Разделение стабильных изотопов углерода микроорганизмами и возможности его практического использования

Зякун, Анатолий Маркович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разделение стабильных изотопов углерода микроорганизмами и возможности его практического использования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разделение стабильных изотопов углерода микроорганизмами и возможности его практического использования"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Т6 од

- ' 4 ; ■ На правах рукописи

УДК579.69

ЗЯКУН АНАТОЛИЙ МАРКОВИЧ

РАЗДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ УГЛЕРОДА МИКРООРГАНИЗМАМИ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕГО ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность - биотехнология 03.00.23 микробиология 03.00.07

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 1994

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Ведущее учреждение: Кафедра микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова

заседании специализированного уч!

биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино Московской области, 142292.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор . доктор геолого-минералогических наук, профессор доктор биологических наук

И.Н. Гоготов В.С. Лебедев В.Ф. Гальченко

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение последних 40 лет свойство биологических систем разделять (фракционировать) изотопы углерода является предметом постоянного внимания биологов, биогеохимиков и геохимиков (Craig, 1953; Галимов,196& Алексеев и др.,1978; Иванов, 1982; Rundel et al., 1989 и др.I-

Результаты анализа вариаций распространения стабильных изотопов 12 С и 13С в продуктах жизнедеятельности живых систем по отношению к углероду потребленного вещества показали, что их количественные значения могут изменятся в зависимости от характера организма, условий его развития и других как физико-химических,так и биологических факторов [Park & Epstein, 1960; Abelson & Hoering,1961; Атексеев и др., 1973; De Niro & Epstein, 1977; Беляев, 1985 и др.].

Информация об условиях, в которых обитали живые организмы, и их физио-лого-биохимических особенностях может проявиться на уровне атомов. В ряде случаев это обеспечивает ее долговременную сохранность и представляет повышенный интерес для специалистов, интересующихся определением происхождения углеродсодержащих продуктов в биосфере, оценкой роли и активности живых систем в природных и биотехнологических процессах [Алексеев и др., 1973; Галимов, 1981; Леин, 1983; Иванов и Нестеров, 1983; Беляев, 1984; Schidlowski, 1988 и др.].

Расшифровка информации, заложенной в изотопных характеристиках углерода анализируемых продуктов, может быть получена при рассмотрении модельных экспериментов или процессов, наблюдаемых в природных условиях, которые связаны с определенными изменениями распространения изотопов и обусловлены различными превращениями углеродсодержащих соединений биологическими системами.

К началу настоящей работы (1974 год) способность к биологическому фракционированию изотопов углерода была показана для высших растений и некоторых водорослей. Фракционирование изотопов углерода фаготрофными бактериями в зависимости от их биохимических и физиологических условий роста не было изучено. Ничего не было известно и о факторах, определяющих формирование изотопного состава углерода метаболитов у наиболее распространенных представителей почвенной микрофлоры - грибов и дрожжей. Не были выявлены и причины, оказывающие влияние на распределение изотопов углерода в продуктах, наблюдаемых при бактериальном образовании и окислении метана. Поэтому сделать однозначные заключения о возможностях использования изотопных данных при диагностике биологических процессов, связанных с образованием соответствующих форм углерода в природных и лабораторных условиях было невозможно.

Принимая во внимание, что в ряде случаев изотопный состав углерода продуктов жизнедеятельности микроорганизмов может быть единственным источником информации о их существовании в природных экосистемах, решение поставленных выше вопросов является весьма актуально. Поэтому анализ факторов, определяющих разделение изотопов углерода в продуктах, образуемых при жизнедеятельности чистых культур микроорганизмов разных таксономических групп, имеет как теоретическую, так и практическую значимость.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в изучении факторов, влияющих на формирование изотопного состава углерода при жизнедеятельности микроорганизмов, как наиболее динамичной части живой материи в природе. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Выяснить диапазон значений изотопного состава углерода продуктов: а) фо-тотрофных бактерий как наименее обследованных в этом плане объектов; б) ге-теротрофов - грибов и дрожжей при их росте на частично окисленных (глюкоза,

целлюлоза, лигнин) и полностью восстановленных (н-алканы) субстратах; в) ме-танобразующих и метанотрофных бактерий.

2. Выявить закономерности разделения изотопов углерода, обусловленные фи-зиолого-биохимическими особенностями роста микроорганизмов и природы используемых ими субстратов.

3. Оценить влияние физических и физико-химических условий обитания микроорганизмов на величину и направленность разделения изотопов углерода.

4. Определить возможность использования вариаций распространенностей изотопов углерода для оценки биосинтетической активности микроорганизмов как в биотехнологических,так и природных процессах.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования фракционирования изотопов углерода при бактериальном фотосинтезе служили представители класса Anoxyphotobacteria: Rhodopseudomonas palustris штамм Накамура (семейство Rhodospirillaceae); Thiocapsa roseopersicina BBS (семейство Chromatiaceae)\ Ectothio-rhodospira shaposhnikovii (семейство Ecioihiorhodaceae) и Chlorobium limicola forma thiosuljatophillum 1С (семейство Chbroblaceae).

При изучении фракционирования изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами использовались грибы базидиомицеты, способные разлагать сложные ароматические и гетероциклические вещества как природного, так и абиогенного происхождения (Phanaerochaete chrysosporium F-1764 (ВКМ ИБФМ РАН); Partus tigrinus 144 [Головлева и др., 1986]); и дрожжи, растущие на н-алканах и углеводах (Candida quiUiermondii ВСБ-774; Candida l'tpolytica 674 (ВКМ ИБФМ РАН).

Изучение фракционирования изотопов углерода при бактериальном метано-генезе проводили у Melhanobacterium formicicum штамм Kuznetsov 41, Methano-bacterium formicicum штамм Ivanov 31, Methanosarcina barken MS, Methanosarcina sp. 47, Methanococcoides euhalobius 283 и Methanobacterium Ihermoautolrophicum ДН. Для анализа фракционирования изотопов углерода метанокисляющими бактериями использовали культуры Methylomonas methanica 12, Methylosinus trichosporium 44, Methylococcus capsulatus и смешанную культуру 1-70 (ВНИИ синтезбелок), содержащую до 95-98% Methylococcus capsulatus. Фракционирование изотопов углерода в природных условиях при бактериальном метаногенезе наблюдали в экспериментах на заводняемых нефтеносных пластах Бондюжского нефтяного месторождения (Татарстан), а при бактериальном окислении метана - в опытах с метанотрофными бактериями, нанесенными на обрушаемые породы выработанного пространства угольных шахт Донбасса (Украина).

Научная новизна. Полученные данные представляют комплексное исследование факторов, определяющих разделение (фракционирование) изотопов углерода микроорганизмами, являющимися ключевыми агентами в цепи круговорота углерода в природных экосистемах. Их новизна состоит в следующем.

1. Установлены факторы, определяющие фракционирование стабильных изотопов углерода фототрофными серобактериями и выявлена роль удельной концентрации С02 в формировании изотопного состава углерода при их метаболизме. Показано наличие специфичной концентрации С02, выше которой фракционирование изотопов определяется биохимическими особенностями изученных бактерий, а при ее уменьшении величина фракционирования изотопов углерода снижается и может достигать нулевого значения.

2. Впервые проведен систематический анализ разделения изотопов углерода микроорганизмами с гетеротрофным типом питания. Показано, что факторами, определяющими величину фракционирования ими изотопов углерода, является вероятность включения в конструктивный метаболизм субстрата или его части, а также соотношения потоков С02, выделяющейся из клетки и включенной в биомассу при ее гетеротрофной фиксации. Предложен критерий, позволяющий

определять участие гетеротрофных микроорганизмов в окислении углеводородов нефти по изотопному составу углерода метаболической С02, липидной и углеводной фракций биомассы.

3. Впервые с использованием сочетания методов материального и изотопного баланса выявлены закономерности фракционирования изотопов углерода чистыми культурами метанобразующих бактерий и доказано, что величина изотопного фракционирования обратно пропорциональна скорости бактериального метан-образования.

4. На основе современных биохимических представлений о механизме бактериального метаногенеза на С,- и С2-субстратах и полученных экспериментальных данных выявлены факторы, определяющие формирование изотопного состава углерода метана, биогенной С02, а также органического вещества биомассы и метаболитов. Показано, что фракционирование изотопов углерода метанобра-зующими бактериями зависит от используемого субстрата ( С02+Н2, метанол, метиламины, ацетат и др.), удельной его концентрации, видовой принадлежности микроорганизмов (мезофилы, термофилы) и удельной скорости метаногенеза.

5. Впервые выяснены причины, детерминирующие величину фракционирования изотопов углерода метанотрофными бактериями и выявлены количественные зависимости между изотопным составом углерода метана в среде обитания метанотрофных бактерий и долей его потребления. Установлена степень влияния условий роста метанотрофов (периодическое и непрерывное культивирование, рост клеток на твердофазных носителях и иммобилизованных в полимерные матрицы, аэрация ) на велтину фракционирования изотопов углерода потребленного ими метана

6. Разработаны методы количественного определения степени потребления и расходования микрооганизмами углерода субстрата в конструктивном и энергетическом обмене на основе анализа изотопного состава углерода продуктов их жизнедеятельности.

Научно-практическая значимость. 1. Создана теоретическая и экспериментальная база данных по фракционированию изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами, позволяющая количественно определять степень обогащения микробной биомассой лигно-целлюлозных природных комплексов (древесные опилки, измельченная солома) при росте на них грибов.

2. На основании анализа изотопных измерений углерода метана и углекислоты в заводняемых нефтеносных пластах и результатов лабораторных экспериментов по фракционированию изотопов углерода метзнобразующими бактериями, растущими на разных субстратах, доказано, что процесс современного бактериального метаногенеза способствует дополнительному получению нефти из нефтеносных пластов.

3. На основе лабораторных экспериментов по фракционированию изотопов углерода метанотрофными бактериями разработана и апробирована методика оценки активности метанокисляющих бактерий при реализации микробиологического способа снижения метана в атмосфере угледобывающих шахт. Результаты измерений изотопного состава углерода метана и углекислоты в шахтной атмосфере показали, что эффективность потреблния метана метанотрофными бактериями, нанесенными на обрушаемые породы в угольной шахте, достигала 50 - 70% от исходной концентрации метана.

Апробация работы. Материалы диссертации были должены на VI-XIII Всесоюзных симпозиумах по стабильным изотопам в геохимии (Москва, 1976, 1978, 1980, 1982, 1984, 1986, 1989, 1992 г.г.), на II-III Всесоюзных совещаниях по геохимии углерода (Москва, 1986, 1991г.г.),на международном симпозиуме "Изотопы в природе", (Лейпциг, 1983), на международном коллоквиуме по изотопам (Фрайберг,1988), на Ш-й Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Ле-

нинград, 1981), на школе-семинаре "Применение масс-спектрометрии в биологии и медицине" (Харьков, 1989, 1992 г.г.), на международной конференции по бактериальным газам (Милан, 1989), на 9-м международном симпозиуме по биогеохимии окружающей среды (Москва, 1990), на 2-й конференции по газам в морских осадках (Дания, 1992), на 193-м национальном собрании американского химического общества (Денвер, Колорадо, 1987).

Публикации. По итогам исследований опубликовано около 50 работ в периодической научной печати и тематических сборниках, получены 2 авторских свидетельства на изобретения. '

Основные защищаемые положения диссертации: 1. Фототрофные бактерии при росте в автотрофных условиях с разной скоростью включают в метаболизм углекислоту, содержащую 12 С и "С (т.е., фракционируют изотопный состав углерода). Также как у высших растений и водорослей, величина этого фракционирования фототрофньши бактериями определяется активностью их ферментных систем, участвующих в первичной фиксации углекислоты (РуДФ-, ФЕП-, и пируват-карбоксилазы).

Обнаружен и изучен фактор фракционирования изотопов углерода фотосин-тезирующими организмами, определяемый концентрацией углекислоты, который по степени влияния на формирование изотопного состава углерода продуктов их жизнедеятельности может перекрыть все другие известные причины, приводящие к фракционированию изотопов углерода.

2. Изучено фракционирование изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами - эукариотами (на примере грибов и дрожжей). В зависимости от используемого субстрата метаболическая углекислота и биомасса клеток могут быть как обогащены изотопом 13С, так и обеднены им относительно потребленной части субстрата. Факторами,определяющими формирование изотопного состава углерода биомассы гетеротрофов и их метаболитов являются процессы, связанные с гетеротрофной ассимиляцией углекислоты (карбоксилирование пирувата, ФЕП и др.) и ее выделением при метаболизме органических субстратов в клетке (функционирование окислительного пентозо-фосфатного цикла, цикла трикарбо-новых кислот и др.).

3. Изотопный состав углерода метана, продуцируемого метанобразующими бактериями, имеет широкий диапазон значений 513С (от крайне низких, не наблюдаемых ни для каких продуктов других организмов, и до величин, наследующих или даже тяжелее изотопного состава углерода используемого субстрата). Факторами, определяющими формирование изотопного состава углерода биогенного метана являются удельная концентрация субстрата (С02), удельная скорость метаногенеза, природа субстрата и особенности его метаболизма бактериями.

4. Фракционирование изотопов углерода метана метанотрофами, растущими в водной среде, определяется соотношением скоростей поступления метана из газовой фазы в жидкость и потреблением его бактериями. Соотношение потоков кислорода и метана в среду обитания метанотрофов также влияют на фракционирование изотопов углерода. Распределение изотопов углерода метана, потребленного бактериями, между биогенной углекислотой и биомассой клеток определяется активностью ферментных систем, ответственных за утилизацию углерода метана.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, и приложения. Общий объем работы : 300 страниц текста, 78 таблиц, 60 рисунков, в том числе 70 таблиц в приложении. Библиография включает 450 наименований

Исходной теоретической и экспериментальной базой для настоящей работы послужили труды Ф.А. Алексеева, С.С. Беляева, Э.М. Галимова, В.А. Гриненко, М.В. Иванова, Р.Н. Ивановского, B.C. Лебедева, АЛО. Леин, E.H. Кондратьевой,

Т.В. Финогеновой, В.И. Устинова, Р. Абеяьсона, Т. Хоуринга, Э. Брода, П. Парка, С. Эпштайна, Дж. Кельтженса, Г. Крейга, М. Шидловского, Дж. Трайтона и многих других, чьи исследования явились источниками информации как о фракционировании изотопов углерода биологическими системами, так и о физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов, которые в, ряде случаев были отправными точками дальнейших исследований и интерпретации полученных результатов.

В диссертации приводятся материалы исследований, выполненных совместно со специалистами биохимиками и микробиологами: М.В. Ивановым, С.С. Беляевым, А.И. Нестеровым, Б.Б. Намсараевым, К.С. Лауринавичусом, О.В. Шипи-ным, Г.И. Гоготовой, Ю.Н. Мшенским, P.P. Гаязовым, А.Н. Шкидченко, Н.В. Шишкановой, Т.В. Финогеновой, Д.Н. Черменским, В.Н. Шишкиной.

Аналитические и изотопные данные были получены при активном участии сотрудников лаборатории масс-спектрометрии: В.А. Бондаря, В.Н. Захарченко, В.И. Сысоевой, Л.П. Машкиной, В.П. Пешенко, В.В. Безручко, В.И. Волошина, А.Э. Голубицкого, C.B. Лысакова. Автор признателен всем коллегам, за помощь при выполнении этой работы.

Глубокую благодарность автор выражает академику М.В. Иванову - инициатору постановки исследований по микробиологическому фракционированию изотопов биофильных элементов, за постоянное внимание и помощь в организации исследований, участие в обсуждении полученных результатов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I Измерение изотопного состава углерода углеродсо-держащих продуктов. (Методическая часть)

Глава I состоит из трех разделов, в которых рассмотрены методические вопросы, связанные с измерением вариаций распространенностей стабильных изотопов углерода 12 С и ПС на уровне природных концентраций (12С - 98,9% и 13С - 1,1%), а также возможности использования их для количественных характеристик потребления субстрата и образования продуктов живыми организмами.

Изотопно разные субстраты (т.е. субстраты, содержащие 12 С и 13С изотопы) с разными скоростями участвуют в химических, биохимических и др. реакциях [Bigeleisen, 1952; Рогинский, 1956). В результате этого для незавершенных процессов отношения содержания изотопов углерода в продукте и остаточном субстрате будут разными, т.е. в реакции произошло разделение (фракционирование) изотопов углерода.

Количественно фракционирование изотопов углерода (D) в этом случае определяется из выражения: D—RcyK/Rnf,

где Дсу6с=(11:|С]/[12С])субс и Япр=([13С]/[12С])„р - отношения содержания изотопов углерода в остаточном субстрате и продукте. Величина D является интегральной характеристикой реакции и зависит от коэффициента фракционирования изотопов (а) и доли потребления субстрата F = (Qa - Q, )/Qa, где Qa и Qx -количества исходного и оставшегося на момент / субстрата.

Коэффициент a=k12/k13 определяется отношением констант скоростей реакций молекул субстрата, содержащих 12С и 13С изотопы, соответственно.

При убыли субстрата по реакции первого порядка существует выражение, которое определяет связь между величиной изотопного состава остаточного

субстрата (#субс), коэффициентом фракционирования (а) и долей потребления субстрата (/) [Гриненко и Гриненко, 1974]: Rcy5c = R„ » (1 - F)exp{(l-a) / а), где

R0 - отношение содержания изотопов углерода 13С и 12 С в исходном субстрате. Для изотопного состава продукта, имеем: Rnp =R0»{(1 - (1 - F)exp(l / а)} / F. В случае малых величин F (на начальных стадиях реакции) величина фракционирования изотопов (D) близка к коэффициенту а, (т.е. а = Лсу6с/Лпр).

Для обеспечения надежности измерения малых вариаций распространенностей изотопов углерода величины R^р анализируемых веществ сравнивали с Лст для образцов, принятых в качестве стандартов, используя выражение: á13Co6p=(Ro6p/R„-l).1000 %o

В настоящее время международным стандартом для углерода является карбонат кальция окаменелости Belemnilella americana поаднемелового периода формации Пи Ди (штат Южная Калифорния, США) - стандарт PDB [Craig, 1957]. Его значение составляет: Rpdb= 0.0112372.

При малых значениях F коэффициент а находим из выражения:

в = (1000+513Ссу6с)/(1000+5,3Сщ))

Важным параметром, количественно характеризующим реакцию, является материально-изотопный баланс для веществ как участвующих, так и образующихся в реакции. Если количества продуктов нормировать по исходному количеству реагента (Q„„ = 1), то тогда:

г,3си„ = £ б,3с, • х, + 5!3cOCT. (i - £ х,)

t-i i-i

где Xi - доля соответствующего продукта в смеси; 5|3Сисх, й13Сост, á13C¡ -изотопный состав исходного реагента, его оставшейся части и продуктов реакции, соответственно.

Анализ малых вариаций распространенностей изотопов углерода проводили с использованием методов изотопной масс-спектрометрии (двухколлекторный приемник ионов и двухканальная система ввода анализируемых газов в масс-спектрометр). В качестве рабочего газа использовали С02, получаемую в результате сжигания органических веществ или разложения карбонатов с помощью безводной ортофосфорной кислоты. Анализируемые образцы С02 предварительно очищали от примесных газов и паров воды путем низкотемпературной вакуумной дисгиляции.

Об изотопном составе углерода в анализируемых образцах судили по отношению интенсивностей пиков в масс-спектре углекислоты для ионов с m/z 44

(UC1602) и m/z 45 (13С1602), определенные на масс-спектрометре СН-7 (Вариан,

ФРГ)- Точность вычисленных значений б13С составляла ±0.2 %о.

Глава II. Фракционирование изотопов углерода фотосинтезирующими организмами.

В главе II, состоящей из 6-ти разделов, проведен анализ факторов, определяющих формирование изотопного состава углерода в продуктах, образующихся при биологическом фотосинтезе (высшие растения, водоросли, фотогрофные бактерии). Основой для выявления возможных причин, оказывающих влияние на распределение изотопов углерода в продуктах высших растений и водорослей, служил обширный материал, предегавленый в литературе.

Нами проведены исследования с фототрофными бактериями, принадлежащими к 4-м семействам (Rhodospirillaceae, Chromatiaceae, Ectothiorhodaceae и Chlo-

гоЫасеае). В случае семейства СЫого/1ехасеае были взяты оценочные литературные данные.

В зависимости от условий роста и биохимических особенностей фотототроф-ных бактерий изучено распределение изотопов углерода потребленной углекислоты и продуктов, образующихся при фотосинтезе. Установлено, что, как и в случае высших растений и водорослей, величина разности в изотопном составе углерода биомассы бактерий (продукт) и остаточной углекислоты в среде (субстрат) зависит от активности ферментных систем, ответственных за первоначальную фиксацию углекислоты (табл. 1).

Таблица 1.Фракционирование изотопов углерода пурпурными и зелеными

Название микроорганизмов X ---- ------. Й13С ° нса; , Ко г13с6и0, %0 Д13С, Я

Ес1лЫро^1пИта 0,66 +7,2 -32,2 38

П. гозеорепшпа 0,63 +5,3 -23,9 -29,2 75

Ю\.ра!ш1т 0,57 +6,0 -24,1 -30,1 3

СкЛШЫа 0,62 +4,0 -16,9 -20,9 0

513Снсо-, 513Сб1Ю, - изотопный состав углерода остаточного бикарбоната и биомассы, соответственно;

д'3С = <513С6Ж)- 513Снсо. - величина фракционирования изотопов углерода;

Я= (активность РуДФ-карбоксилазы)/(активность ФЕП-карбоксилазы), активности взяты из ( Ивановский, 1986 ).

X =( [НС03 7] )/(|НСО} ; ] ), где индексы ¡-, г-исходный и остаточный.

Обнаружено, что рост пурпурных серобактерий Ес.1. зИарохИткоуи при разных удельных концентрациях субстрата (т.е. количествах бикарбоната в среде, отнесенных на единицу биомассы клеток или на клетку) сопровождается разным фракционированием изотопов углерода, которое определяется величиной разности между 513С остаточной углекислоты в среде и образовавшейся биомассы (продукта).

Рис. 1. Фракционирование изотопов углерода фототрофными бактеиями в зависимости от удельной концентации углекислоты, (0, мМоль "НС03"/мг биомассы)

С'Снсо^Ьюга = ^"Снсо^гта) ~ ^"^Ьшт

Как следует из рис. 1, имеется такая удельная концентрация бикарбоната в среде роста фототрофных бактерий, выше которой увеличение содержания углекислоты незначительно сказывается на фракционировании изотопов углерода, а ниже - фракционирование заметно снижается, достигая нулевого значения или даже проявляя обратный изотопный эффект, т.е. в биомассе бактериальных клеток содержится больше изотопа 13С, чем в остаточной углекислоте в среде. Экспериментально доказано, что изменение фракционирования изотопов углерода фототрофными бактериями от удельной концентрации углекислоты зависит от вклада "вторичной" (метаболической) углекислоты, продуцируемой бактериями (например, при декарбоксилировании пирувата или изоцитрата) в общий пул углекислоты. Чем больше доля метаболической углекислоты в среде, тем меньше различие в изотопном составе углерода углекислоты и биомассы фототрофных бактерий. Аналогичная зависимость фракционирования изотопов углерода водорослями была получена нами после соответствующей обработки имеющихся в литературе экспериментальных данных по изменению изотопного состава углерода биомассы относительно углекислоты при разных ее концентрациях в среде [Perdue et al., 1976; Estep et al., 1978].

Семейство < V.. ) - л" С Мви '"СнсвЗ

-40 -ЗО -20 -ю О

Rhodoapirillaceee

Chromaticeee ¿Ь-

Ectothiorhod »сеа« Z^-

СЫогоЫасем ¿2J

Рис 2. Величина фракционирования изотопов углерода фототрофными бактериями

А - наиболее вероятное значение &"С при росте на С02 (газ); Д - при росте на НС03";

--диапазон значений Д13С, встречающихся в литературе.

Анализ литературных и собственных данных по фракционированию изотопов углерода водорослями и фототрофными бактериями позволил прийти к заключению, что их биохимические особенности могут отражаться на фракционировании изотопов углерода лишь при концентрациях углекислоты в среде, превышающих на порядок содержание углерода в биомассе. Факторы внешней среды (температура, рН, концентрация солей) в большей степени будут проявляться при низких концентрациях углекислоты (количество углерода углекислоты примерно равно или меньше его количества в биомассе живых клеток ). В свете этого становится понятным широкий диапазон величин фракционирования изотопов углерода фототрофными бактериями для одних и тех же видов, полу-

ченных разными авторами (рис.2). Поскольку ранее не уделялось должного внимания удельной концентрации углекислоты как фактору, определяющему фракционирование изотопов углерода фотосннтетиками, то, вероятно, отмеченные выше факты обусловлены тем, что опыты проводили при низких удельных концентрациях субстрата, где условия среды ( температура, рН, соленость и т.п. ) в значительной степени сказывались на величине фракционирования изотопов углерода этими микроорганизмами.

Глава ш. Фракционирование пзотопов углерода гетеротрофами

В данной главе анализируется имеющийся фактический материал по разделению изотопов углерода гетеротрофами. В первых трех разделах представлен анализ литературных данных по фракционированию изотопов углерода животными и гетеротрофными микроорганизмами - прокариотами. Четвертый раздел посвящен обсуждению полученных нами экспериментальных данных по фракционированию изотопов углерода при росте гетеротрофных эукариот ( грибов и дрожжей).

При росте гетеротрофных бактерий на субстратах, являющихся компонентами клеток (например, аминокислоты) происходит определенное формирование изотопного состава углерода. Чем выше частота встречаемости в клетке соответствующей структурной единицы, используемой в качестве субстрата,тем в большей степени биомасса клетки обогащена изотопом 13С относительно потребленного субстрата (рис.3).

Рис 3. Изотопный состава углерода биомассы бактерий Vibrio harveyi штамм В-352 относительно аминокислот (субстратов) (Д13С,%о) [Macko & Estep, 1984] в зависимости от частоты обнаружения (R) этих аминокислот в биомассе гетеротрофных бактерий (за 100% принимается частота обнаружения аланина) [Ле-нинджер, 1976]. (Коэфициент линейной корреляции г=0.921 при доверительной вероятности 0.95)

Внутримолекулярная изотопная неоднородность углерода в продуктах гетеротрофных организмов, например, аминокислот [Abelson & Hoering, 1961 ], имеет определенные различия по сравнению с автотрофами. У ряда аминокислот гетеротрофов углерод карбоксильных групп обеднен 13С по сравнению с углеродом алкильной их части, тогда как у фотоавтотрофов имеет место обратная зависимость - углерод карбоксильных групп аминокислот обогащен 13С по сравнению с их алкильными группами. Эти различия обусловлены, в конечном счете, биосинтетическими механизмами утилизации углерода. Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют о специфичности формирования изотопного состава углерода гетеротрофами и необходимости более глубокого их изучения.

Объектами дальнейшего исследования фракционирования изотопов углерода гетеротрофными организмами нами были использованы грибы и дрожжи, в отношении которых не имелось экспериментальных данных. Грибы. Рост грибов РкапагосИаЫа сНфСярогшт и Рапш И%ппи$ на древесных опилках и измельченной пшеничной соломе сопровождается фракционированием изотопов углерода. Метаболическая углекислота обеднена 13С, а биомасса (мицелий), наоборот, имеет повышенное содержание этого изотопа относительно используемого субстрата. Различие в изотопном составе углерода метаболической углекислоты относительно мицелия грибов, выращенных на лигно-целлюлозном субстрате, составляет 2-6%о. При росте этих грибов на древесных опилках и измельченной соломе обнаружено образование газообразного метаболита - СО, количественно зависящего от концентрации кислорода в среде. Изотопный состав углерода СО, продуцируемого грибами, растущими на древесных опилках, на 3%о обеднен изотопом 13С относительно субстрата, а при их росте на измельченной соломе наблюдается обогащение этим изотопом на 5%о относительно субстрата.

Полученные изотопные характеристики углерода продуктов, образуемых грибами при росте на лигно-целлюлозных субстратах (рис. 4), позволили предложить подходы для количественной оценки метаболической активности грибов в природных экосистемах, лабораторных и промышленных процессах, в частности: а) определения количества углерода субстрата, израсходованного грибами на образование метаболической углекислоты при их росте на лигно-целлюлозном субстрате; б) определения доли органического вещества биомассы грибов в смеси субстрат - мицелий; в) оценки эффективности использования грибами углерода субстрата на биосинтез мицелия.

Рис 4. Изотопный состав углерода смеси субстрата (солома) и выращенного на нем гриба Partus tigrinus (S13CZ) в зависимости от содержания мицелия (£) £=(qm/(qs +qm)}' 100%, где qs, qm- количества мицелия и субстрата в смеси

Дрожжи. Изучение фракционирования изотопов углерода дрожжами проводили у Candida quilliermondii и Candida lipotytica. Эти дрожжи были выбраны, во-первых, исходя из их способности использовать органические субстраты, различающиеся степенью окисленности углерода (например, глюкоза и н-алканы), и, во-вторых, возможности управлять в определенной степени путями их метаболизма.

Рост дрожжей иа н-алканах. В режиме периодического культивирования С. quilliermondii в метаболической углекислоте отмечено пониженное содержание тяжелого изотопа 13С по сравнению с потребленными н-алканами. При этом величина 513С углекислоты практически не изменялась в процессе роста популяции и составляла -32 ±2%о. Такие же значения 513С имела углекислота, продуцируемая этими дрожжами при проточном культивировании на н-алканах. Изо-

топный состав углерода биомассы С. дшШегтопсШ, выращенных на н-алканах, составлял -23.3 ±1.4 %о. Таким образом, разность в величинах 513С основных продуктов рассматриваемых микроорганизмов (биомасса и метаболическая углекислота) достигала 7-10%о.

При культивировании С. Иро1упса на н-алканах и глюкозе в одном и том же опыте изучали культуру как на стадии ее роста, так и при образовании, в основном, экзометаболитов. В случае н-алканов это достигали за счет первоначального внесения в питательную среду заведомо малого количества тиамина. При этом наблюдали два состояния культуры: активный рост биомассы клеток (наличие тиамина) и интенсивный биосинтез экзометаболитов (а-кетоглутаровой и пиро-виноградной кислот) при лимите по тиамину. На первой стадии развития культуры реализуется известная схема метаболизма н-алканов дрожжами, где углекислота образуется при декарбоксилировании малата, оксалоацетата, изоцитрата (возможно некоторой части а- кетоглутарата). На второй стадии (при лимите по тиамину) углекислота образуется, в основном, при декарбоксилировании изоцитрата (Финогенова,1982).

Различия в путях образования метаболической углекислоты отражаются и на разности в изотопном составе ее углерода по отношению к биомассе клеток (рис.5). Так, на первой стадии разность величин <513С углекислоты и биомассы составляет 8-10%о, а на второй - 4-5%о. Поскольку метаболическая углекислота на второй стадии образуется в основном при декарбоксилировании изоцитрата, то фракционирование изотопов углерода рассматривали в паре С02 - а-кето-глутарат. И в этом случае разность 513С для этих продуктов составляла 8-10%о.

Рис 5. Рост дрожжей Candida lypofytica на н-алканах при лимите по тиамину и

изотопный состав углерода С02 (газ) и биомассы клеток.

Vco¡ (л / мин.) - скорость образования метаболической углекислоты;

Q6(r / л) - количество биомассы в культуральной жидкости;

QK(r/ л) - количество а-кетоглутаровой кислоты в среде.

Таким образом, рост дрожжей на н-алканах сопровождается фракционированием изотопов углерода, в результате чего метаболическая углекислота на 8-10%о обеднена изотопом 13С относительно основных метаболитов, включая биомассу клеток.

Рост дрожжей на глюкозе. При исчерпании азота культура С. Иро1уйса переходила из активного роста на биосинтез лимонной кислоты, как основного экзометаболита. Утилизация глюкозы дрожжами происходила, в основном, по двум путям: гликолитическому расщеплению (из молекулы глюкозы образуется 2 молекулы пирувата) и частичному окислению в окислительном пентозофосфат-ном цикле (ОПФЦ) (из молекулы глюкозы образуется 3 молекулы С02 и пиру-ват). Пируват, образовавшийся по обоим путям метаболизма глюкозы, может далее окисляться в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) до С02 . Следовательно, и пируват и углекислота в растущей культуре представляют смеси по их происхождению. При активном росте биомассы дрожжей на глюкозе происходит карбоксилирование пирувата или фосфоенолпирувата и образование оксало-ацетата (метаболита ЦТК). Часть углекислоты, образовавшаяся в ОПФЦ при окислении глюкозы, вновь включается в органическое вещество биомассы. Этот процесс сопровождается фракционированием изотопов углерода и оценивается величиной изотопного эффекта ое= 1,008. Из рис. б следует, что на стадии активного роста культуры на глюкозе метаболическая углекислота обогащается 13С на 4-5%о относительно биомассы. На стадии биосинтеза лимонной кислоты (рост культуры минимален или отсутствует) образовавшаяся в ОПФЦ углекислота, не подвергаясь последующему фракционированию изотопов при гетеротрофной фиксации, выходит из клетки. Изотопный состав углерода углекислоты на этой стадии достигает -14,7%о, т.е., С02 обеднена 13С относительно биомассы на 3 - 4 %о. Принимая во внимание особенности метаболизма глюкозы при биосинтезе лимонной кислоты (лимит по азоту) и изотопные характеристики углерода метаболической углекислоты, лимонной кислоты и используемого субстрата, определено, что фракционирование изотопов углерода при окислении глюкозы в ОПФЦ сопровождается обеднением изотопом 13С углекислоты до 10%о относительно субстрата (а=1,01). Таким образом, метаболическая углекислота, образующаяся при окислении органического субстрата гетеротрофными организмами, обеднена изотопом 13С до 10%о относительно субстрата.

Vo зо о2 ^ * з.о- Q« 15. • у ^-^Лимонная —к полота

го 2.0 Ю. - ~ ^Биомаооа

to . 1.О. 5. . ___

в!3с -7.0 - 1.о г.о з.о

-9.0 • -11.0 . -И ^^^^ ^ 'биом.

i.o г.о Время К/ЛЬТИВ1 З.О 1 ров а кия, < Cjtxk-и >

Рис 6. Рост дрожжей Candida lypofytica на глюкозе при лимите по азоту и

изотопный состав углерода С02 (газ) и биомассы клеток.

vc0j (л / мин.) - скорость образования метаболической углекислоты;

Q6(r/ л) - количество биомассы в культуральнсй жидкости;

QK(r/ л) - количество лимонной кислоты в среде.

Полученный результат не всегда наблюдается в природе, что очевидно связано с гетеротрофной фиксацией С02, сопровождаемой фракционированием изотопов углерода с обратным знаком по отношению к процессу ее образования. В зависимости от степени окисленности используемого субстрата возможны разные количества продуцируемой углекислоты и, соответственно, будет различаться ее гетеротрофно фиксируемая часть. Это, в свою, очередь, будет определять степень обогащения 13С выходящей из клетки С02: чем большая часть углерода метаболической углекислоты обратно включается в биосинтез органических продуктов клетки, тем в большей степени будет обогащена изотопом 13С углекислота, выходящая из клетки. Подтверждением этого служит количество субстратов, расходуемое грибами и дрожжами на образование углекислоты, и, соответственно, изотопный состав ее углерода относительно биомассы (табл. 2).

Таблица 2. Изотопные характеристики углекислоты относительно потребленного субстрата (Д,:1ССО)_су6ст) и количества углерода субстратов, израсходованных грибами и дрожжами на обраование С02.

Культура Субстрат, Расход субстрата Д|3С %с\

культивирование на С02, %

С. Iipolytica н-алканы, 60 - 70 -6--7

(периодика)

С. quilliermondii н-алканы, 40 -60 -4 - 6

(периодика)

С. quilliermondii н-алканы, 55 -4,4

(проток)

Ph. chrysosporium целлюл. +ЛИГНИН, 16 - 18 -0,9 - -3,2

(древесина)

P. tigrinus целлюл. +лигнин, 20 - 30 0- -1

(солома)

С. Iipolytica глюкоза 6 +3,4

Таблица 3. Изотопный состав углерода метаболических продуктов, образующихся при росте дрожжей Candida iipolytica на углеводородах и глюкозе.

Анализируемые

Глюкоза н-алканы продукты _

513С,%о Д,%о 5'3С,%о Д,%о

Субстрат -10.0 0 -28.3 0

Биомасса -10.1+0.5 -0.1 -30.5+0.5 -2.2

Углекислота -8.0+0.6 +2.0 -35.0+0.5 -6.7

Белки -11. +0.5 -1.0 -31.0+1.5 -2.7

Липиды -13. +0.3 -3.0 -27.0+1 + 1.3

Углеводы -10.0 0 -33.0+1 -4.7

Экзометаболиты -9.4+0.8 +0.6 -26.0+1 +2.5

Д -Изотопный состав углерода продуктов определен относительно субстрата.

На примере роста дрожжей на н-алканах и глюкозе обнаружены различия в содержании 13С в липидной и углеводной фракциях, связанных с путями их

биосинтеза на указанных выше субстратах (табл 3). Так, рост дрожжей на н-алканах, сопровождаемый гликонеогенезом, приводит к обеднению изотопом 13С углеводной фракции, липндная практически наследует изотопный состав субстрата. Рост этих же микроорганизмов на глюкозе, связанный с липоге-незом, приводит к обеднению изотопом 13С липидной фракции. Различия в изотопных характеристиках углерода метаболитов и отдельных клеточных фракций дрожжей, растущих на н-алканах и глюкозе, можно использовать в качестве специфических признаков, указывающих на потребление микроорганизмами углеводородов в качестве субстратов в природных экосистемах.

В заключение следует отметить, что обнаруженный факт представляет практический интерес, в частности, при выяснении роли микроорганизмов в очистке от загрязнений углеводородами нефти и нефтепродуктами водных и почвенных экосистем.

Глава 4.Фракционирование изотопов углерода метапобразущими

бактериями

В данной главе рассмотрены литературные данные по изотопному составу углерода метана в природных газопроявлениях, а также результаты лабораторных и натурных экспериментов, направленные на выяснение факторов, влияющих на формирование изотопного состава углерода метана.

В лабораторных экспериментах, моделирующих фракционирование изотопов углерода при бактериальном метанобразовании, был использован метанол в качестве субстрата, активирующего метаногенез накопительной культурой, выделенной из глубоководных восстановленных иловых осадков Тихого океана (ЛоБепГеШ & БЛгеппап, 1959), и осадков Большого содового озера (США) (Огет1ап<1 е( а!., 1982). Получаемый в этом случае метан был обеднен 13С относительно субстрата до 70-80%о. В опытах с накопительными культурами, растущими на ацетате, также обнаружено обеднение 13С биогенного метана (цо 80%о) (Ыакт, ¡960).

Проведенные Геймсом и Хайесом (табл.4) исследования фракционирования изотопов углерода метана при росте чистых культур метанобразующих бактерий

Таблица 4. Фракционирование изотопов углерода метанобразующими бактериями в лабораторных экспериментах (литературные данные)

Культура

Субстрат

Литература

Накопительная культура метанол

Накопительная культура Накопительная культура Methanosarcina barken Methanobacterium шт. M.O.H.

Mb. thermoautotrophicum Ms. barkeri

ацетат метанол co2 + H2 CO, + H,

CO,

'2 + H2 ацетат метанол co2 + H,

1,081

1,081 1,081 ■ 1,044

1,059

1,025 1,021 1,076 1,045

Rosenfeld & Silverman, 1959

Nakai, 1960 1,087 Oremland et al., 1982 Games & Hayes, 1976

Games & Hayes, 1976

Games & Hayes, 1978 Kizycki et al., 1987

на С02 +Н2 показали, что различия в содержании 13С в бактериальном метане и субстрате значительно меньше, чем это наблюдали в морских экосистемах и лабораторных экспериментах с накопительными культурами, выделенными из этих систем при их росте на метаноле и ацетате. С другой

стороны, определенные активности метанобразующих бактерий в иловых осадках морских водоемов с использованием тестовых субстратов С02 +Н2 и ацетата показали, что в этих системах бактериальный метаногенез происходит преимущественно за счет потребления С02 +Н2. При этом разность в изотопном составе углерода метана и углекислоты в анализируемых морских осадках составляла -(60-80)%о (Beljaev et al., 1975; Lein et al.,1981). Поэтому нет ясности в какой степени лабораторные эксперименты по фракционированию изотопов углерода при бактериальном метаногенезе отражают процессы, происходящие в природных экосистемах и какие факторы оказывают воздействие на них? Поискам ответа на эти вопросы посвящена глава 4.

В общей схеме восстановления углекислоты до метана [Keltjens & van der Drift, 1986] можно выделить циклы (рис. 7), в которых перенос углеродосодержащих продуктов от одного к другому может сопровождаться фракционированием изотопов углерода. На отдельных стадиях восстановления С02 до метана Cj -метаболиты включаются в прямые реакции, а их промежуточные комплексы с С, - носителями в обратные реакции [Keltjens & van der Drift, 1986]. Различия в молекулярных весах изотопно разных С, - метаболитов (прямая реакция) значительно больше, чем в случае их комплексов ( обратная реакция). Поступление изотопно разных С[ - метаболитов к активному центру ферментной сисиемы сопровождается кинетическим изотопным эффектом (КИЭ),

оцениваемым величиной а = ^т2 / т, [Галимов, 196g], где т1 и т2 - молекулярные веса С, - метаболитов, соответственно. Следовательно, КИЭ, зависящий от молекулярных весов 12 С- и 13С - содержащих метаболитов, прямых реакций значительно больше, чем обратных и, соответственно, будет определять общий изотопный эффект отдельных стадий.

jsvsfc^ IF""" I ICO-MF COj-MF г--^ а у • а „ - 1.019 СО, цикл е* - 1.01У Метаноф/рановый

HCO-H^MPT-" "^н, -H4MPT а - 1.033 Метаноптеряновый

СН ,-S-CoM

V У к „ . Т ». - HS-CoM

4: сн. а - 1.031

Рис. 7. Стадии фракционирования изотопов углерода метанобразующими бактериями, растущими на С02 + Н2. ( Построены согласно [Keltjens & van der Drift, 1986] ).

Цикл I (рис.7) (цикл углекислоты) связан с транспортом углекислоты из жидкой среды в бактериальную клетку. Фракционирование изотопов углерода в нем будет определяться термодинамическим изотопным эффектом (ТИЭ) в системе НСО3 - С02, и КИЭ при ферментативном связывании С02 с метано-фураном (перенос С02 в метанофурановый цикл). С учетом диапазона температур культивирования мезофильных метанотрофов (-2 - +37 ° С) ТИЭ для С02

относительно HCOJ составляет ат - 1.009 - 1.006 [Deuser & Degens, 1967], а КИЭ определяем равным ак =1.011. Общий изотопный эффект в цикле I оцениваем величиной порядка а = а r х ак= 1.017 - 1.02.

В метанофурановом цикле (цикл II) углекислота восстанавливается до фор-мильной группы и переходит в следующий, метаноптериновый цикл (цикл III). КИЭ при переносе формильной группы (ак=1.017) может приводить к обеднению 13С до 17%о относительно С02 в цикле II.

В цикле III углерод углекислоты восстанавливается до метальной группы, которая затем переходит к HS-KoM. Перенос метальной группы сопровождаеться КИЭ (ак = 1.033), в результате чего углерод СН3 -группы, связанной с HS-KoM, обедняется 13С на 33%о относительно этой группы в цикле III. Если СН3 -S-KoM восстанавливается до СН4 необратимо, то тогда фракционирование изотопов

углерода метана относительно НСО, в среде может иметь величину: а=(1,017+1,02)' 1,017' 1,033=1,067+1,07 или -(67-70)%о. Если же только некоторая часть метана выходит из клетки и осуществляется обратный переход метана с образованием метальной группы, то возможна реализация КИЭ на стадии диффузии метана из клетки (ак=1.031). Таким образом, теоретически максимально оцениваемое фракционирование изотопов углерода при бактериальной метангенерации на С02 +Н2 будет достигать -(98- 101)?6о.

Рис. 8. Фракционирование изотопов углерода метанобразующими бакгерями в зависимости от удельной скорости продукции метана (V- 10~1Омл СН4 / кл. в ч

1 - мезофильные метаногены, растущие на С, -субстратах;

2 - мезофильные метаногены, растущие на С2 -сустратах

3 - термофильные метаногены, растущие на Ct -субстратах. « = (1000+513ссу&) /.(1000+S13^)

Измерение изотопного состава углерода метана (рис.8), образуемого чистыми культурами Methanobacterium formicicum шт. Kuznetsov, М. brjantii шт. Ivanov, М. thennoautotrophlcum шт. ДН и Methanosarcina barken шт. MS относительно углекислоты в зависимости от их удельных скоростей метаногенеза показало, что при снижении удельной скорости бактериального метаногенеза величина разности в изотопном составе углерода углекислоты и продуцируемого метана возрастает.

Таким образом, литературные и полученные нами данные свидетельствуют о том, что фактором, определяющим фракционирование изотопов углерода при максимальных скоростях метангенерации (до -20%о, рис.8), является цикл углекислоты, а при крайне низких удельных скоростях фракционирование изотопов углерода реализуется во всех циклах. Максимальное (> 100%о) фракционирование

изотопов углерода метанобразующими бактериями, растущими на С02 +Н2, по нашим данным, может быть достигнуто лишь в случае существования одновременно с восстановлением С02 до СН4 "реокисления" метана до С02. Принципиальная возможность окисления метана метаногенами была показана и ранее (Zehnder & Brock, 1979). Согласно нашему предположению "обратное окисление" метана метаногенами должно проявится также на разности изотопного состава углерода углекислоты (субстрата) и метана (продукта). Полученные данные о зависимости этой разности от удельной концентрации углекислоты для Mb. formicicum при росте на С02 +Н2 (рис. 9) свидетельствуют о том, что увеличивающаяся относительная часть метаболической (вторичной) углекислоты в среде культивирования метаногенов может существенно снижать величины разностей 513С, характеризующих изотопный состав углерода биогенного метана и остаточной углекислоты. Это свидетельствует также в пользу доказательства 'обратного окисления' части метана метанобразующими бактериями. Таким образом, диапазон возможных значений <513С для метана, образуемого бактериями, относительно С02 изменяется в пределах (от -19 до -100%о) в зависимости от удельной скорости его бактериального образования на С02 +Н2. При низких удельных концентрациях С02 и высоких удельных концентрациях метана в среде разность в изотопном составе углекислоты и метана может быть близка к 0.

Рис. 9. Фракционирование иотопов углерода бактериями МеЛапоЬас1егшт /оптасит , растущими на С02 и Н2 в зависимости от удельной концентраии С02 (<3, мг"С"/мг "С" органического вещества).

Для дальнейшего выяснения факторов, влияющих на фракционирование изотопов углерода при бактериальном метаногенезе, была проведена оценка роли органических субстратов (формиата, метанола, метиламина, ацетата) в формировании изотопного состава углерода продуцируемого метана. В проведенных опытах спектр культур, использующих органические субстраты, за исключением формиата, ограничивался представителями родов Ме1капо$агста и МеЛапососсоМея, а на формиате рос и представитель рода МеЛапоЬас/егшт (МЬ./огтШсит штамм Кигп^яоу). Оказалось, что во всех опытах на органических субстратах (формиате, метаноле, метиламине) образуется углекислота, обогащенная ПС относительно субстрата до 15 - 19%о. Это позволяет полагать, что наряду с восстановлением метальной группы субстрата до метана возможна реализация механизма, связанного с первоначальным окислением субстрата до С02, а затем восстановление последней до СН4. Этому предположению не противоречат и литературные дан-

ные по определению происхождения водородных атомов метана, образуемого метаногенами при их росте на метаноле и метиламине (Walter et al., 1981).

Исследование фракционирования изотопов углерода метана и углекислоты, культурой Methanosarcina штамм 47 растущей на ацетате в зависимости от удельной скорости метанобразования, показало, что как и при метаногенезе на С, -субстратах (С02 +Н2, метанол, метиламин, формиат) образование метана у метанобразующих бактерий, растущих на ацетате (С2 -субстрат) происходит с аналогичной зависимостью величины фракционирования изотопов углерода от удельной скорости метаногенеза (рис.8). При низких скоростях образования метана изотопный состав его углерода существенно обеднен "С по сравнению с метильной группой ацетата, являющейся на 80 - 85% его источником (Krzycki et al., 1982). При увеличении удельной скорости метаногенеза на ацетате содержание 13С в образуемом метане также возрастает. Однако, в отличие от предыдущих опытов, при максимальных удельных скоростях метанобразования бактериями, растущими на ацетате, изотопный состав углерода биогенного метана содержит 13С, больше, чем его количество в метильной группе потребленного ацетата как основного предшественника метана. В этих опытах (рис.10) проявляется механизм трансформации углерода ацетата метанобразующими бактериями, приводящий к изотопному эффекту, способствующему не обеднению метана изотопом "С, как это наблюдали ранее, а наоборот, к увеличению его содержания относительно потребленного субстрата (обратный изотопный эффект).

Рис. 10. Стадии факционирования изотопов углерода метанобразующими бактериями, растущими на ацетате. (Построены согласно [Keltjens & van der Drift, 1986] )

Для выявиления КИЭ, обуславливающих фракционирование изотопов углерода на стадии потребления субстрата, были проведены исследования с практически полным исчерпанием ацетата метанобразующими бактериями. Оценка зависимости изотопного состава углерода остаточного ацетата в культуральной жидкости и образующихся продуктов (метана и углекислоты) при росте на нем Methanosarcina sp. штамм 47 при двух удельных скоростях метангенерации (медленной 1,8 х 10~2 мл СН4 /мг биом. в час и быстрой 6,9 х 10"2 мл СН4 /мг биом. в час) показали, что по мере потребления ацетата метаногенами в первом

случае (рис.11, А) изотопный состав оставшейся его части обогащается 13С (эффект Релеевского исчерпания). Во втором (рис.11, В) - изотопный состав углерода остаточного ацетата в течение опьгга практически не изменялся. Однако отмечены существенные изменения величин 5,3Ссо и513Ссн в зависимости как от удельных скоростей роста культур на ацетате, так и степени его исчерпания.

Рис. 11. Изотопный состав углерода ацетата (513С ацетат), метана (513С СН4), углекислоты (513Сс02) при росте Melhanosarcina barkeri на ацетате в зависимости от доли его потребения (F).

А. Удельная скорость метаногенеза 1,8 • 10~2 мл СН4/мг биомассы в час; 3. Удельная скорость метаногенеза 6,9 • 1(T2 мл СН4 /мг биомассы в час. ( В используемом ацетате ¿|3Ссм=-27,8%о и 513ССООН=-З2,0%о)

При низких удельных скоростях метангенерации изотопный состав углерода СО2 обеднен 13С относительно СООН-группы на 10%о, а СН4 - относительно СН3 -группы на 22%о. При высоких удельных скоростях метанобразовання на начальных стадиях потребления субстрата 513CCOi относительно СООН-групп свидетельствует об обеднении изотопом 13С углекислоты на 13%о, в то время как биогенный метан обогащен 13С относительно СН3 -группы на 6%о. С уменьшением количества субстрата (ацетата) в среде изотопный состав углерода углекислоты в обоих случаях (рис.11, А, В) имеет тенденцию к увеличению содержания 1!С относительно первоначальных ее значений в опьгге (при малых

долях потребления субстрата, F<0,2). Величина 613Ссн , характеризующая изотопный состав углерода биогенного метана,образуемого бактериями при росте на ацетате с разными удельными скоростями метаобразования, существенно различается. При низкой удельной скорости метангенерации (рис. И, А) изотопный состав углерода метана обеднен изотопом 13С и изменяется в соответствии с изменением изотопного состава ацетата. По мере потребления ацетата изотопный состав углерода метана обогащается изотопом 13С

относительно начальных его порций. При высоких удельных скоростях образования метана его изотопный состав углерода, наоборот, по мере

потребления субстрата обедняется изотопом 13С (например, от 513ССН) = -22%о

при F<0,1 до 5пСсн = -34%о при F<0,9). Возможные объяснения обнаруженных изменений в изотопных характеристиках углерода метана и углекислоты следует искать, по-видимому, в биохимических особенностях их Образования при росте метаногенов на ацетате (см. рис.10 ). Фактор, определяющий фракционирование изотопов углерода метана, заложен в биохимических особенностях роста метанобразующих бактерий на ацетате, которые соответствующим образом проявляются при разных удельных скоростях метанге-нерации.

Таким образом, полученные данные по фракционированию изотопов углерода меганогенами позволили уточнить существовавшие ранее представления о возможности использования изотопных характеристик углерода метана для выяснения его происхождения в природных экосистемах. С определенной степенью достоверности можно судить о бактериальном происхождении метана

лишь в том случае, если идентифицируемый метан имеет 513Ссн менее -55 - -

50%о. При более высоком содержании 13С ( 513Ссн< > -45%о) метан может быть как бактериального, так и иного (например, термокаталитического) происхождения.

В качестве примера, демонстрирующего применение закономерностей формирования изотопного состава углерода метана, полученного при образовании чистыми культурами метаногенов в лабораторных условиях, приведено доказательство современного бактериального метаногенеза в пластовых водах эксплуатируемых нефтяных месторождений. Опыты проводили на двух участках Бонд-южского нефтяного месторождения (Татарстан). Из анализа полученных данных следовало, что микробиологические, физико-химические и изотопные данные по углероду метана и углекислоты свидетельствуют об активации метан-образующей микрофлоры в экспериментальных нефтедобычных скважинах, способствующей увеличению содержания метана в пластовой жидкости.

Глава V. Фракционирование изотопов углерода метанотрофами

К началу работы автора по этой проблеме в литературе имелись лишь два сообщения (Silverman & Oyama, 1968; Lebedev et al.,1969), свидетельствующие о том, что метанокисляющие микроорганизмы включают в свой метаболизм метан, содержащий преимущественно легкий изотоп 12 С, в результате чего в оставшейся его части увеличивалось содержание изотопа 13С по сравнению с исходным метаном, т.е. при потреблении метана микроорганизмами происходило фракционирование изотопов его углерода. Данные по изотопному составу углерода биомассы клеток метанотрофов и продуцируемой ими углекислоты носили лишь качественный характер. Теоретический анализ влияния растворения и диффузии метана в жидкости на разделение изотопов углерода и последующая экспериментальная проверка предположений показали, что фракционирование изотопов углерода в этом чисто физическом процессе вполне возможно и без участия меТа-нотрофных бактерий.

Величина фракционирования изотопов углерода метана при растворении i водной среде зависит от разности концентрации насыщения жидкости метаном при соответствующих условиях (температура, концентрация солей и т.п.) и егс текущей концентрации в этой жидкости (рис. 12). При достижении равновесногс состояния системы газ - жидкость, когда количество газа, растворившегося i жидкости, равно его количеству, диффундируемому из жидкости в газовую фазу

фракционирование изотопов углерода отсутствует (а=1.0). Исследование фракционирования изотопов углерода метана при наличии в водной среде метано-трофных бактерий показало, что в результате их жизнедеятельности создается не

Рис. 12. Изменене фракционирования изотопов углерода метана от степени приближения средней конентрации расторенного метана в воде (Срасп ) к концентрации его при насыщении водной среды (С„); F=CpaCTB /Сн.

прерывный поток метана из газовой фазы в культуральную жидкость, при котором величина фракционирования изотопов углерода метана зависит от соотношения скорости потребления метана бактериями (v) и возможной скорости его растворения в водной среде (v0), определяемой температурой, аэрацией, содержанием солей в среде и другими факторами. Если скорость растворения метана выше скорости егсг потреблен™ бактериями, то тогда может появится фракционироваие изотопов углерода метана на уровне жидкость - клетка или ферментные системы, участвующие в первоначальном окислении метана. Обнаружено различие в фракционировании изотопов углерода для культур, различающихся строением внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) (рис. 13). Известно [Stirling & Dalton, 1985], что в окислении метана участвуют два типа метанмонооксигеназ (ММО) (растворимые и мембраносвязанные ММО), количества которых зависят от условий культивирования ( соотношение метана, кислорода и ионов меди и др.). Очевидно, что в культуральной жидкости будет избыток метана, если скорость поребления метана бактериями ничтожно мала по сравнению со скоростью его растворения (величина v/v0 = 0), а если равна (v/v0 = l), то рост бактерий лимитирован по метану. При лимите роста метано-трофных бактерий по метану в их клетках присутствуют преимущественно мембраносвязанные метанмонооксигеназы (ММО), а при избытке его и возможном дефиците меди в культуральной жидкости - преимущественно растворимые ММО [Stirling & Dalton, 1985]. Сопоставив литературные данные и результаты наших измерений (рис. 13), приходим к предположению, что фракционирование изотопов углерода метана существенно меньше при его начальном окислении растворенными ММО по сравнению с окислением с участием мембраносвязан-ных ММО. Таким образом, различие в изменении коэффициента фракционирования изотопов углерода метана (а) для метанотрофных бактерий связано, вероятно, как с особенностями строения ВЦМ, так и с соотношением растверен-ных и мембраносвязанных ММО, ответственных за первоначальное окисление метана.

Рис. 13. Изменение коэффциента фракционирования изотопов углерода метана в зависимости от скоростей потребления метана микроорганизмами (у) и растворения его в культуральной жидкости (у0 )

1 - Мг1ку\ойта 1гк1ю$рогшт штамм 44;

2 - МеЛуЬтопаз теЛамса штамм 12.

Было проведено изучение влияния различных факторов роста метанотрофных бактерий на разделение изотопов углерода метана. Опыты проводили с чистыми культурами метанотрофных бактерий, растущими: а) в условиях периодического культивирования с замкнутой по газовому питанию системе, и б) в условиях проточного культивирования при непрерывной подаче в ферментер метанвоз-душной смеси. В экспериментах варианта "а" была реализована возможность проведения ' полного материально изотопного баланса по углероду метана. Средневзвешенный изотопный состав углерода биомассы и газообразной углекислоты практически наследует изотопный состав потребленного метана и характеризуется величиной г13С на 20-30%о меньшей,чем 513С остаточного метана в газовой фазе, т.е., величина коэффициента а составляла 1.02 - 1.03. Изотопный состав углерода отдельных продуктов при периодическом росте метанотрофных бактерий получений на основе материально-изотопного баланса путем количественного сравнения изотопных характеристик продуктов, образованных на отдельных временных интервалах развития популяции, свидетельствует о том, что на всех интервалах , (2) в культуральную жидкость из газовой фазы поступает метан, обедненный изотопом 13С относительно оставшейся его части в газовой фазе. Этот метан потребляется меганотрофными бактериями и расходуется на образование биомассы, углекислоты и экзометаболитов. Анализ значений 513С продуктов жизнедеятельности бактерий (Табл.5 ) указывает на то, что все они имеют пониженное содержание 13С относительно углерода остаточного метана в газовой фазе.

Однако величина 513С отдельных из этих продуктов по отношению к 513С потребленного метана может существенно изменяться в зависимости от стадии развития микроорганизмов.

Оценка фракционирования изотопов углерода метана метанотрофными бактериями при периодическом росте в системе, закрытой по газовому питанию, (рис.14) говорит о том, изотопный состав потребленного метана обеднен изотопом 13С на начальных стадиях развития этих бактерий, а с увеличением коэффициента отражающего количество потребленного ими метана, приближается I

изотопному составу углерода исходного метана. При невысоком коэффициенте потребления метана (/И),163) и сравнительно малом содержании биомассы метанотрофных бактерий в ферментере (0=0,34 г "С"/л) их биомасса обеднена изотопом 13С, а метаболическая углекислота, наоборот, обогащена этим изотопом относительно потребленного метана. Увеличение концентрации биомассы более, чем в 4 раза (6=1,39 г "С"/л и ^=0,626) характеризуется обратной зависимостью - углерод биомассы клеток обогащен изотопом "С относительно потребленного метана, а углекислота существенно обеднена этим изотопом.

0-0.34 г/л Г-ОЛ<53

0-1.3Я г/л Г-0.<52<5

Биомаооа

Биоюооа

Биомасса

Рис 14. Диаграмма распределения изотопного состава углерода в продуктах бактерий Ме1Ну1отопаз теЛатса в зависимости от коэффициента потребления метана (Р) и количества биомассы ((3).

Таблица 5. Изотопный состав углерода метана, растворившегося в культуральной жидкости, и продуктов, образовавшихся при его бактериальном окислении на отдельных стадиях развития популяций метанотрофных бактерий, вычисленный на основании материально-изотопного баланса

Интервалы _5'3С, %о

роста, Д1, ч СН,пэтрс6л. Биомасса СО2 (газ) НСО, СН„ (остат.)

Опыт А. МеЛуЬтопая теЛапка, 12

0 - 10 -52,2 -24,1

18 -24 -37,8 -46,9 -47,0 -13,4 -19,1

Опыт В. МеМу1отопаз теЛатеа, 12

0 - 16 -60,0 - -34,2

16 -24 -53,6 -63,0 -42,0 -32,3

24 - 40 -45,5 -41,0 -51,4 -45,0 -24,7

40 - 46 -39,5 -28,7 -56,1 -37,0 -18,5

Опыт С. МеЛуЬзтиз ¡гкИозропит

Э - 47 -53,5 -31,0

17 - 68 -55,6 -56,2 -63,7 -39,9 -23,3

Примечание: 513С исходного метана -36,0 %о

Таким образом, из анализа полученных изотопных характеристик углерода Зиомассы и метаболической углекислоты следует, что при развитии метанокисля-ощих бактерий изотопный состав углерода этих продуктов может существенно «меняться относительно друг друга. Причину изменений изотопного состава [Тлерода биомассы метанотрофных бактерий и образуемой ими углекислоты следует искать в особенностях биохимических реакций, протекающих в клетках 1а разных стадиях их развития. Однако из-за гетерогенности по времени образо-

вания совокупности бактериальных клеток в культуральной жидкости при периодическом культивировании трудно сделать однозначные выводы о влиянии внутриклеточных процессов на фракционирование изотопов углерода метана метан-окисляющими бактериями в зависимости от условий их роста.

Рис. 15. Изменение фракционирования изотопов углерода метана бактериями МеЛуктопск тейатса в зависимости от концентрации их биомассы в среде.

Е = (513ССН4(оц1) - 5'3ССН4(ш))/ К где 513ССН4^), б'^С сн4<ош) >

0,П. Qo.it - изотопный состав и количетво углерода метана на входе и выходе ферментера.

Концентрация вномвооы. г/л ю 15 го

а-' С.'/..

Рис. 16. Изменение изотопного состава углерода продуктов, образущихся при проточном культивировании метанотрофов в зависимости от концентрации биомассы в ферментере.

1 - СН4 (остаточ.), проток 0,2 ч"1;

2 - СО2 ( газ ), проток 0,2 >Г';

3 - суммарный белок, проток 0,2 ч"1;

4 - биомасса, проток 0,2 ч-1;

5 - липиды, проток 0,2 ч"1;

1а - СН4 (остаточ.), проток 0,1 ч"1; 2а - СО2 ( газ ), проток 0,1 ч"1; За - С02 ( газ ), проток 0,1 ч"1; 4а - биомасса, проток 0,1 ч"1; 5а - липиды, проток 0,1 ч"1.

Из зависимости коэффициента фракционирования изотопов углерода ( а ) от количества биомассы метанотрофных бактерий в среде (рис.15 ), полученной при проточном их культивировании, следует, что существует критическая концентрация клеток, выше которой коэффициент а практически не изменяется, а ниже

- с уменьшением количества биомассы происходит снижение фракционирования изотопов углерода.

Влияние концентрации биомассы метанокисляющих бактерий в среде культивирования, определяющей скорость потребления растворенного метана в ней, также проявляется и на распределении изотопов углерода в продуктах, образующихся при бактериальном окисления метана (метаболическая углекислота, биомасса клеток и ее составные фракции - белки, липиды). На рис. 16 приведены зависимости изотопного состава углерода остаточного метана, метаболической углекислоты, бактериальной биомассы и ее компонентов (белки, липиды) от количества метанокисляющих микроорганизмов в ферментере и величины протока питательной среды.

Для получения дополнительной информации, характеризующей в количественном отношении расходование углерода потребленного метана в клетке, проведена оценка активностей ферментов, определяющих пути окисления метана. Известно, что при использовании метана метанотрофными бактериями разветатение потока его углерода происходит на стадии утилизации формальдегида, часть которого окисляется до С02, а часть идет на образование фосфо-сахаров, которые затем используются в биосинтезе основных компонентов клетки [Троценко, 1992 ]. Анализ активностей ключевых ферментов энергетического и конструктивного путей метаболизма метанокисляющих бактерий и содержания изотопа "С в образуемой ими углекислоте относительно углерода биомассы клеток (проток 0,25 час-1) показывают (табл.6 ), что углерод углекислоты обогащается изотопом "С относительно биомассы с увеличением суммарной активности формиатдегидрогеназы. При максимальной активности гексулозофосфатсинтазы

- основного фермента конструктивного пути - и при минимальной активности формиатдегидрогеназы имеет место некоторое обеднение изотопом 13С метаболической углекислоты относительно биомассы. Таким образом, полученные данные подтверждают наше предположение о причинах изменения изотопного состава углерода углекислоты относительно биомассы в зависимости от концентрации клеток в среде. При низкой активности формиатдегидрогеназы (ключевого фермента пути окисления метана до С02) доля углекислоты, образующейся за счет углерода изотопно легких продуктов клетки выше, чем при высокой активности этого фермента. Поэтому с изменением активностей ферментов, определяющих пути включения углерода метана в клетку, изменяется изотопный состав углерода углекислоты относительно биомассы клеток и, соответственно, относительно метана в среде. Следовательно, изотопный состав углерода углекислоты, образующейся при жизнедеятельности метанокисляющих бактерий,определяется биохимическими реакциями, протекающими в бактериальной клетке, т.е. сугубо внутриклеточными факторами. В проведенном опыте при проточном культивировании метанокисляющих бактерий величина 5'3С метаболической углекислоты относительно биомассы изменяется от -1,7%о до +18,7%о, а относительно остаточного метана от -0,8%о до -11%о. Следует отметить, что изменение разности в <513С углекислоты относительно остаточного метана в пределах от -29%о до -5%о ранее также наблюдали при культивировании накопительной культуры метанотрофных бактерий [Barker & Fritz, 1981].

Известно, что концентрация кислорода, поступающего в среду обитания метанотрофных бактерий, может оказывать влияние на количества растворимых и мембра носвязакных ММО [Sirling & Dalton, 1985]. Поэтому было изучено

фракционирование изотопов углерода метана в зависимости от соотношения кислорода и метана в газовоздушной смеси при проточном культивировании метанотрофных бактерий. На рис.17 приведены величины 513С для остаточного метана и продуктов жизнедеятельности используемых в экспериментах метано-трофов в зависимости от соотношения концентраций метана и кислорода в газовоздушной смеси, поступающей в ферментер. При снижении относительной доли метана в смеси фракционирование его изотопов углерода метанотрофными бактериями падает, достигая -10%о (а = 1.01), а при снижении содержания кислорода в этой же смеси, наоборот, возрастает, достигая максимального значения -30%о (а = 1.03).

Таблица 6. Активность основных ферментов конструктивного и энергетического путей метаболизма метанотрофных бактерий МеЛуЬтопаз теЛапка и изотопный состав углерода углекисоты (<5|3С) относительно их биомассы (проток 0,25 ч"1)

Опыт г13с, %< э Активности ферментов " Темпера-

Формиатдегидрогеназа ГФС ФЕПк тура куль

У, ФМС НАД тивирова-

ния, С0

1 -1,7 330 242 88 301 17,5 37

2 +4,3 541 327 214 162 9,2 31

3 +6,9 574 348 226 198 9,4 32

4 +9,5 940 722 21 195 19,1 34

а) Активность выражена в н молях субстрата в мин. на мг белка;

- суммарная активность формиатдегидрогиназы; ФМС - ФМС-зависимая формиатдегидрогеназа; НАД - НАД-зависимая формиатдегидрогеназа; ГФС - гексулезофосфатсинтаза; ФЕПк - фосфоенолпируваткарбоксилаза.

Обнаруженные зависимости между фракционированием изотопов углерода метана и соотношением концентраций кислорода и метана в газовой среде при росте метанотрофных бактерий имеет как теоретическое, так и практическое значение. Например, на основе этих данных можно понять появление в биосфере изотопно легкого по углероду органического вещества в периоды развития оксигенных водорослей и высших растений [8сЫ(11аш£к1, 1988]. Так, в ранней восстановленной атмосфере в заметных количествах содержался метан, а появившийся кислород в результате жизнедеятельности оксигенных водорослей быстро расходовался в химических и биохимических окислительных процессах, включая и жизнедеятельность метанотрофных бактерий. Согласно экспериментальным данным (рис.17 ), при низком содержании кислорода в атмосфере фракционирование углерода метана метанотрофными бактериями будет максимальным и, соответственно, как синтезируемое ими органическое вещество, так и метаболическая углекислота будут в максимальной степени обеднены изотопом 13С. Изотопно легкая углекислота затем может быть использована фотоавтотрофными организмами, также продуцирующими обедненное 13С органическое вещество.

Таким образом, ключевая роль метанотрофных бактерий в образовании изотопно легкого по углероду органического вещества на начальных периодах развития оксигенных фотосинтетиков не вызывает сомнения.

Рис 17. Изменение фракционирования изотопов углерода метана бактериями Ме№у1отопси те/Иатса, растущими при разных отношениях концентраций метана и кислорода в газовоздушной смеси ферментера. Я = 1СН4]ВЫХ/[02]ВЬП1 Е=(513ССН<(ВЬК)-513Ссн<(и))/Р

Глава VI. Использование изотопных отношений углерода 13 С/12 С для определения активности метанотрофпых бактерий в природных экосистемах.

Количественные соотношения между изотопным составом углерода остаточного метана и потребленной его частью метанотрофными бактериями исследованы на двух моделях. В первой модели иммитировали поступление метана из осадков водоемов в водную толщу, где происходило бактериальное окисление метана. Источником непрерывно поступающего метана в этом случае служила каменноугольная крошка, предварительно насыщенная метаном и затем помещенная в емкость, через которую проходила суспензия с метанотрофными бактериями. Постепенно дегазируемая из каменного угля часть метана окислялась бактериями. На второй модели изучали фракционирование изотопов углерода метана метанотрофными бактериями при повышенных давлениях газовой смеси (до 90 ати). Как в первой, так и второй моделях метанотрофные бактерии использовали преимущественно метан, содержащий изотоп 12 С, в результате чего оставшаяся часть метана имела повышенное содержание 13С изотопа по сравнению с исходным метаном. Коэффициент фракционирования изотопов углерода метана в проведенных опытах с метанотрофными бактериями составлял а = 1.02 -1.03. Так как рост метанотрофных бактерий в опытах происходил в водной среде, то некоторые вариации коэффициента а, по-видимому, обусловлены различиями в концентрации метана в жидкости в рассчете на бактериальную клетку (удельная концентрация субстрата ).

Очевидно, влияние фактора, обусловленного удельной концентрацией субстрата на фракционирование изотопов углерода метана при его бактериальном окислении может быть сведено к минимуму в случае расположения (иммобилизации) метанотрофных бактерий на увлажненной поверхности твердофазного носителя. Были проведены лабораторные эксперименты по определению фракционирования изотопов углерода рассматриваемыми выше бактериями в зависимости от способа их иммобилизации: а) сорбция клеток бактерий на поверхности твердофазного минерального или органического носителей; б) включение бактериальных клеток в полимерную матрицу. Исследование фракционирования изо-

топов углерода метана иммобилизованными метанотрофными бактериями показали (таблице 7), что фракционирование изотопов углерода метана при его окислении на используемых носителях, за исключением полиакриламидного геля, характеризовалось коэффициентом а=1.03±0,003, который по величине был близким к кинетическому изотопному эффекту при диффузии метана через мембрану.

Таблица 7. Фракционирование изотопов углерода метана в зависимости от степени его потребления иммобилизованными клетками метанотрофных бактерий МеЛ\у1отопоз теЛатса

Носитель И «"С, %о а

СН4вход СН4вых. со2

Порода* 0,45 -36,7 -23,9 -34,3 1,029

Порода* 0,14 -36,7 -32,5 -39,2 1,030

Лигносульфанат 0,23 -37,2 -29,2 -43,0 1,0348

Поливиниловый спирт 0,31 -36,7 -26,7 -31,9 1,0322

Полиакриламидный гель 0,79 -36,7 -2.0 - 1,044

' Сланец песчанистый средней крепости.

Выводы, полученные при анализе фракционирования изотопов углерода иммобилизованными клетками метанотрофных бактерий, были основой для создания методики определения их меганокисляющей активности в природных условиях. Этот метод оказался довольно эффективным при разработке технологии бактериального окисления метана в угольных шахтах в случае реализации микробиологического способа снижения загазованности метаном атмосферы угледобычных участков. Изменения изотопного состава углерода оставшейся части метана и углекислоты в атмосфере (рис.18), прошедшей через породы, обработанные бактериальной суспензией, непосредственно доказывали эффективность бактериального потребления метана.

[С1-14].% &13С. °/оо

1.0 -Ю

О.В -2 О

Об -ЗО

04 -40

0.2 -ЗО

О.О

5,3с„

5'3сс

Время бактериальной обработки

ЗО 40 50 60

Время наблюдения, о7тки

Рис 18. Изменение изотопного состава углерода углекислоты и метана в исходящем воздухе из угледобычной лавы после обработки выработанного пространства суспензией метанотрофных бактерий. [СН4] - концентрация метана в исходящем воздухе;

513Ссн< , 513ССОг - изотопный состав углерода метана и углекислоты в исходящем воздухе.

Из рис.18 также видно, что независимо от концентрации метана в воздухе, исходящем из угледобычной лавы, изотопный состав углерода метана и углекислоты оставался постоянным в течение более двух недель наблюдений.

Нанесение суспензии метанотрофных бактерий на обрушенные породы после выемки каменного угля вызвало повышение содержания изотопа 13С в остаточном метане, исходящем из лавы в воздухе, а для углекислоты, наоборот, понижение содержания этого изотопа.

Поскольку изменение изотопного состава углерода остаточного метана в проточной системе пропорционально его потребленной части, были произведены количественные измерения потребления метана метанотрофными бактериями в условиях шахты. Величину коэффициента пропорциональности определяли в модельных экспериментах с иммобилизованными клетками метанотрофных бактерий на образцах пород, взятых непосредственно из обрабатываемого участка. Результаты измерения концентрации метана в воздухе лавы шахтными измерительными устройствами и величины изменения его концентрации, полученные на основе расчетов по изотопным данным, дали удовлетворительное соответствие. Достоинством изотопных измерений бьио то, что полученные этим методом данные указывают на доминирующую роль метанотрофных бактерий в наблюдаемом снижении концентрации метана в воздухе, исходящем из лавы. Такую информацию, очевидно, нельзя получить другими методами.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на примерах разных физиологических групп микроорганизмов (фо-тотрофные бактерии, грибы, дрожжи, метанобразующие и метанотрофные бактерии) продемонстрировано их общее свойство разделять (фракционировать) стабильные изотопы углерода в процессах жизнедеятельности, проявляющееся в изменении изотопного состава углерода микробных продуктов как в сторону обеднения 13С, так и обогащения этим изотопом относительно субстрата.

2. Установлено, что главными факторами, определяющими фракционирование изотопов углерода водорослями и фототрофными бактериями, являются ферментные системы фиксации углекислоты и ее удельная концентрация в среде обитания фотосинтетиков.

3. Впервые у растущих культур фототрофных бактерий и водорослей обнаружено существование "критической" удельной концентрации углекислоты. Их рост при удельных концентрациях ниже критического значения сопровождается уменьшением фракционирования изотопов углерода по мере снижения удельной концентрации С02, а при концентрациях выше - не зависит от концентрации углекислоты и определяется их биохимическими особенностями .

4. Показано, что изотопный состав углерода в продуктах жизнедеятельности гетеротрофов зависит от природы используемого субстрата, путей метаболизма и физиологических условий их роста. Впервые обнаружено, что в основе разделения изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами лежат соотношения количеств выделившейся из клетки углекислоты при окислении субстрата и поступившей в нее при гетеротрофной фиксации С02, а также вероятности непосредственного включения в конструктивный метаболизм клетки субстрата или его части.

5. С использованием чистых культур метанобразующих бактерий обнаружено, что изотопный состав углерода, продуцируемого ими метана при росте на С] - и С2 -субстратах, может иметь различные значения 513С и быть как в максимальной степени обедненным изотопом 13С (до -100%о), так и обогащенным этим изотопом по отношению субстрату.

6. Установлено, что факторами, определяющими изотопный состав углерода метана, образуемого метанобразующими бактериями являются изотопный состав

углерода потребленного субстрата и его биохимические особенности метаболизма, а также удельная скорость бактериального метанобразования и удельная концентрация субстрата в среде.

7. На основе теоретического анализа факторов, определяющих фракционирование стабильных изотопов углерода метана в физических процессах и экспериментальной проверки полученных выводов показано, что разделение изотопов углерода метана может происходить при его растворении на границе раздела фаз газ - жидкость и зависит от уровня насыщения жидкости метаном.

8. Установлено, что величина коэффициента фракционирования изотопов углерода метанотрофными бактериями, растущими в жидкой среде, зависит от соотношения скорости растворения метана, определяемой условиями культиви-роания (температура, аэрация, концентрация метана и др.) и скорости его потребления бактериями.

9. С использованием чистых культур метанотрофных бактерий обнаружено, что фракционирование изотопов углерода потребленного метана на уровне биомасса клеток - метаболическая углекислота определяется активностями ферментных систем, участвующих в метаболизме углерода метана. Углекислота может быть как обеднена 13С изотопом , так и обогащена им отностельно биомассы в зависимости от активностей ключевых ферментов энергетического и конструктивного обменов (формиатдегидрогеназы и гексулозофосфатсинтазы).

10. Впервые изучено разделение изотопов углерода клетками метанотрофных бактерий, иммобилизованных на увлажненной поверхности твердофазных носителей. Показано, что значение коэффициента фракционирования изотопов углерода метана является близким по величине к кинетическому изотопному эффекту для однонаправленной диффузии метана

11. В результате проведенного исследования факторов, определяющих фракционирования изотопов углерода микроорганизмами и с учетом анализа литературных данных созданы научные основы практического использования изотопных характеристик углерода для оценки роли живых организмов в образовании и трансформации углеродсодержащих продуктов в природных экосистемах, а также некоторых биотехнологических процессах.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Зякун А. М. Количественное определение изотопной метки в органических соединениях. Известия АН ССС, (сер. хим.), 1974, No 10, с. 22262229.

2. Зякун А.М., Иванов М.В. Фракционирование стабильных изотопов микроорганизмами. - В сб. Биохимия и физиологи микроорганизмов, Пущино, 1975, с.31-36.

3. Бондарь В.А., Гоготова Г.И., Зякун А.М. О фракционировании изотопов углерода фотоавтотрофными микроорганизмами с различными путями ассимиляции углекислоты. -Докл. АН СССР, 1976, т.228, с.720-722.

4. Бондарь В.А., Намсараев Б.Б., Зякун А.М. Фракционирование изотопов углерода метана и углекислоты при их адсорбции водой. - В сб.: Тезисы VI Всесоюзного симпозиума постабильным изотопам в геохимии, М.: 1976, с.210-212.

5. Зякун А.М., Гоготова Г.И., Бондарь В.А. Фракционирование изотопов углерода углекислоты фотосинтезирующими микроорганизмами. - В сб.: Рост микроорганизмов на С, -соединених. Пущино, 1977, с.151-153.

6. Бондарь В.А., Безручко В.В., Зякун А.М. Устройство подготовки проб для масс-спектрометрического анализа изотопов углерода. - В сб.:Тезисы VII Всесоюзного симпозиума по стабильным изотопам в геохимии, М.: 1978. с.64-66.

7. Зякун А.М., Бондарь ВА., Намсараев Б.Б, Фракционирование стабильных изотопов углерода метана при его микробиологическом окислении. -Геохимия, 1979, N 2, с.291-297.

8. Иванов М.В., Зякун А.М., Бондарь В.А., Безручко В.В., Литвинов П.С., Петух А.П., Мякенький В.И., Мягкий Б.И. Изотопный состав углерода метана и углекислоты как индикатор микробиологического окислени метана в шахтах. - В сб. VIII Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии (11-14 ноября 1980 г. Москва), М., 1980, с.39 - 41.

9. Кириченко Е.Б., Зякун А.М., Бондарь В.А., Кириченко А.Б., Безручко В.В. Соотношение стабильных изотопов углерода ПС/ 12С в вегетативных и генеративных органах растений. - Докл. АН СССР, 1980, т.250, N 2, с.505-508.

10. Зякун А.М., Бондарь В.А., Гоготова Г.И. Разделение изотопов углерода углекислоты при абсорбции ее водой и раствором гидроокиси бария. - Геохимия, 1980, No 5, с.754-758

11. Бондарь В.А., Намсараев Б.Б., Зякун А.М., Нестеров А.И., Иванов М.В. Изменение изотопного состава углерода метана в экспериментах,моделирующих троцесс микробиологического окисления метана в угольных шахтах. - В сб. VIII Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии (11-14 нобря 1980 -., Москва),М,1980,364-366.

12. Zyakun А.М., Bondar V.A., Namsaraev B.B. Fractionation of methane car->on isotopes by methane oxidizing bacteria. - Freib. Forsch. - H>C>360, Hrsg.: leactor der Bergakademie Freiberg Leipzig: VHB Deutscher Verlag für GrundstofF-ndustrie, 1981, p. 19-27. •

13. Иванов M.B., Зякун A.M., Бондарь B.A., Литвинов П.С., Петух А.П., Лякенький В.И., Мягкий Б.И. Использование результатов анализа изотопного остава метана и углекислоты в качестве индикатора микробиологического |кисления метана в угольных шахтах. - Докл. АН СССР, 1981, г.257, N6, .1470-1473.

14. Бондарь В.А., Иванов М.В., Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Шипин ).В., Зякун А.М. Вариации изотопного состава углерода метана, образовавше-эся при бактериальном восстановлении углекислты. - В сб. IX Всесоюзный импозиум по стабильным изотопам в геохимии (16-19 нобря 1982 г.,Москва), 1., 1982, т.1, с.285-286.

15. Ivanov M.V., Beljaev S.S., Zjakun A.M., Bondar V.A., Laurinavichus K.S. lie microbiologische Bildungion Methan in einer abzubanen den Erdöllagerstätte. -reib. Forsch.-H.c.360. Hrsg.: Reactor derBergaxademie Freiberg, Leipzig: VEB leutscher Verlag für Grundstoffindustrie, 1982, p. 189-199.

16. Ivanov M.V., Zjakun A.M., Bondar V.A., Namsaraev B.B., Nesterov A.I. ohlenstoffisotopen-zusammensetzung im Methan und inder Kohlensaure als Para-eter der Microbiologischen Methan-oxydation in Kohlenschachten. - Freib. orsch. - H.C. 360.Hrsg.: Reaktor der Bergakademie Freiberg, Leipzig: VEB Deucher Verlag für Grundstoffindustrie, 1982, p.181-189.

17. Иванов M.B., Беляев C.C., Зякун A.M., Бондарь В.А., Шипин О.В., ауринавичус К.С. Разделение стабильных изтопов углерода метанобразующи-л бакгерими. - Докл. АН СССР, 1983, т.272, с. 1243-1246.

18. Зякун А.М., Абрамов Ф.А., Мякенький В.И., Литвинов П.С., Бондарь А., Нестеров А.И. Промышленные испытани микробиологического способа гижения газобильности добычного участка. - Техн. безоп. охрана труда и гор->-спас. дело, 1983, N 1, с.8-9.

19. Иванов М.В., Беляев С.С., Зякун А.М., Бондарь В.А., Лауринавичус С., Шипин О.В. Фракционирование изотопов углерода метанобразующим и кгерими, растущими на различных субстратах. - In.: Zfl-Mitteilunjen, Nr. 84, Arbeitstagung "Isotope in der Natur" (vom 15-18 November 1983 in Leipzig), ipzig: 1983, v.l, p.139-158.

20. Зякун А.М., Бондарь В.А., Намсараев Б.Б., Нестеров А.И. О возможности использования изотопного анализа углерода для определени интенсивности микробиологического окисления метана в природных экосистемах. -Геохимия, 1983, N 5, с.759-765.

21. Иванов М.В., Беляев С.С., Зякун А.М., Бондарь В.А., Лауринавичус К.С. Микробиологическое образование метана в разрабатываемом нефтяном месторождении. -Геохимия, 1983, N 11, с.1647-1654.

22. Зякун А.М., Иванов М.В. Фракционирование изотопов углерода и водорода метана при его микробном окислении. - В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии. Тезисы докладов (3-5 декабря 1984 г.,Москва), М., 1984, с.ЗО.

23. Зякун А.М., Бондарь В.А, Шкидченко А.Н., Безручко В.В. Фракционирование изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами при их росте на н-алканах. - В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в ■ геохимии. Тезисы докладов (3-5декабря 1984, Москва), М., 1984, С.ЗО.

24. Зякун А.М., Намсараев Б.Б., Бондарь В.А., Лысаков С.В., Иванов MB. Микробиологическое фракционирование изотопов углерода при анаэробном разрушении целлюлозы. -В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии, Тезисы докладов (3-5 декабря 1984г., Москва),М., 1984, с.31.

25. Зякун А.М., Бондарь В.А, Мшенский Ю.Н., Газов Р.Р., Захарченко В.Н., Иванов М.В. Фракционирование изотопов углерода метана окисляющими бактерими в процессе непрерывного культивирования. - В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии, Тезисы докладов (3-5 декабря 1984 г., Москва). М., 1984, с.174.

26. Бондарь В.А., Зякун А.М., Намсараев Б.Б., Нестеров А.И. Исследование фракционирования изотопов углерода метана при его бактериальном окислении. - В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии, Тезисы докладов (3-5 декабря 1984г., Москва), М., 1984, с.175.

27. Бондарь В.А., Беляев С.С., Зякун А.М., Лауринавичус К.С., Шипин О.В., Иванов М.В. Закономерности фракционировани изотопов углерода ме-танобразующими бактериями при их росте на различных субстратах.- В сб. X Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии,Тезисы докладов (3-5 декабря 1984 г., Москва), М., 1984, с.176.

28. Нестеров А.И., Старовойтова Г.А., Бондарь В.А., Зякун AM., Иванов М.В. Микробиологическое окисление метана в каменном угле при различных режимах аэрации. - Прикл. биохим. и микробиол., 1984, т.20, вып.5, с. 641 -647.

29. Иванов М.В., Беляев С.С., Зякун А.М., Бондарь В.А., Лауринавичус К.С., Шипин О.В. Фракционирование изотопов углерода метанобразующей сарциной.- Докл. АН СССР, 1984, т.277, N 1, с. 225-229.

30. Иванов М.В., Беляев С.С., Зякун А.М., Бондарь В.А., Шипин О.В., Лауринавичус К.С. Фракционирование изотопов углерода термофильными метанобразующими бактериями. -Докл. АН СССР, 1985, т.282, N 1, с.180-183.

31. Зякун А.М., Бондарь В.А., Намсараев Б.Б. Фракционирование изотопов углерода метанокислющими бактериями. - Геохимия, 1985, N 9, с. 1362-1369.

32. Зякун А.М., Бондарь В.А., Безручко В.В., Шкидченко А.И. Разделение изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами при их росте на н-ал-канах. -Микробиология, 1986, т.55, вып.6, с.953-957.

33. Зякун А.М. Использование стабильных изотопов для определени путей оттока атмосферного метана. - В сб. Второе всесоюзное совещание по геохимии углерода (тезисы докладов), М. 1986, с.202-204.

34. Зякун А.М., Бондарь В.А., Мшенский Ю.Н., Захарченко В.Н.,Гаязов Р.Р., Шишкина В.Н. Фракционирование изотопов углерода метанокислющими бактериями Methylomonas methanica в процессе их непрерывного роста. -Геохимия, 1987, N 11, с. 1007 - 1013.

35. Zakharchenko V.N., Sysoeva V.I., Bondar V.A., Zyakun A.M. Fractiona->n of carbon isotopes by heterotrophic organismsgrown on liquid paraffins. - In.: Dtopen kolloquium Freiberg'88. Kurzreferate. Freiberg: 1988, PA. 12, p.87-88.

36. Zyakun A.M. Using of carbon stable isotopes to estimate the role of microor-nisms in biogeochemical processes. - In.: Isotopenkolloquium Freiberg'88. Kurz-ferate. Freiberg: 1988, PA 13, p.89-90.

37. Зякун A.M., Бондарь B.A., Дауринавичус K.C., Шипин О.В., Беляев ,С., Иванов М.В. Фракционирование изотопов углерода при росте метан->разующих бактерий на различных субстратах. - Микробиол.журн., 1988, т.50, 2, с. 16-22.

38. Зякун AM. Фракционирование изотопов углерода микроорганизмами. -сб. Двенадцатый Всесоюзный симпозиум по стабильным изотопам в геохи-ии, (17-19 апреля 1989 г., Москва), М., 1989, с.137-138.

39.3ахарченко В.Н., Сысоева В.И., Бондарь В.А., Зякун А.М. Фракциони-гаание изотопов углерода дрожжами рода Candida. - В сб. Двенадцатый Все-1Юзный симпозиум по стабильным изотопам в геохимии (17-19 апреля 1989 г. осква), М„ 1989, с.308-309.

40. Зякун А.М., Захарченко В.Н., Сысоева В.И., Шишканова Н.В., Печен-ш Н.А., Бондарь В.А., Винокурова Н.Г., Ермакова И.Т. Фракционирование ютопов углерода дрожжами Candida Upolytica, растущими на парафине при шите по тиамину. -Микробиол. журн., 1989, т.51, N 3, с. 5-13.

41. Zyakun А.М. Isotopes and possibility of their use as a biomarker of mic-iial products. - In: Bacterial gas conference (Abstracts), Milano, 25-26 September, >89.

42. Зякун A.M., Бондарь B.A., Черменский Д.Н. Образование угарного |за при росте грибов на растительных продуктах. - В сб. 9-й Международ-ый симпозиум по биохимии окружающей среды (тезисы докладов), 4-8 сен-[бря 1989 г., Москва,М., 1989, с. 11.

43. Зякун А.М. Фракционирование изотопов углерода микроорганизма-и -биомаркировка микробных метаболитов. - В сб. 9-й Международный шпозиум по биохимии окружающей среды, 4-8 сентбря 1989 г.,Москва, те-юы, М., 1989, с.202.

44. Zyakun А.М. Isotopes and their possible use as biomarkers of microbial ■oducts. - In: Bacterial gas (Ed. R. Vially), Editions Technip, Paris, 1992, pp 275.

45. Зякун A.M. Оценка роли гетеротрофных микроорганизмов в кругово-5те углерода в биосфере.- В сб. Третье Всесоюзное совещание по геохимии •лерода (тезисы докладов), М., 1991, т.2, с.234-235.

46.'Зякун A.M. Фракционирование изотопов углерода гетеротрофными эганизмами и возможности его использования в биологических следованиях. - В сб. Применение масс-спектрометрии в биологии и едицине (школа-семинар), Харьков, 1992, С728-31.

47. Зякун А.М., Муслаева И.И., Ашйн В.В., Пешенко В.П., Аданин В.М., 1ашкина Л.П., Матшова Р.Н., Финогенова Т.В. Гетеротрофная фиксация -лекислоты Candida iipolytica и ее роль в биосинтезе лимонной кислоты. -1икробиология, 1992, т.61, вып.4, с. 561 - 570.

48. Zyakun А.М. Problems of biogenic methane identification by its hydrogen id carbon isotope contents. - Shallow gas group news letter, 1992, N 6, p. 16-17.

49. Zyakun A.M. Problems of Identifying Biogenic Methane by carbon isotopes. Bulletin of the Geological Society of Denmark, 1994 (in press).

Информация о работе

Зякун, Анатолий Маркович
доктора биологических наук
Пущино, 1994
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы