Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum"

РГ6 од

' ВсЬСогозИый научно —исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

КИРЮХИН МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ АССИМИЛЯЦИИ АММОНИЯ У ОБЛИГАТНОГО МЕТИЛОТРОФА МЕТНУХОВАСНХиБ Р1АСЕ1.1АТиМ

03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1993

Работа выполнена в лаборатории генетшш метилотрофных бактерий Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микрооргашюмов.

Научный руководитель - дошюр биологических наук, профессор Ю. Д. Цыганков.

0(1)ицналы1ые оппоненты: доктор биологических паук А.И.Петрусов; доктор биологических наук Ю.А.Троценко.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.И.Баха РАН.

Л--3"

Защита состоится "М" 1993г. в ° час. на заседании

Специалнзировашюго совета Д 053.05.66 в Московском Государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Лешшские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан^" ^¿¿¿ЗЛ- 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Н.Ф.Пискупкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы, способные использовать восстановленные одноуглеродные (Cl) соединения в качестве единственного источника углерода и энергии, давно привлекают внимание ученых. Это обьясняется как научным, так и практическим интересом. Представляющие собой таксономически неоднородную группу, эти микроорганизмы обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофа-ми. Главным образом это - непатогенность, способность расти на простых средах, используя относительно дешевые субстраты ( метан, метанол), прекрасные ростовые характеристики и качество биомассы. Другой важный аспект применения метилотрофов в промышленности связан с их способностью осуществлять биотрансформации. Наконец, ме-тилотрофы могут служить основой для создания генноинженерных штаммов-продуцентов аминокислот, витаминов, а также гетерологичных белков.

Регуляция синтеза ферментов, участвующих в ассимиляции аммония ранее была изучена у многих бактерий как в стационарных условиях роста, так и при хемостатном культивировании. Среди них есть и работы, посвященные факультативным метилотрофам Hyphomicrobium ZV620 [58], Hyphomicrobium X [47], а так же метилотрофным дрожжам Hansenula polymorpha [48]. Однако до настоящего времени отсутствуют сведения о регуляции ассимиляции аммония у облигатных метилотрофов в условиях хемостатного культивирования. Отсутствует также информация о динамике экспрессии ферментов в переходных условиях роста, которые гораздо чаще встречаются как в природных условиях, так и в периодических и накопительных культурах. Использование переходных условий роста в хемостатной культуре может дать ценную информацию о регуляции ключевых ферментов при изменении внешних условий. К настоящему времени имеются данные по очистке и изучению свойств глутаматдегидрогеназ (GDH) из облигатного метилотрофа Methylophilus methanolovorus [9] и двух факультативных метилотрофов Methylobacterium extorquens AMI [18] и Hyphomicrobium X [46]. Отсутствие достаточной информации о свойствах GDH для метилотрофов, реализующих гексулозофосфатный путь ассимиляции Cl -соединений является существенным пробелом.

Ферменты цикла трикарбоновых кислот у метилотрофов также изучены недостаточно. К настоящему времени показана определенная корреляция между путями ассимиляции С1-соединений и уровнями активности ферментов ЦТК [35. 36, 83, 114].

- г -

Сведения об очистке и изучении свойств цитратсинтазы (CS) и НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (ICDH) отсутствуют в литературе. Некоторые данные по регуляции этих ферментов получены при использовании бесклеточных экстрактов или частично очищенных препаратов ферментов [15, 37, 96, 97]. Для облигатных метилотрофов до сих пор отсутствует сведения о регуляции НАД и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (за исключением Pseudomonas W6), не было сделано попытки установить, принадлежат ли активности с двумя кофакторами разным изоферментам, либо это свойство фермента с двойной специфичностью. Эти данные были бы очень полезны для понимания механизмов регуляции ассимиляции аммония, поскольку в случае облигатных метилотрофов ЦТК разомкнут на уровне оксоглутаратдегидроге-назы и выполняет исключительно биосинтетическую функцию, обеспечивая 2-оксоглутаратом глутаматдегидрогеназную реакцию.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физиологии и биохимии ассимиляции аммония у М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:

- изучение регуляции ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в условиях хемостата;

- изучение регуляции ассимиляции аммония в переходных условиях культивирования;

- выделение, очистку и изучение свойств НАДФ-зависимой глутаматде-гидрогеназы из М. flagellatum;

- выделение, очистку и изучение свойств НАД(Ф)-зависимой изоцит-ратдегидрогеназы из М. flagellatum;

- выделение, очистку и изучение свойств цитратсинтазы из М. flagellatum.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у обли-гатного метилотрофа изучена физиология ассимиляции аммония в условиях непрерывного культивирования в хемостате, а также в переходных условиях культивирования. Показано, что у M.flagellatum имеются две системы утилизации аммония. Ключевым ферментом ассимиляции аммония у М.flagellatum является НАДФ-зависимая глутаматдегид-рогеназа. Утилизация аммония путем прямого восстановительного ами-нирования 2-оксоглутарата с помощью глутама'тдегидрогеназы происхо-

дит как при избытке аммония, так и при его лимитировании. Ферменты глутаматного цикла (глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза) имеют наибольшие значения активностей и принимают участие в утилизации аммония при медленной скорости роста культуры в условиях лимитирования по азоту. НАД(Ф)-зависимая изоцитратдегидрогеназа регулируется аммонием координирование с глутаматдегидрогеназой.

Выделен и охарактеризован ключевой фермент ассимиляции аммония -НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется на метаболическом уровне.

Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована НАД(Ф)-за-висимая изоцитратдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется промежуточными метаболитами и только НАДФ-зависимая активность ингибируется АТФ.

Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована цитратсинта-за. Показано, что фермент не регулируется по типу отрицательной обратной связи и ингибируется АТФ.

Полученные в настоящей работе результаты позволили предложить схему, предполагающую, что скорость ассимиляции аммония определяется на начальных этапах окисления метанола и распределения потоков формальдегида на ассимиляцию и прямое окисление.

Полученные результаты по регуляции ассимиляции аммония у обли-гатного метилотрофа М. flaellatum имеют важное значение для получения штаммов-продуцентов биологически-активных веществ (например аминокислот) с улучшенными технологическими параметрами.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из следующих разд лов: введение, материалы и методы, результаты и обсуждение (10 глав), выводы, список литературы (116 наименований); и содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Обьем работы - 103 с.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 7-ом Международном симпозиуме "Микробный рост на С1 соединениях" (Ворвик, Англия, 1992), на семинаре отдела молекулярной генетики ВНИИГенетика (1993) и на заседании кафедры микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова (1993).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали штамм облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum, описанный ранее [5, 6].

Количество биомассы определяли путем фильтрования культуральной жидкости через мембрану Synpore N6 с последующим высушиванием при 105 С до постоянного веса.

Концентрацию метанола определяли газовой хроматографией по ранее описанной методике [56].

Концентрацию аммония определяли энзиматически [20]. Все измерения активностей ферментов проводили при 42 С, используя двулучевой регистрирующий спектрофотометр Unicam SP-1800 UV (Англия).

Удельную активность всех ферментов выражали в микромолях превращенного субстрата за 1 мин на 1 мг белка (мкМ/мин)/мг.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Регуляция ассимиляции аммония при стационарных условиях роста

1.1 Влияние концентрации аммония на рост культуры и активность ферментов, участвующих в ассимиляции азота.

М. flagellatum выращивали в условиях хемостата при скорости протока 0.15 1/ч . Концентрация метанола в среде была постоянной (312.5 мМ), в то время как концентрацию аммония увеличивали от 2 до 90 мМ. На рис.1 видно, что при концентрации от 2 до 5 мМ аммоний является лимитирующим ростовым субстратом. При концентрации от 15 до 30 мМ рост культуры лимитируется как N-, так и С-источника-ми. В области 60 - 90 мМ рост лимитирован источником углерода (метанолом). Увеличение концентрации азота в среде приводит к увеличению количества биомассы. Исследование ферментов, принимающих участие в ассимиляции аммония показывает, что М. flagellatum обладает ферментами как прямого, так и циклического путей ассимиляции азота (GDH, GS, G0GAT), а так же НАД- и НАДФ-зависимой изоцитрат-дегидрогеназой, обеспечивающей клетку 2-оксоглутаратом. Активность аланиндегидрогеназы не была обнаружена. G0H присутствует в клетках при всех условиях культивирования. Ее активность возрастает с возрастанием концентрации аммония в среде. Активность ICDH так же

возрастает, однако активность НАД-1С0Н возрастает существенно больше, чем НАДФ-1С0Н. Активности вБ и ООвАТ отсутствуют или очень низкие при росте культуры в условиях лимитирования по углероду, и возрастают при переходе на режим И-лимитирования, однако их значения низки по сравнению с активностью 60Н. Количество деаденилиро-ванной, активной формы вБ уменьшается от 84% в присутствии 2 мМ аммония в среде до 45% при 60 мМ аммония (при концентрации аммония 90 мМ, активность вБ не промеряется).

1.2 Влияние скорости протока на активность ферментов ассимиляции аммония.

М. Г1аде11а1шп культивировали в хемостате при скоростях протока от 0.15 до 0.65 1/ч в условиях лимита по углероду, азоту, а так же С/Ы- лимита (среда для культивирования содержала 60, 2 и 15 мМ аммония, соответственно).

1.2.1 Рост в условиях лимитирования по углероду (С-лимит).

Как показано на рис.2, при росте в этих условиях активность БОН,

а так же НАД- и НАДФ-1С0Н возрастает при увеличении скорости роста. Активность вОбАТ низкая в медленно растущей культуре (0.15 - 0.35 1/ч ) и отсутствует в быстро растущих клетках (0.35 - 0.65 1/ч ). Активность СЭ также уменьшается с увеличением скорости роста, причем во всех режимах роста только 45% фермента деаденили-рованно.

1.2.2 Рост в условиях двойного лимитирования (С/И-лимит).

Результаты данного эксперимента представлены на рис.3. Как и в

предыдущем случае активности ЗОН, НАД- и НАДФ-1СйН возрастали при увеличении скорости роста, а активности вБ и вОвАТ уменьшались. Около 58% вБ деаденилированно во всех режимах роста.

1.2.3 Рост в условиях лимитирования по аммонию (М-лимит).

Измерение активностей ферментов в этих условиях показало, что

6йН и НАД-1С0Н регулируются так же, как было показано выше. В противоположность С- или С/И-лимитированной культурам активность НАДФ-1С0Н уменьшается с увеличением скорости роста (рис 4). При увеличении скорости роста от 0.15 до 0.35 1/ч активность СОвАТ увеличивается, однако затем резко падает. Активность вБ уменьшается с увеличением скорости роста, причем около 80% белка деаденилированно во всех режимах роста.

2. Регуляция ассимиляции аммония в переходных условиях роста.

Переходные условия роста достигались путем импульсных добавок аммония к культуре, растущей в условиях С/И- и М-лимита при низкой (0.15 1/ч ) и высокой (0.55 1/ч ) скорости роста. Одновременно с импульсом аммония в ферментер добавляли метанол ( 20 г/л ) для увеличения периода нестационарного роста культуры. Ответ на импульсную добавку аммония аналогичен для двух различных режимов роста. Поэтому здесь представлены данные экспериментов по импульсу аммония для быстро (0.55 1/ч) растущей культуры.

2.1 Импульс аммония/метанола в С/Н-лимитированную культуру, растущую в условиях хемостата.

Аммоний добавляли к С/И-лимитированной культуре до конечной концентрации 60 мМ. Как видно из рис.5, концентрация аммония и метанола начинает уменьшаться немедленно после импульса. Концентрация аммония уменьшается от 60 до 10-15 мМ и не лимитирует рост культуры в этом эксперименте. Утилизация добавленных субстратов приводит к увеличению биомассы. Импульс аммония приводит к увеличению активностей йОН, НАД- и НАДФ-1С0Н и уменьшению активностей и вОбАТ. Активности как индуцируемых, так и репрессируемых ферментов достигают плато через 3 ч. При импульсе аммония до конечной концентрации 15 мМ весь добавленный метанол не утилизируется. Как видно из рис.6 весь добавленный азот ассимилируется через 3 ч, после чего концентрация биомассы остается постоянной. Оставшийся после исчерпания азота метанол (около 8 г/л) не ассимилируется, но окисляется клетками. Импульс низкой концентрации аммония приводит к индукции вОН и НАД- и НАДФ-1С0Н и репрессии бБ/СОбАТ, однако после его исчерпания активности этих ферментов стремятся возвратиться к исходному уровню.

2.2 Импульс аммония/метанола в И-лимитированную культуру, растущую в условиях хемостата.

В противоположность С/И-лимитированной культуре, импульс аммония (до 60 мМ) к культуре, растущей в условиях (Ьлимита не приводит к немедленной ассимиляции азота (рис 7). Скорость утилизации аммония и метанола очень низкая в течение примерно 3 ч, после чего эти субстраты утилизируются со скоростью,аналогичной С/М-лимитирован-

0.06

0.04

0.02

20 40 ¿0

АМН01ШЙ, мМ

Рисунок 1 Рост М. f1age1 latum и удельные активности ферментов, участвующих в ассимиляции аммония при постоянной скорости роста (0.15 ч"') в зависимости от концентрации аммония в среде культивирования. (а) Сухой вес биомассы • остаточная концентрация метанола (Л) и аммония (□). (в) Удельные активности НАДФ-зависимой GDH (О). НАД-зависимой 1CDH (□), ИАДФ-ICDH (А) и G0GAT (#). (с) Удельные активности глутаминсинтетазы, осуществляющие биосинтетическую Q) и транеферазные реакции (аденилированная и деаденшшро-ванная форма фермента (□); только деаденилированная форма (А) )

Вертикальные линии обозначают концентрацию аммония, при которой заканчивается N-лимитированный рост (10.02 мМ) и начинается С-ли-митированный рост (48. 07 мЮ.

а: г.

tn —.

= Я

0.02

0.01

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

СКОРОСТЬ ПРОТОКА, ч"'

Рисунок 2 Активности ферментов, участвующих в ассимиляции аммония при метанол-лимитированном росте в хемостате. (а) Удельные активности НАДФ-зависимой GDH (О). НАД-эависимой ICDH (□), НАДФ-iCDH (Д) и G0GAT ®). (в) Удельные активности глутаминсинте-тазы, осуществляющие биосинтетическую О) и трансфераэные реакции (аденилированная и деаденилированная форма фермента (□); только деаденилированная форма (А) )

Рисунок 3 Активности ферментов, участвующих в ассимиляции аммония при двойном метанол/аммоний-лимитированном росте в хемостате. (а) Удельные активности ШЩ-зависимой БОН (О). НАД-зависимой 1СБН (□), НАДСП СПИ (Л) и ШЗЛТ (#). (в) Удельные активности глу-таминсинтетазы, осуществляющие биосинтетическую О и трансфераз-ные реакции (аденилированная и деаденилированная форма фермента (О ); только деаденилированная форма (А) )

К Е

Н X

¡С Т.

< ^

<_> X

о =

0.06

0.03

О е-

3 с

а г

и ® д

о О Я

= " г

= I Г.

Н 9 к

1! < г

< г ^

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

СКОРОСТЬ ПРОТОКА, ч

Рисунок 4 Активности ферментов, участвующих в ассимиляции аммония при аммоний-лимитированном росте в хемостате. (а) Удельные активности НАДФ-зависимой (ЗБН (О). НАД-зависимой ЮБН (□), НАДФ- 1С0Н (Д) и ООйАТ (#). (в) Удельные активности глутаминсинте-тазы, осуществляющие биосинтетическую О) и трансферазные реакции (аденидированная и деаденилированная форма фермента О; только деаденилированная форма (Д) )

- И -

0.02

O.Ol

Рисунок 5 Ответ метанол/аммоний-лимитированной культуры М. flagellatum, растущей в гемостате при скорости протока 0.55 ч"1 на импульсную добавку 60 мМ аммония и 20 г/л метанола, (а) Сухой вес биомассы (Q), остаточная концентрация метанола (А) и аммония О. (в) Удельные активности НАДФ-зависимой GDH О). НАД-эависи-мой 1CDH (□), НАДФ- ICDH (Л) и G0GAT (•). (с) Удельные активности глутаминсинтетази, осуществляющие Сиосинтетическую О) и трансфе-разные реакции (аденилированная и деаденилированная форма фермента (р); только деаденилированная форма (Д) ) Нулевое время соответствует времени импульса аммония и метанола.

1 2

^ с:

х г> » и

N 1-1 < I

О Ом

о о о <

Л К •

н

У •£

» а •

Ш

0.02

0.01

12 3 4

ВРЕМЯ, Ч

Рисунок 6 Ответ метанол/аммоний-лимитированной культуры М. Паее11а(:ит, растушуй в хемостате при скорости протока 0.55 ч" на импульсную добавку 15 мМ аммония и 20 г/л метанола, (а) Сухой вес биомассы О, остаточная концентрация метанола (&) и аммония (□). (в) Удельные активности НАДФ-зависимой 6ЭН О). НАД-зависи-мой 1С0Н (□), НАДФ-1С0Н (А) и КХЗАТ (#}. (о) Удельные активности глутаминсинтетазы, осуществляющие биосинтетическую О) и трансфе-разные реакции Саденилированная и деаденилированная форма фермента (□); только деаденилированная форма (Л) ) Нулевое время соответствует времени импульса аммония и метанола.

о

0.06

0.03

с; и

15 3-

и и

2

Ю |

и а

н У 5 а*

о с О < и И X .£) ^

К ЕС 'г?

§8 1 «

3 I X

П п к

3 1.2

0 12 3 4 5 6

ВРЕМЯ, ч

Рисунок 7 Ответ аммоний-лимитироваиной культуры М. Г 1а1ит, растущей в хемостате при скорости протока 0. 55 ччна импульсную добавку 60 мМ аммония и 20 г/л метанола (а) Сухой вес биомассы (О ), остаточная концентрация метанола (Д) и аммония (□). (в) Удельные активности НАДФ-зависимой СОН О). НАД-зависимой 1СБН (□), НАДО-1С0Н (Д) и ОССАТ (#). (с) Удельные активности глутаминсинте-тазы, осуществлявшие биосинтетическую О 51 трансфераэиые реакции (аденилированная и деаденилированная форма фермента (Р); только деаденилированная форма (Л) ) Нулевое время соответствует времени импульса аммония и метанола.

ной культуре. Ассимиляция приводит к увеличению биомассы. Конечная концентрация биомассы после утилизации 30 г/л метанола ( 10 г/л остаточного метанола после непрерывного культивирования и 20 г/л импульсная добавка) примерно та хе, что и в в эксперименте с C/N-лимитированной культурой. Активности GDH и НАД- и ИАДФ-ICDH не изменяются в течение первых трех часов, однако затем увеличиваются. Активности GS/G0GAT репрессируются после импульса аммония.

3. Очистка и свойства глутаматдегидрогеназы (GDH) из M.f laqellatum

Фермент был очищен в 62 раза с выходом 32%. Удельная активность фермента составляет 40.2 мкмоль/мин на 1 мг белка. Использование высокоэффективного аффинного сорбента с Ргосion-red НЕЗВ позволило значительно очистить фермент с высоким выходом.

Электрофорез в денатурирующих и неденатурирующих условиях показывает, что препарат фермента является гомогенным. Нативный фермент дает одну белковую полосу при окрашивании как на белок, так и на энзиматическую активность. Относительная молекулярная масса на-тивного фермента составляет 300 000 Да по данным электрофореза. Гель-фильтрация (FPLC, Superóse 6) дает один пик, соответствующий молекулярной массе 295 000 Да. Электрофорез фермента в присутствии SDS дает белковую полосу с молекулярной массой 47000 Да. Таким образом молекула GDH состоит из шести идентичных субьединиц.

Изоэлектрофокусирование дает одну белковую полосу с изоточкой 4.6.

Скорость восстановительного аминирования максимальна при рН 8.0. Окислительное дезаминирование происходит с наибольшей скоростью при рН 9.5.

Фермент инактивируется полностью за 20 мин при 45 С. Однако, фермент в грубом экстракте не теряет активность в тех хе условиях. Это очевидно связано со стабилизирующим влиянием других белков.

Кинетика глутаматдегидрогеназной реакции следует кинетике Михаэ-лиса-Ментен. Константы Михаэлиса для 2-оксоглутарата, НАДФН, аммония, глутамата и НАДФ равны соответственно 1.33, 0.032, 11.5, 7.0, 0.014 мМ.

В реакции восстановительного аминирования в качестве субстратов участвуют только оксоглутарат и НАДФН. При замене НАДФН на НАДН и

оксоглутарата на пируват или оксалоацетат реакция не идет. Для реакции дезаминирования субстратами служат только НАД' и глутамат, но не аспартат, аланин или НАД.

Для изучения возможных механизмов регуляции активности фермента исследовали влияние различных метаболитов на активность GDH. На скорость аминирования и дезаминирования не оказывали влияние следующие субстраты (в концентрации 2 мМ): ATP, ADP, AMP, оксалоацетат, цитрат, изоцитрат, фумарат, малат, пируват, сукцинат, фосфое-нолпируват, формальдегид, формиат, глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюко-нат, рибулозо-5-фосфат, глутамат (в реакции аминирования), глута-мин, глицин, аланин, а так же (в концентрации 0.2 мМ) НАД, НАДН, НАДФ (в реакции аминирования) и Ацетил-КоА.

Ионы тяжелых металлов оказывают ингибирующее воздействие на GDH. Это может указывать на наличие в активном центре GDH сульфгидриль-ных групп.

Таким образом результаты, полученные при изучении свойств глута-матдегидрогеназы из М. flagellatum, показывают, что фермент играет исключительно анаболическую роль к клетке и не регулируется на метаболическом уровне.

4. Очистка и свойства НАД(Ф)-зависимой изоцитоатдегидрогеназы из М. flaqellatum.

Изоцитратдегидрогеназа (1CDH) осуществляет реакцию превращения изоцитрата в 2-оксоглутарат, необходимый для глутаматдегидрогеназ-ной реакции. Поскольку GDH не регулируется на метаболическом уровне, интересно изучить влияние метаболитов на ICDH.

Фермент был очищен в 27 раз с выходом около 10%. Низкий выход обусловлен наибольшими потерями на стадии хроматофокусирования, поскольку фермент неустойчив при низких значениях рН. Удельная активность очищенного фермента составляет 5.5 мкмоль/мин на 1 мг белка для НАД и 1.84 мкмоль/мин на 1 мг белка для НАДФ.

Электрофорез как в денатурирующих, так и в неденатурирующих условиях дает одну белковую полосу. Нативный фермент дает так же одну полосу при окрашивании на энзиматическую активность как с НАД так и с НАДФ. Молекулярная масса нативного фермента по данным на-

тивного электрофореза составляет 72000 Да. Гель-фильтрация (FPLC, Superóse 12) дает один пик, соответствующий молекулярной массе 75000 Да. Электрофорез в денатурирующих условиях дает белковую полосу с молекулярной массой 35000 Да. Таким образом, молекула ICDH состоит из двух идентичных субьединиц.

Изоэлектрическое фокусирование дает одну белковую полосу с изо-точкой 5.1.

Скорость окислительного декарбоксилирования изоцитрата максимальна при рН 8.5 с использованием НАД в качестве субстрата и при рН 6.0 с НАДФ- Обратная реакция не имеет характерного оптимума рН и максимальна при рН 6.0 для НАДН в качестве субстрата и рН 8.5 для НАДФН. Активность ICDH в прямой реакции с использованием НАДФ в качестве кофактора в ее оптимуме рН составляет около 33% от активности ICDH с использованием НАД (в оптимуме рН). Фермент катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата в 8 раз быстрее, чем восстановительное карбоксилирование 2-оксоглутарата при использовании НАД и в 2.5 раз быстрее при использовании НАДФ.

Степень воздействия бивалентных катионов на активность ICDH зависит от рН реакционной смеси и используемого кофактора. Так, ионы двухвалентной меди ингибируют обе активности на 50% при рН 8.5, однако в присутствии ионов Мп не наблюдается такого эффекта и активность НАДФ-ICDH становится равной ее активности при рН 6.0. При рН 6.0 обе активности ингибированы Си на 100%, хотя это воздействие снимается добавлением хелирующего агента (2мМ ЗДТА). Таким образом, ингибирование не является необратимым и носит конкурентный характер за центр связывания. Интересным является влияние ионов двухвалентного цинка. При рН 8.5 НАД-зависимая активность ингибирована на 80% без присутствия Мп и на 90% с Мп . Для НАДФ-зависимой активности при рН 8.5 Zn является сильным активатором (в 6 раз), при этом добавление Мп не оказывает влияния на активность. Таким образом, оптимум рН для НАДФ-зависимой активности ICDH изменяется от 6.0 (без катиона или с Мп или с Мд ) до 8.5 ( с Zn ).

Фермент является достаточно термостабильным (не теряет активности при 50 С в течение 1 часа). Одинаковые кривые зависимостей активностей фермента как с НАД, так и с НАДФ от температуры еще

раз подтверждают факт существования у М. flagellatum изоцитратде-гидрогеназы с двойной специфичностью.

Кинетика изоцитратдегидрогеназной реакции следует уравнению Ми-хаэлиса - Ментен, однако для НАДФ-зависимой реакции наблюдается ингибирование большими концентрациями изоцитрата. Значения кажущихся констант Михаэлиса для трео-О-изоцитрата, НАД и НАД' равны соответственно 9 (НАД). 8 (НАД®). ИЗ. 184 мкМ. Ионы марганца являются неконкурентными активаторами фермента.

Значение константы ингибирования по изоцитрату для НАД'-зависи-мой активности составляет около 36 мМ.

Значения максимальных скоростей для НАД-зависимой реакции составляют 6.6 и 1.3 мкмоль/мин на 1 мг белка (с Мп и без Мп ), для НАДФ-зависимой реакции 1.6 и 0.3 мкмоль/мин на 1 мг белка соответственно.

Для изучения возможных механизмов регуляции активности изоцит-ратдегидрогеназы исследовали влияние на фермент различных метаболитов. На скорость прямой реакции не оказывают влияние практически все метаболиты, за исключением ADP (активация без Мп ) и АТР ( ингибирование ). Однако измерение активности в присутствии активирующих катионов ( Мп или Мд ) снимает ингибирующее воздействие многих метаболитов. Таким образом, только АТР оказывает достаточно сильное ингибирование на НАДФ-зависимую активность ICDH (50%).

Использование аналогов НАД и НАД®, которые имеют модифицированные никотинамидные или адениновые компоненты (APAD, МНЭ)для измерения изоцитратдегидрогеназной реакции показало, что для связывания кофактора с ферментом наиболее важное значение имеет аденино-вая составляющая пиридиннуклеотида.

5. Очистка и свойства цитратсинтазы из М. flaqellatum.

Цитратсинтаза (CS) является первым ферментом цикла трикарбоновых кислот, осуществляющим конденсацию ацетилкофермента А с оксалоаце-татом. В виду того, что у изучаемого объекта цикл играет исключительно биосинтетическую роль, цитратсинтаза может являться мишенью воздействия различных метаболитов.

Цитратсинтаза очищена в 60 раз с выходом около 19%. Удельная активность CS после очистки составляет 9.5 мкмоль/мин на 1 мг белка. Удачным следует признать использование В1ие-сефарозы CL-6B, на которой происходит основная очистка фермента.

Полиакриламидный электрофорез как в денатурирующих, так и в на-тивных условиях дает одну белковую полосу. Относительная молекулярная масса нативного фермента по данным градиентного электрофореза составляет 350000 Да. Электрофорез в присутствии SDS дает белковую полосу с массой 46000 Да. Таким образом фермент состоит, по-видимому, из 8 идентичных субьединиц.

Скорость реакции, катализируемой CS, максимальна при рН 9.0.

На активность фермента не оказывают влияние ионы аммония, Мд, Mn, Zn ( в концентрации 2.5 мМ). Ионы Си и Fe полностью ингибируют CS,однако добавление EDTA (2 мМ) полностью восстанавливает активность в случае с Fe и на 30% с Си . Таким образом ингибирование тяжелыми металлами не носит необратимого характера.

Фермент полностью сохраняет активность при 55 С в течение 30 мин и инактивируется полностью при 70 С за тоже время.

Как показали опыты, цитратсинтаза изучаемого организма не является аллостерическим ферментом и следует кинетике Михаэлиса-Мен-тен. Константы Михаэлиса составляют 36.5 мкМ для ацетил-КоА и 20.8 мкМ для оксалоацетата. Значение максимальной скорости равно в обоих случаях 10.0 мкмоль/мин на 1 мг белка.

Для изучения возможных механизмов регуляции активности фермента исследовали влияние различных метаболитов на активность цитратсин-тазной реакции. На активность не оказывают влияние следующие соединения (в концентрации 5 мМ): глутамат, глутамин, 2-оксоглутарат, изоцитрат, цис-аконитат, цитрат, пируват, малат, фумарат, сукци-нат, ADP, AMP, а так же (в концентрации 0.2 мМ) НАД. НАДФ. НАДН, НАДФН. АТР (5 мМ) ингибирует фермент на 55%.

6. Схема регуляции ассимиляции аммония у М. flaqellatum.

Результаты, полученные в нашей работе позволяют представить схему регуляции ассимиляции аммония у М. flagellatum (рис.8). Из результатов опытов по изучению физиологии ассимиляции азота у М. flagellatum следует, что ключевым ферментом ассимиляции аммония у изучаемого микроорганизма является НАДФ-зависимая глутаматдегидро-

геназа. Ассимиляция аммония путем прямого восстановительного ами-нирования 2-оксоглутарата происходит как при избыточном уровне аммония, так и при его лимитировании. Ферменты глутаматного цикла (GS/G0GAT) имеют наибольшие значения активностей при низкой скорости роста клеток в условиях N-лимитирования, и, по-видимому, играют определенную роль в ассимиляции аммония, хотя глутаматдегид-рогеназа полностью не репрессирована. В условиях избытка азота глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза репрессированы. С увеличением скорости роста культуры в условиях лимитирования по азоту происходит индукция глутаматдегидрогеназы, позволяющая клетке использовать прямой путь ассимиляции аммония вместо энергозависимого глутаматного цикла. При этом индуцируется, по-видимому, система активного транспорта аммония в клетку, поскольку константа Михаэлиса по аммонию для глутаматдегидрогеназы достаточно велика и составляет 11.5 мМ (результаты данной работы).

Как было показано, системы активного транспорта аммония существуют у микроорганизмов с различной физиологией [75]. Активный транспорт аммония происходит только в условиях его лимита.

К настоящему времени глутаматдегидрогеназы были получены в очищенном виде и охарактеризованы из факультативных метилотрофов Р. extorquens AMI [18], Hyphomicrobium X [46], и облигатного метилот-рофа М. methanolovorus [9]. Сравнительный анализ показывает, что основные физико-химические и кинетические свойства (молекулярные характеристики, субстратная специфичность, кинетические константы, влияние катионов и метаболитов) достаточно близки у всех глутамат-дегидрогеназ, независимо от их источника. GDH из М. fläge 1latum близка по своим характеристикам аналогичному ферменту из других бактерий.

У М. fläge 1 latum GDH выполняет исключительно анаболическую функцию, что подтверждается целым рядом данных. Во-первых, этот мети-лотроф не способен использовать глутамат в качестве источника азота. Сродство фермента к 2-оксоглутарату намного выше, чем к глута-мату и скорость аминирования выше скорости дезаминирования.

НАД(Ф)-зависимая изоцитратдегидрогеназа регулируется аммонием координированно с глутаматдегидрогеназой, поскольку фермент обеспечивает 2-оксоглутаратом глутаматдегидрогеназную реакцию. Однако НАД-зависимая активность возрастает существенно больше, чем

А©"

Формальдегид

© ОДДГ

• Формиат

Рибулою-

0-МГДГ (монофос^агпныо) гбедг-0Ндд(<р)Н

НАД(Ф)Н

Пирубат

Ацетил КоА

АТФ0-ис

Цитрат

I

Иэоцитрат НАД

АТф(Г)-НАДО

ИДГ

2- оксоглутарот

Глутамин •

А -|гс

Глутомат

ГОГАТ 2 Глутамат

Оксалоацетат

ГДГ

Мал от

I

Фуморат

I

Сукцинат

Глутамат

Рисунок 8 Схема регуляции ассимиляции аммония у М. Ааде11а1ит

А-оммониО; МДГ-мстаналбсгиОрагеназа; ФДЦГ-формальбегиб-Вег иброгеноза; Г6ФДГ—г люкозо— 6— фосфатвег ийрог еноза; 6ФГДГ— 6-^осфоглюконот0егиврогенаэо: ЦС-цитратсиитаэа ИДГ-иэоцитротвегиврогеиом; ГДГ-г лутомотвег ийрог енаэа; ГС-глутаминсикпетаэа; ГОГАТ-глушомотсинппоза (-) — ингибироЬание; (+) — актибоцип

НАДФ-зависимая. НАДФ-зависимая активность выше при низкой скорости роста и лимите аммония, в то время как НАД'Зависимая активность выше при высокой скорости роста в тех хе условиях, а также при избытке аммония. Физиологическое значение таких модуляций активностей, а также механизм этого процесса пока неясен. Эти изменения, по-видимому, могут происходить при ковалентной модификации фермента. Ранее, такой способ регуляции активности НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы показан для Е. coli. При переходе роста Е. coli с Сахаров на ацетат, изоцитратдегидрогеназа модифицируется фосфорилированием с уменьшением активности фермента [52, 53]. В данном случае значение такой модификации понятно, поскольку при росте на ацетате индуцируются ферменты глиоксилатного шунта и изо-цитрат служит субстратом для изоцитратлиазы. Для выяснения возможности регуляции изоцитратдегидрогеназы путем ковалентной модификации у М. flagellatum необходимы дальнейшие исследования.

К настоящему времени изоцитратдегидрогеназы с двойной специфичностью к кофакторам очищены и охарактеризованы только из двух эу-бактерий: Thermus thermophilus [49] и Rodomicrobium vannielii [80, 81] и архебактерии Sulpholobus acidocaldarius. Данные по очистке и регуляции изоцитратдегидрогеназ из облигатных метилотрофов практически отсутствуют, что затрудняет их сравнение с результатами нашей работы.

Ферменты, участвующие в ассимиляции аммония не ингибируются продуктами своих реакций. Глутаматдегидрогеназа не регулируется на метаболическом уровне, а регулируется, вероятно, на генетическом уровне. Изоцитратдегидрогеназа не ингибируется продуктами 2-оксоглутаратом и глутаматом, и только НАДФ-зависимая активность ингибируется АТФ. Цитратсинтаза не подвержена ингибированию по принципу обратной связи 2-оксоглутаратом и глутаматом, и ингибируется только АТФ. Таким образом активности цитратсинтазы и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы определяются энергетическим состоянием клети, хотя цикл трикарбоновых кислот разомкнут и выполняет только анаболическую функцию.

По-видимому, скорость ассимиляции аммония определяется на начальных этапах окисления метанола и метаболизма формальдегида, поскольку ферменты, принимающие участие в ассимиляции аммония не

регулируются на метаболическом уровне. Это предположение подтверждается следующими фактами: во-первых, все dye-linked метанолдегид-рогеназы проявляют активность in vitro в присутствии иона аммония [15, 44, 51]. В процессе окисления метанола простетическая группа метанолдегидрогеназы (пирролохинолинхинон) связывается с аммонием или аминами, что приводит к активации фермента [10]. Таким образом, аммоний может играть роль активатора метанолдегидрогеназы in vivo и ускорять процессы окисления метанола.

Во-вторых, ключевой фермент диссимиляционного рибулозомоно-фосфатного цикла 6-фосфоглюконатдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа у М. flagellatum подвержены сильному ингибирующему воздействию восстановленными пиридиннуклеотидами [71,76]. Восстановленные пиридиннуклеотиды у исследуемого микроорганизма образуются главным образом при окислении формальдегида в диссимиляцион-ном рибулозомонофосфатном цикле, который сопряжен с процессами ассимиляции. Таким образом, окисление избытка формальдегида, который не может быть ассимилирован клеткой ( например при лимите по аммонию) приводит к увеличению внутриклеточного пула НАД(Ф)Н и выключению диссимиляционного цикла на уровне 6-фосфоглюконатдегид-рогеназы, а затем ассимиляционной ветви цикла на уровне глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы.

Обнаруженная у многих метилотрофов с циклическим окислением формальдегида dye-linked формальдегиддегидрогеназа, по-видимому играет важную роль в распределении потоков формальдегида на ассимиляцию и прямое окисление. Функции этого фермента не совсем ясны; принято считать, что он необходим для детоксикации избыточного формальдегида [16]. Хотя свойства формальдегиддегидрогеназы М. flagellatum не исследованы, ранее было показано, что активность этого фермента возрастает при увеличении скорости роста клеток; при этом увеличивается выброс формиата в культуральную жидкость [17, 34]. Вероятно, этот фермент необходим для окисления избытка формальдегида, который не может быть ассимилирован клеткой. Возможно, что наблюдаемое снижение выхода биомассы по метанолу в N-лимитированной культуре обьясняется окислением формальдегида этим ферментом " в ущерб " ассимиляции. Таким образом достигается корреляция между ассимиляцией формальдегида и аммония, при этом не

происходит накопления промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот ( например 2-оксоглутарата ), которое наблюдалось бы при вовлечении всего образующегося формальдегида в ассимиляционный ри-булозомонофосфатный цикл. Однако для подтверждения этих предположений необходимо дальнейшее изучение этого фермента.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что у М. flagellatum имеются две системы утилизации аммония. Ключевым ферментом ассимиляции аммония у М. flagellatum является НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа. Включение аммония путем прямого восстановительного аминирования 2-оксоглутарата с помощью глутаматдегидрогеназы происходит как при избытке аммония, так и при его лимитировании. Ферменты глутаматного цикла (GS/G0GAT) имеют наибольшие значения активностей при медленной скорости роста культуры в условиях лимитирования по азоту.

2. С увеличением скорости роста клеток в условиях N-лимитирова-ния происходит индукция глутаматдегидрогеназы. Это подтверждает ассимиляционную роль этого фермента в условиях N-лимитирования.

3. Показана координированная регуляция аммонием глутаматдегидрогеназы и НАД(Ф)-изоцитратдегидрогеназы.

4. Выделена и охарактеризована НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа из М. flagellatum. Показано, что фермент не регулируется на метаболическом уровне.

5. Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована НАД(Ф)-за-висимая изоцитратдегидрогеназа. Показано, что фермент не регулируется продуктами реакции и только НАДФ-зависимая активность ингиби-руется АТФ.

6. Впервые из метилотрофа выделена и охарактеризована цитратсин-таза. Фермент не регулируется по принципу отрицательной обратной связи и ингибируется АТФ.

7. Показано, что ферменты, принимающие участие в ассимиляции аммония не регулируются конечными продуктами.

8. Предложена схема, предполагающая, что скорость ассимиляции аммония определяется на начальных этапах окисления метанола и

распределения потоков формальдегида на ассимиляцию и прямое окисление.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kiriukhin M.Y., Detkov S.Y., Baev M.V. and Tsygankov Y.D. NADP-dependent glutamate dehydrogenase from the obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum. FEMS Microbiol. Lett. 1992, 93, 155-160.

2. Baev M. V., Chistoserdova L. V., Chistoserdov A. Y., Polanuer В. M., Sterkin V. E., Kiriukhin M. Y. and Tsygankov Y. D. Effekt of formaldehyde on growth of obligate methylotroph Metylobacillus flagellatum in a substrate non -limited continuous culture. Arch. Microbiol. 1992, 158, 145-148.

3. M.V.Baev, M.Y.Kiriukhin, Y.D.Tsygankov. Environmental regulation of the ammonia assimilation in an obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum. In: Abs. 7-th International Symposium on Microbial Growth on CI Compounds. Warwick, England, 1992, B73.

4. M.Y.Kiriukhin, S.Y.Detkov, M.V.Baev, Y.D.Tsygankov. Purification and properties of NAD- and NADP-dependent isocitrate dehydrogenase from Methylobaci1lus flagellatum. In: Abs. 7-th International Symposium on Microbial Growth on CI Compounds. Warwick, England, 1992, B74.