Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Галофильное метанобразующее сообщество микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Галофильное метанобразующее сообщество микроорганизмов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

на правах рукописи УДК 579.262:582.232

ЖИЛИНА Татьяна Николаевна

ГАЛОФИЛЬНОЕ МЕТАНОБРАЗУЩЕЕ СООБЩЕСТВО МИКРООРГАНИЗМОВ.

(03.00.07 - микробиология)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор Б.В.ГРОМОВ

доктор биологических наук, профессор Л.Г-ЗВЯГИНЦЕВ

доктор биологических наук В.М.ГОРЛЕНКО

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пушино-на-Оке.

Защита состоится "...." --------- 1992г. в./.. часов на

заседании Специализированного Совета Д 002.64.01 при Институте

микробиологии РАН по адресу:117811, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Диссертация разослана " "

и-19 92

Ученый секретарь Специализированногохорета

кандидат биологических наук ¿(с^с^ Е. Никитин

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность проблемы. Метаяогенез - один иэ важнейших биогеохимических процессов, осуществляемых бактериями и. в настоящее время в глобальных масштабах он определяет образование наиболее эффективного парникового газа. В практике метаногенеэ составляет основу анаэробной очистки сточных вод и продукции биогаэа.

Ыетанобраэувдие архебактерии интенсивно изучались на протяжении последнего десятилетия и их биология находится в центре внимания исследователей. Завершая цепь разложения органического вещества, они вступают в тесные трофические отношения с другими микроорганизмами. Изучение трофических отношений в метаногенном сообществе привело к новому понимание функционирования микробных сообществ. Развитие метанобразуюпшх бактерий во всех биотопах, кроме водородных гидротерм, зависит от согласованной работы бактериального сообщества, которое последовательно осуществляет деградацию сложных биополимеров до тех немногих соединений, которые используются ме-таногенами для образования метана. Эти соединения определяют три пути метаногенеза: ацетатный, водородный, и С-1 м^тилотрофный путь. Реализация того или иного пути метаногенеза определяется как особенностями экосистемы, так и входящими в нее видами метаногенов. В отличие от ацетатного й водородного, С-1 путь метаногенеза менее изучен и не исследовался на уровне сообщества. Примером сообщества где реализуется С-1 путь образования метана является галофиль-ное сообщество.

Микробные сообщества экстремальных мест обитания вызывают в настоящее время повышенный интерес не только как источник штаммов для биотехнологии, но и с естественно-научной точки зрения для понимания функционирования биосферы прошлого. Бактерии в этих сообществах представлены экстремофилами со своеобразной физиологией. В гидротермах и гиперсоленых водоемах развивается бактериальное сообщество, практически свободное от эукариотных организмов, что представляет редкую для современных экосистем возможность изучения взаимодействия бактерий в сообществе.

Галофильное микробное сообщество, включающее в большинстве прокариотные организмы, представляет реликтовое сообщество, и в этом смысле может рассматриваться как современный аналог микробных сообществ раннего протерозоя-архея. Исключительное значение для понимания глобальных изменений в прошлом имеет выяснение трофической системы и организмов, входящих в реликтовые микробные сообще-

ства. Такие сообщества являются простейшим! трофическими системами, на основе которых в процессе эволюции формируются более сложные системы с включением высших организмов.

Функционирование сообществ может быть понятно только при знании биологии входящих в него организмов. В связи с этим изучение бактерий, определяющих превращение веществ в сообществе, является необходимым предварительным условием научного анализа.

Принятие в 1991г. на следующее десятилетие международной программы IUBS-IUMS "Микробное разнообразие 21" с особым вниманием к изучению групп микроорганизмов, которые имеют функциональное значение для биосферы и различных экосистем свидетельствует, что поставленная нами задача была актуальна.

Состояние вопроса. Метанобраэующие Сметановые) бактерии или метаногены - высокоспециализированная группа строго анаэробных, неспоровых микроорганизмов, которые образуют метан в качестве основного продукта катаболизма. Они были открыты Зенгеном С1906), который, не имея чистых культур, смог установить высокую специфичность этих бактерий в использовании ими субстратов для образования метана. В познании их биоразнообразия четко простегиваются три периода С рис. I).

1.Начальный период С до 70-х гг.), когда изучались мезобильные, преимущественно пресноводные метаногены, часто в виде смешанных культур. Систематика небольшого числа видов базировалась на их морфофизиологических особенностях СBarker; 1956) Темп описания новых видов в этот период составлял 0,25 вида/год.

2. Новая волна внимания к метановым бактериям возникла с 1970-х гг. после работ Вольфа и его сотрудников (Иллинойс, США), выяснивших основные особенности энзиматического пути метаногенеэа, и работ К.Веэе с коллегами (Иллинойс,США), установивших их принадлежность к новой ветви живого мира - архебактериям или, по предложенной им недавно номенклатуре, - Archea. Широкое использование метода (Hungate, 1969) для изолирования строгих анаэробов позволило обнаружить новых, по преимуществу , водород-использующих, метано-генов в том числе, из морских мест обитания. Темп описания новых видов в период (I975-1983гг.) составлял 1,125 вида/год.

3. Изучение метанобразуюиих архебактерий из экстремальных мест обитания, гиперсоленых водоемов и гидротерм привело в последнее десятилетие к значительному расширению знаний о разнообразии этой уникальной группы архебактерий. Применение молекулярных методов в

систематике метаногенов (Balch et al. , 1979) способствовало очень высокому тешу описания - 6 видов/год. Б настоящее время группа метаногенов включает 18 ролов и более 60 видов.

Систематические исследования, связанные с обоснованием метаболических путей в галофильном сообществе, не проводились. В конце 70-х гг. у галофильных микроорганизмов было установлено существование органических осморегуляторных веществ ("compatible solutes" - Brown, 1976), представляющих значительную часть низкомолекуляр-species Mothanobactoria

-!-

Рис.1. Число видов »етанобраэу-ювшх бактерий по годам.

AL- виды, включенные в список одобренных названий.

VP- узаконенные 1940 50 ' 60 70 80 90 ВИДЫ,

них компонентов в галофильном сообществе. Задача по выяснению деградации этих веществ в галофильном сообществе и анаэробных бактерий, действующих при этом в трофической системе поставлена нами впервые.

Изучение метаногенеза в континентальных и морских соленых водоемах позволило придти к выводу о существовании в них "неконку-курентного пути" (King, 1984) метаногенеза из метиламинов. В соленых водоемах.при изобилии сульфата метаногены неспособны конкурировать с сульфатвосстанавливающими бактериями за ацетат или водород - основные субстраты метаногенеза в пресных водоемах. Вместе с тем пока неизвестны суль$атвосстанавливающие бактерии, способные использовать метиламины. Поэтому метаногены, специализированные на этих субстратах, оказываются вне конкуренции. В этих работах не было установлено какие именно бактерии способны осуществлять этот неконкурентный путь, а известно как ненадежны выводы,.полученные без точного знания микроорганизмов, вызывающих процессы.

Представление о механизме работы анаэробного метаногенного

сообщества основано на тесном трофическом взаимодействии метаноге-нов с микроорганизмами, поставляющими субстраты для их развития. Поэтому совершенно недостаточно знать специфический организм, не-представляя как и откуда он получает свой субстрат.

К началу наших исследований галофильного сообщества (1981г.) не были известны экстремально - галофильные анаэробные бактерии, участвующие в деградации органического вещества, а возможность метаногенеза при солености выше 18^ ставилась под сомнение (Страхов, 1962). Внимание было сосредоточено на аэробных галофильных архебактериях (Larsen, 1980, 1981) и на фототрофных галофилах (Imhoff, Truper 1977, 1981).

Одновременно с нами изучение галофильных анаэробов было начато в США и Израиле, преимущественно на континентальных водоемах (Zeikus, 1983; Oren, 1983). На основе изучения олигонуклеотидных каталогов I6S рРНК они составили новое семейство грамотрицательных эубактерий Haloanaerobiaceae (Oren et al., 1984).

Цель работы. Цель -настоящей работы состояла в выявлении особенностей метаногенеза в галофильном цианобактериальном сообществе и трофических взаимоотношений в нем. Для достижения поставленной цели следовало выяснить, какие именно группы бактерий в сообществе ответственны за превращения веществ, ведущих к образованию метана. Для этого необходимо было сначала обнаружить и описать строго галофильные метановые бактерии. Последующие задачи по выделению и изучению других анаэробных бактерий, их взаимодействию с метаноге-нами и расшифровке особого пути анаэробного метаболизма осморегу-ляторных соединений в галофильном сообществе диктовались внутренней логикой исследования, ставились и решались в ходе работы, включавшей:

1. обнаружение, выделение и описание галофильных метаногенов, выяснение их биологии и взаимодействия с другими анаэробными галофильными микроорганизмами в гиперсоленых водоемах;

2. обнаружение, выделение и описание галофильных гомоаце-татных бактерий, ответственных за появление метиламинов в системе;

3. выделение и описание первичных анаэробных галофилов, участвующих в деградации осморегуляторных соединений углеводной природы;

4. сравнение особенностей галофильного сообщества с другими метаногенными сообществами.

В задачи работы также входило изучение и уточнение таксономи--4-

ческого положения тех штаммов новых архе- и эубактерий, которые были выделены в процессе исследования.

Научная новизна и значимость работы. Открыта и описана новая группа облигатно- метилотрофньгх строго галофильных метаногенов, представленная двумя родами Methanohalophilus и Methanohalobium. В гиперсоленых водоемах они осуществляет неконкурентный путь метаногенеза и строго связаны с использованием метиламинов как субстрата метаногенеза. Эти бактерии составляют самостоятельный кластер на филогенетическом древе архебактерий.

Впервые обнаружена галофильная гомоацетатная эубактерия, представленная новым родом Acetohalobium, использующая ограниченный набор субстратов, в том числе бетаин - основной осморегуля-торный компонент Proteobacteria, - при деградации которого образуются метиламины. С открытием Acetohalobium Сj-путь метаногенеза из метиламинов получил свое микробиологическое обоснование.

Описаны и изучены сахаролитические галофильные анаэробы, в том числе первый экстремально-галофильный Halobacteroides lacunaris, и новый род Haloincola, использующие преимущественно дисахариды трегалоэу и сахарозу - характерные осморегуляторные вещества многих слабых галофилов. Впервые выявлена способность этих бактерий осуществлять сероредукцию, в том числе при солености более 20'/,, когда сульфатредукция уже подавлена.

Расшифрован путь анаэробного метаболизма осморегуляторных веществ в галофильном цианобактериальном сообществе, отличающий его от других микробных сообществ. Этот путь характеризуется последовательным участием специализированных микроорганизмов в превращении осморегуляторных веществ, приводящем в конечном итоге к образованию метана.

Установлена облигатная взаимосвязь организмов разных филогенетических групп Cyanobacteria- Proteobacteria- Haloanaerobiaceae-Methanosarcinaceae в специфическом трофическом пути разложения органического вещества в галофильном цианобактериальном сообществе.

Практическая значимость работы. Получены новые результаты, расширившие знание о разнообразии микробного мира.

Создана коллекция культур галофильных и пресноводных метан-образующих архебактерий и галофильных органотрофных анаэробных эубактерий, используемая в научных целях у нас в стране и за рубежом, включающая 7 родов и II видов. Описано и узаконено 3 новых рода и 6 новых видов. Чистые культуры типовых и эталонных штаммов

приняты в международные коллекции типовых культур - ВКМ, Немецкую СБ5Ю и Американскую метанобразующих архебактерий С 0<ЗС/СМА).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на X школе Всесоюзного микробиологического общества "Теоретические и методические основы изучения анаэробов" СПущино, 19783; на Всесоюзном совещании " Анаэробные микроорганизмы" СПущиноЛ982); на Международном симпозиуме ФЕМО по регуляцкн микробного метаболизма факторами внешней среды СПущино, 1983); на Международном рабочем совещании по биологии и биохимии архебактерий СМюнхен-Мартинсрид, 19853; на Всесоюзном рабочем совещании по архебактериям СПущино,

1988); на Международном симпозиуме по С-1 соединениям СГеттинген,

1989); на билатеральном симпозиуме СССР-ФРГ пб архебактериям СТбилиси, 1990).

Публикации Основные материалы диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из них 28 (24 статьи и 4 тезисов) посвящены изучению галобильного метаногенного сообщества.

Место проведения работы Работа проводилась в Институте микробиологии РАН в лаборатории микробных сообществ , возглавляемой член-корреспондентом РАН Заварзиным Г. А. и была частью плановой тематики лаборатории, касающейся изучения цианобактериальных матов как аналогов строматолитов. В работе участвовали сотрудники Института микробиологии РАН и других институтов - чей вклад в определенные разделы исследований отражен в приведенных в списке литературы публикациях. Автор выражает глубокую признательность всем этим лицам.

Особую благодарность автор приносит профессору Г.А.Заварзину -инициатору этой работы и соавтору большинства публикаций.

ОСНОВНЫЕ ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ

I. Метаногенеэ в гиперсоленых водоемах может осуществляться при любой солености, вплоть до насыщения ЫаС1. В этих водоемах "неконкурентный путь" метаногенеза из метиламинов осуществляют об-лигатно метилотрофные галофильные метанобразующие архебактерии. Среди метаногенов они составляют самостоятельную физиологическую группу, входящую в семейство Ме1Ьапоэагс1пасеае и представленную двумя родами - Ме1ЬапоЬа1 орЫ 1 иэ и Ме1ЬапоЬа1оЫит. Эти роды включают умеренно - и экстремально-галофильные виды и представляют не только отдельную ветвь на филогенетическом дереве архебактерий, но и характеризуются набором морфофизиологических признаков, в первую очередь узко специализированным метилотрофным типом обмена.

2. Метиламины - специфические субстраты метаногенеза в гало-фильиом сообществе. Их появление в системе связано с анаэробной деградацией осморегуляторного вещества глицин-бетаина, осуществляемого" гомоацетатными анаэробными зубактериями рода Acetohalobium.

3. Выделенные из гиперсоленых водоемов Крыма новые представители сем. Haloanaerobiасеае, испольэугэде осморегуляторные вещества углеводной природы, представляют группу первичных анаэробов в трофической системе галофильного микробного сообщества. Они образуют водород, ацетат, этанол - типичные субстраты вторичных анаэробов, в первую очередь сульфатвосстанавливагдах бактерий.Выявленная способность сахаролитичееких галофильных анаэробов к сероре-дукции расширяет представление об их экологической роли, поскольку они участвуют не только в цикле углерода, но и в серном цикле.

4. Галофильные анаэробные органотрофные бактерии представляют самостоятельную филогенетическую группу эубактерий, далеко отстоящую от других грамотрицательных микроорганизмов. Ранг семейства Haloanaerobiaceae не соответствует ни их филогенетическому положению, ни фенотипическим особенностям, связанным с сочетанием необычной комбинации признаков: грамотркцательного строения клеточной стенки и способности к спорообразованию, облигатной галофилии.

5. Галофмьное микробное сообщество отличается от микробных сообществ других экосистем наличием осморегуляторных веществ, разложение которых осуществляется специализированными группами анаэробных бактерий. Это, в конечном итоге, определяет существование специфического Сj--пути метаногенеза из метиламинов в гиперсоленых водоемах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Галофильное сообщество ассоциируется с древними эвапоритовыми породами, для которых показано их биогенное образование в виде ламинитовой строматолитоподобной структуры. Это самые древние из отмеченных в геологической летописи биогенных пород CSchopf, 1983). В начале нашей работы в качестве наиболее достоверных аналогов древних строматолитов рассматривали столбчатые строматолиты Гаме-лин-Пула С Австралия). Впоследствии такими аналогам ламинарных строматолитов стали считать любые цианобактериальные маты CMicro-bial mats: Stromatolites, 1984). Здесь мы рассмотрим только цианобактериальные сообщества, развивающиеся в водоемах морского происхождения - лагунах. К началу наших исследований основным модельным водоемом для изучения реликтовых галофильных цианобактериальных

сообществ служило оз. Солар-Лейк на Синае CCohen, et al. , 1984,), которое сейчас является наилучше исследованной экосистемой в мире CJavor, 1989). Однако, работы проводимые в этом водоеме касались либо изучения биогеохимических процессов in situ, либо отдельных групп организмов, в первую очередь продуцентов. Пионерские исследования галофильных сообществ у нас в стране СИсаченко, 1914, 1927; Перфильев, 1932; Пельш, 1937;) были связаны в основном с серным циклом и были продолжены С Кузнецов, Романенко 1969; Гор-ленко 1968, 1984; Добрынин, 1984). Эти работы, однако, не имели целью выяснение трофической организации галофильного микробного сообщества. Путь деградации органического вещества, завершающийся метаногенезом, и участвующие в нем анаэробные организмы для галофильного сообщества оставались неизвестными.

I.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты и место исследований. Объектом исследования служило галофильное метаногенное сообщество облигатно-анаэробных бактерий. •Для сравнительных исследований, .позволяющих выявить особенности галофильного метаногенеэа использовали культуры пресноводных мета-ногенов, выделенные нами ранее из других экосистем: метантенков, анаэробных осадков рек и болот, газогидротерм Камчатки, а также культуры, полученные от других исследователей: Met hanococco i des methylutens TMA-I0T(=DSM 2657), Methanosarcina acetivorans C2AT C=DSM 2834) (K. Sowers ,США); Methanolobus tindarius ,,Tindari-3"T. (=DSM 2278) CK.O.Stetter, Германия); Methanosarcina barkeri MST C=DSM 800) СM.Bryant.CIA); Methanobacterium thermautotrophicum AH^ C=DSM 1053) ( А.Я.Образцовой, ИБФЮ; Methanohalophilus mahii SLPT C=ATCC 35705) (D.Boone, США), Methanohalophilus zhilinae WeN5T C=DSM 4017) (H. Hippe. Германия), штамм TR-7 CT.Wilharm, Германия).

Местом исследования анаэробных галофильных бактерий в основном служили мелководные водоемы восточного Крыма, которые дали все градации солености от 6°4 в оз. Сиваш до ЗОЯ в оз.Чокрак и переменную в лагунах Арабатской стрелки. Исследования проводили в августе 1983, 1985гг. и июне 1990г. Образцы из Шарк-Бея (Австралия) были отобраны в 1981г. И.Н. Крыловым, а из Калмыкии в 1983г. Г.А.Заварэиным.

В лагунах Арабатской стрелки, питающихся через узкую пересыпь водами оз.Сиваш Г.А.Заварзиным в 1983г. были обнаружены галофиль-ные цианобактериальные маты, подробно изучавшиеся в нашей лаборатории в разных аспектах. Эти маты весьма сходны с таковыми в Со-

лар Лейк на Синае Ссвидетельство В. Крумбейна) и их можно считать типичными для морских водоемов со значительным превышением испарения над притоком. Маты представляют собой структурированное сообщество прокариотных организмов. Продукцию органического вещества в них осуществляют цианобактерии, из которых доминирует М1сгосо1еиз chthonoplast.es. В мате имеется выраженная микрозональность с розовым слоем пурпурных бактерий над черной зоной сульфи-догенеза. Лагуны Сиваша представляли одно из немногих мест в нашей стране, слабо нарушенных деятельностью человека. В Крыму к таким водоемам можно отнести лишь озеро Чокрак.Однако, следует принимать во внимание изменение гидрохимии Сиваша и распреснение этого водоема с 20% до 5% солености дренажными ведами поливных полей Севе-ро-Крымского канала, начиная с 1953 г. Тем не менее, отсутствие связанных с океаном водоемов в аридной зоне нашей страны делает лагуны Арабатской стрелки уникальными объектами для изучения у нас гиперсоленых водоемов морского происхождения. Остальные гиперсоленые водоемы связаны с бессточными бассейнами.

Чокракское озеро также представляет собой испарительный край- ' не мелкий водоем, но иного происхождения, чем лагуны Арабатской стрелки. В Чокракском озере отсутствует цианобактериальный мат, но в черной грязи, заполняющей этот водоем, можно различить полуразложившиеся нити И.асЬрЬэга с прикрепленными к ним бактериями. Другим источником органического вещества может служить развитие Пипа-Пе11а, придающей озеру розовый оттенок.

Исследованные водоемы, помимо отмеченных отличий в поступлении .органического вещества, характеризуются неустойчивым режимом солености. которая резко меняется и от сезона к сезону и в течение одного сезона в зависимости от погоды: она понижается до <10% после таяния снега и повышается до насыщения к концу лета. Следовательно у выделяемых отсюда организмов можно ожидать широкой солеустойчи-вости. При повышении солености важный порог представляет насыщение по гипсу, что примерно сответствует солености 20% ; при этом происходит смена микрофлоры, снижается.сульфатредукция. Режим этих водоемов характеризуется широким диапазоном температур: при ярком солнечном освещении температура мата может значительно превышать температуру воздуха, достигая 60°С, хотя вследствие мелководности эффекта солнечных озер мы не наблюдали. Напротив, кислотность относительно постоянна и находится в области нейтральных значений.

Методы культивирования и выделения микроорганизмов. Для учета.

культивирования и выделения анаэробных микроорганизмов использовали как минеральную основу бикарбонатную среду Пфеннига (Pfennig, 1965). Для работы с анаэробными бактериями на основе методики Хан-гейта наш был разработан ряд приемов применительно к отечественному оборудованию и материалам /2/, послуживших основой для всей дальнейшей работы. Выделение проводили, как правило,путем обогащения культуры в жидкой элективной среде, с последующим выделением отдельных колоний.^Особое внимание уделяли проверке чистоты культур высевом на контрольные среды с последующей микроскопией. Остальные методы приведены в публикациях.

П.ОБЖГАТЮ-МЕТИЛОТРОФНЫЕ ГАЯОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОГЕШ.

После установления использования монометиламина (ММА) для Methanosarcina vacuolata (Жилина,Заварэин,1973) разные авторы подтвердили способность метилотрофных метаногенов сем. Methanosarci-naceae метаболизировать помимо метанола довольно широкий круг метилированных соединений: моно- (МИА), ди- (ДМА), триметиламины (ТМА) , диметилсульфид. метилмеркаптан (Hippe et al., 1979; Orem-land et al., 1989; Mathrani et al., 1988).

Пробы ила из-под пленки цианобактерий из межстолбикового пространства строматолитов Гамелин-Пула (75« NaCl) послужили нам для выделения в 1982г. первого умеренно-галофильного, облигатно-мети-лотрофного метаногена - Methanococcus halophilus Z-7982 /6,7/. Метиламины и метанол служили для него единственными субстратами. До этого времени были известны только метаногены, растущие при солености морской воды, и использующие Hg или формиат. В этих образцах нами не были обнаружены водород-использующие метаногены, но накопительная культура с 3,5% NaCl использовала ацетат и в ней присутствовал организм сходный с морской Methanosarcina acetIvorans.

Выяснение элективных условий роста метилотрофных метаногенов позволило открыть в соленых водоемах Крыма новую группу экстрема-льно-галофильных метаногенов /16, 17/. Для этих бактерий метиламины служат единственным субстратом обмена.

При посеве образцов цианобактериального мата и ила на разные субстраты для метаногенеза было обнаружено, что ацетат и формиат используются только для сульфидогенеза, ^ преимущественно для сульфидогенеза, в то время как метанол и метиламины давали значительную продукцию метана, но не сероводорода. При 20« солености сульфатредукция заметно снижалась, также как метаногенез из метанола и ММА. Продукция метана на ТМА была наивысшей и при

20'4 солености оставалась высокой в пробах из гиперсоленых лагун Арабата и оз. Чокрак /17/ (Табл.I).Эти результаты свидетельствовали о наличии в этих водоемах•неконкурентного пути метаногенеза.

Таблица I

Образование метана и сульфида пробами из соленых водоемов Крыма Смкмоль/сосуд, время инкубации при 15% 21 сутки, при 20%'28 суток)

15% NaCl 20% NaCl

субстраты ch4/h2s ch4/h2s

Сиваш Арабат Чокрак Сиваш Арабат Чокрак

н2 + со2 3.5/87 4/60 6.6/32 0/10 3/23 3/54

формиат 0/104 0/144 4/65 4/II0 4/10 0,6/54

ацетат 0/164 0/162 4/146 4/5 4/8 I/I2

метанол 39/15 4/15 203/2 0/1 4/5 3/6

ММА 340/13 210/15 310/11 49/1 '53/1 4/2

ТМА 450/7 298/17 435/4 66/1 630/1 740/3

Количественный учет метаногенов in situ в цианобактериальном мате лагун Сиваша на различных C-I субстратах при разной солености показал, что метанол используется до солености 15*4, моно- и диметиламины' - до солености 20%. При солености выше 20% тршлетиламин (ТМА) является единственным субстратом. С повышением солености численность метаногенов значительно уменьшалась. На ТМА, как наиболее предпочтительном субстрате, количество метаногенов при солености 5% составляло Ю^к легок в с кг и уменьшалось в сто раз при соленостях 10% и 15%; при 20% и 25% NaCl было соответственно Ю3 и Ю2 клеток/см3/33/.

Выделенные из лагун штамш метилотрофных метаногенов дали спектр форм от умеренно-галофильных с оптимумом при 10% NaCl до экстремально-галофильных с оптимумом при 25% NaCl /17,22/. Таким образом, были открыты бактериальные агенты, осуществляющие неконкурентный путь метаногенеза в гиперсоленых водоемах и установлено, что метаногенеэ в них может осуществляться при

крайне высоких значениях солености. Открытие метаногенов, использующих только метиламины, позволило говорить о существовании в гиперсоленых водоемах новой трофической группы среди метаногенов в дополнение к водород-использующим,характерным для морских условий, и ацетат-использующим,свойственным пресным бессульфатным водоемам.

По морфологии, используемым субстратам, пределам солености, выделенные штаммы могут быть разделены на две группы.СТабл. 2)

Таблица 2.

Характеристики облигатно-метилотрофных галофильных метанобразующих __архёбактерий /37/

организм М НаС1 пределы 1?С опт. Г+Ц лизис иол'/. ЗОБ Источник выделения

Умеренно-галофильные

Ме1ЬапоЬа1 орЫ 1 из

М.Ьа1орШиз 2-7982Т 0,3-2,6 26-36 44 + Шарк Бей, .

Австралия

2-7404 0,8-2.5 37 43 + Чокрак, Крым

2-7405 0.8-1,7 37 44 + Калмыкия

ТЙ-7 0,3-3,4 33 48 + Сицилия

Methanohal.ophil.us эр

г-7401 0.8-3.4 НО 44 + Арабат, Крым

г-7зо1 1,7-4.2 НО 45 + Сиваш, Крым

2-7302 0,8-2.5 НО 42 + Чокрак, Крым

М.паШ БЬР7 0.5-3.5 35 45 + Б.Сол.Озеро,

Юга. США

М.гШпае УеГО1 0,2-2,1 45 41 + Вади Натрун,

Египет

экстремально-галофильные

Ме1ЬапоЬа1оЫит

М. еуеэНда^ 2-7303 2,6-5,1 40-50 37 - Арабат, Крым

штамм 2-7408 1.7-4.2 НО 39 - Сиваш, Крым

штамм 2-7403 1,7-4.2 НО 40 - Калмыкия

штамм 2-7305 2,6-5,1 НО НО — Чокрак, Крым

Ю"~нё~опрёдёляли7

Первую составляют неподвижные Сза исключением 2-7401) кокки -12-

неправильной формы, лиэирующиеся додецилсульфатом натрия CSDS). Метиламины, а для штаммов 2-7405, Z-7302 и метанол служат субстратами роста. Оптимумы солености находятся в области 5-15% NaCl. Эти штаммы по хемотаксономическим характеристикам отнесены к роду Ме-thanohalophilus /34/.

Вторая группа штаммов представлена экстремальными галофилами, использующими только метиламины , из которых преимущественно ТМА. Оптимумы солености для них заключены в пределах от 15 до 25% NaCl. Клетки этих штат/ов - плоские, неподвижные, неправильной формы, одиночные или в цистоподобных агрегатах. Они не лизируются SDS, что указывает на небелковую природу-их клеточных стенок. Для экстремально галофильных метаногенов нами был предложен новый род Methanohalobium, узаконенный в 1988 г. CIJSB, V.38:136) с типовым видом М. evestigatum Z-7303T C=DSM 3721), что значит"отысканный" /22/.

М. evestigatum имеет оптимум роста при 25% и не растет ниже 15% NaCl. /меренный термофил. При 60®С рост и метаногенез отсутствуют, но температурный оптимум широкий при С40-50°), что соответствует условиям его обитания в хорошо прогреваемых мелководных лагунах. Напротив, пределы (6,6-7,5) и оптимум pH (7,0-7,5) узкие и отвечают хорошо забуференной морской среде. Субстратами роста служат только ТМА, ДМА и ММА. Сочетание экстремальной галофилии, как у аэробных архебактерий, и метаногенеза послужило основанием для выделения этого организм в новый род и было подтверждено данными геносистематики. Цитология новых организмов была подробно исследована.

М. halophilus имеет полигональную форму с четко выраженными гранями. Размеры клеток варьируют от 0,5 до 2,5 мкм. Размножение происходит путей деления пополам. Клеточная стенка образована гексагональными субъединицами со стороной 4,9 нм. Клетки из экспоненциальной фазы роста имеют мукополисахаридную капсулу 10-25 нм, в то время как в стационарной фазе она отсутствует и клетки становятся круглыми. Рибосомы М. halophilus по размерам (15-20 нм) близки к рибосомам эукариот. Однако, в целом по ультратонкому строению клетки и структурной организации генома М. halophilus не отличается от других прокариот /18/.

М. evestigatum морфологически можно характеризовать как плоскую метаносарцину с цистоподобными как у Methanosarcina mazei клетками, собранными в агрегаты, или отдельными плоскими клетками

неправильной формы. Появление того или иного типа клеток зависит-от возраста культуры и концентрации ионов кальция и магния в среде. С 1,5 мМ Са и 18 мМ организм растет в агрегатах или в виде отдельных округлых кокков с толстой оболочкой 30-50 нм; с возрастом в результате дезагрегации появляются одиночные плоские клетки. При 4,5 мМкСа2+ и 46 мМ Мд2+ М. еуеэШда^т растет в виде плоских полигональных клеток ("битое стекло"), окруженных слоями отторгнутой клеточной стенки. Оболочка состоит из многих слоев в каждом из которых просматривается субьединичная структура. Деление можно характеризовать как неравномерное, т.к. перегородки могут закладываться в разных, участках клетки. Поэтому клетки варьируют по форме и размерам /30/.

Физиологически выделенные штаммы являются типичными метило-трофными организмами. М. еуеэНда^т из метиламинов предпочитает ТМА. Оба организма, выделенные из богатых органическим веществом цианобактериальных матов, не нуждаются в дополнительной органике и метиламины являются для них единственным источником энергии. Обмен М. ЬаХорШиэ на монометиламине соответствует уравнению:

4 СН3Ш3С1 + 2 НзО = ЗСН4 + С02 + 4 ШДС1. Развитие М. Ьа1орЫ1из на монометиламине начинается или сразу, или после лаг-фазы в несколько часов, зависящей от возраста инокулята. Фаза активного роста длится около 40 часов. Однако этот период не описывается экспоненциальным уравнением, а происходит линейно. Значение удельной скорости роста ^ можно оценить приближенно через конечные разности в пределах от 1,2ШО~2 до 4,72x10"^ час-1. После завершения активного роста начинается фаза замедления, которая может длиться до 15 дней; она сопровождается резким увеличением содержания полисахаридов в клетке. Оптимум роста в области рН 6,57,4. Выше рН 8,0 и ниже рН 6,3 развития нет. Кривые потребления ММА и накопления продуктов,- метана и аммония - зеркально симметричны. -Коэффициент стехиометрии для ММА и аммония К=0,76+0,22. При использовании ММА на 84« выход по метану составил 2,65 мг асб / ммоль СН^, а урожай биомассы 0,15 г асб/л /14/.

Помимо метана и аммония - основных продуктов обмена, образуемых из метиламинов, некоторые галофильные метаногены выделяют и водород, создавая его стационарную концентрацию на уровне десятков миллионных частей (р.р.т.) в газовой фазе. "Гак морские метаногены образуют менее 40 р. р. т. М. Ьа1орЫ1из вообще не образовывал Н2, а М. еуезНдг^ит образует более 1000 р. р. т., особенно на плохо

используемых субстратах /24/. Таким образом, эти метаногены могут участвовать в обмене водорода в сообществе.

В сообществе метаногенных микроорганизмов накапливаются кор-риноиды, количество которых резко возрастает при добавлении к среде метанола, что указывает на возможное участие в их синтезе метилотрофных анаэробов. КорриноиДЫ в основном представлены истинным Bjg или его аналогом фактором III, содержащим в нуклеотидной части молекулы 5-оксибензимидазол. Исследование чистых культур Cj использующих метаногенов и метилотрофных ацетогенов показало, что они обладаюг высокой кобамид-синтезирующей способностью. Неэави-сисимо от субстрата все метаногены образовывали только фактор III, в то время как большинство неспорсвых адетогенов СAcetobacterium woodii, Butyribacterium methylotrophicum, Eubacterium limosum) -истинный витамин B^- У метилотрофных метаногенов - пресноводных метаносарцин и у М. halophilus - фактор III составлял 85-90*/. от общего количества образуемых корриноидов, в то время как у метаногенов, развивающихся на Hg и фермате, уровень накопления фактора III был значительно ниже, но тем не менее позволял допускать участие корриноид-эависимых энзимов в специфических реакциях, связанных с метаболизмом этих соединений. У М. halophilus, было отмечено наибольшее образование фактора III - 16300 мкг/г асб /9, 15, 21/.

Итак, галофильные облигатно метилотрофные метаногены представляют единую морфофизиологическую группу, характеризующуюся использованием метиламинов, неправильно-кокковидной формой клеток, участием в неконкурентном пути метаногенеза в гиперсоленых водоемах. Их экофизиологические характеристики хорошо соответствуют местообитанию, в котором они вследствие крайне узкого набора используемых субстратов могут выполнять строго специализированную роль. Следующий вопрос состоял в выяснении степени их генетического родства.

Таксономия и номенклатура метилотрофных галофильных метаногенов была разработа на основе изучения типовых штаммов монотипических видов и выявила их большое разнообразие. Из 61 вида узаконенных сейчас метаногенов - 10 видов и 5 родов представлено облигат-но-метилотрофными галофальными метаногенаыи. Они выделены из морских и континентальных соленых водоемов, а также из высококинера-лизованных пластовых вод (Образцова и др. 1988). Систематика га-лофильных метаногенов оказалась неупорядоченной. Первые метилот-

рофные морские метаногены с верхним пределом солености до 5% были описаны одновременно с М. halophilus /6,7/ и отнесены к разным родам-. Msthanolobus tindarius CKonig, Stetter 1982), Methanococcoi-des methylutens СSowers, Ferry 1983). M. halophilus был помещен нами на основании морфологии, облигатной галофилии и состава клеточной стенки в род Methanococcus, типовым видом которого в то время был Methanococcus mazei, использующий помимо водорода также метанол. N. halophilus Z-7982T был узаконен в 1984 г. CIJSB v 34:270), но в том же году род Methanococcus подвергся ревизии, в результате которой типовой вид рода М. mazei был перенесен в род Methanosarcina с названием Methanosarcina mazei CMah, Kuhn 1984). Это согласуется с нашими исследованиями морфологии метаносарцин: образующий цисты штамм Z-558 С"морфотип III"), выделенный нами из навоза, соответствовал описанию Methanococcus mazei. Исследованная нами впервые ультраструктура этого организма /4/, выявила характерное для метаносарцин деление дроблением, и позволило классифицировать штамм Z-558 (=DSM 2244) как Methanosarcina mazei (Catalog DSM,

1983), что было подтверждено затем и иммунологическими данными /29/. После изменения содержания рода Methanococcus (Judicial Commission, 1986) с К. vannielii как типовым видом, в нем остались только морские кокковидные метаногены, использующие ' Н2 и формиат. Это привело к несоответствию таксономического положения М.halophilus.

Тем временем были описаны новые таксоны метилотрофных строго галофильных метаногенов Methanohalobium evestigatum /22/ и Halome-thanococcus doii (Yu, Kawamura 1987). Для умеренно галофильных метаногенов был предложен род Methanohalophilus с типовым видом М. mahii CPaterek, Smith, 1988), но без предварительного сравнения с ранее описанным и близким к нему по фенотипическим характеристикам М. halophilus. В роде Methanohalophilus были описаны алкало-фильные виды M.zhilinae CMathrani et all. 1988) и M.oregonense (Liu et all. 1990).

Таксономический статус родов Methanolobus и Methanococcoides был подтверждён данными ДНК и РНК/ДНК гибридизации (Sowers et.al.,

1984). Умеренно- и экстремально-галофИльные виды из различных мест обитания не сравнивались между собой генотипически и правомочность

^ вновь созданных родов и видов оставалась сомнительной. Так -было высказано предположение (Boone et all, 1988), что роды Methanohalophilus и Methanohalobium - синонимы.

Филогенетическое положение метилотрофных галофильных метано-генов было установлено по последовательности нуклеотидов 58 рРНК /23/. Они оказались ближе к аэробным галобактериям, нежели к палочковидным пресноводным метаногенам родов ЬЫЬапоЬас^еггит и Ме-(:ЬапоЬгеу1Ьас1ег. Из сопоставления последовательностей рРНК стало ясно, что М. Ьа1орЫ1из должен быть исключен из рода МеИчапо-соссиэ поскольку он попадает в кластер облигатно - метилотрофных метаногенов. Различаясь большим числом замен нуклеотидов С17-25) слабо-, умеренно-, и экстремально - галофильнне виды родов Ме^а-по1оЬиз, Ме^апососапс^Б, Ме^апоКа]. орМ 1из, Ме1ЬапоЬа1оЫит образовали самостоятельный кластер близкий к метаносарцинам, что соответствует их фенотапическим характеристикам и позволяет рассматривать их как членов сем. МеШапоэагсгпасеае пор. МеИчапописгоЫа-1ез. Этот вывод находит свое подтверждение в РНК/ДНК гибридизации (БоиегБ е1 а1., 1984) и составе липидов /27/.

Состав липидов в сравнительном аспекте был исследован для типовых штаммов галофильных метаногенов родов Ке1Капо1оЬцз, Ме^апо-coccoides, Ме1Капозагс1па, МеИчапоЬаХорМ 1 из, Мо1ЬапоЬа1оЫит и пресноводных метаногенов родов Ме1Ьаг.озагс1па и МеИ1апоЬас1 ег 1ит /27/. Характерные для архебактерий углеводороды - сквалены и/или иэопреноиды, а также соединение, идентифицированное Г.А. Осиповым как фосфоглицероглюконолактон присутствовали у всех метаногенов. Качественный состав жирных кислот метанобраэувшх бактерий близок к таковому у эубактерий. Отношение насиненных кислот к ненасыщенным у пресноводных видов составило Ы, у галофильных 2:1. Для сем. МеИчапозагстасеае характерны глицерофосфаты и фосфаты Сахаров и инозита, которые количественно составляли у разных видов от 25% до 50% липиДной фракции. По соотношению жирных кислот, составу углеводородов М.еуезида!.™ ближе к метаносарцинам, нежели к другим метилотрофным галофильным метаногенам. Это согласуется со сходством их клеточных оболочек. Слабо-, умеренно,- и экстремально -галофильйые виды метилотрофных метаногенов при близких липидных профилях различались составом углеводородов и соотношением обнаруженных в липидной фракции компонентов. Так у М. еуеэида^т присутствовал!! изопреноиды С25.3, С25.4, 025.5 , а у И hal.ophil.iis только сквалены Сдр.5, Сдц.д./П,27/.

Высокая степень изменчивости 5Э рРНК в пределах группы метилотрофных галофильных метаногенов не позволяет использовать ее в качестве абсолютного критерия для таксономии этих организмов и

эволюционных расстояний между ниш. Очевидно, что для получения объективной картины необходимо сравнение большего числа штаммов и разными методами геносистематики. При этом можно ожидать, что границы признаваемых сейчас таксонов окажутся более расплывчатыми, чем они представляются в настоящее время. Исследование ДНК/ДНК гомологии ряда штаммов , выделенных нами и другими исследователями из разных регионов мира подтверждают это наше предположение /34/.

По ДНК/ДНК гибридизации исследованные штаммы распределились на: умеренно-галофильные рода Methanohalophilus и экстремально -галофильные рода Methanohalobium. Среди умеренно-галофильных штаммов, с содержанием ГЦ от 43 до 48% СТабл.2) высокая степень ДНК-ДНК гибридизации С87%) с Methanohalophilus mahii SLPT была обнаружена у Methanococcus halophilus Z-7982, и штаммов Z-7404, TR-7. С очевидностью следует, что все они принадлежат к роду Methanohalophilus и могут рассматриваться как штаммы одного вида. Штамм Z-7405, иммунологически идентичный М.halophilus /29/ имел только 25?« гибридизации с ним, но обнаружил 80% гибридизации с TR-7 и 50Н с М. mahii и отнесен нами к этой же группе. Штаммы 2-7401, Z-730I, Z-7302 по степени ДНК-ДНК гибридизации с М. mahii С37-48%) могут рассматриваться как новые виды Methanohalophilus, если у них будут обнаружены фенотипические и хемотаксономические различия. Алкалофильный М. zhilinae обнаружил 20% гибридизации с М. mahii и 13% с М. evestigatum. По ряду свойств (табл.2) а также интервалу рН (8,2-10,3) и оптимому рН С9,2) он отличается от М.mahii и других галофилов, выделенных из водоемов морского происхождения. Его видовая самостоятельность не вызывает сомнения.

т

Экстремально галофильный Methanohalobium evestigatum Z-7303 имел низкую ДНК-ДНК гибридизацию (6-8%) с умеренно галофильными штаммами, в том числе и с М. mahii. Он отличается от М. halophilus на 26 оснований в 5S рРНК , величину, которая различает другие роды галофильных метаногенов CMethanohalophilus, Methanococcoides, Methanolobus). По ряду фенотипических свойств (Табл.2) М.evestigatum существенно отличается от членов рода Methanohalophilus. Низкая степень ДНК/ДНК гибридизации со штаммами Methanohalophilus подтверждают его таксономический статус. Экстремально галофильные штаммы Z-7408. Z-7403 сходные с типовым штаммом М. evestigatum по морфологии и составу Г+Ц обнаружили только 7-15% ДНК-ДНК гомологии с ним и штаммами Methanohalophilus. Однако, в соответствии с рекомендациями Ad Нос комитета по систематике бактерий не следует соз-

давать новые таксоны, если у них нет четких фенотипически различающих признаков С Wayne et. al. , 1987).

На основе фенотипических характеристик и ДНК-ДНК гомологии (Табл 2,) Methanococcus halophilus Z-7982T и Methanohalophilus mahii SLP^, сходны и могут рассматриваться как штаммы одного вида. Согласно Правилам 23а, 38, и 42 Международного Кодекса Номенклатуры Бактерий CI975) видовой эпитет "halophilus" CIJSB, 1984, V.33: 438) имеет приоритет над видовым эпитетом "mahii" CIJSB, 1988, v.38: 122) и должен быть сохранен. Исходя из этого Methanococcus halophilus перенесен нами в род Methariohalophilus под названием Methanohalophilus halophilus comb.nov./34/. Согласно правилу 37a Международного Кодекса род Methanohalophilus должен быть исключен, если Юридическая Комиссия не признает необходимым противоположное. Однако мы предложили сохранить род Methanohalophilus для умеренно галофильных метаногенов с его текущим таксономическим определением и типовым видом рода Methanohalophilus halophilus Т

Z-7982 C=DSM 3094, OCMI60). После длительной дискуссии в Подкомитете по систематике архебактерий решено временно сохранить и вид М. mahii, т.к. этот штамм имел некоторые различия в профиле белков Сперсональное сообщение Буна, США).

В результате проведенных генотипических исследований ряда умеренно и экстремально-галофильных штаммов следует, что для различных областей солености имеются генетически различные, бактерии, т.е. что в гиперсоленых водоемах имеется не ряд штаммов одного вида, адаптированных к разной солености, но разные виды. Тот факт, что штаммы, выделенные из географически удаленных мест оказались фенотипически и генетически близки, позволяет говорить не о географических расах, а о широком распространении определенных, как например, М. halophilus, видов.

III. ДЕГРАДАЦИЯ БЕТАИНА И ГОМОАЦЕТАТНЫЕ ГАЛОФШЫШЕ АНАЭРОБЫ

Узкая специализация метилотрофных метаногенов к метиламинам заставляла выяснить источник этих соединений в галофильном микробном сообществе. Кингом С1984) было показано, что при разложении бетаина в галофильном сообществе образуются ТМА и ацетат, однако организмы, вызывающие этот процесс , оставались неизвестными. У пресноводных анаэробных бактерий разложение бетаина происходит путем гомоацетатного восстановительного брожения, осуществляемого либо синтрофно, либо в чистой культуре как у Sporomusa sphaeroides (Moller et al., 1984).

В цианобактериальном мате лагун Арабатской стрелки мы обнаружили новый экстремально-галофильный организм, использующий крайне ограниченное число субстратов, но в их числе бетаин, из которого образуются ацетат и метиламины. Таким образом, было найдено недостающее звено в трофической цепи галофильного метаногенеза, ведущее от наиболее вероятного предшественника. Организм представлял первую облигатно-галофильную гомоацететную бактерию, и был выделен

нами в новый род. По физиологии и месту выделения организм получил

т

название Acetohalobium arabaticum с типовым штаммом Z-7288 (= DSM 5501) , узаконенное в CIJSB, 1990,v 40:470).

Клетки Acetohalobium палочковидные, слегка изогнутые, одиночные, в парах или коротких цепочках размером С0,7-1)хС2-5)мкм. Подвижны за счет 1-2 субтерминальных жгутиков. Грамотрицательные. Олйгоспоровые. Клетки остаются жизнеспособными после нагревания до 80° в течение 10 мин. В стационарной стадии роста клетки лизирувтся. Экстремальный галофил с оптимумом роста при 15-18/! NaCl; ниже 10/i и выше 25У. роста нет. Мезофил, максимальная температура роста 47°.

Из 37 испытанных субстратов, включающих углеводы, органически е кислоты, аминокислоты, полиспирты А. arabaticum мог использовать в качестве источника энергии: бетаин, TMA, Hg, СО, формиат, лактат, паруват, гистидин, казаминовые кислоты. При росте на СО, Hg+COg, и формиате продуктом обмена был ацетат. При росте на бетаине и ТМА основным продуктом обмена является ацетат, но кроме него образуются метиламины С Табл.5, 6). Таким образом, Acetohalobium способен к трем типам обмена : хемолитоавтотрофному на Hg+COg, СО; метилотрофному на ТМА; органотрофному на бетаине и некоторых других субстратах /32/.

Организм содержит периплазматическую и цитоплазматическую ги-дрогеназы, катализирующие восстановление бензилвиологена водородом. Обе гидрогеназы стимулировались высокими, вплоть до насыщения концентрациями NaCl и KCl. При 4,5 М NaCl активность увеличивалась более, чем в 5 раз, при 3,54 М KCl - более, чем в 3 раза по сравнению с максимальной активностью без соли. Цитоплаэматические ферменты лактатдегидрогеназа и глутаматдегидрогеназа также стимулировались в пределах от I Ы до 5,2 М. NaCl. Добавление бетаина не оказывало влияния. Полученные данные свидетельствуют о том, что Acetohalobium физиологически адаптирован к среде с высоким содержанием солей благодаря ферментам, которые функционируют при высо-

-ÜÜ-

ких внутриклеточных концентрациях солей /43/.

Выделение гомоацетатного организма показывает, что помимо ВеэиИ^тЬгио, некоторые штаммы которого могут разлагать бетаин и холин с образованием ТМА, в системе имеется специализированный организм, продуцирующий ТМА из осморегуляторного вещества протео-бактерий при высокой солености. Вместе с тем продукция ацетата ставит вопрос об его использовании в трофической системе. Помимо аэробных галобактерий ацетат при солености <20*/, могут использовать сульфатвосстанавливающие и фотосинтезирующие бактерии.

Филогенетически Асе1оЬа1оЫш принадлежит к сем. На1оапаего-Ыасеае, до недавнего временя объединявшему органотрофные грамот-рнаательные эубактерии по преимуществу с углеводным обменом. Асе-1оЬа1оЫшп не использует углеводов, но по ряду признаков - грамот-рицательному строению клеточной стелки, низкому ГЦ, жирнокислотно-му составу мембран - он оказался близок к другим представителям сем. На1оапаегоЫасеае СТабл. 3), что подтвердило и определение последовательности оснований в 55 рРНК /42/.

Существование микроорганизмов в соленых водоемах обусловлено осмотической устойчивостью этих организмов. Возможны две стратегии обеспечения осмотической устойчивости. Одна заключается в активной откачке ионов На+ из клетки и замены их на К+ как у галобактерий; представители сем. На1оапаегоЫасеае используют эту же стратегию. По второй осморегуляцию обеспечивают "совместимые" органические соединения, которые пассивно удерживаются в клетке. Содержание этих оединений в клетках галофилов нарастает пропорционально солености. Идентифицирован ряд таких соединений. У слабых галофилов к ним относятся дисахариды, преимущественно сахароза и трегалоэа, и аминокислоты. Для умеренных галофилов наиболее характерны глицин-бетаин или глицерин-гликоэидн. У Ьйсгосо1еиз сМ.Копор1аз1еБ осмо-регуляторннм веществом оказался гетерозид, который при максимальной солености составляет 30% от общего веса (Кевбрин и др. 1991). Возникает вопрос о путях деградации этих соединений в галофильном анаэробном сообществе. Разложение бетаина осуществляет Acet.oha.lo-Ыит. Какие организмы способны сбраживать осморегуляторные углеводы при высокой солености ?

IV.САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ ГАЛОФИЛЬНЫЕ АНАЭРОБЫ.

Начальные этапы разложения органического вещества в галофильном цианобактериальном сообществе осуществляют анаэробные органотрофные эубактерии, которые поэтому представляют ключевую группу

микроорганизмов для понимания трофической структуры сообщества. Из наблюдений in situ было очевидно, что процесс разложения органического вещества, завершаемый деятельностью вторичных анаэробов, в первую очередь сульфидогенов, идет с большой интенсивностью. В особенности это важно для таких устойчивых сообществ как цианобак-териальные маты морских лагун. Из цианобактериального мата нами были выделены многочисленные там сахаролитические бактерии сем. Haloanaerobiaceae, активно сбраживающие олигосахариды. Их численность составляла в верхнем 4 мм слое мата 10®клеток/см^, и с глубиной снижалась до 10 клеток/см^.

Выделенные из гипергалинных водоемов сахаролитические анаэробы составили три группы, соответствующие самостоятельным видам /35/ СТабл.3).

Таблица 3.

Характеристики анаэробных грамотрицательных эубактерий сем. Haloanaerobiaceae, выделенных из соленых водоемов Крыма

организм NaCl, У. t,C° pH жирные кислоты Сосновные) субстраты продукты г+ц

оптимум

Haiobacteroides CI6.-I-9 Углеводы 30,5

halobius 10-15 40 7,0 016:0 Ацетат,

Z-7287 Этанол

Haiobacteroides 15-18 37 6,8 016:1-9 32,4

lacunaris CI6-0

Z-7888T

Haloincola 10 40 7,5 CI6:1-9 н2,со2. 31,3

saccharolytica Z-7787T CI6:I-II Ацетат.

CI6: 0 CI5:I-II

Acetohalobium 15-18 40 7,8 CI6:1-9 Hp+C0p.C0, 33,6

arabaticum CI6:0 Формиат, Ацетат .

Z-7288T Бетаин TMA Ацетат, ТМА Ацетат, ДМА.ША

Три штамма 2-7187, Z-7287, Z-7387 принадлежали к монотн -Й2-

пическому виду Halobacteroides halobius, описанному Ореном С1984) для Мертвого моря. Наиболее полно был исследован штамм Z-7287 (=DSM 6639).

Клетки Н.halobius - тонкие 0,3-0,5х2-К)мкм, гибкие подвижные палочки с перитрихиальным жгутикованием, образующие в конце развития нежизнеспособные сферопласты. Организм олигоспоровый с грамот-рицательным строением клеточной стенки. Умеренно-галофильный с оптимумом при 10-15% NaCl. Быстрорастущий: при оптимальных условиях (Табл.3) время удвоения в ферментере менее 2ч. при удельной скорости роста /j=0,35 час"'*'. Выход по субстрату Y = 2,5 г белка/М глюкозы. В отличие от типового штамма Орена с пределом роста при 17%, штаммы Н. halobius, выделенные из лагун, росли и при 30% NaCl, но слабо и после длительной лаг-фазы. Различной была также потребность в витаминах. Из 37 испытанных в качестве единственного источника энергии веществ Н. halobius штамм Z-7287 использовал сахарозу, трегалозу, маннозу, глюкозу, фруктозу; слабый рост был на галактозе, мальтозе, целлобиозе, макните, лактате, пирувате. Гид-ролизует крахмал. Азотистые соединения не используются. Таким образом, Н. halobius - узкоспециализированный сахаролитический организм. По мере роста культуры возрастает восстановленность среды и потенциал снижается до* -540мВ, что создает возможность для раэ-развития других анаэробов в цианобактериальном сообществе /35/.

Из соленого оз. Чокрак наш был выделен новый вид Halobacteroides lacunaris Z-7888T(=DSM 6640) , что значит "лагунный" /36/. Клетки Н.lacunaris - гибкие, подвижные палочки 0,7-1 х 0.5-6 мкм с перитрихиальным жгутикованием. В конце экспоненциальной фазы роста образуют сферопласты, «з которых в отличие от Н.halobius удается получить воспроизводимый рост. От Н.halobius, с которым он имеет 40% ЕНК-ШЖ гомологии /35/, этот вид отличается размерами клеток и их полиморфизмом, отсутствием спор и способностью развиваться при экстремальных значениях солености. Он имеет оптимум солености 1518% NaCl и не растет ниже 10% (Табл.3). Рост при 30% сопоставим с оптимальным, но при этом существенно возрастает лаг-фаза с 15 ч до 80-90 ч. Среди известных представителей Haloanaerobiaceae - это первый экстремалъно-галофильный сахаролитический. организм. При сбраживании глюкозы Н.lacunaris образует такие же как и Halobacteroides halobius продукты (Табл. 4). Использует тот же набор углеводов что и Н.halobius, но в дополнение сорбит и слабо рибоэу, сорбозу. Помимо крахмала также активно гидролизует и гликоген. При

оптимальных условиях СТабл. 33 время удвоения в ферментере составляет 4,2 ч., при удельной скорости роста р=0,164 а выход по субстрату Y=5,2 г белка/М глюкозы /36/. Сравнение транспорта 14С глюкозы клетками Н. halobius Z-7287 и Н. lacunaris Z-7888 показало, что Н. lacunaris быстрее транспортирует глюкозу и включает ее в кислотонерастворимые продукты /40/.

В липидной фракции исследованных штаммов Halobacteroides, были обнаружены жирные алифатические и оксикислоты, характерные для мембран и клеточных стенок эубактерий..Жирнокислотные профили ли-пидов мембран у Н.halobius и Н.lacunaris сходны, что указывает на родство этих организмов. До 80% всех жирных кислот составляли пря-моцепочечные Cjg-кислоты, из которых 70% приходилось на долю ненасыщенной nCjg.j-9, что обуславливает значительную пластичность их мембран, выражающуюся в гибкости клеток и способности их сворачиваться и образовывать сферопласты /36/.

Третью группу сахаролитических анаэробных эубактерий • составляют штаммы, выделенные наш из лагун Сиваша CZ-7487, 2-7787'Г) и оз. Сиваш CZ-7587, Z-7687). Это умеренные галофилы с оптимумом роста при IO?-i NaCl, но с широким диапазоном солености 3-30% . При крайних значениях рост, однако, слабый и наступает после длительной лаг-фазы. Морфологически это короткие палочки размером 0,5-0,7 х 1-1,5 мкм. Клетки подвижные, с перитрихиальным жгутикованием, грамотрицательные. Спор не образуют. Время удвоения в ферментере для штамма Z-7787^npH оптимальных условиях СТабл.3) составляет 3,9 ч., а выход по субстрату У=3,8 г белка/М глюкозы. Субстратами для роста служили те же соединения как у Н. halobius, но штаммы новой группы могли использовать лактозу, мелибиозу, арабинозу, -рибозу, ксилозу, эритритол, глицерин , N-ацетилглюкозамин и не были способны к гидролизу крахмала. От Halobacteroides эти штамма отличались морфологией и продуктами обмена (Табл. 4), низкой ДНК-ДНК гомологией (5-I0JÖ, составом липидоз /35,42/. В отличие от представителей Halobacteroides, у которых полностью отсутствовали жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода, у штаммов новой группы присутствовали nCjg.j и nCjy.j. Последовательность 5S рРНК у этих штаммов отличается от Halobacteroides на 17-20 оснований и они представляют самостоятельную ветвь среди Haloanaerobiaceae. По целому ряду признаков они отличались и от других представителей Haloanaerobiaceae. Для этих штаммов наш предложен новый род Halo-incola, что значит "обитатель соли", с видовым эпитетом Н. saccha-

го1уИса и типовым штаммом 2-7787™ С =ПЗМ 6643) /42/.

Таблица 4

Стехиометрические коэффициенты сбраживания глюкозы бактериями родов НАЬОВАСТЕШБЕБ и НАЮШСОГЛ Смоли образуемых продуктов на I моль сброженной глюкозы)

со2

организм |этанол | ацетат | Hg j

HALOBACTEROIDES Стеор.) I I 2 2

Н. lacunaris 2-7888 0,89+0,35 0.93+0,38 2,0+0,5 1,6+0,4

H.halobius 2-7287 1,40+0,38 1,00+0,26 1,8+0,49 1,7+0,78

HAL0INC0LA Стеор.) О 2 4-2

H.saccharolytica Z-7787 0 1,98+0,33 4,02+0,5 1,79

Показано, что дисахариды служат осморегуляторами у слабых га-лофилов CBorowitzka,1981). Оказалось, что трегалоэа и сахароза-лучшие субстраты для выделенных на im штаммов Haloanaerobiaceae. Отсюда можно сделать заключение, что помимо обычных источников углеводов исследуемые организмы хорошо используют углеводы, служащие осморегуляторами в галофильном сообществе. Подтверждением этому является способность штаммов Н. halobius расти на 2-0-0-глюкопира-нозилглицерине - осморегуляторе у Microcoleus СКевбрин и др.,1992).

Сахаролитические анаэробы были выделены из мест обитания с выраженным сульфидогенезом и повышенным содержанием сероводорода, приводящим,,как в оэ.Чокрак,к образованию лечебных грязей. Бонч-0с-моловская с соавторами С1988) установила наличие активного процесса сероредукции в цианобактериальных матах, причем на сероредукцию повышение солености влияло меньше, чем на сульфатредукцию. Изучение выделенных нами организмов обнаружило их необычайно высокую устойчивость к HgS, вплоть до 50 мМ /36/.

При проверке возможности роста выделенных организмов с разными акцепторами электрона оказалось, что они способны только к восстановлению молекулярной серы, образуя в зависимости от условий от 7 до 17 мМ H2S. Высокая численность, сахаролигических анаэробных бактерий в верхних слоях мата, где сероредукция доминирует СБонч-Осмоловская и др., 1988) позволяет предполагать их активное участие в этом процессе в продукционной зоне цианобактериального сообщества. Для системы важно, что сероредукция, осуществляемая этими бактериями может идти при солености выше 20ч, когда сульфатредук-

ция в значительной степени подавлена . Существенно также, что в присутствии Sq продукты обмена сахаролитических анаэробов могут меняться и начинает доминировать ацетат /35,35,42/ .

Из Сиваша при разложении отмершей кладофоры М.В.Симанькова (1991) выделила еще одного представителя сем.Haloanaerobiaceae -анаэробный галофильный целлюлозолитический организм Halocella cellulolytica.

Установленные по последовательности оснований в 5S рРНК эволюционные отношения между изученными представителями Haloanaerobiaceae показывает, что это достаточно далеко дивергировавшие друг от друга организмы С рис. 2) ".

Филогенетически все эти организмы образуют самостоятельную ветвь на одном уровне ветвления с Proteobacteria и представляют таксон более высокого ранга, чем семейство Срис.3).

V. ТРОФИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ В ГАЛОФИЛЬНОМ СООБЩЕСТВЕ.

В результате проведенных исследований нам удалось реконструировать трофические взаимоотношения в галофильном микробном сообществе цианобактериального мата На основании свойств известных по чистым культурам организмов, которые приведены в качестве примеров для возможных узлов в пищевой цепи Срис 4).На метаболической схеме галофильного сообщества выделены три уровня организмов: I - продуценты; 2- первичные анаэробы; 3- вторичные анаэробы.

Основное внимание мы сосредоточили на специфических для сообщества ооморегуляторнья веществах и возможных путях их деградации, оставив пока в стороне протеолитический путь разложения аминокислот - осмолитиков, поскольку возможные агенты этого процесса Halo-anaerobium CZeikus et al., 1983 ) и Sporohalobacter С Oren et al., 1987) были уже описаны.Серный цикл доминирует в галофильном циано-бактериальном ма-те и маскирует другие процессы. Образующийся суль-фатвосстанавливаюцими бактериями сероводород окисляется галофиль-ныыи фототрофными бактериями, а также в цианобактериальном слое до серы. Она может восстанавливаться с образованием HgS сахаролити-ческими бактериями сем. Haloanaerobiaceae, как это было показано нами с чистыми культурами этих организмов, вплоть до предельно высоких значений солености.

Распределение численности исследованных бактерий по слоям мата показало, что и метилотрофные метаногены, и органотрофные анаэробы наиболее обильны в.верхнем слое с цианобактериями, а ниже их численность снижается на несколько порядков, хотя и продолжает ос-

□ .1

I-

Рис 2. Филогенетическое дерево На1оапаегоЫасеае, построенное на ■ основании сравнения нуклеотидных последовательностей в 55 рРНК.

Рис.3. Положение сем. На1оапаегоЫасеае на филогенетическом дереве прокариот на основе последовательности в рРНК.

-¿7-

гаваться заметной. Следовательно, метилотрофные метаногены участвуют в быстром круговороте вещества в местах его продукции, но вместе с тем они могут отвечать и за образование метана в глубоких слоях мата. Эти данные хорошо согласуются с результатами определения продукции СН^ в мате ССлободкин и др. 1992), установившими наибольшую скорость его образования в самом верхнем слое и накопление под газоупором.

Поскольку концентрация осморегуляторных веществ в клетках пропорциональна солености, то можно полагать, что пути, связанные с деградацией этих соединений, приобретают большее значение при повышении солености. Осморегуляторные вещества при этом могут составлять 20-30% от биомассы и их разложение становится важным эвеном цикла углерода в системе.

Наиболее ясным представляется путь разложения бетаина- характерного осморегуляторного вещества протеобактерий. Бетаин протеобактерий разлагается Acetohalobium на ацетат и ТМА. Acetohalobium высокоспециализирован по отношению к бетаину и использует лишь небольшое число других веществ. Продукт его обмена - ацетат - таххге как ацетат, образуемый сахаролитическими анаэробами, может служить субстратом широкого круга протеобактерий, например, фотосинтеэиру-ющих и сульфатвосстанавливающих. ТМА, образуемый из бетаина, служит субстратом неконкурентного пути метаногенеза, для которого нами были открыты соответствующие специфические микроорганизмы.

В ряде случаев нам удалось подтвердить предложенную схему трофических взаимоотношений, исследуя парные взаимодействия микроорганизмов. При совместном росте на бетаине двух культур -Acetohalobium arabaticum" и Methanohalophilus Z-7302 Сбыл выбран штамм, использующий все метиламины) - продуктами обмена были лишь ацетат и метан СТабл.5).

В совместной культуре на ТМА A.arabaticun и М. evestigatum образуется незначительное количество ацетата и ТМА используется в основном для метаногенеза; гомоацетатные эубактерии не могут конкурировать с метанобразующими архебактериями за ТМА СТабл.6) /33/.

Рис 4.Трофические отношения между микроорганизмами в галофильном цианобактериальном сообществе. Жирные стрелки-обнаруженные реакции; микроорганизмы, их осуществляющие, подчеркнуты тонкой линией; осморегуляторные вещества-волнистой линией.

Ice I

¡¡£¿¡<L\ /песги=\ ^ ас ids ) \ mass J

Haloanaerobium Sporohalobacter*

Таблица 5

Образование продуктов из бетаина С36,9 ммоль/л бетаина на среде с 15% ИаС1 при 38°, 9 суток)

штаммы ммоль/л

ацетат ТМА ДМА ММА сн4

МеИаалоЬа1ор1и1цз г-7302 ' "0 0 0 0 0

АсеЬоКаЬЫшп г-7288 40,8 3,87 0,73 3,8 0

Бинарная культура 2-7302+2-7288 43,3 0 0 0 7,2

Таблица 6

Образование продуктов из триметиламина (ТМА 52 ммоль/л , 15% N101, 40°С, 9 суток инкубации)

Штамм остаточный продукты Сммоль/л)

субстрат ТМА Ацетат ДМА ША СН4

Асе1оЬа1оЬ1ит 2-7288 28,4 17,7 . 8,9 4,4 О

Ме1ЬапоКа1оЫит 2-7303 0 0 0 . 20,1 88

Бинарная культура 0,2 12,7 6,3 16,8 62 2-7288 + г-7303

Здесь были рассмотрены только катаболические процессы взаимодействия в галофильном сообществе, которые можно установить, рассматривая организмы со строго специфическим обменом. Ото позволило нам сделать заключение, что галофильное сообщество имеет своеобразный путь деградации осморегуляторных веществ, приводящий к неконкурентному пути меганогенеза при всех значениях солености.

VI. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАНОГЕШЖ СООБЩЕСТВ.

Сравнительный анализ различных метаногенных сообществ позволяет точнее выяснить общие закономерности формирования трофических связей в микробных сообществах и роль разнообразия метанобра-зуюпшх бактерий, определяемую экофизиологией различных видов.

Термофильные сообщества гидротерм по экстремальности' условий обитания представляют наиболее близкую аналогию галофильному

цианобактериальному сообществу. Метанобразующие бактерии в них способны развиваться при крайне высоких температурах в выходах парогазовых струй за счет использования глубинного водорода.

В нашей лаборатории исследовали термофильное* цианобактериаль-ное сообщество кальдеры Узон С см.Кальдернке микроорганизмы "Наука" 1989). Оно развивается при температуре ниже 60°С в углекислотных источниках - мо.фетах, для газового состава которых не характерно присутствие эндогенного водорода. В них имеется мощная продукция органического вещества, приводяаяя к формированию слоистых ■ матов - современных аналогов строматолитов - с термофильными цианобакте-риями Mastigocladus laminosus и Phormidium laminosum, некромасса которых разлагается сообществом термофильных анаэробных бактерий. HgS в этом сообществе имеет как биологическое, так и вулканическое происхождение. Наряду с сульфидогенеэом разложение органического вещества завершается метаногенезом. В этом сообществе отсутствуют метаносарцины и оно представлено палочковидными формами.

В сообществе действуют и ацетатный, и водородный пути метано-генеза. Ацетатный путь осуществляет Methanothrix thermoacetophila (Ножевникова, Ягодина 1982). Водородный путь осуществляют литоаз-- тотрофные бактерии рода Methanobacterium, использующие исключительно Hg. Выделенный нами из газогядротерм Узона штамм Z-I90I /8/ был способен к литоавтрофному росту и по иммунологическим характеристикам оказался близок М. thermautotrophicum /29/. Он не мог использовать формат.

В последнее время установлено, что формиат является вероятной формой межвидового переноса водорода в анаэробном сообществе (Thiele et al., 1988).Из метантенка нами был выделен термофильный формиатиспользующий штамм Methanobacterium thermofornticicum Z-245^ (=DSM 3720), развивающийся при 45-60° /II/. Он был выделен в самостоятельный вид прежде всего на основании способности использовать формиат. Однако по иммунологическим показателям (3+) /29/, последовательности в 5S рРНК (6 мутаций) /23/. и ДНК-ДНК гибридизации (83%) этот вид оказался близок с типовым' видом М. thermautotrophicum. Эти исследования убедили нас в необходимости изменить описание вида М. thermautotrophicum, включив в него и штаммы, использующие формиат /41/.

Оба сообщества и термофильное и галофяльное представлены только бактериями и лишь отдельными формами эукариот как Cyanidium или Dunaliella. В этом отношении их можно назвать реликтовыми. Как

и галощильное, термофильное цианобактериальное сообщество гидротерм представляет собой наиболее близкий аналог древних микробных сообществ, поскольку развивается в струях газа, вероятно аналогичного по составу древней атмосфере. В термофильном цианобактериаль-ном сообществе метанобразующие архебактерии осуществляют завершающий этап разложения органического вещества, а не только используют эндогенные источники. Эти реликтовые сообщества различаются по трофическим особенностям метаногенеза. В термофильном интенсивны и ацетатный, и водородный пути, представленные соответствующими экстремофилами. В галофильном сообществе работает преимущественно метилотрофный путь С King, 1988), связанный с совершенно специфическими для данного сообщества соединениями и осуществляемый мети-лотрофными галофильныш метаногенами сем. Methanosarcinaceae.

В природных местах обитания типичный метаногенез происходит в болотах, которые были нашим первоначальным объектом и которые интересны в сравнительном аспекте тем, что они представляют противоположность термофильным и галофильным цианобактериальным сообществам своею тесной связью с получением органического вещества от высшей растительности,

В болотах происходит разложение некромассы высших растений в субаквальных условиях. В качестве примера нами было исследовано низовое болото в Абрамцево С Моск. обл. ), получающее питание из грунтовых вод. Болото заросло осокой и таволгой, получает листьевой растительный опал. Оно слабо минерализовано, имеет рН 7. Поскольку содержание сульфатов низкое, в этой системе возможность сульфидогенеза ограничена и заключительные процессы анаэробной деградации завершаются метаногенезом. Основное органическое вещество. поступающее в это болото - лигноцеллюлоза высшей растительности. Разложение растительной биомассы в болотах идет по классической схеме метаногенеза СЗаварзин, 1986), включающей разнообразные группы микроорганизмов, при отсутствии или слабом развитии конкурентных процессов. Во многом эти процессы сходны с теми, которые протекают в метантенках и навозе КРС /19/.

Заключительные этапы разложения органического вещества в болотах осуществляют наиболее универсальные из метанобразуюиих организмов - метаносарцины, использующие самый широкий набор субстратов и способные перекрыть все известные пути метаногенеза, кроме формиатного.Из болота в Абрамцево нами были выделены различный метаносарцины, в том числе мезофильный штамм 2-784 с оптимумом рос-

та при 37°С, и близкий по фенотипическим характеристикам к Metha-nosarcina vacuolata Z-76IT C=EKM 1383, DSM 1232) /20/.

Болота бореальной зоны, кроме крайне низкой минерализации, характеризуются резкими годовыми колебаниями температуры и соответственно, помимо мезофильных организмов, в них должны присутствовать и организмы, способные к развитию при температуре близкой к нулю, то есть быть или психрофилами или психротрофами. Благодаря теплоизолирующим особенностям растительного покрова в анаэробной зоне болот сохраняется низкая температура. Серия исследований обнаружила в последние годы значительный метаногенеэ в бореальной и тундровой зоне, но метанобразующие бактерии, развивающиеся ниже 15°С, пока не были известны. Такой организм удалось выделить из подмосковного болота в подледный период метаногенеза. Накопительные культуры были получены на смеси ацетата с метанолом после 3 лет пересевов при 6°С. Чистая культура Methanosarcina sp. Z-7289 росла в пределах 6°- 28°С, но крайне слабо росла выше 20 С Особенностью этого штамма является хороший рост и высокие скорости образования метана на C-I соединениях: метаноле и метиламинах, в то время как водород не используется вообще, а ацетат крайне медленно. Образование метана штаммом Z-7289 из ацетата при температуре выше 15°С начиналось после длительной лагфазы в 20-30 суток. Ниже 15°С образование метана не наблюдали и на 80-е сутки роста, в то время как в накопительной культуре исчерпание 54,2 мМ ацетата при 6°С наступало после 5 месяцев роста. Полученные данные позволяют предположить, что C-I путь метаногенеза имеет важное значение не только в соленых водоемах, но и в психрофильных условиях /38/.

Смесь водорода и углекислоты, не используемая метаносарциной при 6°С, быстро потребляется подвижной палочковидной гомоацетатной бактерией, сходной с Acetobacterium, с образованием ацетата. Водород образуется в системе подвижной кокковидной психротрофной сахаролитической бактерией штамм Z-7I89, образующей из углеводов помимо Н2 и СО2 .ацетат, этанол, бутират /38/.

Таким образом, в болоте в зимний период действует сообщество психрофильных (или психротрофных) организмов, обеспечивающее основные этапы метаногенного пути разложения органического вещества. Судя по физиологии выделенных организмов, лимитирующим этапом является медленное разложение ацетата.

Обше закономерности жизнедеятельности метаногенного сообщества особенно отчетливо наблюдаются при разложении органического

вещества в навозе КРС и метантенках, откуда нами был выделен ряд

меэофильных метаногенов, в том числе новых видов Methanosarcina т т

vacuolata Z-76I /3, 20/, Methanobacterium thermoformicicum Z-245'

/II/, Methanosarcina mazei Z-558 /4, 19/. Все эти работы позволили

нам создать коллекцию метаногенов из разных мест обитания /19/.

Для метанобразующих бактерий свойственно образование консорциумов, которые морфологически оформлены в своеобразные гранулы. Они впервые исследовании нами у метаносарцин СЖилина, 1973), а в последние годи стали предметом многочисленных исследований в связи с очисткой жидких стоков С см.Калюжный и др. 1991). Организмы рода Methanosarcina образуют агрегаты, напоминающие псевдопаренхиму /I/. Формообразующим компонентом служит гетерополисахаридный гли-кокаликс метаносарцин, который позволяет удерживаться внутри колонии бактериям, трофически связанными с ней, в том числе и бактери-олитическим микоплазмам /5/. Это обусловлено необходимостью _ для микроорганизмов, осуществляющих последовательное разложение органических веществ, находиться на минимальном расстоянии друг от друга, обеспечивая быструю межклеточную диффузию метаболитов. На такого рода взаимодействии основаны характерные для метаногенного сообщества синтрофные отношения.

Изучение взаимоотношений между микроорганизмами в элективной культуре, развивающейся на метаноле, показало, что в этой культуре помимо метаносарцины, основного продуцента метала из метанола, может развиваться еще ряд организмов, неспособных к развитию на этом субстрате в чистой культуре. Особенно показательно взаимодействие Methanosarcina и Desulfovibrio. Удалось установить, что Desulfovi-brio vulgaris может развиваться совместно с М. vacuolata на метаноле, так как он использует следы водорода, образуемого метаносар-циной из метанола СЖилина и Заварэин 1973), что впоследствии было подтверждено к для других метаносарцин CLovley, Ferry 1985; Phelps et all., 1985). Выделение водорода иэ C-I соединений установлено и для галофилышх метилотрофных метаногенов /24/.

Сравнивая трофические связи в метаногенных сообществах микроорганизмов, мы видим, что вследствие крайне высокой специализации метаногенов в отношении субстратов в сообществах разных экосистем есть общие закономерности. Этим общим элементом является взаимодействие метаногенов со своими трофическими предшественниками. Вместе с тем имеется большая разница в видовом разнообразии метанобразующих организмов. Доминирующей тенденцией является не

приспособление одного вида к изменяющимся условиям, а смена видов, как это особенно наглядно можно видеть на примере галофильных мети лотрофных метаногенов при постепенном повышении солености. То же относится и к холодным условиям, когда в болоте наряду с меэофиль-ной Methanosarcina vacuolata'обнаруживается и психротрофная Metha-nosarcina sp.

Вместе с тем становится очевидно, что для понимания микробиологии процессов в природе совершенно недостаточно знать организмы со специфическими функциям, но необходимо исследовать взаимодействие организмов друг с другом в составе сообществ. И наоборот, для расшифровки сложных систем взаимодействующих микроорганизмов необходима аналитическая работа по выделению микроорганизмов.

Галофильное сообщество микроорганизмов, благодаря наличию специфических оскорегуляторных веществ и отбору экстремальных форм, представляет особенно наглядный пример такого взаимодействия организмов разных физиологических групп, как правило, крайне удаленных друг от друга филогенетически.

ВЫВОДЫ

1.' Установлена последовательность трофических связей в метан-образующих сообществах и выявлены характерные метанобразующие ар-хебактерии; особое внимание уделено реликтовым сообществам.

2. Установлен трофический путь анаэробного разложения осморегуляторннх веществ в галофильном микробном сообществе.

3. Открыта новая группа умеренно- и экстремально-галофильных строго метилотрофных метаногенов, использующих метиламины в качестве субстрата и описан новый род Methanohalobium.

4. Уточнен таксономический статус метилотрофных умеренно- и экстремально-галофильных метаногенов и установлено их филогенетическое положение среди метанобразующих и других архебактерий.

• 5. Открыт новый род Acetohalobium и описан первый представитель галофильных гомоацетатных бактерий A.arabaticum, способный разлагать глицин-бетаин с образованием метиламинов и осуществляющий литоавтотрофный, метилотрофный, органотрофный ацетогенез при солености до 25%

6. Изучены галофильные сахаролитические организмы сем. Haloanaeroblaceae. Среди них выделены новый род Haloincola и первый экстремально галофильный вид Halobacteroides lacunaris. У них установлена способность к сероредукции и выявлена исключительно высокая устойчивость к сероводороду. Установлено филогенетичес-

кое положение сем. Haloanaerobiaceae среди эубактерий как самостоятельной ветви грамотрицательных организмов.

7. Реконструировано трофическое взаимодействие между организмами разных функциональных групп в галофильном цианобактериальном сообществе. Комбинированными культурами новых организмов подтверждено их попарное взаимодействие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жилина Т.Н. Биотипы метаносарцины. Микробиология. 1976. Т.45

B.З С. 481-489.

2. Жилина Т.Н., Заварзин Г. А. Методы выделения и культивирования метанобразующих бактерий. В кн.:Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов. Пугано. 1978. С. 68-90.

3.Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Сравнительная цитология метаносарцин и описание Methanosarcina vacuolata n.sp. Микробиология. 1979. Т.48. В. 2. С.279-285.

4.Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Образование цист метаносарциной. Микробиология. 1979. Т.48. В.З C.45I-456.

5.Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Микоплаэма в культурах метаносарцины. Микробиология. 1979. Т.48. В.4 С.558-560.

6.Жилина Т.Н. Облигатно-галофильная метанобразующая бактерия. Всес.совещание "Анаэробные микроорганизмы". 19-21 октября 1982г, Пущино. Тез. докл. С.15-16.

7. Жилина Т.Н. Новая облигатно-галофильная метанобразующая бактерия. Микробиология. 1983.Т.52. В.З. С.375-382.

8. Жилина Т.Н., Чудина В.И., Иларионов С.А. , Бонч-Осмоловская Е.А. Термофильные метанобразующие бактерии из метилотрофных ассоциаций "Methanobacillus kuzneceovii". Микробиология. 1983. Т.52. В.2

C.328-333.

9. Быховский В.Я., Жилина Т. Н., Зайцева Н. И. Биосинтез тетрапир-рольных соединений чистыми культурами метанобразующих бактерий. Прикл.биохим. и микробиол. 1983. Т.19. В.5. С. 579-589.

10. Осипов Г.А., Шабанова Е.А., Морозов О.В., Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Жилина Т. Н. Липиды Methanosarcina vacuolata и Metha-nococcus halophilus. Микробиология. 1984. Т.53. В.4. С.633-638.

11. Жилина Т.Н., Иларионов С.А. Характеристика формиатусваивающих метановых бактерий и описание Methanobacterium thermoformicicum n.sp. Микробиогия. 1984. T.53. B.5. С.785-790.

12. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Новые метанобразующие бактерии. Природа. 1985. № 7. С. 103-105.

13. Лысенко A.M., Жилина Т.Н. Определение таксономического положения Methanosarcina vacuolata, Methanococcus halophilu методом ДНК-ДНК гибридизации. Микробиология. 1985. Т.54. В.З. С. 501-502.

14. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Культивирование галофильного метан-образующего кокка на монометиламине. Микробиология. 1985. "Т.54.

B.I. С. 93-99.

15. Bykhovsky V. Ya. , Zaitseva N. I., Zhilina Т. N. Biosynthesis of tetrapyrrole pigments Ccorrins and porp'nynoids) by methane-producing bacteria. In: Environ.Regul.Microb.Metab. CEds. I.S. Kulaev, E. A. Dawes, D. U. Tempest) Press Inc. (London) ,&td. 1985. P. 81-87.

16. Zhilina T.N. Methanogenic bateria from hypersaline environment. Intern. Workshop "Biology and Biochemistry of "Archaebacte-ria" Munchen, 27-30 June 1985, Abstracts, p. II.

17. Zhilina T.N. Methanogenic bacteria from hypersaline environment. Syst. Appl.Microbiol. 1986. V.7. P.216-222.

18. Черни H.E., Попенко В.И., Москвин-Тарханов М.И., Жилина Т.Н. Изучение ультраструктуры клеток галофильной архебактерии Methano-coccus halophilus Микробилогия. 1986. Т.55. В.6. С.989-995.

19. Жилина Т.Н., Бонч-Осиоловская Е.А. , Ножевникова А.Н. Метаноб-разусщие бактерии и ассоциации. В кн: Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: Наука. 1986. С.30-59.

20.Zhilina Т. N..Zavarzin G. A. Methanosarcina vacuolata sp.nov.: a vacuolated methanosarcina. Int.J.Syst.Bact. 1987. v. 37. p. 281-283.

21. Быховский В.Я., Зайцева H. И., Жилина Т.Н., Ножевникова А.Н., Заварзин Г.А. Биосинтез витамина Bjg и его аналогов метанобразую-щими бактериями и ацетогенными метилотрофами. Докл. АН СССР 1987. Т.294. В.З. С.719-722.

22. Жилина Т.Н., Заварзин Г.A. Methanohalobium evestiqatus gen. nov. , sp.nov, экстремально-галофильная метанобразующая архебакте-рия. Докл. АН СССР. 1987. Т.293. ft 2. С.'464-468.

23. Чумаков К.М., Жилина Т.Н., Звягинцева И.С., Тарасов А.1., Заварзин Г. A. 5S РНК у архебактерий. Журн. общей биол. 1987. Т. 48. №2.

C.I67-I8I.

24. БоднарИ.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г. А. Выделение водорода из метиламинов галофильными метанобразуювщми бактериями. Микробиология. 1987г. Т.56. В.З. С.501-503.

25. Жилина Т.Н. Метанобразуюпше метилотрофные архебактерии из гиперсоленых водоемов. В сАрхебактерии. Пущино. 1988. C.II-2I.

26. Безрукова Л.В., Образцова А.Я., Жилина Т.Н., Лауринавичус К.С.

—О/—

Иммунологические исследования метанобразущих микроорганизмов. Там же 1988. С. 151—161.

27. Осипов Г.А., Жилина Т.Н., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Рас-познование образов архебактерий по липидному профиле. Там же 1988.

' С.126-134.

28. Бкховский В. Я-, Зайцева Н.И., Жилина Т.Н., Ножевникова А.Н. Корриноиды метанобразусЕИХ бактерий. Там же 1988г. С.44-50.

29. Безрукова Л.В., Образцова А.Я., Жилина Т.Н. Иммунологические исследования группы штаммов метанобразусщих бактерий. Микробиология. 1989. Т.58. B.I. С.92-98.

30. Жилина Т.Н., Светличная Т.П. Ультратонкое строение Methanoha-lobium evestigatum экстремально галофильной метанобразусаей бактерии. Микробиология. 1989. Т.58.В.2. С.312-318.

31. Zhilina Т.N., Zavarzin G.A. Extremely halophilic methylotro-phic anaerobic bacteria. Cj-sixth International symposium on microbial growth on Cj compounds. Gottingen, FRG,20-25 August 1989, Abstract, L 6.

32. Жилина Т.Н., Заварэин Г.А. Новая экстремально-галофильная го-моацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen.nov., sp. nov. Докл. АН СССР. 1990. T.3II. №3. С.745-747.

33. Zhilina Т.N., Zavarzin G.A. Extremely halophilic, methylotro-phic, anaerobic bacteria. FEKS Microbiol. Rev. 1990. V.87. P. 315322.

34. Wilharm T., Hummel P., Zhilina T. N.. Zavarzin G. A., Stet-ter K.O. Taxonomy of methylotrophic halophilic methanogens. USSR-FRG bilateral symposium "Archaebacteria" Tbilisi, 1-5 October -1990, P. 50.

35. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Лысенко A.M., Заварэин Г.А. Сахаро-литические анаэробы в галофильном цианобактериальноад мате. Микробиология. 1991. Т. 60. B.I. С. 139-147.

36. Жилина Т.Н., Мирошникова Л.В., Осипов Г.А., Заварэин Г.А. Halobacteroides lacunar is sp. nov. новый сахаролитический анаэробный экстремально-галофильный организм из лагунного гиперсоленого озера Чокрак. Микробиология. 1991. Т.60. В.4. С.714-724.

37. Wilharm Т., Zhilina T.N., Hummel P. DNA-DNA homology of methylotrophic halophilic methanogenic bacteria and transfer of Me-thanococcus halophilus— to the genus Methanohalophi 1 us as Metha-nohalophilus halophilus comb.nov. Int.J.Syst.Bact. 1991. V.4I. P". 558-562.

, 38. Жилина Т.Н., Заварэин Г.А. Образование метана при низкой температуре чистой культуроймеганосарцины. Докл. АН СССР. 1991. Т. 317. №5. С. 1242-1245.

39. Жилина Т.Н., Заварэин Г.А. Анаэробные бактерии -деструкторы в галофильном цианобактериальном сообществе. Журн. Общей Биол. 1991'. Т.52. ft 3. С.302-318.

•40. Сексшкин A.A., Северина Л.0., Жилина Т.Н. Влияние условий среды на транспорт глюкозы в клетки гало$ильных анаэробных эубактерий рода Halobacteroides. Микробиология. 1991. Т.60. В. 5. С. 796-800.

41. Touzel J. P., Conway De Macario E. , Nolling J., De Los W.M., Zhilina T.N., Lysenko A.M. DEoxyribonucleic acid ralatedness among some thermophilic members of the genus Hethanobacter ium: Emendation of the species Methanobacteritm thernautotrophicum and rejection of Hethanobacterium thermoformicicum as synonym of Hethanobacterium thermautotrophicum. Int. J.Syst.Bact. , в печати.

42. Zhilina Т. N., Zavarzin G. A. , Buligina E. S, Kevbrin V.V. , Osipov G.A. , Chmakov K.M. Ecology, Physiology and Taxonomy studies on a new Taxon of Haloanaerobiaceae, Haloincola saccharolytica gen.nov. ,sp,nov. Syst. Appl. Microbiol., в печати.

43. Пушева M.А., Деткова Е.Н., Болотина Н. П., Жилина Т. Н. Свойства периплазматической гидрогеназы экстремально-галофильной гомоацетат-ной бактерии Acetohalobium arabaticua. Микробиология, в печати

S