на среде с метиламином в растворимых фракциях индуцировался синтез амицианина. В отличие от штамма 4025 и M.extorquons АМ1, изучаемый метилотроф способен синтезировать этот белок при выращивании его на среде с низким содержанием меди (CuSO^ SH^O <0,1 мг-л""'). Максимум поглощения при 620 им на абсолютном спектре принадлежит окисленной форме амицианина (рис. 3). Восстановление цитохрома с в присутствии- метиламина, -в растворимой фракции, содержащей метиламиндегидрогеназу (МАДГ) и амицианин, свидетельствует в пользу того, что последний является медиатором транспорта электронов между МАДГ и цитохромом с. .

4. Ингибиторный анализ оксидазной активности мембран

Для изучения строения терминального участка дыхательной • цепи M.fïugellatum КТ проводили ингибиторный анализ оксидазной активности мембран, выделенных из выращенных в разных условиях клеток. В качестве доноров электронов использовали восстановленные аскорбатом ТМФД, ДАД (дпаминодурол) и цитохром с сердца лошади.

Кинетические, характеристики оксидазной активности мембран из выращенных в присутствии метиламина клеток приведены в таблице 2.

Кинетические константы оксидазной активности мембранных фракций М.]1ще11аит КТ -из клеток конца логарифмической фазы роста, выращенных на среде с метиламином

Таблица

о

Г-

Субстрат

макс

(мкмоль Оумин-мг бел.)

V,

аскорбат/ТМФД аскорбат/ДАД

0,46 ± 0,10 0,59 + 0,16

0,52 ± 0,09 0,15 ± 0,01

1 1

500 600 700

Длина волны, нм

Рис. 3. Абсолютные спектры поглощения растворимой фракции М./1сще1Шт КТ из клеток ранней логарифмической фазы роста, выращенных в присутствии метиламина. Окисленный, феррицианидом (■—) и восстановленный метиламином (—) образец.

Кинетики подавления цианидом оксидазной активности были монофазными со .значениями К^ 1,2 и 4,5 мкМ при окислении восстановленных ТМФД и ДАД соответственно (рис. 4). В обоих случаях ингибирование протекало по неконкурентному механизму (рис. 5 и 6). Такой тип торможений характеризует перенос электронов через оксидазу о-типа (Dawson а. Jones, 1981 b). Таким образом, данные ингибиторного анализа свидетельствуют в пользу функционирования двух оксидаз о-типа у M.flagellatwn KT, что находится в согласии со спектральной характеристикой мембран (рис., 1). Впоследствии, мы будем обозначать более чувствительную к CJT оксидазу (К{=1,2 mkM^I цитохромом о, а менее чувствительную (К{=4,5 мкМ) - цитохромом о'. При выращивании M.flagellatwn KT на среде с метиламином кинетические константы оксидазной активности мембран не зависели от возраста культуры. При этом 'электроны от аскорбата/ТМФД поступали к кислороду через цитохромом о, а от аскорбата/ДАД - через цитохромом о'.

12 г

-4

[ON !, мкМ

Рис. 4.• Подавлением цианидом оксидазной активности мембран и^ЩеХШт КТ из клеток конца логарифмической фазы роста, выращенных в присутствии метиламина. В качестве субстратов использовали восстановленные аскорбатом ТМФД (□ ) и ДАД (А ). ¡0

2

1/1ТМФД], мМ"1

Рис. 5. Влияние цианида на окибление восстановленного ТМФД мембранами U.flagellatm KT из клеток конца логарифмической фазы роста, выращенных в присутствии метиламина. Концентрация белка в пробах составляла 0,64 мг/мл. KON, mkM:q- 0;д- 0,5; О- 2,0.

1/ШД], мМ~1

Рис. б. Влияние цианида на окисление восстановленного ДАД ■мембранами U.flagellatvm KT из клеток конца логарифмической фазы роста, выращенных в присутствии метиламина. Концентрация белка t в пробах составляла 0,74'мг/мл. KCN, mkM:d- 0;д- 2,5; 0- 5,0.

Рассмотрим теперь условия когда субстратом культивирования является метанол (табл. 3 и 4). В этом случае фаза роста клеток не оказывала влияния на сродство мембран к восстановленным ТМФД и ДАД, тогда как скорость их окисления возросла в 4-5 раз при переходе культуры от начала логарифмической к стационарной фазе роста. Такая активация сопровождалась падением чувствительности к цианиду оксидазной активности в присутствии аскорбата/ТМФД. Отсюда можно заключить, что в молодых клетках из среды с метанолом окисление этого субстрата шло через цитохромом о, а в клетках стационарной фазы роста - через индуцирующийся в этих условиях цитохром о*. Напротив, из постоянных значений К{ для цианида при окислении мембранами аскорбата/ДАД в клетках и.ркщеИсЛт КТ из сред с метанолом и метиламином следует, что электроны от этого субстрата поступают к кислороду только через оксидазу о'. Поэтому скорость поглощения кислорода мембранами- в присутствии восстановленного ДАД характеризует цитохром о'-оксидазную активность.

Из приведенных данных создается впечатление, что в клетках стационарной фазы роста из среды 'с метанолом происходит замена оксидазы о на оксидазу о1. Основным фактором, ее индуцирующим, по всей видимости, является недостаток кислорода в среде, вызванный накоплением биомассы в условиях стационарной фазы роста. В этой связи следует отметить повышение в три раза максимальной оптической плотности культуры при использовании КТ метанола вместо

метиламина в качестве ростового субстрата.

В условиях лимитирования роста метанолом (избытка по кислороду).

—1

увеличение скорости разбавления культуры от 0,15 до 0,55 ч не

оказывало существенного влияния на кинетические характеристики

окисления препаратами мембран восстановленных ТМФД и ДАД (табл.3

и 4). Поглощение 02 мембранами в присутствии аскорбата/ТМФД

подавлялось низкими концентрациями цианида и шло через оксидазу о.

Напротив, окисление аскорбата/ДАД, как и следовало ожидать,.

осуществлялось цитохромом о'. Таким образом, концентрация-метанола в.

среде не является регуляторным фактором для оксидазной 'активности

- М^ЩеНагт КТ. 12

Таблица 3

Кинетические параметры окисления аскорбата/ТМФД мембранами . из выращенной в присутствии метанола М^ЩеЪШит КТ

Условия роста

К„

макс

К

{, Ш

(ММ) (мкмоль 02/мин-мг бел.) (мкМ)

периодическое культура: начало логарифмической фазы

стационарная фаза Лимит по метанолу: ¡1=0,15 ч"7"1 Д=0,55 ч~1

0,99 ± 0,13 0,90 ± 0,08

0,82 ± 0,15 0,90 +■ 0,12

0,75 ± 0,09

3,62 ± 0,36

0,23 ± 0,03 0,34 ± 0,04

1,2

4,5

1,1

1,1

Примечание: даны средние значения из трех: независимых выращиваний

Таблица 4

Кинетические параметры окисления аскорбата/ДАД мембранами из выращенной в присутствии метанола ti.flage11o.tm КТ

Условия культивирования К^ \ако КО

(ММ) (мкмоль 05/мин«мг бел.) (мкМ)

Периодическая культура:

начало логарифмической 0,56 ± 0,13 0,18 ± 0,02 5,0

фазы

стационарная фаза 0*63 + 0,14 0,77 ± 0,15 4,5

Лимит по метанолу:

¡1=0,15 ч~1 0,60 ± 0/17 0,16 ± 0,03 5,0

¡1=0,55 ч~1 0,56 ± 0,13 0,18 ± 0,03 4,5

Примечание: даны средние значения из трех независимых выращиваний

Обращают на себя внимание близкие уровни цитохрома о' в клетках из среды с метиламином, молодых и лимитированных по углероду клетках из среды с метанолом (табл.- 4). Это сходство, по-видимому, определяется 'Высоким содержанием кислорода в втих условиях.

Роль физиологического донора электронов для ' терминального участка дыхательной цепи М./1а#еИсйт' КТ, скорее всего, принадлежит растворимому цитохрому с с высокой изоелектрической точкой (Сц), обнаруженному наш'у этого микроорганизма. Поэтому особый интерес представляло изучение возможности окисления мембранами изучаемого метилотрофа экзогенного цитохрома с. Для исследований были выбраны условия ранней логарифмической и стационарной фаз роста культуры из среды с метанолом, где преобладали оксидазы о и о' соответственно (таблица 5).

Таблица 5

Кинетические параметры окисления восстановленного цитохрома с сердца лошади мембранами М./Та^еХШт КТ

Нароста V Умакс К{ ,ОТ

(мКМ) (мкмоль 02/шп1'МГ бел.) (мкМ)

Ранняя логарифмическая 21,4 ± 2,2' 1,29 ± 0,06 2

Стационарная 22,7 ± 3,8 1,64 ±0,05 10

Примечание: дакы средние значения.из двух независимых выращиваний

Мембраны из клеток разного возраста обнаружили близкие значения К» и V,, • при окислении восстановленного цитохрома с сердца лошади,

Ш МаКС;

Подавление этой реакции цианидом носило, монофазный характер и выявило

константы ингибирования 2 и 10 мкМ для препаратов из клеток ранней

логарифмической и стационарной фаз роста соответственно. Отсюда можно 14

заключить, что окисление цитохрома с сердца лошади, как и в случае аскорбата/ТМФД, может осуществляться обеими оксидазами. В молодых клетках влектроны от восстановленного цитохрома с поступают к кислороду через чувствительный к низким концентрациям • цианида цитохром о. Напротив, в условиях стационарной фазы роста цитохром с-зависимое дыхание идет преимущественно через цитохром о', проявляющий меньшую чувствительность к ингибитору. Удвоенные, по сравнению со значениями для аскорбат/ТМФД-оксидазной активности, константы шгибирования, вероятно, являются следствием высокого рН реакционной смеси в этом -случае (8,5). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что пункт разветвления к терминальным оксидазам у М./1сще1Шт КТ находится на уровне цитохрома с.

5. Кинетический анализ реаоооциации СО с окоидазнши комплексами

Одним из основных критериев принадлежности того или иного гемопротеида к терминальным оксидазам является его способность к обратимому связыванию СО. Это свойство изучали на препаратах мембран М./1а,£е1Шит КТ, полученных из выращенных- в присутствии метанола клеток. Для исследований были выбраны условия ранней логарифшческой и стационарной фаз роста культуры, где, судя по ингибиторному анализу оксидазной активности, преобладали иитохромы о и о' соответственно.

Кинетическийанализ оптических изменений, индуцированных лазерным флеш-фотолизом СО-комплексов восстановленных мембранных белков li.flа$еиаШ%КТ, выявил четыре составляющие (рис. 7, А-С). Эти кинетические компоненты, очевидно, принадлежат четырем лигандсвязывающим гемопротеидам мембран данного метилотрофа. Их кинетические и- спектральные характеристики не зависели от возраста культуры. Значения г (время, за которое спектральный отклик, достигал 1/е часть от максимального значения) и амплитуды кинетических компонент, определенные в области Соре, приведены в таблице 6.

Рис. 7. Светоиндуцируемое разложение СО-комплекса солюбилизированных сктилглюкозидом восстановленных мембранных белков М^Ще1Шт КТ из выращенных в присутствии метанола клеток стационарной фазы роста.(А) Кинетика изменения поглощения после лазерного фотолиза при 434 нм. Стрелка разывает момент- лазерной вспышки. (Б, В) Спектры,, полученные при кинетическом анализе изменений оптического поглощения, индуцируемых вспышкой лазера; г кинетических кривых - 25-30 мс (□ ), 35-70 мкс (▼), 0,25-0,50 мс (0) и 2-4 мс (о).

Таблица 6

Влияние возраста культуры М./Ще1Шт КТ на амплитуды изменений оптического поглощения кинетических компонент в ^-полосе

Время реассоциации Амплитуды (усл. ед.) для препаратов

СО с кинетическими мембран из клеток следующих фаз роста:

компонентами, X ранняя логарифмическая стационарная

' 35-70 мкс .1,5 1,6

■0,25-0,50 чс ' 2,3. 2,3

2-4 ме .1,0 1,0

25-30 мс 8,.7 3,1

Примечания. За условную единицу в обоих случаях принята амплитуда кинетической компоненты с Т=2-4 мс.

Соотношение амплитуд первых трех компонент оставалось неизменным и не коррелировало с изменением амплитуды самой медленной кинетической составляющей (1=25-30 мс') при переходе клеток от ранней логарифмической к стационарной фазе роста. Создавалось впечатление, что у П. fT.agella.tm КТ в этих условиях функционируют два дискретных океидазных комплекса, один из которых имеет монофазную, а другой -трехфазную кинетики СО-реассоциации.

Спектр амплитуд монофазной компоненты (Г=25-30 мс) обнаружил максимумы поглощения при 585 и 430 нм в а- и у-полосах соответственно, характерные для цитохрома о. Ее вклад в амплитуду оптических изменений мембран после облучения их лазером максимален в препаратах из клеток ранней логарифмической фазы роста (табл. 6). Суммируя вышеизложенные данные, можно сделать вывод, что наиболее медленно реагирующей с СО составляющей мембран является высокочувствительная к цианиду оксидаза о.

Напротив, амплитуды трех фаз с меньшими значениями I (35-70 мкс, 0,25-0,50 мо и 2-4 мс) составляли основную часть индуцированных лазерным флвш-фотолизом изменений оптического поглощения препаратов мембран, выделенных из стационарной фазы роста. Таким образом, трехфазная кинетика СО-реассоциации отражает присутствие в мембранах менее чувствительной к цианиду, оксидазы о'. Самая "быстрая" кинетическая составляющая (т=35-70 мкс) с пиками в спектре ее амплитудных изменений при 590 нм в а-полосе и при 434 нм в ^-полосе, очевидно, является результатом фотодиссоциации СО-цитохром о'-комплекса M.flagellatm KT. Вторая, более "медленная" компонента (г=0,25-0,50 мс), с максимумами поглощения в спектре амплитудных изменений при 593 и 440 нм в а- и у--полосах соответственно обнаружила явное сходство со спектральными и кинетическими характеристиками высокоспинового цитохрома Ъ^ в оксидазе Ы Е. coli (Muntyan et al., 1993 а). Природа третьей компоненты (г=2-4 мс), с максимумом поглощения, в спектре амплитудных изменений при 440 нм в у-полосе и отсутствием выраженного пика в области 590 нм, не совсем . ясна. Возможно, она принадлежит, по аналогии, с оксидазой М Е. coli, низкоспиновому гему b-типа, получившему способность реагировать с СО в результате частичной денатурации при выделении мембран.

Значение % СО для цитохромом о' было почти на .три порядка ниже, чем для цитохрома о. Это позволяет полагать, что оксидаза о' M.flagellatm KT имеет большее сродство к СО, а следовательно, и к-О^ по сравнению с оксидазой о.

Способность цитохромов о и о' обратимо связывать СО является подтверждением их оксидазной функции. Высокие скорости СО-реассоциации позволяют рассматривать их в качестве физиологических оксидаз, функционирующих в дыхательной цепи M.flagellatm KT.

Судя по спектральным откликам, отношение щмохром о'/цитохром о возросло в три раза при переходе клеток от начала логарифмической к стационарной фазе роста (табл. 6). Это наблюдение согласуется с параллельной индукцией в 4 раза цитохром о'-оксидазной активности (табл. 5). Кинетические данные по связыванию СО с гемопротеидами

мембран ср\еотвенно дополняют результаты ингибиторного анализа онсидазной активности M.flagellatm KT, который не выявил присутствия цитохрома о в клетках стационарной фазы роста.

Существенное отличие цитохромоксидазы о от о' по характеру реакции с СО, должно быть, является следствием разных механизмов связывания ими лигандов (СО и Og). В этой связи следует отметить удивительное сходство оксидаз о и о.' M.flagellatm KT по кинегикам СО-реассоциации с цитохромными комплексами Ъо и Ы E.coli соотвественно (Muntyan et al., 1993 а, b) Поскольку цитохром о' M.flagellatm KT, как и оксидаза Ы E.coli, содержит дополнительный С0-связывающий гем-b-типа (рис. 7), представляется весьма вероятным функционирование в нем гем-гем биядерного центра для восстановления 02- Напротив, кинетическое сходство цитохрома о M.flagellatm KT с о'ксидазой Ъо E.coli может являться следствием ее принадлежности семейству оксидаз с гем-OUg биядерным центром для связывания лигандов.

В заключение предложена схема путей транспорта электронов, функционирующих у M./I.agelIaíш! КТ при окислении метиламина и метанола (рис. 8), которая, на наш взгляд, наилучшим образом согласуется о экспериментальными данными.

ьскорбат/ДАД

4,5 мкМ СИ Цит. о' - } - *■ 0о

Метиламин

1,2 мкМ СГГ

/

МАДГ-> Амшшанхш -* Цит. -о «г-|—0о

♦ ь

аскорбат/ТМФД

-*■ преимущественный путь при периодическом культивировании -> возможный альтернативный путь

аскорбат/ДАД

Цит.

4,5 мкМ СГГ Шт. о'—I—0.-,

Метанол •

МДГ

■ Шт. ст ■

аскорбат/ТМФД

4 Азурин

\ 1,2 шсМ СЫ -»Цит. о - -|--*0о

преимущественный путь в ранней логарифмической фазе роста и при лимитировании роста метанолом

преимущественный путь в поздней логарифмической и стационарной фазах роста

Рис. 8. Схема транспорта электронов у ií./ZageZZaítда КТ при окислении А- метиламина; Б- метанола.

выводы

1. Показано, что система окисления метанола у М./1а$еПа1т КТ состоит из МДГ, растворимых цитохромов с (с^ и Сд), азурина и двух терминальных оксидаз о и о'. При втом активность МДГ не- является лимитирующим этапом окисления метанола.

2. Адаптация Jí./IageíIaít^m КТ к низким скоростям роста в лимитированной метанолом культуре заключается в дерепрессии синтеза МДГ, растворимых цитохромов с, а также в появлении дополнительного переносчика электронов - белка типа азурина.

3. Продемонстрирована биотрансформация 1,2-пропандиола покоящимися клетками и.^щеНаЬт КТ в молочную кислоту и изучена ее кинетика.

4. При росте На среде с метиламином у, 1?./ТещеИаЫп КТ индуцируется синтез амицианина - медиатора в транспорте электронов от МАДГ к растворимому цитохрому с.

5. Установлено, что у \l.flagellatm КТ функционирует разветвленная дыхательная цепь с двумя терминальными цитохром-с-оксидазами о-типа (о и о1). При этом качественный состав терминального участка не меняется в зависимости от источника углерода в среде, возраста клеток и скорости роста в лимитированной метанолом культуре.

6. При периодическом культивировании в клетках из среды с метиламином преобладает оксидаза о, а в клетках из среды с метанолом - оксидаза о'. В последнем случае соотношение оксидаз о'/о возрастает в три раза при переходе клеток от начала логарифмической к стационарной фазе роста. Концентрация метанола в среде не является регуляторным фактором для оксидазной активности М./1а$е1Шт КТ.

7.-Для оксидазы о' показана трехфазная кинетика СО-реассоциации, а для оксидазы о - монофазная. При этом цитохром о' связывает СО почти на три порядка быстрее по сравнению с цитохромом о и отличается от последнего меньшей чувствительностью к цианиду.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Dinarieva T., Netrusov A. Oupredoxines of obligate methylotroph // FEES Lett. 1989. V. 259. P. 47-49.

2. Dinarieva T., Netrusov A. Laotic acid formation by free and immobilized cells of an - obligate methylotroph // Abstr. of 6th Intern. .Symp. on Microbial Growth on C1 Comp., Gottingen, Germany, 1989. P411.

3. Dinarieva T., Netrusov A. Oupredoxines of obligate methylotroph // Abstr. of 6th Intem. Symp. on Microbial Growth on 01 Comp., Gottingen, Germany, 1989. P410.

4. Dinarieva T., Netrusov A. Laotic acid formation by free and immobilized cells of an obligate methylotroph // Biotechnol. Prog. 1991. V. 7. P. 234-236.

5. Dinarieva T., Netrusov A. Electron transport system from methanol and methylamine on obligate methylotroph Methylobacillus flagellatm KT // EBEC Short Reports. 1992. V. 7. P. 58, 11-87.

6. Dinarieva T., Baev M., Netrusov A. Respiratory chain changes in obligate methylotrophio cells grown on methanol at various dilution rates // Abstr. of 7th Intern. Symp. on Miorobial Growth on 01 Comp,, Warwiok, UK, 1992. 0115.

7. Dinarieva T., Muntyan M., Netrusov A. Evidence for the a^-type terminal oxidase in Methylobacillus flagellatm KT // Abstr. of'22nd PEBS Meeting, Stockholm, 1993. P. 180, 0:05.052.

8. Muntyàn M.S., Blooh D.A., Dinarieva T.Y., Draohev I.A., Netrusov A.I. Two o-type oxidases in Methylobacillus flagellatm KT // Bioohem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 204. P. 428-435.