Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий

Федоров, Дмитрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий"

На правах рукописи

ФЕДОРОВ ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФИТОСИМБИОЗА АЭРОБНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2010

004606818

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущияо.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Н.В. Доронина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, С.Н. Дедыш кандидат биологических наук, В.В. Кочетков

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино

Защита состоится «18» июня 2010 г. в 10°° • час, на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте института http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан « П» мая 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аэробные металотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, широко распространены в природе и часто ассоциированы с растениями. Эти бактерии обнаружены в семенах, филлосфере и ризосфере растений [Согре, Rheem, 1989; King, 1994; Holland, 1997; Троценко с соавт., 2001; Доронина, Троценко, 2000; Доронина с соавт., 2000]. До недавнего времени основной ролью метанотрофов и метилобактерии в природе считали участие в глобальном цикле углерода, в частности, в снижении эмиссии метана, чей парниковый эффект в 20 раз превышает действие СОг. Относительно недавно стало известно, что метан, метанол, метиламины и метилсернистые соединения являются естественными продуктами метаболизма растений, что объясняет постоянную связь метилотрофов с растениями [MacDonald et al., 1993; Fall, 1996; Hanson and Roje, 2001; Keppleret a!., 2006, 2008].

Используя Ci-метаболиты растений в качестве источников углерода и энергии, метилотрофы, в свою очередь, влияют на рост и развитие растений путем секреции биоактивных соединений - фитогормонов (ауксинов, цитокининов), а также витаминов [Доронина с соавт., 2001; Иванова с соавт., 2001]. Кроме того, появились сведения о влиянии метилотрофов на рост и развитие растений за счет активности 1-аминоииклопропан-1-карбоксилатдезаминазы, снижающей уровень биосинтеза стрессового гормона - этилена в растениях. Метилотрофы также могут косвенно стимулировать рост растений, вызывая индуцированную системную устойчивость к фитопатогенным грибам [Madhaiyan et al., 2004, 2006].

В последнее десятилетие фитосимбиоз аэробных метилотрофных бактерий исследуется весьма активно, чему в немалой степени способствуют многочисленные проекты по секвенированию геномов различных метилотрофов, особенно представителей рода Methylobaclerium [Vuilleumier et al., 2009]. Несмотря на интенсивное изучение метаболических основ фитосимбиоза метилотрофов, неизвестными остаются многие вопросы, касающиеся генов и ферментов, определяющих взаимодействие бактерий с растениями.

Цель и задачи исследовании. В связи с вышеизложенным целью работы было выяснение метаболических аспектов фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Исследовать гены и ферменты путей биосинтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) у представителей рода Methylobaclerium.

2. Изучить гены и охарактеризовать соответствующие ферменты метилобактерий, участвующие в деградации аминокислот растений - 1-аминциклопропан-1-карбоновой кислоты и D-цистеина.

3. Определить способность аэробных метилотрофных бактерий синтезировать витамин В|2 и фиксировать N2. Разработать систему вырожденных олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации генов нитрогеназы, фермента, ответственного за фиксацию молекулярного азота.

Научная новизна работы. Впервые у метилотрофов клонирован ген и охарактеризована рекомбинантная индолил-З-пируватдекарбоксилаза, ключевой фермент индолилпируватного (ИПвК)-пути биосинтеза ауксинов. Установлено, что ИПвК-путь определяет способность филлосферного штамма Melhylobacterium extorquens AMI удлинять стебли растений. Показано стимулирующее влияние экзогенной ИУК на уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма метанола у мутантного штамма М extorquens AipdC. У ризосферного штамма Methylobacterium nodularis идентифицирован ген и охарактеризован новый фермент биосинтеза ауксинов - декарбоксилирующая окислительная дезаминаза ароматических L-амипокислот.

Впервые у метилотрофов клонированы гены и охарактеризованы ферменты деградации растительных аминокислот - 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и D-цистеина - АЦК-дезаминаза и D-цистеиндесульфогидраза.

Установлено, что аэробные метилотрофные бактерии различного таксономического положения способны синтезировать и поставлять растениям витамин Ви. Выявлено, что азотфиксация, характерная для метанотрофов, менее распространена у метилобактерий.

Научно-практическое значение.

Данная работа расширяет и углубляет знания о метаболических основах симбиоза метилотрофов с растениями, что позволяет разработать новые биопрепараты-стимуляторы роста и развития растений с заданными свойствами, повышающие продуктивность растений и увеличивающие устойчивость растений к фитопатогенам или стрессовым воздействиям.

Разработанная система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации генов нитрогеназы - niJHD позволяет оценить способность к фиксации атмосферного азота бактерий различного таксономического положения в чистых культурах и сообществах.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях: Международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006, 2010), школах-конференциях молодых ученых ИБФМ РАН (Пущино, 2007 - 2009), международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ РАН (Москва, 2005, 2007, 2009), международной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, Украина, 2007), Втором международном симпозиуме «Регуляторы роста растений: внутриклеточная гормональная сигнализация и применение в аграрной промышленности» (Киев, Украина, 2007), XII съезде Общества микробиологов Украины им. С.Н. Виноградского (Ужгород, Украина, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 11 тезисов. Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ РАН по теме «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№> Госрегистрации 01.2.007 08221).

-2-

к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц., к.б.н. Капаруллиной E.H., к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Торгонской М.Л., к.б.н. Бесчастному А.П., д.б.н. Хмелениной В.Н., всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов (ИБФМ РАН, г. Пущино), а также к.б.н. Чернышову C.B. (ФИБХ РАН).

Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и поддержку. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 288 ссылок, содержит 9 таблиц и 30 рисунков.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили штаммы метилобактерий и метанотрофов, поддерживаемые в лаборатории. Метилобактерии выращивали на среде «К» с 0.5% (об/об) метанола [Доронина, 1999]. Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде «П» в атмосфере СН4 и воздуха (1:1) [Гальченко и др., 2001]. Echerichia coli выращивали на среде LB [Sambrook and Russell, 20011-

Молекулярно-генетнчсскне методы. Выделение геномной и плазмидной ДНК, эндонуклеазные реакции, лигирование, трансформацию штаммов Е. coli проводили стандартными методами [Sambrook and Russell, 2001]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на амплификаторе BIO-RAD MJ Mini (США). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. ПЦР-фрагменты очищали при помощи Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega, США) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Для идентификации генов, кодирующих индолил-3-пируватдекарбоксилазу, триптофандекарбоксилазу, 1 -аминоциклопропан-1 -

карбоксилатдезаминазу, D-цистеиндесульфогидразу, а также структурные гены нитрогеназы (nifliD) в геномах бактерий проводили поиск аминокислотных последовательностей в пакете программ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с использованием известных аминокислотных последовательностей хорошо изученных белков. При разработке системы вырожденных праймеров для ПЦР амплификации niftiD-геаов использовали нуклеотидные последовательности генов, представленных в базе данных GenBank. Аминокислотные последовательности выравнивали при помощи программы ClustalW [Thompson et al., 1994]. Для построения филогенетических деревьев использовали модель UPGMA (unweighted-pair group method with average linkages), реализованную в пакете программ MEGA [Тamura et al., 2007].

Мутаитные штаммы метилобактерий с делециями в генах ipdC и dcyD получали путем гомологичной рекомбинации с мутантными аллелями генов, введенных при помощи конъюгативного переноса в суицидальном векторе pK18mob [Schäfer et al., 1994]. Комплементацию мутаций в Melhylobacterium extorquens осуществляли клонированием ОРС соответствующих генов в векторе рСМ160 с последующим переносом в клетки мутантов посредством конъюгации [Marx and Lidstrom, 2001]. Векторы для

сверхэкспрессии рекомбинантных белков получали клонированием ОРС соответствующих генов в векторах pET-22b(+) (Novagen) или pHUE [Catanzariti et al., 2004]. Экспрессия u очистка рекомбинантных белков. Использовали штаммы Е. coli BL21(DE3, pT-GroE), трансформированные плазмидами р7А-03, р7А-12, р7А-31 и р7А-37. Синтез белков индуцировали добавлением 0.2 шМ изопропил-1-тио-Р-0-галактопиранозида (ИПТГ). Рекомбинантные белки выделяли Ь1|2+-хелатной хроматографией из суперпродуцентов Е. coli в соответствии с методиками фирмы Qiagen с небольшими изменениями [Heneo, 1992]. Белковые фракции анализировали при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза [Laemmli, 1970]. Характеристики рекомбинантных белков определяли, исследуя ферментативные активности в зависимости от температуры, pH и концентрации субстратов. Значения Кт и получали путем аппроксимации данных, используя модуль Enzyme Kinetics 1.3 программы SígmaPlot 10.0 (Systat Software). Молекулярные массы холоферментов определяли гельпроникающей хроматографией и электрофорезом в полиакриламидном геле в нативных условиях с последующим зимографическим анализом.

Ауксины экстрагировали из культуральной жидкости метилотрофов равным объемом кислого (pH 2.5-3.0) этилацетата. Высушенные этилацетатные экстракты разделяли и анализировали методами ТСХ, ВЭЖХ, как описано ранее [Иванова, 2001]. Определение содержания витамина В12 в клетках метилотрофов проводили микробиологическим методом с использованием ауксотрофного по В12 штамма Е. coli - 1133 [Канопкайте, 1978].

Влияние ИУК в культуральной среде на активности ферментов первично го и центрального метаболизма метилобактерий. В середине экспоненциальной фазы роста культуры метилобактерий разделяли на две равные части, к одной из которых добавляли 0.25 мМ ИУК. В конце экспоненциальной фазы роста, активность ферментов в бесклеточных экстрактах определяли известными методами [Доронина, 1999, Paris et al., 1981, Oberhansii et al., 1991]. Содержание белка определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951]. Влияние метилотрофов на рост растений in vitro. Гнотобиотические растения табака культивировали на среде Мурасиге-Скуга (MC) [Murashige and Skoog, 1962]. Растения культивировали при температуре 22-24 "С, фотопериоде 16 ч и интенсивности освещенности 2000 люкс. Черенки табака (3 см) колонизовали метилотрофами, погружением в 20 мл культуры клеток, и переносили на среду MS без фитогормонов. Контролем служили неколонизованные проростки. Количественный анализ растительного материала проводили путем измерения удлинения стеблей растений. В работе использовали методы статистической обработки, реализованные в программе Systat SigmaPlot 10.0. Биологической параллелью (повторностью) служили 5 черенков табака, весь эксперимент повторяли дважды. Присутствие и количество метилотрофов на колонизованных растениях определяли в экстрактах листьев методом разведений и высевом на селективных средах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза ауксинов, в геномах Methylobacterium

С использованием аминокислотных последовательностей индолил-3-пируватдекарбоксилазы из Enterobacter cloaceae (ID белка в базе данных Р23234), триптофандекарбоксилазы Capsicum аппиит (ACN62127), триптофан-2-монооксигеназы из Agrobacterium tumefaciens (ААА92550) провели поиск генов, кодирующих ферменты биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

При помощи программы Protein BLAST выявили присутствие в геномах штаммов Methylobacterium extorquens AMI, РА1, CM4 и DM4, а также M. populi и M. radiotolerans генов, обозначенных МехАМ1_МЕТА1р2494, Mext_2527, Mchl_2750, METDI3257, Мрор_2455 и Mrad2831_1617, соответственно (рис. 1). Перечисленные гены кодируют белки, проявляющие наибольшее сходство (аминокислотная идентичность 32-40 %) с бактериальными бекзоилформиатдекарбоксилазами - группой ферментов филогенетически близких к индолил-З-пируватдекарбоксилазам и входящих в обширное семейство тиамиш1ирофосфат(ТПФ)-зависимых декарбоксилаз а-кетокислот. Аминокислотная идентичность декарбоксилаз метилобактерий с другими хорошо изученными ферментами, участвующими в биосинтезе ИУК, была еще более низкой - 15.5 % с пируватдекарбоксилазой из Zymomonas mobilis, 15.7 % с фенилпируватдекарбоксилазой из Azospirillum brasilense, 17 % с индолилпируватдекарбоксилазой из Е. cloacae и 17 % с декарбоксилазой а-кетокислот из Mycobacterium tuberculosis [Schiitz et al., 2003; Spaepen et al., 2007b; Werther et al., 2008] (рис. 1).

Несмотря на низкое сходство с известными индолилпируватдекарбоксилазами, мы предположили, что бензоилформиатдекарбоксилазы метилобактерий являются ферментами биосинтеза ИУК.

В геномах Methylobacterium sp. 4-46 и М. nodularis ORS 2060 нами обнаружены гены М446_1957 и Mnod_1238, предположительно, кодирующие пиридоксальфосфат-зависимые декарбоксилазы ароматических L-аминокислот. В отличие от остальных штаммов этого рода, гены, кодирующие декарбоксилазы а-кетокислот, в указанных штаммах отсутствуют (рис. 2). К сожалению, декарбоксилазы ароматических аминокислот (ААК) у бактерий не изучены, поэтому крайне сложно предсказать функции аналогичных ферментов из метилобактерий. Путем выравнивания аминокислотных последовательностей различных декарбоксилаз ААК мы выяснили, что наибольший процент аминокислотной идентичности ферментов из метилобактерий наблюдается с декарбоксилазами a-Proteobacteria (55-62%) (рис. 2). Ввиду широкой субстратной специфичности охарактеризованного фермента из эукариот - дигидроксифенилаланин(ДОФА)-декарбоксилазы из почек свиньи [Bertoldi et al., 2008], проявляющей наибольший уровень аминокислотной идентичности, существует большая вероятность того, что ферменты из метилобактерий могут декарбоксилировать триптофан.

96*-

TW-

lOOr

-Enterobacter cloacae (P23234)

-Salmonella typhimurium (NP 461346) -Klebsiellapneumonia (YP 00Ï336386) -Panloea agglomérons (AÄB06571) -Erwinia carotovora (YP 051693) -yersinia mollarelii (EEQ08619) -Mycobacterium tuberculosis (NP 215368) -Psychrobacter arcticus (YP 264 -Lactococcus ¡actis (AAS49I~66) -Nostoc puncliforme (YP_001865677) -Clostridium acetobutylicum (NP 149189) -Bacillus cereus ( YP 083 823), ~ -Burkholderia xenovorans (YP_555 i 76) ~Zymomonas mobilis (YP 163095) -Blastopirellula marina (ZP O 1091097) -Gloeohacter violaceus (NP_925003) ~Methylococcus capsulatus (YP 113473) -Anabaena variabilis (YP_32460^ ■Rhodopseudomonas palustris (NP 948455) ■Bradvrhizobium sp. BTAil (YP 031236700) Desülfovibrio desulfuricans (YF 388823) Rhodospirillum rubrum (YP 427803) Rhodo/erax ferrireducens (YP 521801 ) Azospirillum brasilense (2NXW'_A) 'Chromobacterium violaceum (NP 902771) ■Sulfolobus solfataricus (NP_343070) 'Thermoplasma acidophilum (NP 393976) •Pseudomonasfluorescens (YPJ250581) ■Pseudomonas aeruginosa (YP_001350945) Burkholderia xenovorans (YP~555151)

Pseudomonas ptitida (1YNO A)

'Streptomyces coel¡color (NP "531486) Burkholderia mallei (YPJ0Z164)

~Bradvrhizobium japonicum (NP 774243) -Rhodopseudomonaspalustris (YP 780185)

ИПДК

ПДК

ФПДК

I-Methylobacterium radiotolerans (YP 001754295)

Methylobacterium populi (YP_001923 152) lOffl ¡Methylobacterium extorquens AMI (YP 002963550) 1 nnVMethylobacterium extorquens DM4 (YP_O03068764) fälUelhylobacterium extorquens CM4 (YP_002421517) bVMelhylobuclerium extorquens PA1 (YP_001639992)

Рис. 1. Филогенетическое дерево аекарбоксилаз a-кстокислот бактерий.

ИПДК - индолилпируват-декарбоксилазы, ПДК -пируватдекарбоксилаза, ФПДК - фенилпируватдекарбоксилазы, БФДК - бензоилформиат-декарбоксилазы. Охарактеризованные ферменты

выделены шрифтом. В номера

аминокислотным

полужирным скобках

доступа

указаны к

последова-

тельностям соответствующих белков.

БФДК

0.2

0.0

U A CJ

•©■ s S

= £

« 3

H Q» U

Bacteria

Eukaryota

a-Proteobacteria

Animalia

Plantae

S o £ rs

5\ Sí _ (1.

o 1

-J&C-SVRb---

<r-, ^ Cj _ ' ir C5 I 2

•gbs ¿2 §

^ sh ? s ss a.;: & ~ ¿ 5i5 ^ ?-2 'C i; 3

»K.aí'C-cíSiUS -o v.

? S1® ií - ^"SS

w tor; i. G 3 —

vCrlifi 00 -3- ^

\Q -« O

s fc t: ^

». ü a

£ ce tp

2. Очистка и характеристика рекомбинантной ивдолил-3-пнруватдекарбоксилазы из Methylobacterium extorquens AMI

Ген МехАМ1_МЕТА1р2494 из М. extorquens AMI, названный нами ipdC (indole-3-pyruvate decarboxylase), клонировали в экспрессионном векторе рЕТ-22Ь(+). Посредством гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli и последующей металл-хелатной хроматографии получили электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантного белка IpdC (рис. 3).

I 2 кДа

97 fofo 2 45

»-•31

21.5 __ 14.4

Таблица 1. Кинетическнс характеристики индолил-З-пируватдекарбоксилазы М. extorquens AMI.

Субстрат АГт"(мМ) К, (мМ) k J (с1) кш/Кт( мМ"1 с"1)

Индолилпируват 0.006±0.002 0.37±0.12 0.92±0.09 153

Бензоилформиат 7.3±5.3 3.4±2.5 31.4±18.2 4.3

4-гидроксифенилпируват 5.86Ü.42 22.1U8.14 1.65±0.27 0.28

Пируват 40.5±13.8 - 1.34±0.18 0.033

Параметр Кт заменен на Ks в случае с пируватом. т кал рассчитана с учетом гомогетрамерного строения IpdC.

Методом гель-фильтрации установлено, что нативная м.м. холофермента IpdC составляет 245 кДа, что соответствует гомотетрамерной структуре. Такое строение фермента обычно для ТПФ-зависимых декарбоксилаз, поскольку все охарактеризованные ферменты являются гомотетрамерами [Schütz et al., 2003; Spaepen et al., 2007; Werther et al., 2008).

Были определены основные кинетические характеристики индолил-3-гшруватдекарбоксилазы из М. extorquens AMI (табл. 1). Несмотря на филогенетическую принадлежность к бензоилформиатдекарбоксилазам (БФДК), IpdC M extorquens AMI проявляет кинетические свойства, сходные с индолилпирувадекарбоксилазой из Enterobacter cloaceae [Schütz et al., 2003]. Напротив. IpdC значительно отличается от известных бензоилформиатдекарбоксилаз из псевдомонад по кинетическим характеристикам. Так, например, значение Кт IpdC в реакции декарбоксилирования фенилпирувата в 10-14 раз выше, чем у БФДК из псевдомонад, а также значения kcal и kcJKm значительно ниже (в 6-11 раз и в 1.8 - 3.6 103, соответственно) [Lingen et al., 2003; Saehuan et al., 2007]. Таким образом, изучив кинетические параметры рекомбинантного белка IpdC из Methylobacterium extorquens

-8-

Рнс. 3. ДСН-ПААГ-электрофорез препарата рекомбинантного IpdC из M. extorquens AMI (1) и маркеров молекулярной массы (2).

AMI, мы установили, что продуктом гена МехАМ1_МЕТА1р2494 (ipdC) является индолил-3-пируватдекарбоксилаза, филогенетически удаленная от известных ферментов этого класса. 3. Очистка и характеристика рекомбинантной декарбоксилирующей окислительной дезаминазы ароматических L-аминокислот из Methylobacterium nodularis ORS 2060

Ген Mnod_1238 из М nodularis ORS 2060, названный aodA (decarboxylation-dependent aromatic L-amino acid oxidative deaminase). предположительно, кодирующий пиридоксальфосфат-зависимую декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, клонировали в экспрессионном векторе рЕТ-22Ь(+). Гетерологичной экспрессией в клетках £ coli и последующей металл-хелатной хроматографией получен электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантного белка AodA. (рис. 4). Молекулярная масса субъединицы соответствовала теоретически рассчитанному значению (54.3 кДа).

2 кДа

"—116.0 66.2

15.0

—- 25.0

Рис. 4. ДСН-ПААГ-электрофорез препарата очищенного

рекомбинантного AodA из М. nodularis ORS 2060 (1) и маркеров молекулярной

18.4 массы (2).

- 14.4

Рис. 5. ПААГ-электрофорез в

неденатурирующих условиях препарата очищенного

рекомбинантного AodA из M. nodulans ORS 2060 (I) и маркеров молекулярной массы (2).

Методом нативного ПААГ-электрофореза препарата фермента AodA установлено, что м м. холофермента в нативном состоянии составляет примерно 108 кДа, что соответствует гомодимеру с м.м. субъединицы 54 кДа (рис. 5).

ТСХ-анализ продуктов декарбоксилирования триптофана ферментом AodA не выявил наличие ожидаемого триптамина, однако в реакционной смеси присутствовал индолил-3-ацетальдегид. Поскольку реакционная смесь не содержала сопрягающих ферментов, то это означало, что AodA, помимо декарбоксилирования триптофана, катализирует его окислительное дезаминирование:

+02 + Н20

AodA

+ NH3 + СО; + Н202

Известно, что подобную реакцию осуществляют два фермента - У322Р мутант ДОФА-

декарбоксилаза из почек свиньи и фенилацетальдегидсинтаза растений [Капнпа°а « а1„ 2006;

ВеПоШ1 М а1., 2008]. Растительная фенилацетальдегидсинтаза - единственный нативный

фермент, катализирующий подобную реакцию. Однако, как выяснилось, существенным

отличием фенилацетальдегидсинтазы от AodA метилобактерий является узкая субстратная

-9-

специфичность (активность только с фенилаланином), тогда как фермент метилобактерий способен дезаминировать L-триптофан, L-фенилаланин и L-3,4-дигидpoкcифeнилaлaнин.

Дезаминаза ароматических аминокислот AodA проявляет наибольшую активность при 37 °С и в фосфатном буфере при рН 8.0, что весьма характерно для многих декарбоксилаз ароматических аминокислот [Nakazawaet al, 1981; Facchini, De Luca, 1995].

Анализ зависимости активности фермента от природы и концентрации субстратов выявил, что фермент обладает максимальным сродством к триптофану, хотя наиболее активен при декарбоксилировании ДОФА (табл. 2).

Таблица 2. Кинетические характеристики декарбоксилирующей окислительной дезаминазы ароматических L-аминокислот из M. nodulans ORS 2060.

Субстрат Km, мМ км, мин"1 A'i, мМ п kcal/Кщ, мМ 'мшГ1

L-ДОФА 2±2 700±600 O.liO.l - 359

L-Фенилаланин 1.3±0.6 52±7 - 0.67±0.09 40

L-Триптофан 0.4±0,1 8.4±0.9 - 1.3±0.3 21

Кт фермента при дезаминировании фенилаланина практически идентична значению фенилацетальдегидсинтазы растений (1.3 против 1.2 мМ) [Kaminaga et al., 2006].

Итак, ген Mnod_1238 (aodA) из Methylobacterium nodularis ORS 2060 кодирует декарбоксилирующую окислительную дезаминазу ароматических L-аминокислот. Установлено, что рекомбинантный AodA использует L-триптофан, L-ДОФА и L-фенилаланин в качестве субстратов и, следовательно, может участвовать в биосинтезе ИУК, а также 3,4-дигидроксифенилуксусной и фенилуксусной кислот у этих бактерий. AodA, по-видимому, является новым ферментом в биосинтезе ИУК бактериями по следующему пути: триптофан —» индолил-3-ацетальдегид —► индолил-3-уксусная кислота.

4. Роль нндолил-З-пнруватдекарбоксилазы в биосинтезе ИУК у Methylobacterium extorquens AMI.

Для доказательства участия индолилпируватного пути биосинтеза ИУК был получен мутант И. extorquens &ipdC с делецией гена ipdC, кодирующего индолил-3-пируватдекарбоксилазу. При росте на среде с триптофаном, предшественником биосинтеза ИУК, концентрация индолов в культуральной жидкости мутантного штамма hipdC была в 2.5 раза меньше, чем в культуральной жидкости исходного штамма (табл. 3). Комплементация мутации вектором р7А-09 привела к увеличению в 2.5 раза содержания индолов в культуральной жидкости. ТСХ- и ВЭЖХ-анализ экстрактов культуральной жидкости бактерий показал, что содержание ИУК коррелирует с общей концентрацией индолов. Делеция гена ipdC. не привела к полной утрате способности к биосинтезу ИУК, так как в культуральной жидкости мутанта уровень ИУК составил 46% от штамма дикого типа. Мутантный штамм, содержащий в плазмиде р7А-09 ген ipdC, синтезировал в 3 раза больше ИУК. чем исходный штамм (табл. 3).

- L0 -

Таблица 3. Содержание ИУК и общая концентрация индольных соединений в культуральной жидкости различных штаммов М. еЯогциею.

Штамм Концентрация ИУК, мкг/мл Общая концентрация индолов, мкг/мл

AMI 6.13±0.33 10.1 ±0.7

tsipdC 2.84±0.02 4.0±0.4

AipdC/plA-09 18.06±0.99 24.Ш.2

Из этих данных следует, что индолилпируватный путь биосинтеза ИУК является основным путем, однако мы предположили функционирование дополнительных путей.

Рис. 6. Эффект инокуляции растений табака штаммами М. елЮгс/ием. Контроль -неинокулированное растение.

5. Влияние различных штаммов Metltylobacterium extorquens на рост гнотобиотических растений in vitro.

Чтобы оценить роль индолил-3-пируватдекарбоксилазы у М. extorquens AMI были проведены эксперименты по колонизации гнотобиотических растений табака. Инокуляция штаммом дикого типа AMI привела к увеличению длины растений (8.9 ± 0.7 см), по сравнению с неинокулированньгми (4.1 ± 0.2 см). Напротив, инокуляция мутантным штаммом ДipdC не влияла на рост растений, по сравнению с контролем (рис. 6). В то же время, комплементированный штамм стимулировал рост растений на уровне штамма дикого типа (9.5 ± 0.4 см) (рис. 6). При этом эффективность колонизации всеми штаммами была одинаковой и составила 5 * 104 КОЕ на см2 листовой поверхности. Судя по этим данным, индолилпируватдекарбоксилаза М. extorquens AMI участвует в стимуляции роста, что является одним из ключевых факторов в установлении фитосимбиоза метилобактерий. До сих пор отсутствовали данные о том, что эпифитные бактерии за счет способности к биосинтезу ауксинов стимулируют рост растений, однако подобные эксперименты проводили только с ризосферными бактериями [Spaepen et al., 2007а].

Контроль MpdC Ai/*/C7p7A-09 AMI

Таблица 4. Активности (нмоль/мии/мг) ферментов центрального метаболизма в экстрактах клеток Methylobacterium extorquens AMI и мутанта ДipdC, выращенных па минеральной среде с метанолом пли сукцииатом, без добавления н в присутствии 0.25 мМ МУК.

Фермент Кофактор Штамм AMI Штамм ДipdC

Метанол Сукцннат Метанол Сукцннат

-ПУК +ИУК -ИУК +ИУК -ИУК +ИУК -ИУК +ИУК

Метанолдегидрогеназа ФМС 169 175 4 3 165 168 16 15

Формальдегиддегидрогеназа ФМС 11 15 7 6 18 14 8 17

НАД" 1 4 0 0 1 3 0 0

НАД\ GSH 2 3 0 0 3 4 0 0

Формиатдегидрогеназа ФМС 2 1 0 0 2 3 0.2 0.5

НАД+ 43 42 0 0 34 50 0 0

Оксипируватредуктаза НАДН 244 250 151 126 201 247 93 171

НАДФН 16 18 50 47 13 14 51 88

Серин- глиоксилатаминотрансфераза НАДН 137 147 17 22 76 100 26 32

НАДФН 10 11 1 1 7 15 2 2

Глиоксилатредуктаза НАДН 42 50 25 17 27 38 25 20

Изоцитратдегидрогеназа НАДФН 20 17 67 76 24 19 54 95

Цитратсинтаза ДТНБ 5 7 29 32 25 29 34 56

а-Кетоглутаратдегидрогеназа НАД4 9 9 30 19 28 33 30 43

6. Влияние экзогенной индолил-3-уксусной кислоты на активность ферментов центрального метаболизма у Methylobacterium extorquens AMI

Известно, что экзогенная ИУК может увеличивать экспрессию генов, кодирующих ферменты центрального метаболизма Е. coli, вследствие чего возрастали активности соответствующих ферментов [Bianco et al., 2006Ь]. Мы предположили, что эндогенная ИУК бактерий-продуцентов может сглаживать стимулирующий эффект экзогенного ауксина. В таком случае, для проверки этой гипотезы целесообразно использовать мутанты по биосинтезу ауксинов, например, мутант М. extorquens hipdC.

Результаты энзимологического анализа экстрактов клеток штаммов AMI и мутанта ДipdC, выращенных на минеральной среде с метанолом или сукцинатом в присутствии и отсутствии ИУК, представлены в таблице 4. Из-за большей вариабельности в регуляции ферментов Ci-метаболизма (но не метанолдегидрогеназы) можно отметить незначительную стимуляцию их активности в случае метилотрофного роста штамма AMI.

Поскольку М extorquens AMI, в отличие от Е. coli, способен образовывать ИУК из триптофана, мы предположили, что стимулирующий эффект экзогенной ИУК на клетки штамма AMI будет менее выражен. Энзимологический анализ показал, что относительные активности большинства тестированных ферментов у штамма AipdC, образующего вдвое меньше ИУК, за исключением МДГ, формальдегиддегидрогеназы (ФМС) и изоцитратдегидрогеназы, увеличились в ответ на добавление в среду ИУК при метилотрофном росте мутанта (табл. 4).

Для оценки влияния ИУК на уровни активностей ферментов первичного Q-метаболизма и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) при гетеротрофном росте М. extorquens, эксперименты проводили на клетках, выращенных на среде с сукцинатом. При этом активности ферментов первичного Ci-метаболизма снижались, особенно формальдегид- и формиатдегидрогеназы. Напротив, повышались активности ферментов ЦТК — изоцитратдегидрогеназы, цитратсинтазы и а-кетоглутаратдегидрогеназы (табл. 4). При гетеротрофном росте мутанта уровни активностей ферментов стимулировались ИУК. В частности, уровни оксипируватредуктазы, цитратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы увеличились почти в два раза. Напротив, у родительского штамма AMI, в меньшей степени, чем у мутанта, проявлялся эффект стимуляции экзогенной ИУК уровней активности ферментов при метилотрофном и гетеротрофном росте клеток. Таким образом, мутант с нарушенным биосинтезом ИУК представляется перспективной моделью для последующего изучения молекулярных механизмов воздействия этого ауксина на метаболизм бактерий.

100Г

100

3 II

941

100

100 г

100 55

45r

зТ_г

W-

66rPseudomonas entomophila (ACQ55296) ly-Pseudomonas putida UW4 (Q5PWZ8)

'-Enterobacter cloacae (AAD05069) —Pseudomonasfluorescens (ABR26447) —Pseudomonas syringae (YP_234886) —Dickeya dadantii (YP_002989081) —Methyl,bium petroleiphilum (YP_001022786) —Diaphorobacter sp. TPSY (YP_002554583) —Burkholderia glumae (YP_002908968) j—Burkholderia thailandensis (YPjl39298) '—Burkholderia mallei (YPJ05635) —Ralstonia eutropha (YP 840884) —Sinorhizobium meliloti (ABS 19884) —Rhizobium leguminosarum (ABP88063) —Azospirillum lipoferum (ABE66282) —Mesorhizobium loti (CAD31305) —Methytobacterium radiotolerans (YP 001754199) —Azorhizobium caulinodans (YP_OÖ 1523183) —Bradyrliizobium japonicum (NP_766881) —Phyllobacterium brassicacearum (AB031418) —Agrobacterium radiobacter (YP_002541606) —Methylobacterium nodulans (YP 002500626) —Methylobacterium sp. 4-46 (YP_001767276)

0.15

0.10

0.05

0.00

Рис. 7. Филогенетическое дерево 1-амшюциклопропан-1-карбокснлатдезамнназ бактерий. Охарактеризованные ферменты выделены полужирным шрифтом. В скобках указаны номера доступа к аминокислотным последовательностям соответствующих белков.

Caulobacter sp. КЗ 1 (YP_001684805) Ruegeria pomeroyi (AAV95902) Pectobacterium wasabiae (YP_003259195) Dinoroseobacter shibae (YP_001532782) Deinococcus deserti (YP_002787455) ■Desulfovibrio vulgaris (YP 011858) ■Desulfovibrio desulfuricans (YP_002478931) ■Ralstonia eutropha (YP_297784) Yersinia pestis (YP_651133) 'itrobacter koseri (YP_001452608) ■Escherichia coli (YP_001463223)

^Escherichia coli K-12 (AP_002534)

711Shigella flexneri (YP 689412)

■Rhizobium leguminosarum (YP 002984848) ■Sinorhizobium medicae (YP_001314215) ■Burkholderia phymatum (YP_001861803) ■Burkholderia sp. 383 (YPJ66559) Methylobacterium populi (YP_001925011) ■Methylobacterium extorquens PA1 (YP 001639823) Methylobacterium extorquens CM4 (YP 002421404) ■Methylobacterium extorquens DM4 (YP_003068648) ■Methylobacterium extorquens AMI (YP_002963420) ■Arabidopsis thaliana (NP_175275)

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Рис. 8. Филогенетическое дерево О-цнстеиндесульфогидраз. Охарактеризованные ферменты выделены полужирным шрифтом. В скобках указаны номера доступа к аминокислотным последовательностям соответствующих белков.

7. Идентификация генов, кодирующих АЦК-дезаминазу и D-цистеиндесульфогидразу, в геномах Metliylobacleríum.

Для поиска в базе данных GenBank генов acdS и dcyD, кодирующих, соответственно, 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазу (АЦК-дезаминазу) и D-

цистеиндесульфогидразу, использовали аминокислотные последовательности АЦК-дезаминазы Р. pulida (ID Q5PWZ8) и D-цистеиндесульфогидразы Е. coli (АР_002534). В результате поиска при помощи программы Protein BLAST были выявлены в геномах M extorquens AMI, РА1, CM4 и DM4, а также А/. populi, гены, обозначенные МехАМ1_МЕТА1р2360, Mext_2357, Mchl_2636, METDI3140 и Мрор_2314. Они проявляли наибольшее сходство с D-цистеиндесульфогидразами. С другой стороны, гены Mrad283I_152I, Mnod_5479 и М446_0271 из M. radiololerans, M. nodulans ORS 2060 и Methyhbacterium sp. 4-41, соответственно, имели наибольшее сходство с бактериальными АЦК-дезаминазами. При этом ни один из указанных штаммов не обладал этими генами одновременно.

Выравнивание аминокислотных последовательностей белков AcdS метилобактерий с последовательностями других бактерий выявило наибольшее сходство (85 %) с АЦК-дезаминазами ризобий: Mesorhizobium, Phyllobacterium, Agrobaclerium, Bradyrhizobium и Azorhizobium (рис. 7). Филогенетический анализ позиционировал АЦК-дезаминазы из представителей рода Melhylobacterium совместно с ферментами различных ризобактерий на отдельной ветви. Другой кластер образуют АЦК-дезаминазы бета- и гаммапротеобактерий, в том числе единственный хорошо изученный фермент бактерий из Pseudomonas pulida UW4 (рис. 7) [Hontzeas et al., 2004]. Из факта высокого уровня сходства аминокислотной последовательности ферментов метилобактерий и Р. pulida (71-72%) следует, что эти ферменты действительно являются АЦК-дезаминазами.

Другую группу ферментов, гены которых идентифицированы нами в геномах метилобактерий, составляют D-цистеиндесульфогидразы (рис. 8). Выравнивание их аминокислотных последовательностей показало, что ферменты из метилобактерий практически идентичны друг другу (92-99%), в то время как наиболее близким охарактеризованным ферментом является D-цистеиндесульфогидраза из Е. coli (43%) [Nagasavvaet al., 1985].

Филогенетический анализ выявил, что D-цистеиндесульфогидразы из метилобактерий образуют отдельный кластер совместно с ферментами из Burkholderia и бактерий из семейства Rhizobiaceae, тогда как охарактеризованные ферменты из Е. coli группируются в другом кластере (рис. 8). В отличие от АЦК-дезаминаз. аминокислотная последовательность D-цистеиндесульфогидраз у бактерий различных таксонов проявляла невысокий уровень сходства (40-50%).

8. Очистка и характеристика рекомбинантной D-цистеиндесульфогидразы in Methylobacterium extorquens AMI.

Ген МехАМ1_МЕТА1р2360 из M. extorquens AMI, обозначенный в геноме dcyD (D-cysteine desulfhydrase), клонировали в экспрессионном векторе pET-22b(+). При помощи гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli и последующей металл-хелатной хроматографии получили электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантного белка DcyD (рис. 9). Молекулярная масса субъединицы DcyD соответствовала теоретически рассчитанной и составляла примерно 36 кДа.

Методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле установлено, что нативная м.м. холофермента DcyD составляет 72 кДа, что соответствует гомодимеру (рис. 10). Единственный охарактеризованный фермент бактерий из Е. coli также является гомодимером [Nagasawa et al., 1985].

D-цистеиндесульфогидраза из М. extorquens AMI обладала строгой стереоспецифичностью к D-цистеину, но была совершенно неактивна с L-цистеином. Учитывая высокий уровень сходства аминокислотной последовательности с АЦК-дезаминазами, мы проверили активность фермента DcyD при дезаминировании АЦК, однако активности не обнаружили. Кт фермента при дезаминировании D-цистеина составила 0.46 ± 0.07 мМ, что хорошо согласуется с данными для D-цистеиндесульфогидраз из Е. coli и А. thaliana (0.15 и 0.25 мМ, соответственно) [Nagasawa et al., 1984; Riemenschneider et al., 2005]. kca фермента составила 313 ± 28 мин"', при этом наблюдали эффект ингибирования избытком субстрата (^ 3.2 ± 0.6 мМ) (Рис. 11).

1 2 кДа ^ 2 ^кДа

Рис. 9. ДСН-ПААГ- •""•» 669 Рис. 10. ПААГ-

. 97 электрофорез _ ..„ электрофорез препарата

662 препарата DcyD из М. extorquens AMI

рекомбинантного белка " маркеров

45 DcyD из М. extorquens 232 молекулярной массы (2) в

AMI (1) и маркеров ,40 нативных условиях. D-

молекулярнои массы

цистеиндесульфогидразу

' ' 31 (2). окрашивали инкубацией в

реакционном буфере (50 «М» . 67 мМ Трис-HCl, pH 9,0; 0.5 : мМ D-цистеин; 0.02 мМ

** 14.4 (СН3СОО)2РЬ), маркеры

окрашивали кумасси синим.

D-цистеиндесульфогидраза наиболее активна в 50 мМ HEPES при pH 9.0.

Температурный оптимум фермента оказался смещен в область повышенной температуры.

Максимальную активность наблюдали при 65 °С. В целом, полученные результаты хорошо

согласуются с pH-оптимумом D-цистеиндесульфогидразы из Е. coli [Nagasawa et al., 1984].

Температурный оптимум фермента из Е. coli также смещен в область повышенной

-16-

температуры (45 °С). однако, он значительно ниже, чем у фермента из М. extorquens AMI [Nagasawaet al.. 1984].

D-цистеин, мМ

Рис. 11. Зависимость активности D-цистеиндесульфогидразы от концентрации D-цистеина.

Для дополнительного доказательства того, что ген dcyD кодирует D-цистеиндесульфогидразу, был получен делеционный мутант М extorquens AdcyD. Эта мутация привела к полной потере способности белковых экстрактов превращать D-цистеин в пируват(Рис. 12). Напротив, комплементация данной мутации вектором р7А-25 существенно повысила активность DcyD в экстрактах (Рис. 12). Зимограммы белковых экстрактов штаммов М. extorquens подтвердили результаты этимологического анализа (Рис. 12). Так, на зимограмме экстрактов штаммов AMI и AdcyD/р7А-25 обнаружены пятна, соответствующие D-цистеиндесульфогидразе М. extorquens AMI. тогда как экстракт штамма AdcyD этих пятен не давал. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у М extorquens AMI нет изоферментов D-цистеиндесульфогидразы. Следовательно, ген dcyD кодирует единственную D-цистеиндесульфогидразу у М extorquens AMI.

AM 1 MpdC MpdCJpl A-25

2.3±0.2 H.o. 130.2±5.9 Рис. 12. ПААГ-электрофорез белковых экстрактов штаммов М. extorquens AMI,

мутанта AipdC и комплементированного мутанта MpdC/p7\-25 в нативных условиях.

D-цистеиндесульфогидразную активность в геле выявляли при помощи инкубации в реакционном буфере [50 мМ Трис-HCl, рН 9.0; 0.5 мМ D-цистеин; 0.02 мМ (СН3СОО)2РЬ]. Цифры представляют среднее значение (± стандартная ошибка среднего значения) активности D-цистеиндесульфогидразы в белковых экстрактах, нмоль мин"1 на 1 мг белка. Н.о. - не обнаружена.

кДа 97

66.2

His6-Ub-AcdS - 45

AcdS

21.5

His6-Ub — 14.4

Рис. 13. ДСН-ПААГ-электрофорез препаратов рекомбинантного белка AcdS из М. пиПоШегат ЛСМ2831 после очистки при помощи металл-хелатной хроматографии (1), после обработки деубиквитинилирующей протеазой иэр2 (2), очищенного процессированного белка (3) и маркеров молекулярной массы (4).

Рис. 14. ПААГ-электрофорез препарата AcdS из М. radiotolerans JCM2831 в натнвных условиях. А - Окрашивание геля кумасси синим. Препарат AcdS (1) и маркеры молекулярной массы (2). Б - Зимограмма АЦК-дезаминазной активности в геле, полученная при помощи инкубации в реакционном буфере (50 мМ калий фосфатный буфер, рН 8,0; 2 мМ АЦК; 0,2 мМ пиридоксальфосфат; 0,05 мг/мл феназинметосульфата; 0,1 мг/мл

нитротетразолиевого синего).

9. Клонирование и характеристика 1-аминоцнклопропан-1-карбоксилатдезаминазы из Metliylobacterium radiotolerans JCM2831.

Ген Mrad2831 1521 из М. radiotolerans JCM2831, обозначенный нами acdS (1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase structural gene), клонировали в экспрессионном векторе pHUE. Гетерологичной экспрессией в клетках Е. coli с последующей металл-хелатной хроматографией был получен электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантного белка AcdS, слитого на N-конце с убиквитином и 6 гистидиновыми остатками (рис. 13). Это позволило при помощи деубиквитинилирующей протеазы Usp2 получить фермент AcdS с аминокислотной последовательностью, полностью соответствующей закодированной в геноме М. radiotolerans. Молекулярная масса субъединицы AcdS была равна рассчитанной теоретически и составляла — 36 кДа (рис. 13).

Методом нативного ПААГ-электрофореза установлено, что нативная м.м. активного холофермента AcdS составляет 117 кДа, что превышает массу гомотримера (108 кДа), но значительно меньше - гомотетрамера (144 кДа) (рис. 14а,б). Интересно отметить, что охарактеризованный фермент из P. putida был первоначально описан как гомотример [Jacobson et al., 1994]. однако, детальное изучение четвертичной структуры установило, что АЦК-дезаминаза кристаллизуется в виде гомотетрамера [Karthikeyan et al., 2004]. Несмотря на это, считается, что АЦК-дезаминазы псевдомонад являются гомодимерами, подобно

1 2 кДа A 440

232 iw 140

Л -Л

ферментам дрожжей [Yao et al., 2000]. По-видимому, активная форма АЦК-дезаминазы метилобактерий также является гомодимером, однако, как и у ферментов псевдомонад, существует динамическое равновесие между олигомерами фермента, затрудняющее точное определение молекулярной массы.

АЦК-дезаминаза из И. radiotolerans была неактивна с D-цистеином и L-цистеином. Кт фермента при дезаминировании АЦК составила 2.2 ± 0.6 мМ, что вполне согласуется с таковыми АЦК-дезаминаз псевдомонад (1.5 -3.4 мМ) [Honma and Shinomura, 1978; Hontzeas et al, 2004] и Hansenula saturnus (2.6 мМ) [Honma and Shinomura, 1978]. ксЛ фермента составила 53.3 ± 4.4 мин"1, причем зависимость активности фермента от концентрации субстрата проявляла небольшое отклонение от кинетики Михаэлиса-Ментен (п = 0.8 ±0.1) (Рис. 15). Несмотря на то, что на графике реакции при дезаминировании АЦК наблюдали значительную лаг-фазу, кинетический анализ не выявил эффекта кажущейся активации избытком субстрата. Очевидно, это связано с олигомерным состоянием фермента. По-видимому, при добавлении субстрата неактивный тримерный фермент переходит в активную димерную форму.

1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота, мМ Рис. 15. Зависимость активности 1-амн110циклопропан-1-карбоксилатдезампназы от концентрации АЦК.

АЦК-дезаминаза проявляла наибольшую активность в 50 мМ TAPS при pH 8.0. рН-оптимумы АЦК-дезаминаз псевдомонад либо идентичны таковым фермента из М. radiotolerans [Hontzeas et al., 2004; Todorovic and Glick, 2008], либо несколько смещены в сторону повышенных значений pH 8.5-9.0 [Honma and Shinomura, 1978; Jacobson et al., 1994]. Температурный оптимум фермента оказался смешен в область повышенной температуры. Максимальную активность наблюдали при 45 "С. Напротив, температурный оптимум ферментов псевдомонад находился в диапазоне 30-37 °С [Jacobson et al., 1994; Todorovic and Glick, 2008]. Таким образом, ген acdSM. radiotolerans кодирует АЦК-дезаминазу.

М 12 3-1 5 6 7 8 9 10 11 12 13 /4 ISM

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М

f ■*— 480 п.н.

! », fill I | , ■♦—680n.It.

Рис. 16. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплнфикацни фрагментов «//-генов различных диазотрофов с использованием сочетаний нраимеров F1 - nif'H-Зг (А) и nifD-2f- nif'0-l г (Б). I - Azospiri/him brasilense Sp7, 2 - Beijerinckia mobilis, 3 - Bradyrhizobium japonicum, 4 -Burkholderia sp. R22, 5 - Desidjavibrio desulfuricans, 6 — Erwiniu carolovora, 7 — Methanothermobacter thermoautotrophicus, 8 — Methcmosurcinu barkerii, 9 - Methylobacter marinus 1С, 10 - Methylococcus capsulalus Bath, 11 - Methylomonas melhunicii Si, 12 - Melhylosinus irichosporium OB3b, 13 - Rhizobium leguminosarum VF39, 14 - Xanihobader auloirophicus, 15 - контрольная ПЦР без ДНК, M - маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler DNA Ladder Mix 100 - 10000 bp (Fermentas, Литва).

10. Разработка системы вырожденных праймеров для амплификации фрагментов генов nifHD

На основе представленных в базе данных GenBank известных последовательностей генов nifHD нами разработана система из нескс/ьких вырожденных олигонуклеотндных праймеров для амплификации генов nifHD. Данная система праймеров была проверена на 14 коллекционных штаммах диазотрофных бактерий различного таксономического положения (рис. 16). В целом, удалось получить ПЦР-продукты для всех исследованных диазотрофов, что указывает на «универсальность» данной системы и перспективность ее применения при идентификации новых диазотрофов, в том числе - метилотрофных.

В итоге, нами проанализированы 18 коллекционных штаммов метилобактерий, принадлежащих к 15 видам и реализующих различные пути С|-ассимиляции: Hansschlegelia plantiphila штаммы Si, S2, S4, Paracoccus methylutens, Ângulomicrobium letraedrale, Albibacter methylovorans, Beijerinckia mobilis, Xanthobacter aulotrophicus (рибулозобисфосфатный путь); M extorquens G10 и TK0001, M dichloromelhanicum, Methylopila capsulata (сериновый путь); Methylovorus mays C, Methylophaga murata, Methylobacillus pratensis, Methylovorus glucosetrophus, Methylophilus quaylei, Methylobacillus glycogenes (рибулозомонофосфатный путь), но специфические ПЦР-продукты были обнаружены только в случае Beijerinckia и Xanthobacter, для которых азотфиксация показана ранее [Kennedy, 2005; Wiegel, 2005]. Следовательно, в отличие от метанотрофов, у метилобактерий способность к азотфиксации встречается значительно реже. Более того, анализ геномов метилобактерий, структура которых определена в последнее время, полностью подтверждает результаты данной работы.

11. Содержание витамина Вп в клетках.

Наши исследования показали, что метилобактерии и метанотрофы различного таксономического положения синтезируют, кроме фитогормонов, витамин В12 с выходом 5800 нг/л (табл. 5). Согласно литературным данным, растения не способны синтезировать витамин В [2, поэтому, ассоциированные с ними бактерии могут поставлять эти вещества. Согласно литературным данным, растения не способны синтезировать витамин В12, поэтому ассоциированные с растениями метилобактерии могут поставлять этот кофактор, необходимый для реакций изомеризации и трансметилирования. Кроме того, метилобактерии способны косвенно стимулировать рост и развитие растений за счет активации роста ауксотрофной по витамину В ¡2 эпифитной микрофлоры.

Культуры В12 (нг/л)

Methylobacterium extorquens В12 41.6

Methylobacterium extorquens AM 1 54

Methylobacterium extorquens NCIMB 9399T 40.9

Methylobacterium dichloromethanicum DM4T 50

Methylobacterium sp. G-10 (клетки) 800

Methylobacterium sp. G-! 0 (культуральная жидкость) 5.8

Methylobacterium mesophilicum JCM 2829' (клетки) 590

Methylobacterium mesophilicum JCM 2829т (культуральная жидкость) 0

Methylovorus mays С 0

Methylobacilhis fructoseoxidans 34 6.3

Methylophilus methylotrophus NCIMB 10515T 6.7

Methylomonas methanica S| BKM В - 2110T 37.3

Methylosinus trichosporium OB3b BKM В - 2117T 16

Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (клетки) 29.6

Hansschlegelia plantiphila S1 0.9

Hansschlegelia plantiphila Sz 14.4

Hansschlegelia plantiphila S4 14

Paracoccus sp. S5 117.3

Methylobacterium extorquens Si 48.1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые у метилотрофных бактерий обнаружены гены, кодирующие ферменты биосинтеза ауксинов - индолил-3-пируватдекарбоксилазы и декарбоксилирующей оксилительной дезаминазы ароматических L-аминокислот. Установлено, что индолил-3-пируватный путь является основным путем биосинтеза ИУК у Methylobacterium extorquens AMI, хотя не исключается функционирование альтернативных путей с участием неизвестных ферментов. У другого представителя рода М. nodulans - ферментом биосинтеза ауксинов является обнаруженный нами фермент AodA, катализирующий реакцию прямого окисления триптофана до индолил-3-ацетальдегида. Интересно отметить, что штаммы М extorquens обычно ассоциированы с филлосферой растений. Напротив, М. nodulans выделен из корневых клубеньков. Выявленное разнообразие путей биосинтеза ауксинов у метилобактерий свидетельствует о важной функциональной роли ИУК в фитосимбиозе. Действительно, наши предварительные результаты по инокуляции растений различными штаммами М. extorquens, в том числе мутантным по биосинтезу ИУК, подтверждают ключевую роль ИУК в стимуляции метилобактериями роста растений. Наряду с этим, экзогенный ауксин может стимулировать уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма самих метилобактерий, что свидетельствует о влиянии фитогормонов растений на бактерии.

Очевидно, что метилотрофы при росте на поверхности и внутри тканей растений потребляют не только метанол, но также в качестве источников азота могут использовать такие аминокислоты растений, как 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту и Р-цистеин. Известно, что способность бактерий к дезаминированию АЦК - предшественника фитогормона этилена, образуемого растениями, приводит к различным физиологическим эффектам - повышению устойчивости растений к стрессам, задержке старения [бПск е! а!., 2007]. В данной работе впервые у метилобактерий изучена рекомбинантная АЦК-дезаминаза, позволяющая бактериям влиять на уровень биосинтеза этилена в растениях. Значение АЦК-дезаминазы в фитосимбиозе подчеркивается тем фактом, что гены, кодирующие данный фермент, распространены только у бактерий, ассоциированных с растениями. Кроме того, впервые у метилобактерий описана рекомбинантная О-цистеиндесульфогидраза, которая, по-видимому, также участвует в ассоциации с растениями, повышая устойчивость растений к фитопатогенам за счет образования сероводорода, действующего как фунгицид.

Кроме того, нами показана способность метилотрофов к биосинтезу витамина Вп, за счет которой метилобактерии могут стимулировать как рост растений, так и ауксотрофных по этому витамину микроорганизмов, входящих в эпифитное сообщество. Разработанная нами система ПЦР-идентификации генов нитрогеназы позволит провести анализ новых изолятов и расширить спектр метилотрофных фитосимбионтов, способных к азотфиксации, а также исследовать их участие в азотном метаболизме растений.

Учитывая накопленные к настоящему моменту знания, метилотрофы перспективны не только как модельные организмы в изучении физиолого-биохимических и молекулярно-генетических основ фитосимбиоза, но и для применения в сельском хозяйстве как стимуляторы роста и развития растений и системной устойчивости к фитопатогенам. Обоснованность использования метилотрофов (особенно облигатных), продиктована тем, что они не патогенны для человека, животных и растений, а вместе с этим, обладают множеством полезных свойств. Дополнительным преимуществом препаратов на основе метилотрофных бактерий является способность всех растений выделять метанол и другие Отсоединения, что, по-видимому, полностью или частично снимает проблему специфичности симбиоза бактерий с растениями.

В целом, полученные нами приоритетные данные о метаболических аспектах фитосимбиоза метилобактерий приблизили не только к лучшему пониманию метаболических основ этого процесса, но и к разработке нового поколения препарата — стимулятора роста растений - «метилобактерина».

ВЫВОДЫ

1. Впервые у метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens AMI клонирован ген ipdC и охарактеризована рекомбинантная индолил-3-пируватдекарбоксилаза, ключевой фермент ИПвК-пуги биосинтеза ауксинов. Фермент является гомотетрамером (245 кДа), декарбоксилирует индолил-3-пируват (Кт 6 мкМ, ксл 0.92 с"'), бензоилформиат (Кт 7.3 мМ, tat 31.4 с ), 4-гидроксифенилпируват (Кт 5.9 мМ, Acat 1.6 с1) и пируват(Кт 40.5 мМ, ¿«i 1.3 с"'). Показано стимулирующее влияние экзогенной ПУК на уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма метанола у мутанткого штамма М. extorquens AipdC, что свидетельствует об участии ИУК в регуляции метаболизма метилобактерий.

2. У Methylobacterium nodulans идентифицирован ген aodA и охарактеризован новый фермент биосинтеза ауксинов - декарбоксилирующая окислительная дезаминаза ароматических L-аминокислот. Фермент является гомодимером (108 кДа), дезаминирующим L-триптофан (Кт 0.4 мМ, kat 8.4 мин"1), L-фенилаланин (Кт 1.3 мМ, ксл 52 мин'1) и L-ДОФА (Кт 2 мМ, kcl, 700 мин'1) при оптимальных значениях рН (8.0) и температуры (37 °С).

3. Впервые у метилотрофных бактерий клонированы гены acdS и dcyD, кодирующие ферменты деградации аминокислот растений - 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и D-цистеина - АЦК-дезаминаза из Methylobacterium radiotolerans и D-цистенидесульфогидраза из М. extorquens AMI.

4. Установлено, что аэробные метилотрофные бактерии различного таксономического положения синтезируют витамин Вц (6-800 нг/л). Максимальное содержание витамина В12 обнаружено у представителей рода Methylobacterium — М. extorquens G10 и М. mesophiiicum.

5. Разработана новая система олигонуклеотидных праймеров для детекции структурных генов нитрогеназы (nifHD), позволяющая оценить способность к азотфиксации у различных таксономических групп прокариот.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Иванова Е.Г., Федоров Д.Н , Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Образование витамина Bu аэробными метилотрофными бактериями // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 570-572.

2. Федоров Д.Н., Иванова Е.Г., Доронина, Е.Г., Ю.А. Троценко Новая система вырожденных олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации mfHD генов // Микробиология.

2008. Т. 77. № 2. С. 286-288.

3. Федоров Д.Н., Бут С.Ю., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Влияние экзогенной индолилуксусной кислоты на активность ферментов центрального метаболизма у Methylobacterium extorquens II Микробиология. 2009. T. 78. № 6. С. 844-846.

4. Доронина КВ., Федоров Д.Н., Троценко Ю.А., Смолянина С.О., Беркович Ю.А. Стимуляция облигатными метилотрофными бактериями морфогенеза и антигрибной устойчивости китайской капусты Brassica chinensis L. II Биотехнология. 2009. № 6. С. 56-61.

5. Беркович ЮЛ., Доронина Н.В., Федоров Д.Н., Мухамедиева JI.H., Микос КН., Кривобок Н.М., Смолянин В.Г., Смолянина С. О., Шантурин Н.А. Влияние ассоциированных с растениями аэробных метилотрофных бактерий на динамику концентрации метана и метанола в атмосфере герметичной камеры // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. Т. 44. №1. С. 54-58.

Тезисы:

1 Иванова Е.Г., Федоров Д.Н., Гвоздева ДА. Schlegelia pianliphila gen. nov. sp. nov. - новый таксон аэробных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Сборник тезисов 9-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века». Пущино. 2005. С. 216

2 Иванова Е.Г., Федоров Д.Н. Взаимосвязь аэробных метилотрофных бактерий с растениями // Сборник тезисов Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. 2005. С. 31.

3 Федоров Д.Н, Иванова Е.Г Многие аэробные метилобактерии не обладают «//-генами // Сборник тезисов 10-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука 21 века». Пущино. 2006. С. 216.

4 Ivanova E.G. and Fedorov D.N. Metabolic aspects of methylotrophie bacteria associated with plants II Book of abstract the young scientists and students international scientific conférence "Modem problems of microbiology and biotechnology". Odesa. 2007. P. 7.

5 Ivanova E.G., Fedorov DN., Doronina N.V., Trotsenko У.А. Metabolic aspects of methylotrophie bacteria associated with plants II Book of abstracts the Ilnd international symposium "Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture". Kiev. 2007. P. 127

6 Федоров Д.Н., Иванова Е.Г. Клонирование и характеристика гена биосинтеза ауксинов у Methylobacterium extorquens AMI // Сборник тезисов 3-ей Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. 2007. С. 119.

7 Доронина Н.В., Федоров Д.Н., Гоглева А.А. Фитосимбиоз аэробных метилотрофных бактерий: теоретические и прикладные аспекты II Сборник тезисов XII Съезда микробиологического общества Украины им. С.М. Виноградского. Ужгород, Украина. 2009. С. 10.

8 Федоров Д.Н. Биосинтез индолил-З-уксусной кислоты аэробными метилотрофными бакгериями-фитосимбионтами // Сборник тезисов V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». М.: МАКС Пресс, 2009. С. 61-62.

9 Доронина Н.В., Федоров Д.Н. Фитосимбиоз аэробных метилотрофных бактерий: теоретические и прикладные аспекты И Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва.

2009. С. 57.

10 Федоров Д.Н Окислительная декарбоксилирующая дезаминаза ароматических L-аминокислот -новый фермент биосинтеза ауксинов // Сборник тезисов 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века». Пущино. 2010. Т.2. С.270-271.

11 Щихсаидов М.В., Федоров Д.Н. Характеристика D-цистеиндесульфогидразы Methylobacterium extorquens и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазы Methylobacterium radiotolerans II Сборник тезисов 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология —наука 21 века». Пущино. 2010. Т. 2. С. 275.

Подписано в печать:

12.05.2010

Заказ № 3710 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федоров, Дмитрий Николаевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ б ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий

Глава 2. Физиолого-биохимические основы ассоциации бактерий с растениями

2.1. Типы ассоциации бактерий с растениями

2.2. Косвенное влияние бактерий на рост и развитие растений

2.3. Прямое влияние бактерий на рост и развитие растений

Глава 3. Ассоциации аэробных метилотрофых бактерий с растениями

3.1. Биоразнообразие аэробных метилотрофных бактерий, ассоциированных с растениями.

3.2. Ассоциация аэробных метанотрофов с растениями

3.3. Молекулярные механизмы ассоциации метилотрофов с растениями

3.4. Биосинтез цитокининов аэробными метилотрофами

3.5. Биосинтез ауксинов аэробными метилотрофными бактериями

3.6. 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазау метилобактерий

3.7. Примеры косвенного влияния метилотрофов на растения

3.8. Метилотрофные бактерии и азотный метаболизм растений

3.9. Влияние метилотрофных бактерий на рост и развитие растений in vivo

3.10. Биосинтез витамина Вп аэробными метилотрофами 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Объекты исследований

4.2. Культивирование бактерий

4.3. Молекулярно-биологические методы

4.3.1. Общие методы

4.3.2. Мутагенез

4.3.2. Комплементация мутаций

4.3.3. Создание векторов для сверх-экспрессии рекомбинантных белков

4.3.4. ПЦР-ампилификация nifHD-генов различных бактерий

4.3.5. Филогенетический анализ

4.4. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

4.5. Гельпроникающая хроматография

4.6. Нативный ПААГ-электрофорез и зимографический анализ

4.7. Определение активностей ферментов

4.8. Выделение и анализ ауксинов

4.9. Эксперимент по влиянию экзогенной ИУК на метаболизм М. extorquens

4.10. Эксперимент по инокуляции гнотобиотических растений

4.11. Определение содержания витамина В

4.12. Статистическая обработка данных 61 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Характеристика генов и ферментов биосинтеза ауксинов у метилобактерий

5.1. Поиск генов, кодирующих ферменты биосинтеза ИУК, в геномах представителей рода Methylobacterium

5.2. Очистка и характеристика рекомбинантной индолил-3-пируватдекарбоксилазы из Methylobacterium extorquens AMI"

5.3. Очистка и характеристика рекомбинантной декарбоксилирующей окислительной дезаминазы ароматических L-аминокислот из Methylobacterium nodularis ORS

5.4. Роль индолил-3-пируватдекарбоксилазы в биосинтезе ИУК у Methylobacterium extorquens

5.5. Влияние различных штаммов Methylobacterium extorquens на рост гнотобиотических растений in vitro.

5.6. Влияние экзогенной ИУК на активность ферментов центрального метаболизма у Methylobacterium extorquens AMI

Глава 6. Ферменты катаболизма 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и D-цистеина у метилобактерий

6.1. Поиск генов, кодирующих АЦК-дезаминазу и D-цистеиндесульфогидразу в геномах представителей рода Methylobacterium

6.2. Очистка и характеристика рекомбинантной D-цистеиндесульфогидразы из Methylobacterium extorquens AMI

6.3. Делеция гена D-цистеиндесульфогидразы у Methylobacterium extorquens

6.4. Клонирование и характеристика 1-аминоциклопропан-1карбоксилатдезаминазы из Methylobacterium radiotolerans JCM

Глава 7. Оценка способности метилотрофов к азотфиксации и биосинтезу витамина В

7.1. Разработка системы вырожденных праймеров для амплификации фрагментов генов nifHD

7.2. Содержание витамина В12 в клетках 96 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98 ВЫВОДЫ 100 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГЛ - А^-ацилгомосеринлактон

АЦК - 1 -аминоциклопропан-1 -карбоновая кислота

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

АМФ - аденозинмонофосфорная кислота

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота

ВКМ - Всероссийская Коллекция Микроорганизмов

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

5,6-ДМБ - 5,6-диметилбензимидазол

ДОФА - 3,4-дигидроксифенилаланин

ДОФАмин - 3,4-дигидроксифепилэтиламин

ДСН - додецилсульфат натрия

ДХФИФ - дихлорфенолиндофенол

ИПТГ - изопропил-Р-тиогалактопиранозид

ИАА - индолил-3-ацетальдегид

ИАМ - индолил-3-ацетамид

ИАН - индолил-3-ацетонитрил

ИБ - индолил-3-бутират (ин до ли л-3-масляная кислота)

ИМК - индо ли л-3-молочная кислота

ИПвК - индолил-3-пировиноградная кислота

ИСУ - индуцированная системная устойчивость

ИУК - индолил-3-уксусная кислота

МДГ - метанолдегидрогеназа

НАД+/ НАДНг - окисленный/восстановленный никотинамиддинуклеотид

НАДФ+/НАДФН2 - восстановленный никотинамиддинуклеотидфосфат

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБФ -рибулозо-1,5-бисфосфат

РБФК/О - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа

РМФ - рибулозомонофосфат

РОФМ - розовоокрашенный факультативный метилотроф

СПУ - системная приобретенная устойчивость

ТАМ - триптамин

ТГФ - тетрагидрофолат

ТПФ - тиаминпирофосфат тех - тонкослойная хроматография

ФГА - 3-фосфоглицериновый альдегид

3-ФГК - 3-фосфоглицериновая кислота

ФДГ - формиатдегидрогеназа

ФЕП - фосфоенолпировиноградная кислота

ФМС - феназинметосульфат

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

DMAPP - диметилаллилпирофосфат

GSH - восстановленный глутатион iPA - изопентенил-5'-аденозин iPMP - изопентенил-5 '-аденозинмонофосфат iPTP/iPDP - изопентенил-5'-аденозинтрифосфат/дифосфат iP - изопентенил-5'-аденин

PQQ - пирролохинолинхинон

Trp - триптофан

TSO - оксидаза боковой цепи триптофана

ZMP - зеатинрибозид-5'-монофосфат

ZR - зеатинрибозид

ZTP/ZDP -зеатинрибозид-5'-трифосфат/дифосфат

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий"

Актуальность проблемы. Аэробные метилотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, широко распространены в природе и часто ассоциированы с растениями. Эти бактерии обнаружены в семенах, филлосфере и ризосфере растений [Corpe, Rheem, 1989; King, 1994; Holland, 1997а; Доронина, 1999; Троценко с соавт., 2001; Доронина с соавт., 2004]. До недавнего времени основной ролью метанотрофов и метилобактерий в природе считали участие в глобальном цикле углерода, в частности, в снижении эмиссии метана, чей парниковый эффект в 20 раз превышает действие СОг- Относительно недавно стало известно, что метан, метанол, метиламины и метилсернистые соединения являются естественными продуктами метаболизма растений, что объясняет постоянную связь метилотрофов с растениями [MacDonald et al., 1993; Fall, 1996; Hanson and Roje, 2001; Keppler et al., 2006, 2008].

Используя Ci-метаболиты растений в качестве источников углерода и энергии, метилотрофы, в свою очередь, влияют на рост и развитие растений путем секреции биоактивных соединений - фитогормонов (ауксинов, цитокининов), а также витаминов [Доронина с соавт., 2001; Иванова с соавт., 2001]. Кроме того, появились сведения о влиянии метилотрофов на рост и развитие растений за счет активности 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазы, снижающей уровень биосинтеза стрессового гормона - этилена в растениях. Метилотрофы также могут косвенно стимулировать рост растений, вызывая индуцированную системную устойчивость к фитопатогенным грибам [Madhaiyan et al., 2004, 2006b].

В последнее десятилетие фитосимбиоз аэробных метилотрофных бактерий исследуется весьма активно, чему в немалой степени способствуют многочисленные проекты по секвенированию геномов различных метилотрофов, особенно представителей рода Methylobacterium [Vuilleumier et al., 2009]. Несмотря на интенсивное изучение метаболических основ фитосимбиоза метилотрофов, неизвестными остаются многие вопросы относительно генов и ферментов, определяющих взаимодействие бактерий с растениями.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью работы было выяснение метаболических аспектов фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий. Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Исследовать гены и ферменты путей биосинтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) у представителей рода Methylobacterium.

3. Определить способность аэробных метилотрофных бактерий синтезировать витамин В12 и фиксировать N2. Разработать систему вырожденных олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации генов нитрогеназы, фермента, ответственного за фиксацию молекулярного азота.

Научная новизна работы. Впервые у метилотрофов клонирован ген и охарактеризована рекомбинантная иидолил-3-пируватдекарбоксилаза, ключевой фермент индолилпируватного (ИПвК)-пути биосинтеза ауксинов. Установлено, что ИПвК-путь определяет способность филлосферного штамма Methylobacterium extorquens AMI удлинять стебли растений. Показано стимулирующее влияние экзогенной ИУК на уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма метанола у мутантного штамма М. extorquens AipdC. У ризосферного штамма Methylobacterium nodulans идентифицирован ген и охарактеризован новый фермент биосинтеза ауксинов -декарбоксилирующая окислительная дезаминаза ароматических L-аминокислот.

Установлено, что аэробные метилотрофные бактерии различного таксономического положения способны синтезировать и поставлять растениям витамин В12. Выявлено, что азотфиксация, характерная для метанотрофов, менее распространена у метилобактерий.

Научно-практическое значение.

Разработанная система олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации генов нитрогеназы - nifHD позволяет оценить способность к фиксации атмосферного азота бактерий различного таксономического положения в чистых культурах и сообществах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 11 тезисов.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ РАН по теме «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.2.007 08221).

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Ивановой Е.Г., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц., к.б.н. Капаруллиной Е.Н., к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Торгонской M.JI., к.б.н. Бесчастному А.П., д.б.н. Хмелениной В.Н., всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов (ИБФМ РАН, г. Пущино), а также к.б.н. Чернышову С.В. (ФИБХ РАН).

Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Дорониной Н.В. за постоянное внимание и поддержку.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 288 ссылок, содержит 9 таблиц и 30 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Федоров, Дмитрий Николаевич

выводы

1. Впервые у метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens AMI клонирован ген ipdC и охарактеризована рекомбинантная индолил-3-пируватдекарбокеилаза, ключевой фермент ИПвК-пути биосинтеза ауксинов. Фермент является гомотетрамером (245 кДа), декарбоксилирует индолил-3-пируват (Кт 6 мкМ, kcat 0.92

• с"1), бензоилформиат (Кт 7.3 мМ, ксЛ 31.4 с"1), 4-гидроксифенилпируват 5.9 мМ, kcat 1.6 с"1) и пируват (Кт 40.5 мМ, kcat 1.3 с"1). Показано стимулирующее влияние экзогенной ИУК на уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма метанола у мутантного штамма М. extorquens AipdC, что свидетельствует об участии ИУК в регуляции метаболизма метилобактерий.

2. У Methylobacterium nodulans идентифицирован ген aodA и охарактеризован новый фермент биосинтеза ауксинов - декарбоксилирующая окислительная дезаминаза ароматических L-аминокислот. Фермент является гомодимером (108 кДа), дезаминирующим L-триптофан (Кт 0.4 мМ, kcat 8.4 мин"1), L-фенилаланин (Кт 1.3 мМ, kcat 52 мин"1) и L-ДОФА (Кт 2 мМ, £cat 700 мин"1) при оптимальных значениях рН (8.0) и температуры (37 °С).

4. Установлено, что аэробные метилотрофные бактерии различного таксономического положения синтезируют витамин В12 (6-800 нг/л). Максимальное содержание витамина В12 обнаружено у представителей рода Methylobacterium - М. extorquens G10 и М. mesophilicum.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые у метилотрофных бактерий обнаружены гены, кодирующие ферменты биосинтеза ауксинов - индолил-3-пируватдекарбоксилазы и декарбоксилирующей оксилительной дезаминазы ароматических L-аминокислот. Установлено, что индолил-3-пируватный путь является основным путем биосинтеза ИУК у Methylobacterium extorquens AMI, хотя не исключается функционирование альтернативных путей с участием неизвестных ферментов. У другого представителя рода М. nodulans — ферментом биосинтеза ауксинов является обнаруженный нами фермент AodA, катализирующий реакцию прямого окисления триптофана до индолил-3-ацетальдегида. Интересно отметить, что штаммы М. extorquens обычно ассоциированы с филлосферой растений. Напротив, М. nodulans выделен из корневых клубеньков. Выявленное разнообразие путей биосинтеза ауксинов у метилобактерий свидетельствует о важной функциональной роли ИУК в фитосимбиозе. Действительно, наши предварительные результаты по инокуляции растений различными штаммами М. extorquens, в том числе мутантным по биосинтезу ИУК, подтверждают ключевую роль ИУК в стимуляции метилобактериями роста растений. Наряду с этим, экзогенный ауксин может стимулировать уровни активностей ферментов первичного и центрального метаболизма самих метилобактерий, что свидетельствует о влиянии фитогормонов растений на бактерии.

Очевидно, что метилотрофы при росте на поверхности и внутри тканей растений потребляют не только метанол, но также в качестве источников азота могут использовать такие аминокислоты растений, как 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту и D-цистеин. Известно, что способность бактерий к дезаминированию АЦК предшественника фитогормона этилена, образуемого растениями, приводит к различным физиологическим эффектам - повышению устойчивости растений к стрессам, задержке старения [Glick et al., 2007]. В данной работе впервые у метилобактерий изучена рекомбинантная АЦК-дезаминаза, позволяющая бактериям влиять на уровень биосинтеза этилена в растениях. Значение АЦК-дезаминазы в фитосимбиозе подчеркивается тем фактом, что гены, кодирующие данный фермент, распространены только у бактерий, ассоциированных с растениями. Кроме того, впервые у метилобактерий описана рекомбинантная D-цистеиндесульфогидраза, которая, по-видимому, также участвует в ассоциации с растениями, повышая устойчивость растений к фитопатогенам за счет образования сероводорода, действующего как фунгицид.

Кроме того, нами показана способность метилотрофов к биосинтезу витамина В12, за счет которой метилобактерии могут стимулировать как рост растений, так и ауксотрофных по этому витамину микроорганизмов, входящих в эпифитное сообщество.

Разработанная нами система ПЦР-идентификации генов нитрогеназы позволит провести анализ новых изолятов и расширить спектр метилотрофных фитосимбионтов, способных к азотфиксации, а также исследовать их участие в азотном метаболизме растений.

Учитывая накопленные к настоящему моменту знания, метилотрофы перспективны не только как модельные организмы в изучении физиолого-биохимических и молекулярно-генетических основ фитосимбиоза, но и для применения в сельском хозяйстве как стимуляторы роста и развития растений и системной устойчивости к фитопатогенам. Обоснованность использования метилотрофов (особенно облигатных), продиктована тем, что они не патогенны для человека, животных и растений, а вместе с этим, обладают множеством полезных свойств. Дополнительным преимуществом препаратов на основе метилотрофных бактерий является способность всех растений выделять метанол и другие Сi-соединения, что, по-видимому, полностью или частично снимает проблему специфичности симбиоза бактерий с растениями.

В целом, полученные нами приоритетные данные о метаболических аспектах фитосимбиоза метилобактерий приблизили не только к лучшему пониманию метаболических основ этого процесса, но и к разработке нового поколения препарата -стимулятора роста растений - «метилобактерина».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федоров, Дмитрий Николаевич, Пущино

1. Ъ.Галъченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М.: Гелиос. 2001. 500 с.4 .Дедыш С.Н. Метанотрофные бактерии кислых сфагновых болот // Микробиология. 2002. Т. 71. №6. С. 741-754.

2. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий // Автореф. дисс. докт. биол. наук. Пущино. 1999. 32 с.

3. Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Метанотрофы и метилобактерии обнаружены в тканях древесных растений в зимний период // Микробиология. 2004. Т. 73. С. 817-824.

4. Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. Новые данные о способности меилобактерий и метанотрофов синтезировать ауксины // Микробиология. 2002. Т. 71. № 1.С. 130-132.

5. Заварзин Г.А., Васильева JI.B. Цикл метана на территории России // Круговорот углерода в России. Ред. Заварзин Г.А. М. 1999. С. 202-230.

6. Иванова Е.Г. Ассоциация аэробных метилотрофных бактерий с растениями // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Пущино. 2006. С. 162.

7. Ю.Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины // Микробиология. 2001. Т. 70. №4. С. 452-458.

8. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Шепеляковская А. О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А, Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины // Микробиология. 2000. Т. 69. №6. С. 764-769.

9. Каляева М.А., Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Применение аэробных метилобактерий и метанотрофов для индукции морфогенеза пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) in vitro II Биотехнология. 2003. №2. С. 38-44.

10. Каляева М.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Захарченко Н.С., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Стимуляция метанотрофными бактериями морфогенеза пшеницы in vitro. II Докл. Акад. Наук. 2003. Т. 388. № 6. С. 847-849.

11. Каляева М.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Влияние аэробных метилотрофных бактерий на морфогенез пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) in vitro II Физиология растений. 2003. Т. 48. № 4. С. 595-599.

12. Канопкайте С.И. Кобаламины. Вильнюс: Мокслас. 1978. 144 С.

13. П.Кретович B.JT. Введение в энзимологию. М.: Наука. 1974. С. 97-98.

14. Кулаева О. Н. Зависимость физиологической активности цитокининов от химического строения их молекул // Цитокинины их структура и функция. М.: Наука. 1973. С. 32-76.

15. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка // XLI Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1982. С. 82.

16. Кулаева О.Н., Чайлахян М.Х. Достижения и перспективы в исследовании фитогормонов // Материалы XI Международной конференции по ростовым веществам. М: Агрохимия, 1984. Т. 90. №1. С.106-128.

17. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В. Ф. Система вырожденных олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов пifH различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. Т.70. С. 86-91.

18. Мокроносов А.Т. Интеграция функций роста и фотосинтеза // Физиология растений. 1983. Т.30. №5. С. 868-880.

19. Омельченко М.В., Васильева Л.В., Заварзин Г.А., Савельева Н.Д., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Новый психрофильный метанотроф рода Methylobacter П Микробиология. 1996. Т. 65. № 3. С. 339-343.

20. Рыэюкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов // Прикл. биохимия. 2003. Т. 39. №2. С. 133-159.

21. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н. Выделение органического вещества у морских водорослей // Успехи современной микробиологии. 1981. Т. 92. Вып. 1 (4). С. 100-114.

22. Троценко Ю.А., Доронина Н.В. Биология аэробных метилобактерий — деструкторов галометанов // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 149-160.

23. Троценко Ю.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В. Аэробные метилотрофные бактерии как фитосимбионты // Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 808-830.

24. Троценко Ю.А., Логинова Н.В. Пути метаболизма метилированных аминов у бактерий//Успехи микробиологии. 1979. Т. 14. С. 28-55.

25. Чернядъев ИИ. Фотосинтез и цитокинины // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. №5. С. 644-674.

26. Шепеляковская А.О., Доронина Н.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Новые данные о способности аэробных метилотрофных бактерий синтезировать цитокинины//Докл. РАН. 1999. Т. 368. №4. С. 555-557.

27. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs // Academic Press. London. 1982. P.251

28. ArshadM., Frankenberger W.T., Jr. Ethylene: Agricultural sources and applications // Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. 2002. P. 450.

29. Austin В., Goodfellow M. Pseudomonas mesophilica, a new species of pink bacteria isolated from leaf surfaces // Int. J. Syst. Bacteriol. 1979. V. 29. № 1. P.373-378.

30. Bak S., Tax F.E., Feldmann K.A. Galbraith D.W. Feyereisen R. CYP83B1, a cytochrome P450 at the metabolic branch point of auxin and indole glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis // Plant Cell. 2001. V. 91. P. 101-111.

31. Bartel B. Auxin biosynthesis // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P.51-66.

32. Bartel В., LeClere S., Magidin M., Zolman B.K. Inputs to the active indole-3-acetic acid pool: de novo synthesis, conjugate hydrolysis, and indole-3-butyric acid p-oxidation // J. Plant Growth Regul. 2001. V. 20. P. 198-216.

33. Bartling D., Seedorf M., Schmidt R.C., Weiler E.W. Molecular characterization of 2 cloned nitrilases from Arabidopsis thaliana key enzymes in biosynthesis of plant hormone indole-3-acetic acid // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 6021-6025.

34. Basile B.V., Slede L. and Corpe W.A. An association between a bacterium and a liverwort Scapania numerosal! Bull. Torrey Bot. Club. 1969. V. 69. P. 711-714.

35. Basile D.V., Basile M.R., Li Q.-Y., Corpe W.A. Vitamin Bn-stimulated growth and development of Jungermannia leiantha grolle and Gymnocolea inflata (Huds.) Dum. (Hepaticae) //The Bryologist. 1985. V. 88. № 2. P. 77-81.

36. Bertoldi M., Cellini В., Montioli R., Voltattorni C.B. Insights into the mechanism of oxidative deamination catalyzed by DOPA decarboxylase // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 7187-7195.

37. Bianco С., Imperlini E., Calogero R., Senatore В., Amoresano A., Carpentieri A., Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic acid improves Escherichia coli's defences to stress // Arch. Microbiol. 2006a. V. 185. P. 373-382.

38. Bianco C., Imperlini E., Calogero R., Senatore В., Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic acid regulates the central metabolic pathways in Escherichia coli II Microbiology. 2006b. V. 152. P. 2421-2431.

39. Bystrykh, L. V., Govorukhina N.I., Dijkhuizen L., Duine J.A. Tetrazolium-dye-linked alcohol dehydrogenase of the methylotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica is a three-component complex // Eur. J. Biochem. 1997. V. 247. P. 280-287.

40. Calhoun A., King G.M. Regulation of root-associated methanotrophy by oxygen availability in the rhizosphere of two aquatic macrophytes. Appl. Env. Microbiol. 1997. V.63. P. 3051-3058.

41. Carls R.A., Hanson R.S. Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle mutants of Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1971. V. 106. P. 848-855.

42. I.Chen C.-M. Cytokinin biosynthesis and interconversion // Physiol. Plant. 1997. V. 101. P. 665-673.

43. Cheng Z., Duncker B.P., McConkey B.J., Glick B.R. Transcriptional regulation of ACC deaminase gene expression in Pseudomonas putida UW4 // Can. J. Microbiol. 2008. V. 54. P. 128-136.

44. Cohn W.E. Nomenclature/"B 12", ed. Dolphin D., John Wiley & Sons, New York-Chichester-Bristane-Toronto-Singapore. 1982. V. l.P. 17-22.

45. Costacurta A., Keijers V., Vanderleyden J. Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 463-472.

46. Dedysh S.N. Exploring methanotroph diversity in acidic northern wetlands: Molecular and cultivation-based studies // Microbiology. 2009. V. 78. P.655-669.

47. Ded.ysh S.N., Panikov N.S., Liesack W, Grobkopf R., Zhou J., Tiedje J.M. Isolation of acidophilic methane-oxidising bacteria from northern peat wetlands // Science. 1998b. V. 282. № 5387. P. 281-284.

48. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs // Appl. Environ. Microbiol. 1998a. V. 64. № 3. P. 922-929.

49. Dedysh S.N., Ricke P., Liesack W. NifH and NifD phylogenies: an evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria // Microbiology. 2004. V. 150. P. 1301-1313.

50. Dickinson C.H., Austin В., Goodfellow M. Quantitative and qualitative studies of phylloplane bacteria from Loliumperene II J. Gen. Microbiol. 1975. V. 91. P. 157-166.

51. Dijkhuizen L., Arfman N. Methanol metabolism in thermotolerant methylotrophic Bacillus sp. // In Andreesen J.R., Bowien B. (ed.), Microbial growth on Ci-compounds. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. P. 215-219.

52. Doronina N.V., Ivanova E.G., Trotsenko Y.A. Phylogenetic position and emended description of the genus Methylovorus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 903-906.

53. Downie J.A. Functions of Rhizobial nodulation genes./In: Spaink, H.P., Kondorosi, E., Hooykaas, P.J.J. (Eds.), The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998. P. 387-402.

54. Dubey S.K. Methane emission and rice agriculture. Current Science. 2001. V. 81. P. 345-346.

55. Facchini P.J., De Luca V. Expression in Escherichia coli and partial characterization of two tyrosine/dopa decarboxylases from opium poppy // Phytochemistry. 1995. V. 38. P.1119-1126.

56. Facchini P.J., Huber-Allanach K.L. Tari L.W. Plant aromatic L-amino acid decarboxylases: evolution, biochemistry, regulation, and metabolic engineering applications // Phytochemistry. 2000. V. 54. P. 121-138.

57. Fall R. Cycling of methanol between plants, methylotrophs and the atmosphere // In Microbial Growth on Ci Compounds / Eds. M.E. Lidstrom, F.R. Tabita. Kluwer Acad. Publ. Dordrecht. 1996. P. 343-350.

58. Francez-Charlot A., FrunzkeJ., Reichen C., Zingg Ebneter J., GourionB., Vorholt J. Sigma factor mimicry involved in regulation of general stress response // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009. V. 106. P. 3467-3472.

59. Frenkel C., Peters J.S., Tieman D.M., Tiznado M.E., Handa A.K. Pectin methylesterase regulates methanol and ethanol accumulation in ripening tomato (Lycopersicon esculentum) fruit // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 8. P. 4293-4295.

60. Gilbert В., Frenzel P. Methanotrophic bacteria in the rhizosphere of rice microcosms and their effect on porewater methane concentration and methane emission // Biol. Fertil. Soils. 1995. V. 20. P. 93-100.

61. Glick B.R., Patten C.L., Holguin G., Penrose D.M. Biochemical and genetic mechanisms used by plant growth promoting bacteria. Imperial College Press, London. 1999. P. 276.

62. Glick B.R., Todorovic В., Czarny J. Cheng Z., Duan J., McConkey B. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase // Crit. Rev. Plant Sci. 2007. V. 26. P. 227-242.

63. Gourion В., Rossignol M, Vorholt J.A. A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. V. 103. P. 13186-13191.

64. Haas £>., Defago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads // Nature Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 307-319.

65. Haberer G., Kieber J.J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 254-362.

66. Y21.Hanson A.D. and Roje S. One-carbon metabolism in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 119-137.

67. Ъ\.Непсо К. The QIAexpressionist: The High Level Expression and Protein Purification System // QIAGEN Press, Hamburg. 1992

68. Holland M.A. Methylobacterium and plants // Recent Res. Devel. Plant Physiol. 1997a. V. l.P. 207-213.

69. Holland M.A. Occam's razor applied to hormonology. Are cytokinins produced by plants? //Plant Physiol. 1997b. V. 115. №3. P. 865-868.

70. Holland M.A., Polacco J.C. Urease-null and hydrogenase-null phenotypes of a phylloplane bacterium reveal altered nickel metabolism in two soybean mutants // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 942-948.

71. ХЪЬ.Нопта M., Shimomura T. Metabolism of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid // Agric. Biol. Chem. 1978. V. 42. P. 1825-1831.

72. Ivanovo E., Doronina N., Trotsenko Y. Hansschlegeliaplantiphila gen. nov. sp. nov., a new aerobic restricted facultative methylotrophic bacterium associated with plants // Syst. Appl. Microbiol. 2007. V. 30. P. 444-452.

73. Jabrin S., Ravanel S., Gambonnet В., Douce R., Rebeille F. One-carbon metabolism in plants. Regulation of tetrahydrofolate synthesis during germination and seedling development //Plant Physiology. 2003. V. 131. P. 1431-1439.

74. Jaftha J.B., Strijdom B. W., Steyn P. L. Characterization of pigmented methylotrophic bacteria which nodulate Lotononis bainesii /I System. Appl. Microbiol. 2002. V. 25. P. 440-449.

75. Johnson P.A., Quayle J.R. Microbial growth on Ci-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate of methanol-grown Pseudomonas AMI // Biochem. J. 1964. V. 93. P. 281-290.

76. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases // Plant. Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 677-685.

77. Kang Y.S., Kim J., Shin H.D., Nam Y.D., Bae J.W., Jeon C.O., Park W. Methylobacterium platani sp. nov., isolated from a leaf of the tree Platanus orientalis II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2849-2853.

78. Kato Y„ Ooi R„ Asano Y. A new enzymatic method of nitrile synthesis by Rhodococcus sp. strain YH3-3 // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1999. V. 6. P. 249-256.

79. Kato Y, Ooi R., Asano Y. Distribution of aldoxime dehydratase in microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 2290-2296.

80. Kawaguchi M., Fujioka S., Sakurai A., Yamaki Y.T.R., Syono K. Presence of a pathway for the biosynthesis of auxin via indole-3-acetamide in trifoliata orange // Plant Cell Physiol. 1993. V. 34. P. 121-128.

81. Kende H. Ethylene biosynthesis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 44. P. 283-307.

82. Kennedy C. Genus Beijerinckia. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition / Ed. Brenner, Krieg, Staley and Garrity. New-York: Springer-Verlag,. 2005. V. 2. Part C. P. 423-432.

83. Keppler F., Hamilton J.T.G., Brab M., Rockmann T. Methane emission from terrestrial plants under aerobic conditions //Nature. 2006. V. 439. P. 187-191.

84. Keppler F., Hamilton J.T.G., McRoberts W.C., Vigano I., Brafi M, Rockmann T. Methoxyl groups of plant pectin as a precursor of atmospheric methane: evidence from deuterium labelling studies //New Phytologist. 2008. V. 178. P. 808-814.

85. Khalil, M.A.K. (ed.) Atmospheric methane: sources, sinks and role in global changes. Springer-Verlag, Berlin, Hidelberg, New York. 1993.

86. Koga J., Adachi Т., Hidaka H. IAA biosynthesis pathway from tryptophan via indole-3-pyruvic acid in Enterobacter cloacae // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 701-706.

87. Krieger F., Spinka M., GolbikR., Hubner G., Konig S. Pyruvate decarboxylase from Kluyveromyces lactis : An enzyme with an extraordinary substrate activation behaviour // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 3256-3263.

88. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

89. Levering P.J., Dijukhuizen L., Harder W. Metabolic regulation in the facultative methylotroph Arthrobacter PI. Growth on primary amines as carbon and energy source // Arch Microbiol. 1984. V. 139. P. 188-195.

90. Liu P., Nester E. W. Indoleacetic acid, a product of transferred DNA, inhibits vir gene expression and growth of Agrobacterium tumefaciens C58 // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. V. 103. P. 4658-4662.

91. Madhaiyan M„ Poonguzhali S., Ryu J., Sa T. Regulation of ethylene level in canola (Brassica campestris) by 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase containing Methylobacterium fujisawaense II Planta. 2006a. V. 224. P. 268-278.

92. Manulis S., Shafrir H., Epstein E., Lichter A., Barash I. Biosynthesis of indole-3-acetic acid via the indole-3-acetamide pathway in Streptomyces spp. // Microbiology. 1994. V. 140. P. 1045-1050.

93. Manulis S., Valinski L., Gafni Y., Hershenhorn Y. Indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in Erwinia herbicola in relation to pathogenicity on Gypsophila panicidata II Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. V. 39. P. 161-171.

94. Martens J.-H., Barg H., Warren M.J., Jahn D. Microbial production of vitamin B12 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 275-285.

95. Martinez-Romero E. The dinitrogen-fixing bacteria // In Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. (eds.) The Prokaryotes. 3rd ed. Springer-Verlag, New York. N.Y. 2006. V. 2. Chapter 1.24. P. 793-817.

96. Marx C.J., Lidstrom M.E. Development of improved versatile broad-host-range vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria I I Microbiology (UK). 2001. V. 147. P. 2065-2075.

97. Мок D. W., MokM.C. Cytokinin metabolism and action // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 89. P. 89-118.

98. Morris R.O. Genes specifying auxin and cytokinin biosynthesis in prokaryotes // In: Plant Hormones/Ed. Davies P.J. Kluwer Academic Publishers. Netherlands, 1995. P. 318-339.

99. Murashige Т., Skoog F. Revised medium for growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

100. Murrell J. C. and Dalton H. Nitrogen fixation in obligate methanotrophs//J Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 3481-3486.

101. Murrell J.C., McDonaldI.R. Methylotrophy // In Lederberg J. (ed.), Enzyclopedia of microbiology. Academic Press, New York. 2000. V. 3. P. 245-255.

102. Nagasawa Т., Ishii Т., Kumagai H, Yamada H. D-cysteine desulfhydrase of Escherichia coli. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1985. V. 153. P. 541-551.

103. Nakazawa II., Kumagai H., Yamada H. Aromatic L-amino acid decarboxylase from Micrococcus percitreus: purification, crystallization and properties // Agric. Biol. Chem. 1981. V. 45. P. 2543-2552.

104. Narumiya S., Takai К, Tokuyama Т., Noda Y„ Ushiro H., Hayaishi O. A new metabolic pathway of tryptophan initiated by tryptophan side chain oxidase // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 7007-7015.

105. Nemecek-Marshall M., MacDonald R.C., Franzen J.J., Wojciechowski C.L., Fall R. Methanol emission from leaves // Plant Physiol. 1995. V. 108. № 4. P. 1359-1368.

106. Nishigaki I., Ichinose H, Tamai K., Nagatsu T. Purification of aromatic L-amino acid decarboxylase from bovine brain with a monoclonal antibody // Biochem. J. 1988. V. 252. P. 331-335.

107. Nishio N., Tsuchiya Y., Hayashi M., Nagai S. A fed-batch culture of methanol-utilizing bacteria with pH-stat // J. Ferment. Technol. 1977. V. 55. P. 151-155. 1

108. Nonomura A.M., Benson A.A. The path of carbon in photosynthesis: improved crop yields with methanol // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1991. V. 89. P. 9794-9798.

109. Normanly J., Bartel B. Redundancy as a way of life IAA metabolism // Curr. Op. in Plant Biol. 1999. V. 2. P. 207-213.

110. Normanly J., Cohen J.D., Fink J.R. Arabidopsis thaliana auxotrophs reveal a tryptophan-independent biosynthetic pathway for indole-3-acetic acid // Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P.10355-10359.

111. Persello-Cartieaux F., David P., Sarrobert C., Thibayd M.S., Achouak W., Robaglia C., Nussaume L. Utilization of mutants to analyze the interaction between Arabidopsis and its naturally rood-associated Pseudomonas II Planta. 2001. V. 212. P. 190-198.

112. Pirttila A.M., Laukkanen H., Pospiech H., Myllyla R., HohtolaA. Detection of intracellular bacteria in the buds of scotch pine (Pinus sylvestris L.) by in situ hybridization // Appl. Envir. Microbiol. 2000. V. 66. № 7. P. 3073-3077.

113. Pirttila A.M., Pospiech II, Laukkanen II., Myllyla R., HohtolaA. Seasonal variations in location and population structure of endophytes in buds of Scots pine И Tree Physiology. 2005. V. 25. P. 289-297.

114. Pollmann S., Muller A., Piotrowski M., Weiler E.W. Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana II Planta. 2002. V. 216. №1. P. 155-161.

115. Powell G.K., Morris R.O. Nucleotide sequence and expression of a Pseudomonas savastanoi cytokinin biosynthetic gene: homology with Agrobacterium tumefaciens tmr and tzs loci //Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. №6. P. 2555-2565.

116. TIA.Prinsen E., Costacurta A., Michiels K., Vanderleyden J., Van Onckelen H. Azospirillum brasilense indole-3-acetic acid biosynthesis: evidence for a non-tryptophan dependent pathway // Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. V. 6. P. 609-615.

117. Renier A., Jourand P., Rapoir S., Poinsot V, SyA., Dreyfus В., Moulin L. Symbiotic properties of Methylobacteirum nodulans ORS 2060T: a classic process for an atypical symbiont // Soil Biol. Biochem. 2008. V. 40. P. 1404-1412.

118. Riemenschneider A., Wegele R., Schmidt A., Papenbrock J. Isolation and characterization of a D-cysteine desulfhydrase protein from Arabidopsis thaliana II FEBS J. 2005. V. 272. P. 1291-1304.

119. Robinson Т. The organic constituents of higher plants // 5th ed. Cordus Press. No. Amherst. Massachusetts. 1983. P. 77-79.

120. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.Y., Hunt M.D. Systemic acquired resistance // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1809-1819.

121. Saotome M., Shirahata K, Nishimura R., Yahaba M„ Kawaguchi M., Syono K, Kitsuwa Т., Ishii Y, Nakamura T. The identification of indole-3-acetic acid and indole-3-acetamide in hypocotyls of Japanese cherry // Plant Cell Physiol. 1993. V. 34. P. 157-159.

122. Schimel, J. Playing scales in the methane cycle: from microbial ecology to the globe //Nature. 2004. V. 101. P. 12400-12401.

123. Schimel, J. Rice, microbe and methane //Nature. 2000. V. 403. P. 375-377.

124. Schutz H, Seiler W., Conrad R. Process involved in formation and emission of methane in rice paddies // Biogeochemistry. 1989. V. 7. P. 33-53.

125. Senthilkumar M„ Madhaiyan M., Sundaram S.P., Kannaiyan S. Intercellular colonization and growth promoting effects of Methylobacterium sp. with plant-growth regulators on rice (Oryza sativa L. Cv CO-43) // Microbiol. Res. 2009. V. 164. P. 92-104.

126. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. P. 237-242.

127. Siegel M. A direct micro determination for sulfide I I Anal. Biochem. 1965. V. 11. P. 126-132.

128. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria // Bio/Technology. 1983. V. l.P. 784-791.

129. Spaepen S., Das F., Luyten E., Michiels J., Vanderleyden J. Indole-3-acetic acid-regulated genes in Rhizobium etli CNPAF512 // FEMS Microbiol. Lett. 2009. V. 291. P. 195-200.

130. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. 2007a. V. 31. P. 425-448.

131. Strom Т., Ferenci Т., Quayle J.R. The carbon assimilation pathway of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium II Biochem. J. 1974. V. 144. P. 465-476.

132. Taiz L., Zeiger E. Auxin: the growth hormone // In Plant physiology, 3rd ed. Sinauer Associates. 2002. Chapter 19. P. 423-460.

133. Todorovic В., Glick B.R. The interconversion of ACC deaminase and D-cysteine desulfhydrase by directed mutagenesis // Planta. 2008. V. 229. P. 193-205.

134. Toraya Т., Yongsmith В., Tanaka A., Fukui S. Vitamin B12 production by a methanol-utilizing bacterium // Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 477-479.

135. А.Татига К., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. // Mol. Biol. Evol. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

136. Todorovic В., Glick B.R. The interconversion of ACC deaminase and D-cysteine desulfhydrase by directed mutagenesis // Planta. 2008. V. 229. P. 193-205.

137. Toraya Т., Yongsmith В., Tanaka A., Fukui S. Vitamin B12 production by a methanol-utilizing bacterium // Appl. Microbiol. 1975. V. 30. P. 477-479.

138. Trotsenko Y.A., Shishkina V.N., Govorukhina N.I., Sokolov A.P. Biochemical basis for obligate methylotrophy and obligate autotrophy: comparative aspects // Winogradsky Symp. on Lithoautotrophy. 1987. P. 26.

139. Vande Broek A., Lambreht M., Eggemont K., Vanderleyden J. Auxins upregulate expression of the indole-3-pyruvate decarboxylase gene in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 1338-1342.

140. Vary P. S., Johnson M.J. Cell yields of bacteria grown on methane // Appl. Microbiol. 1967. V. 15. P. 1473-1478.

141. Vecherskaya M. S., Galchenko V.F., Sokolova E.N., Samarkin V.A. Activity and species composition of aerobic methanotrophic communities in tundra soils // Curr. Microbiol. 1993. V. 27. №3. P. 181-184.

142. Voltattorni C.B., Giartosio A., Turano C. Aromatic-L-amino acid decarboxylase from pig kidney // Methods Enzymol. 1987. V. 142. P. 179-187.

143. Vuilleumier S., Chistoserdova L., Lee M.-C., Bringel F., Lajus A., Zhou Y., Gourion

144. Watanabe F, Nakano Y, Tamura Y., Yamanaka H. Vitamin В12 metabolism in a photosynthesizing green alga, Chlamydomonas reinhardtii II Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1075. P. 36-41.

145. Wei G., Kloepper J.W., Tuzun S. Induction of systemic resistance of cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth-promoting rhizobacteria // Phytopathology. 1991. V. 81. P. 1508-1512.

146. Whipps J.M. Carbon utilization / In: The Rhizosphere (Lynch J.M., Ed.). Wiley Interscience, Chichester, U.K. 1990. P. 59-97.

147. Whipps J.M. Developments in the biological control of soil-borne plant pathogens // Adv. Botan. Res. 1997. V. 26. P. 1-134.

148. Wiegel J.K.W. Genus Xanthobacter. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition / Ed. Brenner, Krieg, Staley and Garrity. New-York: Springer-Verlag,. 2005. V. 2. Part C. P. 555-566.

149. Williams P. Quorum sensing, communication and cross-kingdom signaling in the bacterial world // Microbiology. 2007. V. 153. P. 3923-3938.

150. Wolnak В., Andreen B.H., Chsholm J.A., Saaden M. Fermentation on methane // Biotechnol. Bioeng. 1967. T. 9. C. 57-68.

151. WoodwardA. W., Bartel B. Auxin: regulation, action and interaction // Annals of Botany. 2005. V. 95. P. 707-735.

152. Xie K, Pasternak J. J., Glick B.R. Isolation and characterization of mutants of the plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida CR12-2 that overproduce indoleacetic acid // Curr. Microbiol. 1996. V. 32. P. 67-71.

153. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. 1985. V. 33. P. 103-119.

154. Yao M., Ose Т., Sugimoto H., Horiuchi A., Nakagawa A., Wakatsuki S., Yokoi D., Murakami Т., Honma M., Tanaka I. Crystal structure of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase from Hansenula saturnus II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 34557-34565.

155. Yasukawa Т., Kanei-Ishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin//J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 25328-25331.

156. Yokota Т., Murofushi N., Takahashi N. Extraction, purification, identification // Hormonal Regulation of Development V.l. / Ed. MacMillan J. Berlin: Springer-Verlag. 1980. P. 113-202.

157. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M. Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison // Environ. Microbiol. 2003. V. 5. P. 539-554.

158. Zehr J.P., McReynolds L.A. Use of degenerate oligonucleotides for amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodesmium thiebautii II Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 2522-2526.

159. Zhao Y., Christensen S.K., Fankhauser C., Cashman J.R., Cohen J.D., Weigel D., Chory J. A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis // Science. 2001. V. 291. P. 306-309.

Информация о работе

Федоров, Дмитрий Николаевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы