Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антагонистические взаимоотношения в смешанных культурах метанотрофных бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пашкова, Наталья Игоревна, Пущино

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИМ. Г.К. СКРЯБИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи

ПАШКОВА НАТАЛЬЯ ИГОРЕВНА

Антагонистические взаимоотношения в смешанных культурах метанотрофных бактерий: цитофизиологические и биохимические аспекты.

03.00.07 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., В.Н.С. А.Б. ЦИОМЕНКО, К.6.Н., с.н.с. Н.Г. СТАРОСТИНА

Пущино - 1998

Список сокращений

ПААГ - полиакриламидный гель

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ПХМБ - п-хлормеркурибензоат

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

Дс-Иа - додецилсульфат натрия

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ОП - оптическая плотность

кДа - килодальтон

ММО - метанмонооксигеназа

Т-1 +

Г - грамположительные Г ~ - грамотрицательные КОЕ - колониеобразующие единицы

Содержание

стр.

Введение 5 Обзор литературы

Глава 1. Метанотрофные бактерии 8

1.1. Характеристика метанотрофных бактерий 8

1.2. Роль метанотрофных бактерий в природе 15

1.3. Биотехнологичесий потенциал метанотрофов 19

1.4. Смешанные культуры метанотрофов 22 Глава 2. Взаимоотношения в сообществах микроорганизмов 24

2.1. Типы межпопуляционных взаимоотношений микроорганизмов 24

2.2. Роль межмикробных взаимодействий в функционировании популяций микроорганизмов 27

2.3. Внеклеточные вещества, участвующие в антагонистических взаимодействиях микроорганизмов 29

2.3.1. Антибиотики 29

2.3.2. Литические ферменты 31

2.3.3. Бактериоцины 36

Глава 3. Материалы и методы 45

3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования 45

3.2. Получение суммарных экзометаболитов метанотрофных бактерий 46

3.3. Определение спектра бактериолитической активности Pseudomonas

sp.(ЛМ7) 46

3.4. Индуцированный автолиз клеток метанотрофных бактерий 46

3.5. Электронномикроскопические методы 47

3.6. Методы изучения динамики роста популяций 47

3.7. Определение влияния экзометаболитов метанотрофных бактерий

на рост тест-культур 49

3.8. Методы выделения и очистки литического комплекса, секретируемого Pseudomonas sp. (J1M7) 50

3.9. Определение литической активности 51

3.10. Определение протеолитической активности 51

3.11. Электрофорез в ПААГ 52

3.12. Выявление литической активности ферментов литического комплекса

с помощью электрофореза 53

3.13. Выявление протеолитической активности ферментов литического комплекса с помощью электрофореза 53

3.14. Идентификация белка-бактериоцина в геле после электрофореза культуральной жидкости Methylobacter bovis 98 54

3.15. Методы определения свойств антимикробных соединений 54

3.16. Определение содержания белка и углеводов 56

Результаты

Глава 4. Антагонистические взаимоотношения между метанотрофными бактериями 57

4.1. Изучение взаимоотношений между различными штаммами метанотрофных бактерий 57

4.2. Выявление природы вещества с ингибирующей активностью, секретируемого в культуральную жидкость Methylocystis minimus 33 63

Глава 5. Взаимоотношение метанотрофных и гетеротрофных бактерий: бактериолизис 74

5.1. Спектр литического действия Pseudomonas sp. (ЛМ7) в отношении метанотрофных бактерий 76

5.2. Межпопуляционные взаимоотношения в смешанных культурах метанотрофных и литических бактерий 77

5.3. Исследование литического комплекса, секретируемого Pseudomonas

sp. (Л М7) 85

5.4. Особенности процессов лизиса клеток метанотрофных бактерий под действием Pseudomonas sp.(HM7) 97

Обсуждение результатов 101

Выводы 113

Список литературы

114

Введение

Метанотрофные бактерии (метанотрофы) по ряду физиолого-биохимических свойств представляют собой уникальную группу микроорганизмов. Потребляя метан в качестве единственного источника углерода и энергии, они являются единственными известными представителями микробного мира, замыкающими углеродный цикл на уровне метана. Метанотрофы привлекают внимание исследователей в связи с важной экологической ролью. Обладая своеобразными биохимическими механизмами окисления метана и последующей его ассимиляцией, а также часто способностью к азотфиксации, метанотрофные бактерии активно участвуют в биосинтезе органического вещества на Земле. Они вносят значительный вклад в снижение "парникового эффекта" и следовательно, принимают участие в формировании климата планеты (Hanson, 1992).

Кроме того, метанотрофы обладают большим биотехнологическим потенциалом как продуценты белка, полисахаридов, поли-(3-гидроксибутирата, применяются для снижения метанообильности угольных шахт. Этим микроорганизмам свойственна биокаталитическая способность к трансформации широкого перечня органических соединений, что позволяет использовать их для ремедиации загрязнённых экосистем (Alvarez-Cohen, 1993; Hanson & Hanson, 1996).

В последние годы одним из важнейших направлений микробиологии является исследование взаимоотношений между организмами в сообществах. Ранее микробиологи концентрировали внимание на выделении и изучении чистых культур микроорганизмов, хотя в природе они в большинстве случаев обитают в многовидовых сообществах. Взаимодействия между компонентами таких сообществ сложны и многообразны. Ещё начиная с работ Л.Пастера внимание бактериологов привлекали явления активного угнетения одних микроорганизмов другими - процессы микробного антагонизма (Егоров, 1994). При изучении метаболических взаимодействий были обнаружены и охарактеризованы такие важные факторы регуляции микробных ассоциаций, как антибиотики, литические ферменты и бактериоцины. Кроме теоретического интереса исследования метаболических межмикробных взаимодействий постепенно приобрели и большое практическое значение.

Не являются исключением в этом отношениии и метанотрофные бактерии. Известно, что связанные с жизнедеятельностью метанотрофов природные и многие биотехнологические процессы осуществляются ассоциациями и смешанными культурами. С учётом этого исследования взаимоотношений метанотрофных бактерий между собой и с другими микроорганизмами приобретают особую важность. Для понимания процессов, происходящих в природных ассоциациях метанотрофных бактерий, а также для конструирования стабильных биотехнологически значимых консорциумов на основе метанотрофных культур, необходимо изучение антагонистических взаимодействий между различными представителями этой группы бактерий. Несмотря на обширные сведения о биологии метанотрофных бактерий, проблема межмикробных взаимоотношений в данной группе бактерий остаётся не изученной и затрагивается лишь в единичных работах. Так, Graham с соавторами (1993) показали конкурентные взаимоотношения между представителями I и II типов метанотрофов, были выявлены факторы, влияющие на конкуренцию. В нашей лаборатории впервые были начаты исследования метаболических взаимодействий между разными штаммами метанотрофов, в результате которых было обнаружено преобладание антагонистических взаимоотношений (Старостина с соавт., 1994).

К настоящему времени детально исследованы положительные взаимоотношения между метанотрофами и гетеротрофами. Метанотрофные бактерии в процессе жизнедеятельности выделяют в окружающую среду органические вещества, которые утилизируются гетеротрофами-спутниками, тем самым устраняется автоингибирование метанотрофных бактерий (Малашенко с соавт., 1978).

Тем не менее, наряду с положительным влиянием со стороны гетеротрофных спутников в метанокисляющих культурах нередко наблюдаются и явления антагонизма, приводящие к ингибированию роста, лизису метанотрофов. В результате возникающих между бактериями антагонистических взаимоотношений происходят срывы биотехнологических процессов культивирования. Так, из смешанной метанотрофной культуры Methylomonas meihanica 12 был выделен контаминант Pseudomonas sp. (ЛМ7), лизировавший клетки метанотрофов (Старостина с соавт., 1990). До начала настоящей работы не проводились систематические исследования взаимодействий негативного типа в смешанных культурах и ассоциациях метанотрофных бактерий.

Целью данной работы явилось изучение биохимических и цитофизиологических особенностей антагонистических взаимоотношений в смешанных культурах метанотрофных бактерий как между различными метанотрофными штаммами, так и между метанотрофами и гетеротрофами. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

■ исследовать динамику межпопуляционных взаимодействий антагонистического типа в выбранных модельных системах "метанотроф + метанотроф" и "метанотрофные бактерии + гетеротрофные литические бактерии";

■ выявить природу антимикробных агентов, участвующих в исследуемых антагонистических взаимодействиях, и частично охарактеризовать их свойства.

Обзор литературы.

Глава 1. Метанотрофные бактерии.

1.1. Характеристика метанотрофных бактерий.

Метанотрофные бактерии (метанотрофы) - высокоспециализированная группа бактерий, использующих метан в качестве единственного источника углерода и энергии.

Зонген в 1906 г. впервые выделил и описал микроорганизм Bacillus methanicus, способный расти в атмосфере метана в качестве единственного источника углерода (Sohngen, 1906). Он отмечал, что образование метана в природе происходит в больших количествах. Низкое содержание этого газа в атмосфере, вероятно, обусловлено его окислением микроорганизмами.

Систематика метанотрофных бактерий.

На основании морфологических и физиологических свойств известные метанотрофные бактерии разделены на несколько родов, предложенных Whittenbury с соавторами (1970, 1981, 1984), объединённых в семейство Methylococcaceae\ Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylocystis, Methylosinus. В связи с различиями в строении внутрицитоплазматических мембран, которые коррелируют с типом обмена, метанотрофные бактерии разделены на два типа. Представители I типа, включающего род Methylomonas и род Methylobacter, реализуют гексулозофосфатный путь ассимиляции метана, тогда как у бактерий II типа, который включает род Methylocystis и pop, Methylosinus, функционирует сериновый путь (Малашенко с соавт., 1978; Гальченко с соавт., 1986; Hanson et al.,1991). Некоторые авторы выделяют метанотрофы рода Methylococcus из I типа в отдельную группу - X тип. Как и бактерии I типа, они ассимилируют метан гексулозофосфатным путём. Однако у метанотрофов X типа обнаружены ферменты серинового пути и цикла Кальвена гидроксипируватредуктаза, серинглиоксилатаминотрансфераза и

рибулозобисфосфаткарбоксилаза (Whittenbury, 1981; Whittenbury & Dalton,1981). Они имеют ДНК с более высоким содержанием G+C, по сравнению с метанотрофами I типа (Whittenbury & Krieg, 1984; Hanson et al.,1991).

С целью уточнения видового и родового статуса некоторых штаммов Гальченко и Нестеров (1981), Романовская с соавторами (1991) проводили электрофоретический анализ клеточных белков метанотрофных бактерий. В результате авторы подтвердили существование пяти известных в литературе родов метанотрофов, исследованные штаммы которых имели сходные белковые спектры. Однако были выявлены штаммы, которые занимали обособленное положение.

Bowman с соавторами (1995) провели сравнительную характеристику 136 штаммов метанотрофных бактерий по 124 фенотипическим признакам. На основании полученных результатов авторы предложили объединить виды I типа метанотрофов в три гомологичных кластера и включить в семейство Methylococcaceae род Methylococcus, Methylomicrobium, Methylobacter и Methylomonas, Метанотрофы II типа были сгруппированы в близкородственные роды Methylosinus и Methylocystis. Данная классификация метанотрофных бактерий в настоящее время является наиболее приемлемой.

Результаты секвенирования 5S рРНК и 16S рРНК позволили установить филогенетические взаимоотношения среди метилотрофных бактерий, а также метилотрофов с другими группами бактерий (Hanson et al.,1991; Bratina et al.,1992; Bulygina et al.,1993; Brusseau et al.,1994). Обнаружено, что метилотрофные бактерии с сериновым путём ассимиляции формальдегида образуют две группы внутри а-подраздела Proteobacteria, среди которых метанотрофы составляют группу Па. Семейство Methylococcaceae образует отдельную ветвь у-подраздела Proteobacteria, который, кроме метанотрофов, включает некоторые гетеротрофные бактерии, например, Е. coli, A. chroococcum, Legionella sp. Метилотрофные бактерии, ассимилирующие формальдегид рибулозомонофосфатным путём, но не утилизирующие метан, расположены в (3-подразделе Proteobacteria.

Физиология метанотрофных бактерий.

Морфология и культуральные свойства метанотрофов отличаются большим разнообразием (Whittenbury et al., 1970; Малашенко с соавт.,1978; Whittenbury & Krieg,1984; Романовская с соавт.,1991). Большинство изученных метанотрофных бактерий представляет собой Г аэробные бактерии в форме прямых или изогнутых палочек, кокков. Размеры клеток варьируют от 0,5 до 4 мкм. Характерна высокая

степень полиморфизма клеток в популяциях. Многие штаммы образуют клеточные агрегаты неправильной формы, включающие иногда более 100 клеток. Клетки метанотрофных бактерий имеют покоящиеся формы: экзоспоры, цисты и "незрелые" цисты. Подвижность клеток метанотрофов обеспечивается наличием полярного жгутика или пучка жгутиков и проявляется преимущественно в фазе экспоненциального роста. Имеются также и неподвижные формы.

У некоторых видов присутствует капсулярное вещество, представленное макрокапсулами, фибриллами, микрокапсулами, а также внеклеточная слизь. Фибриллярные капсулы обнаружены у бактерий II типа (Сузина и Фихте, 1986). Они имеют плотно упакованные или редко расположенные, толстые или тонкие фибриллы. Часто фибриллы участвуют в образовании бактериями скоплений-розеток. У некоторых видов формируются надклеточные поверхностные образования: трубочки, чашеобразные выросты и др.

Колонии некоторых метанотрофных бактерий пигментированы: охрово-розовые, красные, жёлтые, коричневые, но большинство изученных культур не имееют пигмента. Некоторые виды выделяют водорастворимый пигмент (Романовская с соавт.,1991).

Клеточная стенка метанотрофов трёхслойная, типична для Г ~ бактерий. Структура клеточной стенки в деталях имеет отличия у разных видов метанотрофов. Клетки бактерий II типа имеют клеточную стенку в виде единичного слоя, прилегающего к цитоплазматической мембране. Ригидный слой у них чётко выражен и

о

имеет толщину 70-150 А, в отличие от клеток I типа, у которых этот слой слабо различим. На ультратонких срезах клеток выявляются рибосомы, вакуоли, иногда газовые вакуоли (Малашенко с соавт., 1978; Сузина и Фихте, 1986).

Характерной особенностью метанотрофных клеток является наличие развитой системы внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) (Proctor et al.,1969; Моносов и Нетрусов, 1976; Малашенко с соавт.,1978). По характеру упаковки и расположению в клетке различают два типа ВЦМ. У метанотрофов I типа мембраны располагаются в виде плотноупакованных стопок вдоль продольной оси клеток. Они могут быть тесно сжаты или разделены тонким слоем цитоплазмы. ВЦМ II типа обнаружены у метанотрофов рода Methylosinus и Methylocystis: спаренные листки мембран

расположены параллельно клеточной стенке и граничат с полостями разных размеров. Они имеют такую же трёхслойную структуру, как и ВЦМI типа.

Развитая система внутрицитоплазматических мембран образуется в результате инвагинации цитоплазматической мембраны. Предполагалось, что ВЦМ функционально ответственны за окисление метана (Малашенко с соавт, 1978). Однако, по мнению ряда авторов, эти мембраны не связяны прямо с процессом окисления метана метанотрофами. Возможно, они играют важную роль в усилении энергодающих механизмов клетки (Best & Higgins, 1981; Scott et al., 1981).

Метаболизм метанотрофных бактерий.

Метанотрофные бактерии способны строить сложные органические соединения клетки только из метана, т.е. облигатно зависят от метана как источника углерода. При этом источником энергии для синтеза клеточных веществ является окисление метана до С02 (Anthony, 1991; Hanson et al.,1991; Hanson,1992; Lidstrom, 1991).

Процессы биологического окисления метана до углекислого газа протекают ступенчато, через метанол, формальдегид и формиат. На рис.1 показан путь ассимиляции метана у метанотрофов, центральную роль в котором играет формальдегид как интермедиат катаболизма и анаболизма.

Первым этапом метаболического пути является окисление метана до метанола с помощью метанмонооксигеназы (ММО) - многокомпонентной ферментной системы (Dalton, 1992; Lipscomb, 1994). Эта ферментная система окисляет метан до метанола с использованием молекулярного кислорода и восстановителя (обычно NAD(P)H или восстановленный цитохром с). Данный этап является специфическим для метанотрофных бактерий. Дальнейшие пути трансформации углерода в целом сходны у всех микроорганизмов, окисляющих Ci-соединения. Метанол окисляется до формальдегида, который используется как восстановитель в электронтранспортной цепи, окисляясь до формиата, или асссимилируется клетками рибулозомонофосфатным и/или сериновым путём. И, наконец, формиат окисляется до углекислого газа при участии NAD-зависимой формиатдегидрогеназы (Anthony, 1991; Hanson & Hanson, 1996).

Образующийся при окислении метана углекислый газ т�