Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов

Каллистова, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов"

Российская академия наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградскоги

На правах рукописи

КАЛЛИСТОВА Анна Юрьевна

АЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА В ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЕ ПОЛИГОНА ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003056054

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Н. Ножевникова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Н. Дедыш

доктор технических наук, академик Жилищно-коммунальной Академии РФ Л.И. Гюнтер

Ведущая организация: кафедра биологии почв

факультета Почвоведения Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "23" апреля 2007 г. в 14°° часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу:

117312 Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан марта 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук • о^-у Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к изучению микробиологии цикла метана обусловлен тем, что метан является конечным продуктом микробного разложения органического вещества в анаэробных условиях и одним из наиболее опасных парниковых газов. Содержание СН4 в атмосфере ежегодно возрастает в среднем на 1% за счет дисбаланса между его продукцией и окислением (Заварзин и Кларк, 1987; Blake and Rowland, 1988; Galchenko et al., 1989; IPCC, 2001). Большой вклад в изучение микробных процессов цикла СН4 принадлежит институту микробиологии им. С.Н. Виноградского, где проводятся комплексные исследования водных (Гальченко, 1995, 2006; Иванов и др., 2001; Ivanov and Lein, 2003, 2006; Пименов, 2004, Пименов и Гальченко, 2006), наземных (Заварзин, 1995; Заварзин и Васильева, 1999, Дедыш, 2004; Коцюрбенко, 2004; Кравченко и Быкова, 2004) и антропогенных (Zavarzin and Nozhevnikova, 1993; Ножевникова, 1994, 1995; Иванов, 2004) экосистем. Среди антропогенных местообитаний важным источником атмосферного СН4 являются полигоны захоронения твердых бытовых отходов (ТБО), вклад которых в глобальную эмиссию СН4 составляет 6-12% (IPCC, 2001). В России проблема утилизации ТБО приобрела угрожающие масштабы. В отличие от развитых стран запада, в нашей стране не используется раздельный сбор ТБО, лишь незначительная часть отходов подвергается предварительной механической обработке (прессованию), не производится реутилизация бумаги, металлов, стекла и пластиков, а также отдельная обработка органической фракции отходов. Наиболее применяемым способом утилизации ТБО в России является их захоронение на специальных полигонах, общая площадь которых превышает 40 тыс. га. и ежегодно увеличивается на 2.5-4%. Однако большинство российских полигонов ТБО не соответствует современным нормам организации санитарных полигонов и оказывает негативное воздействие на окружающую среду и здоровье населения (Доклады 4-го Международного конгресса по управлению отходами «ВейсТек», 2005). Полигоны ТБО загрязняют прилежащие почвы и грунты, грунтовые воды и атмосферу тяжелыми металлами и другими токсичными соединениями, включая газообразные и летучие вещества. Помимо отрицательного влияния локального характера, полигоны ТБО являются источником парниковых газов, главным образом СН4 и С02. При отсутствии систем сбора биогаза, для уменьшения эмиссии СН4 с поверхности полигонов ТБО чрезвычайно важно его микробное окисление в аэробном покрывающем отходы слое антропогенной почвы, где развивается плотная популяция метанотрофных бактерий (Whalen et al., 1990; Nozhevnikova et al., 1993a, b; Nozhevnikova and Lebedev, 1995; Bogner et al., 1997).

Метанотрофные бактерии (метанотрофы) представляют собой уникальную группу микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании СН4 в качестве единственного источника углерода и энергии. Метанотрофные бактерия выделены из различных почв, водной толщи озер и морей, болот, горячих источников, антарктических местообитаний, ризосферы растений и органов морских беспозвоночных животных (Hanson and Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Гальченко и Пименов, 2004). Высокая активность метанотрофной популяции обнаружена в покрывающей почве полигонов ТБО (Ножевникова и др., 1993; Jones and Nedwell, 1993; Nozhevnikova et al., 2003a). В отличие от анаэробного микробного сообщества, функционирующего в толще отходов, где температура постоянна, жизнедеятельность метанотрофных бактерий покрывающей почвы существенно зависит от климатических условий. Исследования активности, плотности и состава метанотрофной популяции в холодные и теплые

сезоны года особенно важны для полигонов ТБО, расположенных в умеренной климатической зоне России, для которой характерны выраженные сезонные колебания температуры и длительная холодная зима. Изучение влияния факторов окружающей среды на плотность и состав метанотрофной популяции и создание условий, необходимых для максимальной активности метанотрофных бактерий, важно для разработки способов снижения эмиссии СН4 с поверхности российских полигонов ТБО.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение аэробного окисления метана в покрывающей почве полигона ТБО.

Конкретные задачи исследования включали:

1. Изучение сезонной динамики эмиссии и аэробного окисления СН4, активности и численности метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО.

2. Выделение накопительных культур метанотрофных бактерий из образцов покрывающей почвы при разных температурах и концентрациях СН4.

3. Изучение биоразнообразия культивируемых метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО.

4. Разработку способа снижения эмиссии СН4 с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено комплексное сезонное исследование эмиссии и аэробного окисления СН(, численности и состава метанотрофной популяции покрывающей почвы полигона ТБО. Зафиксирована крайняя неоднородность потоков СН4 с поверхности полигона. Показана зависимость эмиссии СН4 от возраста участка полигона и сезона года. Выявлена обратная зависимость между сезонными изменениями эмиссии СН4 и метанокисляющей активностью покрывающей почвы. Впервые использован метод CARD-FISH для анализа численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ. Применение данного метода позволило выявить высокую численность метанотрофов, которую не удавалось обнаружить ранее с помощью традиционных методов культивирования. Показан значительный вклад метанотрофов в. общую численность бактериальной популяции покрывающей почвы, что может свидетельствовать о важной роли этих бактерий не только в окислении СН4, но и в почвообразовании. Сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило исследовать видовой состав метанотрофной популяции покрывающей почвы. Впервые в покрывающей почве полигона ТБО, наряду с известными мезофильными метанотрофами, идентифицированы метанотрофы, близкородственные ацидофильным видам, выделенным из кислых сфагновых болот, психротолерантным видам, выделенным из арктических болотных почв, и термотолерантному виду, выделенному из активного ила очистных сооружений. Эти данные расширяют представление об экологии и распространении метанотрофных бактерий в природе. Результаты работы могут быть использованы при выборе и создании технологий рекультивации полигонов ТБО. Получен патент на способ снижения эмиссии СН4 с поверхности полигона ТБО путем интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях: "Workshop оп Sustainable Lancffill Management" (2003); 4-м Международном конгрессе по управлению отходами «ВейстТэк» (2005); "International Conference оп Arctic Microbiology" (2004); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология Микробов» (2004); 7th FAO/SREN-WORKSHOP "The future of biogas for sustainable energy production in Europe" (2005); 1-ой Всероссийской и II-ой

Международной молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (2005, 2006).

' Публикации, lio материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (3 экспериментальные статьи, 1 глава в монографии, 1 патент, 3 статьи в сборниках материалов международных конференций и 5 тезисов).

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Молекулярно-биологические исследования проведены на кафедрах науки об окружающей среде и молекулярной биологии факультета биологии и науки об окружающей среде Университета г. Ювяскюля (Финляндия) и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. А.Н. Ножевниковой за общее научное руководство, предоставленную возможность работы за рубежом, помощь в обсуждении результатов и редактирование диссертации и благодарит сотрудников ИНМИ РАН к.б.н. М.В. Кевбрину и В.К. Некрасову за иммунофлуоресцентный анализ накопительных культур метанотрофов и помощь в лабораторных исследованиях, М.В. Глаголева, H.A. Шнырева, к.б.н. М.В. Чистотина и к.б.н. A.C. Саввичева за помощь в полевых работах, сотрудников кабинета газохроматографического анализа ИНМИ РАН, сотрудника кафедры физики и мелиорации почв факультета почвоведения МГУ д.б.н. A.B. Смагина, директора полигона ТБО «Хметьево» В.Э. Эвальда и зарубежных партнеров: д-ра, проф. Ю. Ринтала, д-ра, проф. М. Куломаа, д-ра Г. Юргенса и JI. Монтонен. Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории антропогенных мест обитания за внимание, всестороннюю поддержку и участие в этой работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов INCO-Copernicus (ICA2-СТ-2001-10001 А/144168), правительства г. Москвы (договор № 12-Э/04), РАН (проект №3 безвалютного обмена между РАН и АН Финляндии) и АН Финляндии (№ 214719).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 18 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 202 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил полигон захоронения ТБО «Хметьево», расположенный в 65 км от Москвы (Солнечногорский р-н, Московская обл.). Полигон «Хметьево» является одним из крупнейших подмосковных полигонов ТБО и используется для захоронения отходов с 1984 года. Работы проводили в период с апреля по декабрь 2002-2005 гг. на четырех участках полигона (N1, 2, 3 и 4), возраст которых после закрытия для захоронения отходов к моменту начала измерений составлял 5, 10, 15 и 2.5 года, соответственно. Полевые исследования и отбор образцов на участке N1 (160 х 160 м) осуществляли в апреле-июле 2002 г. В центральной части участка 20 экспериментальных точек были распределены по площади 40 х 40 м. Измерение эмиссии СН4 дополнительно проводили еще в 19

точках, лежащих по диагонали участка, расстояние между точками составляло 10-13 м. Работы на участке N2 (75 х 250 м) проводили в aBi-усте-октябре 2002 г в 26 точках, расстояние между которыми составляло 25-50 м. Сезонную динамику эмиссии, окисления СН4 и численности метанотрофных бактерий исследовали в апреле-декабре 2003-2005 гг. на участке N3 (100 х 200 м) в 25 точках, расстояние между которыми составляло 25-50 м. Полевые работы на участке N4 (30 х 30 м) проводили в апреле-июле 2004-2005 гг. на 8 экспериментальных площадках (1 х 1 м).

В полевых условиях проводили: измерение эмиссии СН4 камерно-статическим методом (Орлов и др., 1987); отбор порового газа по профилю покрывающей почвы (0-65 см) с помощью иглы-бура Ястребова (Вадюнина и Корчагина, 1973); определение концентраций СН4, 02, С02 в поровом газе с помощью инфракрасного портативного газоанализатора ПГА-7 (Россия); определение температуры почвы и воздуха с помощью транзисторного электротермометра ТЭТ-2 (Россия) и(или) температурных датчиков (Dallas Semiconductor, США); определение почвенной водопроницаемости трубочным методом, твердости твердомером Качинского и плотности прибором Качинского (Вадюнина и Корчагина, 1973; Корчагина, 1983); отбор образцов покрывающей почвы с помощью шпура из отдельных экспериментальных точек с 3-х глубин почвенного слоя (0-20, 20-40 и 4060 см). Образцы упаковывали в стеклянные сосуды или пластиковые пакеты и транспортировали в лабораторию.

В лабораторных условиях проводили: определение концентрации СН4 в пробах надпочвенного воздуха методом газоадсорбционной хроматографии на ГХ 3700 (сорбент Porapak Q) и Кристалл 5000.1 (сорбент Хромосорб 102) с пламенно-ионизационным детектором (Россия). Эмиссию СН4 рассчитывали из уравнения скорости изменения концентрации СН4 в камере (коэффициенту линейной регрессии) (Орлов и др., 1987; Смагин и др., 2003).

Определяли абсолютно сухую массу (асм) почвы и почвенной суспензии путем высушивания образцов почвы с исходной влажностью (почвенных суспензий) до постоянного веса при 105°С, влажность и pH почвы (Ганжара и др., 2002).

Определяли метанокисляющую активность образцов почвы с исходной влажностью и почвенных суспензий (почва: вода, 1: 2 по массе) при 10 и 20°С и начальной концентрации СН4 в газовой фазе 10%. Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности. Метанокисляющую активность рассчитывали по убыли СН4 из газовой фазы в течение 1-3 суток с начала инкубации. Концентрацию СН4 измеряли на ГХ Хром-5 (Чехия) с использованием детектора по теплопроводности и активированного угля АГ-3 в качестве сорбента. Для отдельных почвенных образцов определяли зависимость метанокисляющей активности от температуры инкубации. Инкубацию проводили при 2, 5, 10,20, 25, 30, 40, 50 и 60°С.

Проводили количественный учет метанотрофных бактерий методами предельных разведений (МПР) и флуоресцентной in situ гибридизации (CARD-FISH). МПР использовали для определения наиболее вероятной численности культивируемых метанотрофов. Из почвенной суспензии готовили серию 10-кратных разведений в физрастворе. Из каждого разведения производили 10%-ный засев 3-х флаконов с 10 мл стерильной среды «П» (Гальченко, 2001) и содержанием СН4 в газовой фазе 10%. Культивирование проводили при 20°С. О росте метанотрофов судили по убыли СН4 из газовой фазы; концентрацию СН4 измеряли на ГХ Хром-5. Оценку численности метанотрофов проводили с использованием вычислительных таблиц (Alexander, 1982; Егоров (ред.), 1995).

Численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ, определяли методом CARD-FISH с использованием 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных

зондов, меченных пероксидазой хрена, с последующей амплификацией сигнала раствором тирамида, связанного с флуоресцентным красителем СуЗ. Свежеприготовленные почвенные суспензии фиксировали 96% этанолом (1: 1 по объему). Использовали зонды EUB338 (Amann et al., 1990) для гибридизации с представителями домена Bacteria, Му84, Му705 и Ма450 (Eller et al., 2001) для гибридизации с представителями метанотрофов I и II типов. Фиксированную почвенную суспензию обрабатывали ультразвуком. Гибридизацию проводили в соответствии с разработанными ранее методиками CARD-FISH (Amann et al., 1992; Schönhuber et al., 1997; Hahn, 2001; Pernthaler et al., 2002a). Клетки микроорганизмов подсчитывали в 20-40 случайно выбранных полях зрения эпифлуоресцентного микроскопа (Leitz DM RBE, Германия).

Проводили выделение накопительных культур метанотрофных бактерий из покрывающей почвы участков разного возраста полигона «Хметьево», отобранной в апреле-ноябре 2002-2005 гг. из различных экспериментальных точек в интервале глубин 0-60 см. Накопительные культуры выделяли при температуре 10, 20 и 40°С на жидкой минеральной среде «П» с содержанием СН4 в газовой фазе 5, 10 и 50%. Морфологию клеток определяли с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием световых микроскопов ЛОМАМ И-1 (Россия) и Axiolmager Dl (Германия).

Идентификацию метанотрофных бактерий в накопительных культурах осуществляли с помощью методов непрямой иммунофлуоресценции (Кондратенко и др., 1981; Гальченко и др., 1988) и молекулярной экологии. Использовали иммунные сыворотки (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова) к 11 видам метанотрофов: Methylomonas methanica, 'Methylobacter bovis', 'Mb. chroococcitm', Methylocystis echinoides, 'Mes. methanolicus', 'Mes. pyriformis', Mes. parvus, Methylosinus sporium, Ms. trichosporium, Methylococcus capsulatus (коллекция UNIQEM ИНМИ РАН, культуры предоставлены Член-корр. РАН В.Ф. Гальченко) и Methylocapsa acidiphila (культура предоставлена д.б.н. С.Н. Дедыш). О положительном сигнале судили по интенсивности свечения клеток при просмотре под микроскопом ЛЮМАМ И-1.

Идентификация культивируемых метанотрофов молекулярными методами включала: выделение общей ДНК методом, основанным на использовании гексадецилтриметиламмониум бромида (Wilson, 1989); ПЦР-амплифнкацию фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК с использованием праймеров: MethTldF/MethTlbR, специфичных для представителей метанотрофов I и X типов, 27F/MethT2R, специфичных для представителей метанотрофов II типа (Wize et al., 1999), и универсальных бактериальных праймеров (GC)984F/1492R (Heuer et al., 1997). ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами MethTldF/MethTlbR, очищали и секвенировали. ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами GC984F/1492R, разделяли методом денатурирующего гель-электрофореза (DGGE) в 6% акриламидном геле, который содержал линейный градиент (от 30% до 60%) ДНК-денатурантов (смесь мочевины и формамида). Электрофорез проводили с использованием Universal Mutation Detection System (BioRad Laboratories Inc., США). После электрофореза, гели окрашивали водным раствором флуоресцентного ДНК и РНК красителя GelStar. Полоски, содержащие фрагменты ДНК определенной нуклеотидной последовательности, вырезали из гелей, ДНК экстрагировали и реамшшфицировали. Реакции секвенирования проводили с использованием DNA Sequencing kit "Big Dye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction" (ABI prism, Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе 310 Genetic Analyzer (ABI Prism, Applied Biosystems, США). Секвенированные

последовательности 16S рДНК сравнивали с последовательностями различных представителей домена Bacteria в GenBank с помощью программы BLAST [http;//www.n cb i. n 1 ni. nih. go y/bl ast]. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью программного пакета ARB (Ludwig et al., 2004). Приведенные а диссертации модификации методик и программ ПЦР-амплификации разработаны д-ром Г. Юргенсом и Л. Монгонен.

Разрабатывали способ снижения эмиссии СН4 с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции в покрывающую почву консорциума метан отросших бактерий, активных при пониженных температурах. Консорциум получали путем смешивания быстрорастущих накопительных культур аборигенных метанотрофов, выделенных при 10 и 20°С из покрывающей почвы полигона «Хметьево». Культивирование производили при !4.5-17°С на минеральной среде «П>> с 10% СН4 и газовой фазе. Проводили пилотный полевой эксперимент но интродукции метанотрофного консорциума в покрывающую почву участка N3 полигона «Хметьево». Для этого в районе точки 25 закладывали две площадки (опытную и контрольную) размером 1 х 1.5 м, расстояние между площадками составляло ] м. Метанотрофный инокулят объемом 10 л вносили на опытную площадку (на контрольную вносили 10 л воды), и площадки присыпали свежим грунтом. На обеих площадках измеряли эмиссию СШ до и после интродукции консорциума и проводили отбор образцов покрывающей почвы. В иноку ля те и почвенных образцах определяли видовой состав метапотрофной популяции методом непрямой имунофлуоресценции. Численность метанотрофов в почвенных образцах определяли с помощью МНР.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эмиссия метана с поверхности полигона «Хметьево»

Па полигоне «Хметьево» исследовали эмиссию СН4 в зависимости от возраста участка полигона и сезона года. Эмиссия СН4 с поверхности всех исследованных участков была крайне неоднородной (рис, 1) и варьировала от 0.2 ± 0.1 (участок N3) до 9057.5 ± 116 мгС м'2 час'! (MI).

1 10000 s.

Показана зависимость эмиссии СН4 от возраста участка полигона: величины суммарного и максимального потока СН4 с поверхности участка, возраст которого после закрытия составлял более 15 лет (N3), были существенно ниже, чем с «молодых» участков (табл. 1). Снижение общей эмиссии СН4 на «старых» участках объясняется истощением разлагаемого органического вещества в анаэробной зоне свалочного тела.

Табл. 1. Эмиссия СН4 с поверхности участков разного возраста полигона ТБО «Хметьево»

№ Возраст Эмиссия СН4, мг С м"2 час"1

участка участка, лет Максимальная Средняя

4 2.5 3823.3 ±301 1507.4

1 5 9057.5 ± 116 555.6

2 10 3444.4 ± 376 209.7

3 15 2009.5 ± 480 96.5

Сезонную динамику эмиссии СН4 исследовали в период с апреля по конец ноября 2003 г. на участке N3 полигона «Хметьево». Измерения проводили в экспериментальной точке 6, которая характеризовалась высоким содержанием СН4 (>30%), и С02 (>15%) по почвенному профилю ниже 10 см. Максимальная эмиссия СН4 наблюдалась в периоды с низкой температурой почвенного слоя (ранняя весна и поздняя осень). В теплое время года (с мая по октябрь) происходило снижение потоков СН4, вероятно обусловленное более эффективным микробным окислением СН4 при увеличении температуры покрывающей почвы. В июне и начале октября наблюдалось потребление СН4 из приземного воздуха (рис. 2).

Рис. 2. Сезонные изменения потока СН4 с поверхности эксп. т. 6 уч. N3 полигона «Хметьево», 2003 г.

3000

2500 - т

г и

2000-

1500

ш н

о и о 1=

868,74

1000

-500

Апрель

Июнь Июль Сеит. Время отбора проб

Ноябрь

Таким образом, результаты наших измерений подтверждают зависимость эмиссии СН4 от возраста участка полигона и сезона года.

2. Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона «Хметьево»

При миграции биогаза из анаэробной зоны в аэрируемом слое покрывающей почвы часть СН4 окисляется метанотрофными бактериями. Активность метанотрофной популяции покрывающей почвы является важным фактором, влияющим на величину потока СН4 с поверхности полигона (Nozhevnikova et al., 1993а,b; Bogner and Spokas, 1993; Jones andNedwell, 1993; Nozhevnikova and Lebedev, 1995; Bogneretal., 1999).

2.1. Потребление метана из приземного воздуха. На полигоне «Хметьево» были замечены точки с отсутствием эмиссии СН4 и потреблением СН4 из приземного воздуха (рис. 3). Способность покрывающей почвы полигонов ТБО окислять СН4 приземного воздуха является доказательством активности аэробных метанотрофных бактерий (Boeckx et al., 1996; Bogner et al., 1997b, 1999; Boijesson and Svensson, 1997b; Borjesson et al., 1998a; Nozhevnikova et al., 2003a). Максимальное потребление CH4 из приземного воздуха наблюдалось летом - в начале осени. Замечено снижение величины потребления СН4 с возрастом участка полигона, что, вероятно, связано со снижением общей продукции СН4 на более «старых» участках.

Точка отбора проб

< U

I ¡5

о к

о и

1 о -1 -2 -3

гт

12 16 d5

9 11

AS dl4 dl8

Рис. 3. Эмиссия и потребление СН4 на участке N1 полигона «Хметьево» в апреле 2002 г.

Другим свидетельством участия метанотрофов в окислении СН4, образуемого в анаэробной зоне полигона, является резкое снижение его концентрации в поровом газе вверх по профилю покрывающей почвы. Исследование порового газа, проведенное в разных точках на 3-х участках полигона, показало, что в большинстве случаев на глубине 45-60 см он состоял из смеси СН4 (30-60%) и С02 (25^0%). Концентрация этих газов снижалась вверх по профилю покрывающей почвы. Снижение концентрации СН4 может быть обусловлено: (1) выделением в атмосферу, (2) разбавлением проникающим воздухом и (3) микробным окислением ^огЬетаИсоуа й а1., 2003Ь). Обычно наблюдалась корреляция между концентрацией СН4 в поровом газе и потоком СН4 в отдельных точках: наивысшая концентрация СН4 в поровом газе на глубине 0-45 см была характерна для точек с высокой эмиссией СН4, и напротив, в точках, где концентрация СН4 резко уменьшалась по профилю покрывающей почвы, эмиссия была низкой или отсутствовала.

2.2. Факторы окружающей среды, влияющие на метанокисляющую активность покрывающей почвы. Основными факторами, влияющими на активность микробной популяции покрывающей почвы, являются условия окружающей среды, а именно доступность субстрата, достаточная влажность и

комфортная температура (Bogner and Spokas, 1993; Nozlievnikova and Lebedev, 1995; Hilger and Humer, 2003). В исследуемой нами системе субстратом является. метан, который постоянно поступает из анаэробной зоны полигона. Лимитирующим фактором может являться второй субстрат - кислород. Доступ 02 в слой покрывающей почвы на полигонах ТБО ограничен только в местах очень мощного потока СН4 из анаэробной зоны. Наши измерения показали, что 02 проникал на глубину до 60 см, и его концентрация в поровом газе снижалась вниз по разрезу покрывающей почвы.

Температура покрывающей почвы оказывает существенное влияние на жизнедеятельность почвенных микроорганизмов. На «старом» участке (N3) полигона «Хметьево» зимой слой покрывающей почвы замерзал полностью, а в период с 10 апреля по 28 ноября температура почвы колебалась от 0.7 до 22.5°С (рис. 4). Весной и летом почва прогревалась сверху, и ее температура уменьшалась с глубиной. Осенью, напротив, температура была выше на глубине 40-60 см. Однако на «молодых» участках полигона за счет интенсивной деградации органической фракции отходов может происходить разогрев покрывающей почвы снизу, а в зимнее время часто наблюдается протаивание снега. На самом «молодом» участке N4 полигона «Хметьево» мы зафиксировали увеличение температуры вниз по профилю покрывающей почвы в мае-июне 2005 г. Летом температура почвы превышала температуру воздуха и достигала 23°С на глубине 55 см.

Рис. 4. Сезонные 30 изменения температуры покрывающей почвы (участок N3 полигона «Хметьево», 2003 г).

Температуру измеряли 10 апреля (□), 18 мая (о), 8 июля (н), 9 сентября (А) и 28 ноября (•), сд±0.02-1.19°С.

Покрывающая почва полигонов ТБО относится к антропогенным почвам, сформированным в результате деятельности человека. Толщина слоя, состав и качество покрывающей почвы важны для заселения и развития в ней микроорганизмов, в том числе и метанотрофных бактерий. Мощный слой покрывающей почвы (до 1 м) способствует окислению СН4, благодаря наличию более стабильного концентрационного градиента газов по почвенному профилю и большей площади для заселения микроорганизмами (Bogner е1 а1., 2000). На полигоне «Хметьево» максимальная толщина слоя покрывающей почвы составляла 60 см, а в отдельных местах, особенно на «молодых» участках, не превышала и 30 см. Покрывающая почва имела неоднородную структуру и содержала песок, перемешанный с глиной и мелкими камнями, причем в одних точках почва преимущественно состояла из глины, в других - из песка. Если покрывающая почва содержит значительное количество песка, его высокая водопроницаемость приводит к сухости почвы и уменьшению микробного окисления СН4. Глина, наоборот, обладает

Температура, С

О 5 10 15 20 2?

высокой в одо удерживают ей способностью, что в период дождей приводит к переувлажнению почвы. Водный барьер мешает проникновению Ог на глубину и замедляет транспорт газообразных субстратов к клеткам бактерий, что снижает метан окисляющую активность покрывающей почвы и увеличивает эмиссию СН4 с полигона. На участке N1 полигона «Хметьено» мы исследовали водопроницаемость, влажность, плотность и твердость покрывающей почвы. Почва везде была «весьма плотная» (по Качинскому), и в зависимости от ее состава варьировали водопроницаемость и влажность. В точках, где почва преимущественно состояла из глины, отмечена низкая водопроницаемость, максимальная влажность и значительная эмиссия СНд Обратные характеристики установлены для точек, где почва преимущественно состояла из песка, В июне 2002 г. содержание воды в почве варьировало от 3,3 до 17.6%. и на влажность почвы влиял микрорельеф. В засушливое лето 2002 г. высокое содержание песка в покрывающей почве скорее являлось ее недостатком, поскольку высокая Водопроницаемость и как следствие этого низкая влажность приводили к снижению метанокисляюшсй активности почвы (табл. 2).

Табл. 2, Физические и микробиологические характеристики верхнего слоя

Состав Влажность. Плотность, Твердость". Водопронииае МО МПР

покрывают % г СМ ^ кПа масть, мм активность. численность ,

ей почвы мин 1 м км оль СП г'1 почвы сут"' метанотрофов. кл г 1 асм

2е Песок 3,9 1.17 6319 5.8 (наилучш.) 4.0 ±0.2 5.7 х 10J

4 Глина П.О 1.26 7878 0,5 (неуд.) 6.6 * 0.4 7.4 х 10'

(¡9 Смесь песка и глины 8.2 1.44 7235 1 64 (хор.) 8.0 ± 0.3 7.1 х !0J

Примечание: J - номер точки; - твердость по сдавливанию; ' - микроповышение, МО -метанокис ляющая активность.

Следующий 2003 год характеризовался типичными для климата Московской области сезонными изменениями температуры и влажности, более благоприятными для активности мстанотрофных бактерий. Влажность покрывающей почвы в мае-июле 2003 г, составляла 15-30% (рис. 5), и общий поток СН4 с поверхности участка значительно снижался по сравнению с апрелем.

Рис. 5. Сезонные изменения влажности покрывающей почвы (т. 1, участок N3 полигона «Хметьево», 2003 г.).

Влажность, % от сух. веса 0 10 20 30 40 50 60 70 80

10 апреля

1С ®

18 мая

с 8 июля

9 сентября

28 ноября

□ 0-20 см Ш 20-40 см 10

140-60 см

Максимальная влажность (до 60%) наблюдалась в

верхнем почвенном слое (0-20 см) в периоды таяния снега (апрель) и дождей

(сентябрь). В это время переувлажнение и пониженная температура почвы подавляли метанокисляющую активность, что приводило к увеличению эмиссии СН4 с поверхности полигона. Кроме того, высокая влажность усиливает метаногенез в анаэробной зоне полигона, что также увеличивает эмиссию СН( с его поверхности (Ножевникова и др., 1989; Bogner and Spokas, 1993; Czepiel et al., 1996).

2.3. Метанокисляющая активность покрывающей почвы. Определение метанокисляющей активности покрывающей почвы проводили ex situ в водных почвенных суспензиях при температуре 10 и 20°С и концентрациях СН4 и 02 в газовой фазе 10% и 18%, соответственно. Такое соотношение газов соответствовало средней концентрации СН4, наблюдаемой в покрывающей почве полигона и исключало недостаток 02, необходимого для окисления этого количества СН4, т.е. практически исключалась лимитация по субстрату. При этом, однако, создавались более благоприятные условия для развития метанотрофных бактерий, чем те, которые существовали на полигоне in situ. Исследовали влияние суспендирования покрывающей почвы на метанокисляющую активность путем инкубации почвы с естественной влажностью и инкубации водной почвенной суспензии. При инкубации почвенной суспензии скорость окисления СН4 была в 2.1-4.7 раз выше, чем при инкубации нативной почвы.

Все образцы покрывающей почвы, отобранные на 4-х исследованных участках полигона «Хметьево» обладали метанокисляющей активностью. На «молодых» участках (N1 и 4), где общая концентрация СН4 по профилю почвы была выше, чем на «старых» участках, покрывающая почва имела больший метанокисляющий потенциал, и часто точки с отсутствием или низкой эмиссией СН4 характеризовались высокой скоростью его окисления (табл. 3). В образцах покрывающей почвы, отобранных на участке N4, зафиксирована высокая метанокисляющая активность (2.8-12 мкмоль С1Ц г'1 асм почвы сут'1), что указывало на формирование эффективного метанотрофного биофильтра в течение 2-3 лет после закрытия участка для захоронения ТБО. Мезофильные условия и интенсивное поступление СН4 способствовали развитию метанотрофных бактерий в покрывающей почве «молодого» участка полигона.

Табл. 3. Метанокисляющая активность водных суспензий почвы, отобранной с глубины 30-40 см из точек с разной эмиссией СН4 (участок N1 полигона «Хметьево», апрель 2002 г.)______

№ ' точки Поток СН4 [СН4]\ об% МО активность, мкмоль СН4 г"1 почвы сут'1

мг С и1 ч"1 ммоль СН4 м~2 сут"1 10°С 20°С

2 -0.5 ± 0.3 -1.0 ±0.6 5.3-38.5 3.36 ±0.2 13.0 ±0.6

4 9057.5 ± 116 18115 ±232 50-56 1.6 ±0.1 5.3 ±0.3

d9 234±115 468 ±230 35-48.8 н.д. 8.8 ±0.5

Примечание:а - концентрация СНд на глубине 35-45 см; МО - метанокисляющая активность.

2.4. Сезонные изменения метанокисляющей активности покрывающей почвы. Сезонную динамику метанокисляющей активности исследовали в образцах почвы, отобранных из экспериментальной точки 1 участка N3 полигона «Хметьево». Данная точка характеризовалась низкой эмиссией СН4 в течение 2003 г. и максимальной для всего участка полигона величиной потребления СН4 из приземного воздуха, зафиксированной в мае.

Метанокисляющая активность покрывающей почвы возрастала в теплое время года (рис. 6) и была максимальной в образцах почвы, отобранных в июле, когда средняя температура почвы была близка к температуре лабораторной инкубации (20°С). Низкие скорости окисления СН4 показаны для образцов почвы, отобранных в апреле и ноябре, когда температура почвы была ниже 7°С. Данные по сезонной динамике окисления СН4 согласовались с данными по эмиссии СН4: когда в теплое время года метанокисляющая активность возрастала, эмиссия СН4 снижалась.

3-1

Рис. 6.

Й-

я р> В Й

в й

и а « ь « в я «

Я 'и

I £

1 и

2,5 -

1.5

0,5

10 апреля 18 мая 8 июля 28 ноября Время отбора проб

Метанокисляющая активность и 20°С водных суспензий почвы, отобранной с глубины 0-40 см из т. 1 участка N3 полигона «Хметьево», 2003 г.

2.5. Зависимость метанокисляющей активности от температуры инкубации.

Зависимость метанокисляющей активности от температуры определяли в диапазоне температур 2-60°С в водных суспензиях почвы, отобранной на участке N3 полигона «Хметьево» в мае и декабре 2005 г. Наименьшая метанокисляющая активность , наблюдалась при

температуре 2°С, а наивысшая - при 50°С (рис. 7).

3 2 о

К и

л ч о Е

2,5

1,5

1 -

0,5

Рис. 7. Зависимость

метанокисляющей

активности

покрывающей почвы от температуры инкубации. Почва отобрана с глубины 2040 см из т. 1 участка N3 полигона «Хметьево» в мае 2005 г.

Температура, °С 12

Температура покрывающей почвы на исследованном «старом» участке (N3) полигона «Хметьево» даже летом не превышала 23°С. Обнаруженная способность к окислению СН4 при 2°С и максимум метанокисляющей активности при 50°С, указывали на присутствие в покрывающей почве разнообразной по видовому составу метанотрофной популяции, представленной психротолерантными, мезофилышми и термотолерантными видами.

3. Численность метанотрофов в покрывающей почве полигона «Хметьево»

Численность метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона «Хметьево» определяли с помощью двух методов: МПР и CARD-FISH. Сочетание данных методов позволило оценить реальную плотность метанотрофной популяции in situ, влияние сезонных изменений температуры и влажности почвы на численность метанотрофов, а также вклад культивируемых метанотрофов (определенных МПР) в численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ (CARD-FISH).

3.1. Численность культивируемых метанотрофов. Определение численности культивируемых метанотрофов проводили на 3-х участках (N1, 2 и 3) полигона «Хметьево» в образцах покрывающей почвы, отобранных из нескольких экспериментальных точек с 3-х глубин (0-20, 20-40 и 40-60 см). На рисунке 8 показано изменение численности метанотрофов по профилю покрывающей почвы (т. 2, участок N1) весной (а) и летом (б) 2002 г. Весной численность метанотрофов была выше, чем летом и достигала максимальных значений в слое покрывающей почвы 2040 см. Летом численность метанотрофов увеличивалась с глубиной и достигала максимума в слое покрывающей почвы 40-60 см. Такое распределение метанотрофов по профилю покрывающей почвы может быть обусловлено погодными условиями: низкая влажность покрывающей почвы во время жаркого и засушливого лета 2002 г. привела к подавлению жизнедеятельности и снижению численности бактерий в верхнем слое покрывающей почвы (0-40 см) летом по сравнению с весной. Высокая численность метанотрофов обычно (но не всегда) была характерна для точек с низкой эмиссией СН4.

з -1

а Численность культивируемых метанотрофов, кл х 10 г аш почвы б

О 100 200 300 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2

0-20

20-10

40-60

-4-

10 15 20 0 5

Температура," С

Рис. 8. Численность культивируемых метанотрофов (□) и температура (о) покрывающей почвы в точке 2 участка N1 полигона «Хметьево» в апреле (а) и июне (б) 2002 г.

3.2. Сезонная динамика численности культивируемых метанотрофов.

Сезонную динамику численности культивируемых метанотрофов определяли в образцах почвы, отобранных из экспериментальной точки 1 участка N3 полигона «Хметьево» в период апрель-ноябрь 2003 г. Численность метанотрофов, рассчитанная на 35-е сутки инкубации, варьировала от 4 х 102 до 2 х 105 кл г асм почвы и увеличивалась после 2.5 мес. инкубации до 7 х 102 - 17 х 105 кл г'1 асм почвы. Максимальная численность метанотрофов обнаружена в теплое время года (май, июль). Ранней весной (апрель) и поздней осенью (конец ноября) численность метанотрофов снижалась, что, вероятно, связано с влиянием температуры. Максимальная численность метанотрофов, рассчитанная после 2.5 мес. инкубации, обнаружена в слое покрывающей почвы 20-40 см для всех исследованных образцов. По-видимому, параметры лабораторного культивирования (температура, концентрация СН4, время инкубации, состав элективной среды) были наиболее предпочтительны для нескольких видов метанотрофов, активных в слое покрывающей почвы 20-40 см. Близкая численность метанотрофов (n х 106 кл г 1 почвы) определена ранее с помощью МПР в болотных и свалочных почвах (Jones and Nedwell, 1993; Svenning et al., 2003). Замечена положительная корреляция (г = 0.998) между численностью метанотрофов и метанокисляющей активностью покрывающей почвы (рис. 9).

Рис. 9. Корреляция между численностью культивируемых метанотрофов (а) и метанокисляющей активностью (б). Покрывающая почва отобрана с глубины 0-40 см из т. 1 уч. N3, 2003г.

В Ъ

I м

I о

В л

л 5

о о

« И

10 апреля 18 мая 8 июля 28 ноября Время отбора проб

Участие метанотрофов в снижении эмиссии СН4 в теплое время года подтверждают сравнительные данные по численности метанотрофов (рис. 10а) и эмиссии СН4 (рис. 106) для двух точек участка N3 полигона «Хметьево». В точке 1 с низкой эмиссией СН4 численность культивируемых метанотрофов в слое покрывающей почвы 0-60 см была довольно высока и мало изменялась в июле по сравнению с маем (48-58 х 104 кл г"1 асм почвы). Напротив, в мае в точке 6 численность метанотрофов была низкой (0.44 х 104 кл г"1 асм почвы), а эмиссия СН4

июля в этой точке замечено ) наряду со значительным

высокой (570±36 мг С м"2 ч'1). резкое падение эмиссии СН4 (до

Однако уже к началу иъ ю 0.95±0.1 мг С м"2 ч"1

увеличением численности культивируемых метанотрофов (39 х 105 кл г'1 асм почвы). Очевидно к сёредйне лета в покрывающей почве создаются условия, благоприятные

для размножения метанотрофов, активность которых может приводить к снижению эмиссии СП^

л 400 ° IS F с

О ц

я _

it А

a, z S -

S июля Время отбор:» ггроб

600 500 400 300 200 100 0 •100

IS мая

Пволя Время отбора проб

N точки

Рис. 10. Сравнительные данные по численности метанотрофов, определенной с помощью МПР (а), и эмиссии CHj (б) в точках 1 н 6 участка N3 полигона «Хмегьево» (2003 г.).

3.3. Сезонная динамика численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ. Численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ, определяли с помощью метода CARD-F1SH в тех же образцах покрывающей почвы, которые использовали для определений численности метанотрофов с помощью МПР. Общая численность метанотрофов 1 и II типов варьировала от 15 ± 2 до 56- 7 х 10s о г"' асм почвы (рис. II).

9 сентября

2S ноября

□ 0-20 Си 320.40 см «40-60 ал

Рис. П.

Численность

метанотрофов

I и II типов по профилю покрывающей почвы и

Численность метанотрофов, х 108 кл г"1 асм почвы

0 10 20 30 40 50 60 70 -+------ I-1-1--(-1-1

ю 10 апреля

S" 13 мая

Е S июля 5

численность, усредненная для глубины 0-60 ем (•),

Наиболее высокая плотность популяции наблюдалась в теплый сезон года (май-сентябрь), когда температура покрывающей почвы составляла Ц.5-22.]5°С. Ранней весной (апрель) и поздней осенью (конец ноября) численность активных метанотрофов снижалась. Низкая численность метанотрофов в апреле в слое

покрывающей почвы выше 40 см вероятно связана с влиянием низкой температуры в течение предшествующей зимы. Однако достаточно высокая численность, обнаруженная на глубине 40-60 см, где в холодный сезон могла поддерживаться максимальная температура, позволяет предположить присутствие в этом почвенном слое психротолерантных метанотрофов. В теплый сезон года высокая плотность и активность метанотрофной популяции могла приводить к истощению доступного СН4 в верхних почвенных горизонтах, результатом чего являлось потребление СН4 из приземного воздуха, замеченное в мае. Снижение численности метанотрофов в верхнем слое покрывающей почвы в июле может являться результатом недостатка СН4 в поровом газе (0.1-0.7% СН4 на глубине 0-50 см). Осенью снижение общей численности метанотрофов связано с увеличением влажности и уменьшением температуры покрывающей почвы.

Таким образом, данные, полученные методом CARD-FISH, отражают влияние факторов окружающей среды (температуры, влажности почвы и доступности субстратов метанотрофного роста) на численность и распределение метанотрофов по профилю покрывающей почвы. Обнаружена корреляция численности метанотрофов, определенной методом CARD-FISH, с данными по потокам СН4, полученными в полевых условиях (рис. 12). Потребление СН4 из приземного воздуха наблюдалось в то же время, что и максимальная численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ (г = -0.854).

й о

о к ■ н о

5 ё Е

60 т

б /'

■ — I i 1 I .. .

\ — !

а \

/ г = -0.854

г 3

■2

■ 1

- -1

Е U

и о

S в

Рис. 12. Корреляция между потоком СН4 (а) и численностью метанотрофов (CARD-FISH) в слое

покрывающей почвы 0-40 см (б). Покрывающая почва отобрана из т. 1 участка N3, 2003 г.

10 апреля 18 мая 8 июля 28 ноября Время отбора проб

рч \ / г~ "и-И54 Й Общая численность

Q Т L о бактерий, определенная

методом CARD-FISH,

О 1 варьировала от 38 ± 12 до

-3 153 ± 17 х 108 кл г"1 асм почвы с максимумом, зафиксированным в июле и сентябре. В нижних горизонтах покрывающей почвы, благодаря доступности большего количества СН4, вклад метанотрофов в бактериальную численность был максимален.

Методом CARD-FISH во всех образцах покрывающей почвы показано присутствие представителей обоих типов (I и II) метанотрофов, причем метанотрофы I типа численно преобладали над метанотрофами II типа. Преобладание метанотрофов I типа может быть связано с их способностью расти при низких концентрациях СН4 и пониженных температурах. Напротив, представители метанотрофов II типа предпочитают высокие концентрации СН4 и мезофильные условия (Graham et al., 1993; Amaral et al., 1995; Hanson and Hanson, 1996; Кевбрина и др., 2001; Börjesson et al., 2004). Однако, влияние температуры, влажности,

концентрации субстратов на динамику численности представителей метанотрофов I и II типов в покрывающей почве полигона ТБО нуждается в дополнительных исследованиях.

Таким образом, с помощью МПР и CARD-FISH продемонстрирована одинаковая сезонная динамика численности метанотрофов в покрывающей почве с максимумом, зафиксированным в теплое время года. Численность метанотрофов, определенная методом CARD-FISH, в меньшей степени изменялась по профилю покрывающей почвы, меньше варьировала в зависимости от сезона года и значительно превышала численность метанотрофов, определенную с помощью МПР. Низкая численность культивируемых метанотрофов связана с ограничениями метода предельных разведений, который удобен для подсчета быстрорастущих гетеротрофных микроорганизмов, но не позволяет учитывать те микроорганизмы, которые не растут в заданных элективных условиях или растут медленно. Ранее уже обсуждалось отсутствие универсальных сред и условий для культивирования метанотрофных бактерий (Escoffier et al. 1997; Дедыш, 2006). Максимальное разведение, в котором фиксировалось окисление СН4 в отдельных флаконах, было 10"6. Однако при расчете численности метанотрофов по статистическим таблицам, мы учитывали только то разведение, в котором окисление СН4 наблюдалось во всех 3-х параллельных флаконах. Возможно, что в последних разведениях плотность метанотрофов была слишком низкой для окисления детектируемого количества СН4. В этом случае необходима инкубация более длительная, чем 2.5-3 месяца.

4. Биоразнообразие культивируемых метанотрофов в покрывающей почве полигона «Хметьево»

Биоразнообразие метанотрофов в покрывающей почве полигона «Хметьево» исследовали с помощью методов непрямой иммунофлуоресценции и молекулярной экологии. Проводили выделение накопительных культур метанотрофных бактерий из покрывающей почвы различных участков полигона «Хметьево» при температуре 10, 20 и 40°С и концентрациях СН4 в газовой фазе 5, 10 и 50%. В накопительных культурах определяли видовой состав метанотрофной популяции.

4.1. Идентификация культивируемых метанотрофов методом непрямой иммунофлуоресценции. В накопительных культурах, выделенных при температуре 10 и 20°С, идентифицировано 10 видов метанотрофов: Methylomonas methanica, 'Methylobacter bovis 'Mb. chroococcum ', Methylocystis echinoides, 'Mes. methanoliciis ', 'Mes. pyriformis ', Mes. parvus, Methylosiniis sporium, Ms. trichosporium и Methylocapsa acidiphila. Идентифицированные нами виды были обнаружены ранее на других полигонах ТБО и иловых чеках (Nozhevnikova et al., 1993а; Ножевникова и др., 1999; Nozhevnikova et al., 2001) за исключением ацидофильного вида Мер. acidiphila, выделенного ранее из кислого торфяного болота (Dedysh et al., 2002) и впервые идентифицированного на полигоне ТБО. В накопительных культурах, выделенных из почвенных образцов, отобранных ранней весной, метанотрофы идентифицированных видов составляли 0.4-8% от общего числа микроорганизмов и присутствовали предпочтительно в культурах, инкубированных при 20°С. В некоторых накопительных культурах, выделенных из образцов покрывающей почвы, отобранных в холодное время года, не было обнаружено ни одного из тестируемых видов. В отличие от весеннего сезона, летом метанотрофы идентифицированных мезофильных видов доминировали в метанотрофной популяции, и их количество иногда превышало 50% от общего числа микроорганизмов.

4.2. Идентификация культивируемых метаиотрофов молекулярными методами. Накопительные культуры, выделенные при разных температурах, отличались по составу метанотрофной популяции (табл. 4). В накопительных культурах, выделенных при 10°С, преобладали метанотрофы, близкородственные (99% сходства последовательностей генов 16S рДНК) психрофильному виду Methylobacter psychrophilus, выделенному ранее из болотистой почвы тундры (Омельченко, 1994; 1996) и психротолерантному виду Mb. tundripaludum SV96, выделенному из арктической болотной почвы (Wartiainen et al., 2006). Эти виды имеют оптимумы роста при 10 и 23°С, соответственно. Также обнаружено присутствие ацидофильных метанотрофов рода Methylocella (99% сходства последовательностей генов 16S рДНК с Mcel. tundrae или Mcel. palustris). Оба вида растут при пониженной температуре и имеют оптимумы роста при 15-20°С (Дедыш, 2004). В накопительных культурах, выделенных при 20°С, идентифицированы нуклеотидные последовательности, близкородственные известным представителям родов Methylobacter и Methylosinus (98-100% сходства последовательностей генов 16S рДНК). В накопительной культуре, выделенной при 40°С, единственный ' идентифицированный метанотроф имел 99% сходства последовательности гена 16S рДНК с таковой у термотолерантного вида Methylocaldum gracile. Вид Md. gracile растет в температурном диапазоне 20-47°С с оптимумом роста при 42°С (Хмеленина и др., 2006). Культивирование метанотрофных бактерий при концентрациях СН4 в газовой фазе 5, 10 и 50% не выявило четкой зависимости состава метанотрофной популяции от содержания субстрата.

Табл. 4. Состав метанотрофной и метилотрофной популяции в накопительных культурах, выделенных из покрывающей почвы полигона «Хметьево»_

т,°с %СН4в газовой фазе Близкородственный вид (% сходства последовательностей генов 16S рДНКа) № сиквенса

10 5 Methylosinus sporium (100) csl0-7c

Methylobacillus flagellatus (97) csl0-7a

10 Methylobacillus flagellatus (97) csl0-8a

Methylobacter psychrophilus (99), Methylobacter tundripaludum (99) csl0-2a2, -2a3, -2c, -3c, -5a, -5b, csl0-5c

Methylobacter marinus (98) csl0-4a, -4c

50 Methylocella tundrae (99), Methylocella palustris (99) csl0-9b

20 5 не обнаружено cs20-7

10 Methylobacter marinus (98), Methylobacter luteus (98) cs20-2a, -3a, -4a

Methylobacter tundripaludum (99), Methylobacter psychrophilus (98) cs20-6a, 20-6b

Methylosinus trichosporium (100) cs20-8f

50 Methylosinus sporium (99) cs20-9b

40 10 Methylocaldum gracile (99) cs40-llc

Примечание: * - % сходства последовательностей генов 16S рДНК определен при сравнении нуклеотидных последовательностей в GenBank с помощью программы BLAST.

Помимо метанотрофных бактерий в накопительных культурах, выделенных при 10°С, обнаружено присутствие облигатных метилобактерий (97% сходства последовательностей генов 16S рДНК с Methylobacillus flagellatus). Также идентифицированы различные неметанотрофные представители класса у-Proteobacteria, группы Chlamydia/Verrucomicrobia и некультивируемые и

неидентифицированные бактерии, что подтвердило отсутствие универсальных условий для культивирования метанотрофных бактерий.

Из образца покрывающей почвы, отобранного в апреле 2002 г с участка N1 полигона «Хметьево», выделена чистая культура метанотрофной бактерии С820-4 (заключение о чистоте культуры сделано на основании ВССЕ анализа). Секвенирование ДНК фрагмента (1430 пн), полученного при ПЦР-амплификации с праймерами МеШТЫР/1492Я, выявило 98% сходства последовательностей генов 168 рДНК штамма сб20-4 и вида МЬ. Шпс!г1ра1ис1ит. С видом МЬ. рвускгоркйив штамм с.я20-4 имел 97% сходства последовательностей генов 16Б рДНК (рис. 13). Клетки в культуре с$20-4 представлены округлыми палочками размером 0.6-0.7 х 1.1 мкм.

I- Ме%1оЬайег мпе1апсШ, L20841

91 '- МеШуЬЬайег сарБиЙиБ, 120843

1- Мб№у1оЬамег Ьоу1б, 120839

- Ме«1у1оЬааег Меив, АР304195 МеШуЬЬайег таппиз, АР304197

--МеШуЬЬайег эр. 5РВ, А0868427

76 г МеШу1сЬас{ег шпйпраЫит эггаю Э\/96Т, AJ414655

99 I - МеШуЮЬайег рБусИгорЬПиз, АР152597

МеШуЮЬайег ер. Т20, АИ31868

62 I '- св20-4

94 - Ме1Ьу!оЬас1ег даЬШепЬигуь Х72773

Ме%1оЬас1ег эр. Ш12, АУ007295

МеШу/оЬайег акаНрЬНиэ, АР096091 _0.1П

Рис. 13. Филогенетическое положение штамма ся20-4 в пределах рода МеЖу1оЬас1ег.

Таким образом, в накопительных культурах, выделенных из покрывающей почвы полигона «Хметьево», методами непрямой иммунофлуоресценции и молекулярной экологии идентифицированы известные мезофильные, психротолерантные, термотолерантные и ацидофильные виды метанотрофов. Оба метода выявили присутствие в накопительных культурах различных представителей родов МеАу1оЬаМег и МеЛуЬзтш. Разница в видовом составе метанотрофной популяции, обнаруженная при сравнении результатов, полученных двумя методами, обусловлена тем, что иммунофлуоресцентный анализ проводили на ранних стадиях выделения культур, когда метанотрофная популяция была наиболее разнообразной по составу. При этом не могли быть идентифицированы те виды, к которым отсутствовали специфичные сыворотки. Напротив, молекулярные методы использовали на более поздних стадиях выделения культур, когда минорная и медленно растущая части метанотрофной популяции уже успели элиминироваться.

5. Снижение эмиссии метана с поверхности полигона ТБО при помощи иптродукцпи консорциума метанотрофных бактерий

В полевых условиях на участке полигона «Хметьево» был поставлен пилотный эксперимент по инокуляции покрывающей почвы консорциумом метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах. Консорциум получали в лабораторных условиях путем смешивания быстрорастущих при 14.5-17°С накопительных культур аборигенных метанотрофов, выделенных при 10 и 20°С из покрывающей почвы полигона «Хметьево». Общая численность микроорганизмов в инокуляте составляла 13 х 107 кл мл"1.

После интродукции консорциума в покрывающую почву следили за эффективностью сохранения и развития материала и за изменением потоков СНд.

Доминирующий в инокуляте вил ' Ме1Ьу1осузШ т&ЬапоИсш' также преобладал на опытной площадке по прошествии 1.5 месяцев после интродукции, и его вклад в общую численность микроорганизмов составлял 30%. На контрольной площадке его вклад не превышал 2.3%. Численность культивируемых метанотрофов в покрывающей почве опытной площадки была выше, чем контрольной (рис, 14), а эмиссия СН4 в первые 2 месяца после интродукция консорциума (октябрь, ноябрь) ниже (рис. 15).

контроль

Окт. 2003

Аир. 2004

Рис. 14.

Численность культивируемых метанотрофов в образцах покрывающей почвы опытной и контрольной площадок.

Дата

Рис. 15, Эмиссия СН4с

поверхности опытной и контрольной площадок.

-2,0->

Сен г. до Сект. после Окт. 2003 Иояб. 2003 полипа полива

Дата

Результаты предварительного полевого эксперимента свидетельствовали о способности консорциума метанотрофных бактерий выживать в покрывающей почве полигона и приводить к снижению эмиссии СН4. Для увеличение продолжительности биостимуляции окисления СН4 необходимы дополнительные исследования с целью выяснения условий сохранения жизнеспособности, активности и конкурентоспособности и нтродуциро ванного метанотрофного консорциума.

Предложенный метод перспективен для использования на «старых» участках полигонов ТБО при локальном нарушении слоя покрывающей почвы во время их рекультивации, а также на участках с маломощным слоем покрывающей почвы. Обогащение покрывающей почвы метанотрофными бактериями, активными при пониженных температурах, важно для уменьшения эмиссии СН4 в холодное время года (ранняя весна и поздняя осень), когда происходит снижение окисления СН4 in situ.Однако для максимально эффективной борьбы с эмиссией СН4 на полигонах ТБО необходим комплексный подход к этой проблеме, сочетающий технические (контроль за составом ТБО, предобработка ТБО, установка на полигоны систем сбора биогаза, отвода фильтрационных вод, аэрации и ирригации), почвенные (подбор и использование на полигонах ТБО почв и грунтов, в которых поддерживаются оптимальные для окисления СН4 физико-химические условия) и биологические (озеленение, внесение в покрывающую почву компостов, активных илов, растительных остатков и консорциумов бактерий) методы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью почвенных, микробиологических и молекулярио-биологических методов проведено комплексное сезонное исследование эмиссии и аэробного окисления СН4, численности и состава метанотрофной популяции на полигоне ТБО. Зафиксирована крайняя неоднородность потоков СН4 с поверхности полигона, которая обусловлена неоднородностью захороненных отходов, их количеством (мощность слоя), качеством складирования (плотность слоя), содержанием разлагаемого органического вещества, интенсивностью метаногенеза в анаэробной зоне полигона, качеством пересыпающего грунта, наличием в свалочном теле разломов и трещин, по которым устремляется свалочный биогаз и интенсивностью аэробного окисления СН4. Показана зависимость эмиссии СН4 от возраста участка полигона и сезона года. Потоки СН4 были тем выше, чем моложе участок полигона и чем слабее окисляющая активность метанотрофной популяции покрывающей почвы. Максимальная эмиссия СН4 наблюдалась ранней весной, после таяния снега, летом эмиссия снижалась и увеличивалась поздней осенью. Напротив, метанокисляющая активность покрывающей почвы и численность культивируемых метанотрофов были максимальными в теплый сезон, что доказывает связь между снижением эмиссии СН4 летом с его более эффективным аэробным окислением. Метанокисляющая активность и численность метанотрофных бактерий зависели от физических свойств покрывающей почвы (температуры, состава, плотности, водопроницаемости и влажности), а также от концентрации субстратов метанотрофного роста (СН4 и 02). Использование на полигонах ТБО покрывающей почвы, преимущественно состоящей из песка, не рационально, поскольку в засушливый летний сезон ее высокая водопроницаемость приводит к сухости почвы, подавлению метанокисления и к увеличению эмиссии СН4 с поверхности полигона. Глинистая почва, обладающая противоположными свойствами, неблагоприятна для метанокисления в сезон дождей и во время таяния снега.

данными полевых измерений потоков СН4. Достаточно высокая численность метанотрофов, обнаруженная в холодные сезоны года, указывала на присутствие в покрывающей почве психротолерантных метанотрофов. Высокое соотношение между представителями метанотрофов I и II типов свидетельствовало о преобладании метанотрофов I типа на участках с низкой концентрацией СН4 по разрезу покрывающей почвы.

Сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило исследовать видовой состав культивируемых метанотрофов покрывающей почвы. Накопительные культуры, выделенные при разных температурах из почвы, отобранной в разные сезоны года, отличались по составу метанотрофной популяции. Методом непрямой иммунофлуоресценции показано, что в накопительных культурах, выделенных из почвы, отобранной ранней весной, количество идентифицированных мезофильных метанотрофов составляло менее 10% от общего числа микроорганизмов. Летом, напротив, метанотрофы мезофильных видов доминировали в метанотрофной поиуляции. С помощью молекулярных методов в накопительных культурах, выделенных при 10°С, идентифицированы метанотрофы, близкородственные известным пеихротолерантным видам, при 20°С - мезофильным, и при 40°С - термотолерантным. Впервые в покрывающей почве полигона ТБО идентифицированы метанотрофы, близкородственные ацидофильным видам, выделенным ранее из кислых сфагновых болот. Обнаруженное в покрывающей почве полигона ТБО большое видовое разнообразие метанотрофных бактерий свидетельствует о способности метанотрофной популяции покрывающей почвы сохранять активность в изменяющихся условиях окружающей среды таких, как температура (0.7-23°С) и концентрации СН4 (0.1-60%).

Получен патент на способ снижения эмиссии СН4 с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах. Использование полученных в настоящей работе результатов может помочь в решении проблемы эмиссии СН4 с поверхности рекультивируемых полигонов ТБО в России.

ВЫВОДЫ

1. Общим свойством всех исследованных участков полигона ТБО являлась гетерогенность потоков СН4, которые варьировали от -3.45 ± 1.35 до 9057.5 ±116 мг С м'2 час'1 Средняя эмиссия СН4 зависела от возраста участка полигона и была максимальной на участке, закрытом 2.5 года назад, а минимальной - более 15 лет.

2. В результате впервые проведенного на полигоне ТБО детального исследования эмиссии и аэробного окисления СН4 выявлена обратная зависимость между сезонными изменениями потоков СН4 и метанокисляющей активностью покрывающей почвы. В теплый сезон года метанокислякяцая активность возрастала, а эмиссия СН4 снижалась.

3/ Методом CARD-FISH, ранее не применявшимся для исследования метанотрофных бактерий, выявлена высокая численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ, которая значительно превышала численность метанотрофов, определенную методом предельных разведений. Численность метанотрофных бактерий была максимальной в теплый сезон года и положительно коррелировала с метанокисляющей активностью покрывающей почвы.

метанотрофного роста (СН4 и Ог), что указывает на необходимость поддержания в покрывающей почве условий, благоприятных для метаногрофных бактерий.

5. С помощью микробиологических и молекулярно-биолошческих методов выявлено большое видовое разнообразие метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО. Обнаружены известные представители мезофильных, психротолерантных, термотолерантных и ацидофильных метанотрофов, что указывает на способность метанотрофной популяции покрывающей почвы сохранять активность в изменяющихся условиях окружающей среды. В теплый сезон года преобладали мезофильные метанотрофы, а в холодный - психроактивные.

6. Разработан способ снижения эмиссии СН4 с поверхности полигона ТБО, основанный на интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженной температуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Экспериментальные статьи:

1. А. Ю. Каплистова. М. В. Кевбрина, В. К. Некрасова, М. В. Глаголев, М. И. Серебряная, А. Н. Ножевникова. Окисление метана в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов // Микробиология. 2005. Т. 74(5). С. 699-706.

2. А. 10. Каллистова. М. В. Глаголев, Н. А. Шнырев, М. В. Кевбрина, В. К. Некрасова, М. В. Чистотин, Е. В. Фаустова, М. И. Серебряная, А. Н. Ножевникова. Эмиссия метана с поверхности полигона захоронения твердых бытовых отходов в зависимости от возраста полигона и от сезона года // Ж. Эколог. Химии. 2006. Т. 15(1). С. 13-21.

3. A.Yu. Kallistova, М. V. Kevbrina, V. К. Nekrasova, N. A. Shnyrev, J-K. М. Einola, М. S. Kulomaa, J. A. Rintala and A. N. Nozhevnikova. Enumeration of methanotrophic bacteria in the cover soil of an aged municipal landfill // Microbial Ecology. 2007. (published on-line).

Главы в монографиях:

4. A. H. Ножевникова, А. Ю. Каллистова. М. В. Кевбрина. Эмиссия и окисление метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов: сезонные измерения // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 172-192.

Патент:

5. Гальченко В. Ф., Гонопольский А. М., Каллистова А. Ю„ Кевбрина М. В., Мурашов В. Е., Некрасова В. К., Новицкий И. Ю., Ножевникова А. Н., Пименов Н. В., Саввичев А. С., Серебряная М. И. Способ обработки рекультивируемых полигонов твердых бытовых отходов и свалок. Решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2005113259 принято 20.06.2006.

Статьи сборниках материалов конференций:

6. A. Nozhevnikova, A. Kallistova. М. Kevbrina, М. Glagolev, V. Nekrasova, V. Lebedev, J. Einola, К. Sormunen, and J. Rintala. Oxidation of methane in landfills located in cold climate zone: geochemical and microbiological studies // In: Proc. of

Workshop on Sustainable Landfill Management. - Chennai, India, 3-5 December 2003. P, 183-190.

7. A.N. Nozhevnikova, A.Yu. Kallistova, A.S. Sawichev, M.V. Kebrina, V.K. Nekrasova, V.E. Murashov, M.V. Serebryanaya, I.Ju. Novitskiy. Mitigation of methane emission from landfills by microbial methane oxidation // In: Proc. of 7th FAO/SREN-WORKSHOP "The future ofbiogas for sustainable energy production in Europe". - Uppsala, Sweden, 30 November-2 December 2005. P. 16-23.

8. Kallistova A. Yu.. Kevbrina M. V., Einola J-K. M., Kulomaa M. S., Ríntala J. A. and Nozhevnikova A. N. Quantitative identification of methanotrophic bacteria in the cover soil of an aged municipal landfill // In: Proc. of7,h FAO/SREN-WORKSHOP "The future of biogas for sustainable energy production in Europe". - Uppsala, Sweden, 30 November-2 December 2005. P. 180-184.

Тезисы конференций:

9. A. Kallistova. M. Kevbrina, V. Nekrasova, A. Nozhevnikova. Density and activity of ,methanotrophic bacteria in landfill cover soil: comparison of hot and cold seasons //

, International Conference on Arctic Microbiology. - Rovaniemi, Finland, 22-25 March 2004. P. 75.

10.А. Каллистова А. Ю., Кевбрина M. В., Некрасова В. К., Глаголев М. В., Чистотин М. В., Шнырев Н. А., Ножевникова А. Н. Сезонная динамика микробного окисления метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов // Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов»,- Москва, 2124 октября, 2004. С. 41.

11.Ножевникова А.Н., Саввичев С.А., Каллистова А. Ю.. Кевбрина М. В., Мурашов В.Е., Серебряная М.И., Новицкий И.Ю. Активация микробного образования и окисления метана на полигонах твердых бытовых отходов (ТБО) // 4-й Международный конгресс по управлению отходами «ВейстТэк-2005.».-Москва, 31 мая -3 июня 2005. С. 239-240.

12.Каллистова А. Ю.. Ейнола Ю., Ножевникова А.Н. 2005. Количественная идентификация метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона захоронения твердых бытовых отходов методом флуоресцентной in situ гибридизаций // Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 1-3 ноября 2005. С. 34-35.

13. А. Ю. Каллистова, Г. Юргенс, Л. Монтонен, У. Мюнстер, А. Н. Ножевникова. Биоразнообразие метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО // 11-ая Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 1-3 ноября 2006. С. 60-61.

Принято к исполнению 19/03/2007 Исполнено 20/03/2007

Заказ № 196 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каллистова, Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И

Глава 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИГОНОВ ТБО

1.1. Продукция, состав и утилизация ТБО в России

1.2. Характеристика микробных процессов на полигонах ТБО

1.3. Эмиссия метана с поверхности полигонов ТБО

Глава 2. МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ

2.1. Классификация и общая характеристика метанотрофных бактерий

2.2. Биохимические особенности окисления метана метанотрофными бактериями

2.3. Экология метанотрофных бактерий

Глава 3. МЕТАНОКИСЛЯЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЫ ПОЛИГОНОВ ТБО

3.1. Измерение метанокисляющей активности покрывающей почвы

3.1.1. Измерение окисления метана in situ

3.1.2. Измерение окисления метана ex situ

3.2. Влияние факторов окружающей среды на метанокисляющую активность покрывающей почвы

3.2.1. Температура

3.2.2. Влажность

3.2.3. Концентрация субстратов метанотрофного роста

3.2.4. Соединения азота

3.2.5. Летучие органические соединения

3.2.6. Состав покрывающей почвы

3.2.7. Кислотная реакция среды (рН)

3.2.8. Растительный покров

3.3. Способы снижения эмиссии метана с поверхности полигонов ТБО

Глава 4. ЧИСЛЕННОСТЬ И СОСТАВ МЕТАНОТРОФНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЫ ПОЛИГОНОВ ТБО

4.1. Оценка численности и выделение метанотрофов с помощью методов культивирования

4.2. Исследование метанотрофной популяции с помощью анализа состава клеточных жирных кислот

4.3. Оценка численности и видового состава метанотрофной популяции методом непрямой иммунофлуоресценции

4.4. Количественная идентификация метанотрофов методом флуоресцентной in situ гибридизации

4.5. Исследование биоразнообразия метанотрофов методами, основанными на использовании ПЦР

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. Объект исследования

5.2. Определение эмиссии метана

5.3. Определение состава порового газа по разрезу покрывающей почвы

5.4. Определение физических характеристик покрывающей почвы

5.5. Отбор образцов покрывающей почвы

5.6. Метод газоадсорбционной хроматографии

5.7. Определение метанокисляющей активности покрывающей почвы

5.8. Определение численности метанотрофных бактерий

5.8.1. Метод предельных разведений

5.8.2. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (CARD-FISH)

5.9. Выделение накопительных культур метанотрофных бактерий

5.10. Определение морфологии клеток микроорганизмов

5.11. Идентификация метанотрофных бактерий

5.11.1. Метод непрямой иммунофлуоресценции

5.11.2. Методы, основанные на использовании ПЦР

5.11.2.1. ДНК-экстракция

5.11.2.2. ПЦР-амплификация

5.11.2.3. Разделение ПЦР-продуктов методом DGGE

5.11.2.4. Секвенирование ДНК-фрагментов

5.12. Разработка способа снижения эмиссии метана при помощи интродукции консорциума метанотрофных бактерий

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. ЭМИССИЯ МЕТАНА С ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИГОНА «ХМЕТЬЕВО»

Глава 7. АЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА В ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЕ

ПОЛИГОНА «ХМЕТЬЕВО»

7.1. Влияние факторов окружающей среды на метанокисляющую активность покрывающей почвы

7.2. Метанокисляющая активность покрывающей почвы

7.3. Сезонные изменения метанокисляющей активности покрывающей почвы

7.4. Зависимость метанокисляющей активности покрывающей почвы от температуры инкубации

Глава 8. ЧИСЛЕННОСТЬ МЕТАНОТРОФОВ В ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЕ ПОЛИГОНА «ХМЕТЬЕВО»

8.1. Численность культивируемых метанотрофов

8.2. Сезонная динамика численности культивируемых метанотрофов

8.3. Сезонная динамика численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ

Глава 9. БИОРАЗНООБРАЗИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЕТАНОТРОФОВ В ПОКРЫВАЮЩЕЙ ПОЧВЕ ПОЛИГОНА «ХМЕТЬЕВО»

9.1. Идентификация метанотрофных бактерий методом непрямой иммунофлуоресценции

9.2. Идентификация метанотрофных бактерий молекулярными методами

9.2.1. ПЦР-амплификация образцов ДНК с метанотрофными и универсальными бактериальными праймерами

9.2.2. Разделение ДНК-фрагментов методом DGGE

9.2.3. Видовой состав бактериальной популяции в накопительных культурах

9.2.4. Молекулярный анализ культуры cs20

9.2.5. Молекулярный анализ образцов покрывающей почвы

Глава 10. СНИЖЕНИЕ ЭМИССИИ МЕТАНА С ПОВЕРХНОСТИ

ПОЛИГОНА ТБО ПРИ ПОМОЩИ ИНТРОДУКЦИИ КОНСОРЦИУМА

МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов"

Актуальность проблемы

Интерес к изучению микробиологии цикла метана обусловлен тем, что метан является конечным продуктом микробного разложения органического вещества в анаэробных условиях и одним из наиболее опасных парниковых газов. Содержание метана в атмосфере ежегодно возрастает в среднем на 1% за счет дисбаланса между его продукцией и окислением (Заварзин и Кларк, 1987; Blake and Rowland, 1988; Galchenko et al., 1989; IPCC, 2001). Большой вклад в изучение микробных процессов цикла метана принадлежит институту микробиологии им. С.Н. Виноградского, где проводятся комплексные исследования водных (Гальченко, 1995, 2006; Иванов и др., 2001; Ivanov and Lein, 2003, 2006; Пименов, 2004, Пименов и Гальченко, 2006), наземных (Заварзин, 1995; Заварзин и Васильева, 1999, Дедыш, 2004; Коцюрбенко, 2004; Кравченко и Быкова, 2004) и антропогенных (Zavarzin and Nozhevnikova, 1993; Ножевникова, 1994, 1995; Иванов, 2004) экосистем. Среди антропогенных местообитаний важным источником атмосферного метана являются полигоны захоронения твердых бытовых отходов (ТБО), вклад которых в глобальную эмиссию метана составляет 6-12% (IPCC, 2001). В России проблема утилизации ТБО приобрела угрожающие масштабы. В отличие от развитых стран запада, в нашей стране не используется раздельный сбор ТБО, лишь незначительная часть отходов подвергается предварительной механической обработке (прессованию). Не производится сортировка отходов и реутилизация бумаги, металлов, стекла и пластиков, а также отдельная обработка органической фракции отходов с получением компостов. Основным способом утилизации ТБО в России является их захоронение на специальных полигонах, общая площадь которых превышает 40 тыс. га. и ежегодно увеличивается на 2.5-4%. Однако большинство российских полигонов ТБО не соответствует современным нормам организации санитарных полигонов и оказывает негативное воздействие на окружающую среду и здоровье населения (Сборник докладов 4-го Международного конгресса по управлению отходами «ВейсТек», 2005). Полигоны ТБО загрязняют прилежащие почвы и грунты, грунтовые воды и атмосферу тяжелыми металлами и другими токсичными соединениями, включая газообразные и летучие вещества. Помимо отрицательного влияния локального характера, полигоны ТБО являются источником парниковых газов, главным образом СН4 и СО2. При отсутствии систем сбора биогаза, для уменьшения эмиссии метана с поверхности полигонов ТБО чрезвычайно важно его микробное окисление в аэробном покрывающем отходы слое антропогенной почвы, где развивается плотная популяция метанотрофных бактерий (Whalen et al., 1990; Nozhevnikova et al., 1993a, b; Nozhevnikova and Lebedev, 1995; Bogner et al., 1997a).

Метанотрофные бактерии (метанотрофы) представляют собой уникальную группу микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана в качестве единственного источника углерода и энергии. Метанотрофные бактерии выделены из различных почв, водной толщи озер и морей, болот, горячих источников, антарктических местообитаний, ризосферы растений и органов морских беспозвоночных животных (Hanson and Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Гальченко и Пименов, 2006). Высокая активность метанотрофной популяции обнаружена в покрывающей почве полигонов ТБО (Ножевникова и др., 1993; Jones and Nedwell, 1993; Nozhevnikova et al., 2003a). В отличие от анаэробного микробного сообщества, функционирующего в толще отходов, где температура постоянна, жизнедеятельность метанотрофных бактерий покрывающей почвы существенно зависит от климатических условий. Исследования активности, плотности и состава метанотрофной популяции в холодные и теплые сезоны года особенно важны для полигонов ТБО, расположенных в умеренной климатической зоне России, для которой характерны выраженные сезонные колебания температуры и длительная холодная зима. Изучение влияния факторов окружающей среды на плотность и состав метанотрофной популяции и создание условий, необходимых для максимальной активности метанотрофных бактерий, важно для разработки способов снижения эмиссии метана с поверхности российских полигонов ТБО.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение аэробного окисления метана в покрывающей почве полигона ТБО.

Конкретные задачи исследования включали:

1. Изучение сезонной динамики эмиссии и аэробного окисления метана, активности и численности метанотрофных бактерий в покрывающей почве полигона ТБО.

2. Выделение накопительных культур метанотрофных бактерий из образцов покрывающей почвы при разных температурах и концентрациях метана.

3. Изучение биоразнообразия культивируемых метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО.

4. Разработку способа снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено комплексное сезонное исследование эмиссии и аэробного окисления метана, численности и состава метанотрофной популяции покрывающей почвы полигона ТБО. Зафиксирована крайняя неоднородность потоков метана с поверхности полигона. Показана зависимость эмиссии метана от возраста участка полигона и сезона года. Выявлена обратная зависимость между сезонными изменениями эмиссии метана и метанокисляющей активностью покрывающей почвы. Впервые использован метод CARD-FISH для анализа численности метанотрофных бактерий, активных в покрывающей почве in situ. Применение данного метода позволило выявить высокую численность метанотрофов, которую не удавалось обнаружить ранее с помощью традиционных методов культивирования. Показан значительный вклад метанотрофов в общую численность бактериальной популяции покрывающей почвы, что может свидетельствовать о важной роли этих бактерий не только в окислении метана, но и в почвообразовании. Сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило исследовать видовой состав метанотрофной популяции покрывающей почвы. Впервые в покрывающей почве полигона ТБО, наряду с известными мезофильными метанотрофами, идентифицированы метанотрофы, близкородственные ацидофильным видам, выделенным из кислых сфагновых болот, психротолерантным видам, выделенным из арктических болотных почв, и термотолерантному виду, выделенному из активного ила очистных сооружений. Эти данные расширяют представление об экологии и распространении метанотрофных бактерий в природе. Результаты работы могут быть использованы при выборе и создании технологий рекультивации полигонов ТБО. Получен патент на способ снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО путем интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на конференциях: "Workshop on Sustainable Landfill Management" (2003); 4-м Международном конгрессе по управлению отходами «ВейстТэк» (2005); "International Conference on Arctic Microbiology" (2004); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология Микробов» (2004); 7th FAO/SREN-WORKSHOP "The future of biogas for sustainable energy production in Europe" (2005); 1-ой Всероссийской и И-ой Международной молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (2005, 2006).

Место проведения работы

Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Молекулярно-биологические исследования проведены на кафедрах науки об окружающей среде и молекулярной биологии факультета биологии и науки об окружающей среде Университета г. Ювяскюля (Финляндия) и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. А.Н. Ножевниковой за общее научное руководство, предоставленную возможность работы за рубежом, помощь в обсуждении результатов и редактирование диссертации и благодарит сотрудников ИНМИ РАН к.б.н. М.В. Кевбрину и В.К. Некрасову за иммунофлуоресцентный анализ накопительных культур метанотрофов и помощь в лабораторных исследованиях, М.В. Глаголева, Н.А. Шнырева, к.б.н. М.В. Чистотина и к.б.н. А.С. Саввичева за помощь в полевых работах, сотрудников кабинета газохроматографического анализа ИНМИ РАН, сотрудника кафедры физики и мелиорации почв факультета почвоведения МГУ д.б.н. А.В. Смагина, директора полигона ТБО «Хметьево» В.Э. Эвальда и зарубежных партнеров: д-ра, проф. Ю. Ринтала, д-ра, проф. М. Куломаа, д-ра Г. Юргенса и J1. Монтонен. Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории антропогенных мест обитания за внимание, всестороннюю поддержку и участие в этой работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов INCO-Copernicus (ICA2-CT-2001-10001 А/144168), правительства г. Москвы (договор № 12-Э/04), РАН (проект №3 безвалютного обмена между РАН и АН Финляндии) и АН Финляндии (№214719).

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 18 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 202 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каллистова, Анна Юрьевна

выводы

1. Общим свойством всех исследованных участков полигона ТБО являлась гетерогенность потоков метана, которые варьировали от -3.45 ± 1.35 до 9057.5 ± 116 мг С м"2 час'1. Средняя эмиссия метана зависела от возраста участка полигона и была максимальной на участке, закрытом 2.5 года назад, а минимальной - более 15 лет.

2. В результате впервые проведенного на полигоне ТБО детального исследования эмиссии и аэробного окисления метана выявлена обратная зависимость между сезонными изменениями потоков метана и метанокисляющей активностью покрывающей почвы. В теплый сезон года метанокисляющая активность возрастала, а эмиссия метана снижалась.

3. Методом CARD-FISH, ранее не применявшимся для исследования метанотрофных бактерий, выявлена высокая численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ, которая значительно превышала численность метанотрофов, определенную методом предельных разведений. Численность метанотрофных бактерий была максимальной в теплый сезон года и положительно коррелировала с метанокисляющей активностью покрывающей почвы.

4. Подтверждена зависимость метанокисляющей активности и численности метанотрофных бактерий от физических свойств покрывающей почвы (температуры, состава, плотности, водопроницаемости, влажности) и концентрации субстратов метанотрофного роста (СН4 и Ог), что указывает на необходимость поддержания в покрывающей почве условий, благоприятных для метанотрофных бактерий.

5. С помощью микробиологических и молекулярно-биологических методов выявлено большое видовое разнообразие метанотрофов в покрывающей почве полигона ТБО. Обнаружены известные представители мезофильных, психротолерантных, термотолерантных и ацидофильных метанотрофов, что указывает на способность метанотрофной популяции покрывающей почвы сохранять активность в изменяющихся условиях окружающей среды. В теплый сезон года преобладали мезофильные метанотрофы, а в холодный - психроактивные.

6. Разработан способ снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО, основанный на интродукции в покрывающую почву консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженной температуре.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью почвенных, микробиологических и молекулярно-биологических методов проведено комплексное сезонное исследование эмиссии и аэробного окисления метана, численности и состава метанотрофной популяции на полигоне ТБО. Зафиксирована крайняя неоднородность потоков метана с поверхности полигона, которая обусловлена неоднородностью захороненных отходов, их количеством (мощность слоя), качеством складирования (плотность слоя), содержанием разлагаемого органического вещества, интенсивностью метаногенеза в анаэробной зоне полигона, качеством пересыпающего грунта, наличием в свалочном теле разломов и трещин, по которым устремляется свалочный биогаз и интенсивностью аэробного окисления метана. Показана зависимость эмиссии метана от возраста участка полигона и сезона года. Потоки метана были тем выше, чем моложе участок полигона и чем слабее окисляющая активность метанотрофной популяции покрывающей почвы. Максимальная эмиссия метана наблюдалась ранней весной, после таяния снега, летом эмиссия снижалась и увеличивалась поздней осенью. Напротив, метанокисляющая активность покрывающей почвы и численность культивируемых метанотрофов были максимальными в теплый сезон, что доказывает связь между снижением эмиссии метана летом и его более эффективным аэробным окислением. Метанокисляющая активность и численность метанотрофных бактерий зависели от физических свойств покрывающей почвы (температуры, состава, плотности, водопроницаемости и влажности), а также от концентрации субстратов метанотрофного роста (СН4 и Ог). Использование на полигонах ТБО в качестве покрывающей почвы грунта, преимущественно состоящего из песка, не вполне рационально, поскольку в засушливый летний сезон его высокая водопроницаемость приводит к сухости почвы, подавлению метанокисления и к увеличению эмиссии метана с поверхности полигона. Глинистый грунт, обладающий противоположными свойствами, неблагоприятен для метанокисления в сезон дождей и во время таяния снега.

В настоящей работе впервые был использован метод CARD-FISH для анализа численности метанотрофной популяции, активной в покрывающей почве in situ. Применение данного метода позволило выявить высокую численность метанотрофов, которую не удавалось обнаружить ранее с помощью традиционных методов культивирования. Показан значительный вклад метанотрофов в общую численность бактериальной популяции покрывающей почвы, что может свидетельствовать о важной роли этих бактерий как в окислении метана, так и в почвообразовании. Численность метанотрофов, активных в покрывающей почве in situ, коррелировала с данными полевых измерений потоков метана. Достаточно высокая численность метанотрофов, обнаруженная в холодные сезоны года, указывала на присутствие в покрывающей почве психротолерантных метанотрофов. Высокое соотношение между представителями метанотрофов I и II типов свидетельствовало о преобладании метанотрофов I типа на участках с низкой концентрацией метана по разрезу покрывающей почвы.

Сочетание микробиологических и молекулярно-биологических методов позволило исследовать видовой состав культивируемых метанотрофов покрывающей почвы. Накопительные культуры, выделенные при разных температурах из почвы, отобранной в разные сезоны года, отличались по составу метанотрофной популяции. Методом непрямой иммунофлуоресценции показано, что в накопительных культурах, выделенных из почвы, отобранной ранней весной, количество идентифицированных мезофильных метанотрофов составляло менее 10% от общего числа микроорганизмов. Летом, напротив, метанотрофы мезофильных видов доминировали в метанотрофной популяции. С помощью молекулярных методов в накопительных культурах, выделенных при Ю°С, идентифицированы метанотрофы, близкородственные известным психротолерантным видам, при 20°С - мезофильным, и при 40°С - термотолерантным. Впервые в покрывающей почве полигона ТБО идентифицированы метанотрофы, близкородственные ацидофильным видам, выделенным ранее из кислых сфагновых болот. Обнаруженное в покрывающей почве полигона ТБО большое видовое разнообразие метанотрофных бактерий свидетельствовало о способности метанотрофной популяции покрывающей почвы сохранять активность в изменяющихся условиях окружающей среды таких, как температура (0.7-23°С) и концентрации СН4 (0.1-60%).

Разработан способ снижения эмиссии метана с поверхности полигона ТБО при помощи интродукции консорциума метанотрофных бактерий, активных при пониженных температурах. Результаты работы могут быть использованы при выборе и создании технологий рекультивации полигонов ТБО.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каллистова, Анна Юрьевна, Москва

1. Безрукова Л.В., Николенко Ю.И., Нестеров А.И., Гальченко В.Ф., Иванов М.В. Сравнительный серологический анализ метанотрофных бактерий // Микробиология. 1983. Т. 52(5). С. 800-805.

2. Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В., Честных О.В., Заварзин Г.А. Метанотрофы психрофильного микробного сообщества заполярной тундры России // Микробиология. 2002. Т. 71(4). С. 538-544.

3. Бутусов М., Герман Л., Прайнжорн Дж. Безотходная переработка ТБО // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 99-100.

4. Вадюнина А.Ф. и Корчагина З.А. Методы исследования физических свойств почв и грунтов // М.: Высшая школа. 1973. 399 С.

5. Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю., Заварзин Г.А. Психрофильные ацидофильные метанотрофы из сфагнеты зоны вечной мерзлоты // Доклады Академии наук. 1999. Т. 368(1). С. 125-128.

6. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Выделение и свойства новых штаммов облигатных метанотрофов // Микробиология. 1977. Т. XLVI(5). С. 890897.

7. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова Л.В., Соколова Е.Н., Иванов М.В. Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры Черного моря // Микробиология. 1988. Т. 57(2). С. 305-311.

8. Гальченко В.Ф. Бактериальный цикл метана в морских экосистемах // Природа. 1995. № 6. С. 35-48.

9. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии // М.: ГЕОС. 2001. 500 С.

10. Гальченко В.Ф. Биогеохимия окисления метана в Черном море // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 45-90.

11. Гальченко В.Ф. и Пименов Н.В. Метанотрофные симбионты морских животных // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 225-262.

12. Ганжара Н.Ф., Борисов Б.А., Байбеков Р.Ф. Практикум по почвоведению // Под ред. Н.Ф. Ганжары / М.: Агроконсалт. 2002. 280 С.

13. Глаголев М.В. Математическое моделирование метанокисления в почве // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 315-341.

14. Горбатюк О.В., Минько О.И., Лифшиц А.Б. Ферментеры геологического масштаба // Природа. 1989. № 9. С. 71-79.

15. Дедыш С.Н. Метанотрофные бактерии кислых сфагновых болот // Микробиология. 2002. Т. 71(6). С. 741-754.

16. Дедыш С.Н. Ацидофильные метанотрофные бактерии // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Вып. XII. С. 109-125.

17. Дедыш С.Н. Ацидофильные метанотрофные бактерии // Дисс. на соискание ученой степени д. б. н. Москва, 2005.

18. Дедыш С.Н. Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 192-224.

19. Заварзин Г.А. Трофические связи в метаногенном сообществе // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. №3. с. 341-360.

20. Заварзин Г.А. Биогаз и малая энергетика // Природа. 1987. № 1. С. 66-79.

21. Заварзин Г.А. и Кларк У. Биосфера и климат глазами биологов // Природа. 1987. № 6. С. 65-77.

22. Заварзин Г.А. Психрофильный цикл Зенгена // Ж. Эколог. Химии. 1995. Т. 4(1). С. 312.

23. Заварзин Г.А. и Васильева Л.В. Цикл метана на территории России // В кн.: Круговорот углерода на территории России / Под ред. Г.А. Заварзина / М.: Комплекс перспективного развития города Правительства Москвы. 1999. С. 202-230.

24. Захаров С.А. Экономические и налоговые механизмы управления отходами производства и потребления в Московской области // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 53-55.13 12

25. Зякун A.M. Использование С/ С для характеристики процесса бактериального метанокисления // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 285-314.

26. Иванов М.В., Русанов И.И., Пименов Н.В., Байрамов И.Т., Юсупов С.К., Саввичев А.С., Леин А.Ю., Сапожников В.В. Микробные процессы цикла углерода и серы в озере Могильном //Микробиология. 2001. Т. 70(5). С. 675-686.

27. Иванов М.В. Микробиологический метод борьбы с метаном в угольных шахтах // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Вып. XII. С. 160-171.

28. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метанотрофы как симбионты растений // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 263-284.

29. Кевбрина М.В., Охапкина А.А., Ахлынин Д.С., Кравченко И.К., Ножевникова А.Н., Гальченко В.Ф. Рост мезофильных метанотрофов при низких температурах // Микробиология. 2001. Т. 70(4). С. 444-451.

30. Кондратенко Г.П., Николенко Ю.И., Безрукова JI.B., Нестеров А.И., Гальченко В.Ф. Идентификация метанотрофных бактерий методом иммунофлуоресценции // Микробиология. 1981. Т. 50(2). С. 320-325.

31. Корчагина З.А. Учебное руководство к полевой практике по физике почв // М.: МГУ. 1983.84 С.

32. Коцюрбенко О.Р. Метаногенные микробные сообщества холодных наземных экосистем // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Вып. XII. С. 213-236.

33. Кравченко И.К. и Быкова С.А. Окисление атмосферного метана микроорганизмами аэробных почв // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Вып. XII. С. 235-248.

34. Кравченко И.К., Семенов В.М., Кузнецова Т.В., Дулов JI.E., Семенова Н.А., Гальченко В.Ф., Боукс П., Ван Климпут О. Окисление метана и превращение азота в серой лесной почве // Почвоведение. 2004. № 1. С. 60-67.

35. Лебедев B.C., Горбатюк О.В., Иванов Д.В., Ножевникова А.Н., Некрасова В.К. Биогеохимические процессы образования и окисления биогаза на свалках бытовых отходов // Ж. Эколог. Химии. 1993. № 4. С. 323-334.

36. Лебедев B.C., Каменщиков А.Ф., Глаголев М.В., Иванов Д.В., Каменщикова А.Ю. Математическое моделирование состава биогаза в процессе окисления на объектах захоронения бытовых отходов // Геоинформатика. 1996. № 1(4). С. 23-26.

37. Лебедев B.C., Балакин В.А., Иванов Д.В., Соловьев А.В., Телешева С.Ю. Применение изотопно-химических методов при геоэкологических исследованиях захороненных органических отходов // Разведка и охрана недр. 2005. № 4. С. 76-79.

38. Лебедев В.Н. Безотходная экологически чистая технология сортировки и переработки твердых бытовых отходов (ТБО) // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 101-102.

39. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Богаченко В.Н. Швед А.Д. Термофильные и термотолерантные бактерии, ассимилирующие метан // Микробиология. 1975. Т. XLIV(5). С.855-862.

40. Мирный А.Н. Прогнозы изменения состава ТБО крупных городов России // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 124-125.

41. Никогосов Х.Н., Игнатьева О.М., Левина В.В., Корнеева А.А. Перспектива использования вторичных материальных ресурсов // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 120-122.

42. Ножевникова А.Н., Елютина Н.Ю., Некрасова В.К., Труфманова Е.А. Образование метана микрофлорой грунта полигона твердых бытовых отходов // Микробиология. 1989. Т. 58(5). С. 859-863.

43. Ножевникова А.Н., Лебедев B.C., Заварзин Г.А., Иванов Д.В., Некрасова В.К., Лифшиц А.Б. Образование, окисление и эмиссия биогаза на объектах захоронения бытовых отходов // Ж. Общ. Биологии. 1993. Т. 54(2). С. 167-182.

44. Ножевникова А.Н. Метаногенные микробные сообщества в охране окружающей среды // Дисс. на соискание ученой степени д. б. н. Москва, 1994.

45. Ножевникова А.Н. Мусорные залежи «метановые бомбы» планеты // Природа. 1995. № 6. С. 25-34.

46. Ножевникова А. Н., Некрасова В. К., Лебедев В. С. Образование и окисление метана микробной популяцией осадков иловых чеков при низких температурах // Микробиология. 1999. Т. 68(2). С. 267-272.

47. Ножевникова А.Н., Каллистова А.Ю., Кевбрина М.В. Эмиссия и окисление метана на полигоне захоронения твердых бытовых отходов: сезонные измерения // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 172-191.

48. Омельченко М.В., Савельева Н.Д., Васильева Л.В., Заварзин Г.А. Психрофильное метанотрофное сообщество из почвы тундры // Микробиология. 1992. Т. 61(6). С. 10721077.

49. Омельченко М.В., Васильева Л.В., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофильного метанотрофа // Микробиология. 1993. Т. 62(5). С. 849-854.

50. Омельченко М.В. Психрофильный метанотроф и его спутники // Дисс. на соискание ученой степени к. б. н. Москва, 1994.

51. Омельченко М.В., Васильева JI.B., Заварзин Г.А., Савельева Н.Д., Лысенко A.M., Митюшина JI.JI., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Новый психрофильный метанотроф рода Methylobacter И Микробиология. 1996. Т. 65(3). С. 384-389.

52. Орлов Д.С., Минько О.И., Каспаров С.В., Амосова Я.М., Глаголев М.В. Методы изучения газовой функции почв //В кн.: Современные физические и химические методы исследования почв / Под ред. А.Д. Воронина и Д.С. Орлова. М.: МГУ. 1987. С. 118-156.

53. Пименов Н.В. Микробные процессы в зонах разгрузки газосодержащих флюидов на дне океана // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2004. Вып. XII. С. 337-360.

54. Пименов Н.В. и Гальченко В.Ф. Метанокисление в районах черноморских метановых сипов // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 91-112.

55. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие. // Под ред. Н. С. Егорова. 3-е изд. / М.: МГУ. 1995. 224 С.

56. Смагин А.В., Глаголев М.В., Суворов Г.Г., Шнырев Н.А. Методы исследования потоков газов и состава почвенного воздуха в полевых условиях с использованием портативного газоанализатора ПГА-7 // Вестник МГУ. Сер. 17 (Почвоведение). 2003. № 3. С. 29-36.

57. Смагин А.В. и Глаголев М.В. Современные полевые методы изучения газовой функции болотных почв // В сб. мат. 3-й Научной Школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2004. С 53-63.

58. Смагин А.В. Газовая фаза почв // М.: МГУ. 2005. 301 С.

59. Соломин И.А. и Гасьмаева О.В. Погребенные несанкционированные свалки Москвы и методы их обезвреживания // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 122-123.

60. Троценко Ю.А. и Хмеленина В.Н. Особенности биологии и осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов //Микробиология. 2002. Т. 71(2). С. 149-159.

61. Турова Т.П., Омельченко М.В. Фегединг К.В., Васильева JI.B. Филогенетическое положение Methylobacter psychrophilus sp. nov. // Микробиология. 1999. Т. 68(4). С. 568

62. Харитонова Н.В. и Корнилаев Е.М. Оценка воздействия полигонов захоронения ТБО на подземные воды // Сб. докл. 4-го Межд. конгр. по управлению отходами «ВейстТэк-2005». Москва, 31 мая -3 июня 2005 г. С. 255-256.

63. Хмеленина В.Н., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. Физиолого-биохимические особенности галоалкалотолерантного метанотрофа // Микробиология. 1997. Т. 66(4). С. 437-443.

64. Хмеленина В.Н. и Троценко Ю.А. Особенности метаболизма облигатных метанотрофов // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 24-44.

65. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников А.С., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2006. Вып. XIII. С. 147-171.

66. Цинберг М.Б. и Ивановская И.Б. Образование метана на свалке твердых бытовых отходов г. Оренбурга // Чистый город. Оренбург.: ЭкоБиос. 1998. № 4. С. 33-36.

67. Adamsen A.P.S. and King G.M. Methane consumption in temperate and subarctic forest soils: rates, vertical zonation, and responses to water and nitrogen // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 485-490.

68. Alexander M. Most probable number method for microbial populations // In: Methods of soil analysis. Agronomy monograph / Page A.L., Miller R.H., Keeney D.R. (Eds.). 2nd Ed. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin. 1982. V. 2(9). P. 815-820.

69. Amann R.I, Binder B.J., Olsen R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D. A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analysing mixed microbial populations // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 1919-1925.

70. Amann R.I., Zarda В., Stahl D.A., Schleifer K.H. Identification of individual prokaryotic cells by using enzyme-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 3007-3011.

71. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.

72. Amaral J.A. and Knowles R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 126. P. 215-220.

73. Amaral J.A., Archambault C., Richards S.R., Knowles R. Denitrification associated with groups I and II methanotrophs in a gradient enrichment system // FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 18. P. 289-298.

74. Barber R.D. and Ferry J.G. Methanogenesis // In: Encyclopedia of life science / Nature Publishing Group. 2001. www.els.net.

75. Bender M. and Conrad R. Effect of CH4 concentrations and soil conditions on the induction of CH4 oxidation activity//Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P. 1517-1527.

76. Blake D.R. and Rowland F.S. Continuing worldwide increase in tropospheric methane, 1978 to 1987 //Science. 1988. V. 239(4844). P. 1129-1131.

77. Boeckx P., Van Cleemput 0., Villaralvo I. Methane emission from a landfill and the methane oxidizing capacity of its covering soil // Soil Biol. Biochem. 1996. V. 28. P. 1397-1405.

78. Boeckx P. and Van Cleemput O. Methane oxidation in neutral landfill cover soil: influence of moisture content, temperature, and nitrogen-turnover // J. Environ. Qual. 1996. V. 25. P. 178183.

79. Bogner J.E. and Spokas K.A. Landfill CH4: rates, fates, and role in global carbon cycle // Chemosphere. 1993. V. 26(1-4). P. 369-386.

80. Bogner J., Spokas K., Burton E., Sweeney R., Corona V. Landfills as atmospheric methane sources and sinks // Chemosphere. 1995. V. 31(9). P. 4119-4130.

81. Bogner J.E., Sweeney R.E., Coleman D., Huitric R., Ririe G.T. Using isotopic and molecular data to model landfill gas processes // Waste Manage. Res. 1996. V. 14. P. 367-376.

82. Bogner, J., Meadows, M., Czepiel, P. Fluxes of methane between landfills and the atmosphere: natural and engineered controls // Soil Use Manage. 1997a. V. 13. P. 268-277.

83. Bogner J.E., Spokas K.A., Burton E.A. Kinetics of methane oxidation in a landfill cover soil: temporal variations, a whole-landfill oxidation experiment, and modeling of net CH4 emissions // Environ. Sci. Tech. 1997b. V. 3. P. 2504-2514.

84. Bogner J.E., Spokas K.A., Burton E.A. Temporal variations in greenhouse gas emissions at midlatitude landfill // J. Environ. Qual. 1999. V. 28. P. 278-288.

85. Bogner J.E., Sass R.L., Walter B.P. Model comparisons of methane oxidation across a management gradient: wetlands, rice production systems, and landfill // Global Biogeochemical Cycles. 2000. V. 14(4). P. 1021-1033.

86. Borjesson G. and Svensson B.H. Seasonal and diurnal methane emissions from a landfill and their regulation by methane oxidation // Waste Manage. Res. 1997a. V. 15. P. 33-54.

87. Borjesson G. and Svensson B.H. Effects of a gas extraction interruption on emissions of methane and carbon dioxide from landfill, and on methane oxidation in the cover soil // J. Environ. Qual. 1997b. V. 26. P. 1182-1190.

88. Borjesson G., Sundh I., Tunlid A., Svensson B.H. Methane oxidation in landfill cover soils, as revealed by potential oxidation measurements and phospholipids fatty acid analyses // Soil Biol. Biochem. 1998a. V. 30. P. 1423-1433.

89. Borjesson G., Sundh I., Tunlid A., Frostegard A., Svensson B.H. Microbial oxidation of CH4 at high partial pressures in an organic landfill cover soil under different moisture regimes // FEMS Microbiol. Ecol. 1998b. V. 26. P. 207-217.

90. Borjensson G., Chanton J., Svensson B.H. Methane oxidation in two Swedish landfill covers measured with carbon-13 to carbon-12 isotope ratios // J Environ. Qual. 2001. V. 30. P. 369-376.

91. Borjesson G. Inhibition of methane oxidation by volatile sulfur compounds (CH3SH and CS2) in landfill cover soils // Waste Manage. Res. 2001. V. 19. P. 314-319.

92. Borjesson G, Sund I, Svensson B. Microbial oxidation of CH4 at different temperatures in landfill cover soils // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 48. P. 305-312.

93. Bourne D.G., Holmes A. J., Iversen N., Murrell J.C. Fluorescent oligonucleotide rDNA probes for specific detection of methane oxidizing bacteria // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 31. P. 29-38.

94. Bourne D.G., McDonald I.R., Murrell J.C. Comparison ofpmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 3802-3809.

95. Bowman J.P., McCammon S.A., Skerratt J.H. Methylosphaera hansonii gen. nov., sp. nov., a psychrophilic, group I methanotroph from Antarctic marine-salinity, meromictic lakes // Microbiology. 1997. V. 143. P. 1451-1459.

96. Bowman J. The methanotrophs the families Methylococcaceae and Methilocystaceae // In: The Prokaryotes / Dworkin M et al (Eds.). 3rd edition. 2000. An evolving electronic resource for the microbiological community.

97. Bykova S., Boeckx P., Kravchenko I., Galchenko V., Van Cleemput O. Response of CH4 oxidation and methanotrophic diversity to NH4+ and CH4 mixing ratios // Biol. Fertil. Soils. 2007. V. 43. P. 341-348.

98. Cai Z. and Yan X. Kinetic model for methane oxidation by paddy soil as affected by temperature, moisture and N addition// Soil Biol. Biochem. 1999. V. 31. P. 715-725.

99. Chan A.S.K. and Parkin T.B. Evaluation of potential inhibitors of methanogenesis and methane oxidation in a landfill cover soil // Soil Biol. Biochem. 2000. V. 32. P. 1581-1590.

100. Chanton J.P., Rutkowski C.M., Mosher B. Quantifying methane oxidation from landfills using stable isotope analysis of downwind plumes // Environ. Sci. Technol. 1999. V. 33. P. 3755-3760.

101. Chanton J. and Liptay K. Seasonal variations in methane oxidation in a landfill cover soil as determined by an in situ stable isotope technique // Global Biogeochemical Cycles. 2000. V. 14(1). P. 51-60.

102. Chen A.C., Ueda К., Sekiguchi Y., Ohashi A., Harada H. Molecular detection and direct enumeration of methanogenic Archaea and methanotrophic Bacteria in domestic solid waste landfill soils // Biotech. Lett. 2003. V. 25. P. 1563-1569.

103. Chiemchaisri W., Visvanathan C., Wu J. S. Effects of trace volatile organic compounds on methane oxidation // Braz. Arch, of Biol. Tech. 2001. V. 44(2). P. 135-140.

104. Christophersen M., Linderad L., Jensen P.E., Kjeldsen P. Methane oxidation at low temperatures in soil exposed to landfill gas // J Envirol. Qual. 2000. V. 29. P. 1989-1997.

105. Christophersen M., Kjeldsen P., Hoist H., Chanton J. Lateral gas transport in soil adjacent to an old landfill: factors governing emission and methane oxidation // Waste Manage. Res. 2001. V. 19. P. 126-143.

106. Czepiel P.M., Mosher В., Crill P.M., Harriss R.C. Quantifying the effect of oxidation on landfill methane emissions // J. Geophys. Res. 1996. V. 101. P. 16,721-16,729.

107. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W., Groflkopf R., Zhou J., Tiedje J.M. Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands // Science. 1998. V. 282. P. 281-284.

108. DeLong E.F., Taylor L.T., Marsh T.L., Preston C.M. Visualization and enumeration of marine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5554-5563.

109. De Visscher A., Thomas D., Boeckx P., Van Cleemput 0. Methane oxidation in simulated landfill cover soil environments // Environ. Sci. Tech. 1999. V. 33(11). P. 1854-1859.

110. De Vissher A., Schippers M., Van Cleemput 0. Short-term kinetic response of enhanced methane oxidation in landfill cover soils to environmental factors // Biol. Fertil. Soils 2001. V. 33. P.231-237.

111. Dunfield P.F., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Yu.A., Dedysh S.N. Methylocella silvestris sp. nov., a novel methane-oxidizing bacterium isolated from an acidic forest cambisol // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1231-1239.

112. Einola J-K.M., Kettunen R.H., Rintala J.A. Responses of methane oxidation to temperature and water content in cover soil of a boreal landfill // Soil Biol. Biochem. 2007. V. 39. P. 11561164.

113. Eller G., Stubner S., Frenzel P. Group-specific 16S rRNA targeted probes for the detection of type I and type II methanotrophs by fluorescent in situ hybridization // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 198. P. 91-97.

114. Epp M.A. and Chanton J.P. Rhizospheric methane oxidation determined via the methyl fluoride inhibition technique // J. Geophys. Res. 1993. V. 98. P. 18,413-18,422.

115. Escoffer S., LeMer J., Roger P.A. Enumeration of methanotrophic bacteria in ricefield soils by plating and MPN techniques: a critical approach // Eu. J. Soil Biol. 1997. V. 33. P. 41-51.

116. Fjellbirkeland A., Torsvik V., 0vreas L. Methanotrophic diversity in an agricultural soil as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis profiles of pmoA, mxaF and 16S rDNA sequences // Antonie van Leeuwenhoek. 2001. V. 79. P. 209-217.

117. Frenzel P. and Karofeld E. CH4 emission from a hollow-ridge complex in a raised bog: The role of CH4 production and oxidation // Biogeochemistry. 2000. V. 51. P. 91-112.

118. GalchenkoV.F., Lein A., Ivanov M. Biological Sinks of methane // In: Exchange of trace gases between terrestrial ecosystems and the atmosphere / M.O. Andreae and D.S. Schimel (Eds.). John Wiley & Sons Ltd. 1989. P. 59-71.

119. Gebert J., Groengroeft A., Miehlich G. Kinetics of microbial landfill methane oxidation in biofilters // Waste Manage. 2003. V. 23. P. 609-619.

120. Gebert J., Grongrofit A., Schloter M., Gattinger A. Community structure in a methanotroph biofilter as revealed by phospholipids fatty acid analysis // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 240. P. 61-68.

121. Graham D.W., Chaudhary J.A., Hanson R.S., Arnold R.G. Factors affecting competition between type I and type II methanotrophs in two-organism, continuous-flow reactors // Microbial Ecol. 1993. V. 25. P. 1-17.

122. Gulledge J., Ahmad A., Steudler P.A., Pomerantz W.J., Cavanaugh C.M. Family- and genus-level 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for ecological studies of methanotrophic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4726-4733.

123. Hahn D. Manual for in situ analysis of microbial populations // In: Workshop on Sediments and Biofilms. EAWAG, Kastanienbaum, Switzerland, 10-14 September 2001.

124. Hanson R.S and Hanson Т.Е. Methanotrophic bacteria // Microbiol. Rew. 1996. V. 60. P. 439-471.

125. Henckel Т., Jackel U., Schnell S., Conrad R. Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil that oxidize atmospheric methane // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P.1801-1808.

126. Heuer H., Wieland G., Schonfeld J., Schonwalder A., Gomes N.C.M., Smalla K. Bacterial community profiling using DGGE or TGGE analysis // Environ. Mol. Microbiol.: Protocols and Applications. 2001. P. 177-190.

127. Heyer J., Galchenko V.F., Dunfield P.F. Molecular phylogeny of type II methane-oxidizing bacteria isolated from various environments // Microbiology. 2002. V. 148. P. 2831-2846.

128. Hilger H.A., Liehr S.K., Barlaz M. A. Exopolysaccharide control of methane oxidation in landfill cover soil // J. Environ. Engineer. 1999. V. 125(12). P. 1113-1123.

129. Hilger H.A., Wollum A.G., Barlaz M.A. Landfill methane oxidation response to vegetation, fertilization, and liming // J. Environ. Qual. 2000a. V. 29. P. 324-334.

130. Hilger H.A., Cranford D.F., Barlaz M.A. Methane oxidation and microbial exopolymer production in landfill cover soil // Soil Biol. Biochem. 2000b. V. 32. P. 457-467.

131. Hilger H. and Humer M. Biotic landfill cover treatments for mitigating methane emissions // Environ. Monitor. Assessment. 2003. V. 84. P. 71-84.

132. Holmes A.J., Costello A., Lindstrom M.E., Murrell J.C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionary related // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 132. P. 203-208.

133. Humer M. and Lechner P. Alternative approach to the elimination of greenhouse gases from old landfills // Waste Manage. Res. 1999. V. 17. P. 443-452.

134. Ivanov M.V. and Lein A. Yu. Fractionation of stable isotopes of carbon and sulfur during biological processes in the Black Sea // In: Past and present water column anoxia / L.N. Neretin (Ed.). Springer. 2006. P. 373-417.

135. Jackel U., Thummes K., Kampfer P. Thermophilic methane production and oxidation in compost // FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V. 52. P. 175-184.

136. Jones H.A. and Nedwell D.B. Methane emission and methane oxidation in landfill cover soil //FEMS Microbiol. Ecol. 1993. V. 102. P. 185-195.

137. Ketttunen R.H., Einola J-K.M., Rintala J.A.A. Landfill methane oxidation in organic soil columns at low temperature // Water, Air, and Soil Pollution. 2006. V. 177. P. 313-334.

138. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Yu.A. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes // Current Microbiology. 1997. V. 35. P. 257-261.

139. Kightley D., Nedwell D.B., Cooper M. Capacity for methane oxidation in landfill cover soils measured in laboratory-scale soil microcosms // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 592-601.

140. King G.M. and Adamsen A.P.S. Effects of temperature on methane consumption in a forest soil and in pure culture of the methanotroph Methylomonas rubra И Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58.P. 2758-2763.

141. Kolb S., Knief G., Stubner S., Conrad R. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 24232429.

142. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // In: Nucleic techniques in bacterial systematics / E. Stackebrandt and M. Goodfellow (Eds.). John Wiley & Sons Ltd., Chichester, United Kindom. 1991. P. 115-175.

143. Luton P.E., Wayne .M., Sharp R.J., Riley P.W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill // Microbiology. 2002. V. 148. P.3521-3530.

144. Marchiol L., Mori A., Leita L., Zerbi G. Gas Exchanges in soybean as affected by landfill biogas atmosphere // J. Environ. Qual. 1999. V. 28. P. 289-293.

145. Maurice C., Ettala M., Lagerkvist A. Effects of leachate irrigation on landfill vegetation and subsequent methane emissions // Water, Air, and Soil Pollution. 1999. V. 113. P. 203-216.

146. McDonald I.R. and Murrel J.C. The particulate methane monooxygenase gene pmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 156. P. 205-210.

147. Могу К., Sparling R., Hatsu M., Takamizawa K. Quantification and diversity of the archaeal community in a landfill site // Can. J. Microbiol. 2003. V. 49. P. 28-36.

148. Murrell J.C., McDonald I.R., Bourne D.G. Molecular methods for the study of methanotroph ecology // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 103-114.

149. Murrell J.C., Gilbert В., McDonald I.R. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase // Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 325-332.

150. Muyzer G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems // Current Opinion in Microbiology. 1999. V. 2. P. 317-322.

151. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V.K., Lebedev V.S., Lifshits A.B. Microbiological processes in landfills // Wat. Sci. Tech. 1993a. V. 27(2). P. 243-252.

152. Nozhevnikova A.N., Lifshits A.B., Lebedev V.S., Zavarzin G.A. Emission of methane into the atmosphere from landfills in the former USSR // Chemosphere. 1993b. V. 26(1-4). P. 401417.

153. Nozhevnikova A.N. and Lebedev V.S. Burial sites of municipal garbage as a source of atmospheric methane //J. Ecol. Chem. 1995. № 4. P. 48-58.

154. Nozhevnikova A.N., Lebedev V.S., Ivanov D.V., Nekrasova V.K. Formation of methane oxidizing microbial filter in landfill // In: Proc. of Int. FAWQ Symposium on anaerobic digestion of solid waste. Barselona, Spaine, 15-17 June 1999. P. 216-219.

155. Nozhevnikova A., Glagolev M., Nekrasova V., Einola J., Sormunen K., Rintala J. The analysis of methods for measurement of methane oxidation in landfills // Wat. Sci. Tech. 2003a. V. 48(4). P. 45-52.

156. Oda Ya., Slagman S-J., Meijer W.G., Forney L.J., Gottschal J.C. Influence of growth rate and starvation on fluorescent in situ hybridization of Rhodopseudomonas palustris II FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 32. P. 205-213.

157. Panikov N.S., and Dedysh S.N. Cold season CH4 and CO2 emission from boreal peat bogs (West Siberia): winter fluxes and thaw activation dynamics // Global Biogeochemical Cycles. 2000. V. 14(4). P. 1071-1080.

158. Pernthaler A., Pernthaler J., Amann R. Fluorescence in situ hybridization and catalyzed reporter deposition for the identification of marine bacteria // Appl. Environ Microbiol. 2002a. V. 68. P. 3094-3101.

159. Pichler M. and Kogel-Knabner I. Chemolytic analysis of organic matter during aerobic andanaerobic treatment of municipal solid waste // J. Environ. Qual. 2000. V. 29. P. 1337-1344.

160. Pohland F.G. and Kim J.C. Microbially mediated attenuation potential of landfill bioreactor systems // Wat. Sci. Tech. 2000. V. 41(3). P. 247-254.

161. Rudd J.W.M., Furutani A., Flett R.J., Hamilton R.D. Factors controlling methane oxidation in shield lakes: The role of nitrogen fixation and oxygen concentration // Limnology Oceanography. 1976. V. 21. P. 357-364.

162. Schafer H. and Muyzer G. Denaturing gradient gel electrophoresis in marine microbial ecology // Methods in microbiology. 2001. V. 30. P. 425-468.

163. Schuetz C., Bogner J., Chanton J., Blake D., Morcet M., Kjeldsen P. Comparative oxidation and net emission of methane and selected non-methane organic compounds in landfill cover soils //Environ. Sci. Technol. 2003. V. 37(22). P. 5150-5158.

164. Steinkamp R., Zimmer W., Papen H. Improved method for detection of methanotrophic bacteria in forest soils by PCR // Current Microbiology. 2001. V. 42. P. 316-322.

165. Streese J. and Stegmann R. Microbial oxidation of methane from old landfills in biofilters // Waste Manage. 2003. V. 23. P. 573-580.

166. Svenning M.M., Wartiainen I., Hestnes A.G., Binnerup S.J. Isolation of methane oxidizing bacteria from soil by use of a soil substrate membrane system // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 44. P. 347-354.

167. Trotsenko Yu.A. and Khmelenina V.N. Biology of extremophilic and extremotolerant methanotrophs //Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 123-131.

168. Tsien H.C., Bratina B.J., Tsuji K., Hanson R.S. Use of oligodeoxynucleotide signature probes for identification of physiological groups of methylotrophic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 2858-2865.

169. Tsubota J., Eshinimaev B.T., Khmelenina V.N., Trotsenko Yu.A. Methylothermus thermalis gen. nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1877-1884.

170. Uz I., Rasche M.E., Townsend Т., Ogram A.V., Lindner A.S. Characterization of methanogenic and methanotrophic assemblages in landfill samples // The Royal Society Biology Letters. 2003. V. 270. P. 202-205.

171. Visvanathan C., Pokhrel D., Cheimchaisri W., Hettiaratchi J.P.A., Wu J.S. Methanotrophic activities in tropical landfill cover soils: effects of temperature, moisture content and methane concentration // Waste Manage. Res. 1999. V. 17. P. 313-323.

172. Ward R.S., Williams G.M., Hills C.C. Changes in major and trace components of landfill gas during subsurface migration // Waste Manage. Res. 1996. V. 14. P. 243-261.

173. Wartiainen I., Hestnes A.G., McDonald I.R., Svenning M.M. Methylobacter tundripaludum sp. nov., a methane-oxidizing bacterium from Arctic wetland soil on the Svalbard islands, Norway (78°N) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 109-113.

174. Whalen S.C., Reeburgh W.S., Sandbeck K.A. Rapid methane oxidation in a landfill cover soil // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 3405-3411.

175. Whittenbury R., Phillips K.S., Wilkinson J.F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria// J. General Microbiology. 1970a. V. 61(2). P. 205-218 with 3 plates.

176. Whittenbury R., Davies S.L., Davey J.F. Exospores and cysts formed by methane-utilizing bacteria // J. General Microbiology. 1970b. V. 61(2). P. 219-226 with 5 plates.

177. Whittenbury R. and Dalton H. The methylotrophic bacteria // In: The Prokaryotes. A. Handbook on Habits, Isolation, and Identification of bacteria / New York.: Springer-Verlag. 1981. V. I.

178. Wilshusen J.H., Hettiaratchi J.P.A., De Visscher A., Saint-Fort R. Methane oxidation and formation of EPS in compost: effect of oxygen concentration // Environ. Pollution. 2004a. V. 129. P. 305-314.

179. Wilshusen J.H., Hettiaratchi J.P.A., Stein V.B. Long-term behavior of passively aerated compost methanotrophic biofilter columns // Waste Manage. 2004b. V. 24. P. 643-653.

180. Zavarzin G.A. and Nozhevnikova A.N. Landfills and waste deposits producing greenhouse gases // Current Opinion in Biotechnology. 1993. V. 4. P. 356-362.

Информация о работе

Каллистова, Анна Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы