Культивируемые аэробные бактерии из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей

Корсакова, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивируемые аэробные бактерии из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Культивируемые аэробные бактерии из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей"

На правах рукописи

КОРСАКОВА Екатерина Сергеевна

КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ ИЗ РАЙОНА ПРОМЫШЛЕННЫХ РАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 МАР 2014

Пермь-2014

005546410

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Плотникова Елена Генриховна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзиматической деградации органических соединений ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина РАН Соляникова Инна Петровна

доктор медицинских наук, начальник отделения препаратов бактериотерапии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» Несчисляев Валерий Александрович

Ведущая организация: ФГБУН Институт биохимии и физиологии

растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

Защита диссертации состоится «17» апреля 2014 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 при ФГБУН Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс:(342)2809211.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат диссертации разослан «У/ » марта 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Галофильные и галотолерантные микроорганизмы входят в состав трех доменов Bacteria, Archaea и Еикагуа и широко распространены в природных (океаны и моря, гиперсоленые озера, солончаковые почвы и т.д.) и различных антропогенных экосистемах с повышенным уровнем минерализации (Oren, 2008; Benlloch et al., 2002; Hedí et al., 2009; Jiang et al., 2006; Singh, 2012; Xiang et al., 2008). Галофилия и галотолерантность микроорганизмов обусловлены определенными механизмами их противостояния к воздействиям высоких концентраций солей, например, накоплением неорганических ионов внутри клеток или активным удалением солей из цитоплазмы за счет высоких концентраций синтезируемых органических молекул (осмолитов).

Район промышленных разработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых и натриевых солей (ВКМКС) (г. Березники, г. Соликамск, Пермский край) объединяет как природные, так и антропогенные, сформировавшиеся в процессе добычи солей, микробиоценозы. ВКМКС представляет собой многопластовую толщу соленосных отложений с пластами сильвинита и каменной соли (Белкин, 2008). При промышленной добыче и переработке солей на поверхности складируются отходы производства в шламохранилищах и галитовых отвалах, содержание хлорида натрия в последних составляет более 90%. Растворение материала солеотвалов приводит к появлению вокруг них зон засоления радиусом до 5 м, а в понижениях, прилегающих к подножью, образуются озера с соленой водой (рассолосборники) (Бабошко, Бачурин, 2009; Шубин, 2005). Кроме того, в отходах (глинисто-солевых шламах, избыточных маточных рассолах) предприятий соледобывающего производства ОАО «Уралкалий» были обнаружены стойкие органические загрязнители, а именно моно(поли)ароматические углеводороды и их производные, галогенсодержащие органические соединения и фталаты (Бачурин, Одинцова, 2009). Данные соединения устойчивы к внешним воздействиям, токсичны для человека, обладают канцерогенными свойствами и оказывают негативное воздействие на биосферу в целом (http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tpl7.html). При комплексной нагрузке абиотических факторов в районах соледобычи возникают условия для формирования уникальных сообществ галофильных и галотолерантных микроорганизмов, в том числе способных разлагать экотоксиканты.

Ранее из почв района солеразработок ВКМКС были выделены и охарактеризованы бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов (нафталина, фенантрена) родов Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus (Плотникова и др., 2001, 2011; Ястребова и др., 2009). В составе полученного из техногеннозасоленной/загрязненной почвы консорциума, метаболизирующего нафталин, выявлены галотолерантные деструкторы рода Rhodococcus и галофильные бактерии сем. Halomonadaceae, представители которых были описаны в качестве нового рода Salinicola (Ананьина и др., 2007). Описаны новые таксоны архей и прокариот, выделенные из продуктов флотационного обогащения калийных минералов и техногенных вод шламохранилища ОАО «Уралкалий» (Реутских, Саратов, 2012; Саратов и др., 2012а; Саралов и др., 20126; Saralov et al., 2013).

Вместе с тем, до настоящего времени не была проведена комплексная оценка таксономического (филогенетического) и функционального разнообразия микроорганизмов из природных (ископаемых залежей солей) и техногенных экосистем района разработок ВКМКС. Следует отметить, что галофильные и галотолерантные

бактерии характеризуются высоким биотехнологическим потенциалом. Так, осмопротекторные соединения, накапливающиеся клетками для их стабилизации и защитного эффекта, нашли широкое применение в косметической промышленности, а также в качестве криопротекторов (Garrity et al., 2005). Кроме того, солеустойчивые бактерии, способные разлагать широкий спектр ароматических соединений, перспективны для разработки экобиотехнологий (например, для очистки почв, донных отложений, шламов, характеризующихся высоким уровнем солености) (Singh, 2012). Поэтому исследование культивируемых бактерий с уникальными физиолого-биохимическими свойствами с целью их дальнейшего использования в биотехнологических целях является важным и перспективным направлением исследований.

Цель настоящего исследования - изучение таксономического и функционального разнообразия аэробных органотрофных бактерий из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей.

Основные задачи исследования

1. Выделение и идентификация аэробных бактерий из ископаемых залежей солей и техногенных экосистем территории промышленных разработок ВКМКС.

2. Оценка таксономического (филогенетического) разнообразия галофильных бактерий сем. Halomonadaceae из подземных (природных) и наземных (техногенных) экосистем района солеразработок.

3. Исследование бактериального состава ризосферы растений, произрастающих на засоленных почвах территории калийного производства (г. Соликамск).

4. Характеристика аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов моно(поли)ароматических соединений, выделенных из отходов (техногенно-минеральных образований) калийного производства (г. Березники).

Научная новизна

Впервые изучено таксономическое (филогенетическое) разнообразие галофильных бактерий в подземных соляных залежах и наземных техногенных объектах промышленных разработок солей на территории России (Верхнекамское месторождение солей, Пермский край). Обнаружены представители 40 родов (более 120 видов) бактерий, входящих в состав 24 семейств 4 филумов: «Proteobacteria», vActinobacteria», «Bacteroidetes» и «Firmicutes». Выявлены потенциальные представители новых родов и видов в составе классов Flavobacteriia и Gammaproteobacteria. Показано повсеместное распространение на территории ВКМКС (в ископаемых залежах солей, продуктах их технологической обработки, отходах производства и техногеннозасоленных почвах) протеобактерий семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria). Представители рода Chromohalobacter (сем. Halomonadaceae) доминировали в образцах руд (сильвинит, каменная соль) и наземных высокоминерализованных образцах (гапитовые отходы, донные отложения рассолосборников). Обнаружены бактерии порядка Actinomycetales, являющиеся активными деструкторами ароматических углеводородов, присутствующих в отходах солепроизводства. Выделен и описан галотолерантный штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ АС 2631D), деструктор моно(поли)ароматических углеводородов.

Теоретическое и практическое значение работы

и натриевых солей. Информация о бактериальных культурах, способных к деструкции ароматических соединений (стойких органических загрязнителей) при высокой минерализации среды, может быть использована как основа для создания новых подходов к разработке методов биоремедиации экстремальных экосистем. Создана рабочая коллекция галотолерантных/галофильных бактерий (157 штаммов), перспективных для фундаментальных исследований и использования в биотехнологиях. Штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, перспективный для разработки новых экобиотехнологий, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ АС 2631D. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК 12 штаммов бактерий, выделенных из ризосферы растений, произрастающих на засоленных почвах района соледобычи, депонированы в базе данных GenBank под номерами KF010924 - 28, КС992726 -31, КС538827.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Галофильные бактерии семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria) имеют повсеместное распространение в районе промышленных разработок ВКМКС (Пермский край) - как в ископаемых залежах солей, так и на техногеннозасоленных территориях. Доминирующими культивируемыми бактериями в образцах руд (сильвинит, каменная соль) и наземных высокоминерализованных объектах (галитовые отходы, донные отложения рассолосборников) являются представители рода Chromohalobacter.

2. Техногенное засоление почвы оказывает влияние на формирование микробного сообщества ризосферы растений, произрастающих в районе складирования отходов предприятия ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск, Пермский край). Доминирующими группами в ризосфере являются бактерии семейства Halomonadaceae (родов Halomonas и Salinicolá) и галотолерантные бактерии классов Actinobacteria и Bacilli.

3. В отходах (техногенно-минеральных образованиях) калийного производства (г. Березники, Пермский край) преобладают актинобактерии порядка Actinomycetales -деструкторы токсичных органических соединений. Штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ АС 2631D) способен разлагать нафталин, o/jmo-фталевую и бензойную кислоты в присутствии повышенных концентраций хлорида натрия.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на II, III и V Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия», Пермь, 2009, Нижний Новгород, 2010, Тверь, 2012; Международной Научной Конференции «Микробиологическая биотехнология - наукоемкое направление современных знаний», Кишинев, Молдова, 2011; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; 14-й, 16-й и 17-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010, 2012, 2013; Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии», Пущино, 2012; VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; VIII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012; Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2013»,Тула, 2013; 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 2013.

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 25 таблиц и 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 172 литературных источника, из них 47 на русском и 125 на английском языках. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека» (номер гос. регистрации НИР 01201353247). Исследования поддержаны проектом Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (номер гос. регистрации в ЦИТиС №01200963682), грантом РФФИ-Урал №11-04-96028-р_урал_а, а также научным проектом молодых ученых УрО РАН №13-4-НП-448. Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Объекты исследования. Из района ВКМКС на территории соледобывающих предприятий ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск, г. Березники, Пермский край) в июне 2008 г., 2011 г. были отобраны образцы галитовых отходов, грунта около солеотвалов, образцы воды и донных отложений рассолосборника (рисунок 1).

1600

| 1400

§ 1200

+■ 1000 z

g 800

| 600

I 400 Ï

| 200 о

Рисунок 1. Концентрация ионов N8* в исследуемых образцах, отобранных на территории промышленных разработок ВКМКС: / - галитовые отходы, 2 - грунт, 3 - сильвинит, 4 - каменная соль, 5 - дно рассолосборника, б - вода рассолосборника, 7 - ТМО, 8 - почва (ризосфера растений).

Образцы руды (каменной соли и сильвинита) и техногенно-минеральных образований (ТМО) из шламоотстойников соледобывающих производств были предоставлены сотрудниками ФГБУН Горного института УрО РАН (отбор проб осуществляли в 2009 году). В июне 2008, 2011, 2012 гг. были отобраны образцы ризосферы растений, доминирующих вблизи солеотвалов (г. Соликамск): ястребинка зонтичная (Hieracium umbellatum L.), вероника дубравная (Veronica chamaedrys), торичник солончаковый (Spergularia salina J. & С.), мятлик луговой (Роа pratensis L.), марь красная (Chenopodium rubrum L.), мать-и-мачеха обыкновенная (Tussilage farfara), нивяник обыкновенный {Leucanthemum vulgaré). Концентрация ионов Na+ в образцах ризосферы составляла 0,34 - 10,52 мг-экв/100г (или 78,2 - 2419,6 мг/кг). Почва, отобранная на расстоянии 1600 м от солеотвала СКПРУ-1 (контрольный вариант), содержала Na+ в концентрации 0,02 мг-экв/100 г (4,6 мг/кг).

Среды и условия культивирования. Для выделения и роста галофильных и галотолерантных бактерий была использована минеральная среда Раймонда (MCP) (Raymond, 1961). Содержание хлорида натрия в среде варьировалось от 30 до 200 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (БСР) в MCP добавляли триптон («Difco», США) (5 г/л) и дрожжевой экстракт («Difco», США) (2,5 г/л). Для выделения и роста бактерий-деструкторов в качестве субстрата использовали нафталин, орто-фталевую (орто-ФК) или бензойную (БК) кислоты в концентрации 1 г/л. При выделении галофильных микроорганизмов использовали среду АТСС 213 «Halobacterium medium» (200 г/л NaCl) (www.atcc.org/-~/media/2DB3DC353ECE44A6BDB7CA5965614347.ashx).

Выделение микроорганизмов проводили методом прямого высева на агаризованную БСР (30 и 50 г/л NaCl), а также методом накопительного культивирования (НК) на среде MCP (30 г/л NaCl) с нафталином, орто-ФК и БК (1 г/л) в качестве ростовых субстратов, и на среде АТСС 213 «Halobacterium medium» (200 г/л NaCl).

Изучение ростовых характеристик бактерий. Параметры роста выделенных бактерий изучались в периодической культуре. Бактерии выращивались на MCP и БСР в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем среды - 100 мл) при 28°С и аэрации на шейкере (100 об/мин). Оптическую плотность (ОП) культуральной жидкости определяли на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм. Расчет удельной скорости роста (ц), времени удвоения (td) и длительность /og-фазы (Ti) проводили по стандартным формулам (Нетрусов и др., 2005).

Разложение ароматических углеводородов бактериями. Утилизацию орто-ФК и БК определяли по изменению концентрации ароматических субстратов в среде при периодическом культивировании в MCP. Концентрация соединений оценивалась при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Егорова и др., 2010).

Качественный и количественный анализ продуктов бактериальной деструкции орто-ФК и БК проводили в опытах с «отмытыми» клетками с применением ВЭЖХ и спектрофотометрии (Егорова и др., 2010).

Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий изучали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983).

Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров: 27F (5' -AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTC AG-3' ) и 1492R (5' - ACGG(C/T)TACCTTGTTACG АСТТ-3 ' ) на амплификаторе My Cycler («Bio-Rad Laboratories», США), как описано (D.J. Lane, 1991).

Амплификацию функциональных генов с использованием тотальной ДНК исследуемых штаммов и функциональных праймеров, комплементарных консервативным участкам генов benA, рсаН, phtAa, phtB, narAaAb осуществляли на приборе MyCycler («Bio-Rad Laboratories», США), как описано в работах (Anan'ina et al., 2011; Stingley et al., 2004; Baggi et al., 2008).

Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США) в Научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и генетики Естественнонаучного института при Пермском государственном национальном исследовательском университете.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner vi.О, сравнивая с гомологичными нуклеотидными последовательностями из баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).

ДНК-типирование. REP-ПЦР (полимеразную цепную реакцию повторяющихся экстрагенетических палиндромных последовательностей ДНК) и ВОХ-ПЦР (полимеразную цепную реакцию повторяющихся Вох-элементов) проводили согласно методу (Versalovic et al., 1994). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле на 1х буфере TBE в течение 2 часов при напряжённости электрического поля 5,7 V/cm.

Плазмидную ДНК выявляли методом пульс-электрофореза с использованием прибора CHEF DR II («Bio-Rad Laboratories», США) согласно рекомендациям производителя.

Статистическая обработка результатов. Повторность опытов трёхкратная. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал. Для обработки результатов использовали статистический модуль Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Бактерии, выделенные из образцов сильвинита и каменной соли (рудник СКПРУ-1, ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)

Методом накопительного культивирования на среде АТСС 213 «Halobacterium medium» (200 г/л NaCl) из образцов сильвинита было изолировано 5 штаммов бактерий и 2 штамма - из образцов каменной соли. Сравнение фингерпринтов, полученных методом ПЦР повторяющихся ВОХ-элементов, штаммов сходных морфогрупп, изолированных как из образцов сильвинита (штаммы ТС101, ТС111, ТС112, ТС132), так и из образцов каменной соли (штамм ТС121), показало гомологичность их профилей (формируют одну геномогруппу). Ко второй геномогруппе были отнесены идентичные по фингерпринтам штаммы ТС 11 (образец сильвинита) и ТС 122 (образец каменной соли).

Представители каждой геномогруппы были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (таблица 1). Установлено, что исследуемые штаммы являются представителями семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria филума «Proteobacteria») и имеют высокий уровень сходства с видами Chromohalobacter canadensis и Chromohalobacter japonicus.

Изолированные штаммы рода Chromohalobacter способны к росту в диапазоне концентраций соли от 20 г/л до 250 г/л и pH 7,0 в среде культивирования, что подтверждает физиологические параметры роста умеренно галофильных бактерий рода Chromohalobacter (Ventosa et al., 1989).

Таблица 1

Результаты филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерий, выделенных из образцов сильвинита и каменной соли

Штамм Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных GenBank Сходство генов 16S рРНК, % Кол-во нуклео-тидов

С2 Bacillus licheniformis DSM137 (СР000002) 100 800

ТС11 Chromohalobacter canadensis АТСС 43984T (AJ295143) 99,9 1372

ТС101 Chromohalobacter japonicus 43T (AB105159) 99,7 1407

В результате накопительного культивирования на БСР (50 г/л NaCl) из образца каменной соли был выделен единственный штамм С2, имеющий 100% сходство с типовым штаммом Bacillus licheniformis DSM13T (таблица 1). Установлено, что данный штамм является галотолерантным организмом, способным к росту на среде БСР как в отсутствие хлорида натрия в среде, так и в присутствии NaCl до 130 г/л. Штамм С2 растет при рН 6,0-8,0.

2. Бактерии, выделенные из галитовых отходов района солеразработок (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)

При изучении образцов галитовых отходов (солеотвалы СКПРУ-1 и СКПРУ-2) методом НК на средах БСР и АТСС 213 «Halobacterium medium» было выделено и идентифицировано 7 штаммов бактерий. Анализ фингерпринтов изолятов ТС52 и ТС512 показал гомологичность ВОХ-профилей этих штаммов не только между собой, но и с ранее выделенным из залежей солей штаммом Chromohalobacter sp. ТС101. Штаммы ТС71, ТС72, ТС732, ТС91, изолированные из образцов галитовых отходов, имеют гетерогенные ВОХ-фингерпринты.

Шесть штаммов бактерий на основании анализа гена 16S рРНК были близкородственны видам Chromohalobacter canadensis и Chromohalobacter japonicus. Штамм С31 показал наибольшее филогенетическое сходство (99,7%) со штаммом вида Streptomyces ambofaciens (порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria, филум «Actinobacteria») (таблица 2).

Таблица 2

Результаты филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерий, выделенных из галитовых отходов

С31 Streptomyces ambofaciens HBUM 174708т (AB184182) 99,7 1400

ТС71 Chromohalobacter canadensis АТСС 43984T (AJ295143) 99,9 1335

ТС72 Chromohalobacter canadensis АТСС 439847 (AJ295143) 99,9 1391

ТС732 Chromohalobacter canadensis АТСС 439847 (AJ295143) 99,9 1392

ТС52 Chromohalobacter japonicus 43T (AB 105159) 99,7 1395

ТС91 Chromohalobacter canadensis АТСС 439847 (AJ295143) 99,9 1402

Три изолята рода Chromohalobacter (штаммы ТС71, ТС72 и ТС732) являются наиболее солеустойчивыми (диапазон роста при концентрации NaCl в среде культивирования составлял 20-300 г/л). Другие штаммы этого рода (ТС52, ТС512 и ТС91) растут при меньшем содержании соли в среде культивирования (20-250 г/л). Галотолерантный изолят Streptomyces sp. С31 способен к росту при содержании соли 0-30 г/л и значении pH 6,0-8,0.

Доминирующей группой в изученных образцах галитовых отходов, в которых концентрация ионов Na+ составляла 471,41-1812,68 мг-экв/100г (108330-416990 мг/кг), являются бактерии рода Chromohalobacter (сем. Halomonadaceae). Подобная картина наблюдалась и при изучении микробного сообщества ископаемых залежей солей. Внимания заслуживает тот факт, что штаммы, выделенные из галитовых отходов, показали свою идентичность с бактериальными изолятами из породы сильвинита и каменной соли по филогенетическому анализу и сравнению фингерпринтов, полученных методом ВОХ-ПЦР. Данный факт может свидетельствовать о том,

что галофильные бактерии семейства Halomonadaceae происходят из пород каменной соли, сильвинита и далее сохраняются в галитовых отходах.

3. Бактерии из образцов грунта, отобранных вблизи солеотвалов Соликамского рудоуправления (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)

Из исследуемых образцов грунта, отобранных на расстоянии 1-2 метров от солеотвала (концентрация Na+ 1325,74 мг-экв/100 г, что соответствует 304980 мг/кг) методом НК на средах БСР и АТСС 213 «Halobacterium medium» были изолированы 6 штаммов грамотрицательных и эндоспоровых бактерий (таблица 3). Анализ REP-профилей геномной ДНК бактерий показал, что штаммы К511 и К513 формируют одну геномогруппу. Сравнение ВОХ-фингерпринтов штаммов ТС31, ТС32 и бактерий, выделенных из залежей калийно-магниевых солей, галитовых отходов, показало, что штамм ТС32 из образца грунта СКПРУ-2 имел идентичный профиль со штаммом Chromohalobacter sp. ТС91, изолированным из галитовых отходов солеотвала СКПРУ-1.

Определение филогенетического положения на основании анализа генов 16SpPHK показало, что штаммы К51 и К52 относятся к родам Bacillus и Virgibacillus (класс Bacilli), штамм К511 - к роду Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria). Штаммы ТС31 и ТС32 были наиболее близки к Chromohalobacter canadensis (сем. Halomonadaceae) (таблица 3).

Таблица 3

Результаты филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерий, выделенных из образцов грунта

К51 Bacillus alcalophilus ТСС11004T(X76436) 99,5 1400

К511 Pseudomonas putida АТСС 12633T (D84020) 99,0 1400

К52 Virgibacillus picturae DSM 14867T(AJ315060) 99,5 1400

ТС31 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1401

ТС32 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1389

Штаммы Chromohalobacter spp. ТС31 и ТС32 растут при содержании соли 20-250 г/л в среде культивирования. Штаммы Pseudomonas sp. К511 и К513 растут в диапазоне концентраций 0-50 г/л NaCl и при pH 6,0-8,0. Bacillus sp. К51 и Virgibacillus sp. К52 способны к росту от 0 до 100 г/л NaCl и pH 6,0-8,0 в среде культивирования.

Помимо бактерий рода Chromohalobacter, выявленных также в залежах калийно-магниевых солей и галитовых отходах (таблица 1, 2), в исследованных образцах грунта были обнаружены характерные для почвенной микробиоты бактерии рода Pseudomonas (штаммы К511 и К513), наиболее близкие к типовому штамму Pseudomonas putida (таблица 3).

4. Бактерии, выделенные из образцов воды, соляных отложений со дна рассолосборника (СКПРУ-2, ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)

Из образцов рассолосборника (вода, донные солевые отложения) методом НК было изолировано 10 галофильных штаммов микроорганизмов, различающихся морфологией колоний при росте на агаризованных средах: БСР (150 г/л NaCl) и АТСС 213 «Halobacterium medium» (200 г/л NaCl). Сравнение REP-ПЦР профилей

фрагментов геномной ДНК выделенных штаммов показало, что штаммы В201 и В202 имеют идентичные ЯЕР-фингерпринты, а изолят В151 отличается от них. Подробный анализ фрагментов геномной ДНК, полученных методом ВОХ-ПЦР, показал, что морфологически схожие изоляты из одного образца солевых отложений рассолосборника ТС21 и ТС23 принадлежат одной геномогруппе и отличаются от изолята ТС22.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16БрРНК показал, что все выделенные штаммы являются представителями класса Саттарго1еоЬас1ег1а (таблица 4). Кроме бактерий рода Скгото\ш1оЬас1ег, обнаруженных в высокоминерализованных образцах района разработок ВКМКС (таблица 1, 2, 3), были выделены штаммы, близкородственные бактериям рода Мютагта (штаммы В152, В153). Ранее бактерии данного рода были изолированы только из природных морских экосистем (ЬИр://уугту.Ьас1егю.пе1ЛШотаппа.Ь1:т1). Штаммы ТС42 и ТС62 имели низкий процент сходства по гену 168рРНК (93,8 % и 93,4 %, соответственно) с типовым штаммом БаИтврЪаега Иус/гоЛегтаИя, поэтому можно предположить, что данные культуры представляют собой новые таксономические единицы, требующие более подробного изучения (таблица 4).

Таблица 4

Результаты филогенетического анализа (ген 168 рРНК) бактерий,

выделенных из образцов рассолосборника

Штамм Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных ОепВапк Сходство генов 16S pPHK,% Кол-во нуклео-тидов

Вода рассолосборника

В151 Chromohalobacter canadensis АТСС 43984т (AJ295143) 99,4 1400

В152 Idiomarina loihiensis L2TRT(AF288370) 99,0 1370

В201 Chromohalobacter canadensis АТСС 43984T (AJ295143) 99,4 1400

ТС42 Salinisphaera hydrothermalis EPR70T (EU740416) 93,8 1356

Дно (солевые отложения) рассолосборника

ТС21 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1390

ТС22 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1374

ТС23 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1398

ТС62 Salinisphaera hydrothermalis EPR70T (EU740416) 93,4 1331

Примечание. Цветом выделены штаммы, претендующие на описание в качестве новых таксонов.

Все изолированные микроорганизмы являются галофильными. Штаммы Idiomarina sp. В152 и В153 растут при концентрации соли 20-100 г/л. Штаммы Chromohalobacter spp. В151, В201, В202, изолированные из образцов воды рассолосборника с концентрацией ионов Na+ 181,07 мг-экв/100 г (соответствует 41630 мг/кг), способны к росту при содержании соли 20-150 г/л, в то же время штаммы Chromohalobacter sp. ТС21, ТС22, ТС23, изолированные из донных (солевых) отложений (рисунок 1) растут при более высокой концентрации NaCl (20-300 г/л). Рост штаммов наблюдался при значении рН 7,0-7,5.

Так же как и в других исследуемых образцах района солеразработок в образцах рассолосборника были обнаружены бактерии семейства Halomonadaceae. Все они имели наибольший уровень сходства по гену 16SpPHK (от 99,4% до 99,9%) с типовым штаммом Chromohalobacter canadensis. В то же время штаммы отличались на генотипическом уровне (ВОХ-фингерпринты) от изолятов рода Chromohalobacter из других экотопов, что говорит об их индивидуальности.

5. Бактерии из образцов ризосферы растений, произрастающих на территории солеразработок (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)

Из образцов ризосферы 7 видов растений: ястребинки зонтичной, вероники дубравной, торичника солончакового, мятлика лугового, мари красной, мать-и-мачехи обыкновенной, нивяника обыкновенного, доминирующих в районах соледобычи, методами НК (БСР, 150 г/л NaCl) и прямого высева на агаризованную БСР (50 г/л NaCl) было выделено 63 штамма бактерий, различающихся морфологией колоний при росте на агаризованных средах. Их идентификация была проведена на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (таблица 5).

Таблица 5

Результаты филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерий, выделенных из ризосферы растений

Ризосфера мятлика лугового

Незаселенная почва

МВС2 Pseudomonas baetica а390т (FM201274) 99,3 876

МВС4 Pseudomonas mandelii С1Р 105273х (AF058286) 99,6 827

МВСб Micro bacterium maritypicum DSM12512T(AJ853910) 99,6 611

МВС8 Pseudomonas reinekei Mt-1T(AM293565) 98,6 753

Засоленная почва

M45-1N Kocuria polaris CMS 76orT(AJ278868) 99,7 743

M45-2N Halomonas ventosae AI 12T (AY268080) 99,4 1385

M45-6N Zhihengiiuelia halotolerans YIM 70185T(DQ372937) 99,9 807

М46-7 Alleromonas hispanica F-32T (AY926460) 96,7 1337

М46-11 Isoptericola halotolerans YIM 70177T(AY789835) 99,1 784

М47-1 Kushneria marisflavi SW32T(AF251143) 98,7 1404

М47-2 Microbacterium profundi Shh49T(EF623999) 98,7 1314

M55-1N Streptomyces griseoplanus AS 4.1868T (AY999894) 100 815

M55-2N Nesterenkonia halotolerans YIM 70084T (AY226508) 100 927

M55-6N Micrococcus endophytics YIM 56238T(EU005372) 99,9 726

М56-8 Leeuwenhoekiella marinoßava LMG 1345T(AF203475) 97,7 1318

M65-1N Rhizobium selenitireducens B1T(EF440185) 97,7 1257

M65-2N AItererythrobacter indicus MSSRF26T(DQ399262) 99,3 841

M65-3N Thalassospira lucentensis DSM 14000T (AM294944) 98,2 1320

M65-4N Rhizobium sphaerophysae CCNWGS0238T(FJ154088) 97,6 1317

M65-5N Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T (AB 176954) 99,2 1344

M75-1N Bacillus aquimaris TF-12T(AF483625) 99,1 1286

M75-3N Bacillus thioparans BMP-1T(DQ371431) 99,9 837

M95-1N Planomicrobium koreense JG07T(AF144750) 99,8 881

M95-3N Paracoccus homiensis DD-Rl 1T(DQ342239) 99,0 817

M95-7N Auranlimonas coralicida WP1T (AJ786361) 99,9 913

МН46-1 Kushneria marisflavi SW32T(AF251143) 98,7 1390

МН46-2 Halomonas sulfidaeris ATCC BAA-8037 (AF212204) 98,8 1350

МН96-1 Halobacillus profundi IS-Hb4T (AB 189298) 99,0 1358

MH4R1 Halomonas sulfidaeris ATCC BAA-8037 (AF212204) 99,1 1233

MH4R2-1 Idiomarina loihiensis L2TRT(AF288370) 100 835

MH5R3-2 Halomonas alkaliphila 18bAGT(AJ640133) 99,9 1390

MH6Rla Virgibacillus halodenitrificans DSM 10037T(AY543169) 100 805

MH6R2-2b Oceanobacilluspicturae LMG 19492T(AJ315060) 100 811

MH7R1-2 Arthrobacter nicotianae DSM 20123T(X80739) 99,3 1366

MH9R1-2 Virgibacillus necropolis LMG 19488T (AJ315056) 98,3 1335

Продолжение. Таблица 5 Результаты филогенетического анализа (ген 16в рРНК) бактерий, выделенных из ризосферы растений

Штамм Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных СепВапк Сходство генов 16S рРНК, % Кол-во нуклео-тидов

Ризосфера вероники дубравной

MH2R2-2 Bacillus hwajinpoensis SW-72T(AF541966) 99,9 742

Ризосфера ястребинки зонтичной

М16-1 Pseudomonas brenneri CFML 97-391T(AF268968) 99,4 801

М17-1 Brevibacterium casei NCDO 2048T(X76564) 99,8 791

Ризосфера торичника солончакового

M35-11N Isoptericola halotolerans YIM 70177T(AY789835) 99,6 774

M35-15N Pseudomonas seleniipraecipitatus CA5T(FJ422810) 99,2 831

MH3R1-1 Idiomarina loihiensis L2TRT(AF288370) 100 783

MH3R3-1 Salinicola salarius М27т (AM229316) 99,3 1390

Ризосфера мари красной

М105-1 Salinicola salarius М27т (AM229316) 99,3 1346

Ml 06-5 Kushneria marisflavi SW32T(AF251143) 98,6 1386

Ml 07-2 Microbacterium phyllosphaerae DSM13468T(AJ277840) 100 764

Ml 07-4 Bacillus safensis FO-036bT(AF234854) 99,9 834

Ml 15-1 Bacillus hwajinpoensis SW-72T(AF541966) 99,7 782

Ml 15-3Na Halomonas tilanicae BH1T(FN433898) 98,9 1405

Ml 16-2 Microbacterium terricola KV-448T(AB234025) 98,8 1294

Ml 16-3 Halomonas taeanensls BH539T(AY671975) 99,3 1377

Ml 16-4 Planomicrobiumflavidum ISL-41T(FJ265708) 99,1 736

Ml 16-7 Salegentibacter salarius 1SL-6T(EF486353) 99,1 789

Ml 16-8 Marinobacter maritimus CK47T(AJ704395) 97,8 1343

Ml 36-2 Isoptericola chiayiensis 06182M-1T(FJ469988) 99,1 1291

Ml 36-3 Isoptericola halotolerans YIM 70177T(AY789835) 99,2 779

Ml 36-7 Salinibacteriam amurskyense KMM 3673T (AF539697) 99,8 863

MII13R2-2 Idiomarina loihiensis L2TRT(AF288370) 100 833

Ризосфера мать-и-мачехи обыкновенной

M125-1 Halomonas boliviensis LC1T(AY245449) 99,3 1316

Ml 26-4 Janibacter hoylei DSM 21601T (FR749912) 100 686

M127-7 Micrococcus yunnanensis YIM 65004T(FJ214355) 100 883

Ризосфера нивяника обыкновенного

MH14R2-2 Virgibacillus necropolis LMG 19488T (AJ315056) 97,6 1332

Примечание. Цветом выделены штаммы, претендующие на описание в качестве новых таксонов.

Филогенетический анализ микроорганизмов выявленных морфо/геномогрупп показал, что значительная часть бактерий класса Gammaproteobacteria представлена галофилами семейства Halomonadaceae (родов Kushneria, Halomonas, Salinicola). Наибольшую долю среди представителей галомонад составляли бактерии рода Halomonas (34% от общего количества морфо/геномогрупп данного семейства) (рисунок 26). Бактерии рода Salinicola (рисунок 26), изолированные из ризосферы торичника солончакового и мари красной, имели высокий уровень сходства (ген 16S рРНК) с типовым штаммом Salinicola salarius М27т. Бактерии рода Salinicola были впервые выделены из почвы района солеразработок г. Березники (Ананьина и др., 2007).

Кроме галофильных бактерий в образцах ризосферы были обнаружены галотолерантные бактерии классов Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Flavobacteriia (рисунок 2а). В исследованных образцах ризосферы также встречались бактерии классов Bacilli и Actinobacteria (рисунок 2а, 2в).

■ Baälli

ü Gammaproteohaderia

□ Aclinobacteria

■ Flavobacteriia

□ Alphaproleobacteria

Ш Pseudomonas ö Idiomarina □ Salmicola О Hahmonas • Alteromona.s © Kushneria ■ Marinobacler

6% 6%

■ Brevibacteriiim

□ Isoptericola

■ Kocuria

□ Zhihengliuella О Microbacterium

□ Streptomyces

□ Neslerenkonia 3 Micrococcus

□ Arlhrobacter

□ Salinihaclerium

Рисунок 2. Относительное содержание филогенетических групп бактерий: (а) процентное соотношение классов; (б) класс (¡иттарго1епЬасыг'ш (процентное соотношение родов); (в) класс АсйпоЬааепа (процентное соотношение родов).

В образцах ризосферы были также выявлены бактерии, имеющие низкий уровень сходства по гену 16S рРНК (в пределах 96,7-97,8%) с известными видами родов Alteromonas, Leeuwenhoekiella, Marinobacter, Rhizobium, Virgibacillus, и являющиеся потенциальными представителями новых таксонов.

В ризосферной почве без засоления (контрольный вариант) доминирующей группой бактерий являлись представители класса Gammaproteobacteria (как и в засоленной почве), но 98,8% от общей численности составляли негалофильные бактерии pona Pseudomonas (таблица 5).

Таким образом, техногенное засоление почвы в окрестностях предприятий ОАО «Уралкалий» оказывает сильное влияние на микробное сообщество ризосферной зоны растений, приводящее к широкому распространению галотолерантных и галофильных бактерий, а также увеличению доли микроорганизмов классов Actinobacteria и Bacilli в ризосферной зоне.

6. Галофильные бактерии из техногенно-минеральных образований (БКПРУ-2, ОАО «Уралкалий», г. Березники)

При культивировании на среде АТСС 213 «Halobacterium medium» (200 г/л NaCl) из техногенно-минеральных образований было выделено 5 галофильных штаммов микроорганизмов. Штаммы ТС 151, ТС 171, ТС 181 на основании анализа ВОХ-ПЦР отнесены к одной геномогруппе. Они обладают гомологичными ДНК-профилями со штаммами ТС 122 и ТС 11 (таблица 1), изолированными из образцов каменной соли и сильвинита (СКПРУ-1, г.Соликамск). Генотипирование штамма ТС161 показало, что он имеет сходство со штаммом ТС31, выделенным из образца грунта около

солеотвала СКПРУ-1 (таблица 3). Изолят ТС 141 имеет отличный от других гетерогенный ВОХ-профиль.

Филогенетический анализ (ген 168рДНК) изолятов показал, что все 5 штаммов являются представителями класса Оаттарго1еоЬас1ег1а (таблица 6). Из них четыре штамма проявили наибольшее сходство с бактериями рода Скгото/1а1оЬас1ег. Штамм ТС 141 показал весьма низкий уровень сходства нуклеотидной последовательности гена 168рРНК с таковой типового штамма рода 8аИтврЬаега (93,5%) (таблица 6). Похожие культуры были выделены из образцов воды и донных отложений рассолосборника СКГ1РУ-2 (г. Соликамск, Пермский край).

Таблица 6

Результаты филогенетического анализа (ген 168 рРНК) бактерий,

выделенных из образцов ТМО шламохранилища БКПРУ-2

Штамм Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных GenBank Сходство генов 16S pPHK,% Кол-во нуклео-тидов

ТС141 Salinisphaera hydrothermalis EPR70T (EU740416) 93,5 743

ТС151 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1248

ТС161 Chromohalobacter canadensis ATCC 43984T (AJ295143) 99,9 1402

Примечание. Цветом выделены штаммы, претендующие на описание в качестве новых таксонов.

На рисунке 3 приведена электрофореграмма продуктов ВОХ-ПЦР, отражающая генетическое разнообразие галофильных штаммов рода Chromohalobacter, изолированных из высокоминерализованных экониш района солеразработок, а б

Рисунок 3. Электрофореграмма ВОХ-профилей исследуемых бактерий, близкородственных (a) Chromohalobacter canadensis: I - ТС 101, 2 - ТС52, 3- TCI91 (из коллекции лаборатории ЛММБ ИЭГМ УрО РАН); (б) Chromohalobacter japonicus: 1 - ТС21, 2-ТС22, 3 - ТС31, 4 - ТС32, 5 - ТС71, б - ТС72, 7 - ТС732, 8 - ТС11, 9 - В201, М — маркер O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва).

Ml 23 1 23 4 56M 789

Изоляты, близкие виду С. japonicus, выделенные из одного биотопа, характеризовались одинаковым набором ВОХ-ПЦР продуктов, в то время как штаммы этой группы, изолированные из разных биотопов, отличались между собой. Значительно большим разнообразием характеризовались штаммы, близкородственные С. canadensis. Выявлен генетический полиморфизм бактериальных культур этого филогенетического кластера, выделенных из одного биотопа (дно стока рассолосборника, грунт возле солеотвала и соляная корка солеотвала), и, в то же время, в одну геномогруппу входили изоляты разных биотопов (рисунок 4).

шШт

0.02

100

ТС151, ТС171, ТС181 ТС11, TC122 TC71, TC72 TC32

TC21, TC22

С. canadensis АТСС 43984' (AJ295143) B201, B202 TC23 TC91 TC161 TC31

С. japonic us 43т (AB105159) С. beijerinckii АТСС19372Г (АВ021386) ТС52, ТС512

ТС101, ТС111, TC112, TC121, TC132

98 С. marismortui АТСС 17056 т (Х87219)

С. sarecensis DSM 15547 1 (AY373448) С. nigrandesensis LTS-4NT7 (AJ277205) 100 С. salexigens DSM 3043T(AJ295146)

С. israelensis АТСС 4398 5 T (AJ295144)

Pseudomonas pulida DSM 291T (Z76667)

Рисунок 4. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода

neighbor-joining, показывающее положение исследуемых бактерий рода Chromohalobacter, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК длиной 1248 п.н. Показаны значения «bootstrapw-анализа выше 80%.

Таким образом, впервые выявлено филогенетическое разнообразие и широкое распространение галофильных бактерий семейства Halomonadaceae в экосистемах района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей. Согласно

полученным данным бактерии рода Chromohalobacter присутствуют как в природных, так и в техногенных высокоминерализованных экосистемах района соледобычи

Пермского края.

7. Галотолерантные бактерии из техногенно-минеральных образований (БКПРУ-2, ОАО «Уралкалий», г. Березники)

Исследованы пять образцов ТМО из шламохранилища предприятия БКПРУ-2 ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). Методом прямого высева на агаризованную БСР (50 г/л NaCl) были выделены в чистую культуру 138 штаммов, объединенных по морфологии колоний в 30 морфогрупп. Представители каждой группы были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Было установлено, что 39% изолированных штаммов являются представителями класса Actinobacteria, 27% - относятся к классу Gammaproteobacteria, 27% — к классу Bacilli, 7% - к классу Alphaproteobacteria (рисунок 5а).

Наибольшим многообразием характеризовались микроорганизмы класса Actinobacteria, среди которых доминирующее положение занимала группа бактерий рода Arthrobacter (42% от общего количества актинобактерий). Менее многочисленными были бактерии родов Rhodococcus и Dietzia (по 17% от общего числа), около 8% - бактерии родов Kocuria, Micrococcus и Streptomyces (рисунок 56).

□ Rhodococcus Hi Dietzia

□ Arthrobacter

□ Kocuria Л Micrococcus

□ Streptomyces

Рисунок 5. Относительное содержание филогенетических групп бактерий:

(а) классов Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria;

(б) родов класса Actinobacteria.

Все изолированные культуры способны к росту как в средах без добавления NaCl, так и в средах с повышенной концентрацией соли (до 100 г/л), т.е. являются галотолерантными организмами по классификации Кашнера (Кашнер, 1981). Некоторые изоляты рода Bacillus (штаммы ВОЗ, ВОб, ВО 18, ВОЗЗ) были способны к росту в присутствии 150 г/л хлорида натрия.

В результате изучения биодеградационных свойств изолированных бактерий было выявлено, что штаммы Rhodococcus sp. BOl, Bacillus sp. B04 и Arthrobacter sp. B025 обладают наиболее широкой субстратной специфичностью и способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие ароматические углеводороды как нафталин, бифенил и орто-ФК. Другие бактериальные культуры показали менее активный рост на ароматических углеводородах и продуктах их разложения. Выявление бактерий, способных к деструкции подобных соединений, обусловлено тем, что в составе техногенно-минерапьных образований присутствуют различные стойкие органические загрязнители (полициклические ароматические соединения, фталаты, галогенсодержащие углеводороды) (Бачурин, Одинцова, 2009).

8. Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов из ТМО шламохранилища БКПРУ-1, ОАО «Уралкалий»

Из двух образцов ТМО шламохранилища БКПРУ-1 ОАО «Уралкалий» (г. Березники) методом НК на МСР (50 г/л NaCI) с нафталином или орто-ФК в качестве субстрата (1 г/л) выделено 28 штаммов бактерий, отличающихся морфологией колоний и клеток. Из НК с нафталином выделено 20 штаммов, из НК с орто-ФК - 8 штаммов.

В результате сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолятов и типовых штаммов (база данных EzTaxon) было установлено, что штаммы, выделенные из НК с нафталином, принадлежат к классам Actinobacteria и Gammaproteobacteria. при этом актинобактерии занимают доминирующее положение (89%) (рисунок ба). Среди микроорганизмов класса Actinobacteria практически половина всех изолятов была наиболее близка к представителям рода Rhodococcus (49%) (рисунок 66). Согласно результатам филогенетического анализа в НК с орто-ФК большую часть (66%) также составляет группа актинобактерий (рисунок 6в), наиболее широко представленная бактериями рода Rhodococcus (рисунок 6г).

Actinobacteria

Gammaproteobacteria

П Alphaproteobacteria

17%

Рисунок 6. Относительное содержание филогенетических групп бактерий: (а) классов (Actinobacteria и Gammaproteobacteria) и (б) родов класса Actinobacteria в НК с нафталином; (в) классов (Gammaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria) и (г) родов класса Actinobacteria в НК с орто-ФК.

Все выделенные штаммы способны к росту как в средах без добавления NaCl, так и в средах с повышенной концентрацией соли (до 150 г/л). Растут в среде при значениях рН 6,0-8,0.

Большинство галотолерантных бактерий-деструкторов способны использовать в качестве ростовых субстратов: бензол, толуол, фенол, бифенил, бензойную, лара-гидроксибензойную (ПГБК), орто-фталевую и протокатеховую кислоты (ПКК). Среди исследуемых культур наибольший интерес представляет штамм КТ112-7, обладающий широкой субстратной специфичностью в отношении различных моно(поли)ароматических соединений.

9. Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 - деструктор ароматических углеводородов, выделенный из отходов калийного производства

Штамм КТ112-7 (=ВКМ АС 263ID) выделен из ТМО БКПРУ-1 (г.Березники) методом НК на орото-фталате. При инкубировании в течение 3 суток на агаризованной БСР штамм КТ112-7 образует округлые, матовые, светло-розовые колонии размером 1-3 мм. Клетки штамма грамположительные, неподвижные, не образуют спор, каталазоположительные, с трехстадийным морфогенетическим циклом развития. Штамм растет при температуре 10-45°С с оптимумом роста при 28°С. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма КТ 112-7 (размером 1400 п.н.) показал 100% сходство с аналогичным геном типового штамма Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082т (GenBank Z37138). На основании морфо-физиологических и молекулярно-генетических признаков на настоящем этапе работы штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis.

В клетках штамма КТ112-7, выращенных на БСР, методом пульс-электрофореза обнаружено две мегаплазмиды размером около 470 т.п.н. и 500 т.п.н., сопоставимые по размеру с плазмидами рЯНЬ2 (443 т.п.н.) и рЯНЬЗ (332 т.п.н.) активного деструктора ароматических соединений ЯНА 1 (УесИег е? о/., 2009).

Штамм Я. \vratislaviensis КТ112-7 способен расти на бензоле, толуоле, феноле, орто-ФК, БК, бифениле, нафталине, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии. При выращивании штамма в жидкой среде наиболее эффективный рост был отмечен при культивировании на орто-ФК, БК и бифениле.

Изучена способность Я. \vratislaviensis КТ112-7 к росту при содержании высоких концентраций орто-ФК и БК в среде. При выращивании штамма на 8 г/л орто-ФК или на 3,4 г/л БК зарегистрировано накопление биомассы (ОПбоо=2,2). Однако характер роста культуры на субстратах отличался. Так, увеличение концентрации орто-ФК приводило к повышению максимальной удельной скорости роста (от 0,050±0,002 до 0,070±0,003 ч"1), снижению времени удвоения культуры (от 13,8±0,1 до 9,6±0,1 ч) и практически не влияло на продолжительность подготовительной фазы роста. Повышение концентрации БК приводило к увеличению подготовительной фазы роста, а динамика изменения ростовых параметров имела противоположный характер, т.е. наибольшая удельная скорость роста при минимальной концентрации субстрата (0,24±0,02ч"').

0,8 0.6 0,4

Деструкция ароматических углеводородов при разной солености среды. В MCP с орто-ФК в качестве единственного источника углерода и энергии штамм КТ112-7 способен к росту при содержании до 90 г/л NaCl (рисунок 7). Повышение концентрации соли в среде приводило к увеличению подготовительной фазы роста (24-480 ч), снижению удельной скорости роста (от 0,050±0,004 до 0,006±0,001 ч"1), но практически не сказывалось на максимальной плотности культуры. Отмечена корреляция между ростом культуры и убылью орто-ФК (г = -0,92).

ОП„„ (а) Г/Л (5)

0-----1--'--------'----1 о

О 10 20 30 су,. 40 0 10 20 30 сут <10

Рисунок 7. Рост штамма Д. wratislaviensis КТ112-7 в МСР на орто-ФК (а) и убыль субстрата (б) при различных концентрациях №С1 (г/л): 1 — 0,2 — 30, 3 — 70, 4 - 90,

5- 100, б- 110, 7- 120.

Анализ культуральной среды в экспериментах с «отмытыми» клетками показал присутствие трех метаболитов разложения орто-ФК (таблица 7). С повышением содержания №С1 в среде отмечалось увеличение концентрации интермедиатов и снижение уровня деструкции субстрата.

0,8 0,6 0,4

Таблица 7

Разложение орто-ФК штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при разной концентрации NaCI

Метаболиты

NaCI, г/л Время, ч Деструкция, % 3,4-ДГФК*, ОПзо«, ед. ПКК**, мг/л Пирокатехин, мг/л

0 2 78,3 ±0,1 0,372 н.д.*** н.д.

24 99,9 ±0,1 0,374 н.д. н.д.

30 2 80,1 ±0,2 0,336 н.д. 26,5 ± 0,2

24 93,2 ± 0,2 0,371 15,2 ±0,2 59,1 ±0,1

50 2 79,6 ± 0,4 0,315 н.д. 41,9 ± 0,1

24 90,5 ± 0,3 0,377 88,8 ± 0,2 30,4 ±0,1

60 2 75,8 ±0,4 0,421 92,0 ± 0,3 268,5 ± 0,4

24 86,6 ± 0,3 0,376 66,9 ±0,1 167,6 ±0,3

Примечание. *3,4-ДГФК - 3,4-дигидроксифталевая кислота, **ПКК - протокатеховая кислота, ***н.д. — не детектировалось.

При культивировании штамма KT 112-7 в MCP с БК в качестве субстрата наблюдался рост при содержании в среде до 75 г/л NaCI (рисунок 8). Подготовительная фаза роста была сопоставима с таковой при культивировании на орто-ФК при аналогичных концентрациях соли в среде. Повышение концентрации NaCI приводило к снижению оптической плотности культуры (С)Пбоо=0,65-0,45) и уменьшению удельной скорости роста (от 0,23±0,01 до 0,040±0,005 ч"'). Рост штамма КТ112-7 сопровождался убылью субстрата (г = - 0,93).

Рисунок 8. Рост штамма R. wratislaviensis КТ112-7 в MCP на БК (а) и убыль субстрата (б) при различных концентрациях NaCI (г/л): 1 -0,2 - 30, 3 — 60, 4 - 75, 5 - 90.

Основные метаболиты деструкции БК штаммом KT 112-7 установлены в опытах с «отмытыми» клетками (таблица 8). При высоком содержании хлорида натрия (60 г/л) обнаружен только пирокатехин, в то время как при меньшей концентрации соли (30 и 50 г/л) и без NaCI в среде зафиксировано образование иора-гидроксибензойной, протокатеховой кислот и пирокатехина в качестве промежуточных соединений (рисунок 9).

Таблица 8

Разложение БК штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при разной концентрации NaCl

NaCl, г/л Время, ч Деструкция, % Метаболиты, мг/л

ПГБК* ПКК" Пирокатехин

0 2 81,3 ±0,3 27,7 ± 0,3 н.д.*** н.д.

24 99,9 ±0,1 5,4 ± 0,2 8,84 ± 0,4 2,3 ±0,1

30 2 65,4 ±0,2 14,2 ±0,1 н.д. 52,7 ± 0,2

24 92,3 ± 0,2 6,9 ±0,1 3,2 ± 0,2 27,5 ±0,1

50 2 66,4 ± 0,4 27,1 ±0,3 9,4 ± 0,2 71,4 ± 0,1

24 87,3 ± 0,2 37,4 ± 0,2 15,5 ±0,5 86,8 ± 0,2

60 2 62,0 ± 0,3 н.д. н.д. 110,8 ±0,4

24 85,4 ± 0,4 н.д. н.д. 136,1 ±0,3

Примечание. *ПГБК - иа/га-гидроксибензойная кислота, **ПКК - протокатеховая кислота, ***н.д. - не детектировалось.

Метаболические пути деструкции орто-ФК и БК штаммом KT 112-7. Анализ соединений, образующихся при культивировании R. wratislaviensis КТ1 12-7 с орто-ФК и БК (таблица 7, 8), а также анализ функциональных генов позволили представить вероятную схему метаболических путей деструкции данных соединений исследуемым штаммом (рисунок 9).

Известно, что разложение орто-ФК аэробными бактериями может осуществляться через стадию образования 3,4-дигидрокси- или 4,5-дигидроксифталевой кислоты, каждая из которых далее трансформируется до протокатеховой кислоты (ПКК) (Choi et al., 2005; Liang et al, 2008). На основании анализа метаболитов (таблица 7) показано, что штамм KT 112-7 осуществляет разложение орто-ФК через 3,4-дигидроксифталевую кислоту. Данное предположение подтверждает и тот факт, что в результате специфичной амплификации получен фрагмент гена phtB, кодирующего фталат 3,4-г<ис-дигидродиолдегидрогеназу. В ряде работ (Vamsee-Krishna et al.. 2006; Liang et al., 2008) описан путь трансформации орто-ФК, в котором ПКК, один из основных метаболитов, окисляется протокатехоат 3,4-диоксигеназой (ген рсаН) до 3-карбокси-г/мс,г/мс-муконовой кислоты. У исследуемого штамма R. wratislaviensis КТ112-7 отсутствовала специфичная амплификация гена рсаН, т.о. вопрос разложения ПКК требует дальнейшего изучения.

Интересный результат получен при анализе метаболического пути разложения БК штаммом КТ112-7 (таблица 8). ВЭЖХ-анализ показал присутствие в среде ПГБК, ПКК и пирокатехина. Предположительно, в R. wratislaviensis КТ112-7 присутствуют два метаболических пути разложения бензоата, и при высоком уровне осмотической нагрузки на клетки штамма активируется только классический путь трансформации БК (Borgne et al., 2008; Solyanikova et al., 2008) (рисунок 9, a). Известно, что окисление БК до пирокатехина осуществляется бензоат-1,2-диоксигеназой (ген ЬепЛ). С ДНК исследуемого штамма амплифицирован фрагмент гена ЬепА, характеризующийся высоким уровнем гомологии (98%) с геном бензоат-1,2-диоксигеназы известного деструктора R. jostii RHA1 (Vedler et al., 2009).

Анализ литературы и баз данных показал, что среди бактерий метаболический путь, при котором БК под действием бензоат-4-монооксигеназы окисляется до nLEK, встречается крайне редко и описан для ряда штаммов рода Pseudomonas (Reddy, Vaidyanathan, 1976) и для штамма Burkholderia sp. 383 (GenBank CP 000152).

У штамма ВигкИоШег1а ер. 383 трансформация БК осуществляется последовательно путем образования ПГБК, ПКК и пирокатехина (http://www.genome.jp). В результате проведенного исследования нами впервые для штаммов рода й/гогз?ососсм5 предложен путь разложения БК через стадию образования ПГБК (рисунок 9, б). Окисление ПГБК до ПКК описано для широкого круга бактерий (8о1уаткоуа е? а1., 2008). Присутствие среди метаболитов ПКК, пирокатехина (таблица 8) и отсутствие специфичной амплификации генарсаН позволяет предположить, что трансформация ПКК происходит путем декарбоксилирования (http://www.brenda-enzymes.info).

Штамм Я. \vratislaviensis КТ112-7 способен к эффективному росту на нафталине в качестве единственного источника углерода и энергии при содержании №С1 до 50 г/л в среде культивирования. Стоит отметить тот факт, что у штамма КТ112-7 отсутствовала амплификация гена пагАа, детерминирующего начальные этапы деструкции нафталина. На данном этапе исследований можно предположить, что разложение нафталина исследуемым штаммом осуществляется путем, отличным от ранее описанных для родококков (АпапЧпа ег«/., 2011).

но-

Бензойная кислота

орто- Фталевая кислота

ЬепА

рЬ 181 ОН

„,-он

1 НО-—,---""' -о н

3,4-Дигидрокси-фталевая кислота

НСК"

Протокатеховая кислота

НО Ьн

Пирокатехин

Соединения основного обмена клетки

Рисунок 9. Предложенная схема метаболических путей разложения БК и орто-ФК штаммом Л. \vratislaviensis КТ112-7.

Таким образом, галотолерантный штамм R. wratislaviensis КТ112-7, выделенный из техногенно-минеральных образований района промышленных разработок ВКМКС, обладает уникальным сочетанием путей разложения ароматических соединений. Следует отметить, что штамм способен осуществлять эффективную деструкцию орто-ФК в условиях высокой солености среды (до 90 г/л NaCl). Кроме того, данный штамм способен к деструкции бифенила и полихлорированных бифенилов, что было показано в исследованиях Егоровой Д.О. с коллегами (Егорова и др., 2013). Полученные результаты позволяют рекомендовать данный штамм для использования в биотехнологиях утилизации (трансформации) ароматических соединений в условиях повышенной минерализации.

ВЫВОДЫ

1. Выделено в чистую культуру, охарактеризовано и идентифицировано 157 штаммов аэробных бактерий из различных образцов района разработок Верхнекамского месторождения солей: ископаемых (подземных) соляных залежей и наземных техногенных объектов - отходов калийного производства, засоленной почвы, рассолосборников. На основании филогенетического анализа (ген 16S рРНК) бактерии были отнесены к 40 родам (более 120 видам), входящим в состав 24 семейств 4 филумов: «Proteobacteria», «Actinobacteria», «Bacteroidetes» и «Firmicutes». Выявлены потенциальные представители новых таксонов в составе классов Flavobacteriia и Gammaproteobacteria.

2. Показано повсеместное распространение на территории промышленных солеразработок Верхнекамского месторождения галофильных бактерий семейства Halomonadaceae (класс Gammaproteobacteria). Представители рода Chromohalobacter (сем. Halomonadaceae) доминировали в образцах руд (сильвинит, каменная соль) и в наземных высокоминерализованных образцах (галитовые отходы, донные отложения рассолосборников).

3. Установлено, что техногенное засоление почвы является определяющим фактором, влияющим на таксономический состав бактериального сообщества ризосферы растений, произрастающих в районе складирования отходов предприятия ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск, Пермский край): доминирующими группами являются галофильные бактерии семейства Halomonadaceae (родов Halomonas, Kushneria, Salinicola) и галотолерантные бактерии класса Actinobacteria (родов Brevibacterium, Isoptericola, Kocuria, Zhihengliuella, Microbacterium, Streptomyces, Nesterenkonia, Micrococcus, Arthrobacter, Salinibacterium, Janibacter) и класса Bacilli (родов Bacillus, Planomicrobium, Halobacillus, Virgibacillus, Oceanobacillus).

4. В отходах (техногенно-минеральных образованиях) соледобывающего предприятия (г. Березники, Пермский край) преобладают галотолерантные бактерии родов Arthrobacter и Rhodococcus (класс Actinobacteria), являющиеся деструкторами моно(поли)ароматических углеводородов (нафталина, бифенила, бензола, толуола, фенола, бензойной, ор/яо-фталевой, ларл-гидроксибензойной и протокатеховой кислот).

5. Галотолерантный штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ AC 2631D), выделенный из техногенно-минеральных образований, способен утилизировать нафталин, opmo-фталевую и бензойную кислоты в присутствии повышенных концентраций хлорида натрия (50 г/л, 90 г/л и 75 г/л, соответственно).

6. Показано, что при разложении бензойной кислоты (БК) в условиях повышенной минерализации среды (концентрация NaCl выше 60 г/л) в клетках штамма R. wratislaviensis КТ112-7 активируются ферментные системы «классического» пути

утилизации БК - через пирокатехин. При меньшем содержании соли в среде культивирования деструкция БК штаммом КТ112-7 осуществляется через стадию образования иора-гидроксибензойной кислоты, такой путь разложения БК впервые выявлен у грамположительных бактерий.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Филогенетическое разнообразие бактерий ризосферы растений, произрастающих на техногеннозасоленных почвах / Е.С. Корсакова, Л.Н. Ананьина, A.B. Назаров, Е.Г.Плотникова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -Т. 4/1.-С. 81-82.

2. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия / Д.О. Егорова, Е.С. Корсакова,

B.А. Демаков, Е.Г. Плотникова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2013. - Т. 49, № 3. - С. 267-278.

3. Корсакова, Е.С. Бактерии-деструкторы стойких органических загрязнителей - эфиров фталевой кислоты, как основа для создания новых экобиотехнологий / Е.С. Корсакова, A.A. Пьянкова, Е.Г. Плотникова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2013.-Т. 15,№3 (5). - С. 1633-1636.

4. Разнообразие бактерий семейства Halomonadaceae района разработок Верхнекамского месторождения солей / Е.С. Корсакова, Л.Н. Ананьина, A.B. Назаров, Б.А. Бачурин, Е.Г. Плотникова // Микробиология. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 247-250.

Публикации в других журналах и сборниках

5. Изучение разнообразия бактерий накопительной культуры, полученной из образца породы Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей / Л.Н. Ананьина, Е.С. Пастухова (Корсакова), О.В. Ястребова, Е.Г. Плотникова // Материалы III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». - Пермь. - 2008. - С. 112.

6. Пастухова (Корсакова), Е.С. Изучение бактерий, выделенных из района солеразработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей / Е.С. Пастухова (Корсакова), О.В. Ястребова // Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2009». - Пермь. - 2009. - С. 61-62.

7. Разнообразие бактерий, выделенных из района солеразработок месторождения калийных солей Верхнекамья / О.В. Ястребова, Л.Н. Ананьина, Е.С. Пастухова (Корсакова), Е.Г. Плотникова // Вестник Пермского Университета. Серия биология. -2009.-Т. 10 (36).-С. 124-129.

8. Бактерии-деструкторы ор/яо-фталевой кислоты, выделенные из отходов калийного производства / Е.С. Пастухова (Корсакова), Д.О. Егорова, О.В. Ястребова, Е.Г. Плотникова // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2010. - Т. 1 (3). -

C. 24-28.

9. Пастухова (Корсакова), Е.С. Бактерии-деструкторы нафталина и ор/ио-фталата из техногенно-минерапьных образований (ТМО) соледобывающего предприятия / Е.С. Пастухова (Корсакова), Е.А. Шестакова, О.В. Ястребова // Материалы 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2010. - Т. 2. - С. 250-251.

10. Пастухова (Корсакова), Е.С. Галотолерантные бактерии-деструкторы ароматических углеводородов из района разработок Верхнекамского месторождения солей / Е.С. Пастухова (Корсакова), Е.А. Шестакова, О.В. Ястребова // Материалы III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2010». - Нижний Новгород. - 2010. - С. 66-67.

11. Пастухова (Корсакова), Е.С. Характеристика штамма Rhodococcus wratislaviensis KTU2-7 - деструктора ароматических углеводородов / Е.С. Пастухова (Корсакова), Д.О. Егорова, Е.Г. Плотникова // Материалы Международной научной конференции «Микробиологическая биотехнология - наукоемкое направление современных знаний». - Кишинев. Молдова. - 2011. - С. 194-195.

12. Корсакова, Е.С. Поиск бактерий-деструкторов ароматических углеводородов, перспективных для ремедиации техногеннозагрязненных почв с высоким уровнем засоления / Е.С. Корсакова, М.А. Мартусевич, Е.Г. Плотникова // Материалы Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии». -Пущино.-2012.-С. 54.

13. Корсакова, Е.С. Бактерии семейства Halomonadaceae района солеразработок Верхнекамского месторождения солей / Е.С. Корсакова, A.A. Пьянкова, J1.H. Ананьина // Материалы 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2012. - С. 23.

14. Мартусевич, М.А. Разнообразие бактерий-деструкторов нафталина, выделенных из района солеразработок (г. Соликамск, Пермский край) / М.А. Мартусевич, Е.С. Корсакова, Е.Г. Плотникова // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых «Симбиоз - Россия 2012». - Тверь. - 2012. -С. 337-339.

15. Пьянкова, A.A. Характеристика бактерий сем. Halomonadaceae, выделенных из высокоминерализованных экотопов Верхнекамского месторождения солей / A.A. Пьянкова, Е.С. Корсакова, J1.H. Ананьина // Материалы VIII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва. - 2012. - С. 88-89.

16. Филогенетическое разнообразие бактерий, выделенных из ризосферы мятлика лугового (Роа pratensis L.), произрастающего в условиях засоления на территории солеразработок (г. Соликамск, Пермский край) / Е.С. Корсакова, JI.H. Ананьина, A.B. Назаров, Е.Г. Плотникова // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». -Саратов.-2012.-С. 34.

17. Корсакова, Е.С. Культивируемые микроорганизмы из техногенно-минерапьных образований района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей / Е.С. Корсакова, Е.А. Шестакова, JI.H. Ананьина // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология - 2013». -Тула.-2013.-С. 31.

18. Корсакова, Е.С. Филогенетическое разнообразие бактерий, выделенных из ризосферы мари красной (Chenopodium rubrum L.), произрастающей в условиях засоления на территории солеразработок (г. Соликамск, Пермский край) / Е.С. Корсакова, A.A. Пьянкова, A.B. Назаров // Вестник Пермского Университета. Серия биология. -2013,-Т. 1 (3). - С. 47-50.

19. Пьянкова, A.A. Бактерии рода Salinicola, выделенные из почв района разработок Верхнекамского месторождения солей / A.A. Пьянкова, Е.С. Корсакова, JI.H. Ананьина // Материалы 17 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. -2013. - С. 40-41.

20. Plotnikova, Е. Halophilic microorganisms from the Verkhnekamsk salt mining region (Russia) / E. Plotnikova, E. Korsakova, L. Anan'ina // 5th Congress of European Microbiologists «FEMS 2013». - Leipzig. - Germany. - 2013. - Abstact № 763.

КОРСАКОВА Екатерина Сергеевна

КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ ИЗ РАЙОНА ПРОМЫШЛЕННЫХ РАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 6.03.2014. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ _Набор компьютерный._

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корсакова, Екатерина Сергеевна, Пермь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201457036 -

КОРСАКОВА Екатерина Сергеевна

КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ ИЗ РАЙОНА ПРОМЫШЛЕННЫХ РАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ

03.02.03 Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Е. Г. Плотникова

Пермь-2014

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................11

1.1 Промышленные разработки Верхнекамского месторождения солей..........11

1.2 Экстремофильные микроорганизмы, способные существовать в условиях высокой минерализации среды........................................................................................15

1.2.1 Общая характеристика бактерий семейства На1отопас1асеае..............................21

1.2.2 Галофильные и галотолерантные бактерии из ризосферы растений........................................................................................................................................................................25

1.3 Биодеградация моно(поли)ароматических углеводородов................................28

1.3.1 Разложение нафталина бактериями........................................................................................29

1.3.2 Разложение орто-фталевой кислоты бактериями..................................................35

1.3.3 Разложение бензойной кислоты бактериями............................................................40

1.3.4 Галотолерантные и галофильные бактерии-деструкторы стойких

органических загрязнителей......................................................................................................................43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................49

2.1 Образцы исследования..........................................................................................................................49

2.2 Среды и условия культивирования бактерий......................................................................53

2.3 Методы выделения бактерий..............................................................................................................53

2.4 Определение ростовых характеристик....................................................................................54

2.4.1 Рост бактерий на ароматических углеводородах........................................................55

2.4.2 Рост бактерий при изменении осмолярности среды или концентрации субстрата..................................................................................................................................55

2.5 Разложение ароматических углеводородов бактериями..........................................56

2.6 Морфологическая и физиолого-биохимическая идентификация бактерий..........................................................................................................................................................................57

2.7 Молекулярно-генетические методы..........................................................................................58

2.7.1 Подготовка проб ДНК для ПЦР..............................................................................................58

2.7.2 Амплификация гена 168 рРНК................................................. 59

2.7.3 Амплификация функциональных генов......................................... 59

2.7.4 Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК.................... 60

2.7.5 Определение нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ.............................................................. 60

2.7.6 ДНК-типирование................................................................. 61

2.7.7 Рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК.. 61

2.7.8 Плазмидная ДНК................................................................... 61

2.7.9 Денатурирующий градиентный гель электрофорез........................ 62

2.8 Статистическая обработка результатов......................................... 63

Глава 3. БАКТЕРИИ ИЗ ЗАЛЕЖЕЙ СОЛЕЙ (ВЕРХНЕКАМСКОЕ МЕСТОРОЖДЕНИЕ).................................................................... 64

3.1 Бактерии, выделенные из образцов сильвинита и каменной соли (рудник СКПРУ-1, ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)........................... 64

3.2 Микроорганизмы в образце каменной соли, выявленные методом

денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ).................. 67

Глава 4. БАКТЕРИИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ГАЛИТОВЫХ ОТХОДОВ, ГРУНТА, ПОЧВЫ И РАССОЛОСБОРНИКОВ РАЙОНА СОЛЕРАЗРАБОТОК..................................................................... 69

4.1 Бактерии, выделенные из галитовых отходов района солеразработок (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)................................................... 69

4.2 Бактерии из образцов грунта, отобранных вблизи солеотвалов Соликамского рудоуправления (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск).......... 72

4.3 Бактерии, выделенные из образцов воды, соляных отложений со дна рассолосборника (СКПРУ-2, ОАО «Уралкалий», г. Соликамск).............. 75

4.4 Бактерии, выделенные из ризосферы растений, произрастающих вблизи солеотвалов (ОАО «Уралкалий», г. Соликамск)......................... 78

Глава 5. ГАЛОФИЛЬНЫЕ И ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ОТХОДОВ (ТЕХНОГЕННО-МИНЕРАЛЬНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ) КАЛИЙНОГО ПРОИЗВОДСТВА ОАО «УРАЛКАЛИЙ»................................................................... 88

5.1 Культивируемые галотолерантные бактерии из ТМО шламохранилища БКПРУ-2 ОАО «Уралкалий».................................... 88

5.2 Культивируемые галофильные бактерии из ТМО шламохранилища БКПРУ-2 ОАО «Уралкалий».......................................................... 94

5.3 Культивируемые бактерии-деструкторы из ТМО шламохранилища БКПРУ-1 ОАО «Уралкалий».......................................................... 96

5.4 Галотолерантный штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 -деструктор моно(поли)ароматических углеводородов........................... 100

5.4.1 Идентификация и геномные исследования.................................. 100

5.4.2 Деградационная активность..................................................... 101

5.4.3 Деструкция ароматических углеводородов при разной солености среды....................................................................................... 104

5.4.4 Функциональные гены деструкции ароматических соединений...... 107

5.4.5 Метаболические пути деструкции орто-ФК и БК у штамма ^

R. wratislaviensis КТ112-7..............................................................

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 111

ВЫВОДЫ.................................................................................. 115

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ........................................... 117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................. 118

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................... 136

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Галофильные и галотолерантные микроорганизмы, способные к активной жизнедеятельности в широком диапазоне концентраций солей, имеют весьма широкое распространение. Они обнаружены в природных биотопах (океаны и моря, гиперсоленые озера, солончаковые почвы и т.д.) и антропогенных экосистемах с повышенным уровнем минерализации (Benlloch et al., 2002; Hedi et al., 2009; Jiang et al., 2006; Singh, 2012; Xiang et al, 2008). Галофильные и галотолерантные микроорганизмы - представители трех доменов Bacteria, Archaea и Eukarya (Oren, 2008), используют стратегии, при помощи которых могут противостоять воздействиям высоких концентраций солей: накопление неорганических ионов внутри клеток или активное удаление солей из цитоплазмы за счет накопления высоких концентраций органических молекул - осмолитов.

Кроме того, в отходах (глинисто-солевых шламах, избыточных маточных рассолах) соледобывающего производства предприятий ОАО «Уралкалий» были обнаружены стойкие органические загрязнители, а именно моно(поли)ароматические углеводороды и их производные, галогенсодержащие органические соединения и фталаты (Бачурин, Одинцова, 2009). Данные

соединения, обладающие устойчивостью к внешним воздействиям, токсичностью, канцерогенными свойствами, представляют существенную опасность для здоровья человека и биосферы в целом (http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tpl7.html). Таким образом, в районе соледобычи при комплексной нагрузке (высокий уровень минерализации и токсичные поллютанты) возникают условия для выживания уникальных галофильных и галотолерантных микроорганизмов, в том числе способных разлагать широкий спектр экотоксикантов.

Ранее из почв района солеразработок ВКМКС были выделены и охарактеризованы бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина, фенантрена) родов Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus (Плотникова и др., 2001, 2011; Ястребова и др., 2009). В составе полученного из техногеннозасоленной/загрязненной почвы консорциума, метаболизирующего нафталин, выявлены галотолерантные деструкторы рода Rhodococcus и галофильные бактерии сем. Halomonadaceae, представители которых были описаны в качестве нового рода Salinicola (Ананьина и др., 2007). Описаны новые таксоны архей и прокариот, выделенные из продуктов флотационного обогащения калийных минералов и техногенных вод шламохранилища ОАО «Уралкалий» на территории ВКМКС (г. Соликамск, Пермский край) (Реутских, Саралов, 2012; Саралов и др., 2012а; Саралов и др., 20126; Saralov et al., 2013).

Однако до настоящего времени не было проведено комплексной оценки таксономического (филогенетического) и функционального разнообразия микроорганизмов из природных (ископаемых залежей солей) и техногенных экосистем района разработок ВКМКС. Следует отметить, что галофильные и галотолерантные бактерии характеризуются высоким биотехнологическим потенциалом. Так, осмопротекторные соединения, накапливающиеся клетками для их стабилизации и защитного эффекта, нашли широкое применение в косметической промышленности, а также в качестве криопротекторов (Garrity et al., 2005). Кроме того, солеустойчивые бактерии, способные разлагать широкий спектр ароматических соединений, перспективны для разработки

экобиотехнологий (например, для очистки почв, донных отложений, шламов, характеризующихся высоким уровнем солености) (Singh, 2012). Поэтому исследование культивируемых бактерий с уникальными физиолого-биохимическими свойствами с целью их дальнейшего использования в биотехнологических целях является важным и перспективным направлением исследований.

Основные задачи исследования

Научная новизна

распространение на территории ВКМКС (ископаемых залежах солей, продуктах их технологической обработки, отходах производства и техногеннозасоленных почвах) протеобактерий семейства На1отопас1асеае (класс Оаттарго1еоЪас1епа). Представители рода СкготоНа1оЬас1ег (сем. Нсйотопайасеаё) доминировали в образцах руд (сильвинит, каменная соль) и наземных высокоминерализованных образцах (галитовые отходы, донные отложения рассолосборников). Обнаружены бактерии порядка Асипотусе1а1ез, являющиеся активными деструкторами ароматических углеводородов, присутствующих в отходах солепроизводства. Выделен и описан галотолерантный штамм КИойососсш \vratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ АС 2631 Б), деструктор моно(поли)ароматических углеводородов.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты выполненного исследования расширяют представления о разнообразии галофильных и галотолерантных бактерий техногеннозасоленных/загрязненных районов промышленных разработок месторождений калийно-магниевых солей. Информация о бактериальных культурах, способных к деструкции ароматических соединений (стойких органических загрязнителей) при высокой минерализации среды, может быть использована как основа для создания новых подходов к разработке методов биоремедиации экстремальных экосистем. Создана рабочая коллекция галотолерантных/галофильных бактерий (157 штаммов), перспективных для фундаментальных исследований и использования в биотехнологиях. Штамм Яко(1ососст \vratislaviensis КТ112-7, перспективный для разработки новых экобиотехнологий, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ АС 263 Ш. Нуклеотидные последовательности генов 16Б рРНК 12 штаммов бактерий, выделенных из ризосферы растений, произрастающих на засоленных почвах района соледобычи, депонированы в базе данных ОепВапк под номерами КРО10924 - 28, КС992726 - 31, КС538827.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Техногенное засоление почвы оказывает влияние на формирование микробного сообщества ризосферы растений, произрастающих в районе складирования отходов предприятия ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск, Пермский край). Доминирующими группами в ризосфере являются бактерии семейства Halomonadaceae (родов Halomonas и Salinicola) и галотолерантные бактерии классов Actinobacteria и Bacilli.

3. В отходах (техногенно-минеральных образованиях) калийного производства (г. Березники, Пермский край) преобладают актинобактерии порядка Actinomycetales — деструкторы токсичных органических соединений. Штамм Rhodococcus wratislaviensis KT 112-7 (=ВКМ AC 263ID) способен разлагать нафталин, opwo-фталевую и бензойную кислоты в присутствии повышенных концентраций хлорида натрия.

Апробация работы и публикации

Пущино, 2010, 2012, 2013; Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии», Пущино, 2012; VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; VIII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012; Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2013»,Тула, 2013; 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 2013.

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 28 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 169 литературных источников, из них 47 на русском языке и 122 зарубежных, и приложения.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практич

Информация о работе

Корсакова, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Пермь, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Культивируемые аэробные бактерии из района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы