Особенности метаболизма метилотрофов

Троценко, Юрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности метаболизма метилотрофов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма метилотрофов"

Г 7 о а 5 1

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 576.8

ТРОЦЕНКО ЮРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА МЕТИЛОТРОФОВ Специальность - микробиология 03.00.07

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Пущино - 1992

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Г.А.Заварзин

А.К.Романова

Т.В.Финогенова

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ

Защита диссертации состоится " 24 " апреля 1992 г.

в 15 час 00 мин на заседании Специализированного Совета при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Диссертация разослана " 23 " марта 1992 г

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов.

.'/.., . : ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метилотрофньте микроорганизмы, использующие метан, метанол, метилированные амины и другие восстановленные С j-соединения в качестве источника углерода и энергии, давно привлекают внимание отечественных и зарубежных исследователей. Повышенный интерес к метилотрофам обусловлен их важной ролью в биосферном цикле углерода и других элементов, уникальными особенностями биологии, а также реальными перспективами использования в биотехнологии и генной инженерии.

В последние два десятилетия метилотрофы изучаются особенно интенсивно. Значительный прогресс в этой области отражен в монографиях (Малашенко, Романовская, Троценко, 1978; Anthony, 1982; Large, 1983; Кондратьева, 1983; Подгорский, 1983; Гальченко, Андреев,Троценко, 1986; Сузина, Фихте, 1986; Large, Bamforth, 1988; Романовская, Столяр, Малашенко, 1991; Goldberg, Rokem, 1991) и трудах специализированных Ci-симпозиумов. Однако ко времени начала данной работы (1969 год) исследования по метилотрофии ограничивались отдельными гидами метан- и ме-танолиспользующих бактерий, у которых группа Квейла обнаружила сериновый и гексозофосфатный пути первичной ассимиляции С j-соединений. Промежуточный (центральный) метаболизм метилотрофов был исследован недостаточно, поскольку априорно предполагалось, что он универсален у метилотрофов и гетеротрофов. В частности, неизученными были пути азотного и фосфорного метаболизма, уровни и механизмы ассимиляции СО2 у различных метилотрофов. Неясными были причины облигатной зависимости ряда метилотрофных бактерий от Ci-соединений, а также функциональная роль внутрицитоплазматических мембран у метанотрофов. Практически неизученной оставалась группа метилотрофных дрожжей. В целом к началу 70х годов представления о биологии метилотрофов, в особенности о таксономии, организации и регуляции Ci-метаболизма, были весьма фрагментарными, что ограничивало возможности их практического применения.

Принятые сокращения: АДГ - алкогольдегидрогеназа, АО - алкогольоксидаза, ВЦМ -внутрицитоплазматические мембраны, ГАФ - глицеральдегидфосфат, ГлбФ - глюко-зо-6-фосфат, ГС - глутаминсинтетаза, ГОГАТ - глутамат-2-оксоглутаратаминотранс-фераза, ГФД - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, ГФС - гексулозофосфатсинтаза, GSH - восстановленный глутатион, ДГФЦ - диссимиляционный гексулозофосфатный цикл, ДОА - диоксиацетон, ДОАС - диоксиацетонсинтаза, ДОАК - диоксиацетонки-наза, ДОАФ - диоксиацетонфосфат, ИЦЛ - изоцитратлиаза, КДФГ - 2-кето-З-дезок-си-б-фосфоглюконат, Ксу5Ф - ксилулозо-5-фосфат, МА, ДМА и ТМА - моно-, ди- и триметиламины, МАДГ - метиламиндегидрогеназа, МАО - метиламиноксидаза, МГ -N-метилглутамат, МДГ - метанолдегидрогеназа, ММО - метанмонооксигеназа, MC -малатсинтаза, ПДГ - пируватдегидрогеназа, ПФ - полифосфат, РМФ - рибулозомо-нофосфатный, Ру5Ф - рибулозо-5-фосфат, РБФ - рибулозобисфосфатный, СБФ - се-догептулозо-1,7-бисфосфат, ТА - трансальдолаза, ТК - транскетолаза, ТМАДГ -триметиламиндегидрогеназа, ТМАО - триметиламиноксигеназа, ФАДГ - формальде-гиддегидрогеназа, ФБФ - фруктозо-1,6-бисфосфат, ФГД - 6-фосфоглюконатдегидро-геназа, ФДГ - формиатдегидрогеназа, ФЕП - фосфоенолпируват, ФМС -феназин-метосульфат, Фн и ФФН - неорганический орто- и пирофосфат, ФрбФ - фруктозо-6-фосфат, ФФК - фосфофруктокиназа, ГМГ - гидроксиметилглутатион.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным представлялось необходимым расширить спектр культур метилотрофов, детально охарактеризованных в таксономическом и физиолого-биохимическом аспектах для понимания особенностей организации и регуляции их метаболизма, а также расширения возможностей практического применения. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Создать представительную коллекцию чистых культур метилотрофов и определить их таксономическое положение.

2. Исследовать пути первичного и центрального метаболизма у метилотрофов разных систематических групп.

3. Изучить регуляцию первичного С1 -метаболизма у метилотрофов.

4. Выяснить причины неспособности облигатных метилотрофных бактерий расти на ролиуглеродных (Сп) субстратах.

5. Исследовать роль внутрицитоплазматических мембран у метанотрофов.

6. Выявить перспективные для биотехнологии штаммы метилотрофов.

Научная новизна. Создана наиболее представительная и охарактеризованная отечественная коллекция чистых культур метилотрофных бактерий и дрожжей, а также их мутантов. Упорядочена систематика облигатных и факультативных метилотрофных бактерий, предложено 20 новых таксонов. Для основных коллекционных штаммов метилотрофных бактерий и дрожжей разработаны таксономические паспорта и метаболические карты. Выявлены особенности метаболизма углерода, азота, фосфора у метилотрофов разного систематического положения. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция множественных энзиматических дефектов (блоков) в путях центрального метаболизма, объясняющая неспособность облигатных метилотрофов расти на полиуглеродных субстратах. Определены уровни фиксации СО2 и активности соответствующих карбоксилаз у метилотрофов с различными путями Сх-метаболизма. Установлены общие принципы и специфика регуляции первичных путей метаболизма различных метилотрофов. Наиболее детально эти закономерности изучены на примере диссимиляционного гексулозофосфатного цикла у бактерий и диоксиацетонового цикла у дрожжей. Специфические ферменты данных путей метаболизма получены в высокоочищенном состоянии, исследованы их свойства. Выявлены закономерности формирования мембранного аппарата метанотрофов и его роль в компартментации и регуляции ферментов С1-окисления, а также участие в энергообеспечении метанотрофов. Установлено функционирование у метилотрофных дрожжей футильного цикла окисления формальдегида - нового механизма детоксикации СН2О. В результате комплексных исследований достигнуто более полное и глубокое понимание биологии и метаболизма прокариотных и эукариотных метилотрофов.

Научно-практическое значение. Полученные результаты создали научную основу и" методологические предпосылки практической реализации метаболического потенциала метилотрофов. Установлено, что метилотрофные бактерии, имеющие разные пути С1-метаболизма, различаются по ряду биотехнологических показателей (скорости роста, выходу биомассы, ее составу). Разработаны способы получения ряда практически важных продуктов (ферменты, полисахариды, поли-^-гидроксибутират, кароти-ноиды), биологической очистки промстоков, содержащих токсичные одно- и полиуглеродные соединения. Результаты диссертационной работы вошли в монографии, 4

учебники и обзоры, используются в лекциях по микробиологии. Штаммы метило-трофов и препараты ферментов применяются в ИБФМ РАН, МГУ, ИнМи РАН, ИМВ АН Украины, ИМВ АН Казахстана, ВНИИГенетика, ВНИИСинтезбелок, ВНИИБио-технология, а также в ряде зарубежных лабораторий.

Апробация. Основные положения диссертационной работы были доложены на всесоюзных и международных конференциях по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, 1972, 1978, 1983), всесоюзных микробиологических съездах (Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата,1985), всесоюзных конференциях и школах по микробиологическому использованию С j-соединений (Пущино, 1971, 1976, 1986), международных симпозиумах "Рост микроорганизмов на (^-соединениях" (Токио, 1974; Пущино, 1977; Шеффилд, 1980; Миннеаполис, 1983; Харен, 1986; Геттинген, 1989), "Микробиологическое образование и потребление газов" (Геттинген, 1975), симпозиумах соцстран по биотехнологии (Лейпциг, 1980, 1982; Братислава, 1983)., симпозиуме по хемоавтотрофии, посвященном памяти С.Н.Ви-ноградского (Геттинген, 1987), международных конференциях "Роль формальдегида в биологических системах" (Балатон"фюред, 1985; Кештели, 1987), 15-м международном дрожжевом симпозиуме (Рига, 1991), а.также на отраслевых конференциях по проблемам использования метилотрофных микроорганизмов в биотехнологии. Публикации. По материалам диссертации опубликовано более, 150 работ, 2 монографии, получено 10 авторских свидетельств.

Благодарности. В исследованиях принимали участие студенты, аспиранты, стажеры и сотрудники лаборатории, руководимой автором, а также сотрудники ряда других лабораторий. Всем участникам этой работы автор глубоко признателен за сотрудничество, их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. ОРГАНИЗАЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

Метанотрофы - подгруппа метилотрофных бактерий, структурно и функционально специализированных на использовании метана в качестве источника углерода и энергии. Поскольку выделение и идентификация метанотрофов подробно описаны в монографии (Гальченко, Андреев, Троценко, 1986), представляется целесообразным ограничиться здесь рассмотрением особенностей их метаболизма и ультраструктуры. 1.1. Пути первичного и центрального метаболизма. Энзимологические исследования показали, что изучаемые метанотрофы окисляют метан до СО2 через метанол, формальдегид и формиат, о чем свидетельствовало наличие у них активности ММО, а также соответствующих дегидрогеназ (ФАДГ и ФДГ). Первичная ассимиляция углерода метана осуществляется одним из двух основных путей, .которые в целом коррелируют с типом ВЦМ. Так, бактерии родов Methylomonas, Methylobacter и Methylo-coccus (I тип) имеют высокие активности ГФС - ключевого фермента РМФ-пути. У бактерий родов Methylosinus и Methylocystis (II тип) ГФС нет, но высоки активности оксипируватредуктазы и серин-глиоксилатаминотрансферазы - специфических ферментов серинового пути (Рис.1,2). Наличие у ряда метанотрофов I типа наряду с ГФС небольших активностей оксипируватредуктазы, серин-глиоксилатаминотрансфе-

сн,

гк

СНоОН

СН20-НАДН |

Глюкоза (02)

Гексулозо-бФ -

_) '

Фруктозо-бФ

Рибулозо-5Ф

■Полисахариды

Глнжо'зо-бФ Фруктозо-1, 6Ф2

6-Фосфоглюконат

2-Кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат

Диоксиацетон-Ф-

■^•-Глицералъдегид-ЗФ-«^

-Ацетил-КоА\ \ Фосфоенолгшруват \ С0> \ \(

\ \\ /

\ Оксалоацетат

Глиоксилат--Ц-»-Малат

Изоцитрат----1Н —

НАД(Ф)ЁГ^

- о(.-Кетоглутарат

НАДФНр-ч М»;

V Фуиарат

\ /

Сукцинат —.—-Порфирины

Глутамат-

.Белки

Рис.1. Пути первичного и промежуточного метаболизма

у облигатных метанотрофов I типа (Тгс^вепко,1983). ---II— метаболические.блоки

Глюкоза (Сд) -г-

СНоОН

ВДН

сн2о-

}

Серии—^ го.

Фосфоенолпируват^—Пируват|

СО

нсоон

Глицин

Н \

С0\-Энергия\_Глиоксшат^У

Оксалоацетат\

НАДНЧ \

Г \Р02 . Малат у I

^-АТФ \ ^ /

п*

I I / I ' I

Липида (Поли-р-оксибутират)

шХ

Цитрат

\ Оксалоацетат ' \ /

Глиоксилат---^[»-Малат

Изоцитрат---

НАДФН>

■¿умарат

©(.-Кетоглутэтат Сукцинат

НАДН

НААН

-Глутамин -Глутамат

■АТФ ин.

Глутамат -

-Белки

Рис.2.Пути первичного и промежуточного метаболизма

у облигатных метанотрофов II типа (Тгс^зепко,1983). —11— метаболические блоки

разы, а также серинтрансоксиметилазы позволяло заключить, что в первичную ассимиляцию С i-соединений у этих метанотрофов возможен вклад реакций серино-вого пути. Об этом свидетельствовало также возрастание активности оксипируват-редуктазы у Methylobacter bovis при выращивании на метане в присутствии формиата.

Показано, что исследуемые метанотрофы ассимилируют СО2 только в качестве • дополнительного к метану или метанолу источника углерода. Уровень фиксации СО2 у метанотрофов зависит прежде всего от особенностей их первичного метаболизма. У Methylosinus trichosporium и Methylocystis methanolicus (сериновый путь) около 30% углерода клеток может происходить из СО2; у Methylomonas methanica, Methylobacter chroococcum, Methylococcus capsulatus (РМФ-путь) доля углерода, происходящего из СО2, составляет 5-12 %. Уровни фиксации СО2. как правило, несколько выше при росте бактерий на метаноле, чем на метане. У метанотрофов I типа обнаружены различия в наборе карбоксилаз: M.methanica имеет ФЕП-карбоксилазу и "малик"-фер-мент, а Mb.bovis и Mb.chroococcum, кроме того, ФЕП-карбоксилазу. Активность С3-карбоксилаз у метанотрофов I типа значительно ниже, чем у метанотрофов II типа, что согласуется с различиями в уровнях ассимиляции СО2 этими бактериями. Для всех изученных метанотрофов характерно отсутствие пируваткарбоксилазы и ФЕП-карбокситрансфосфорилазы. Особый интерес представляет присутствие РБФ-карбок-силазы у представителей рода Methylococcus, поскольку они не способны к росту в автотрофных условиях. Вероятно, функция реакций цикла Кальвина связана с окси-геназной активностью РБФ-карбоксилазы. Образующийся фосфогликолат может участвовать в реакциях серинового пути, о чем свидетельствует наличие соответствующих ферментов (Рис.3) (67, 88).

Энзимологический анализ выявил две основные группы метанотрофов, различающихся способами ассимиляции аммония. Первая группа представлена бактериями

I типа, ассимилирующими NH4 + в основном посредством восстановительного ами-нирования пирувата и а-кетоглутарата, а также через глутаматный цикл. Напротив, у бактерий II типа глутаматный цикл является единственным путем ассимиляции NH4 +. Особое положение занимает Mc.capsulatus, поскольку, в отличие от метанотрофов II типа, не имеет глутаматдегидрогеназы, но обладает ферментами глутамат-ного цикла и аланиндегидрогеназой. Эти результаты подтверждают правомочность выделения данного вида в особую подгруппу (тип "X") (31,67).

Профили активности ферментов цикла Кребса у изученных штаммов подтвердили корреляцию путей первичного и центрального метаболизма у метанотрофов (Davey et al., 1972). У бактерий родов Methylomonas, Methylobacter и Methylococcus (I тип, РМФ-путь) нет а-кетоглутаратдегидрогеназы, тогда как Methylosinus и Methylocystis (II тип, сериновый путь) этот фермент имеют. Изоцитратдегидрогеназа у метанотрофов I типа активна с НАД и НАДФ, у штаммов II типа - только с НАДФ.

Кроме того, нами выявлены новые особенности в центральном метаболизме метанотрофов. Ни у одного из исследованных штаммов не найдены специфические ферменты глиоксилатного шунта - ИЦЛ и MC. Отсутствие ИЦЛ у метанотрофов

II типа свидетельствует о том, что они реализуют ИЦЛ"-вариант серинового пути, в котором неясен путь регенерации глицина. У Ms.trichosporium и Mcs.echinoides не найдены также гомоизоцитратлиаза и оксиглутаратдегидрогеназа, что исключает возможность синтеза метанотрофами глиоксилата (глицина) через гомоцитрат (Kortstee, 1980). Напротив, наличие у Ms.trichosporium пропионил-КоА карбоксилазы 8

Полисахариды

сн4

СНдОН Гексуло зо-бФ —>-Фруктозо-6Ф^.„>_»- Фруктозо-1,6®2

СН20-

НАДН |

нсоон

Диоксиацетон-Ф-

перестроики

Рибулозо-5Ф —+

Глюкозо-бФ

С0с

"Энергия

Глицеральдегид-ЗФ НАДН—

(2) З-ФГКч >ч-КАД(Ф)К АТФ N00,

6-Фосфоглюкокат-^*-Рибулозо-5Ф-^+-Рибулозо-1,510

СО,

2-Кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат

Алании-

шц НАД(Ф)Н

-|Шгруват|ч

НАДН'

ч\\

АТФ

Липиды

Цитрат

Адетил-КоА \ч 2-ФГК со2-Л\со^ч| У? ФЕП

\ Оксалоацега^ \

■Глицеральдегид-ЗФ |»НАДН у7 3-ФГК^

Фосфогликолат

Гликолат

}

Глиоксилат

Глиоксилат--=И|-»-Малат

у I

Изоцитрат--—^ I

\ Фумарат

Оксипируват

|-НАДН Глицерат

НАДН

Л-Кетоглутарат

X /

Сукцинат-

-Порфирины

НАДН

—Глутемин

-^-Глутамат-

Глутамат-»-Белки-

I—<—\ ?-

ТФ •ш.

Рис. 3. Пути первичного и промежуточного метаболизма

У Ме1;11у1ососсиз сарзи1а1;из (Тго1зепко, 1993)-

и метилмалонил-КоА мутазы свидетельствует в пользу синтеза глиоксилата через р-метиласпартат.

У метанотрофов II типа, в отличие от метанотрофов I типа, отсутствует общая активность пируватдегидрогеназного комплекса, что обусловлено дефектом в Е1-компоненте (декарбоксилаза) (54, 67).

У метанотрофов обоих типов не найдена активность пируваткиназы - важного фермента гликолиза. Отсутствие у бактерий II типа ФЕП синтетазы и пируватфос-фатдикиназы прерывает последовательность глюконеогенеза от пирувата. Следовательно, у них блокированы все возможные пути синтеза фосфотриоз из пирувата и интермедиатов ЦТК, поскольку отсутствуют также пируваткарбоксилаза и ФЕП-кар-боксикиназа.

Изучаемые метанотрофы существенно различаются по набору ферментов углеводного метаболизма. У МвЛпсЬовропит, в отличие от М.теШашса и Мс.сарзи1аШз, отсутствуют гексокиназа, КДФГ-альдолаза, дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата, причем эти ферменты не индуцировались при выращивании бактерий на метане в присутствии глюкозы. Результаты подтверждают отмеченную ранее, но не получившую объяснения особенность углеводного метаболизма у метанотрофов I типа, а именно - одновременное действие двух путей распада фосфосахаров. По-видимому, это связано с дефектами в центральном метаболизме: из-за отсутствия пируваткиназы путь распада фосфогексоз через ФБФ-альдолазу не способен обеспечить клетки пируватом. Напротив, участие КДФГ-альдолазы может привести к избыточному образованию пирувата, отток которого в биосинтетические пути ограничен из-за отсутствия пируваткарбоксилазы и ФЕП-синтетазы (Рис. 1-3). 1.2. Использование полиуглеродных соединений Одной из причин отсутствия роста метанотрофов на Сп-субстратах может быть непроницаемость клеточной мембраны. Представляло интерес выяснить, мо^ ли Сп-соединения проникать в клетки метано-трофных бактерий и метаболизироваться.

Клетки. М.теШашса и МвЛпсЬозропит включали 2-'^С-ацетат и 3-^С-пиру-ват, причем скорость включения была существенно выше в присутствии метана. Рост этих бактерий в присутствии Р14С -малата, 2,3-

14С

-сукцината или Р14С -глюкозы сопровождался накоплением радиоуглерода в клетках. У М.теШатса до 17% углерода синтезированной биомассы может происходить из глюкозы. Напротив, у МБ.йчсЬозро-пит включение 1^С-глюкозы составляло менее 1% от общего углерода клеток, что согласуется с отсутствием гексокиназы и других ферментов углеводного метаболизма у данного штамма. Следовательно, Сп-соединения не обеспечивают рост, но способны проникать в клетки метанотрофов. Более того, многие из них могут служить дополнительными к метану (метанолу) источниками углерода (54, 106).

Предполагалось, что отсутствие а-кетоглутаратдегидрогеназы у метанотрофов

I типа является универсальной причиной их облигатной зависимости от С1-субстратов, т.к. блокируется полное окисление органических соединений через ЦТК и генерация энергии. Однако такое объяснение неубедительно, поскольку известны примеры роста бактерий в гетеротрофных условиях при отсутствии функционального ЦТК. Это объяснение в принципе не может быть отнесено к облигатным метанотрофам

II типа, имеющим полный набор ферментов цикла Кребса.

Наши данные свидетельствуют о наличии множественных метаболических блоков в путях центрального обмена метанотрофов, что составляет биохимическую осно-10

ву их облигатной зависимости от С j-соединений. Например, блок на уровне пируват-киназы у метанотрофов I типа препятствует использованию гликолиза в качестве альтернативного циклу Кребса механизма образования энергии. Отсутствие глиокси-латного шунта весьма ограничивает метаболизм С2-соединений и служит одной из причин неспособности метанотрофов расти на этих субстратах. Несмотря на наличие у метанотрофов II типа а-кетоглутаратдегидрогеназы, у них блокированы пути глю-конеогенеза от пирувата и интермедиатов ЦТК, нет глиоксилатного шунта. Это делает невозможным рост на пирувате, С2- и Отсоединениях. У метанотрофов II типа отсутствуют также механизмы первичной ассимиляции и основные пути диссимиляции углеводов, что препятствует росту этих бактерий на сахарах (Рис.1-3).

Обнаруженные метаболические блоки позволяют объяснить ингибирование роста бактерий на метане в присутствии сравнительно низких концентраций органических соединений (Eroshin et al., 1968; Eccleston, Kelly, 1973; Малашенко с соавт., 1978). Можно полагать, что экзогенные органические соединения или их интермедиа-ты, накапливаясь в клетках вследствие метаболических блоков, нарушают регуляцию ферментов С i-метаболизма и ингибируют рост облигатных метанотрофов (67, 92). 1.3. Фосфорный обмен метанотрофов не изучался, хотя представляет интерес для понимания особенностей их энергетики и связи с путями углеродного и азотного метаболизма. С целью восполнения данного пробела было решено выяснить роль неорганических пиро- и полифосфатов в метаболизме разных метанотрофов. Как известно, метаболическая роль этих соединений заключается, с одной стороны, в поддержании на определенном уровне концентрации Фн, а с другой - в резервировании активированного фосфата, который может Использоваться для ряда эндергонических реакций (Кулаев, 1975). Наши данные в целом согласуются с этим заключением.

Изученные штаммы, представляющие три основных типа метанотрофов, накапливали. ПФ в количествах, сравнимых с таковыми у других бактерий (5-6 мг/г сухих клеток). Накопление ПФ существенно возрастало при увеличении остаточного фосфора в среде и свободного Фн в клетках. Следовательно, синтез ПФ регулируется концентрацией внутриклеточного Фн.

У M.methanica и Mc.capsulatus выявлено два пути биосинтеза ПФ с участием полифосфаткиназы и 1,3-дифосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы. Активность последней обнаруживалась только при выращивании Mc.capsulatus при избытке фосфора в среде, что коррелирует с максимальным накоплением ПФ и, очевидно, указывает на участие данного фермента исключительно в синтезе ПФ. Уровень 1,3-дифосфоглицерат: полифосфатфосфотрансферазы у исследованных метанотрофов отражает особенности их углеродного метаболизма. Наибольшей активностью этого фермента обладает M.methanica. У данного метанотрофа с РМФ-циклом основным путем синтеза фосфотриоэг является распад фосфогексоз посредством ФБФ-альдо-лазы. Напротив, у Mc.capsulatus ее активность ниже, что согласуется с минорными реакциями гликолиза и преимущественным синтезом триоз в РБФ-цикле. В то же время отсутствие 1,3-дифосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы у Ms.trichospo-rium коррелирует с направленностью гликолитической последовательности в сторону глюконеогенеза у метанотрофов II типа с сериновым путем.

Гидролиз ПФ до Фн у метанотрофов происходит с участием полифосфатазы, активность которой максимальна при выращивании бактерий в лимите по фосфору. При этом, по-видимому, имеет место дерепрессия синтеза полифосфатазы. Следова-

тельно, функция полифосфатазы и ПФ, вероятнее всего, связана с поддержанием относительно постоянного уровня Фн в клетке.

Обнаружение у метанотрофов высоких концентраций ФФН (»5 мМ) указывает на важную физиологическую роль этого соединения. Действительно, ФФН участвует в фосфорилировании ФрбФ до ФБФ, в синтезе АТФ из АДФ, а у Mc.capsulatus, кроме того - АДФ из АМФ. Факт присутствия ФФН-ФФК у Mc.capsulatus интересен, поскольку ввиду крайне низкой активности АТФ-ФФК у представителей рода Methylo-coccus рядом авторов отрицается физиологическое -значение распада фосфогексоз через гликолитический путь. Однако наши результаты позволяют пересмотреть такую точку зрения, поскольку ФФН-ФФК обнаруживается стабильно у данного вида, причем ее уровень выше активности АТФ-ФФК. У Ms.trichosporium этот фермент вследствие обратимости катализируемой реакции, возможно, обеспечивает синтез фосфогексоз (122, 125).

ФФН-ФФК из M.methanica очищена до гомогенного состояния. Фермент является димером с Мг 92 кД (2x45 кД). Кажущиеся значения Кт к ФрбФ - 0,38 мМ; ФФН - 0,051 мМ; ФБФ - 0,1 мМ; Фн - 1,7 мМ. Активность фермента зависит от наличия Mg2 + . Поскольку исследованные нами соединения не оказывают влияния на активность ФФН-ФФК M.methanica, вопрос о регуляции РМФ-цикла у метанотрофов остается открытым. Предполагалось, что регуляторной точкой этого цикла может служить АТФ-зависимая ФФК. Однако значительно большая активность ФФН-ФФК в экстрактах указывает на участие в РМФ-цикле у M.methanica именно этого фермента. Более того, высокое сродство и специфичность ФФН-ФФК по отношению к ФФН ставят под сомнение возможность функционирования у метанотрофов АТФ-ФФК. Участие ФФН-ФФК в РМФ-цикле указывает на важную роль ФФН у метанотрофов и необходимость дальнейшего изучения факторов, регулирующих его внутриклеточную концентрацию.

В целом полученные данные дают возможность представить участие неорганических пиро- и полифосфатов в метаболизме облигатных метанотрофов I типа. ФФН (образующийся в анаболических реакциях пирофосфоролиза и, возможно, при окислительном фосфорилировании) участвует в синтезе АТФ из АДФ, а также активирует метаболиты гликолиза. Затем фосфатная группа с АТФ или ФГК переносится на ПФ. Вследствие обратимости полифосфатазы ПФ могут служить донором энергии и фосфата для синтеза АТФ при определенном энергетическом состоянии клеток. Кроме того, ФФН, заменяя АТФ при фосфорилировании ФрбФ и участвуя в прямом синтезе АТФ из АДФ, может, по крайней мере частично, компенсировать низкую эффективность окислительного фосфорилирования у метанотрофов (125). 1.4. Функции внутрицитоплазматических мембран. С целью выяснения роли ВЦМ у метанотрофов было исследовано влияние условий культивирования на организацию их мембранного аппарата и определена внутриклеточная локализация ферментов энергетического метаболизма. Эксперименты в основном проводили с клетками M.methanica, обладающим ВЦМ I типа, которые обычно представлены стопками плотно упакованных везикулярных дисков, распределенных по всей цитоплазме.

Оказалось, что наибольшее количество ВЦМ в середине экспоненциальной фазы роста образуется при выращивании культуры в условиях низкого рСНф При этом активность окисления метана была выше у клеток, содержащих больше ВЦМ. Поскольку вторым субстратом ММО является кислород, исследовали изменение со-12

держания ВЦМ при выращивании культуры в условиях высокого и низкого рС>2- Характер колебаний содержания ВЦМ и активности окисления метана при изменении рС>2 или РСН4 был практически одинаковым. Это позволяет считать, что наиболее обширная система ВЦМ образуется в условиях дефицита обоих субстратов ММО, обеспечивая большую эффективность их усвоения (56,82).

М.теЛашса может также использовать метанол в качестве источника углерода и энергии. У адаптированной к метанолу культуры на начальных стадиях роста некоторые клетки лишены ВЦМ, а у остальных стопки мембран беспорядочно разбросаны в цитоплазме. В экспоненциальной фазе роста наблюдали увеличение относительной площади ВЦМ, которая, однако, значительно меньше, чем при выращивании клеток на метане. В стационарной фазе содержание ВЦМ вновь уменьшалось. Следовательно, колебания относительной площади ВЦМ аналогичны при выращивании клеток на метане или метаноле. Хотя дыхание клеток при росте на метаноле в целом слабее, чем при выращивании на метане, характер изменений активности окисления С}-соединений по фазам роста на метане или метаноле одинаков. Итак, исследования на клеточном уровне показали, что у М.теШашса ■ формирование ВЦМ определяется процессами С1-окисления (124).

Далее были охарактеризованы очищенные фракции ВЦМ, цитоплазматической мембраны и клеточной стенки М.теЛашса. Обнаружено, что везикулы ВЦМ покрыты глобулярными структурами диаметром 9,0-9,5 нм, расположенными с гексагональной симметрией. Каждая глобула состоит из 7 субъединиц. По-видимому, глобулярные структуры непрочно связаны с мембраной, поскольку часть их отделяется в процессе дезинтеграции клеток. В свободном состоянии глобулы имеют диаметр 13 нм. Несоответствие диаметра свободной и мембраносвязанной форм глобулярных структур свидетельствует о различных конформационных состояниях субъединиц, составляющих глобулу. При выращивании М.теЛашса ■ на среде с метанолом глобулярные структуры теряют упорядоченную организацию и слабее связаны с мембраной. Следовательно, при росте на метаноле происходит не только уменьшение площади ВЦМ в клетках метанотрофов, но имеют место качественные изменения структуры мембран, что может быть связано с изменением их функции (77).

Показано, что мембранная фракция М.теЛашса обладает активностью ряда ферментов энергетического метаболизма, включая ферменты С \-окисления. Фракция ВЦМ обладала более высокой активностью дегидрогеназ метанола, формальдегида, сукцината, НАДН, АТФазы и содержанием цитохромов Ь, с, а по сравнению с фракцией ЦМ. Обнаружена способность фракции мембран М.теШашса к окислительному фосфорилированию. Сопряженный с дыханием синтез АТФ наблюдали при окислении НАДН, сукцината, аскорбата + ТМФД и метанола. Рассчитанные отношения Р/О оказались довольно низкими, что свидетельствует о неэффективности окислительного фосфорилирования у метанотрофов. Следовательно, мембранная фракция М.теЛат-са обладает активностью ряда ферментов энергетического метаболизма и способна к окислительному фосфорилированию (40, 44, 45, 84).

Поскольку биохимическими методами не удалось разделить фракции цитоплазмы и содержимого везикул ВЦМ, для уточнения локализации ферментов энергетического обмена у М.тейшшса были дополнительно использованы цитохимические методы (Рйс.4). При этом оказалось, что МДГ и пероксидаза локализованы в пери-плазматической фракции и внутри везикул ВЦМ, тогда как ФДГ, сукцинатдегидроге-

наза и АТФаза обнаружены только внутри везикул ВЦМ. Напротив, НАДН-дегидро-геназа найдена в периплазматической фракции и на наружной стороне везикул ВЦМ. Следовательно, ВЦМ М.тейшиса функционально не являются продолжением цкто-плазматической мембраны. Если некоторые окислительные реакции могут быть связаны с цитоплазматической мембраной (дегидрогеназы метанола, формальдегида и НАДН обнаружены в периплазме), то синтез АТФ у М.теШашса происходит только в ВЦМ (судя по локализации АТФазы). С другой стороны, у М.теШашса все исследованные ферменты энергетического метаболизма локализованы либо" на внутренних мембранах, либо в пределах везикул ВЦМ, но не в цитоплазме. Не исключено, что в цитоплазме происходят процессы ассимиляции -соединений. ВЦМ в таком случае обеспечивают компартментацию анаболических и катаболических процессов (100).

Из полученных результатов следует, что ВЦМ метанотрофов - динамические структуры, содержание которых в клетках варьирует в зависимости от условий культивирования. Формирование ВЦМ у метанотрофов определяют процессы окисления С [-соединений и, прежде всего, СН4. При этом важнейшее значение имеют уровни субстратов ММО - СН4 и 02- Наличие ферментов энергетического метаболизма в ВЦМ и их способность осуществлять окислительное фосфорилирование свидетельствует о том, что метаболическая роль ВЦМ у метанотрофов связана с процессами преобразования энергии и синтезом АТФ. Можно полагать, что варьируя внутриклеточное содержание ВЦМ, эти бактерии регулируют интенсивность энергетических процессов при росте на метане.

Рис.4.Внутриклеточная локализация ферментов энергетического метаболизма у М.теШашса. 1-МДГ, 2-ФАДГ, 3-ФМС-зависимая ФДГ, 4-НАД-зави-симая ФДГ, 5-АТФаза, 6-сукцинат-дегидрогеназа (ФМС),7- НАДН-дегид-рогеназа. КС - клеточная стенка, ПП-периплазма, ЦМ-цитоплазмати-ческая мембрана.

Глава II. ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЕТИЛОБАКТЕРИЙ.

2.1. Выделение и идентификация метилобактерий. В процессе работы было выделено и охарактеризовано более 50 штаммов метилобактерий, использующих различные восстановленные ^-соединения (но не СН4) в качестве источников углерода и энергии. При идентификации многих изолятов возникли сложности, поскольку систематика метилобактерий не разработана, вследствие чего они (за исключением родов НурЬопнсгоЫит и АгЙ1гоЬас1ег) не представлены в 9-м издании определителя Берги (1984). Лишь недавно формально узаконены 4 рода грамотрицательных метилобактерий: МеШу1оЬасШиз (облигатные), МеШу1орЫ1и8 (ограниченно-факультативные), МеШу^Ьайепит (факультативные) и Methylophaga (морские метилобактерии). Для упорядочения таксономического положения штаммов метилобактерий, явно отличав-14

шихся от представителей указанных таксонов, необходимо было ввести новые родовые и видовые названия. С этой целью нами предложены 2 родовых и 18 видовых названий. В качестве примера приводим краткие описания двух новых родов грам-отрицательных метилобактерий.

Гено- и хемотаксономическими методами показана правомерность отнесения к новому роду Methylovorus 5 штаммов ограниченно-факультативных метилобактерий, способных расти на метаноле и глюкозе. Эти штаммы имеют высокий уровень ДНК-ДНК гомологии между собой (»50%), но проявляют низкую гомологию с типичными представителями ограниченно-факультативных метилобактерий рода Methylophilus и с облигатными метилобактериями рода Methylobacillus. По совокупности признаков представители рода Methylovorus занимают промежуточное положение между родами Methylophilus и Methylobacillus (104, 126, 130).

К новому роду Melhylomicrobium отнесены 3 штамма аэробных неспорообра-зующих подвижных бесцветных факультативно-метилотрофных бактерий с серино-вым путем, размножающихся делением, напоминающим почкование. Содержание ГЦ в ДНК 64-68 мол.%. Бактерии характеризуются присутствием цис-метилоктадецено-вой кислоты (cll-Mel8:lw7) в жирнокислотном составе клеток и низкими уровнями гомологии ДНК с известными представителями Methylobacterium, Hyphomicrobium и Pseudomonas (112).

2.2. Пути первичного и центрального метаболизма. Сравнительный анализ путей метаболизма метанола и метилированных аминов у метилобактерий разного таксономического положения выявил как общие черты, так и весьма существенные отличия, особенно в механизмах первичного окисления и ассимиляции этих С ¡-соединений.

Установлено, что большинство грамотрицательных метилобактерий окисляют метанол посредством дегидрогеназы, проявляющей активность с ФМС и, следовательно, содержащей пирролохинолинхинон в качестве кофермента. Единственным исключением оказался Pseudomonas esterovorus 24, у которого обнаружена слабая активность АО (128, 132). Напротив, у грамположительных метилобактерий найдена НАД-, зависимая МДГ (Bacillus methanolica), а у Mycobacterium methanolovorus фермент проявлял активность с искусственными акцепторами электронов типа МТТ и N.N-ди-метил-р-нитрозоанилин (131, 136).

Еще более разнообразными оказались пути окисления метилированных аминов (Табл.1). Так, гифомикробы окисляют ТМА до МА при участии дегидрогеназы (ФМС) и монооксигеназы (НАДФН), освобождающих две формальдегидных единицы, а третья образуется из МА в результате функционирования N-метилглутаматного пути с промежуточным синтезом ^-глутамилметиламида и N-метил-глутамата. Ами-нометильная группа последнего далее окисляется дегидрогеназой (ФМС) до СН2О и NH4 + с регенерацией глутамата, выступающего в качестве акцептора МА. Важно отметить, что активность специфических ферментов N-метилглутаматного пути гораздо выше у клеток, выращенных на средах с метилированными аминами. Следовательно, замена в С ¡-субстрате гидроксильной группы на аминную вызывает существенные изменения в первичном метаболизме гифомикробов и других метилобактерий, индуцируя синтез специфических ферментов N-метилглутаматного пути (11, 14-16, 32).

Использование метилированных аминов, связанное с первичным N-метилиро-ванием аминокислот или их кетоаналогов, до недавнего времени рассматривалось как весьма редкое явление, поскольку было констатировано только у Pseudomonas spp.

МА и MS. Нами обнаружено N-метилирование глутамата у Ps.methylica, Pseudomonas spp. 15, 20, 52, Hyphomicrobium vulgare ZV и 3, Brevibacterium sp. 24. Это указывает на достаточно широкое распространение реакций N-метилирования аминокислот у метилобактерий, использующих метилированные амины.

Наиболее распространенным способом использования МА, очевидно, является его прямое окисление до СН2О и NH4 + , катализируемое метиламиндегидрогеназой (ФМС). Этот механизм реализуют метилобактерии с различными путями С [-ассимиляции: сериновым (Methylobacterium, Methylomicrobium), РМФ (Methylobacillus, Ме-thylophilus, Methylovorus) и РБФ (Blastobacter). Следовательно, прямое окисление МА (дегидрогеназой или оксидазой) и N-метилглутаматный путь не связаны специфически с путями Ci-ассимиляции.

Таблица 1

Отличия в первичном метаболизме метилированных аминов у бактерий

Род Путь окисления Путь С j-ассимиляции

(CH3)3N CH3NH2 СН20

Methylobacterium ТМАДГ МАДГ Прямой Сериновый (ИЦЛ")

Hyphomicrobium ТМАДГ МГ Прямой Сериновый (ИЦЛ")

Methylomicrobium МАДГ Прямой Сериновый (ИЦЛ")

Arthrobacter TMAO МАО ДГФЦ РМФ (ФБФ)

Brevibacterium TMAO МГ ДГФЦ РМФ (ФБФ)

Mycobacterium ТМАДГ МАДГ Прямой РМФ (ФБФ)

Methylophilus ТМАДГ МАДГ ДГФЦ РМФ (КДФГ)

Methylobacillus МАДГ ДГФЦ РМФ (КДФГ)

Methylovorus МАДГ ДГФЦ РМФ (КДФГ)

Blastobacter ТМАДГ МАДГ Прямой РБФ (ФБФ)

Иные пути использования метилированных аминов обнаружены у АпЬгоЬа^ег 81оЫГогт15. Окисление ТМА до СН2О и N114 + происходит последовательно с промежуточным образованием К-окиси ТМА, ДМА и МА при участии соответствующих монооксигеназ (НАДФН) и деметилазы, а также аминоксидазы. В последнем случае, кроме СН2О и N114 + ' образуется Н202- Формальдегид под действием дегидрогеназ может частично окисляться через муравьиную кислоту до СО2, однако активности ФАДГ и ФДГ низки. По-видимому, большая часть формалъдегидных единиц используется на биосинтетические и энергетические нужды посредством реакций РМФ-цик-ла. Его ассимиляционная ветвь регенерирует акцептор СН2О (Ру5Ф) в серии ТА/ТК реакций и образует фосфотриозы при участии ФБФ-альдолазы. Диссимиляционная ветвь РМФ-цикла осуществляет циклическое окисление СН2О до СО2 и, судя по высокой активности ГФД и ФГД, участвует в поддержании пула НАД(Ф)Н, необходимого для оксигенирования ТМА и ДМА, а также для обеспечения энергетических и биосинтетических потребностей клеток. Дальнейший метаболизм триоз может быть связан с фосфосериновым путем, о функционировании которого у А^оЬ^огшв свидетельствует наличие соответствующих ферментов. Но более существенно для конструктивного метаболизма артробактерий превращение фосфотриоз через (фос-16

фо)пируват, ацетил-КоА и далее через ЦТК и глиоксилатный шунт в органические кислоты и аминокислоты (19).

Наряду с рассмотренными отличиями, связанными с видовыми и штаммовыми особенностями, между путями первичного и центрального метаболизма Ci-соедине-ний у метилобактерий наблюдается определенная корреляция. Для бактерий с сери-новым путем характерно прямое окисление СН2О через формиат, тогда как у метилобактерий с РМФ-путем обычно доминирует циклическое окисление CII2O. Реализация у ряда метилобактерий с РМФ-путем прямого и циклического окисления СН2О, возможно, объясняется дивергентной эволюцией метилотрофов. Судя по активностям ФАДГ и ФДГ, у многих метилобактерий с РМФ-путем прямое окисление СН2О постепенно утратило свое значение. Соответственно, у метилобактерий с РМФ- и РБФ-путями ферменты углеводного метаболизма играют существенную роль в регенерации первичного акцептора СН2О или СО2 (Ру5Ф или Ру1,5Ф2> и образовании НАД(Ф)Н. Напротив, метилобактерии с сериновым путем имеют низкие активности ферментов углеводного метаболизма. Кроме того, у многих из них нет ПДГ, чью роль поставщика активированных ацетильных единиц для ЦТК выполняет МЛ. Что касается ЦТК, то он выполняет преимущественно анаболическую функцию, в особенности при метилотрофном росте бактерий, поскольку они генерируют НАД(Ф)Н и энергию в основном в путях линейного или циклического окисления метанола и метилированных аминов (24, 32).

Уровни фиксации СО2 у метилобактерий несколько выше, чем у метанотро-фов. При метилотрофном росте бактерии, реализующие РБФ-путь, образуют из СО2 более 80% углерода клеток (остальная часть углерода ассимилируется на уровне СН2О и формиата). Бактерии с сериновым путем образуют около 50%, а бактерии с РМФ-путем - до 15%. Метилобактерии отличались от метанотрофов большим разнообразием карбоксилаз, в частности, наличием пируваткарбоксилазы, которая более активна у бактерий с РМФ-путем (35). Количество ассимилированной бактериями углекислоты было существенно ниже при гетеротрофном росте (2-4%) (73, 93).

Таким образом, СО2 является дополнительным источником углерода, необходимым для всех метано- и метил отрофных бактерий. Однако масштабы ассимиляции СО2 значительно варьируют и определяются гено- и фенотипическими особенностями метилотрофов, т.е. типом метаболизма и условиями выращивания, в частности, природой основного источника углерода и энергии. Это объясняется тем, что СО2 играет различную роль в метаболизме данных бактерий. Так, у бактерий с РБФ-пу-тем фиксация СО2 на С5- и С3- акцепторах является основным механизмом вовлечения С ¡-соединений в конструктивный обмен, поэтому они способны ассимилировать максимальное количество С02- Бактерии с сериновым путем фиксируют СО2 гораздо менее интенсивно, поскольку образуют триозы из двух молекул СН2О и одной молекулы СО2, т.е. по крайней мере треть углерода их клеток происходит из углекислоты. Наименьшим уровнем фиксации СО2 при метилотрофном росте обладают бактерии с РМФ-путем, у которых СО2 не участвует в первичном синтезе триоз и ассимилируется анаплеротически, т.е. исключительно для восполнения пула оксало-ацетата и для обеспечения биосинтетических функций ЦТК, разомкнутого у этих бактерий на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы. Минимальные уровни фиксации СО2 бактериями при гетеротрофном росте связаны, вероятно, с тем, что в этом случае катаболические функции ЦТК явно преобладают над анаболическими и, сле-

довательно, потребность в СО2 для регенерации оксалоацетата крайне мала (80).

Энзимологические данные указывают также на наличие у метилобактерий определенной связи ферментов ассимиляции NH4 + с путями Ci-метаболизма. Для бактерий с сериновым и РБФ-путями характерно восстановительное аминирование пирувата и/или глиоксилата. Кроме того, у них функционирует глутаматный цикл (ГС/ГОГАТ). Метилобактерии с РМФ-путем ассимилируют NH4 + посредством глу-таматдегидрогеназы (Methylobacillus, Arthrobacter) или через глутаматный цикл (Methylophilus, Methylovorus) (57, 80).

2.3. Использование полиуглеродных соединений облнгатнымн метилобактериями.

Влияние Сп-соединений на рост облигатных метилобактерий проявлялось в значительных метаболических изменениях. Так, при росте Methylobacillus flagellatum на метаноле в присутствии ацетата последний транспортируется в клетки и посредством ацетил-КоА синтетазы превращается в ацетил-КоА, который активирует дегидро-геназы ЦТК, генерирующие НАДН. При этом усиление активности НАДН-оксидазы и наличие фосфорилирования при окислении НАДН свидетельствуют об увеличении вклада гетеротрофного способа получения энергии. Следовательно, ацетат может быть дополнительным источником энергии. Кроме того, он служит дополнительным источником углерода, поставляя метаболиты ЦТК для анаболических процессов. Несмотря на это, рост бактерий на метаноле в присутствии ацетата в значительной степени подавлен, вероятно, вследствие репрессии МДГ, ФДГ, ГФС, ГФД и ПДГ. Показано, что ацетат может непосредственно ингибировать активность некоторых ферментов, например МДГ, или, поступая в окислительную ветвь ЦТК, способствует избыточному накоплению а-кетоглутарата, также ингибирующего ряд ферментов С1-метаболизма (МДГ, ГФС) (127).

При росте M.flagellatum на метаноле в присутствии глюкозы последняя незначительно потребляется клетками и не увеличивает урожай. Вместе с тем глюкоза может вовлекаться в метаболизм изучаемого вида после фосфорилирования гексокина-зой и далее использоваться по пентозофосфатному пути или при участии фосфокето-лазы и рибулозо-5-фосфатэпимеразы с образованием ацетил-КоА, минуя ПДГ. Стимулирование глюкозой некоторых дегидрогеназ ЦТК и ФГД, а также НАДН-оксидазы, вероятно, обеспечивает клетки энергией, получаемой от окисления дополнительного количества НАДН по гетеротрофному пути. В присутствии глюкозы уменьшается эффективность фосфорилирования ряда дыхательных субстратов, а также ослабляются анаболические процессы, связанные с активностью ГФС. В целом такие метаболические перестройки, вероятно, равноценны, поэтому прироста биомассы не происходило (127).

В отличие от ацетата и глюкозы добавление малата в среду с метанолом приводило к небольшому увеличению урожая клеток. Это обусловлено тем, что малат активирует не только ферменты ЦТК, но также ферменты прямого окисления метанола и РМФ-пути. Кроме того, изучаемый штамм способен синтезировать из малата аспартат (через оксалоацетат), глицин (через глиоксилат), глутамат (через цитрат) и другие аминокислоты, что снижает энергетические затраты по сравнению с их синтезом de novo из углерода метанола, что также может повышать выход биомассы. Следовательно, малат способен служить доцолнительным источником углерода и энергии (127).

При добавлении меченных Сп-соединений к суспензиям клеток M.methanolovo-

rus было обнаружено, что Р14С -глюкоза, -ГлбФ, р14С-фруктоза, р'^С-аланин и Р14С -аспартат не ассимилировались даже при наличии метанола в среде. Напротив, З-'^С-пируват и 2-'4С-атт,етат включались клетками (96).

Клетки Methylobacillus methanolovorus активно окисляли метанол, формальдегид, несколько слабее - этанол и формиат. В то же время метиламин, глюкоза, фруктоза, рибоза, ГлбФ, 6-фосфоглюконат, пируват, ацетат, цитрат и аланин не окислялись. Напротив, цитрат, а-кетоглутарат (в меньшей степени глицин, метионин, ксилоза и ацетат) ингибировали окисление бактериями метанола. Степень подавления дыхания клеток заметно возрастала после преинкубации с Сп-соединенияМи. Это указывает на ограниченную проницаемость клеточной мембраны данных бактерий для Сп-соединений, либо на ингибирующее действие продуктов их метаболизма (96).

Важно отметить, что глицин, метионин, ацетат и а-кетоглутарат подавляли не только рост и дыхание клеток, но и активность МДГ. Цитрат и а-кетоглутарат ингибировали также ГФС и ГФД. Указанные соединения не влияли на активность ФГД, а цитратсинтазу слабо ингибировал только а-кетоглутарат. Следовательно, ингибирова-нне Сп-соединениями роста и дыхания облигатных метилобактерий может проявляться уже на первых этапах С ¡-метаболизма, а именно на уровне МДГ и ГФС (127).

Энзимологический анализ выявил отсутствие у M.methanolovorus ряда ферментов гликолиза, глюконеогенеза, ЦТК и глиоксилатного шунта: 6-ФФК, ФБФазы, СБФазы, пируваткиназы, ФЕП-карбоксилазы, ФЕП-синтетазы, пируватфосфатдики-назы, а-кетоглутаратдегидрогеназы, K'UI и MC. Активность гексокиназы явно недостаточна для роста на гексозах. Окисление глюкозы до глюконата не происходит ввиду отсутствия глюкозодегидрогеназы. Энзимологические данные суммированы в виде схемы путей первичного и промежуточного метаболизма у M.methanolovorus с указанием основных энзиматическпх блоков (Рис.5). В целом обнаруженные нами особенности в организации центрального метаболизма облигатных метилобактерий и мета-нотрофов I типа совпадают, что указывает на общую биохимическую основу их строгой зависимости от Ci-соединений (92).

Итак, облигатные метилотрофы характеризуются сильно редуцированным набором ферментов центрального метаболизма. У них, как правило, цикл Кребса разо-мхнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы, не действует глиоксилатный шунт, отсутствуют или крайне низки активности ферментов гликолиза. В итоге ограничивается возможность окисления и ассимиляции Сп-соединений. Поскольку облигатные метилотрофы образуют восстановительные эквиваленты в результате прямого или циклического окисления Ci-соединешш при участии специфических ферментов, присутствие Сп-соединений либо не оказывает существенного влияния на эти процессы, либо блокирует один из этапов Ci-окисления. Узкая специализация энергетического метаболизма облигатных метилотрофов подтверждается также фактом стимуляции метанолом ассимиляции клетками пирувата и ацетата. Все перечисленные факты указывают на то, что облигатные метилотрофы отличаются от факультативных по целому ряду функциональных признаков, включая транспорт, энергетический и конструктивный метаболизм, а также регуляцию этих процессов (92,96).

По нашему мнению, концепция "множественных энзиматических дефектов" составляет биохимическую основу облигатной метилотрофии и находится в соответствии с результатами опытов по превращению факультативных метилотрофов Pseudomonas sp. AMI (Bolbot, Anthony, 1980) и Hyphomicrobium sp. X (Dijkhuizen et al,

1984) в облигатные и наоборот. Из этих опытов могло создаться впечатление, что только удаление (или внесение) пируватдегидрогеназы или а-кетоглутаратдегидроге-назы определяет степень зависимости данных метилотрофов от С1-субстратов. Однако известно, что оба исходных штамма уже были ограниченно-факультативными ме-тилотрофами, т.е. росли всего на нескольких Сп-субстратах из-за отсутствия целого ряда ферментов гетеротрофного обмена. Не удивительно поэтому, что на столь редуцированном энзиматическом фоне удаление (или добавление) еще одного важного фермента оказывало существенное влияние на спектр ростовых субстратов указанных метилотрофов. В принципе, известны примеры бактерий, дефектных по ПДГ или а-кетоглутаратдепщрогеназе, но сохранивших способность к гетеротрофному росту. По-видимому, единичный метаболический блок может компенсироваться альтернативными или анаплеротическими путями (92,96).

(ФМС) СН30Н-

(ФМС) (ФМС)

- снхо —нсоон —

¿Ри(улозо-5ч

.б-ф-ыюконат

___ {'НАД(ф)и З-Гти.

| Глюкоза [——Глюкто-б-ф /

ч У

к 2- Кето -З-виокси- V /

6-сроарослюконат ^ Фруктоза-б-ф

Пшцеральдешд-З-ф

уоосфоиицерат

\Ацетат\

Оксалоацстат

--------

Цитрат Глиоксилат

( ' Фумарат

цис-Аканитат / j

Изоцитрат^-------—Сукиинат

ХН3

Глутаиат-^-

НАД(Ф)\_1

■V

НАЛ(Ф)Н

«1

Л1

«<- Кетоглутарат

Рис.5. Пути первичного и промежуточного метаболизма метанола у М.теШапо^уопк. 20

В свете вышеизложенного уместен вопрос о происхождение облигатных мети-лотрофов. Наиболее логичным представляется их появление в результате длительной специализации энзиматического аппарата некоторых гетеротрофных бактерий на преимущественное использование С i-соединений и необратимой утраты механизмов синтеза и регуляции некоторых ферментов гетеротрофного обмена. Факультативные метилотрофы в отличие от облигатных сохранили в большей или меньшей степени механизмы синтеза и регуляции ферментов гетеротрофного метаболизма. Ответ на вопрос о происхождении и эволюционных связях облигатных и факультативных ме-тилотрофов может также дать сравнительный анализ их геномов, в частности, нук-леотидных последовательностей ДНК и РНК. Полученные нами совместно с другими исследователями данные относительно размеров геномов и степени гомологии нукле-отидных последовательностей 5S рРНК указывают на таксономическую обособленность облигатных метилобактерий от факультативных, а также от метанотрофов. Это в свою очередь свидетельствует в пользу их полифилетического происхождения. 2.4.Регуляция днсснмиляционного гексулозофосфатного цикла. Схема цикла предложена на основании энзимологических данных (Colby, Zatman, 1975). Вскоре циклическое окисление СН2О до СО2 было подтверждено нами в изотопных опытах на экстрактах разных метилобактерий (-20). Эта последовательность включает конденсацию СН2О с Ру5Ф, изомеризацию образовавшегося гексулозо-6-фосфата через ФрбФ до ГлбФ и окисление последнего через 6-фосфоглюконат до Ру5Ф и С02- В итоге окисление одной молекулы СН2О дает две молекулы НАД(Ф)Н. Степень сопряженности дкссимиляционной и ассимиляционной ветвей различна у бактерий, реализующих разные варианты РМФ-пути. У метилобактерий, осуществляющих расщепление гексозофосфатов по пути Энтнера-Дудорова (Methylomonas, Methylophilus, Ме-thylovorus, Methylobacillus, Ps.oleovorans), в точке разветвления находится 6-фосфоглюконат; у бактерий с гликолитическим типом распада фосфогексоз (Acetobacter, Nocardia, Arthrobacter) на этом метаболическом перекрестке стоит ФрбФ. Логично полагать, что у метилобактерий первой группы специфическим ферментом ДГФЦ является только ФГД, а у второй, кроме того, ГФД и ГФИ. Различия должны, очевидно, отражаться и на характере регуляции активности ферментов ДГФЦ. Для проверки этого предположения были исследованы свойства высокоочищенных ГФД и ФГД Ps.oleovorans и A.globiformis (Табл.2).

Физико-химические свойства гомологичных ферментов ДГФЦ у данных метилобактерий заметно отличаются, тогда как общим регуляторным свойством является иншбирование активности восстановленными пиридиннуклеотидами и ЛТФ, что в принципе характерно для НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Другие испытывавшиеся соединения не влияли на активность ГФД Ps.oleovorans и ФГД A.globiformis. Напротив, спектр эффекторов ФГД Ps.oleovorans и ГФД A.globiformis гораздо шире (39,81).

Характер регуляции ДГФЦ у разных метилобактерий согласуется с путями их метаболизма (Рис.6). ФГД является основной регуляторной точкой цикла у бактерий, реализующих вариант Энтнера-Дудорова РМФ-пути, что коррелирует с ключевой ролью этого фермента в ДГФЦ у данной группы бактерий. Поскольку остальные стадии полностью совпадают в ассимиляционной и диссимиляционной ветвях РМФ-пути, специфическая регуляция ДГФЦ у Ps.oleovorans может осуществляться только на уровне ФГД.

Таблица 2

Свойства дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата у метилобактерий с разными типами распада фосфогексоз

Характеристики Pseudomonas oleovorans Arthrobacter globiformis

ГФД . ФГД ГФД ФГД

Мол.масса, кД 100 110 142 229

Число субъединиц 2 2 2 4

Оптимум рН 8,5 8,0 7,5 7,5

Кофакторы НАД (Ф) НАДФ НАДФ НАДФ

Кт, нМ 65 (НАД Ф) 55 (НАД Ф) 16 (НАДФ) 37 (НАДФ)

28(Гл6Ф) 15 (ФГ) 26(Гл6Ф) 39 (ФГ)

Ингибиторы АТФ, АТФ, АТФ,НАД (Ф) Н АТФ,

НАД(Ф)Н НАД(Ф)Н, Ру5Ф,Фр6Ф, ФБФ,

Ру5Ф,ФБФ, а-кетоглутарат, НАД(Ф)Н

ФрбФ фосфоглицерат

Активаторы - - ацетил-КоА -

У бактерий, реализующих гликолитический вариант РМФ-пути, разветвление путей ассимиляции и диссимиляции происходит наболее ранней стадии: именно ГФД является основной мишенью метаболической регуляции. ФГД играет в данном случае вспомогательную роль, замыкая ДГФЦ и предотвращая накопление промежуточного продукта, 6-фосфоглюконата.

Таким образом, регуляция ДГФЦ у метилобактерий, реализующих различные варианты РМФ-пути, осуществляется в разных точках. Тем не менее регуляторные механизмы во всех случаях довольно близки. В первую очередь регуляция ДГФЦ осуществляется с помощью высокоэнергетических соединений - АТФ и НАД(Ф)Н. Повышение внутриклеточной концентрации этих метаболитов приводит к снижению скорости циклического окисления СН2О. Соответственно, повышается доля СН2О, используемого клеткой на биосинтетические нужды. Поскольку в процессах биосинтеза расходуются АТФ и НАД(Ф)Н, их внутриклеточные уровни постепенно снижаются. При этом снимается ингибирование ДГФЦ и скорость окисления СН2О возрастает. Следовательно, ингибирование ферментов данного цикла высокоэнергетическими метаболитами предотвращает нерациональное окисление ростового субстрата и способствует его более эффективному использованию на нужды биосинтеза. Сходными причинами может объясняться и ингибирование ключевых ферментов ДГФЦ сахарофосфатами, при окислении которых образуются НАД(Ф)Н и АТФ. Вместе с тем регуляция ДГФЦ у разных метилобактерий имеет ряд особенностей. Представляет интерес ингибирование этого процесса а-кетоглутаратом и активирование аце-тил-КоА. Отличия между Рв.о^оуогам и А^1оЫСопш5 обнаружены не только на этапе первичной ассимиляции СН2О, но и в центральных метаболических путях. Ввиду отсутствия а-кетоглутаратдегидрогеназы у Рз.окоуогак ЦТК разомкнут и выполняет исключительно биосинтетическую функцию. Напротив, у А^1оЫ(Ъгт1$ 22

функционирует полный ЦТК, энергетическая роль которого мои:ет возрастать при повышении внутриклеточной концентрации а-кетоглутарата. Соответственно, уменьшается потребность в циклическом окислении СНоО и, видимо, происходит ингибирование данного процесса. По мере расходования а-кетоглутарата усиливается значение ДГФЦ.

Активность ГФД А.{>1оЫ&эгтт8 возрастает в. присутствии ацетил-КоА, являющегося центраболитом биосинтеза. В то же время на биосинтетические потребности расходуются восстановленные пиридиннуклеотиды, в первую очередь НАДФН, основным источником которого служит ДГФЦ. Его роль при повышении внутриклеточной концентрации ацетил-КоА может существенно" возрастать. По мере расходования ацетил-КоА происходит уменьшение скорости циклического окисления СН2О.

СН3ОН

Клеточная стенка

Периплазма

"МемОрана

СН3ОН

|мдг

Цитоплазма

сн2о-

ГФС,

со2

Ру-5-Ф

НАД(Ф)Н

-нсоон-^сог

Гу-6-Ф

г—©—

_ГЧ_ АТФ

)

\-НАД(Ф)Н ДГ^-НА

КДФГ

Рибоэо-5-Ф Фруктоэо-1, 6-Ф2 Фосфоенолпируват

АТФ. АДФ-Фр1, 6-4>2

-ф.-------

Фруктоэо-1, 6-Ф2

З-Ф-Глицерат

еб-Кетоглутарат

|Адетил-КоА

Рис.6. Регуляция активности ферментов ДГФЦ у метилобактерий (74, 95). Итак, у метилобактерий с РМФ-путем основными регуляторными точками ДГФЦ являются ГФД (гликолитический распад фосфогексоз) или ФГД (вариант Энтнера-Дудорова). Интенсивность циклического окисления СН2О контролируется уровнями АТФ, НАД(Ф)Н и некоторых метаболитов.

Глава Ш.ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ.

3.1. Пути первичного и центрального метаболизма метанола. Со времени выделения первых штаммов метилотрофных дрожжей исследования ряда лабораторий, включая нашу, привели к расшифровке путей первичного и промежуточного метаболизма метанола, создав основу для изучения принципов их регуляции (Рис.7) (90).

Установлено, что в отличие от метилотрофных бактерий дрожжи обладают специфическими внутриклеточными органеллами (пероксисомами), в которых метанол окисляется АО с образованием СН2О и Н2О2. последняя разлагается каталазой. СН2О окисляется НАД- и GSH-зависимой ФАДГ до формиата и далее ФДГ до С02-СН2О может также восстанавливаться до метанола под действием НАДН-зависимой формальдегидредуктазы. Однако физиологическое значение и природа такой активности были не ясны.

У метилотрофных дрожжей функционирует особый ассимиляционный путь, получивший название диоксиацетонового или ксилулозомонофосфатиого цикла. Первая реакция данного цикла - между СН2О и Ксу5Ф - катализируется пероксисомным ферментом, специфической транскетолазой (диоксиацетонсинтазой) с образованием ГАФ и ДОА. Последний фосфорилирустся диоксиацетонкиназой в ДОАФ, который служит источником триоз для биосинтеза различных компонентов клеток или, конденсируясь с ГАФ в альдолазной реакции, дает ФБФ. Последующий гидролиз -ФБФ под действием ФБФазы приводит к образованию ФрбФ, участвующего вместе с ГАФ в реакциях перестроек и регенерации Ксу5Ф.

Метаболическая судьба первых продуктов ассимиляции углерода метанола у дрожжей - ДОА и ГАФ - различна. ДОА после фосфорилирования в ДОАФ участвует в регенерации акцептора, а ГАФ окисляется в гликолитической последовательности до пирувата и далее в форме ацетил-КоА направляется в цикл Кребса.

Значение цикла Кребса в энергетическом обмене дрожжей, по-видимому, ограничено в метилотрофных условиях, поскольку активности большинства входящих в его состав ферментов ниже, чем при росте на Сп-субстратах. Ввиду высоких активностей ФАГД и ФДГ можно ожидать, что у дрожжей (как и у метилотрофных бактерий) цикл Кребса не является основным источником НАДН при росте этих организмов на восстановленных С ¡-субстратах. Это заключение согласуется с различиями в уровнях фстивности разных форм глутаматдегидрогеназы - фермента, сопряженного с ЦТК. Активность НАД(Ф)-зависимой "катаболической" глутаматдегидрогеназы незначительна, тогда как НАД(Ф)Н-зависимая активность, катализирующая отток а-ке-тоглутарата на биосинтетические процессы, гораздо выше, особенно у выращенных на' метаноле клеток. Совокупность энзимологических данных подтверждает вывод о слабой сомкнутости цикла Кребса на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы и его преимущественно биосинтетической роли при метилотрофном росте дрожжей (38, 43).

Восполнение С4-интермедиатов ЦТК у дрожжей осуществляется посредством реакций Сз-карбоксилирования и глиоксилатного шунта, однако их вклад различен при использовании клетками метанола и глюкозы. Интенсивная фиксация 14С02 клетками Candida methylica в присутствии метанола с первичным образованием 24

аспартата и малата указывала на важную роль реакций ,:арбогсилиро'"ания пкрувата или ФЕП. Из данных энзимологического анализа следует, что ресинтез оксалоацетата обеспечивается в основном пируваткарбоксилазой, которая гораздо более активна у клеток, использующих метанол. Напротив, у клеток, использующих глюкозу, заметно выше активности специфических ферментов глиоксилатного шунта (ИЦЛ и МС). Это свидетельствует о его доминирующей роли в анаплеротическом синтезе оксалоацетата по сравнению с карбоксилированием пирувата и ФЕП. В то же время необходимо учесть, что соотношение указанных анаплеротических реакций, так же как и / других элементов метаболизма, варьирует в зависимости от различных факторов и, как правило, сопровождается соответствующими изменениями в ультраструктуре клеток (4,43).

сн,ом

ФАД, 02

М:

НАД НАД -»г НАД НАД »г Н С Н 0 ^ ■ НСООИ ** СО:

_ Ксилулоза-5Р—

ДиокспацЬтоЯ АТФ

С5Н

/1йгРц5улазо-1Ф

^У/т^0""" У,"™* Мг ДижиацеЬон- Глицералъдегид-Ф иЛ,!К) \_НАДФ

бФ-Глюконат хтма'Ш'II

\^НАДФ Ъг РУт ' . гЫосраглицерат • ФасфооксипируВат

\НАДФ I /

^Глюкоза -6Ф фруктазо-бп

• кн,

ФосфоенолпируВат Фоаросерим

I Пиру Ват V . Алании Серин

Оксалоацетат I

/ '

Малат I

фумарат \

Сукцинит '

и„ НАА' нг

"у1 Ч' НАД

Глутамат « /

Цитрат

цис-Аконитат ГлиокЬилат |

Нзоцитрат С02 НАД(Ф) надср)н2

.> изоци/

А1

А НА*

^нм

а -Кешаглутарат

Рис.7. Пути первичного и промежуточного метаболизма метанола у дрожжей

С.шеШуНса (38)

Характерным примером такой структурно-функциональной перестройки является рост дрожжей на метаноле в условиях разной обеспеченности СС>2- Так, увеличение выхода биомассы С.ЬоМшН КД1 при одновременном использовании метанола и

экзогенного бикарбоната обусловлено снижением активности ряда ферментов С j-окисления, что коррелирует с изменениями структуры пероксисом. В итоге уменьшается холостое окисление метанола и усиливаются биосинтетические процессы, в особенности ассимиляция СО2, о чем свидетельствует возрастание (в 5-10 раз) активности карбоксилаз пирувата и ФЕП. Следовательно, различная-обеспеченность мети-лотрофов СС>2 является важным регулирующим фактором и представляет интерес для их культивирования (27,49).

Энзимологический анализ выявил у изучаемых дрожжей фосфоксипируватре-дуктазу и фосфосеринфосфатазу - ферменты, участвующие в биосинтезе серина, причем их уровни несколько выше у клеток, выращенных на глюкозе, чем на метаноле. Если активность НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы существенно выше у ме-тилотрофно выращенных клеток, то НАДН-зависимая форма фермента, напротив, более активна при росте дрожжей на глюкозе. Активность аланиндегидрогеназы (НАДФ) невысока и найдена только у клеток, выращенных метилотрофно (38,43). 3.2.Регуляция путей первичного метаболизма метанола. Поскольку формальдегид весьма токсичен и находится на разветвлении путей первичного окисления и ассимиляции метанола, логично возникали два вопроса: 1) как концентрация СН2О поддерживается в клетках дрожжей на нетоксичном уровне и 2) как регулируется распределение СН2О на процессы окисления и ассимиляции. Для ответа на эти вопросы: -оценивали скорости окисления и ассимиляции клетками '^С-метанола; -определяли уровни аденин- и пиридиннуклеотидов;

-выясняли роль GSH, который способен спонтанно взаимодействовать с СН2О, образуя нетоксичный аддукт (S-гидроксиметилглутатион, ГМГ); - исследовали свойства ферментов, связанных с метаболизмом СН2О. Эту серию опытов проводили с культурой метилотрофных дрожжей C.búidinii КД1, выращенной в периодическом режиме.

При увеличении начальной концентрации метанола в среде (0.1-5%) происходило падение активности АО (от 150 до 80 имоль.мин"' • мг белка"!) И) напротив, возрастала активность АДГ (от 20 до 130 нмоль • мин~1 • мг белка-'), а также уровни СН2О и GSH. Тенденция к стабилизации уровня экзогенного СН2О объясняется тем, что понижение активности АО ограничивает скорость образования СН2О. С другой стороны, при повышении уровня GSH возрастает и концентрация ГМГ (субстрата ФАДГ). Соответственно, увеличивается скорость окисления СН2О до С02-

Увеличение активности АДГ приводит к активизации футильного цикла (АО + АДГ), действие которого может проявляться in vivo. Так, при добавлении 30 мМ СН2О к. суспензии клеток дрожжей наблюдали постепенное накопление метанола в среде (до 5 мМ). По мере, уменьшения уровня СН2О концентрация метанола также падала до нуля. При анализе культуры, растущей в периодическом режиме на возрастающих концентрациях метанола, обнаружена аналогичная синхронность в уровнях СН2О и GSH, которая совпадала с изменениями активности ФАДГ. Следовательно, GSH является не только косубстратом ФАДГ, но и своеобразной ловушкой СН2О.

Показано, что в динамике роста дрожжей на метаноле уровни адениннуклео-тидов (АТФ, АДФ, АМФ) изменяются координированно, а уровни пиридиннуклеотидов (НАД и НАДН) - реципрокно. Отмечена обратная зависимость между скоростью окисления дрожжами метанола до СО2 и концентрациями АТФ и НАДН при культивировании на средах с возрастающими исходными концентрациями спирта. Обнару-26

женная при этом стабилизация уровня СН2О осуществляется снижение»! скорости его образования АО и усиленным окислением до СО2 дегидрогеназами формальдегида и формиата. Понижение уровня избыточного ИАДН происходит в результате функционирования футильного цикла (АО + АДГ) (79,85).

На основании полупенных данных предлагается следующая модель поддержания внутриклеточной концентрации СН2О на нетоксичном уровне у метилотрофных дрожжей. Образующийся из метанола СН2О, с одной стороны, негативно контролирует уровни и активности АО и ДОАС, с другой - стимулирует синтез GSH, что приводит к увеличению уровня ГМГ и ускорению его распада под действием ФАДГ. При достаточно высохих концентрациях СН2О, превосходящих внутриклеточный пул GSH, избыточный формальдегид может восстанавливаться АДГ до метанола или выводиться из клеток (85,95).

3.3.Регуляция ферментов диоксиацетонового цикла. Основные свойства этих ферментов приведены в Табл.3. ДОАС содержит тиаминпирофосфат в качестве простети-ческой группы. Фермент катализирует перенос гликольальдегидного фрагмента от Ксу5Ф на СН2О. Для ДОАС характерна крайняя нестабильность in vitro и чувствительность к реагентам на SH-группы (ПХМБ, N-этилмалеимид). Наряду с пониженным оптимумом рН-активности эти свойства ДОАС отличают данный фермент от ТК пекарских дрожжей. Нестабильность ДОАС, по-видимому, обусловлена наличием реакционноспособных SH-групп; существенных для проявления активности фермента. Следует отметить, что СН2О и Ксу5Ф дестабилизируют фермент. СН2О также ингибирует ДОАС (К; = 8,2 мМ), причем инглбирующий эффект усиливается и становится кооперативным после кратковременной преинкубации ДОАС с СН2О. Коо-перативность в данном случае вызвана наложением двух типов взаимодействия СН2О с ферментом - ингибированич и инактивации. Возможно, аналогичная картина наблюдается in vivo при метилотрофном росте дрожже":. Известно также, что GSH реагирует с СН2О, образуя ГМГ, константа равновесия (Kj) равна 1,2 шМ (Uotila, Koi-vusalo, 1974). Ингибирование ДОАС глутатионом путем образования ГМГ по форме

■Таблица 3

Основные свойства ферментов диоксиацетонового цикла у дрожжей Candida boidinii КД1, выращенных на метаноле

Характеристики

ДОАС

ДОАК

ФБФаза

Молекулярная масса, кД Количество субъединиц рН-оптимум активности Изоэлектрическая точка Кофакторы

6,8-7,1 7,1

Tn®,Mg2+ •

GSH СН20(0,5) Ксу5Ф(0,35)

155 2

1?9 2

7,5-8,5

4,6 Mg2 +

209 2-4 7,5-8,5

5,2 Mg2 +

Ингибиторы Km, мМ

АДФ,АТФ,М82 + ДОА(О.ООб) MgAT®(0,35)

АМФ.ФБФ ФБФ (0,003) СБФ(0,08)

соответствует конкурентному типу. Константа ингибирования (К; = 1,5мМ) близка Kj, что подтверждает выдвинутое предположение. Наши результаты согласуются с представлениями to роли ДОАС в первичной ассимиляции СН2О в триозы, в то время как ТК участвует в основном в перестройках сахарофосфатов (50,51).

Зависимость скорости реакции, катализируемой ДОАК, от концентрации MgAT<I> является гиперболической, Кт = 0,35 мМ. Однако при анализе этой зависимости выявлено отклонение функции у/[s] от гиперболы. АДФ. АТФ и Mg2 + инги-бируют активность фермента. Двухфазная кинетика v/ [АТФ] in vitro возникает в результате действия Mg2 + как бесконкурентного ингибитора. По мере насыщения фермента субстратом степень ингибирования возрастает, но концентрация самого ингибитора уменьшается. АТФ, действуя как конкурентный ингибитор, вызывает появление сигмоидной кривой на графике v/ [Mg2 + ], поскольку степень ингибирования и

СН3ОН

, i

сн2о

со.

НАД НАДН

Цитоплазма G-SH

СН4ОН S *сн2

ГАФ' ДОА.

Пероксисома

Н+

„сн2о

Кс-5-Ф«Ф-

СО

__НАДН

----АТФ

Ф-6-Ф

АМФ

-у А » Ф-1. 6-Ф2

Mg АТФ -;Mg АД^

М&АТФ

Биосинтез

Фя

Рис.8. Регуляция активности ферментов первичного метаболизма метанола у

дрожжей

концентрация данного ингибитора уменьшаются пропорционально увеличению концентрации комплекса М{»АТФ (60).

Свойства ФБФазы из клеток, выращенных на меганоле или глюкозе, примерно одинаковы. Фермент активен с ФБФ и СБФ. АМФ ингабирует активность фермента по бесконкурентному типу. Электрофоретическим анализом ФБФазы из дрожжей, выращенных на метаноле, этаноле или глюкозе, обнаружены две формы фермента. Менее подвижная форма преобладает у клеток, выращенных на метаноле и этаноле, более подвижная - у клеток, выращенных на глюкозе. С использованием БОБ-диск-электрофореза показано, что у дрожжей, выращенных на метаноле, присутствует ФБФаза с Мг 46 кД (А-форма), также в минорных количествах присутствуют два белка с Мг 40,7 и 41,7 кД, условно обозначенных как В-форма. Напротив, препарат ФБФазы из дрожжей, выращенных на глюкозе, представлен только В-формой. Можно полагать, что форма В возникает из формы А в результате индуцируемого глюкозой ограниченного протеолиза. В целом свойства ФБФаз С.Ьо!Шпм и других дрожжей близки (95).

Полученные данные позволили предложить интегральную модель регуляции первичного метаболизма метанола у дрожжей (Рис.8). Ее основные положения:

1) ОЭН поддерживает баланс свободного и связанного СН2О, стимулируя его окисление до СО2 дегидрогеназами формальдегида и формиата;

2) Ферменты первичного окисления и ассимиляции метанола находятся под ингиби-торным контролем энергетических эквивалентов, а именно: ФАДГ и ФДГ (НАДН, АТФ), ДОАК (АТФ, АДФ) и ФБФаза (АМФ). ДОАК также, вероятно, положительно контролируется уровнем М§АТФ.

Итак, у дрожжей пути первичного метаболизма метанола функционируют в соответствии с балансом расходования и синтеза энергетических эквивалентов. Это обеспечивает энергетическую регуляцию процессов окисления и ассимиляции метанола. Кроме того, существенное влияние на скорость метаболизма метанола могут оказывать уровни СН2О и вБИ.Функционирование футильного цикла (АО + АДГ) также оказывает влияние на стехиометрию распределения СН2О на процессы первичного окисления и ассимиляции (90,95).

В заключение кратко остановимся на основных результатах наших исследований по реализации метаболического потенциала метилотрофов в биотехнологии.

Установлено, что метилотрофные бактерии, реализующие разные пути С ¡-метаболизма, различаются по удельной скорости роста, выходу биомассы, ее элементному, аминокислотному и жирнокислотному .составу, а также степенью переваривае-мости протеолитическими ферментами in vitro. По этим показателям бактерии с РМФ-путем наиболее предпочтительны для промышленного культивирования и получения кормового белка (70,86).

Кроме того, проведен скрининг и испытания в лабораторных условиях штаммов - продуцентов экзополисахаридов, поли-В-гидроксибутирата и каротиноидов из метана и метанола.

Разработаны регламенты получения препаратов очищенных ферментов из ме-тилотрофных бактерий (ГФД, глутаматдегидрогеназы) и дрожжей (АО, каталаза). Указанные ферменты использовались для биоаналитических целей в ряде организаций и Получили положительные отзывы (41,65,116,120).

Разработаны и успешно апробированы на предприятиях целлюлозно-бумажной, деревообрабатывающей и химической промышленности способы микробиологической очистки сточных вод, содержащих токсичные С1- и Сп-соединения (метанол, метилированные амины, формальдегид, цианид и метилацетат) (16,29,35,58,132).

Наконец, следует отметить, что некоторые из полученных мутантов метило-трофных дрожжей были использованы для совместных работ по клонированию генов АО, каталазы и ДОАК (62,97, 107,134).

ВЫВОДЫ

1.Создана представительная и охарактеризованная коллекция метилотрофных бактерий и дрожжей, а также их мутантов. С использованием методов хемо- и генотак-сономии упорядочено систематическое положение облигатных и факультативных ме-тилотрофов: предложено 20 новых таксонов (2 рода и 18 видов).

2.Выявлено многообразие путей первичного метаболизма С ¡-соединений у метило-трофов разного таксономического положения. Бактерии окисляют метанол ФМС-или НАД-зависимыми дегидрогеназами, дрожжи - алкогольоксидазой. Окисление метилированных аминов катализируется дегидрогеназами (ФМС или НАД), оксидазами или оксигеназами (НАДФН), а также с промежуточным синтезом Ы-метилпроизвод-ных глутамата. Образующийся формальдегид ассимилируется бактериями РМФ-, РБФ- или сериновым путями, имеющими несколько вариантов, тогда как дрожжи реализуют диоксиацетоновый цикл.

3.Установлена корреляция путей первичной ассимиляции ^-соединений с активностью ферментов центрального метаболизма углерода и азота, особенно четко проявляющаяся у метанотрофов I и И типа, усваивающих N114 + при участии глутаматдегидрогеназы или ферментов глутаматного цикла, соответственно. У всех изученных метилотрофов при росте на С1-субстратах реакции цикла Кребса выполняют в основном анаболическую функцию из-за отсутствия или низкой активности ряда ферментов, в частности а-кетоглутаратдегидрогеназы.

4.0бнаружено, что облигатные метилотрофные бактерии имеют множественные энзи-матические дефекты (блоки) в путях центрального метаболизма (гликолиз, глюко-неогенез, цитратный цикл и глиоксилатный шунт), препятствующие росту на полиуглеродных субстратах.

5.Продемонстрировано, что уровни ассимиляции СО2 метилотрофами определяются их гено- и фенотипическими особенностями,т.е. типом метаболизма и природой основ ного источника углерода, составляя соответственно 15, 50 и 80% для бактерий с РМФ-, сериновым и РБФ-путями при метилотрофном росте, а при гетеротрофном -не более 5% общего содержания углерода клеток.

6.Выявлены различия в путях метаболизма неорганических пиро- и полифосфатов у метанотрофов разного таксономического положения, коррелирующие с путями их углеродного и азотного обмена. Уровни внутриклеточных пулов неорганических пиро- и полифосфатов, а также активности ферментов фосфорного метаболизма у 30

етанотрофов указывают на участие ФФН и ПФ в фосфорилиргшании фруктозо-6-осфата до фруктозо-1,6-бисфосфата и генерации энергии.

.Динамика формирования и функции внутрицитоплазматических мембран зависят от :ловий культивирования метанотрофов, в особенности от уровней СН4 и 02- Преи-ущественная локализация ферментов энергетического обмена в ВЦМ обеспечивает х компартментацию и регуляцию энергетических процессов.

,У метилобактерий с РМФ-путем основными регуляторными точками диссимиляци-нного гексулозофосфатного цикла являются глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа (гли-элитический тип распада фосфогексоз) или 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (вариант нтнера-Дудорова). Интенсивность циклического окисления СН2О регулируется яутриклеточными уровнями НАД(Ф)Н, АТФ и некоторых метаболитов. .У дрожжей регуляция активности ферментов первичного метаболизма метанола гуществляется как интермедиатами С [-метаболизма (СН2О, S-гидроксиметилглута-юн), так и энергетическими эквивалентами: НАДН и АТФ (дегидрогеназы форм-1ьдегида и формиата), АТФ и АДФ (диоксиацетон киназа), АМФ (фруктозобисфос-атаза). Поддержание внутриклеточной концентрации формальдегида на гтоксичном уровне происходит посредством образования адцуктов с GSH, ункционирования футильного цикла (алкогольоксидаза + алкогольдегидрогеназа) пи экскреции СН2О.

Э.Метилотрофы с разными путями С [-метаболизма различаются по ряду биотехно-эгических показателей. Предложены к внедрению штаммы - продуценты кормового глка, экзополисахаридов, поли-^З-гидроксибутирата и каротиноидов из метана и етанола, а также активные деструкторы ряда токсичных соединений.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Кирикова Н.Н.,Троценко Ю.А.- Использование одноуглеродных соединений Pseu-amonas sp.l, Вестник МГУ биол.почвовед. 1971, N4, с.94.

Кирикова H.H..Троценко Ю.А.,Кондратьева E.H.- Ассимиляция одноуглеродных )единений Pseudomonas sp.2 - Микробиол.1972,т.41, с.5-10.

.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.- О метаболизме метиламина у Pseudomonas sp.2 -[икробиология 1973, т.43, N6, с.783-789.

Троценко Ю.А.,Быковская С.В.,Кирикова H.H.- О метаболизме метанола у Candida ethylica - ДАН СССР 1973, т.211, N5, с.1230-1232.

Логинова Н.В..Троценко Ю.А.- Ферменты метаболизма метанола и метиламина у seudomonas methylica - Микробиология 1974, т.43, с.979-985.

Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.,Шишкина В.Н.- Метаболизм метиламина у гифомик-эбов- ДАН СССР, 1974, т.216, N6, с.1413-1416.

Шишкина В.Н.,Троценко Ю.А.- Свойства нового штамма Hyphomicrobium, исполь-дащего одноуглеродные соединения - Микробиология 1974, Т43, с.765-770. Троценко Ю.А.,Быковская С.В.,Кирикова Н.Н.,Бабьева И.П.- Candida methylica >.п.- новый вид дрожжей, использующих метанол - Микология фитопатология 1974, 8, N4, с.323-326.

Троценко Ю.А.,Быковская С.В.,Кирикова H.H.- Способ получения биомассы - Авт. >ид. N449933 БИ N42, 1974.

Ю.Троценко Ю.А.,Кирикова Н.Н.,Быковская С.В.- Ферменты углеводного метабо лизма у факультативных метилотрофов - Микробиология 1974, Т43, с.915. Н.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.,Нетрусов А.И.- Особенности метаболизма метанол; и метиламина у Pseudomonas sp.2 - Сб."Проблемы регуляции обмена веществ ; микроорганизмов", Пущино, 1974, с.349-354.

12.Гальченко В.Ф.,Шишкина В.Н.,Тюрин В.С.,Троценко Ю.А.- Выделение чисты: культур метанотрофов и их свойства - Микробиология 1975, Т44, с.844-890.

13.Trotsenko Y.A.- Alternative pathways of methanol metabolism in prokaryotes and euka ryotes- Proc. I Int. Symp."Microbial Growth on Cj-compounds" Tokyo 1975, p.179-182.

14.Лошнова Н.В.,Троценко Ю.А.- Факультативный метилотроф, относящийся i Arthrobacter- Микробиология 1975, т.44, N6, с.987-992.

15.Троценко Ю.А.- Метаболизм метилотрофов - Биохимия и физиология микроорга низмов, НЦБИ Пущино, 1975, с.62-63.

16.Логинова Н.В.,Шишкина В.Н.,Троценко Ю.А.- Первичные пути метаболизма ме тилированных аминов у Hyphomicrobium vulgare - Микробиол. 1976, т.45, N1, с.41-47

17.Шишкина В.Н.,Юрченко В.В.,Романовская В.А.,Малашенко Ю.Р.,Троценко Ю.А. Об альтернативности путей ассимиляции метана у облигатных метилотрофов -Микро биология 1976,т.45, N3, с.417-419.

18. Trotsenko Y.A.- Isolation and characterization of obligate methanotrophic bacteria Microbial production and utilization of gases (H2. CO2, CH4) Ed:H.G.Schlegel et al 1976, p.329-336.

19.Логинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Пути окисления и ассимиляции метилированны: аминов у Arthrobacter globiformis - Микробиология 1976, с.217-223.

20.Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Циклический путь окисления формальдегида Pseudomonas oleovorans - Микробиология 1977, t.46.N6, с.1119-1121.

21.Гальченко В.Ф.,Шишкина В.Н.,Сузина Н.Е.,Троценко Ю.А.- Выделение и свойст ва новых штаммов облигатных метанотрофов - Микробиол. 1977, т.46, N5, с.890-897

22.Логинова Н.В.,Шишкина В.Н.,Филиппова Т.И.,Троценко Ю.А.-Сравнительно изучение метаболизма метанола и метиламина у Hyphomicrobium vulgare 3.-Извести АН СССР сер. биол. 1977,N2, с.235-243.

23.Логинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Метаболизм метанола у Pseudomonas oleovorans Микробиология 1977, т.46, N2, с.210-216.

24.Логинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Пути метаболизма метилированных аминов у бак терий - Сб."Рост микроорганизмов на Cj-соединениях", Ред. Скрябин Г.К. и др. НЦБИ Пущино 1977, с.38-40.

25.Малашенко Ю.Р.,Романовская В.А.,Троценко Ю.А.- Метанокисляющие микроор ганизмы - Изд-во "Наука", ред. Г.А.Заварзин 1978, 197 с.

26.Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Очистка и характеристика 3 гексулозофосфатсинтазы из факультативного метилотрофа Pseudomonas oleovorans Биохимия 1978, т.43, N5, с.782-787.

27.Быковская С.В.,Логинова Н.В.,Гагарина В.А.,Малашенко Ю.Р.,Троценко Ю.А. Влияние углекислоты на метилотрофный метаболизм Candida boidinii - Микробиоло гия 1978, т.47, N5, с.953-956.

28.Логинова Н.В.,Намсараев Б.Б.,Троценко Ю.А.- Автотрофный метаболизм метано ла у Microcyclus aquaticus - Микробиология 1978, т.47, Nl,c.l68-170.

2^Логинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Метаболизм углерода у метилотрофных бактерий, выделенных из активных илов - Микробиология 1978,т.47, с.939-946. ЗО.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.- Метилотрофный метаболизм и его регуляция -Сб."Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов, НЦБИ Пущино 1979, с.256-265.

31 .Shishkina V.N., Trotsenko Y.A.- Pathways of ammonia assimilation in obligate methane utilizers- FEMS Microbiol.Letters 1979, v.5, p. 187-191.

32.Троценко Ю.А., Логинова H.B.- Пути метаболизма метилированных аминов у бактерий - Успехи микробиологии 1979, N14, с.28-55.

ЗЗЛогинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Карбоксилазы пнрувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов - Микробиология 1979, т.42, N2, с.202-207.

34. Логинова Н.В., Троценко Ю.А.- Blastobacter viscosus - новый вид автотрофных бактерий, использующих метанол - Микробиология 1979,т.48,с.785-792.

35. Loginova N.V., Trotsenko Y.A.-.Autotrophic growth on methanol by bacteria isolated from activated sludge - FEMS Microbiol.Letters 1979,v.5, N2,p.239-243.

36.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.-Физиолого-биохимическая характеристика мета-яолиспользующих бактерий активных илов целлюлозно-бумажных предприятий -Всесоюзная конференция "Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды" Пущино 1979, с. 113-115.

}7.Логинова Н.В.,Троценко Ю.А.- Образование экзополисахарида Blastobacter «scosus при росте на среде с метанолом - Прикладная биохимия микробиология 1980, т. 16, N3, с.331-334.

?8.Быковская С.В., Троценко Ю.А.- Метаболизм метилотрофных дрожжей Candida nethylica - Микробиология 1980, т.49, N5, с.695-700.

i9.Соколов А.П., Лучин С.В., Троценко Ю.А. - Очистка и свойства дегидрогеназ •люкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата - Биохимия 1980,т.45, с. 1371 -1378. Ю.Четина Е.В.,Троценко Ю.А.- Выделение и идентификация мембран Methylomonas nethanica - Микробиология 1980, т.49, N6, с.936-941.

И.Троценко Ю.А., Соколов А.П., Лучин С.В., Логинова Н.В.- Способ получения (егидрогеназ - Авт. свид. N763463. БИ N34, 1980.

12.Galchenko V.F.,Nesterov A.I.,Andreev L.V.,Trotsenko Y.A.-New species of nethanotrophic bacteria Methylocystis - Pushchino 1980,p.l-26.

(З.Быковская C.B..Троценко Ю.А.- Альтернативные пути углеродного метаболизма и [X регуляция у метилотрофных дрожжей Candida methylica - Микробиология 1981, .50, N5, с.781-787.

!4.Четина Е.В., Троценко Ю.А.- Внутриклеточная локализация ферментов окисления ^-соединений у облигатных метанотрофов - Микробиология 1981,t.50,N3,c.446-452. 5.Четина Е.В.,Сузина Н.Е.,Троценко Ю.А.- Выделение и характеристика мембран -iethylomonas methanica - Биохимия 1981, т.46, с.2112-2121.

6.Логинова Н.В..Троценко Ю.А.- Свойства облигатного метилотрофа Methylophilus lethanolovorus - Микробиология 1981, т.50, Nl,c.21-28.

7.Логинова Н.В.,Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Автотрофный метаболизм мета-ола у Blastobacter viscosus - Микробиология 1981,т.50,с.591-597.

8.Bystrykh L.B.,Sokolov А.Р.,Trotsenko Y.A.- Purification and properties of dihyd-axyacetone synthase from the methylotrophic yeast Candida boidinii - FEBS Letters 1981, .132. N2, p.324-328.

49.Троценко Ю.А.,Быковская С.В.,Логинова Н.В.,Гагарина В.А.,Гулевская С.А.,Ма-лашенко Ю.Р.- Цитобиохимические особенности Candida boidinii при непрерывном культивировании на метаноле и НСО3"- Микробиология 1981, т.50, N6, с.1057-1061.

50.Быстрых Л.В.,Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Диоксиацетонсинтаза метилотрофных дрожжей - Биохимия 1981, т.46, N12, с.2257-2260.

51.Быстрых Л.В.,Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Разделение транскетолазы и диокси-ацетонсинтазы метилотрофных дрожжей - ДАН СССР 1981, т.258, с.499-501.

52.Логинова Н.В., Говорухина Н.И., Троценко Ю.А.- Метаболизм облигатного мети-лотрофа Methylophilus methanolovorus - Микробиология 1981,т.50,с.305-310.

53.Троценко Ю.А., Соколов А.П., Логинова Н.В.- Способ получения глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы - Авт. свид. N873686, БИ N35, 1981.

54.Shishkina V.N.,Trotsenko Y.A.- Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria - FEMS Microbiol.Letters 1982, v.13, p.237-242.

55.Логинова H.B..Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Свойства пируваткарбоксилазы факультативного метилотрофа Pseudomonas oleovorans - Биохимия 1982, т.47, N10, с.1629-1634.

56.Четина Е.В., Сузина Н.Е.,Фихте Б.А.,Троценко Ю.А.- Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата Methylomonas methanica - Микробиология 1982, т.51, N2, с.247-254.

57.Логинова Н.В..Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Ферменты ассимиляции аммония у бактерий с различными путями Сj-метаболизма - Микробиология 1982, т.51, N1, с.38-42.

58.Померанц Л.Б.,Болотникова Э.В.Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.-Влияние метил-сернистых соединений на дегидрогеназную активность бактерий, использующих метанол - Сб. "Охрана окружающей среды от загрязнений промыш. выбросами ЦБП", Л-д 1982, N10, с.121-126.

59.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.,Гагарина В.А.,Малашенко Ю.Р.- Способ получсни; биомассы бактерий - Авт. свид. N915461, БИ N36, 1982.

60.Быстрых Л.В.,Троценко Ю.А.- Очистка и некоторые свойства диоксиацетонкиназь метилотрофных дрожжей Candida boidinii- Биохимия 1983, т.48, N10, с. 1611-1616.

61.Доронина Н.В.,Говорухина Н.И..Троценко Ю.А.- Blastobacter aminooxidans ■ новый вид бактерий, автотрофно растущих на метилированных аминах Микробиология 1983, т.52, N5, с.709-715.

62.Титоренко В.И..Троценко Ю.А.- Селекция мутантов - продуцентов аминокислот i разветвленной цепью у метилотрофных дрожжей - Микробиология 1983, т.52, N6 с.979-985.

63.Троценко Ю.А.- Метилотрофные эукариоты - Успехи микробиологии 1983, т.18 с.18-38.

64.Титоренко В.И..Быковская С.В.,Троценко Ю.А.- Характеристика мутантов i особенности генетической регуляции метаболизма метанола у Candida boidinii Микробиология 1983, т.52, N2, с.307-311.

65.Троценко Ю.А.,Логинова Н.В.,Говорухина Н.И.- Способ получения глутаматде гидрогеназы - Авт. свид. N1017730, БИ N18, 1983.

66.Убийвовк В.М.,Быстрых Л.В.,Троценко Ю.А.- Участие глутатиона в регуляцш метаболизма метанола у дрожжей - Микробиология 1983,т.52, с.383-387.

57.Trotsenko Y.A.- Metabolic features of methane- and methanol-utilizing bacteria - Acta Biotechnol.1983, v.3, N3, p.301-304.

58.Trotsenko Y.A.,Bykovskaya S.V.- Candida methylica, a new species. In: Yeasts: :haracteristics and identification. Eds. Barnett I.A., Payne R.W., Yarrow L.D.- Cambridge University Press 1983, p.811.

59.Бурьянов Я.И.,Быковская С.В.,Троценко Ю.А.- Способ получения S-аденозилме-гионинсинтетазы - Авт. свид. N1262951, БИ N 27, 1984.

/О.Четина Е.В.,Т^оценко Ю.А.- Оценка перевариваемости биомассы метанотрофных 5актерий - Прикл. биохим. микробиол.1984, т.20, с.648-652.

M.Trotscnko Y.A.,Bystrykh L.V.,Ubiyvovk V.- Regulatory aspects of methanol metabolism n yeasts- Proc.4th Int.Symp. Microbial Growth on Ci-Compounds. Eds.Crawford

Hanson R.S., Washington, 1984,p.118-122. . Р2.Троценко Ю.А.,Соколов А.П.- Эволюция путей первичной ассимиляции Ci-соеди-{епий у бактерий- Сб. "Вопросы эволюции бактерий", Пущино 1984,с.80-93. 'З.Доронина Н.В.Дроценко Ю.А.- Уровни ассимиляции углекислоты у бактерий с юзличными путями Сi-метаболизма - Микробиология 1984,т.53,с.885-889. '4.Троценко Ю.А., Соколов А.П. - Регуляция диссимиляционного гексулозофос-[штного цикла у метилотрофных бактерий - Сб. "Проблемы биохимии и физиологии шкроорганизмов", Пущино 1985, с.44-50.

г5.Гаязов Р.Р.,Шишкина В.Н.,Мшенский Ю.Н.,Троценко Ю.А.,Иванов М.В.- Влия-|ие температуры на рост и метаболизм Methylomonas methanica - ДАН СССР 1985, .284, N3, с.746-748.

'б.Троценко Ю.А.,Быстрых Л.В.- Регуляция путей первичного метаболизма метанола ' метилотрофных дрожжей - "Сб. Проблемы биохимии и физиологии микроорганиз-юв". Пущино 1985, с.37-44.

'7.Suzina N.E.,Chetina E.V.,Trotsenko Y.A.,Fikhte B.A.- Peculiarities of the upramolecular organization of intracytoplasmic membranes in methanotrophs - FEMS Microbiol. Letters 1985, v.30, N1, p.111-114.

8.Доронина H.В..Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Свойства факультативного мети-:отрофа, идентифицированного как Protaminobacter ruber - Микробиология 1985, т.54, i3, с.363-369.

9.Trotsenko Y.A.,Bystrykh L.V.- Regulation of primary pathways of methanol metabolism l methylotrophic yeasts - Environmental Regulation of Microbial Metabolism FEMS Symp. icad. Press, London 1985, p.l 13-120.

0.Троценко Ю.А.- Особенности метаболизма метилотрофов - Сб. "Генетика и фи-иология микроорганизмов - перспективных объектов генной инженерии", Пущино, 1ЦБИ АН СССР 1985, с.39-60.

1.Соколов А.П.,Троценко Ю.А.- Очистка и свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогена-ы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы факультативного метилотрофа Arthrobacter Iobiformis- Биохимия 1985, т.50, N8, с.1269-1277.

2.Сузина Н.Е.,Четина Е.В.,Троценко Ю.А.,Фихте Б.А.- Влияние условий культиви-ования на организацию мембранного аппарата и поверхности трубчатых структур леток Methylocystis echinoides- Микробиология 1985, т.54, N2, с.214-221.

3.Быстрых Л.В.,Быковская С.В.,Троценко Ю.А.- Регенерация ксилулозо-5-фосфата диоксиацетоновом цикле ассимиляции метанола у дрожжей - Биохимия 1986, т.51, t2, с.302-305.

84.Четина Е.В.,Троцеико Ю.А.- Активность окислительного фосфорилирования в мембранах метилотрофных бактерий - Микробиология 1986,с.539-542.

85.Убийвовк В.М.,Троценко Ю.А.- Регуляция уровня формальдегида у метилотрофных дрожжей Candida boidinii - Микробиология 1986, т.55, с.181-185.

86.Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.- Состав биомассы бактерий, растущих на метаноле - Прикладная биохимия и микробиология 1986, т.22, N4, с.557-561.

87.Гальченко В.Ф.,Андреев Л.В.,Троценко Ю.А.- Таксономия и идентификация обли-гатных метанотрофных бактерий - Пущино 1986, 96 с.

88.Шишкина В.Н.,Троценко Ю.А.- Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофны-ми бактериями - Микробиология 1986, т.55, N3, с.377-382.

89.Trotsenko Y.A.,Doronina N.V.,Govorukhina N.I.- Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria - FEMS Microbiol.Letters 1986, v.33, p.293-297.

90.Harder W., Trotsenko Y.A., Bystrykh L.V., Egli T. - Metabolic regulation in methylotrophic yeasts- Proc.5th Int. Symp Microbial Growth on Cj-Compounds, Eds: H.W. van Verseveld, J.A.Duine. Martinus Nijhof Publishers, Dordrecht 1987, p.139-149.

91.Соколов А.П.Дроценко Ю.А.- Очистка и свойства NADP-зависимой глутаматде-гидрогеназы из облигатного метилотрофа Methylophilus melhanolovorus - Биохимия 1987, т.52, N9, с.1417-1422.

92.Trotsenko Y.A.,Shishkina V.N.,Govorukhina N.I.,Sokolov A.P.- Biochemical basis for obligate methylotrophy and obligate autotrophy: comparative aspects- Winogradsky Symp. on Lithoautotrophy, 1987, p.26.

93.Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.,Гагарина В.А.,Малашенко Ю.А.- Рост метилотрофных бактерий при различных соотношениях метанола и бикарбоната - Прикладная биохимия и микробиология 1987; т.23, N1, с.36-39.

94.Клецова Л.В.,Говорухина Н.И.,Цыганков Ю.Д.,Троценко Ю.А.- Метаболизм облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum - Микробиология 1987, т.56, N6, с.901-906.

95.Троценко Ю.А.,Быстрых Л.В.,Соколов А.П.- Регуляция первичного метаболизма метанола у бактерий и дрожжей- Сб. "Биохимия и физиология метилотрофов",ОНТИ НЦБИ 1987, с.62-77.

96.Говорухина Н.И.Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.- Влияние полиуглеродных соединений Há рост и метаболизм облигатного метилотрофа Methylophilus methanolovorus-Микробиология 1987,т.56,с.564-569.

97.Икономова Р.Н.,Тихомирова Л.П.,Фодор И.И.,Быстрых Л.В.,Аминова Л.Р.,Тро-ценко Ю.А.- Экспрессия гена диоксиацетонкиназы метилотрофных дрожжей Hansenu-la polymorpha в Saccharomyces cerevisiae- ДАН СССР 1987, т.294, N1, с.233-236.

98.Говорухина Н.И.,Клецова Л.В.,Цыганков Ю.Д.,Троценко Ю.А., Нетрусов А.И.-Характеристика нового облигатного метилотрофа - Микробиология 1987, т.56, N5, с.849-854.

99.Четина Е.В.,Троценко Ю.А.- Уровни аденин- и пиридиннуклеотидов у метанотрофных бактерий - Микробиология 1987, т.56, N3, с.369-373.

ЮО.Четина Е.В.,Сузина Н.Е.,Фихте Б.А.,Троценко Ю.А.- Цитохимическое выявление локализации ферментов энергетического метаболизма у Methylomonas methanica-Микробиология 1988, т.57, N1, с.125-131.

101.Доронина Н.В., Говорухина Н.И., Лысенко A.M., Троценко Ю.А.- Анализ ДНК-ДНК гомологий у облигатно метилотрофных бактерий - Микробиология 1988, т.57, 36

N4, с.629-633.

102.Шарышев А.А.,Сысоев О.В.,Быстрых Л.В.,Краузова В.И.,Троценко Ю.А.- Изучение субклеточного распределения ферментов у дрожжей Candida boidinii, выращенных на метаноле - Биохимия 1988, т.53, N3, с.483-490.

ЮЗ.Быстрых Л.Б.,Троценко Ю.А.- Свойства фруктозо-1,6-бисфосфатазы метило-фофных дрожжей Candida boidinii - Биохимия 1988, т.53, N1, с.82-90.

104.Доронина Н.В.,Говорухина Н.И.Дроценко Ю.А.- Новые виды ограшпенно-фа-сультативных метилотрофных бактерий - Микробиология 1988, т.57, с.828-834.

105.Быстрых Л.В..Михалева Н.И.,Ушаков В.М.,Фихте Б.А.,Троценко Ю.А.- Свойства :упероксиддисмутазы из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha - Прикладная биохимия и микробиология 1988, т.24, N3, с.335-341.

Юб.Шишкина В.Н.,Троценко Ю.А.- Влияние глюкозы на рост и метаболизм облигат-1ых метанотрофов - Микробиология 1988, т.57, N6, с.917-923.

l07.Tikhomirova L.P.,Ikonomova R.N.,Kuznetsova E.N.,Fodor I.I.,Bystrykh L.V.,Aminova L.R.,Trotsenko Y.A.- Transformation of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: Cloning and expression of genes -J.Basic Microbiol 1988,v.28, N5,p.343-351. Ю8.Троценко Ю.А.,Четина E.B.- Энергетический метаболизм метилотрофных бакте-5ий - Успехи микробиолопш 1988, т.22, с.3-34.

l09.Bystrykh L.V.,Aminova L.R.,Trotsenko Y.A.- Methanol metabolism in mutants of the nethylotrophic yeast Hansenula polymorpha - FEMS Microbiol. Letters 1988, v.51, N2-3, j.89-94.

ИО.Булыгина Е.С.,Гальченко В. Ф., Нетрусов А.И., Никитин Д.И.,Романовская З.А.,Троценко Ю.А., Говорухина Н.И.- Классификация метилотрофных бактерий по юследовательностям 5S рибосомной РНК - Мол.генет.микробиол.вирусол. 1989, N3, :.18-24.

Ш.Четина Е.В.,Троценко Ю.А.- Терминальные оксидазы метанотрофных бактерий vfethylomonas methanica - Микробиология, 1989, т.58, N1, с.31-35.

12.Говорухина Н.И.,Доронина Н.В..Андреев Л.В.,Троценко Ю.А.- Methylomicrobium новый род факультативных метилотрофных-бактерий- Микробиология 1989, т.58-,

<12, с.326-333^

13.Соколов А.П.,Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Характеристика м ста н о л д е ги д р о-еназ ограниченно-факультативного и облигатного метилотрофов - Биохимия 1989, .54, N.5, с.811-816.

14.Сысоев О.В..Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Изучение, роли глутатиона у ме-илотрофных бактерий с различными путями Сj-метаболизма - Микробиология 1989, .58, N4, с.549-552.

15.Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Фосфолипидный состав метилотрофных бакте-1ий - Микробиология 1989, т.58, N3. с.405-411.

16.Bystrykh L.V.,Romanov V.P.,Steczko J.,Trotsenko Y.A.- Catalytic variability of lcohol oxidase from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha - Biotechnology tpplied Biochemistry 1989, N11, p.184-192.

П.Складнев Д.А.,Цыганков Ю.Д.,Кузнецов Э.В.,Баев М.В.,Говорухина Н.И., Тро-;енко Ю.А.- Влияние некоторых органических соединений на рост метилотрофных актерий Methylobacterium МВ1 - Биотехнология 1989, t.5,N5, с.559-564. 18.Trotsenko Y.A.,Doronina N.V.,Hirsch P.- Genus Blastobacter Zavarzin 1961, 962AL -iergey's Manual of Syst. Bacteriol. 1989, v.3, p. 1963.

U9.Bulygina E.S.,Galchenko V.F.,Govorukhina N.I.,Netrusov A.,Nikitin D.I.,Trotsenko Y.A.,Chumakov K.M.- Taxonomic studies on methylotrophic bacteria by 5S ribosomal RNA sequencing- J. Gen. Microbiol.1990, v.136, N3, p.441-446.

120.Trotsenko Y.A.,Bystrykh L.V.- Production of metabolites by methylotrophic yeasts -Biotechnology Advances 1990, v.8, p.105-119.

121.Sokolov A.P.,Trotsenko Y.A.- Glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phos-phogluconate dehydrogenase from Arthrobacter globiformis - Methods in Enzymology 1990, v.188, p.339-345.

122.Trotsenko Y.A.,Shishkina B.N.- Studies on phosphate metabolism in obligate methanotrophs - FEMS Microbiol. Revs. 1990, v.87, N3-4, p.267-271.

123.Соколов А.П.,Томашевская Л.Г.,Троценко Ю.А.- Получение и первичная фено-типическая характеристика МОХ"-мутантов ограниченио-факультативного метило-трофа Methylophilus glucoseoxidans- Микробиол. 1990, т.59, с.399-403.

124.Гаязов Р.Р.,Четина Е.В.,Мшенский Ю.Н.,Троценко Ю.А.- Физиологические и цитобиохимические особенности Methylomonas methanica при росте на метане в присутствии метанола - Прикл. биохим.-микробиол.1990, t.26.N3, с.394-398.

125.Шишкина В.Н.,Троценко Ю.А.- Метаболизм неорганических полифосфатов и пи-рофосфата у метанотрофных бактерий - Микробиология 1990, т.59, с.533-538.

126.Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Methylovorus - новый род ограниченно-факультативных метилотрофных бактерий - Микробиология 1990, т.59, с.880-890.

127.Говорухина Н.И.,Четина Е.В.,Троиенко Ю.А.- Влияние полиуглеродных соединений на рост и метаболизм Methylobacillus flagellatum - Микробиология 1990, т.59. N2, с.249-256.

128.Rakov D.Y.,Doronina N.V.,Trotsenko Y.A.,Alieva R.M.- Pathways of methylacetatc metabolism in methylotrophic bacteria - FEMS Microbiol.Letters 1990, v.67, Ni, p.67-72.

129.Говорухина Н.И.,Троценко Ю.А.- Содержание поли-^-оксибутирата у метилотрофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции метанола - Прикладная биохимия и микробиология 1991, т.27, N1, с.98-101.

130.Govorukhina N.I.,Trotsenko -Y.A.- Methylovorus, a new genus of methylotrophic bacteria - Int.J.Syst.Bacteriol 1991, v.41, N1, p.158-162.

131.Доронина H.B.,Гришина Е.В.Диканская Э.М.,Троценко Ю.А.- Новый грамполо-жительный факультативный метилотроф Mycobacterium methylovorum - Микробиоло гая, 1991, т.60, N4, с.725-732.

132.Раков Д.Ю.,Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.,Алиева P.M.- Рост метилотрофны) бактерий на метилацетате - Прикл. биохим. микробиол. 1991, т.27,N4, с.133-137.

133.Доронина Н.В.,Троценко Ю.А.- Methylobacillus viscogenes - новый вид облигатно метилотрофных бактерий, образующих экзополисахарид - Микробиология 1991, т.60 N5, с.908-914.

134.Aminova L.R.,Kyslikova E.,Volfova 0.,Trotsenko Y.A.- Characterization of catalase negative mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha - Folia Microbiol. 1991 v.36, N2, p.157-163.

135.Сысоев О.В.,Грузман М.Б.,Иванов Е.В.,Троценко Ю.А. - Каталаза метилотроф ных дрожжей Hansenula polymorpha: очистка и свойства - Биохимия, 1991, т.56, N10 стр.1858-1863.

136.Соколов А.П.,Белова Л.Л.,Троценко Ю.А.- Очистка и некоторые свойства NAD зависимой метанолдегидрогеназы термотолерантного метилотрофа Bacillus methylo thermophilus - Прикладная биохимия и микробиология 1992, т.28, N2, стр.25-32

Информация о работе

Троценко, Юрий Александрович
доктора биологических наук
Пущино, 1992
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Особенности метаболизма метилотрофов ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма метилотрофов"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности метаболизма метилотрофов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология