Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий

Деткова, Екатерина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий"

На правах рукописи

I I

'1 ДЕТКОВА Екатерина Николаевна

ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ И БИОЭНЕРГЕТИКА ГАЛОФИЛЬНЫХ

I И АЛКАЛОФИЛЬНЫХ АЦЕТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

I Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ , диссертации на соискание ученой степени

| кандидата биологических наук

I !

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук М.А. Пушева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.К. Плакунов

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова

Ведущая организация:

Институт биохимии им.Баха РАН

Защита диссертации состоится 8 декабря 2003 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук с

Л.Е. Никитин

1oo3'b

Актуальность темы. Ацетогенные бактерии представляют собой группу облигатных анаэробов, использующих ацетил-КоА-путь Вуда-Льюнгдала как механизм для восстановительного синтеза ацетата из СО2, для накопления энергии и синтеза клеточного углерода. Они присутствуют повсеместно в аноксических местах обитания, играя важную роль в глобальном цикле углерода. В настоящее время известно около 100 видов из следующих 18 родов [Drake et al., 2002]: Acetitomaculum, Acetobacterium, Acetohalobium, Acetonema, Butyribacterium, Caloramator, Clostridium, Eubacterium, Holophaga, Moorella, Natroniella, Oxobacter, Ruminococcus, Sporomusa, Syntrophococcus, Thermoacetogenium, Thermoanaerobacter, Treponema. Ацетогены - филогенетически очень разобщенная группа бактерий, которые различаются по морфологии, по наличию, форме и локализации спор, по подвижности и типу жгутикования, по физиологическим и биохимическим характеристикам. Они имеют высокий биотехнологический потенциал как продуценты уксусной кислоты при анаэробных ферментациях углеводов или при восстановлении оксидов углерода. Ацетогенные бактерии являются метаболически гибкими анаэробами, и способны к трансформации разнообразных органических субстратов, таких как углеводы, спирты, органические кислоты, ароматические соединения, а также к использованию Нг и СО2, что определяет их участие в различных микробных сообществах. В процессе гетеротрофного роста АТФ может синтезироваться в достаточных количествах на уровне субстратного фосфорилирования. При автотрофном росте синтез ацетата из СО2, когда Нг является донором электронов, должен быть сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хемиосмотическому механизму. Необходимым условием электрон-транспортного фосфорилирования является присутствие мембран-связанных переносчиков электронов и донорно-акцепторной системы, а также АТФ-синтазы.

К началу наших исследований у ряда ацетогенов были найдены цитохромы, менахиноны и Fe-S-бвлки [Gottwald et al., 1975; Yang et al., 1980; Elliott and Ljungdahl, 1982; Hugenholtz and Ljungdahl, 1989]. Показано, что ключевые ферменты ацетил-КоА-пути -гидрогеназа, СО-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза и формиатдегидрогеназа - являются мембран-связанными [Ljungdahl, 1994]. АТФ-синтаза FiFo-типа была подробно изучена у Moorella thermoacetica [Mayer et al., 1986]. Thermoanaerobacter kivtii, Ruminococcus productus и Acetobacterium woodii отличаются от других исследованных ацетогенов зависимостью от Na+ для метаболической активности [Geerligs et al., 1989; Heise et al., 1989; Yang and Drake, 1990]. Однако, физиология, биохимия и энергетический метаболизм ацетогенов из экстремальных мест обитания не изучены, поскольку такие местообитания до последнего времени не исследовались в достаточной степени на наличие процессов ацетогенеза и соответствующих микроорганизмов.

Исследование микробных сообществ из экстремальных мест обитания представляет большой интерес с естественно-научной точки зрения для понимания функционирования биосферы прошлого. В связи с этим в лаборатории микробных сообществ ИНМИ РАН было исследовано галофильное микробное сообщество из цианобактериальных матов лагун Арабатской стрелки, расположенных на восточном побережье озера Сиваш. В результате был выделен ряд первичных и вторичных анаэробов, участвующих в разложении органического вещества, среди которых - первый представитель галофильных ацетогенов Acetohalobium arabaticum, способен развиваться в области солености от 10 до 25 % [Жилина и Заварзин, 1990]. Изучение анаэробного пути деградации органических веществ в содовом озере Магади (Кения) привело к описанию ряда новых родов, вовлеченных, главным образом, в ацетогенез. В связи с этим представилась возможность для изучения ранее неисследовавшихся алкалофильных ацетогенов. Большой интерес представляет изучение механизмов адаптации микроорганизмов, и в том числе ацетогенов, к экстремальным условиям окружающей среды.

Цель и задачи работы. Целью работы было изучение особенностей физиологии,

биохимии и биоэнергетики ацетогенных бактерий мест обитания.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Описание первых облигатно галоалкалофильных ацетогенных бактерий Ыа1гоп1е11а acetigena и Ишгоптсо1а ЫзНсИптогат, выделенных из содового озера Магади.

а) определение внутриклеточных концентраций ионов Ка+, К+ и СГ у алкалофильных и галоалкалофильных ацетогенов.

б) исследование ключевых ферментов метаболизма ацетогенных бактерий и их способности функционировать в средах с высоким содержанием солей и при высоких значениях рН.

3. Исследование компонентов цепи переноса электронов у экстремально галофильной ацетогенной бактерии АсеЮка1оЫит агаЪайсит.

4. Изучение роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий при использовании различных энергетических субстратов.

Научная новизна. Проведено сравнительное изучение первых представителей ацетогенных бактерий из высокоминерализованных мест обитания. Исследованы и описаны галоалкалофильные ацетогенные бактерии из озера Магади, которые составили два новых рода и вида: ЫшготеИа асеН£епа gen.nov., вр.поу. является первым алкалофильным ацетогеном в порядке На1апаегоЫа1еБ; Ыа1гомпсо1а ЫзйсИпоуогат gen.nov., вр.поу. - первый алкалофильный представитель в кластере XI грамположительных бактерий с низким содержанием Г+Ц порядка Ооз^сМея. Получены балансовые уравнения разложения основных субстратов. Изучена экофизиология N. acetigena при различных значениях рН среды и различных сочетаниях №С1, КагСОз/ИаНСОз, которые характерны для содовых озер.

Обнаружены сходные стратегии адаптации к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей: накопление высоких внутриклеточных концентраций ионов и СГ у галоалкалофильной N. асеп^епа и умеренно алкалофильной галотолерантной ацетогенной бактерии ТггиШНа magadiensis, и способность всех исследованных ферментов экстремофильных ацетогенов функционировать в средах с высоким содержанием солей. Впервые обнаружена периплазматическая гидрогеназа у облигатно галофильной ацетогенной бактерии АсеюИаЫшт агаЬайсит и показано, что ее активность стимулируется в присутствии высоких концентраций КаС1 и КС1, вплоть до насыщающих.

Показано, что одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам является способность их ферментов функционировать при высоких значениях рН.

Впервые проведено сравнительное изучение роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме галофильных и алкалофильных ацетогенов. Ингибиторный анализ показал, что данные микроорганизмы используют разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза - электрон-транспортное или субстратное фосфорилирование, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют наши представления о разнообразии, функционировании и значении ацетогенов в природе. Галофильные и алкалофильные бактерии представляют интерес для биотехнологических исследований, связанных с применением солеустойчивых и устойчивых к высоким значениям рН ферментов.

Апробация работы. Отдельные материалы диссертации были представлены на 7-м Международном Симпозиуме по микробному росту на С|-соединениях (Уорвик, Великобритания, 1992), на 5-й конференции Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии" (Пущине, 1992), на 5-ой международной конференции "Молекулярная

биология гидрогеназ" (Альбертвилль, Франция, 1997), на международном симпозиуме "Водородный метаболизм азотрофных и анаэробных бактерий" (Умеа, Швеция, 1998), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), а также на конкурсах научных работ Института Микробиологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей, 4 тезиса, 1 статья находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов и списка < используемой литературы. Работа содержит 36 рисунков, 14 таблиц и 5 фотографий. Список

литературы содержит 175 публикаций.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Т.Н. Жилиной, к.б.н. В.В. Кевбрину, к.б.н. Л.Е. Дулову, к.б.н. Н.Д. Савельевой, д.х.н. Г.А. Осипову, к.б.н. * H.A. Кострикиной, к.б.н. A.M. Лысенко за помощь на определенных этапах работы. Особую

благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. М.А. Пушевой и заведующему лабораторией реликтовых микробных сообществ академику Г.А. Заварзину за предложенную тему, обсуждение результатов и общее научное руководство.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы, среды и условия культивирования. Чистые культуры анаэробной экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum Z-7288 и анаэробных алкалофильных ацетогенов - штаммы Z-7937T, Z-7939 и Z-79401 получены от д.б.н. Т.Н. Жилиной, а чистая культура анаэробной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Tindallia magadiensis Z-7934 - от к.б.н. B.B. Кевбрина, из коллекции лаборатории реликтовых микробных сообществ ИНМИ РАН.

Все среды для культивирования готовили по анаэробной методике. A. arabaticum культивировали на минеральной среде Пфеннига с 15% NaCl [Жилина и Заварзин, 1990]. Культуру выращивали в атмосфере Hi + СОг (80:20), СО + СО2 + N2 (30:20:50) или на триметиламине, лактате и формиате (0.5%) с газовой фазой, состоящей из смеси N2 + СОг (80:20). Штамм Z-7937T культивировали на лактате и этаноле, а штаммы Z-7939 и Z-7940T на гистидине (0.5%) при pH 9.7 на среде следующего состава (в г/л): КН2РО4 — 0,2; MgCl2x6H20 — 0,1; NH4CI — 1,0; KCl — 0,2; NaCl— 15,7; Na2C03 — 68,3; NaHCOj — 38,3; раствор микроэлементов по Липперту - 1 мл [Pfenning and Lippert, 1966]; 0.04% резазурин - 2 мл; раствор витаминов по Волину - 2 мл fWolin et al., 1963]; дрожжевой экстракт - 0,2. В качестве восстановителей использовали ИагЗхЭНгО - 1,0 г/л или тиогликолат Na - 1,0 г/л. При определении зависимости роста от концентрации NaCl все соли натрия замещали на соли калия в эквимолярном количестве. Т. magadiensis культивировали при pH 8,5 на минеральной среде по [Kevbrin et al., 1998]. В качестве субстратов использовали аргинин или пируват.

Определение роста. Рост культур определяли по оптической плотности при 600 нм на спектрофотометре "Specol - 10" (Германия). Экономический коэффициент (Y) рассчитывали по общему клеточному белку. Белок определяли по Лоури [Lowry et al., 1951]. Удельную скорость роста (р) рассчитывали на компьютере по программе FERMENT.BAS [Veiga and Gutierrez, 1991].

Аналитические определения. Ацетат, этанол и лактат определяли методом газоадсорбционной хроматографии на газовом хроматографе 3700 с пламенно-ионизационным детектором (Россия). Для определения лактата культуральную жидкость сначала подкисляли, а затем обрабатывали 15% иодной-кислотой [Teunissen et al., 19891. СО2 определяли на хроматографе Chrom-5 (Чехия) с катарометром. Водород определяли на хроматографе ЛХМ-80 с катарометром. Формиат определяли колориметрически с ацетамидом и уксусным ангидридом [Lang and Lang, 1972], гистидин определяли

колориметрически с сульфаниловой кислотой [Коренман, 1970]. Аммиак определяли диффузионным методом с использованием реактива Несслера. Цитохромы определяли спектрофотометрически при комнатной температуре. Дифференциальные спектры восстановленной дитионитом и окисленной Н2О2 мембранной фракции (10мг/мл белка) снимали в спектрофотометре SP-1800 (Pye-Unicum, USA), используя 1-см-кюветы. Для анализа хинонов клетки суспендировали в ацетоне и встряхивали 12 ч при 15°С. Желтый супернатант отфильтровывали через мембранный фильтр (45 мкм) и концентрировали в вакуумном испарителе. Остаток растворяли в н-гексане; гексановую фракцию экстрагировали водой, высушивали с Na2S04 и выпаривали. Остаток растворяли в этаноле и использовали для анализа в МР-598В Hewlett-Packard хроматомасс-спектрофотометре. ß

Фпавины выделяли аэробно [Farakas and Kokai, 1971] с использованием колоночной хроматографии на Sepharose CL-6B и тонкослойной хроматографии на Silperl-силикагеле с люминесцентным индикатором 366 для УФ (Чехия). Флавины идентифицировали методами абсорбционной спектрофотометрии на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) и 4

флуоресцентной спектрофотометрии на спектрофотометре MPF-2A (Hitachi).

Получение бесклеточных экстрактов и сферопластов. Бесклеточные экстракты получали разрушением клеток лизоцимом (5 мг/мл) или ультразвуком в УЗДН-1 при 0.4 мА. Разрушение клеток проводили в строго анаэробных условиях с использованием буферных растворов, приготовленных на освобожденной от кислорода воде и хранившихся под азотом. 250 мл каждой культуры на стадии экспоненциального роста осаждали центрифугированием при 5000 g. Осадки клеток суспендировали в 5 мл буфера Трис-HCl, содержащего 10 мМ формиата натрия, 25 мМ тиогликолат натрия, 25 мг лизоцима и 5 мкг ДНКазы. Суспензию инкубировали при 37°С в течение 12 ч. Разрушенные клетки центрифугировали при 5000g в течение 40 мин. Супернатант использовали для определения активностей ферментов.

Для получения сферопластов 250 мл культуры на стадии экспоненциального роста осаждали центрифугированием. Осадок клеток суспендировали в 3 мл смеси, содержащей 1 мл 20 мМ буфера HEPES pH 7,72, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ формиата натрия, 25 мМ тиогликолата натрия, 2 мл 1 М раствора сахарозы с 10 мМ MgCb и 50 мМ меркаптоэтанола. К смеси добавляли NaCI до конечной концентрации 15% и 2 мг/мл лизоцима. Суспензию инкубировали при 37°С в течение суток. Периплазматическую фракцию получали после центрифугирования сферопластов при 4000g при 4°С в течение 30 мин. После отделения «периплазмы» сферопласты подвергали лизису в 10 мл буфера 20 мМ HEPES pH 7,72 и последующему ультрацентрифугированию при 105 000g в течение 1 ч при 4°С. Получали две фракции — растворимую и мембранную.

Определение активности ферментов. Активности гидрогеназы и СО-дегидрогеназы определяли спектрофотометрически по восстановлению бензилвиологена водородом или СО, соответственно, при 37°С при 600 нм в регистрирующем спектрофотометре «Specord» (Германия) [Пушева и др., 1989; Пушева и Соколова, 1995]. Активность лактатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм по окислению НАДН в присутствии пирувата натрия [Bergmeyer, 1963]. Активность глутаматдегидрогеназы определяли аналогичным методом по окислению НАДН в присутствии щавелево-уксусной кислоты [Bergmeyer, 1963].

Определение внутриклеточных концентраций ионов Na*, К* и СГ. Концентрацию неорганических ионов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе 1С-1000 (Biotronik, ФРГ) с кондуктометрическим детектором. Определение хлорид-иона проводили в 2,5 мМ карбонатном буфере на разделительной колонке ВТХ An (4,6 мм х 100 мм) с суппрессорной колонкой ВТ S AG (6,6 мм х 150 мм). Скорость потока элюента - 1,5 мл/мин; объем вводимой пробы - 30 мкл. Определение иона натрия проводили в 0,8 мМ растворе азотной кислоты на разделительной колонке ВТ IV КА (3 мм х 100 мм) с суппрессорной колонкой ВТ S KG (6,6 мм х 150 мм). Скорость потока элюента - 1,5 мл/мин; объем вводимой пробы - 30 мкл. Внутриклеточный осмотический объем рассчитывали на основании геометрических размеров клеток [Fagerbakke et al„ 1999].

Фотометрические измерения светорассеивания клеток. Фотометрические измерения светорассеивания клеток N. acetigena и Natr. histidinovorans проводили по изменению оптической плотности культур в присутствии протонофоров в аэробных условиях на спектрофотометре Specol-10 (ФРГ) при 600 нм в течение 30—60 мин.

Метаболические ингибиторы - N,N - дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД) (Serva,ФРГ), ванадат (Реахим, Россия), моненсин, трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон (ФКЦФ) (Serva, ФРГ). 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиденил малонитрил (SF-6847), карбонил-цианид-га-хлорфенилгидразон (КЦХФ), амилорид (Serva,ФРГ) и родамин 6G (Реахим, Россия) добавляли в ростовую среду перед инокуляцией клеток. Все ингибиторы, за исключением ванадата, вносили в среду в виде этанольных растворов. Ванадат вносили в виде водного раствора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Описание Natroniella acetieena (штамм Z-79371) и Natronincola histidinovorans (штаммы Z-7939 и Z-79401).

Штаммы Z-7937' (=DSMZ 9952), Z-7939 и Z-7940T (=DSMZ 11416х) были выделены ранее д.б.н. Т.Н.Жилиной из осадка щелочного озера Магади (Кения).

1.1. Описание Natroniella acetigena.

Диагноз Natroniella gen. nov. Natroniella gen. nov. Na.tro.ni.ella. От латинского натрон - карбонат натрия NaíCOj - организм, растущий в содовых отложениях. Грамотрицательные спорообразующие палочки с перетрихальным типом жгутикования. Галоанаэроб, который выполняет гомоацетогенную ферментацию из ограниченного числа соединений. Экстремальный галоалкалофил. Низкое содержание Г+Ц в ДНК - 31,9 %. Относится к спорообразующей ветви порядка Halanaerobiales, семейства Halobacteroidaceae. Типовой вид Natroniella acetigena.

Диагноз Natroniella acetieena sp. nov. От латинского aceti - от уксусной кислоты и gena от genium - продуцирующий: организм, который продуцирует уксусную кислоту.

Грамотрицательные, спорообразующие палочки с закругленными концами 1-1,2 дм х 6-15 цм, подвижные за счет перетрихальных жгутиков. Спорообразование редкое. Для чистой культуры характерен быстрый и полный лизис. Хемоорганотрофный облигатный анаэроб, который сбраживает очень ограниченное число субстратов до уксусной кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода и энергии ограниченный набор соединений, такие как лактат, пируват, глутамат, этанол, пропанол. При росте на пропаноле такзке образуется пропионат. Дрожжевой экстракт и витамины стимулируют рост.

Экстремальный галоалкалофил. Облигатно нуждается в хлориде и карбонате натрия. Растет в высокоминерализованных хлорид-бикарбонатных средах при солености от 10 до 26% с оптимумом 12-15% общей солености и в области pH от 8,1 до 10,7 с оптимумом при pH 9,7-10,0. Мезофил с оптимумом для роста 37°С и максимумом 42°С. Содержание Г+Ц в ДНК 31,9%. Типовой штамм Z-7937T (=DSMZ 9952) выделен из донных осадков содового озера Магади (Кения).

Таблица 1. Характеристики роста N. acetigena на лактате и этаноле.

Субстрат р,, час"' Y, г белка/М ацетата Сацета-У страт

Лактат Этанол 0,15 0,08 Н.д. 0,46 1,44 1,53

Динамика роста N. асей%епа на лактате и этаноле показана на рис. 1,2.

10 20 30

время,час

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

лактат |

ацетат | ОП, 600 |

Рис. 1. Рост Ыа^отеНа acetigena на среде с лактатом.

0,07

0,06

0,05 0,04 с: .3 К н С к з я к

0,03 0,02 >1 О « с? 2 $ * к е п

0,01

О 10 20 30 40 50 60 70 время, час

0 10 20 30 40 время, час

Рис.2. Рост МШготеИа асейцепа на среде с этанолом. (А): 1-011,600; 2-С белка, мг/мл; (Б): 1-потребление этанола , 2-синтез ацетата.

Исходя из полученных данных были выведены следующие уравнения образования ацетата:

2 СН3СН(ОН)СОО* -> 3 СНзСОО' + Н+ (А) 2 СН3СН2ОН + 2 НСОз" -> 3 СНзСОО" + Н+ + 2Н20 (Б)

Экофизиология N. acetigena была изучена при различных значениях рН среды и различных соотношениях №0, №гСОз и ИаНСОз, которые характерны для содовых озер. Результаты представлены как некоторая область роста в координатах рН-№С1-щелочность (1Ма2С03/ №НС03) (рис.3).

Рис.3. Область роста N. acetigena в координатах pH-NaCl-щелочность (Alk.). Ряды на оси Alk соответствуют следующим значениям соотношений Na2C03/NaHC03 , г/л: 1, 0/95.4; 2, 30/78.6; 3, 60/61.8; 4, 90/45.1; 5, 120/28.3; 6, 150/11.5; 7,180/0.

На основании уникальных физиологических особенностей и особой филогенетической позиции штамма Z-7937T, он был выделен в новый род порядка Halanaerobiales и семейства Halobacteroidaceae - Natroniella, с типовым видом Natroniella acetigena и узаконен (VALIDATION LIST № 59. Int. J. Syst. Bacteriol. (1996) 46:1189-1190).

1.2. Описание Natronincola histidinovorans (штаммы Z-7939 и Z-7940T).

Диагноз Natronincola gen, nov. Natronincola ( Nat.ron.in.co.la.): natron-сода; incola-природный, аборигенный. Алкалофильные, облигатно анаэробные, осуществляющие брожение палочки с грамположительной структурой клеточной стенки. Протеолитическая бактерия. Использует аминокислоты. Продуктами обмена являются ацетат и аммоний. Член клостридиальной ветви анаэробных грамположительных эубактерий с низким содержанием Г+Ц порядка Clostridials и семейства Clostridiaceae. Типовой вид Natronincola histidinovorans.

Диагноз Natronincola histidinovorans sp. nov. Natronincola histidinovorans (his.ti.di.no.vo.rans): histidin-аминокислота; vora-есть быстро: использующий гистидин как главный субстрат. Клетки - палочки размером 0,7-1x2-6 цм, иногда образующие длинные нити. Подвижность обусловлена наличием перитрихально расположенных жгутиков. Размножение происходит делением, иногда с образованием конечных круглых мини-клеток. Штаммы олигоспсровый и иеспоровый; споры круглые и расположены на конце клетки,

Органотроф. Использует в качестве единственного источника углерода и энергии гистидин, глутамат, казаминовые кислоты, пептон. Штамм Z-7939 растет также на пирувате. Рост стимулируется в присутствии дрожжевого экстракта и витаминов. В отсутствии дрожжевого экстракта роста нет. Главным продуктом обмена является ацетат. Аммоний образуется в больших количествах.

Мезофил. Оптимальная температура для роста - 37°С, максимальная - 45°С.

Истинный алкалофил. Оптимум рН 9,4 с пределами 8,0-10,5. Умеренный галофил, растущий при солености не менее 4% NaCI и не более 16%, с оптимумом при 8-10%. Облигатно зависит от Na+ и СОз2" ионов. Оптимальная концентрация ЫаНСОз - 4-6%.

Содержание Г+Ц в ДНК штамма Z-7940 - 31,9 мол. %, а штамма Z-7939 — 32,3 мол. %. Месгообитание: осадки содовых озер.

Типовой штамм Z-7940T (=DSMZ 11416т) и штамм Z-7939 были выделены из высушенного цианобактериального мата озера Магади (Кения).

Таблица 2. Характеристики N. acetigena и Natr. histidinovorans.

Параметр N. асеП^епа г-7937т Ышг. histidinovorans 2.-7939 2-7940т

Размеры клеток (цм) 1-1,2 х 12-15 0,7-1x2-6

Подвижность перитрих перитрих

Споры олигоспоровый олигоспоровый неспоровый

Тип клеточной стенки Грам (-) Грам (+)

Оптимальная 37 (42) 37-40 (45)

температура,°С (макс.) (мезофил) (мезофил)

Область рН (оптимум) 8,1 - 10,7 (9,7-10,0) (апкалофил) 8,0 - 10,5 (9,4) (апкалофил)

ЫаС1, % (оптимум) 10-26(12-15) (экстремальный галофил) 4-16 (8-10) (умеренный галофил)

Отношение к Ыа+ без роста нет без Ыа+ роста нет

Отношение к Ог строгий анаэроб строгий анаэроб

Г+Ц в ДНК, мол. % 31,9 32,3 31,9

Субстраты:

Н2+С02 - -

со+со2+^ - -

Лактат + -

Пируват + +

Глутамат + +

Этанол + -

Пропанол + -

Гистидин - +

Казаминовые кислоты - +

Пептон - +

Конечные продукты ацетат (на пропаноле- ацетат и пропионат) ацетат и аммиак (следы формиата)

Таблица 3. Характеристики роста Natr. histidinovorans на гистидине.

Количество потребленного гистидина, ммоль/л Количества образовавшихся продуктов, ммоль/л СпрОДуКТ^СГисТИдИН

18,8 ацетат формиат аммиак ацетат формиат аммиак

43,7 7,0 59,2 2,32 0,37 3,15

Исходя из полученных данных было выведено следующее уравнение: 2Гистидин + 12Н20 = 5СН3СОО" + 2 НС03" + Н+ + 6NH4+ Динамика роста Natr. histidinovorans на гистидине показана на рис.4.

Согласно фенотипическим и филогенетическим характеристикам, было предложено описать штаммы Z-79401 и Z-7939 как новый род порядка Clostridiales и семейства Clostridiaceae - Natronincola с типовым видом Natronincola histidinovorans и узаконить (VALIDATION LIST № 68. Int. J. Syst. Bacterid. (1999) 49:1-3).

О 10 20 30 40 50 время, час

• ацетат ■ гистидин Л формиат -*-ОП, 600

Рис.4. Рост ИмготпсоЫ (¡¡¡И(Нпоуогап5 на среде с гистидином.

2. Стратегии адаптации галофильных и алкалофильиых ацетогенов к экстремальным условиям окружающей среды.

2.1. Изучение действия катионов и анионов на рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии Асе1ока1оЫит агаЬаНсит.

А. агаЬаНсит, принадлежащий к порядку На1апаегоЫа1с5 [Жилина и Заварзин, 1990], является экстремально галофильным организмом, так как растет в области солености от 10 до 25% ЫаС1 с оптимумом при 15 — 18%. А. агаЬаНсит способен к трем типам питания: хемолитотрофному, метилотрофному и органотрофному.

Общим свойством всех галофильных бактерий является их способность расти в присутствии высоких концентраций солей и необходимость №С1 для роста. Исследование специфической потребности в ионах и СГ , а также толерантности по отношению к другим солям является очень важным, поскольку, в большинстве случаев, для роста необходима минимальная концентрация требуется для генерации 1Ча+-градиента

через цитоплазматическую мембрану, а также для первичной дыхательной внешней натриевой помпы. Экстремальные галофилы не способны расти в среде, содержащей другие соли вместо №0, хотя, иногда КС1 и некоторые другие соли могут частично замещать №С1.

С целью изучения специфичности ЫаС1 для роста А. агаЬаНсит исследовали возможность роста в присутствии 2.05 — 2.56 М ЫаС1, 2.04 — 2.7 М КС1, 2.3-4.7 М ЫС1, 1.95 М 1^28 04 и при их сочетаниях с различным содержанием №С1 в среде. Культура не растет при 1.54 М (9%) №С1.

Организм специфически зависит от ионов натрия. Ионы калия и лития, уравненные по молярному содержанию, не заменяют натрий. Рост полностью отсутс!Вовал, когда среда содержала только соли лития или калия. 1^2304 может частично заменять ЫаС1, если в среде присутствует не менее 1.54 М К'аСЛ и 0.4 М ЫгЗОд. Хлоридный ион имеет преимущество перед сульфатом для роста организма. Данные табл. 4 показывают, что только в присутствии не менее чем 1.54 М КаС1 добавление №1ЯО,| может поддерживать рост.

Таким образом, показано, что минимальное количество №С1, необходимое для роста А. агаЬаНсит снижается с 1.71 М (10 %) в обычной комплексной среде [Жилина и Заварзин, 1990] до 1.54 М (9%) в присутствии 0.4 М Ц23 04.

Таблица 4. Влияние солей натрия, калия и лития на рост А. агаЬаНсит на среде с

лактатом.

Соли Концентрация, М ОПбоо

ИаС1 2.56 0.16

№С1 2.05 0.15

N32804 1.30 0.01

КС1 2.70 0.01

КС1 2.04 0.01

1лС1 4.70 0.01

1лС1 3.50 0.01

1лС1 2.30 0.01

1л2804 1.95 0.01

№С1 + 1л2804 1.54 + 0.4 0.06

№С1 + 1л2804 1.0 + 0.93 0.01

№С1 + и2804 0.5 + 1.4 0.01

№С1 + N32804 1.54 + 0.52 0.13

№С1 + №2804 1.0+1.0 0.01

N80 + N3,504 0.77 + 1.3 0.01

2.2. Определение внутриклеточных концентраций ионов N8*, К+ и СГ у Ыа1гоп1е11а асе^епа и ТтйаШа тадсиИеп$1$.

Внутри микробного мира существуют две фундаментально различные стратегии адаптации к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей: 1) клетки могут поддерживать высокие внутриклеточные концентрации солей, осмотически эквивалентные внешним концентрациям (стратегия - "соль внутри"). При этом все внутриклеточные системы должны быть адаптированы к присутствию высоких концентраций солей; 2) клетки могут активно исключать соли и поддерживать их низкие концентрации в цитоплазме. Осмотическое давление среды сбалансировано за счет небольших органических молекул - осморегуляторов (стратегия - "совместимые осморегуляторы"), которые либо синтезируются внутри клетки, либо проникают в клетку из внешней среды. При этом внутриклеточные системы не нуждаются в специальной адаптации. Цель данной работы - оценить, какие физиологические механизмы используют ацетогены, выделенные из высокоминерализованных мест обитания, для адаптации к высокой концентрации соли.

Были определёны внутриклеточные и внеклеточные концентрации ионов К+ и СГ у двух ацетогенных микроорганизмов - N. acetigena и Т. та$аШеп.ш, в зависимости от концентрации №С1 в среде (таблица 5).

Из таблицы 5 видно, что внутриклеточные концентрации ионов и СГ у N. acetigena зависели от концентрации №С1 в среде. Они возрастали от 0,91 М до 1,98 М и от 0,37 М до 0,89 М, соответственно, при увеличении концентрации №С1 в среде от 0,27 М (1,57 %) до 0,95 М (5,57 %). Внутриклеточная концентрация №+ у Т. та£асИет1х возрастала от 0,36 М до 0,62 М. Концентрация СГ в клетках, выросших на среде без №С1, составляла 0,035 М и возрастала до 0,74 М в присутствии 0,68 М (4 %) ЫаС1 в среде. Хотя Т. magadiensis, в отличие от N. acetigena, и накапливала ионы К+ внутри клеток до концентраций значительно превышающих их содержание в среде, внутриклеточная концентрация К+ у обеих бактерий была относительно низкой и практически не зависела от внешней концентрации №С1.

Таким образом, показано, что изученные анаэробные эубактерии - экстремально галоалкалофильная N. acetigena и умеренно алкалофильная галотолерантная Т. magadiensis, поддерживают высокие внутриклеточные концентрации ионов и СГ, которые возрастают при увеличении количества №С1 в среде, что позволяет этим организмам сбалансировать

внутреннее осмотическое давление с внешней высокоминерализованной окружающей средой.

Таблица 5. Внутриклеточные и внеклеточные концентрации К+ и С1" у N. асе^епа

Микроорганизм и условия культивирования Na+ вне (М) Na+ внутр. (М) Г вне (М) г внутр. (М) СГ вне (М) СГ внутр. (М)

N. acetigena

0,27 MNaCl (1,57%) 1,37 М [Na+] обший 1,54 0,91 0,003 0,004 0,26 0,37

N. acetigena

0,95 М NaCl (5,57 %) 2,05 М [Na+] „вшив 2,03 1,98 0,003 0,015 0,93 0,89

Т. magadiensis

Без NaCl, 0,48 М [Na+] „6ЩИЙ 0,45 0,36 0,001 0,047 0,034 0,035

Т. magadiensis

0,68 М NaCl (4 %) 1,16 М [Na+] обЩИЙ 1,02 0,62 0,001 0,031 0,72 0,74

Примечание. Вне - концентрация иона в супернатанте после осаждения клеток, внутр,-внутриклеточная концентрация иона.

Поскольку ионы и СГ накапливались в клетках, было изучено влияние некоторых солей на активность ключевых ферментов пути синтеза ацетата у галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий (путь Вуда-Льюнгдала) - гидрогеназу и СО-дегидрогеназу.

2.3. Влияние солей на активность ключевых ферментов метаболизма галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий.

Присутствие высоких внутриклеточных концентраций солей требует дополнительной адаптации всей ферментативной системы. В клетках, использующих эту стратегию для осмотической адаптации, все ферменты и структурные клеточные компоненты приспосабливаются к присутствию высоких концентраций солей, чтобы обеспечить должное функционирование внутриклеточного ферментативного аппарата.

2.3.1. Свойства гидрогеназы экстремально галофильной ацетогенной бактерии Асе1о1ш1оЫит агаЬайсит.

Была исследована активность гидрогеназы с бензилвиологеном в качестве переносчика электронов в целых клетках, периплазме, растворимой фракции и в мембранах А. агаЬаНсит (таблица 6).

На основании данных по клеточному фракционированию показано, что у А. агаЬайсит содержится наряду с растворимым цитоплазматическим ферментом, свойственным ацетогенным бактериям, периплазматическая гидрогеназа. Наличие периплазматической гидрогеназы у А. агаЬайсит может свидетельствовать о специфической адаптации этого организма к низким уровням растворенного водорода в гиперсоленых водоемах. Об этом свидетельствует и высокая активность фермента (0,56 Е), полученная для целых клеток (таблица 6).

Таблица 6. Распределение гидрогеназной активности в клетках А. arabaticum

Общая активность, Удельная активность,

Клеточная фракция мкмоль/мин Активность, % мкмоль/(мин- мг)

Целые клетки _ — 0,56

Суспензия сферопластов — 100 _

Периплазма 0,97-1,63 31-35 0,15

Лизированные сферопласты 2,17-2,99 65-69 0,88

Цитоплазма 1,57-2,41 50-52 1,4-1,9

Мембраны 0,22-0,35 5-10 0,3-0,64

Активности гидрогеназы, а также внутриклеточных катаболитных ферментов - СО-дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы А. arabaticum измеряли в буферных смесях с высокими концентрациями солей — NaCl, KCl, LiCl.

Периплазматическая гидрогеназа была не только стабильна в концентрированных растворах солей, но и стимулировалась этими концентрациями вплоть до насыщающих (рис.5).

Е, %

100 SO 60 40 20

Рис.5. Зависимость активности

периплазматической гидрогеназы А. arabaticum от NaCl (1), KCl (2), LiCl (3).

с,м

Характер зависимости фермента от ЫаС1 и КС1 был одинаков. За 100% приняты максимальные активности, составляющие для №С1 1,9 Е, для КС1 2,2 Е и для 1лС1 0,9 Е. Активность гидрогеназы увеличивалась пропорционально концентрациям солей и достигала 5-кратного уровня при 4,5 М №С1 и 3-кратного уровня при 3,54 М КС1. Хлориды калия и натрия оказывали специфическое действие на фермент, тогда как хлорид лития оказывал незначительное стимулирующее влияние до 1 М, по-видимому, в результате увеличения ионной силы раствора, после чего наблюдалось ингибирование реакции.

Известно, что многие галофилы требуют для оптимального роста двухвалентные катионы и Мп2+ [Ьапуь 1974]. Активность гидрогеназы А. агаЬаНсит стимулировалась в присутствии от 20 до 160 мМ М§2+, при дальнейшем увеличении концентрации магния скорость реакции снижалась. Для Мп2+ оптимальная концентрация составляла 30-50 мМ. Ре2+ оказывал активирующее действие на гидрогеназу в широкой области оптимальных значений от 10 до 70 мкМ. Влияние ионов двухвалентных металлов объясняется их стабилизирующим действием на структуру белков галофилов.

Для сравнительного изучения действия солей на ферменты А. агаЬайсит исследованы активности внутриклеточных катаболитных ферментов — СО-дегидрогеназы, глутамат- и лактатдегидрогеназы в зависимости от №С1. Максимальная активность СО-дегидро1 еназы наблюдалась при 1 М ЫаС1. При дальнейшем увеличении концентрации соли происходило незначительное ингибирование активности фермента (рис. 6).

АКТИВНОСТЬ,

100 ■ 80 60 40 -

_I_I_I-1_и

. 0 12 3 4

I N>01, М

^ Установлено увеличение активности глутаматдегидрогеназы на 52% при 1,7 М соли и

активности лактатдегидрогеназы на 58% в присутствии 5,2 М ЫаС1. Таким образом, активности внутриклеточных ферментов, так же как и периплазматического фермента, зависят от насыщающих концентраций солей натрия и калия.

Таким образом, впервые исследованные периплазматическая гидрогеназа и внутриклеточные катаболитные ферменты облигатно-галофильной бактерии А. агаЬаЧсит, отличаются устойчивостью к высоким концентрациям солей, что отражает экстремальную галофилию самого организма.

2.3.2. Влияние солей на активности СО-дегидрогеназ (СО-ДГ) N. acetigena и /ш/ййиоуогаля.

Обе культуры ацетогенных бактерий обладали высокой активностью СО-ДГ в бесклеточных экстрактах. Фермент N. асе^епа был активен в области концентраций от 0 до 4,1 М №С1 с оптимумом при 0,7 М ИаО (15,8 Е в отсутствии соли и 20 Е при 0,7 М КаС1). В присутствии 0,7 М №С1 происходила стимуляция активности СО-дегидрогеназы на 20 %. При изменении концентрации соли от 3,5 М и выше активность фермента снижалась (рис.7). №С1 практически не влиял на активность СО-ДГ Ыа1г. Ы.ч1'кИптогап$ в области концентраций от 0 до 4,1 М (около 1,5 Е) (рис.7). Активность СО-дегидрогеназы N. асе^епа была постсЙнной в присутствии от 0 до 0,7 М ШНС03 (12 Е), а затем несколько снижалась (рис.8). ИаНСОз ингибировал активность СО-ДГ Ышг. ЫзНсИпоуогапз на 40 % при изменении концентрации от 0 до 1,2 М (снижение активности от 1,8 Е до 1,1 Е) (рис.8).

2.3.3. Свойства гидрогеназы и СО-дегидрогеназы галотолерантной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Т. та£шНеп$1$.

Т. та$асИе№1$ обладала высокими активностями СО-дегидрогеназы и гидрогеназы, катализирующей выделение Нг, в бесклеточных экстрактах.

' СО-дегидрогеназа Т. magadiensis угнеталась в присутствии №С1. При увеличении

' концентрации соли от 0 до 4,3 М активность фермента снижалась, более, чем на 50 % (от

^ 1,16 Е до 0,48 Е), что может объясняться влиянием ионной силы раствора (рис.9).

Гидрогеназа Т. magadiensis также ингибировалась в присутствии №С1. При увеличении концентрации соли от 0 до 4,3 М активность фермента снижалась от 0,26 Е до 0,1 Е (ингибирование активности на 60 %) (рис.9). СО-ДГ имела максимальную активность в присутствии 0,25 М №НСОз (стимуляция более, чем на 30 %, активность выросла от 0,89 Е до 1,3 Е), после чего наблюдалось небольшое ингибирование (рис.10). Уровень активности гидрогеназы Т. magadiensis оставался примерно постоянным в области концентраций N811003 от 0 до 1,2 М (рис.10).

Как оказалось, все исследованные ферменты галофильных и алкалофильных ацетогенов толерантны к присутствию высоких концентраций солей. Свойства этих ферментов представлены в таблице 7.

Рис.6. Влияние №С1 Асем1га1оЫит агаЬайсит.

на СО-дегидрогеназу

40 20 0

• N. асеН§епа

* ИаЬ-. ЫБй&поуогага

0 1 2 3 4 5 №С1, М

Рис.7. Зависимость активностей СО-дегидрогеназ N. асе^епа и Л'а/г. Ызпётоуогапй от концентрации ЫаС1.

- СО-дегидрогеназа "гидрогеназа

Рис.9. Зависимость активностей СО-дегидрогеназы и гидрогеназы Т magadlensls от концентрации ЫаС1.

т '-ш

О 0,2 0,4 0,6 0,8 ЫаНСОз, М

-N. acetigena -Natr. histidmovorans

Рис.8. Зависимость активностей СО-дегидрогеназ N. acetigena и Natr. htstidinovorans от концентрации NaHC03.

ЫаНСОЗ, М

Рис.10. Зависимость активностей СО-дегидрогеназы и гидрогеназы Т. magadiensis от концентрации NaHC03.

Таблица 7. Ферменты галофильных и алкапофильных ацетогенов.

Микроорганизм Фермент Область активности Оптимальная концентрация

Acetohalobium arabaticum Z-7288 Гидрогеназа 0 - 4.8 М NaCl, LiCl 0 - 3.6 KCl насыщающая ЫаС1, КС1 1 м иа

СО-дегидрогеназа 0 - 4.8 М NaCl 1 М N301

Natroniella acetigena Z-7937 СО-дегидрогеназа 0-4.1 MNaCl 0 - 0.95 M NaHC03 0.7 М №С1 0 - 0.7 М NaHC03

Natronincola histidinovorans Z-7940 СО-дегидрогеназа 0-4.1 M NaCl 0- 1.2MNaHCOj 0-4.1 М N301 без №НСОз

Tindallia magadiensis Z-7934 Гидрогеназа 0 - 4.3 M NaCl 0- 1.2MNaHC03 без ИаС1 0.24 М N811003

СО-дегидрогеназа 0 - 4.3 M NaCl 0 - 1.2 M NaHC03 без №С1 0.25 М ШНСОз

Результаты, полученные в пп. 2.2 и 2.3, согласуются с основной гипотезой о том, что галоанаэробы и некоторые другие представители галофильных анаэробных эубактерий физиологически адаптированы к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей, в результате адаптации ферментов, которые функционируют при высокой внутриклеточной концентрации соли [Oren, 1999].

2.4. Влияние рН на активность ключевых ферментов алкалофильных ацетогенов.

Активности СО-дегидрогеназ N. acetigena, Natr. histidinovorans и Т. magadiensis и активность гидрогеназы Т. magadiensis измеряли в буферных смесях с различными значениями рН (от 5 до 12). У N. acetigena максимальная активность СО-ДГ в бесклеточном экстракте наблюдалась при рН 9.0 с пределами от 6.0 до 12.0 (рис.11), что несколько ниже рН-оптимума для роста у этой бактерии. Активность фермента возрастала в 4 раза при 1 увеличении рН от 7.0 до 9.0. Оптимальная активность СО-ДГ Natr. histidinovorans наблюдалась при рН 9.5 с пределами от 6.5 до 10.5 (рис.11), что совпадало с рН-оптимумом роста. При увеличении рН от 7.0 до 9.0 активность возрастала в 5 раз. Максимальные активности, как СО-дегидрогеназы, так и гидрогеназы в бесклеточном экстракте Т. i magadiensis наблюдались при рН 10.05 (рис.11), что выше рН-оптимума для роста этой бактерии. Однако, пределы активности ферментов в щелочной области несколько отличались. Для СО-дегидрогеназы он наблюдался при рН 11.5, тогда как для гидрогеназы он был несколько выше и наблюдался при рН 12.

Показано, что изученные ферменты алкалофильных ацетогенов крайне устойчивы к высоким значениям рН, подобно ферментам из других алкалофильных микроорганизмов [Horikoshi, 1999]. Таким образом, можно заключить, что одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам является способность их ферментов функционировать при высоких значениях рН.

1,6

1 I

О -I-*-*-*-!-,-1 ,

5 7 9 11 13

рн

Рис. 11. Влияние рН на активность ключевых ферментов алкалофильных ацетогенов.

СО-дегидрогеназа N. асе1щепа

Гидрогеназа Т. гпа^нНет^

СО-дегидрогеназа Т. пшgadiensls

СО-дегидрогеназа N3(1. [шЫтогогаш

3. Сравнительное изучение энергетического метаболизма галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий.

Ацетогенные бактерии используют большое разнообразие субстратов в качестве источников энергии, и вероятно, обладают различными механизмами запасания энергии в ходе ацетогенеза. Фосфорилирование на уровне субстрата играет важную роль в процессе органотрофного роста. В ходе ацетогенеза из Н2+СО2 синтеза АТФ на уровне субстрата не происходит. Это вызывает вопрос о дополнительных механизмах синтеза АТФ в этих условиях [Циг^аЫ, 1994]. Синтез ацетата из СОг, когда Н2 является донором электронов, должен быть сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хемиосмотическому механизму. Необходимым условием электрон-транспортного фосфорилирования является присутствие мембран-связанных переносчиков электронов и донорно-акцепторной системы, а также АТФ-синтазы.

3.1. Исследование компонентов цепи переноса электронов у А. агаЬайсит.

Мембранная и растворимая клеточные фракции А. агаЬаИсит были исследованы на наличие цитохромов. При спектрофотометрическом определении дифференциальных спектров (восстановленный минус окисленный) образцов клеток и мембран цитохромы не были обнаружены. При использовании стандартной методики определения в клетках бактерии также не были найдены хиноны. Отсутствие хинонов было подтверждено $

хроматомасс-спектрометрическим анализом.

В клетках А. агаЬаИсит были идентифицированы флавопротеины. Флавин был изолирован из лизированных сферопластов А. агаЬаИсит после депротеинизации с ^

применением колоночной хроматографии на ЗерЬагозе СЬ-6В и тонкослойной хроматографии на силикагеле. Флавин растворим в воде, имеет два максимума поглощения при 447 нм и при 365 нм. Он обладает интенсивной зелено-желтой флуоресценцией. В спектре возбуждения флуоресценции обнаружено три максимума — при 280, 370 и 448 нм. В спектре эмиссии флуоресценции водного раствора флавина имеется максимум при 524 нм. При добавлении дитионита наблюдалось полное гашение флуоресценции, характерное для флавинов. Идентификацию флавина проводили тонкослойной хроматографией на силикагеле Э^рег!. По значениям в различных системах растворителей и рН-зависимостям он отличался от ФАД, ФМН, рибофлавина и люмифлавина. Изолированный флавин очень фотолабилен и неустойчив даже при хранении в темноте в растворах при рН 2—3. ,

Максимальная флуоресценция флавина из А. агаЬаИсит наблюдалась при рН 3,0—3,5. '

Как показал флуоресцентный анализ бесклеточных экстрактов A. arabaticum, данный микроорганизм содержит фолаты с максимумом флуоресценции 450 нм при возбуждении лучами с длинами волн 260-280 нм и 340-360 нм.

Методом флуоресцентного анализа, в бесклеточных препаратах A. arabaticum были также идентифицированы корриноидные соединения с максимумом флуоресценции при 580 нм (XBO,6.= 510-530 нм). Корриноиды являются одними из главных кофакторов ацетогенных бактерий, участвуя в ряде окислительно-восстановительных реакций и в образовании -С-С-связи при синтезе ацетата через ацетил-КоА-путь фиксации углекислоты. При исследовании биосинтеза корриноидов и их предшественников у A. arabaticum показано, что в клетках | содержится фактор III - гетероциклический нуклеотидсодержащий корриноид. Обнаружены

также внеклеточные корриноиды - уропорфирин I и метилированные производные уропорфирина. Наибольшее накопление корриноидов наблюдалось на среде с ( триметиламином. Таким образом, А. arabaticum не содержит цитохромов и хинонов и

синтезирует корриноиды на всех испытанных субстратах. Поэтому этот организм можно отнести ко второй группе ацетогенов (с A. woodii и R. productus как модельными организмами) в отношении их энергетики [Müller and Gottschalk, 1994].

3.2. Биоэнергетические аспекты ацетогенеза из разных субстратов у экстремально галофильной ацетогенной бактерии А. arabaticum.

А. arabaticum использует для роста довольно узкий спектр энергетических субстратов, таких как водород, формиат, лактат, аспартат, гистидин, бетаин, триметиламин и некоторые другие. Изучение энергетического обмена этой бактерии позволило установить, что А. arabaticum может использовать разные механизмы запасания энергии при ацетогенезе в зависимости от энергетического субстрата.

С целью изучения роли АТФазы и Ка+/Н+-антипорта был проведен ингибиторный анализ у литотрофно, метилотрофно и гетеротрофно растущего А. arabaticum. В таблице 8 представлены данные по влиянию ДЦКД, моненсина и ванадата на рост и образование ацетата при использовании бактерией различных энергетических субстратов - Н2+СО2, CO+CO2+N2, триметиламина, формиата и лактата. Рост и ацетогенез А. arabaticum при культивировании на Н2+СО2 частично ингибировался ДЦКД - ингибитором FiFo-АТФазы, в концентрации 700 мкМ (более, чем на 5D %). Причем, в этих условиях наблюдалась задержка роста на 4-5 суток за счет начального ингибирующего действия ДЦКД.

Культуры, растущие на СО+СОг, были не чувствительны к 700 мкМ ДЦКД. При увеличении концентрации ДЦКД до 1400 мкМ, рост и ацетогенез на Н2+СО2 и на СО+СО2 полностью угнетался.

Таблица 8. Влияние метаболических ингибиторов на рост и ацетогенез при

автотрофии, метилотрофии и гетеротрофии А. arabaticum.

Ингибитор, мкМ Субстраты роста

н2 формиат лактат ТМА со/со2

рост/ацетат рост/ацетат рост/ацетат рост/ацетат роста/ацетать

Контроль 0,05 12,8 0,07 12,2 0,176 60,0 0,091 31,6 0,052 5,3

ДЦКД (700) 0,02" 5,7 0,06 12,4 0,171 56,2 0,048 25,0 0,062в 8,2

ДЦКД (1400) 0,006 2,6 н.д. н.д. 0,171 54,4 н.д. Н.Д. 0,006 1,4

Ванадат (50) 0,044 10,6 0,065 11,3 н.д. н.д. 0,094 32,8 0,05 5,1

Моненсин (14) 0,002 1,7 0,002 1,6 0,005 1,1 0,001 0,9 0,005 1,5

Обозначения.а - ОП^оо; - мМ;в - данные после 4-дневного периода задержки роста.

Рост и ацетогенез у культур, использующих формиат и лактат, не чувствительны к 700 мкМ ДЦКД. ДЦКД не препятствовал росту и ацетогенезу культуры, использующей

триметиламин как энергетический субстрат. Однако, на триметиламине при почти двухкратном снижении биомассы количество образованного ацетата изменялось |

незначительно; таким образом при росте на триметиламине в присутствии ДЦКД наблюдалось разобщение роста и ацетогенеза. Полученные результаты по эффекту ДЦКД на Л. arabaticum позволяют предполагать, что окисление Нг и СО у этой бактерии сопряжено с генерацией АТФ через электрон-транспортное фосфорилирование по хемиосмотическому механизму в ходе ацетогенеза при участии АТФ-синтазы. О том, что этот фермент, вероятно, FiFo-типа, свидетельствуют результаты по отсутствию эффекта ванадата, ингибитора Е1Е2- |

АТФазы, на рост и ацетогенез A. arabaticum, что согласуется с данными, полученными для '

других ацетогенов - A. woodii, М. thermoacetica и М. thermoautotrophica [Ljungdahl, 1994; I

Müller and Gottschalk, 1994]. Рост и ацетогенез А. arabaticum на всех субстратах ^ чувствителен к моненсину, искусственному Na+/H+-aiiTHnopTepy и ингибитору ApNa и ДрН, и для него необходим №+-потенциал, устанавливаемый за счет Ыа+/Н+-антипорта. Такой обмен катионов широко распространен среди бактерий и был установлен для '

ацетогенов М. thermoacetica и А. woodii [Müller and Gottschalk, 1994]. Использование А. 1

arabaticum всех испытанных субстратов зависит от ApNa и ДрН. Ингибиторный анализ показал, что А. arabaticum использует разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

3.3. Биоэнергетика ацетогенеза алкалофильных ацетогенных бактерий N. acetigena, Natr. histidinovorans и Т. magadiensis.

Представители новых родов алкалофильных ацетогенных бактерий N. acetigena, Natr. histidinovorans и Т. magadiensis осуществляют ацетогенез в содовых озерах. Вопрос состоит в том, каким образом обеспечивается энергетический обмен ацетогенных бактерий при экстремально высоком содержании Na+ в среде и щелочных pH. Сочетание ацетогенеза и алкалофилии представляет большой интерес с точки зрения энергетических проблем, связанных с ростом организмов при pH более 9 и, соответственно, низкой концентрации протонов в среде.

В таблице 9 представлены данные по влиянию ингибитора FjFo-АТФазы - ДЦКД, моненсина и ванадата на рост и образование ацетата N. acetigena при использовании этанола или лактата и Natr. histidinovorans, растущей на гистидине. Рост и ацетогенез обеих бактерий полностью подавлялись ДЦКД в концентрации 700 мкМ. Полученные результаты позволяют предполагать, что окисление энергетических субстратов N. acetigena и Natr. histidinovoran<: сопряжено с генерацией АТФ через электрон-транспортное фосфорилирование по хемиосмотическому механизму при участии АТФазы. Отсутствие эффекта ванадата -ингибитора Е|Е2-АТФазы - на N. acetigena свидетельствует о том, что организм, вероятно, ^

содержит фермент FiFo-типа. Частичное подавление ванадатом роста и ацетогенеза Natr. '

histidinovorans может свидетельствовать о том, что культура содержит фермент как F1F0-типа, так и Е|Е2-типа.

Рост и ацетогенез N. acetigena на обоих субстратах подавлялся моненсином, л

искусственным №+/Н+-антипортером и ингибитором ApNa и ДрН. Рост и ацетогенез Natr. histidinovorans Z-7939 чувствителен к моненсину в концентрации 14мкМ. Однако моненсин не препятствовал росту и ацетогенезу Natr. histidinovorans Z-7940, которые начинались после двухнедельной задержки за счет начального ингибирующего действия антибиотика. В этом случае при двухкратном снижении биомассы количество образованного ацетата уменьшалось лишь на 25% по сравнению с контролем; таким образом при росте Z-7940 на гистидине в присутствии моненсина наблюдалось разобщение роста и ацетогенеза.

Для выяснения ионной специфичности АТФазы у N. acetigena использовали родамин 6G, способный в концентрации 3 мкМ подавлять ДрН-зависимый синтез АТФ в митохондриях и у Methanobacterium thermoautotrophicum, при этом не воздействуя на

Др№+-зависимый синтез АТФ. Местом действия родамина 6С в митохондриях является Бо-часть АТФазы. Родамин 6в (3.4 мкМ) добавляли в 20-часовую культуру N. асе^епа на среде с этанолом, что приводило к остановке роста и синтеза ацетата. Полученные данные указывают на то, что у N. асе^епа эффективно действует протонтранслоцирующая АТФаза, что также было подтверждено наличием Независимого синтеза АТФ у этого организма [Питрюк и др., 2001].

Таблица 9. Влияние метаболических ингибиторов на рост и ацетогенез N. асе^епа и

Шгг. ЫхИсИпоуогат.

Ингибитор, Микроорганизм и субстрат роста

мкМ N. acetigena N. acetigena Natr. Natr.

Z-7937 Z-7937 histidinovorans histidinovorans

лактат этанол Z-7939 Z-7940

гистидин гистидин

рост/ацетат рост/ацетат рост/ацетат рост'/ацетат0

Контроль 0,041 64 0,101 90,7 0,138 39,4 0,128 40,9

ДЦКД (700) 0,008 2,0 0,004 1,6 0,01 2,1 0,008 1,9

Ванадат (50) 0,042 65,6 0,095 92,9 0,089 18,7 0,094 20,6

Моненсин (14) 0,008 1,8 0,007 1,7 0,01 2,0 0,056° 29,2

Обозначения.* - ОПбоо; - мМ;' - данные после 2-недельного периода задержки роста.

Фотометрические измерения светорассеивания покоящихся клеток N. acetigena показали, что сразу после добавления протонофоров ФСЦФ (100 мкМ) или SF-6847 (3.2 мкМ) наблюдается первоначальное колебание оптической плотности за счет внесения этанольного раствора ингибитора. Через 50 с. воздействия протонофоров светорассеивание быстро снижается, и через 35—50 мин наступает лизис (рис.12А). В контроле без добавления протонофоров оптических изменений в течение этого периода не наблюдалось. В отличие от N. acetigena, изменений светорассеивания клеточных суспензий Natr. histidinovorans в присутствии разобщителей— ФКЦФ (100 мкМ) или КЦХФ (100 мкМ) — не наблюдалось (рис. 12Б), что обусловлено, по-видимому, спецификой строения этой грамположительной бактерии.

20 30

ВРЕМЯ, МИН

20 30 40 ВРЕМЯ, МИН

Рис.12. Изменения оптической плотности клеточных суспензий N. асе^епа (А) и N. hisdidinovorans (Б) в присутствии протонофоров: 1,3 - ФСЦФ (100 мкМ), 2 - 8И-6847 (3,2 мкМ), 4 - КЦХФ (100 мкМ). Стрелкой указано время внесения ингибиторов.

Полученные данные с грамотрицательной N. асеИ$епа свидетельствуют о том, что при деэнергизации клеток протонофорами снимается осмотический барьер цитоплазматической

мембраны в результате подавления Ка+/Н+-антипорта, и Na+ из среды поступает внутрь клеток, приводя их к лизису. Ацетогенез прекращается вследствие гибели культуры. Таким образом, стратегия приспособления N. acetigena к экстремальным условиям обусловлена непрерывными энергетическими затратами на поддержание целостности клетки.

Таким образом, два организма продемонстрировали существенно различные способы приспособления к экстремальным условиям среды. Галоанаэроб N. acetigena относится к самостоятельной филогенетической ветви порядка Halanaerobiales, и его приспособление к щелочной среде основано на активном энергетическом механизме. Его можно рассматривать как галофила, приспособившегося к щелочной среде. Напротив, представитель иной филогенетической ветви "клостридиев с низким Г+Ц", Natr. hisdidinovorans, оказался истинным алкалофилом, не претерпевающим дезинтеграции при блокировании энергетических процессов.

С целью установления роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме исследовано действие метаболических ингибиторов и ионофоров на умеренно алкалофильную ацетогенную бактерию Tindallia magadiensis, растущую на средах с различными акцепторами электронов.

В таблице 10 представлены данные по влиянию ингибиторов и ионофоров, внесенных сразу после засева культуры, на конечный выход биомассы и ацетогенез Т. magadiensis при росте на аргинине и пирувате, пути использования которых как энергетических субстратов сильно различаются.

Рост и ацетогенез Т. magadiensis при культивировании на аргинине практически полностью угнетался 500 мкМ ДЦКД. Использование аргинина в качестве субстрата предполагает его участие в орнитиновом цикле и его последующее превращение в карбамилфосфат с образованием СО2 и NH3 за счет карбамат киназы. Последняя реакция связана с образованием АТФ из АДФ и Ф„ при участии F1F0 - АТФ - синтазы [Driessen and Konings, 1990]. СО2 затем включается в ацетил-КоА путь с образованием ацетата как конечного продукта. Полученные результаты по эффекту ДЦКД на Т. magadiensis позволяют предполагать, что окисление аргинина у этой бактерии сопряжено с генерацией АТФ через электрон-транспортное фосфорилирование по хемиосмотическому механизму в ходе ацетогенеза при участии АТФ-синтазы.

Таблица 10. Влияние ингибиторов и ионофоров на рост и синтез ацетата Т. magadiensis.

Ингибитор, мкМ Используемый субстрат

арп НИН пируват

роста/ацетат6 рост/ацетат

Контроль 0.115 19.6 0.120 30.15

ДЦКД (500) 0.025 7.32 0.114 22.0

Ванадат (50) 0.110 20.3 0.115 32.4

Моненсин (10) 0.005 2.0 0.005 2.48

Родамин 6G (3) 0.01 7.3 0.115 29.4

SF-6847 (3,2) 0.091 18.84 0.120 32.5

ФКЦФ (50) 0.113 19.4 0.113 31.3

Амилорид (50) 0.118 17.1 0.116 29.7

Обозначения.а - ОПыю;

- мМ.

При культивировании Т. magadiensis на пирувате ДЦКД не оказывал влияния на рост, хотя ингибировал синтез ацетата почти на 30%. Таким образом, при росте организма на пирувате в присутствии ДЦКД наблюдалось разобщение роста и ацетогенеза. Пируват в ходе ацетогенеза декарбоксилируется и окисляется пируват-ферредоксин-оксидоредуктазой до ацетил-КоА, восстановленного ферредоксина и СО2, который вовлекается в путь Вуда-Льюнгдала. Ацетил-КоА превращается в ацетат при участии ацетилфосфата [Müller and

Gottschalk, 1994]. В данном случае путь Вуда-Льюнгдала служит для сброса электронов, позволяя бактерии синтезировать АТФ за счет фосфорилирования на субстратном уровне. Поскольку ДЦКД частично угнетал ацетогенез T. magadiensis при росте на пирувате, можно предполагать также участие окислительного фосфорилирования в генерации энергии в ходе ацетогенеза. АТФаза, вероятно, является белком FiFo-типа, поскольку ванадат, ингибитор EiE2-ATP-a3bi, в концентрации 50 мкМ не угнетал рост и ацетогенез Т. magadiensis ни на аргинине, ни на пирувате.

Для выяснения ионной специфичности АТФазы у Т. magadiensis использовали родамин 6G. Данный ингибитор вызывает сильное угнетение роста и ацетогенеза культуры на среде с г аргинином и не влияет на рост и ацетогенез на среде с пируватом (таблица 10).

Следовательно, можно полагать, что при росте на среде с аргинином синтез АТФ сопряжен с действием Н+-АТФазы. Полученные данные указывают также на то, что Т. magadiensis может расти в присутствии родамина 6G и, следовательно, использовать первичный ' натриевый градиент для синтеза АТФ за счет №+-транслоцирующей АТФазы, когда Н+-

зависимая АТФ-синтаза угнетена родамином 6G.

Рост и ацетогенез Т. magadiensis как на аргинине, так и на пирувате, чувствителен к моненсину в концентрации 10 мкМ, искусственному №+/Н+-антипортеру и ингибитору ApNa. Снятие протонного градиента в присутствии протонофора SF-6847 не оказывало влияния на рост и ацетогенез Т. magadiensis на пирувате, а на аргинине ингибировало рост на 15%, не влияя на синтез ацетата. Протонофор ФКЦФ практически не влиял на рост и ацетогенез организма на всех исследованных субстратах. Рост и ацетогенез Т. magadiensis как на аргинине, так и на пирувате, не чувствительны к амилориду - ингибитору Na+/H+-антипорта (таблица 10).

На основании проведенных исследований можно предполагать, что энергетический метаболизм Т. magadiensis основан на использовании как натриевого цикла, так и протонного градиента. Из результатов ингибиторного анализа также следует, что Т. magadiensis использует разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ацетогенные бактерии широко распространены в природе и могут быть обнаружены даже в таких экстремальных местах обитания, как содовые озера Африки. Выделенные бактерии представляют собой новые таксоны, катаболические возможности которых очень ограничены. Трофические потребности N. acetigena сориентированы в направлении лактата и этанола, продуктов первичных анаэробов, например, таких как алкалофильные спирохеты из озера Магади. Определенные свойства, такие как ограниченное число потребляемых л субстратов, низкая способность к спорообразованию и быстрый лизис в чистой культуре

указывают на то, что N. acetigena полностью удовлетворяет требованиям, чтобы развиваться как член кооперативного сообщества. Natr. histidinovorans является представителем алкалофильных и умеренно-гапофильных организмов протеолитического пути в анаэробном i сообществе в содовом озере. Ростовые характеристики этой бактерии в области рН-щелочность-соленость, соответствуют природным условиям в озере Магади.

Рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии A. arabaticum специфически зависит от ионов натрия. Ионы калия и лития, уравненные по молярному содержанию, не заменяют натрий. Возможно, что Na+ требуется для генерации №+-градиента через цитоплазматическую мембрану, а также для первичной дыхательной внешней натриевой помпы. Однако, U2SO4 может частично замещать NaCl. Было показано, что минимальное количество NaCl, необходимое для роста A. arabaticum снижается в присутствии U2SO4. Изменение минимального количества NaCl в зависимости от различных условий характерно для многих галофильных бактерий [Adams et al., 1987; Vreeland and Martin, 1980].

Анаэробные эубактерии - экстремально галоалкалофильная N. acetigena и умеренно-алкалофильная галотолерантная Т. magadiensis - поддерживают высокие внутриклеточные концентрации ионов Na+ и СГ, которые возрастают при увеличении количества NaCl в среде, что позволяет этим организмам сбалансировать внутреннее осмотическое давление с внешней высокоминерализованной окружающей средой. Внутриклеточные концентрации ионов Na+ являются достаточно высокими, и намного больше, чем внутриклеточные концентрации ионов К+, а внутриклеточные и внеклеточные концентрации ионов СГ сбалансированы между собой. Внутриклеточный К+ вносит относительно низкий вклад в достижение осмотического баланса между клетками и окружающей средой.

Впервые обнаружена и исследована периплазматическая гидрогеназа у облигатно-галофильной ацетогенной бактерии A. arabaticum. Периплазматическая гидрогеназа в '

значительной степени стимулировалась в присутствии высоких концентраций NaCl и KCl, и |

ее активность достигала максимальных значений при насыщающих концентрациях солей. 1

Гидрогеназа, локализованная в цитоплазме, также стимулировались NaCl при концентрациях 1,0-5,2 М. Наличие периплазматической гидрогеназы у А. arabaticum может свидетельствовать о специфической адаптации этого организма к низким уровням растворенного водорода в гиперсоленых водоемах. Активности внутриклеточных катаболитных ферментов — СО-дегидрогеназы, глутамат- и лактатдегидрогеназы так же, как и периплазматический фермент, зависят от насыщающих концентраций NaCl.

Результаты ингибиторного анализа позволяют предполагать, что автотрофный рост А. arabaticum сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хсмиосмотическому механизму при участии АТФазы FiFo-типа. В процессе гетеротрофного роста АТФ синтезируется на уровне субстратного фосфорилирования. Таким образом, А. arabaticum использует разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

При исследовании цепи переноса электронов в клетках А. arabaticum были иденшфицированы флавопротеин и корриноидные соединения; цитохромы и хнноны не обнаружены. Таким образом, при автотрофном росте экстремально-галофильной бактерии А. arabaticum восстановление СОг до ацетата происходит с использованием пути Вуда-Льюнгдала при участии гидрогеназы, СО-дегидрогеназы, АТФ-синтазы, системы Na+/H+-антипорта, корриноидных белков, фолатов и флавинов. Этот организм можно отнести ко второй группе ацетогенов (с A. woodii и R. productus как модельными организмами) в отношении их энергетики [Müller and Gottschalk, 1994].

Культуры галоалкалофильных ацетогенных бактерий N. acetigena и Atar. 'nistiainovorans и галотолерангной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Т. magadiensis обладали высокими активностями СО-дегидрогеназы в бесклеточных экстрактах. Т. magadiensis также обладала высокой гидрогеназной активностью, которая катализировала образование Нг как побочного продукта на большинстве используемых f

субстратов. Изученные ферменты N. acetigena, Nat г. histidinovorans и Т. magadiensis оказались солетолерантными, хотя значительно различались по их чувствительности к специфическим концентрациям солей. Таким образом, результаты проведенного исследования согласуются с основной гипотезой о том, что галоанаэробы и некоторые представители галофильных анаэробных эубактерий [Oren, 1999] физиологически адаптированы к высоким концентрациям солей за счет ферментов, которые функционируют при высокой внутриклеточной концентрации соли.

Окисление энергетических субстратов N. acetigena (лактат, этанол) и Atar. histidinovorans (гистидин) сопряжено с генерацией АТФ через электрон-транспортное фосфорилирование по хемиосмотическому механизму при участии АТФазы. Это отличает алкалофильную N. acetigena от галофильного A. arabaticum, который при росте на лактате синтезирует АТФ на уровне субстратного фосфорилирования, что, возможно, связано с различными путями расщепления этого субстрата. Угнетение роста, ацетогенеза и синтеза АТФ в присутствии ДЦКД наблюдалось у A. arabaticum только в условиях автотрофного

роста. N. acetigena и Мг7г. Лий'(Ипоуогапз продемонстрировали существенно различные способы приспособления к экстремальным условиям среды. Галоанаэроб N. acetigena относится к самостоятельной филогенетической ветви порядка На1апаегоЫа1ех, и ее приспособление к щелочной среде основано на активном энергетическом механизме. Ее можно рассматривать как галофила, приспособившегося к щелочной среде. Напротив, представитель иной филогенетической ветви "клостридиев с низким Г+Ц", Natr. ЫзсИсИптогапз, оказался истинным алкалофилом, не претерпевающим дезинтеграции при блокировании энергетических процессов.

На основании проведенных исследований можно предполагать, что энергетический метаболизм галотолерантной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Т. magadiensiч основан, как на использовании натриевого цикла, так и протонного градиента. Из результатов ингибиторного анализа также следует, что Т. magadiensis использует разные механизмы запасания энергии в течение ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

Изученные ферменты алкалофильных ацетогенов крайне устойчивы к высоким значениям рН, что, возможно, является одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам.

ВЫВОДЫ

1. Описаны в соавторстве первые представители алкалофильных ацетогенных бактерий, изолированные из содового озера Магади (Кения) - Мг/гош'еНа асе^епа, новый род порядка На1апаегоЫа1е5 и Natwnincola histidinovorans, новый род порядка С1озгпсИа1ез, развивающиеся в высокоминерализованных средах при рН от 8 до 10,5.

2. Изученные анаэробные эубактерии - экстремально галоалкалофильная N. асе^епа и умеренно-алкалофильная галотолерантная Т. magadiensis, поддерживают высокие внутриклеточные концентрации ионов и СГ, зависящие от содержания №С1 в среде, что позволяет этим организмам сбалансировать внутреннее осмотическое давление с внешней высокоминерализованной окружающей средой. Внутриклеточный К+ вносит относительно низкий вклад в достижение осмотического баланса между клетками и окружающей средой.

3. Показано, что внутриклеточные ферменты у исследованных гапофильных и галоалкалофильных ацетогенов толерантны к присутствию высоких концентраций солей Ка\ Результаты, полученные на примере N. асе^епа и Т. magadiensis согласуются с основной гипотезой о том, что галоанаэробы и некоторые другие представители гапофильных анаэробных эубактерий физиологически адаптированы к

. осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей,

* за счет ферментов, которые функционируют при высокой внутриклеточной

концентрации соли. Установлена способность ключевых ферментов алкалофильных ацетогенов функционировать при высоких значениях рН, что является одним из > способов адаптации бактерий к высокощелочным средам.

4. Впервые для ацетогенных бактерий установлено наличие периплазматической гидрогеназы у экстремально галофильного Асе1ока1оЫит агаЬшкит, активность которой стимулируется в присутствии высоких концентраций солей - №С1 и КС1, вплоть до насыщающих. Наличие периплазматической гидрогеназы может свидетельствовать о специфической адаптации этого организма к низким уровням растворенного водорода в гиперсоленых водоемах.

5. Установлено, что экстремально галофильная ацетогенная бактерия А. агаЬшкит осуществляет восстановление СО2 до ацетата по ацетил-КоА-пути Вуда-Льюнгдала при участии гидрогеназы, СО-дегидрогеназы, АТФ-синтазы, системы Ыа+/Н+-антипорта, корриноидных белков, фолатов и флавина.

6. Показано, что в зависимости от используемого энергетического субстрата и специфики метаболизма галофильные и алкалофильные ацетогены используют разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза - электрон-транспортное или субстратное фосфорилирование, Na+- и Н+-градиенты через мембрану. Na+/H+-антипорт является универсальным механизмом для создания ионных градиентов и поддержания рН-гомеостаза у алкалофилов.

Список работ по материалам диссертации:

1. Пушева М.А., E.H. Деткова, Н.П. Болотина, Т.Н. Жилина. Свойства fJ периплазматической гидрогеназы экстремально гапофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. II Микробиология, 1992, т.61, вып.6, стр.933-938.

2. Быховский В.Я., М.А. Пушева, Н.И. Зайцева, Т.Н. Жилина, Д.Б. Папковский, Е.Н. ^ Деткова. Биосинтез корриноидов и их возможных предшественников экстремально гапофильной гомоацетатной бактерией Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. // Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т.ЗО, вып.1, стр.95-103.

3. Быховский В.Я., П.Дж. Сантандер, Э. Ступперих, Н.И. Зайцева, М.А. Пушева, Е.Н. Деткова, Д.С. Валюшок, А.И. Скотт. Биосинтез корриноидов облигатно анаэробными микроорганизмами: выделение и идентификация промежуточных соединений биогенеза витамина В12 и его аналогов, накапливаемых при развитии Clostridium thermoaceticum, Sporomusa ovata и Acetohalobium arabaticum. II Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т.32, вып.2, стр. 185-193.

4. Пушева М.А., Е.Н. Деткова. Биоэнергетические аспекты ацетогенеза из разных субстратов у экстремально гапофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum. // Микробиология, 1996, т.65, вып. 5, стр.589-593.

5. Zhilina T.N., G.A. Zavarzin, E.N. Detkova, F.A. Rainey. Natroniella acetigena gen. nov., sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales. // Current Microbiology, 1996, vol. 32, pp. 320-326.

6. Zhilina T.N., E.N. Detkova, F.A. Rainey, G.A. Osipov, A.M. Lysenko, N.A. Kostrikina, G.A. Zavarzin. Natronincola histidinovorans gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic acetogenic anaerobe.// Current Microbiology, 1998, vol. 37, pp. 177-185.

7. Пушева M.A., A.B. Питрюк, Е.Н. Деткова, Г.А. Заварзин. Биоэнергетика ацетогенеза экстремально алкалофильных гомоацетогенных бактерий Natroniella acetigena и Natronincola histidinovorans.il Микробиология, 1999, т.68, вып. 5, стр.651-656.

о. Питрюк А.В., Е.Н. Деткова, М.А. Пушева. Сравнительное изучение энергетического обмена анаэробных алкалофилов из содовых озер. // Микробиология, в печати.

9. Pusheva М., Е. Detkova, N. Bolotina and Т. Zhilina. 1992. Salt dependent hydrogenase in f extremely halophilic methylotrophic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. // In 7th International symposium on microbial growth on C-l compounds.

10. Pusheva M.A. and E.N. Detkova. Properties of the periplasmic hydrogenase of the extremely halophilic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. Vth International conference on the molecular biology of hydrogenases. Albertville (France)

July 12-17, 1997. ,

11. Pusheva M.A., E.N. Detkova. Properties of the periplasmic hydrogenase of extremely halophilic homoacetogenic bacterium Acetohalobium arabaticum. COST action 818. , Hydrogenase and their biotechnological application. Workshop. Hydrogen metabolism of azotrophic and anaerobic bacteria. Umea, Sweden, 11-14 June,1998.

12. Питрюк A.B., Е.Н. Деткова, М.А. Пушева. 2000. Особенности энергетического метаболизма галоалкалофильных гомоацетогенных бактерий Natronincola histidinovorans и Natroniella acetigena.il Горизонты физико-химической биологии -Пущино - т. 1, стр.203.

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ № 1408 Тираж 100

* 17704

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Деткова, Екатерина Николаевна

страница

ВВЕДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий"

Актуальность темы. Ацетогенные бактерии представляют собой группу облигатных анаэробов, использующих ацетил-КоА-путь Вуда-Льюигдала как механизм для восстановительного синтеза ацетата из СОг, для накопления энергии и синтеза клеточного углерода. Они присутствуют повсеместно в аноксических местах обитания, играя важную роль в глобальном цикле углерода. В настоящее время известно около 100 видов из следующих 18 родов [Drake et al., 2002]: Acetitomaculum, Acetobacterium, Acetohalobium, ^ Acetonema, Butyribacterium, Caloramator, Clostridium, Eubacterium, Holophaga, Moorella,

Natroniella, Oxobacter, Ruminococcus, Sporomusa, Syntrophococcus, Thermoacetogenium, Thermoanaerobacter, Treponema. Ацетогены - филогенетически очень разобщенная группа бактерий, которые различаются по морфологии, по наличию, форме и локализации спор, по подвижности и типу жгутикования, по физиологическим и биохимическим характеристикам. Они имеют высокий биотехнологический потенциал как продуценты уксусной кислоты при анаэробных ферментациях углеводов или при восстановлении оксидов углерода. Ацетогенные бактерии являются метаболически гибкими анаэробами, и способны к трансформации разнообразных органических субстратов, таких как углеводы, спирты, органические кислоты, ароматические соединения, а также к использованию Н2 и СОг, что определяет их участие в различных микробных сообществах. В процессе гетеротрофного роста АТФ может синтезироваться в достаточных количествах на уровне субстратного фосфорилирования. При автотрофном росте синтез ацетата из СОг, когда Н2 является донором электронов, должен быть сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хемиосмотическому механизму. Необходимым условием электрон-транспортного фосфорилирования является присутствие мембран-связанных переносчиков электронов и донорно-акцепторной системы, а также АТФ-синтазы.

К началу наших исследований у ряда ацетогенов были найдены цитохромы, менахиноны и Fe-S-бглки [Gottwald et al., 1975; Yang et al., 1980; Elliott and Ljungdahl, 1982; Hugenholtz and Ljungdahl, 1989]. Показано, что ключевые ферменты ацетил-КоА-пути -гидрогеназа, СО-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза и формиатдегидрогеназа - являются мембран-связанными [Ljungdahl, 1994]. АТФ-синтаза FiFo-типа была подробно изучена у Moorella thermoacetica [Mayer et al., 1986]. Thermoanaerobacter kivui, Ruminococcus productus и Acetobacterium woodii отличаются от других исследованных ацетогенов зависимостью от Na+ для метаболической активности [Geerligs et al., 1989; Heise et al., 1989; Yang and Drake, 1990]. Однако, физиология, биохимия и энергетический метаболизм ацетогенов из экстремальных мест обитания не изучены, поскольку такие местообитания до последнего времени не исследовались в достаточной степени на наличие процессов ацетогенеза и соответствующих микроорганизмов.

Исследование микробных сообществ из экстремальных мест обитания представляет большой интерес с естественно-научной точки зрения для понимания функционирования биосферы прошлого. В связи с этим в лаборатории микробных сообществ ИНМИ РАН было исследовано галофильное микробное сообщество из цианобактериальных матов лагун Арабатской стрелки, расположенных на восточном побережье озера Сиваш. В результате был выделен ряд первичных и вторичных анаэробов, участвующих в разложении органического вещества, среди которых - первый представитель галофильных ацетогенов Асе1оИа1оЫит агаЪайсит, способен развиваться в области солености от 10 до 25 % [Жилина и Заварзин, 1990]. Изучение анаэробного пути деградации органических веществ в содовом озере Магади (Кения) привело к описанию ряда новых родов, вовлеченных, главным образом, в ацетогенез. В связи с этим представилась возможность для изучения ранее неисследовавшихся алкалофильных ацетогенов. Большой интерес представляет изучение механизмов адаптации микроорганизмов, и в том числе ацетогенов, к экстремальным условиям окружающей среды.

Цель и задачи работы. Целью работы было изучение особенностей физиологии, биохимии и биоэнергетики ацетогенных бактерий, выделенных из высокоминерализованных мест обитания.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Описание первых облигатно галоалкалофильных ацетогенных бактерий ЫМготеНа асейщепа и ЫШгоптсо1а Ы5й(Ипо\огаю, выделенных из содового озера Магади.

2. Изучение механизмов адаптации галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий к экстремальным условиям окружающей среды, таким как осмотический стресс и высокие значения рН, включая: а) определение внутриклеточных концентраций ионов 1С1" и СГ у алкалофильных и галоалкалофильных ацетогенов. б) исследование ключевых ферментов метаболизма ацетогенных бактерий и их способности функционировать в средах с высоким содержанием солей и при высоких значениях рН.

Научная новизна. Проведено сравнительное изучение первых представителей ацетогенных бактерий из высокоминерализованных мест обитания. Исследованы и описаны галоалкалофильные ацетогенные бактерии из озера Магади, которые составили два новых рода и вида: Иа^отеПа асе1'щепа деп.поу., Бр.поу. является первым алкалофильным ацетогеном в порядке На1апаегоЫа1ез; АТШгоптсо1а Ь'Ш'кИпохогат §еп.поу., Бр.поу. — первый алкалофильный представитель в кластере XI грамположительных бактерий с низким содержанием Г+Ц порядка Ооэ^сНакз. Получены балансовые уравнения разложения основных субстратов. Изучена экофизиология N. асе^епа при различных значениях рН среды и различных сочетаниях ЫаС1, ЫагСОз/МаНСОз, которые характерны для содовых озер.

Обнаружены сходные стратегии адаптации к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей: накопление высоких внутриклеточных концентраций ионов Ка+ и СГ у галоалкалофильной N. асе^епа и умеренно алкалофильной галотолерантной ацетогенной бактерии ТМаШа magadieюis, и способность всех исследованных ферментов экстремофильных ацетогенов функционировать в средах с высоким содержанием солей. Впервые обнаружена периплазматическая гидрогеназа у облигатно галофильной ацетогенной бактерии АсеЮка1оЫит агаЪайсит и показано, что ее активность стимулируется в присутствии высоких концентраций №С1 и КС1, вплоть до насыщающих.

Впервые проведено сравнительное изучение роли окислительного фосфорилирования и ионных градиентов в энергетическом метаболизме галофильных и алкалофильных ацетогенов. Ингибиторный анализ показал, что данные микроорганизмы используют разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза — электрон-транспортное или субстратное фосфорилирование, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

Апробация работы. Отдельные материалы диссертации были представлены на 7-м Международном Симпозиуме по микробному росту на С [-соединениях (Уорвик, Великобритания, 1992), на 5-й конференции Российской Федерации "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1992), на 5-ой международной конференции "Молекулярная биология гидрогеназ" (Альбертвилль, Франция, 1997), на международном симпозиуме "Водородный метаболизм азотрофных и анаэробных бактерий" (Умеа, Швеция, 1998), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), а также на конкурсах научных работ Института Микробиологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей, 4 тезиса, 1 статья находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа содержит 36 рисунков, 14 таблиц и 5 фотографий. Список литературы содержит 181 публикацию.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Деткова, Екатерина Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Описаны в соавторстве первые представители алкалофильных ацетогенных бактерий, изолированные из содового озера Магади (Кения) - Ата1готе11а aceíigena, новый род порядка На1апаегоЫа1ез и ЫШготпсо1а ЫзИсИпоуогат, новый род порядка С1о5ШсПа1ез, развивающиеся в высокоминерализованных средах при рН от 8 до 10,5.

2. Изученные анаэробные эубактерии - экстремально галоалкалофильная N. асеС^епа и умеренно алкалофильная галотолерантная Т. та%ас1\ет1$, поддерживают высокие внутриклеточные концентрации ионов и СГ, зависящие от содержания ЫаС1 в среде, что позволяет этим организмам сбалансировать внутреннее осмотическое давление с внешней высокоминерализованной окружающей средой. Внутриклеточный К+ вносит относительно низкий вклад в достижение осмотического баланса между клетками и окружающей средой.

3. Показано, что внутриклеточные ферменты у исследованных галофильных и галоалкалофильных ацетогенов толерантны к присутствию высоких концентраций солей Ыа+. Результаты, полученные на примере N. асе1щепа и Т. magadiensis согласуются с основной гипотезой о том, что галоанаэробы и некоторые другие представители галофильных анаэробных эубактерии физиологически адаптированы к осмотическому стрессу, возникающему в присутствии высоких концентраций солей, за счет ферментов, которые функционируют при высокой внутриклеточной концентрации соли. Установлена способность ключевых ферментов алкалофильных ацетогенов функционировать при высоких значениях рН, что является одним из способов адаптации бактерий к высокощелочным средам.

4. Впервые для ацетогенных бактерий установлено наличие периплазматической гидрогеназы у экстремально галофильного Асе1оИа1оЫит агаЬаНсит, активность которой стимулируется в присутствии высоких концентраций солей - ЫаС1 и КС1, вплоть до насыщающих. Наличие периплазматической гидрогеназы может свидетельствовать о специфической адаптации этого организма к низким уровням растворенного водорода в гиперсоленых водоемах.

5. Установлено, что экстремально галофильная ацетогенная бактерия А. агаЬаНсит осуществляет восстановление СОг до ацетата по ацетил-КоА-пути Вуда-Льюнгдала при участии гидрогеназы, СО-дегидрогеназы, АТФ-синтазы, системы Ка+/Н+-антипорта, корриноидных белков, фолатов и флавина.

6. Показано, что в зависимости от используемого энергетического субстрата и специфики метаболизма галофильные и алкалофильные ацетогены используют разные механизмы запасания энергии в ходе ацетогенеза - электрон-транспортное или субстратное фосфорилирование, и Н+-градиенты через мембрану. ЫаТН антипорт является универсальным механизмом для создания ионных градиентов поддержания рН-гомеостаза у алкалофилов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное исследование показало, что ацетогенные бактерии достаточно широко распространены в природе и могут быть обнаружены даже в таких экстремальных местах обитания, как содовые озера Африки. Выделенные бактерии представляют собой новые таксоны, катаболические возможности которых очень ограничены. Трофические потребности Natroniella acetigena сориентированы в направлении лактата и этанола, продуктов первичных анаэробов, например, таких как алкалофильные спирохеты из озера Магади. Определенные свойства, такие как ограниченное число потребляемых субстратов, низкая способность к спорообразованию и быстрый лизис в чистой культуре указывают на то, что N. acetigena полностью удовлетворяет требованиям, чтобы развиваться как член кооперативного сообщества. Natronincola histidinovorans является представителем алкалофильных и умеренно галофильных организмов протеолитического пути в анаэробном сообществе в содовом озере. Ростовые характеристики этой бактерии в области рН-щелочность-соленость, соответствуют природным условиям в озере Магади.

Общим свойством всех галофильных бактерий является необходимость NaCl для роста, а также их способность расти в присутствии высоких концентраций солей. Рост экстремально галофильной ацетогенной бактерии Acetohalobium arabaticum специфически зависит от ионов натрия. Ионы калия и лития, уравненные по молярному содержанию, не заменяют натрий. Рост полностью отсутствовал, когда среда содержала только соли лития или калия. Однако, было замечено, что LÍ2SO4 может частично заменять NaCl, если в среде присутствует не менее 1.54 М NaCl и 0.4 М LÍ2SO4. В отличие от A. arabaticum, NaCl, NaBr, Nal, NaNOí, Na2S04, KC1, KBr, KI и KNO3 (1 M) способны удовлетворить потребность в солях для роста умеренно галофильной бактерии Micrococcus varians ssp. halophilus. Примечательно, что этот галофил обнаружил обильный рост в среде, содержащей 3.0 М (31 %) NaBr или 3.5 М (30 %) NaN03 [Kamekura and Onishi, 1982]. В настоящей работе показано, что минимальное количество NaCl, необходимое для роста A. arabaticum не является постоянным, а может изменяться в зависимости от состава среды. Оно снижается с 1.71 М (10 %) в обычной комплексной среде [Жилина и Заварзин, 1990] до 1.54 М (9%) в присутствии 0.4 М LÍ2SO4. Изменение минимального количества NaCl в зависимости от различных условий характерно для многих галофильных бактерий. Например, минимальное количество NaCl, необходимое для роста умеренно галофильной бактерии Vibrio costicola, может быть уменьшено от 0.5 М до 0.3 М, если общую молярную концентрацию раствора среды увеличить от 0.5 М до 1.0 М добавлением эквимолярного количества сахарозы или глицерина [Adams et al., 1987]. Таким образом, было показано, что NaCl необходим для роста экстремально галофильной ацетогенной бактерии A. arabaticum. Возможно, что Na+ требуется для генерации Ыа+-градиента через цитоплазматическую мембрану, а также для первичной дыхательной внешней натриевой помпы [Ventosa et al., 1998].

В данной работе показано, что изученные анаэробные эубактерии - экстремально галоалкалофильная N. acetigena и умеренно алкалофильная галотолерантная T. magadiensis -поддерживают высокие внутриклеточные концентрации ионов Na+ и СГ, которые увеличиваются при увеличении количества NaCl в среде, что позволяет этим организмам сбалансировать внутреннее осмотическое давление с внешней высокоминерализованной окружающей средой. Внутриклеточные концентрации ионов Na+ и СГ у N. acetigena и Т. magadiensis близки к тем, которые характерны для других анаэробных галофилов [Oren 1986b; Rengpipat et al., 1988]. Внутриклеточные концентрации солей у аэробных галофильных архебактерий и некоторых галофильных анаэробных эубактерий зависят от внешних концентраций солей. Внутриклеточная концентрация хлорида обычно поддерживается на уровне, эквивалентном концентрации хлорида в окружающей среде, а внутриклеточная концентрация натрия несколько ниже, либо практически равна его внешней концентрации. Кроме того, для галофильных архебактерий также характерно накопление высоких внутриклеточных концентраций ионов К+, которые в несколько раз превышают их содержание в среде [Lanyi, 1974; Martin et al., 1999]. Показано, что у N. acetigena и Т. magadiensis внутриклеточные концентрации ионов Na+ являются достаточно высокими, и намного больше, чем внутриклеточные концентрации ионов К+, а внутриклеточные и внеклеточные концентрации ионов СГ сбалансированы между собой. В данном случае, в противоположность некоторым галофильным архебактериям, внутриклеточный К+ вносит относительно низкий вклад в достижение осмотического баланса между клетками и окружающей средой.

Впервые обнаружена и исследована периплазматическая гидрогеназа у облигатно галофильной ацетогенной бактерии A. arabaticum, которая растет в области солености от 10 до 25% NaCl с оптимумом при 15 — 18%. Периплазматическая гидрогеназа в значительной степени стимулировалась в присутствии высоких концентраций NaCl и КС1 вплоть до насыщающих. При 4,5 M NaCl активность увеличивалась более чем в 5 раз, при 3,54 M КС1 активность увеличивалась более чем в 3 раза. Гидрогеназа, локализованная в цитоплазме, также стимулировались NaCl при концентрациях 1,0-5,2 М. Гидрогеназа является ключевым ферментом энергетического метаболизма, катализирующим обратимую реакцию окисления водорода и ответственного за потребление и выделение водорода у ацетогенов. Локализация гидрогеназы в периплазме была установлена для пресноводных сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio [Badziong and Thauer, 1980], а также для алкалофильного сульфатредуктора Desulfonatromim lacustre [Пушева и др., 1999]. Предполагается ее участие в межвидовом переносе водорода в анаэробных сообществах. Несмотря на достаточно большое количество работ, связанных с изучением внутри- и внеклеточных ферментов галофильных бактерий, данные о гидрогеназах практически отсутствуют. Изучение ряда ферментов в бесклеточных экстрактах умеренно галофильной эубактерии Halobacteroides acetoethylicus показало увеличение активности гидрогеназы на 60% от ее максимальной активности в присутствии высоких значений солей. Однако при концентрации NaCl выше 2,3 М активность фермента подавлялась [Rengpipat et al., 1988]. Нужно отметить, что активность гидрогеназы A. arabaticum достигала максимальных значений при насыщающих концентрациях солей в отличие от фермента из умеренно галофильной бактерии Н. acetoethylicus, что может быть связано с адаптацией этой бактерии к среде с более умеренными концентрациями соли (оптимум для роста при 10% NaCl). Наличие периплазматической гидрогеназы у А. arabaticum может свидетельствовать о специфической адаптации этого организма к низким уровням растворенного водорода в гиперсоленых водоемах.

Для сравнительного изучения действия солей на ферменты А. arabaticum исследованы активности внутриклеточных катаболитных ферментов — СО-дегидрогеназы, глутамат- и лактатдегидрогеназы в зависимости от NaCl. Установлено увеличение активности глутаматдегидрогеназы на 52% при концентрации соли 1,7 М и активности лактатдегидрогеназы на 58% в присутствии 5,2 М NaCl. Максимальная активность СО-дегидрогеназы наблюдалась при 1 М NaCl. Таким образом, активности внутриклеточных ферментов так же как и периплазматический фермент, зависят от насыщающих концентраций NaCl. Абсолютная потребность в NaCl и устойчивость ферментов А. arabaticum к высоким концентрациям солей аналогична другим представителям галоанаэробов [Oren 1986b; Rengpipat et al., 1988].

Результаты ингибиторного анализа позволяют предполагать, что автотрофный рост А. arabaticum сопряжен с синтезом АТФ за счет электрон-транспортного фосфорилирования по хемиосмотическому механизму при участии АТФазы FiFo-типа, что согласуется с данными, полученными для других ацетогенов - A. woodii, М. thermoacetica и М. thermoautotrophica [Müller and Gottschalk, 1994; Ljungdahl, 1994]. В процессе гетеротрофного роста АТФ синтезируется на уровне субстратного фосфорилирования. Как следует из полученных данных, использование А. arabaticum триметиламина, также как других испытанных субстратов, зависит от ApNa и ДрН. Установлено, что у A.woodii синтез АТФ сопряжен как с ApNa, так и с ДрН [Heise et al., 1991]. Таким образом, как показал ингибиторный анализ, А. arabaticum использует разные механизмы запасания энергии в течение ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

При исследовании цепи переноса электронов в клетках Acetohalobiiim cirabaticum был идентифицирован флавопротеин; цитохромы и хиноны не были обнаружены. Также были обнаружены корриноидные соединения, являющиеся главными кофакторами ацетогенных бактерий и участвующие в ряде окислительно-восстановительных реакций, а также в образовании -С-С- связи при синтезе ацетата через ацетил-КоА-путь. Таким образом, было показано, что при автотрофном росте экстремально галофильной бактерии A. arabaticum восстановление СОг до ацетата происходит с использованием пути Вуда-Льюнгдала при участии гидрогеназы, СО-дегидрогеназы, АТФ-синтазы, системы Ыа+/Н+-антипорта, корриноидных белков, фолатов и флавинов. Этот организм можно отнести ко второй группе ацетогенов (с A. woodii a R. producías как модельными организмами) в отношении их энергетики [Müller and Gottschalk, 1994].

Культуры галоалкалофильных ацетогенных бактерий Naíroniella acetigena и Natronincola histidinovorans и галотолерантной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Tindallici magadiensis обладали высокими активностями СО-дегидрогеназы в грубых экстрактах. СО-дегидрогеназа является одним из ключевых ферментов нециклического ацетил-КоА-пути Льюнгдала-Вуда, который используется ацетогенными бактериями для восстановления СОг до ацетата. Т. magadiensis также обладала высокой гидрогеназной активностью, которая катализировала образование Нг как побочного продукта на большинстве используемых субстратов. Изученные ферменты N. acetigena, Natr. histidinovorans и Т. magadiensis оказались солетолерантными, хотя значительно различались по их чувствительности к специфическим концентрациям солей. Активности гидрогеназы и СО-дегидрогеназы Т. magadiensis были оптимальны в отсутствии NaCl. Несмотря на угнетение NaCl, оба фермента функционировали при концентрациях до 4,3 М. Уровень активности гидрогеназы оставался примерно постоянным в области концентраций от 0 до 1,2 М №НСОз, в то время, как активность СО-ДГ была оптимальной при 0,25 М NaHC03. СО-ДГ N. acetigena и Natr. histidinovorans были активны в присутствии от 0 до 4,1 М NaCl. Однако, фермент N. acetigena имел оптимальную активность при 0,7 М этой соли, а уровень активности фермента Natr. histidinovorans оставался примерно постоянным при всех исследуемых концентрациях. ЫаНСОз угнетал активность СО-ДГ Natr. histidinovorans, но практически не оказывал влияния на фермент N. acetigena.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что ферменты изученных галофильных и галоалкалофильных ацетогенов достаточно толерантны к присутствию высоких концентраций солей. Это подтверждает основную гипотезу о том, что галоанаэробы и некоторые представители галофильных анаэробных эубактерий [Oren, 1999] физиологически адаптированы к высоким концентрациям солей за счет ферментов, которые функционируют при высокой внутриклеточной концентрации соли. Хотя галоанаэробы относятся к эубактериям, они имеют некоторое физиологическое и биохимическое сходство с галофильными архебактериями, которые используют аналогичную стратегию приспособления к соленой среде ("salt-in" - стратегия) [Oren, 1999]. В клетках, использующих эту стратегию для осмотической адаптации, все ферменты и структурные клеточные компоненты приспосабливаются к присутствию высоких концентраций солей, чтобы обеспечить должное функционирование внутриклеточного ферментативного аппарата.

При изучении энергетического метаболизма галоалкалофильных ацетогенных бактерий было показано, что окисление энергетических субстратов N. aceíigena (лактат, этанол) и Natr. hisíidinovorans (гистидин) сопряжено с генерацией АТФ через электрон-транспортное фосфорилирование по хемиосмотическому механизму при участии АТФазы. В отличие от N. aceíigena, нейтрофильный галоанаэроб A. arabaíicum на среде с лактатом не чувствителен к ДЦКД и сбраживание лактата сопровождается фосфорилированием на субстратном уровне. Угнетение роста, ацетогенеза и синтеза АТФ в присутствии ДЦКД наблюдалось у A. arabaticum и Т. kivui только в условиях автотрофного роста на средах с Нг + СО2 [Yang and Drake, 1990]. N. aceíigena и Natr. hisíidinovorans продемонстрировали существенно различные способы приспособления к экстремальным условиям среды. Галоанаэроб N. aceíigena относится к самостоятельной филогенетической ветви порядка Halanaerobiales, и ее приспособление к щелочной среде основано на активном энергетическом механизме. Ее можно рассматривать как галофила, приспособившегося к щелочной среде. Напротив, представитель иной филогенетической ветви "клостридиев с низким Г+Ц", Natr. hisdidinovorans, оказался истинным алкалофилом, не претерпевающим дезинтеграции при блокировании энергетических процессов.

На основании проведенных исследований можно предполагать, что энергетический метаболизм галотолерантной умеренно алкалофильной ацетогенной бактерии Tindallia magadiensis основан, как на использовании натриевого цикла, так и протонного градиента. Из результатов ингибиторного анализа также следует, что Т. magadiensis использует разные механизмы запасания энергии в течение ацетогенеза, в зависимости от используемого энергетического субстрата.

Показано, что изученные ферменты алкалофильных ацетогенов крайне устойчивы к высоким значениям pH, подобно ферментам из других алкалофильных микроорганизмов [Horikoshi, 1999]. Таким образом, можно заключить, что одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам является способность их ферментов функционировать при высоких значениях рН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Деткова, Екатерина Николаевна, Москва

1. Бонч-Осмоловская Е.А., И .Я. Веденина, Г. А. Заварзин. 1988. Гиперсоленые лагуны озера Сиваш и анаэробная деструкция органического вещества в галофильных цианобактериальных матах. Микробиология 57(3):442-449.

2. Венецкая С.Л., Л.М. Герасименко. 1988. Электронно-микроскопическое изучение микроорганизмов в галофильном цианобактериальном сообществе. Микробиология 57(3):450-457.

3. Герасименко Л.М., A.B. Дубинин, Г.А. Заварзин. 1996. Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология. Микробиология 65:844-849.

4. Герасименко Л.М., В.К. Некрасова, В.К. Орлеанский, С.Л. Венецкая, Г.А. Заварзин. 1989. Первичная продукция галофильных цианобактериальных сообществ. Микробиология 58(3):507-514.

5. Горленко В.М., Е.И. Компанцева, С.А. Коротков H.H. Пучкова, A.C. Савичев. 1984. Условия развития и видовой состав фототрофных бактерий в соленых мелководных водоемах Крыма. Известия АН СССР, Серия биология, 3:362-374.

6. Дубинин A.B., Л.М. Герасименко, Г.А. Заварзин. 1992а. Азотфиксация цианобактерии Microcoleus chthonoplastes из гиперсоленых лагун оз. Сиваш. Микробиология 61(5):852-857.

7. Дубинин A.B., Л.М. Герасименко, Г.А. Заварзин. 1995. Экофизиология и видовое многообразие цианобактерий озера Магади. Микробиология 64(6):845-849.

8. Дубинин A.B., Л.М. Герасименко, С.Л. Венецкая, М.В. Гусев. 19926. Отсутствие роста цианобактерии Microcoleus chthonoplastes в чистой культуре. Микробиология 61(1):57-63.

9. Жилина Т.Н. 1983. Новая облигатно галофильная метан-образующая бактерия. Микробиология 52(3):375-382.

10. Ю.Жилина Т.Н., В.В. Кевбрин, A.M. Лысенко, Г.А. Заварзин. 1991. Сахаролитические анаэробы в галофильном цианобактериальном мате. Микробиология 60(1): 139-147.

11. П.Жилина Т.Н., Г.А. Заварзин. 1987. Methanohalobium evestigatus, п. gen., п. sp., экстремально галофильная метаногенная архебактерия. Доклады Академии Наук СССР 293:464-468.

12. Жилина Т.Н., Г.А. Заварзин. 1990. Новая экстремально галофильная гомоацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. Доклады АН СССР, 311:745-747.

13. Жилина Т.Н., Е.С. Гарнова, Т.П. Турова, H.A. Кострикина, Г.А. Заварзин. 2001а. Halonatromim saccharophilum gen. nov., sp. nov. новая галоалкалофильная бактерия пор. Halanaerobiales из озера Магади. Микробиология 70:77-85.

14. Жилина Т.Н., Е.С. Гарнова, Т.П. Турова. 20016. Amphibacillus fermentum sp. nov., Amphibacillus tropicus sp. nov. новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. Микробиология 70:825-837.

15. Заварзин Г.А. 1993. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты. Микробиология 62(5):789-800.

16. Заварзин Г.А., JI.M. Герасименко, Т.Н. Жилина. 1993. Цианобактериальные сообщества гиперсоленых лагун Сиваша. Микробиология 62(6): 1113-1126.

17. Заварзин Г.А., Т.Н. Жилина, В.В. Кевбрин. 1999. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие. Микробиология 68(5):579-599.

18. Заварзин Г.А., Т.Н. Жилина, Е.В. Пикута. 1996. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы. Микробиология 65(4):546-553.

19. Заварзин Г.А., Т.Н. Жилина. 2000. Содовые озера природная модель древней биосферы континента. Природа 2:45-55.

20. Звягинцева И.С., А.Л. Тарасов. 1987. Экстремально галофильные бактерии из засоленных почв. Микробиология 56:839-844.

21. Исаченко Б.Л. 1952. Избранные труды. Т.2. С.169.

22. Кевбрин В.В., A.B. Дубинин, Г.А. Осипов. 1991. Осморегуляция у морской цианобактерии Microcoleus chthonoplastes. Микробиология 60(4):596-600.

23. Кевбрин В.В., A.M. Лысенко, Т.Н. Жилина. 1997. Физиология алкалофильного метаногена Z-7936, нового штамма Methanosalsus zhilinae, выделенного из озера Магади. Микробиология 66:315-320.

24. Кевбрин В.В., Т.Н. Жилина, Г.А. Заварзин. 1995. Физиология галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobiiim arabaticum. Микробиология 64(2): 165-170.

25. Компанцева Е.И. 1985. Несерные пурпурные бактерии в бентосных микробиальных сообществах: Диссертация канд.биол.наук. М.: ИНМИ АН СССР.

26. Коренман И.М. 1970. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. Москва: Химия.

27. Пикута Е.В., A.M. Лысенко, Т.Н. Жилина. 1997. Распространение Desulfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы. Микробиология 66:262-268.

28. Пикута Е.В., Т.Н. Жилина, Г.А. Заварзин, H.A. Кострикина, Г.А. Осипов, Ф.А. Рейни. 1998. Desulfonatromim lacustre gen. nov., sp. nov.-новая алкалофильнаясульфатвосстанавливающая бактерия, использующая этанол. Микробиология 67:123131.

29. Питрюк А.В., М.А. Пушева. 2001. Различие ионной специфичности синтеза АТФ у экстремально алкалофильных сульфатредуцирующих и ацетогенных бактерий. Микробиология 70:459-464.

30. Пушева М.А., Т.Г. Соколова. 1995. Распределение активностей СО-дегидрогеназы при СО-зависимом и пируватзависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans. Микробиология 64:581-586.

31. Пушева М.А., Ю.Ю. Берестовская, Н.П. Бородулина. 1989. Влияние никеля на метаболизм гомоацетогенных бактерий. Микробиология 58:206-210.

32. Пушева М.А., А.В. Питрюк, Ю.Ю. Берестовская. 1999. Особенности метаболизма экстремально алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий Desulfonatronum lacustre и Desulfonatronovibrio hydrogenovorans. Микробиология 68:651-663.

33. Симанькова М.В., Г.А. Заварзин. 1992. Анаэробное разложение целлюлозы в озере Сиваш и гиперсоленых лагунах Арабатской косы. Микробиология 61(2):288-293.

34. Скулачев В.П. 1989. Биоэнергетика: мембранные преобразователи энергии.- М. Высшая школа.

35. Слободкин А.И., Г.А. Заварзин. 1992. Образование метана в галофильных цианобактериальных матах лагун оз. Сиваш. Микробиология 61(2):294-298.

36. Сорокин Д.Ю., А.М. Лысенко, Л.Л. Митюшина. 1996. Выделение и характеристика алкалофильных хемоорганотрофных бактерий, окисляющих восстановленные неорганические серные соединения до тетратионата. Микробиология 65:370-383.

37. Троценко Ю.А., В.Н. Хмеленина. 2002. Особенности биологии и осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов. Микробиология 71(2): 149-159.

38. Хмеленина В.Н., М.Г. Калюжная, Ю.А. Троценко. 1997. Физиолого-биохимические особенности галоалкалофильного метанотрофа. Микробиология 66:437-443.

39. Adams M.W.W., L.E. Mortenson, and J.S. Chen. 1981. Hydrogenases. Biochimica et Biophysica Acta 594:105-176.

40. Adams R., J. Bygraves, M. Kogut, N.J. Russell. 1987. The role of osmotic effects in haloadaptation of Vibrio costicola. Journal of General Microbiology 133:1861-1870.

41. Andreesen J.R., and L.G. Ljungdahl. 1973. Formate dehydrogenase of Clostridium thermoaceticim: Incorporation of selenium-75, and the effects of selenite, molybdate, and tungstate on the enzyme. Journal of Bacteriology 116:867-873.

42. Avetisyan A.V., P.A. Dibrov, A.L. Semeykina, V.P. Skulachev, M.V. Sokolov. 1991. Adaptation of Bacillus FTU and Escherichia coli to alkaline conditions: the Na+-motive respiration. Biochimica et Biophysica Acta 1098:95-104.

43. Badziong W. and R.K. Thauer. 1980. Vectorial electron transport in Desulfovibrio vulgaris (Marburg) growing on hydrogen plus sulfate as sole energy source. Archives of Microbiology 125(1-2): 167-174.

44. Bengis-Garber C., and D.J. Kushner. 1981. Purification and properties of 5-nucleotidase from the membrane of Vibrio costicola, a moderately halophilic bacterium. Journal of Bacteriology 146:24-32.

45. Bergmeyer H.U. 1963. Methods of Enzymatic Analysis, p. 1064. New York: Academic Press.

46. Bischoff J.L., D.B. Herbst, and R.J. Rosenbauer. 1991. Gaylussite formation at Mono Lake, California, USA. Geochimica et Cosmochimica Acta 55:1743-1747.

47. Braun M., F. Mayer and G. Gottschalk. 1981. Clostridium aceticum (Wieringa), a microorganism producing acetic acid from molecular hydrogen and carbon dioxide. Archives of Microbiology 128:288-293.

48. Callaway T.R. and J.B. Russell. 1999. Selection of a highly monensin-resistant Prevotella bryantii subpopulation with altered outer membrane characteristics. Applied and Environmental Microbiology 65(11):4753-4759.

49. Clark J.E., and L.G. Ljungdahl. 1984. Purification and properties of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, an iron-sulfur flavoprotein from Clostridium formicoaceticum. Journal of Biological Chemistry 259:10845-10849.

50. Clark J.E., S.W. Ragsdale, L.G. Ljungdahl, and J. Wiegel. 1982. Levels of enzymes involved in the synthesis of acetate from CO2 in Clostridium thermoautotrophicum. Journal of Bacteriology 151(l):507-509.

51. Das A. and L.G. Ljungdahl. 2000. Acetogenesis and acetogenic bacteria, v.l, p. 18-27. In: Lederberg J. (ed.), Encyclopedia of microbiology, New-York: Academic Press.

52. Dennis P.P., and L.C. Shimmin. 1997. Evolutionary divergence and salinity-mediated selection in halophilic archaea. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(1):90-104.

53. Dibrov P.A., V.A. Kostyrko, R.L. Lazarova, V.P. Skulachev, I.A. Smirnova. 1986. The sodium cycle. I. Na+-dependent motility and modes of membrane energization in the marine alkalotolerant Vibrio alginolyticus. Biochimica et Biophysica Acta 850:449-457.

54. Drake H.L. 1982. Demonstration of hydrogenase in extracts of the homoacetate-fermenting bacterium Clostridium thermoaceticum. Journal of Bacteriology 150:702-709.

55. Drake H.L. 1994. Acetogenesis, acetogenic bacteria, and the acetyl-CoA "Wood/Ljungdahl" pathway: past and current perspectives, p.3-60. In: Drake H.L. (ed.), Acetogenesis, New-York-London: Chapman and Hall.

56. Drake H.L., K. Kusel and C. Matthies. 2002. Ecological consequences of the phylogenetic and physiological diversities of acetogens. Antonie van Leeuwenhoek 81:203-213.

57. Drake H.L., S.L. Daniel, K. Kusel, C. Matthies, C. Kühner, and S. Braus-Stromeyer. 1997. Acetogenic bacteria: what are the in situ consequences of their diverse metabolic versatilities? Biofactors 6(1): 13-24.

58. Elliott J.I. and L.G. Ljungdahl. 1982. Isolation and characterization of an Feg-Sg ferredoxin (ferredoxin II) from Clostridium thermoaceticum. Journal of Bacteriology 151:328-333.

59. Fagerbakke K.M., S. Norland, M. Heldal. 1999. The inorganic ion content of native aquatic bacteria. Canadian Journal of Microbiology 45:304-311.

60. Farakas A.G. and K. Kokai. 1971. Extraction, purification, and separation of tissue flavins for spectrophotometric determination. In: Colowick S.P., N.O. Kaplan (eds.), Methods in Enzymology V, XVIII. Part B, p. 385. London-New York: Academic Press.

61. Fischer F., R. Lieske and K. Winzer. 1932. Biologische Gasreaktionen. II. Uber die Bildung von Essigsaure bei der biologischen Umsetzung von Kohlenoxyd und Kohlensaure mit Wasserstoff zu Methan. Biochemistry 245:2-12.

62. Fontaine F.E., W.H. Peterson, E. McCoy, M.J. Johnson and G.J. Ritter. 1942. A new type of glucose fermentation by Clostridium thermoaceticum n. sp. Journal of Bacteriology 43:701715.

63. Fontecilla-Camps J.C., M. Frey, E. Garcin, C. Hatchikian, Y. Montet, C. Piras, X. Vernede, and A. Volbeda. 1997. Hydrogenase: A hydrogen-metabolizing enzyme. What do the crystal structures tell us about its mode of action? Biochimie 79(11):661-666.

64. Galinski E.A., and R.M. Herzog. 1990. The role of trehalose as a substitute for nitrogen-containing compatible solutes (Eciolhiorhodospira halochloris). Archives of Microbiology 153:607-613.

65. Garnova E.S., T.N. Zhilina, T.P. Tourova, A.M. Lysenko. Anoxynalromtm sibiricum gen. nov., sp. nov. alkaliphilic saccharolytic anaerobe from cellulosolytic community of Nizhnee Beloe (Transbaikal region). Extremophiles, in press.

66. Geerligs G., P. Schonheit and G. Diekert. 1989. Sodium dependent acetate formation from CO2 in Peptostreptococcusproductus (strain Marburg). FEMS Microbiology Letter 57:253258.

67. Gottschalk G. 1989. Bioenergetics of methanogenic and acetogenic bacteria, p. 383-396. In: H.G.Schlegel and B. Bowien (ed.), Autotrophic bacteria. Science Tech Publishers, Madison, Wis.

68. Gottwald M., J.R. Andreesen, J. LeGall and L.G. Ljungdahl. 1975. Presence of cytochrome and menaquinone in Clostridium formicociceticum and Clostridium thermoaceticum. Journal of Bacteriology 122:325-328.

69. Grant W.D. and B.E. Jones. 2000. Alkaline environments, v.l, p. 126-133. In: Lederberg J. (ed.), Encyclopedia of microbiology, New-York: Academic Press.

70. Grant W.D., W.E. Mwatha and B.E. Jones. 1990. Alkaliphiles: ecology, diversity and applications. FEMS Microbiology Reviews 75:255-270.

71. Guffanti A.A., R.F. Bornstein, T.A. Krulwich. 1981. Oxidative phosphorylation by membrane vesicles from Bacillus alcalophilus. Biochimica et Biophysica Acta 635:619-630.

72. Hamaide F., D.J. Kushner, and G.D. Sprott. 1983. Proton motive forse and Na+/H+ antiport in a moderate halophile. Journal of Bacteriology 156:537-544.

73. Heise R., J. Reidlinger, V. Muller and G. Gottschalk. 1991. A sodium-stimulated ATP synthase in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. FEBS 295:119-122.

74. Heise R., V. Muller and G. Gottschalk. 1989. Sodium dependence of acetate formation by the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. Journal of Bacteriology 171(10):5473-5478.

75. Horikoshi K. 1999. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63(4):735-750.

76. Hu S.I., E. Pezacka, and H.G. Wood. 1984. Acetate synthesis from carbon monoxide by Clostridium thermoaceticum. Purification of the corrinoid protein. The Journal of Biological Chemistry 259:8892-8897.

77. Hugenholtz J. and L.G. Ljungdahl. 1989. Electron transport and electrochemical proton gradient in membrane vesicles of Clostridium thermoautotrophicum. Journal of Bacteriology 171(5):2873-2875.

78. Imhoff J.F. 1986a. Survival strategies of microorganisms in extreme saline environments. Adv. Space Res. 6(12):299-306.

79. Imhoff J.F. 1986b. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria. FEMS Microbiology Reviews 39:57-66.

80. Imkamp F. and V. Muller. 2002. Chemiosmotic energy conservation with Na+ as the coupling ion during hydrogen-dependent caffeate reduction by Acetobacterium woodii. Journal of Bacteriology 184(7): 1947-1951.

81. Jones B.E., W.D. Grant, A.W. Duckworth and G.G. Owenson. 1998. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles 2:191-200.

82. Jones B.F., H.P. Eugster and S.L. Rettig. 1977. Hydrochemistry of the lake Magadi basin, Kenya. Geochimica et Cosmochimica Acta 41:53-72.

83. Kamekura M. 1986. Production and function of enzymes of eubacterial halophiles. FEMS Microbiology Reviews 39:145-150.

84. Kamekura M. and H. Onishi. 1982. Cell-associated cations of the moderate halophile Micrococcus varians spp. halophilus grown in media of high concentrations of LiCl, NaCl, KC1, RbCl or CsCl. Canadian Journal of Microbiology 28:155-161.

85. Kerby R. and J.G. Zeikus. 1983 . Growth of Clostridium thermoaceticum on H2/CO2 or CO as energy source. Current Microbiology 8:27-30.

86. Kevbrin V.V. and G.A. Zavarzin. 1992. Effect of sulfur compounds on the growth of the halophilic homoacetic bacterium Acetohalobium arabaticum. Microbiology 61:563-567.

87. Kevbrin V.V., T.N. Zhilina, F.A. Rainey and G.A. Zavarzin. 1998. Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits. Current Microbiology 37:94-100.

88. Khmelenina V.N., M.G. Kalyuzhnaya, N.G. Starostina, N.E. Suzina, Yu.A. Trotsenko. 1997. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes. Current Microbiology 35:257-261.

89. Kitada M., A.A. Guffanti, T.A. Krulwich. 1982. Bioenergetic properties and viability of alkalophilic Bacillus firmus RAB as a function of pH and Na+ contents of the incubation medium. Journal ofBacteriology 152(3): 1096-1104.

90. Krulwich T.A. and A.A. Guffanti. 1989. Alkalophilic bacteria. Annual Reviews of Microbiology 43:435-463.

91. Krulwich T.A., J. Cheng, A.A. Guffanti. 1994. The role of monovalent cation/proton antiporters in Na+-resistance and pH homeostasis in Bacillus-, an alkaliphile versus a neutralophile. Journal of Experimental Biology 196:457-470.

92. Krulwich T.A., M. Ito, A.A. Guffanti. 2001. The Na+-dependence of alkaliphily in Bacillus. Biochimica et Biophysica Acta 1505:158-168.

93. Krulwich T.A., M. Ito, D.B. Hicks, R. Gilmour, A.A. Guffanti. 1998. pH homeostasis and ATP synthesis: studies of two processes that necessitate inward proton translocation in extremely alkaliphilic Bacillus species. Extremophiles 2(3):217-222.

94. Krulwich T.A., M. Ito, R. Gilmour, M.G. Sturr, A.A. Guffanti, D.B. Hicks. 1996. Energetic problems of extremely alkaliphilic aerobes. Biochimica et Biophysica Acta 1275:21-26.

95. Kushner D.J. 1986. Molecular adaptation of enzymes, metabolic systems and transport systems in halophilic bacteria. FEMS Microbiology Reviews 39:121-127.

96. Lang E. and H. Lang. 1972. Spezifische Farbreaktion zum direkten Nachweis der Ameisensaüre. Fresenius'Z Anal. Chem. 260:8-10.

97. Lanyi J.K. 1974. Salt-dependent properties of proteins from extremely halophilic bacteria. Bacteriological Reviews 38(3):272-290.

98. Lanyi J.K., and R.E. MacDonald. 1976. Existence of electrogenic hydrogen ion/sodium ion antiport in Halobacterium halobium cell envelope vesicles. Biochemistry 15(21):4608-4614.

99. Larsen, H. 1962. Halophilism, p. 297-342. In I.C. Gunsalus and R.Y. Stanier (ed.), The bacteria, vol. 4. Academic Press, Inc., New York.

100. Larsen, H. 1986. Halophilic and halotolerant microorganisms an overview and historical perspective. FEMS Microbiology Reviews 39:3-7.

101. Liaw H.J., and R.A. Mah. 1992. Isolation and characterization of Haloanaerobacter chitinovorans gen. nov., sp. nov., a halophilic, anaerobic, chitinolytic bacterium from a solar saltern. Applied and Environmental Microbiology 58:260-266.

102. Ljungdahl L.G. 1986. The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria. Annual Reviews of Microbiology 40:415-450.

103. Ljungdahl L.G. 1994. The acetyl-CoA parthway and the chemiosmotic generation of ATP during acetogenesis, p.63-87. In: Drake H.L. (ed.), Acetogenesis, New-York-London: Chapman and Hall.

104. Lovell C.R., A. Przybyla, and L.G. Ljungdahl. 1988. Cloning and expression in Escherichia coli of the Clostridium thermoaceticum gene encoding thermostable formyltetrahydrofolate synthetase. Archives of Microbiology 149:280-285.

105. Lowe S.E., M.K. Jain, and J.G. Zeikus. 1993. Biology,ecology, and biotechnological applications of anaerobic bacteria adapted to environmental stresses in temperature, pH, salinity, or substrates. Microbiological Reviews 57:451-509.

106. Lowry O.H., N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Rendall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193:265-275.

107. Lundie L.L.Jr., and H.L. Drake. 1984. Development of a minimally difined medium for the acetogen Clostridium thermoaceticum. Journal of Bacteriology 149:700-703.

108. Margesin R., and F. Schinner. 2001. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles 5:73-83.

109. Martin D.D., A.C. Rose, and M.F. Roberts. 1999. Osmoadaptation in Archaea. Applied and Environmental Microbiology 65(5):1815-1825.

110. Mayer F., D.M. lvey and L.G. Ljungdahl. 1986. Macromolecular organization of Fi-ATPase isolated from Clostridium thermoaceticum as revealed by electron microscopy. Journal of Bacteriology 166(3): 1128-1130.

111. Menon S. and S.W. Ragsdale. 1999. The role of an iron-sulfur cluster in an enzymatic methylation reaction. The Journal ofBiological Chemistry 274(17): 11513-11518.

112. Mitchell P. 1961. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic mechanism. Nature 191:144-148.

113. Ollivier B., P. Caumette, J-L. Garcia, and R.A. Mah. 1994. Anaerobic bacteria from hipersaline environments. Microbiological Reviews 58:27-38.

114. Onishi H., and K. Sonoda. 1979. Purification and some properties of an extracellular amylase from a moderate halophile, Micrococcus halobius. Applied and Environmental Microbiology 38(4):616-620.

115. Oremland R.S., and G.M. King. 1989. Methanogenesis in hipersaline environments, p.180-190. In Y. Cohen and E. Rosenberg (ed.), Microbial mats: physiological ecology of benthic microbial communities. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

116. Oren A. 1986a. The ecology and taxonomy of anaerobic halophilic eubacteria. FEMS Microbiology Reviews 39:23-29.

117. Oren A. 1986b. Intracellular salt concentrations of the anaerobic halophilic eubacteria Haloanaerobium praevalens and Halobacleroides halobius. Canadian Journal of Microbiology 32:4-9.

118. Oren A. 1993. Ecology of extremely halophilic microorganisms, p. 25-53. In R.H. Vreeland and L.I. Hochstein (ed.), The biology of halophilic bacteria. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.

119. Oren A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63(2):334-348.

120. Oren A. 2002. Diversity of halophilic microorganisms: environments, phylogeny, physiology, and applications. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 28:5663.

121. Oren A., and L. Mana. 2002. Amino acid composition of bulk protein and salt relationships of selected enzymes of Salinibacter ruber, an extremely halophilic bacterium. Extremophiles 6:217-223.

122. Oren A., and P. Gurevich. 1993. The fatty acid synthetase of Haloanaerobium praevalens is not inhibited by salt. FEMS Microbiology Letter 108:287-290.

123. Oren A., M. Heldal, S. Norland, and E.A. Galinski. 2002. Intracellular ion and organic solute concentrations of the extremely halophilic bacterium Salinibacter ruber. Extremophiles 6:491-498.

124. Pezacka E. and H.G. Wood. 1984. Role of carbon monoxide dehydrogenase in the autotrophic pathway used by acetogenic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6261-6265.

125. Pezacka E. and H.G. Wood. 1986. The autotrophic pathway of acetogenic bacteria. Role of CO dehydrogenase disulfide reductase. The Journal of Biological Chemistry 261(4): 1609-1615.

126. Pfenning N. and K.D. Lippert. 1966. Über das Vitamin B-Bedürfnis phototropher Schwefelbakterien. Archives of Microbiology 55:245-246.

127. Ragsdale S.W. 1997. The Eastern and Western branches of the Wood/Ljungdahl pathway: how the East and West were won. BioFactors 6:3-11.

128. Ragsdale S.W. and H.G. Wood. 1985. Acetate biosynthesis by acetogenic bacteria. The Journal of Biological Chemistry 260(7):3970-3977.

129. Reidlinger J. and V. Müller. 1994. Purification of ATP synthase from Acetobacterium woodii and identification as a Na(+)-translocating FiF0-type enzyme. European Journal of Biochemistry 223:275-283.

130. Rengpipat S., S.E. Lowe, and J.G. Zeikus. 1988. Effect of extreme salt concentrations on the physiology and biochemistry of Halobacteroides acetoethylicus. Journal of Bacteriology 170(7):3065-3071.

131. Robertson D.E., D. Noll, M.F. Roberts, J.A.G.F. Menaia, and DR. Boone. 1990. Detection of the osmoregulator betaine in methanogens. Applied and Environmental Microbiology 56(2):563-565.

132. Robertson D.E., M. Lai, R.P. Gunsalus and M.F. Roberts. 1992. Composition, variation, and dynamics of major osmotic solutes in Methanohalophilus strain FDF1. Applied and Environmental Microbiology 58(8):2438-2443.

133. Russell W.K. and P.A. Lindahl. 1998. C0/C02 Potentiometrie titrations of carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum and the effect of C02. Biochemistry 37:10016-10026.

134. Sadler M., M. McAninch, R. Alico, and L.I. Hochstein. 1980. The intracellular Na+ and K+ composition of the moderately halophilic bacterium, Paracoccus halodenitrificans. Canadian Journal of Microbiology 26:496-502.

135. Salvarrey M.S., and J.J. Cazzulo. 1980. Some properties of the NADP-specific malic enzyme from the moderate halophile Vibrio costicola. Canadian Journal of Microbiology 26:50-57.

136. Schäfer G., M. Engelhard, and V. Müller. 1999. Bioenergetics of the Archaea. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63(3):570-620.

137. Shanmugasundaram T. and H.G. Wood. 1992. Interaction of ferredoxin with carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. The Journal of Biological Chemistry 267(2):897-900.

138. Shanmugasundaram T., S.W. Ragsdale, and H.G. Wood. 1988. Role of carbon monoxide dehydrogenase in acetate synthesis by the acetogenic bacterium, Acetobacterium woodii. BioFactors 1(2): 147-152.

139. Skulachev V.P. 1985. Membrane-linked energy transductions. Bioenergetic functions of sodium: H+ is not unique as a coupling ion. European Journal of Biochemistry 151(2): 199-208.

140. Sleator R.D., and C. Hill. 2001. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiology Reviews 26:49-71.

141. Slonczewski J.L. 2000. pH Stress, v.3, p.625-632. In: Lederberg J. (ed.), Encyclopedia of microbiology, New-York: Academic Press.

142. Smigan P., A. Majernik, M. Greksak. 1994. Na+-driven ATP synthesis in Methanobacterium thermoautotrophicum and its differentiation form H+-driven ATP synthesis by rhodamine 6G. FEBS Letter 347:190-194.

143. Sorokin D.Yu., B.E. Jones, J.G. Kuenen. 2000. An obligate methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment. Extremophiles 4(3): 145-155.

144. Speelmans G., B. Poolman and W.N. Konings. 1995. Na+ as coupling ion in energy transduction in extremophilic Bacteria and Archaea. World Journal of Microbiology and Biotechnology 11:58-70.

145. Strunk O. and W. Ludwig. 1995. ARB a software environment for sequence data. Department of Microbiology, Technical University ofMunich, Munich, Germany.

146. Talibart R., M. Jebbar, G. Gouesbet, S. Himdi-Kabbab, H. Wroblewski, C. Blanco, and T. Bernard. 1994. Osmoadaptation in Rhizobia: ectoine-induced salt tolerance. Journal of Bacteriology 176(17):5210-5217.

147. Tanner R.S., L.M. Miller and D. Yang. 1993. Clostridium ljungdahlii sp. nov., and acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. International Journal of Systematic Bacteriology 43:232-236.

148. Teunissen M.J., Marras S.A.E., Op den Camp H.J.M., Vogels G.D. 1989. Improved method for simultaneous determination of alcohols, volatile fatty acids, lactic acid or 2,3-butanediol in biological samples. J. Microbiol. Methods 10(4):247-254.

149. Thauer R.K., K. Jungermann and K. Decker. 1977. Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriological Reviews 41(1): 100-180.

150. Tierney T. 1997. Geology of the Mono Basin. Kutsavi Press, Mono Lake Committee, Lee Vining, California, p. 1-73.

151. Unemoto T., H. Tokuda, M. Hayashi. 1990. Primary sodium pumps and their significance in bacterial energetics. In The Bacteria: A Treatise of Structure and Function, Bacterial Energetics, vol.12 (ed. T.A. Krulwich), pp. 33-54. Orlando: Academic Press.

152. Unemoto T., T. Tsuruoka, M. Hayashi. 1973. Role of Na+ and K+ in preventing lysis of a slightly halophilic Vibrio alginolyticus. Canadian Journal of Microbiology 19:563-571.

153. Veiga M. and F. Gutierrez. 1991. BASIC computer program for the graphic representation of microbial growth curves and batch fermentations. J. Microbiol. Methods 13(l):23-38.

154. Ventosa A., and J.J. Nieto. 1995. Biotechnological application and potentialities of halophilic microorganisms. World Journal of Microbiology and Biotechnology 11:85-94.

155. Ventosa A., J.J. Nieto, and A. Oren. 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(2):504-544.

156. Vreeland R.H. and E.L. Martin. 1980. Growth characteristics, effects of temperature, and ion specificity of the halotolerant bacterium Halomonas elongata. Canadian Journal of Microbiology 26:746-752.

157. Wieringa K.T. 1936. Over het verdwijnen van waterstof en koolzuur onder anaerobe voorwaarden. Antonie van Leeuwenhoek 3:263-273.

158. Wolin E.A., M.J. Wolin, R.S. Wolfe. 1963. Formation of methane by bacterial extracts. Journal of Biological Chemistry 238:2882-2886.

159. Wood H.G. 1991. Life with CO or CO2 and H2 as a source of carbon and energy. FASEB Journal 5:156-163.

160. Xu Y., P.J. Zhou, and X.Y. Tian. 1999. Characterization of two novelhaloalkaliphilic archaea Natronorubrum bangense gen. nov., sp. nov., and Natronoritbrumttibetense gen. nov., sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 49:261-266.

161. Yang H. and H.L. Drake. 1990. Differential effects of sodium on hydrogen- and glucose-dependent growth of the acetogenic bacterium Acetogenium kivui. Applied and Environmental Microbiology 56(l):81-86.

162. Yang S.-S., L.G. Ljungdahl, D.V. DerVartanian and G.D. Watt. 1980. Isolation and characterization of two rubredoxins from Clostridium thermoaceticum. Biochimica et Biophysica Acta 590:24-33.

163. Yumoto I., K. Yamazaki, T. Sawabe, K. Nakano, K. Kawasaki, Y. Ezura and H. Shinano. 1998. Bacillus horti sp. nov., a new gram-negative alkaliphilic bacillus. International Journal of Systematic Bacteriology 48:565-571.

164. Zavarzin G.A. and T.N. Zhilina. 2000. Anaerobic chemotrophic alkaliphiles, p. 191208. In: Seckbach J. (ed.), Journey to diverse microbial worlds. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers.

165. Zhilina T.N. and G.A. Zavarzin. 1994. Alkaliphilic anaerobic community at pH 10. Current Microbiology 29:109-112.

166. Zhilina T.N., E.N. Detkova, F.A. Rainey, G.A. Osipov, A.M. Lysenko, N.A. Kostrikina and G.A. Zavarzin. 1998. Natronoincola histidinovorans gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic acetogenic anaerobe. Current Microbiology 37:177-185.

167. Zhilina T.N., G.A. Zavarzin, E.N. Detkova and F.A. Rainey. 1996a. Natroniella acetigena gen. nov., sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales. Current Microbiology 32:320-326.

Информация о работе

Деткова, Екатерина Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Физиология, биохимия и биоэнергетика галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы