Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ацидофильные метанотрофные бактерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ацидофильные метанотрофные бактерии"

На правах рукописи

ДЕДЫШ Светлана Ннколаевна АЦИДОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор JI.B. Калакуцкий

Доктор биологических наук, профессор B.C. Прасолов

Доктор биологических наук, профессор М.М. Умаров

Ведущая организация - кафедра микробиологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится « » 2005 г. в 1400 ч. на заседании диссертационного

совета Д.002.224.02 при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан « » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

JI.E. Никитин

(eié

www

Актуальность проблемы

Метан является одним из наиболее активных парниковых газов, быстрые темпы накопления которого в атмосфере Земли (до 1% в год) (Cicerone, Oremland, 1988; IPCC, 2001) вызывают обоснованную тревогу мирового сообщества (Рамочная конвенция ООН об изменении климата, 1992). В глобальном бюджете атмосферного СН4 выделяют два крупнейших его источника - естественные болота и заболоченные земли, а также рисовники (Matthews, Fung, 1987; Aselmann, Crut7en, 1989; Hein et al., 1997) Значимость каждого из этих источников варьирует в различных географических регионах. Основные площади рисовников сосредоточены в юго-восточной Азии, низовые болота расположены по большей части в тропических регионах, тогда как северные широты (выше 60°N) заняты массивами верховых и мезотрофных болот. Вклад этих северных болот в бюджет атмосферного СН4 особенно значителен для России, стран Скандинавии, Канады и севера США (Matthews, Fung, 1987; Hein et al., 1997; Panikov, 1999; Заварзин, Васильева, 1999) Наиболее обширные массивы болот - 161 млн га - расположены в России, причем большая их часть сосредоточена в Западной Сибири, где они составляют до 80% территории (Вомперский и др., 1999; Land resources of Russia , 2002). Полевые измерения величин эмиссии метана из западносибирских болот показали, что они достаточно высоки и варьируют от 0.5 до 40 мг СН4-С ч'1 м"2 (Паников и др. 1993, 1995, 1997), причем эмиссия метана из нейтральных низовых болот незначительна, а максимальные ее значения регистрируются в верховых и мезотрофных кислых сфагновых болотах.

Метан, поступающий из северных болот в атмосферу, имеет биогенное происхождение, о чем свидетельствует его легкий изотопный состав (Quay et al, 1988) Продукция биогенного метана обусловлена деятельностью двух специфических групп прокариотных организмов - метаногенных и метанотрофных бактерий (Заварзин, 1979, 1984), а эмиссия СЙЦ из болот в атмосферу есть результат дисбаланса в их функционировании. Однако природа как метаногенных, так и метанотрофных организмов, осуществляющих реакции цикла метана в сфагновых болотах, долгое время оставалась неизвестной. Причиной тому являлись специфические характеристики этих болот как среды обитания микроорганизмов, прежде всего, их высокая ммдатнст^.^Д^^^1 pH торфяной

I ВИМИОТЕКЛ

2&U6

влаги в верховых сфагновых болотах лежат в диапазоне 3-4.5, а в мезотрофных болотах - в диапазоне 4-5.5. Помимо этого, для сфагновых болот характерны низкая буферность воды, низкое содержание минеральных солей (< 50 мг/л) и преобладание пониженных температур. Совокупность этих характеристик не позволяла соотнести процессы биогенного образования и потребления СН4 в этой экосистеме с каким-либо из ранее известных микроорганизмов цикла метана

Определенный прогресс в исследовании закономерностей метаногенеза в сфагновых болотах и идентификации микроорганизмов - агентов этого процесса был достигнут лишь в последние годы (Horn et al., 2003; Galand et al., 2003; Sizova et al., 2003; Kotsyurbenko et al., 2004), однако чистые культуры ацидофильных метаногенов не описаны и поныне. Настоящая же работа была посвящена исследованию метанотрофных бактерий, слагающих «бактериальный газовый фильтр», который перехватывает образованный в анаэробных слоях сфагновых болот СН4 на его пути в атмосферу. Именно эффективность работы метанокисляюще1 о микробного сообщества является тем естественным механизмом, который контролирует величину эмиссии метана из северных болот (Panikov et al., 2001). В противоположность достаточно хорошо изученным метанотрофным сообществам низовых болот (Намсараев, 1973) и рисовников (Henckel et al., 1999; Frenzel, 2000; Eller, Frenzel, 2001), представленных известными метанотрофами I и II типов, состав этих сообществ в сфагновых болотах долгое время оставался «белым пятном» в экологии метанотрофных бактерий. Актуальность обнаружения и исследования этих организмов была продиктована самой глобальностью распространения кислых торфяных болот, являющихся доминирующими наземными экосистемами бореальной зоны Северного полушария и одним из наиболее характерных для России ландшафтов.

Состояние вопроса

Высокая активность процессов потребления метана в сфагновых болотах была продемонстрирована многими исследователями (Yavitt et al., 1988, 1990; Panikov et al., 1993; Dunfield et al., 1993; Sundh et al., 1994, 1995; Nedwell, Watson, 1995; Krumholz et al., 1995; McDonald et al., 1996). Полученные ими данные свидетельствовали о функционировании в болотах активно окисляющего метан

микробного сообщества, хорошо адаптированного к существованию в кислых и холодных условиях Свойства же известных к тому времени метанотрофных микроорганизмов не позволяли связать наблюдаемый процесс окисления метана в кислых болотах с какими-либо из их изученных представителей.

Метанотрофные бактерии (МБ) составляют уникальную группу микроорганизмов, способных использовать метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Ключевой особенностью метанотрофов является обладание метанмонооксигеназой (ММО) - ферментом, катализирующим начальный этап окисления СН4 до СН3ОН. По совокупности морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических характеристик метанотрофные бактерии разделены на две основные группы, тип I и тип II, которые принадлежат к классам Gamma- и Alphaproteobacteria, соответственно (Hanson, Hanson, 1986; Гальченко, 2002). Ко времени начала поисков микроорганизмов, способных окислять метан в холодных и кислых сфагновых болотах (середина 90-х годов) перечень узаконенных таксонов метанотрофных бактерий насчитывал 8 родов Ни для одного из них не была продемонстрирована способность к росту при pH ниже 5.5. Психрофильные метанотрофы, способные развиваться в диапазоне температур Ol 3 до 20°С к тому времени были уже выделены (Омельченко и др., 1992, 1996; Bowman et al., 1997), но они имели оптимум развития в нейтральной области pH и также не были способны расти в кислых средах. Попытки же выделения метанотрофных бактерий из торфов кислых болот на традиционно используемых для культивирования этой группы микроорганизмов средах (с содержанием минеральных солей 1.5-3 г/л, высокой буферной емкостью и pH 6.0-7.5) не имели успеха.

Несостоятельность традиционных культуральных подходов для выявления метанотрофов сфагновых болот побудила ряд ученых обратиться к косвенным методам исследования, в частности, анализу экстрагированных из торфа ДНК и жирных кислот (ЖК). Анализ ПЦР-амплифицированных из «торфяной» ДНК фрагментов филогенетических и функциональных генов метанотрофов выявил наличие неизвестных ранее метанотрофов II типа, филогенетически близких к роду Methylocystis, что дало основания для предположения о существовании неизвестных ацидофильных метанотрофов в пределах Alphaproteobacteria

(McDonald et al., 1996; McDonald, Muirell, 1997). Анализ экстрагированных из сфагнового торфа ЖК подтвердил высокое содержание кислот 16:1<о8с и 18:1со8с, являющихся «индикаторными» ЖК метанотрофов I и II типов, соответственно Суммарное содержание этих кислот хорошо кореллировало с величиной потенциальной метанотрофной активности, при этом содержание 181м8с на порядок и более превышало содержание 16:1ш8с (Krumholz et al., 1995; Sundh et al., 1995). Итак, было установлено, что сфагновый торф колонизирован метанотрофными бактериями, и бактерии эти отличны от коллекционных культур. Однако в отсутствие изолятов без ответа оставался вопрос о том, являются ли обнаруженные косвенными методами метанотрофы истинно ацидофильными организмами или всего лишь ацидотолерантными формами известных метанотрофов. Таким образом, непременным условием составления картины функционирования метанпотребляющего фильтра кислых сфагновых болот стало получение культур населяющих болота метанотрофных бактерий и исследование их биологии и экологии.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось выявление и изучение метанотрофных бактерий, слагающих метанокисляющий фильтр северных кислых ультрапресных болот и снижающих эмиссию парникового газа СН4 в атмосферу.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи' 1 Исследовать закономерности процессов окисления СН4 образцами кислых торфов для выявления физиологического оптимума населяющих их метанотрофных бактерий.

2. Разработать адекватные культуральные подходы для выделения ацидофильных метанотрофных микробных сообществ и изучить их состав.

3. Выделить чистые культуры ацидофильных метанотрофных бактерий из сфагновых болот различного географического расположения, исследовать особенности их биологии и установить их филогенетическую принадлежность и таксономический статус.

4. Осуществить сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ключевых ферментов ацидофильных метанотрофов - растворимой и мембранной

ММО, метанолдегидрогеназы и нитрогеназы - с таковыми у ранее известных метанотрофов.

5. Разработать молекулярные подходы, позволяющие идентифицировать и определять численность ацидофильных метанотрофных бактерий в природных средах.

6. Определить состав и численность популяций метанотрофных бактерий, слагающих метанотрофный фильтр сфагновых болот различного географического расположения, и оценить вертикальную структуру этого фильтра

Научная новизна и значимость работы.

Установлена природа микробного блока, осуществляющего естественный контроль над эмиссией метана из северных болот, и выявлены микроорганизмы -агенты процессов окисления метана в кислых, холодных и ультрапресных природных экосистемах.

Описана неизвестная ранее группа ацидофильных метанотрофных бактерий, составляющих филогенетически обособленную ветвь метанотрофных организмов в пределах класса Alphaproteobacteria. Установлен и узаконен таксономический статус представителей этой группы - двух новых родов, Methylocella и Methylocapsa, и четырех новых видов метанотрофных бактерий, Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila. Типовые штаммы этих новых бактерий депозитированы в международных коллекциях микроорганизмов - АТСС, DSMZ и NCIMB.

Исследования ацидофильных МБ позволили существенно расширить знания о биологии метанотрофных бактерий, в частности, их физиологии, ультраструктуре клеток, хемотаксономических и генотипических характеристиках.

Впервые для количественных исследований популяций метанотрофов в природном местообитании применен метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH). Идентифицированы основные микробные популяции, слагающие метанокисляющий фильтр сфагновых болот, а также определена их популяционная численность в болотах бореальной зоны и зоны тундры России.

Практическая ценность.

Разработаны концептуально-новые приемы выделения микроорганизмов из ультрапресных местообитаний, позволившие изолировать представителей функционально важной, но некультивируемой ранее группы ацидофильных метанотрофных бактерий.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, а также ртоА, ттоХ, mxaF, nifH и nifD генов ацидофильных метанотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Разработан и апробирован наиболее полный из существующих на сегодняшний день набор 16S рРНК-специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для дифференцированной детекции метанотрофных бактерий. Он включает зонды различного уровня специфичности: от видо-специфичных зондов для ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila, до родо- и группо-специфичных зондов для известных ранее МБ I и II типов. Разработана также модификация метода FISH для анализа образцов торфа, применимая для оценки популяционной плотности не только метанотрофных, но и любых других групп бактерий.

Получена коллекция изолятов ацидофильных МБ, обладающих растворимой формой ММО и, в силу этого, имеющих хороший потенциал для применения в биотехнологии очистки кислых природных сред от загрязнения.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. 98-th Annual Meeting of American Society for Microbiology, Atlanta, USA, 1998

2. Kongress der VAAM "Mikrobiologie 2000", München, Germany, 2000

3. Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы- К 75-летию со дня рождения академика РАН ЕН Кондратьевой» Москва, МГУ им М.В. Ломоносова, 2000.

4. 9-th International Symposium on Microbial Ecology, Amsterdam, the Netherlands, 2001.

5. International Workshop "Microbial responses to environmental challenges", Marburg, Germany, 2001.

6. Gordon Research Conference "Molecular basis of microbial one-carbon metabolism", Connecticut College, USA, 2002.

7. 103-rd Annual Meeting of American Society for Microbiology, Washington, USA, 2003.

8. FEMS Congress of European microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003;

9. Расширенном заседании Ученого совета ИНМИ РАН, посвященном 70-летию со дня рождения академика РАН Г.А. Заварзина "Новые микроорганизмы, новые типы метаболизма", 2003.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 30 печатных работах: 17 экспериментальных статьях, 2 обзорах и 11 тезисах.

Ci руктура диссертации

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 235 страницах, включая 20 таблиц, 49 рисунков и списка литературы из 294 наименований, т них 54- на русском, 2 - на немецком и 238 - на английском языке.

Место проведения работы

Основная часть работы проводилась в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН: с 1991 по 2001 г. в лаборатории почвенной микробиологии и биокинетики под руководством проф. Н.С. Паникова, а с 2002 г. - в лаборатории реликтовых микробных сообществ под руководством академика РАН профессора Г А Заварзина. Молекулярный компонент исследований был выполнен соискателем в Центре Микробной Экологии Мичиганского i осударствепного Университета, лаборатории проф. J.M. Tiedje (Ист-Лансинг, США), а также лаборатории др. W. Liesack в Макс-Планк-Институтс микробиоло1 ии суши (Марбург, Германия).

Образцы торфа болот различного географического расположения, использованные в работе, были предоставлены проф. Паниковым Н.С. и акад. Заварзиным Г.А. (ИНМИ РАН), а также др. Heyer J. и проф. Frenzel P. (MPI, Марбург). В ИНМИ РАН проводились исследования метанокисляющей активности образцов торфяных болот и ее зависимости от различных факторов, а также выделение культур и изучение биологии ацидофильных МБ. Исследования кинетики окисления метана в торфе и анализ ростовых характеристик сообществ и чистых культур болотных метанотрофов проводились под руководством проф. Паникова Н.С. и с участием Дорофеева А.Г. Анализ ферментов углеродного и азотного метаболизма ацидофильных метанотрофов осуществлялся Хмелениной В.Н. в лаборатории проф. Троценко Ю.А. (ИБФМ РАН, Пущино). Исследования ультратонкого строения клеток ацидофильных МБ были проведены совместно с Сузиной Н.Е. (ИБФМ РАН, Пущино) и Кострикиной H.A. (ИНМИ РАН). В описании ацидофильных метанотрофов болот тундры участвовали также Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю. и Белова С.Э. (ИНМИ РАН). Молекулярный анализ состава ацидофильных метанотрофных сообществ и определение филогенетического положения изолятов ацидофильных МБ проводились в Центре Микробной Экологии Мичиганского Университета. Разработка и применение^ рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов для дифференцированной детекции и определения популяционной численности МБ in situ осуществлялись в Марбургском Макс-Планк-Институте при участии Derakshani M. и Dunfield P.F. Там же проводился анализ функциональных генов, кодирующих растворимую и мембранную ММО, метанолдегидрогеназу и нитрогеназу ацидофильных МБ.

Автор выражает глубокую признательность всем упомянутым участникам данной работы.

Основные защищаемые положения диссертации.

1 Окисление метана в сфагновых болотах осуществляется неизвестной ранее, специализированной группой ацидофильных метанотрофных бактерий, хорошо адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях.

2 Ацидофильные МБ представляют филогенетически обособленную группу бактерий в пределах класса Alphaproteobacteria, которая находится лишь в отдаленном родстве с представителями ранее известных метанотрофов II типа.

3. Культуральные подходы и молекулярные методы детекции, разработанные ранее для нейтрофильных метнотрофов, не могут быть использованы или имеют лишь ограниченное применение для исследования ацидофильных МБ. Единственным строго количественным из доступных на настоящий момент методов исследования популяционной экологии ацидофильных МБ является метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными зондами.

4. Ареал распространения ацидофильных МБ довольно широк и включает сфагновые болота бореальной и тундровой зон, а также кислые лесные почвы бореальной зоны.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования

Оценку активности потребления метана в сфагновых болотах проводили на примере 8 болотных массивов, расположенных на территории Московской, Тверской и Томской областей, и представляющих основные типы болот севера Европейской части России и Западной Сибири (Табл. 1) Определение скорости потребления метана образцами торфа проводили путем введения СН4 в воздушную фазу инкубационных флаконов и прослеживания динамики его остаточного содержания на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Оценку небиологического связывания СН4 осуществляли в контрольных опытах с инкубацией образцов в присутствии ацетилена (1 об. %) как ингибитора активности метанотрофов.

Накопительные культуры болотных метанотрофных микроорганизмов получали путем инокулирования торфом жидкой минеральной среды М2 (Dedysh et al, 1998), содержащей (мг/л диет воды) KN03, 200; КН2Р04, 40; MgS04* 7Н20, 25; СаС12*2Н20, 5 и 1 мл/л раствора микроэлементов (Гальченко, 2002), с последующей инкубацией под 10-15% метана при 20°С. Эту же минеральную среду без KN03 использовали для получения накопительных культур азотфиксирующих

метанотрофов. Варьирование кислотности среды в диапазоне рН 4.0-6 0 осуществляли путем добавления 0.1М раствора Н3Р04.

Культивирование выделенных метанотрофных сообществ проводили на качалке в герметично закрытых сывороточных флаконах объемом 500 мл с объемом среды 100 мл и содержанием 15-20% СН4 в газовой фазе. Для определения оптимума рН метанотрофных сообществ исследовали кинетику их роста в диапазоне рН 3 5-8.5 на средах с одинаковой ионной силой, которые приготовляли путем смешивания 0.1М растворов Н3Р04, КН2Р04, К2НР04 и К3Р04 в различных пропорциях

Для изоляции чистых культур метанотрофных бактерий использовали два подхода: а) рассев метанотрофных сообществ на кислую (рН 5 0-5.5) агаризованную среду М2, и б) многократно повторяющиеся предельные разведения в жидкой безазотистой среде М2. Изучение морфологических, физиологических, хемотаксономических и генотипических свойств чистых культур болотных изолятов проводили с помощью стандартных методик, используемых в микробиологической практике. Описание новых таксонов метанотрофных бактерий осуществляли в соответствии с правилами, предъявляемыми Международным комитетом по систематике бактерий к описанию новых таксонов микроорганиз мов.

Для экстракции ДНК из сообществ и чистых культур ацидофильных метанотрофов использовали модификацию стандартного метода, основанного на применении додецил сульфата натрия в качестве лизируюшего агента, с дополнительными этапами разрушения агрегатов клеток путем растирания со стерильным песком и трех быстро чередующихся циклов замораживания (-70°С) и оттаивания (+70°С). В ходе работы производили ПЦР-амп.тификацию фрагментов следующих филогенетических и функциональных генов метанотрофов: а) гена, кодирующего 16S рРНК (условия реакции и праймеры, предложенные Weisburg et al. 1991); б) ртоА, кодирующего полипептид, несущий активный ценгр мембранной ММО (Holmes et al., 1995); в) ттоХ, кодирующего а-субчастицу растворимой ММО (McDonald et al., 1995; Auman et al., 2000); r) mxaF, кодирующего метанолдегидрогеназу (McDonald, Murrcll, 1997); д) ni/H, кодирующего редуктазный компонент нитрогеназного комплекса (Auman et al., 2001; Булыгина и др., 2002) и е) nifD, кодирующего а-субчастицу нитрогеназы

(Dedysh et al., 2004). ПЦР реакции проводили на термоциклере РЕ GeneAmp PCR System 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Для клонирования ПЦР-амшшфицированных фрагментов использовали ТА cloning kit (Invitrogen). Отбор рекомбинантных клонов проводили путем прямой амплификации клонированных фрагментов с использованием праймеров, специфичных для вектора pCR II (Zhou et al., 1997). В случае исследования ДНК сообществ, полученные библиотеки клонов подвергались рестрикционному анализу с использованием тетрамерных эндонуклеаз Mspl, Rsal, Hhal и НаеIII для выявления групп клонов, несущих одинаковые фрагменты ДНК. Нуклеотидные последовательности репрезентативных клонов или амплифицированных фрагментов ДНК определяли на секвенаторах ABI 373А и ABI 377А (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Анализ полученных нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей, а также построение филогенетических дендрограмм производили с использованием программного пакета ARB (разработан О. Strunk и W. Ludwig, Технический Университет, Мюнхен). Статистическая достоверность полученных дендрограмм рассчитывалась с использованием программного пакета Phylip с помощью "bootstrap''-анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Для поиска уникальных последовательностей в 16S рРНК ацидофильных метанотрофов и создания олигонуклеотидных зондов для их специфической детекции использовали программный пакет ARB. Проверку специфичности зондов осуществляли путем их тестирования в базе данных Ribosomal Database Project. Синтез олигонуклеотидных зондов, меченых флуоресцентными красителями СуЗ, Су5 и FLUOS, осуществлялся MVG Biotech (Эберсберг, Германия). Оптимизацию условий гибридизации новых олигонуклеотидных зондов проводили с использованием целевых и контрольных культур бактерий в диапазоне а) температур от 30 до 70°С и б) концентраций формамида в гибридизационном буфере от 0 до 40%. Для фиксации микробных сообществ, чистых культур бактерий и нативных образцов торфа использовали 4% раствор формальдегида Фиксацию образцов торфа предваряла процедура последовательной экстракции из них клеток микроорганизмов. Гибридизацию препаратов фиксированных клеток или торфяных экстрактов с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными

зондами проводили в соответствии с методикой Stahl & Amann (1991) с последующей окраской препаратов универсальным красителем ДНК - DAPI. Помимо зондов, разработанных в настоящем исследовании для детекции ацидофильных МБ, использовали группо-специфичные зонды для детекции метанотрофов I и II типов (зонды М84 + М705 и М-450, соответственно) (Eller et al., 2000). Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Йена, Германия). Определение численности целевых популяций метанотрофов в образцах торфа осуществляли путем учета количества гибридизованных с зондами клеток в 100 полях зрения микроскопа, с последующим расчетом численности соответствующих популяций в 1 г сырого торфа. Общую численность микроорганизмов и общую численность эубактерий в образцах определяли путем аналогичного учета клеток, окрашенных DAPI и гибридизованных с универсальным зондом на эубактерии EUB338 (Amann et al., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Закономерности процессов окисления метана в сфагновых торфах. 1.1. Активность потребления СН4 в северных болотах различных типов и ее распределение по профилю болота. Скорость потребления метана образцами торфа болот различных типов варьировала в диапазоне 0-2.35 мг C-CII4/4 дм3 (Табл. 1). Наибольшая потенциальная метанпотребляющая активность была обнаружена в торфах мезотрофных осоково-сфагновых и некоторых верховых олиготрофных сфагновых болот. Прямой зависимости активности потребления метана от величины pH болотной воды не наблюдалось, хотя максимальная ее величина - 2 35 мг С-СН4/ч дм3 - была зарегистрирована в мезотрофном болоте Приокско-террасного заповедника с относительно высоким pH (5 6-5 8) Однако и образцы торфа ряда кислых верховых болот - Сосвятский Мох, Бакчарское (pH 3 54.5) - также обнаруживали высокую активность потребления СН4 (1.25-1.87 mi С-СН4/ч дм3). Распределение потенциальной метанпотребляющей активности по профилю исследованных болот характеризовалось наличием ярко выраженного максимума в слое торфа, расположенном непосредственно под уровнем фунтовых вод (УГВ) (Табл. 1). Локализация УГВ в болотах являлась основным фактором,

Таблица 1. Активность окисления метана в болотах различных типов

Болото Время отбора проб Тип болота рН УГВ см Максимум метанотр. активности в слое, см V » ш? мг С-СНд/ ч дм3 Кпи цМ СН4

Сосвятский Мох (Тверская обл.) VI. 1992 верховое олиготрофное кустарничково -сфагновое 3.5-4.2 10-15 15-20 1.25 0.95

Киргизное (Томская обл.) VIII. 1992 верховое олиготрофное кустарничково -сфагновое 3.5-4.0 10-15 20-25 0.38 0 59

Цыганово (Томская обл.) VIII1992 верховое олиготрофное кустарничково -сфагновое 3.5 5 2-15 0.40 0.17

Круглое (Томская обл.) VIII. 1992 мезотрофное осоково-сфагновое облесенное 4.0-4.2 0-5 2-15 1.67 0.82

Жуковское (Томская обл.) VIII. 1992 низинное моховое миперотроф-ное 5.5-5.7 0 0-13 0.49 0.84

Болото Приокско-террасного заповедника (Моек обл.) У1993 мезотрофное осоково- нушицево- сфагновое облесенное 5.6-5.8 21 20-25 2.35 1.80

Бакчарское (Томская обл.) VII. 1993 VIII. 1994 верховое осоково-пушицево-сфагновое 4.0-4.4 10-15 0-5 17-23 7-15 1.87 1.35 0.27 1.61

«Снегири» (Московская обл.) XI. 1993 мезотрофное осоково- сфагновое 4 5-5.0 10-15 20-25 0.97 0 52

определяющим характер профильного распределения скоростей окисления СН( В затопленных низинных болотах наиболее активный слой располагался непосредственно у поверхности, тогда как в верховых и мезотрофных болотах он находился под УГВ, на глубине 10-30 см. Потенциальная способность образцов торфа окислять метан прослеживалась во всех исследованных нами болотах до

глубины по меньшей мере 60 см от поверхности, проникая в отдельных случаях до глубин порядка 100-180 см.

1.2. Кинетика окисления метана в сфагновом торфе в зависимости от концентрации СНЦ, рН, температуры и концентрации солей.

Микробиологический характер процессов потребления метана сфагновыми торфами был подтвержден экспериментами с применением ацетилена, известного как специфического ингибитора активности метанотрофов (Prior, Dalton, 1985; Bedard, Knowles, 1989). Введение C2H2 в инкубационные флаконы с торфом полностью подавляло процесс окисления метана.

Для определения ростовых характеристик и выяснения физиологического оптимума болотных метанотрофов была изучена кинетика потребления метана в образцах нативного торфа верхового сфагнового болота Сосвятский Мох (Тверская обл.) Исследование зависимости скорости бактериального потребления СН4 от его концентрации в газовой фазе показало, что окисление метана осуществляют различные популяции метанотрофных микроорганизмов, обладающие высоким (Ksi=0.043 цМ) и низким (Ks2 = 1.8 цМ) сродством к субстрату. Таким образом, механотрофное сообщество сфагновых болот было способно активно функционировать как при низких, так и при высоких концентрациях СН4 Длительная инкубация образца торфа под 10% СН4 инициировала экспоненциальный рост метанотрофных микроорганизмов с удельной скоростью 0.001 ч"', что свидетельствовало о крайне низкой скорости роста болотных метанотрофов in situ.

Дальнейшие эксперименты были направлены на исследование воздействия тех факторов среды, которые определяют специфику верховых сфагновых болот- рН, температуры и концентрации солей в торфяной влаге. Зависимость метанотрофной активности торфа от рН носила характер куполообразной кривой с максимумом при рН 5.0-5.5 (Рис. 1). Достоверное потребление метана прослеживалось при подкислении среды вплоть до рН 3.3. В нейтральной среде активность резко снижалась. Скорость окисления метана нативными образцами торфа с рН 4.2 превышала таковую при рН 7 в 3-4 раза, свидетельствуя об ацидофильной природе населяющих болота МБ. Температура, так же как и рН, весьма значимо влияла на

Скорость потребления метана, мкг С /(чтсг)

60 г

60

К

20°С

40

20

0

0 2 4 6

8

рН

Ю 0 5 10 15 20 25 30

Температура, °С

Рис. 1. Зависимость скорости потребления метана образцами торфа верхового сфагнового болота Сосвятский Мох (Тверская обл.) от температуры и величины рН торфяной влаги.

метанокисляющую активность образцов торфа. Оптимальным оказался диапазон температур от 15 до 20°С. При повышении температуры до 25°С скорость потребления СН4 снижалась в 3 раза. В то же время даже при 10°С регистрировалась, хотя и менее высокая, но значительная скорость потребления метана. Таким образом, метанотрофное сообщество сфагновых болот оказалось представлено психроактивными организмами. Для выяснения степени лимитированности этого сообщества источниками биогенных элементов, в частности доступным азотом, были проведены эксперименты с обогащением торфа нитратами. Вопреки ожиданиям, внесение КЫОэ даже в малых дозах вызывало не стимуляцию, а сильное ингибирующее действие, имеющее пороговый характер и проявляющееся уже при дозах ЮЧОз около 1 мкг/ г торфа.

Данные кинетических исследований позволили сделать вывод, что мстанотрофы сфагновых болот представлены психроактивными и умеренно ацидофильными медленно растущими популяциями, чрезвычайно чувствительными к повышенным концентрациям солей. Стратегия исследования, диктуемая данными проведенного кинетического анализа, сводилась к необходимости разработки новых и отказа от старых сред и условий, традиционно используемых для выделения и культивирования метанотрофных организмов (рН 6.5-7 0. температуры выше 25°С, 1.5-3 г солей/ л среды).

2. Ацидофильные метанотрофные сообщества.

2.1. Новый подход к получению накопительных культур ацидофильных МБ.

Получение накопительных культур метанотрофных организмов из кислых болот было осуществлено путем воспроизведения условий, обеспечивающих наибольшую активность потребления метана сфагновым торфом - инкубации при температуре 20°С и использовании кислых минеральных сред (рН 4-6) с общим содержанием солей, не превышающим 250 мг/л. В целях выделения азотфиксирующих метанотрофов использовали те же среды без источника связанного азота. Результатом явилось успешное выделение накопительных культур метанотрофов из образцов торфа четырех сфагновых болот различного географического расположения - болота Сосвятский Мох Тверской области, а также болот Киргизное, Круглое и Бакчарское Томской области.

2.2. Ростовые характеристики ацидофильных метанотрофных сообществ. Полученные сообщества использовали метан в качестве источника углерода и энергии и устойчиво росли на кислых разбавленных средах в диапазоне рН от 4 до 6. Морфологически, сообщества, полученные при рН 4 и рН 6, не различались и состояли преимущественно из палочковидных клеток, собранных в бесформенные агрегаты. Стехиометрия роста была аналогична таковой у известных метанотрофных бактерий - СН4 : 02 : С02 = 1 : 1.1 : 0.6 с выходом 0.4 г С биомассы/ г С- СН4. Удельная скорость роста сообществ варьировала ог 0.015 до 0.040 ч"1. Рост происходил как в безазотистой среде, гак и при невысоком содержании (до 200 мг /л) источника связанного азота, К>Ю3 или (МН4)2804. Клетки, выращенные на среде с нитратом, свободно и без лаг-фазы переключались на рост в безазотистой среде. Напротив, росту клеток, выросших в режиме азотфиксации и перенесенных на среду с нитратом предшествовала продолжительная (40 ч) лаг-фаза. Таким образом, азотфиксирующий режим роста был более естественным для сообществ сфагновых болот. Определение интенсивности потребления СН4 сообществами при различных значениях рН показало, что максимальные значения - до 0.5 ммоль СН4 /(ч на 1 биомассы) -приходятся на диапазон рН 4.5 - 5.5, в котором наблюдалась и максимальная активность потребления метана нативными образцами торфа. При переходе в более кислую область рН скорость потребления метана сообществами снижалась заметно

слабее, чем при переходе к нейтральным значениям. Тестирование выделенных сообществ на средах с различным содержанием биогенных минеральных элементов подтвердило, что они не растут на средах, содержащих более 1 г солей в литре. Оптимальные условия для роста соответствовали содержанию солей от 25 до 250 мг/л. В целом, экофизиологические свойства этих умеренно ацидофильных сообществ гармонично отвечали характерным особенностям того местообитания, откуда они были выделены.

2.3. Идентификация метаиотрофно1 о компонента сообществ. Идентификация метанотрофных бактерий, входящих в ацидофильные сообщества, была осуществлена пугем ПЦР-амплификации из ДНК этих сообществ фрагментов функциональных генов метанотрофов - ттоХ (кодирующего растворимую ММО) иртоА (кодирующего мембранную ММО).

В реакции с амплификацией ттоХ ПЦР продукты были получены только для трех сообществ, выделенных на азотсодержащей среде из болот Сосвятский Мох, Киргизное и Круглое. Определение нуклеотидньтх последовательностей клонированных фрагментов ттоХ показало, что во всех трех сообществах присутствуют метанотрофные бактерии, МтоХ которых значительно отличается (20-23% отличий аминокислотных последовательностей) от двух других известных групп МтоХ - группы Methylococcus capsulatus (Bath)/ Methylomonas spp. и группы Methylosinusf Methylocystis. Из ДНК сообщества болота Круглое, помимо вышеуказанного типа фрагментов ттоХ, был получен и второй их тип. Эти фрагменты ттоХ были достаточно близки к таковым у представителей рода Methylocystis - 96.6% сходства на уровне аминокислотных последовательностей, что означало их принадлежность организму нового вида этого рода.

Фрагменты ттоХ не удалось амплифицировать из ДНК сообщества, выделенного из Бакчарского болота. ПЦР-амплификация фрагментов ртоА генов и анализ их нуклеотидных последовательностей показали, что в этом сообществе присутствует лишь один метанотрофный организм, ртоА которого также относится к неизвестной ранее группе ртоА генов. Отличия аминокислотной последовательности этого РтоА фрагмента от РтоА последовательностей метанотрофов I типа составляли от 32 до 45%, а от РтоА последовательностей метанотрофов II типа - от 28 до 30%.

Таким образом, в каждом из ацидофильных сообществ было установлено присутствие неизвестных метанотрофных бактерий. Гены, кодирующие ММО этих бактерий, не принадлежали ни одной из известных ранее групп ртоА и ттоХ генов и представляли новые, эволюционно обособленные линии этих генов. 3. Ацидофильные метанотрофные бактерии и их свойства. Выделение чистых культур метанотрофных бактерий из ацидофильных сообществ было осуществлено двумя различными методами. Первый, более традиционный метод рассева накопительных культур на агаризованную среду позволил получить изоляты рода МеЛуЬсеПа - штаммы 86, К и М131 - из сообществ, выделенных на азотсодержащей среде из болот Сосвятский Мох, Киргизное и Круглое. Этот же методический прием позднее позволил получить ряд изолятов МеЛу1осе!1а из сфагновых торфов и кислых лесных почв различных географических регионов (Табл. 2).

Таблица 2. Источники выделения ацидофильных метанотрофных бактерий

Таксон Штамм Источник выделения № типового штамма

Melhylocella palustris KT Верховое сфапговое болото Киргизное, Томская обл., Западная Сибирь АТСС 700799

/-/-/ S6 Верховое сфагновое болото Сосвятский Мох, Тверская обл. -

/-/-/ M131 Осоково-сфагновое мезотрофное болото Круглое, Томская обл. -

/-/-/ Ch3 Сфагновый торфяник зоны тундры, Чукотка

/-/-/ Y5 Сфагновый торфяник зоны тундры, Югорск

/-/-/ H4 Сфагновый торфяник озера Kleine Fuchskuhle, Германия -

Melhylocella silvestris BL2T Кислая леспая почва, Марбург, Германия DSM 15510; NCIMB 13906

Methylocella tundrae T41 Сфагновый торфяник зоны тундры, Воркута DSM 15673; NCIMB 13949

/-/-/ Y1 Сфагновый торфяник зоны тундры, Югорск -

/-/-/ Chi Сфагновый торфяник зоны тундры, Чукотка -

Methylocapsa acidiphila B2T Верховое болото Бакчарское, Томская обл , Западная Сибирь DSM 13967; NCIMB 13765

Вторым подходом, использованным для получения изолятов МБ, был метод многократных предельных разведений в безазотистой низкоминерализованной жидкой среде. Этот методический прием позволил получить куль гуру ацидофильного метанотрофа другого рода- Methylocapsa - который не растет на агаризованных средах.

3.1. Морфологические и физиологические характеристики ацидофильных МБ.

Род Methylocella. Клетки Methylocella представляют собой мелкие (0.6-1.0 * 1.0-2.5 цм), неподвижные, прямые или изогнутые биполярные палочки (Рис 2). Характерная особенность клеток - формирование на их полюсах гранул поли-ß-оксибутирата. Покоящиеся клетки - экзоспоры, сходные с таковыми у Methylosinus - наблюдаются крайне редко. Рост происходит как на аг аризованных, так и в жидких средах. В качестве источников углерода и энергии представители рода Methylocella используют метан, метанол и метиламин. Температурный диапазон роста - от 4 до 30"С с оптимумом при 15-25'С. Methylocella - умеренно ацидофильный организм, растущий в диапазон pH от 4.2 до 7.5 с оптимумом при pH 5.5. Все представители этого рода предпочитают расти на средах с содержанием минеральных солей 100-500 мг/л. Уникальная особенность ультраструктуры клеток Methylocella заключается в отсутствии внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) (Рис. 2, 3, 4), характерных для всех ранее известных метанотрофов. Клетки обладают широким периплазматическим пространством и системой шаровидных везикул, формирующихся путем инвагинации цитоплазматической мембраны Methylocella является единственным ныне известным метанотрофом, клетки которою содержат только растворимую ММО. Рост на безазотистых средах за счет фиксации N2 происходит только в условиях пониженного парциального давления кислорода. Содержание ГЦ в ДНК составляет 60-63 мол %. Три ныне известных вида рода Methylocella - М. palustris, М. tundrae и М. silvestris (Рис. 2, 3, 4) - были выделены из кислых сфагновых торфяников бореальной зоны и зоны тундры, а также кислых лесных почв (Табл. 2). Межвидовые различия заключаются в особенностях морфологии колоний и клеток, некотором различии температурных и pH оптимумов роста, способности расти при высоких концентрациях метанола в среде и чувствительности к солям (Табл. 3).

Рис. 2. Ацидофильная метанотрофиая бактерия Methylocella palustris К, выделенная из верхового сфагнового болота: (А) морфология клеток, фазовый контраст, маркер - 10 цм; (Б) вид клеток в сканирующем микроскопе, маркер -1 цм, (В) ультратонкий срез вегетативной клетки , маркер - 0.5 цм.

*А*Й fl • .V*

k "*V»• v * \ i о

»ЛИ f

f* А *

* «t'i / ^

Рнс. 3. Ацидофильная метанотрофиая бактерия Methylocella silvestris BL2, выделенная из кислой лесной почвы: (А) морфология клеток, фазовый контраст, маркер - 10 цм; (Б) ультратонкнй срез вегетативной клетки, показывающий шаровидные мембранные везикулы, маркер - 0.2 цм, (В) ультратонкий срез клеток, выращенных на метаноле и содержащих крупные гранулы поля -ß- оксибутирата, маркер - 0.2 цм.

Рис. 4. Ацидофильная метанотрофиая бактерия МеИгу1осе11а ¡ипёгаг Т4, выделенная из сфагнового торфяника тундры: (А) морфология клеток в молодой (7 дней) и (Б) старой (1 месяц) культурах, фазовый контраст, маркер - 10 цм; (В) ультратонкий срез клетки, выявляющий ее специфическую «вогнутую» форму; (Г) срез клетки, показывающий шаровидные мембранные везикулы и гранулу поли -р-оксибутирата, маркер - 0.5 цм.

Таблица 3. Дифференцирующие характеристики видов рода Methylocella

Характеристика М. palustris М. sylvestris М. tundrae

Размеры клеток, цм 0.6-1.0 х 1.0-2.5 0.6-0.8 х 1.2-2.0 0.6-0.8 х 1.0-1.5

Наличие макрокапсулы + + -

Морфология колоний высокие полупрозрачные колонии плотно-слизистой консистенции высокие полупрозрачные колонии слизистой консистенции мелкие кремовые колонии гомогенной консистенции

Рост в жидкой среде с образованием хлопьев с образованием хлопьев гомогенный

Температурный оптимум роста, 'С 20 20-25 15

рН оптимум роста 5.0-5.5 5.5 5.5-6.0

Рост на метаноле, % СН3ОН в среде до 0.3 до 5.0 до 2.0

Концентрация ЫаС1, подавляющая рост, % 0.5 0.8 0.8-1.2

Род МеШу1осарБа. Клетки Ме^у\осар$а представляют собой коккобациллы размером 0.7-1.0 х 0.8-1.2 |1м (Рис. 5), характерной особенностью которых является образование агрегатов клеток, погруженных в плотный полисахаридный матрикс. На периферии таких агрегатов наблюдаются покоящиеся клетки, близкие по ультраструктуре к цистам АгогоЪаМег. В отличие от Ме1ку1осе11а, Ме^Ьсарэа не растет на агаризованных средах. В качестве источников углерода и энергии представители рода МехИуЬсаряа используют метан и метанол, причем последний поддерживает рост только в низких концентрациях, до 0.05 об.%. Температурный диапазон роста - 10-30°С - с оптимумом при 20-24°С; рН диапазон роста - 4.2-7.2 -с оптимумом при рН 5.0-5.5. Оптимальное содержание минеральных солей в среде для Ме1ку1осарва составляет 200-500 мг/л. ИаС1 ингибирует рост клеток при его содержании в среде выше 0.5%. Клетки Ме1ку1осар$а обладают прекрасно развитой системой ВЦМ (Рис. 5Б), способ организации которых отличается от ранее известных I и II типов организации ВЦМ метанотрофных бактерий. В клетках МеЛу1осар$а мембраны собраны в плотные пакеты, что характерно для I типа

Рис. 5. Ацидофильная азотфиксируюшая метанотрофиая бактерия МаЬуЬсаряа аЫМрИНа В2: (А) морфология клеток, фазовый контраст, маркер - 5 цм; (Б) ультратонкий срез вегетативных клеток, заключенных в полисахаридный матрикс; (В) ультратонкий срез цисты, маркер - 0.5 цм.

ВЦМ, однако мембраны в этих пакетах ориентированы параллельно клеточной стенке, как у метанотрофов II типа. Кроме того, ВЦМ структуры МеЛуЬсаряа локализованы всегда только на одной стороне клетки. Такой тип упаковки мембран был классифицирован как новый, III тип организации ВЦМ у метанотрофов (ЭеёуяЬ е* а1., 2002). Клетки Мегку1осаряа содержат только мембранную ММО. В отличие от представителей МеЛу1осе11а, бактерии рода Мегку1осар$а даже в полностью аэробных условиях способны к экспоненциальному росту на жидких безазотистых средах. Содержание ГЦ в ДНК - 63 мол.%. Единственный описанный к настоящему времени вид рода МеЛуЬсаряа - Ме1Ьу1осар$а acidiph.Ua - был выделен из сфагнового болота Западной Сибири (Табл. 2).

3.2. Состав клеточных жирных кислот. Подобно другим известным метанотрофам II типа, в составе клеточных жирных кислот (ЖК) ацидофильных метанотрофов доминируют мононенасыщенные ЖК с 18 атомами углерода (Табл. 4). Однако, у ацидофильных МБ эти кислоты представлены единственным изомером - 18:1ш7, в то время как весьма характерный для метанотрофов рр. Ме1ку1овтия и МеМуЬсуз^ изомер 18:1(в8 отсутствует. Ранее, ЖК 18:1со8 рассматривалась в качестве надежного идентификационного маркера метанотрофов II типа, что широко использовалось в экологических исследованиях для детекции этих организмов. Исследования ацидофильных метанотрофов

показали, что область применимости 18:1со8 как маркера ограничена лишь рр \1ethylosinus и МеЖуЬсуяНя. Различия спектров ЖК у представителей ацидофильных МБ незначительны Так, спецификой ЖК спектра МеЛуЬсеНа Шги1гае является довольно высокое содержание су19:0со8с (7-13% всех ЖК), а для клеток МеМуЬсеПа 5//уел7га характерно присутствие другой несвойственной известным метанотрофам ЖК - ¡17:0 (Табл. 4).

Таблица 4. Сравнение состава клеточных жирных кислот ацидофильных

метанотрофов и других МБ П типа

Кислота МеЛу1осе11а ра1и&т К МеЛу1осе11а Ыпёгае Т4 \iethylocella ,и7ш>.йш ВЬ2 МеЛу1осар$а ас'ШрШа В2 Ме(Иу1о5ши$ и \iethylocystis т-"

14:0 0 4.1 0 0 0

¡15:0 0.2 1.0 1.2 0.1 0-0.9

15:0 0.1 0 0 0 0-0.7

16:1га7с 6.8 11.3 8.8 4.7 0.3-14.2

16:10)71 5.8 0 0 0 0

16:0 5.9 7.2 3.0 7.3 0.7-5.1

¡17:1ш9с 0 0.3 0 0 0

¡17:0 0 0.6 2.5 0.6 0-0.3

а17:0 0.3 0 0 0 0-0.6

17:1 ю8с 0.3 0.3 0 0 0-0.2

17:1<й7с 0 0 0 1.0 0-0.7

су 17:0 0 5.0 0 0 0

17:0 0.1 0 0 0.1 0-0.4

¡18:0 0 0 0.5 0 0

18:1ш8с 0 0 0 0 52 9-73.6

18:1ю7с 78.6 61.4 82.2 78.3 14.8-37 7

18:0 0.9 0.4 1.2 7.6 0-5.0

су19:0ю8с 0 7.9 0 0 0-0.4

19:0 0 0 0.6 0 0

* - данные Вомутап е1 а1. (1993).

3.3. Филогенетическая принадлежность. По данным филогенетического анализа ацидофильные метанотрофы принадлежат к новой ветви метанотрофных бактерий в пределах Alphaproteobacteria, находясь лишь в отдаленном родстве с представителями pp. Methylosinus и Methylocystis (93.0-93.8 % сходства последовательностей генов 16S рРНК) (Рис. 6). Ближайшие филогенетические "родственники" Methylocella и Methylocapsa - ацидофильные азотфиксирующие бактерии рода Beijerinckia (96.0-97.0% сходства генов 16S рРНК), являющиеся типичными обитателями кислых почв и болот. Большинство известных представителей рода Beijerinckia являются органотрофными организмами, и лишь для одного вида этого рода - Beijerinckia mobilis - была показана способность к метилотрофному метаболизму (Dedysh et al., in press). Еще одним организмом, принадлежащим к филогенетическому кластеру Methylocella- Methylocapsa -Beijerinckia, является ацидофильная фототрофная бактерия Rhodoblastus acidophila, также способная к росту на метаноле. Все эти организмы характерны для пресноводных кислых местообитаний и имеют один и тот же оптимум pH 5.5. Несмотря на принадлежность к различным метаболическим типам (метанотрофы, метилотрофы, органотрофы и фототрофы), организмы этой «ацидофильной» группы, по-видимому, связаны общей эволюционной историей.

Ацидофильным метанотрофам присуще высокое внутривидовое сходство нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Для представителей видов рода Methylocella это сходство составляет 99.7-100%. Например, последовательности 16S рРНК целого ряда штаммов Methylocella palustris (К, S6, М131, Y5 и Н4) полностью идентичны, хотя эти штаммы были выделены из географически удаленных регионов (Рис.6, Табл. 2). Это же справедливо и для штаммов Methylocella tundrae (Chi, Т4 и Y1), выделенных из сфагновых торфяников Чукотки и окрестностей Воркуты и Югорска.

Сходство нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК Methylocapsa acidiphila и представителей рода Methylocella довольно высоко - 95.0 - 97.3%. В то же время, степень гомологии ДНК Methylocella и Methylocapsa составляет лишь 7%, подтверждая принадлежность этих бактерий к двум разным родам метанотрофных бактерий.

j Methylocella palustris K1 Methylocella palustris Ш

и

—I

Methylocella palustris YS Methylocella palustris Ch3

И"---Methylocella sylvestris ВЫ'

i Methylocella tundrae Chi 40 f Methylocella tundrae VI ' Methylocella tundrae T41 г Beijerinckia indica subsp indica П Beijerinckia mdica subsp ledicogenes J- Beijerinckia derxn subsp venezuelae StP— Beijerinckia derxn subsp derxii

- Beijerinckia mobilis

Methytocepsa acidiphile B2T

Rkodoblastus acidophiJa Methylosinus trichospanum Ob3b Methylosinus trichospomm Sm6 Methvloswm sporium Sm27a !_r Metkylosmus sponum 44/2 Methylosimts sponum Щ— Methylocystis sp H9a Lj— Methvlocystis parvus

1— Methylocystis echwaides IMET10491

Rhodopseudamonas palustris

Bradvrhtzobium japonicum

I L

wj

IM

IM

- Aiorhizobium caullnodam

Mesorhizobium mediterranem

Sinorhi-obtum melihli

- Rhodobacter capsulatum

Rhodospmllum rubrum

Melhylomonas methamca SI

- "Methylomoma rubra"

Methylobacter luteus Melhylococati capsulatus Texas

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas stutzen

010

Рис. 6. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклсотидпых последовательностей генов 16в рРНК ацидофильных метаиотрофов, азотфиксирующих хемоорганотрофных бактерий р. Веуеппскга, фототрофных бактерий р. ШюЛоЫазШз, метанотрофных бактерий II типа рр. МеМуЬятт и МеИгуЬсухИв, и других представителей класса Л1ркаргШеоЬас1епа. Филогенетический анализ включал также последовательности генов 168 рРНК иетанотрофов I типа рр. Ме/Ьу/отопач, \Iethylobacter и МеЛуЬсоссю, а также некоторых других представителей СаттарШеоЬаШгШ.

3.4. Функциональные гены ацидофильных метанотрофных бактерий.

Ген ртоА кодирует белок, несущий активный центр мембранной ММО. В целом, филогения ртоА генов у метанотрофных бактерий хорошо соответствует филогении генов, кодирующих 16S рРНК. Таким образом, ртоА гены метанотрофов, принадлежащих Alpha- или Gammaproteobacteria, формируют два отдельных филогенетических кластера (Holmes et al., 1995; McDonald & Murreil, 1997). Определение транслированной аминокислотной последовательности ртоА гена ацидофильного метанотрофа Methylocapsa acidiphila В2 показало, что он представляет новую эволюционную ветвь РтоА, удаленную как от кластера РтоА метанотрофов II типа (28-30.5% отличий аминокислотных последовательностей), так и от кластера РтоА метанотрофов I типа (32-44.5% отличий) (Рис. 7). В то же время, последовательность PmoA Methylocapsa acidiphila оказалась сходна (79 581% идентичности) с таковыми у обширной группы клонов ртоА генов (MR2, MR4, RA14, Rold 1, 3 и 5, Maine 6 и 10, Pantanal 11 и 13), полученных из кислых лесных почв США, Дании, Германии, Норвегии и Бразилии (Holmes et а!, 1999; Henckel et al., 2000; Jensen et al., 2000). По всей видимости, Methylocapsa acidiphila В2 является первым, полученным в чистой культуре, представителем некоей обширной группы метанотрофных бактерий, населяющих кислые лесные почвы.

Ген ттоХ кодирует а-субчастицу гидроксилазного компонента растворимой ММО. Аналогично генам, кодирующим мембранную ММО, ттоХ гены метанотрофов I и П типа также формируют два различных кластера Определение последовательностей фрагментов ттоХ генов представителей рода Methylocella выявило, что они не принадлежат ни к одному из двух ранее известных кластеров ттоХ, а формируют отдельный филогенетический кластер (Рис 7). Различия последовательностей МтоХ представителей разных видов Methylocella не превышают 5%, тогда как их различия с последовательностями МтоХ метанотрофов I и II типов составляют 23.5-25% и 21-22%, соответственно

Ген mxaF кодирует главную субчастицу метанолдегидрогеназы, второго фермента в цепочке окисления метана, и присутствует у всех метилотрофных бактерий. Гены mxaF метанотрофов и метилотрофов зачастую формируют общие кластеры, не позволяя дифференцировать эти группы бактерий. Например,

PmoA

100'

- Methylocapsa ucidiphila B2

г MR2 ft MR4 P- Rold3/PantaiMli3 I* RAI4 jjP— Roldl/MaineiO

П— PI

1 921— Marnefi

>— Roldi/Pamanall!

- \feth\losltius trifhoiporium

г- Methyiocyxía parvuA

-- Kfethyincvbtis sp M

---Nitrosococcus oceam

----Methylomicrobium album

- Methylnmicrobium pelagtcum str. IR1

-—- Methylomonas methamia

91-- Methylocaldum szegedieise

^ r~ Methylocaldum tepldum 1— Methylocaldum gracile

--Methylococcus capsulatus

-------"Methylothermus" sp. str HB

Nitrvsomonas europaea Nitrosospira multiformis

0.10

MmoX

L____

100

Methylocóícus capsulalus Bath

______ _ j Wethylamonas sp KSP1I1

Methylomonas sp LWI3

- Mcthylocella tundrae Г41

- Methyloctlla sylvestris BL2*

Methylucella palustris KT

iЛ

2Üj— Methylocysns sp LR1 '— Methylocystis sp 51

j---Methylocystis sp. M

LI— Methylosmus sp LW4 Methylosmus spurium SE2

Ii--Methylosmus sponum D15a

Methylosmus sponum SC8

I— Methylosmus IrtchospormmKS18

100 L__j Methvlosmus tnchosponum ОВЗЬ

Methylosmus tnchosponum sc 10

Рис. 7. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей PmoA и MmoX ацидофильных метанотрофов и метанотрофов I и II типов. В анализ последовательностей PmoA был включен ряд клонов (MR2, MR4, RA14, Rold 1, 3 и 5, Maine 6 и 10, Pantanal 11 и 13), полученных из кислых почв различных географических регионов (Holmes et al., 1999; Henckel et al., 2000; Jensen et al., 2000), а также гомологичные последовательности AmoA некоторых нитрифицирующих бактерий.

аминокислотные последовательности фрагментов MxaF представителей рода Methylocella наиболее близки к таковым у метилотрофных бактерий р. Methylobacterium, а также Beijerinckia mobilis и Methylorhahdus multivorans (86-91% идентичности), тогда как аналогичный показатель сходства между MxaF Methylocella и Methylocapsa не превышает 83%.

Гены nifH и nifD кодируют редуктазный компонент нитрогеназного комплекса и а-субчастицу нитрогеназы, соответственно. Способность к фиксации N2 имеет критическое значение для микроорганизмов ультрапресных сфагновых болот, так как содержание доступных форм азота в этих болотах крайне/низко. Обладают этой способностью и ацидофильные метанотрофы. Дендрограммы, построенные на основе сравнительного анализа транслированных аминокислотных последовательностей NifH и NifD ацидофильных МБ и других азотфиксирующих представителей Alphaproteobacteria, были полностью конгруэнтны (Рис. 8). Последовательности NifH и NifD трех видов р. Methylocella формировали в группах NifH и NifD других азотфиксирующих представителей альфа-протеобактерий отдельные компактные кластеры с уровнем идентичности 98.5-100% и 96.2-98%, соответственно. Характерно, что, несмотря на значительные (8.7-11.4%) различия нуклеотидных последовательностей nifH у штаммов Methylocella palustris и Methylocella tundrae, изолированных из сфагновых болот различных географических регионов, аминокислотные последовательности их NifH были полностью идентичны. Последовательности же фрагментов NifH и NifD Methylocapsa acidiphila В2 оказались очень близки таковым у Beijerinckia mdica (98.5% и 96.6% идентичности, соответственно). Высокое сходство NifH и NifD у Methylocapsa и Beijerinckia хорошо совпадает с общей особенностью физиологии этих бактерий - способностью к экспоненциальному росту на безазотистых средах в полностью аэробных условиях По сравнению с Methylocapsa, рост Methylocella и других азотфиксирующих метанотрофов (Methylosinus, Methylocystis, и Methylococcus) на безазотистых средах происходит только в условиях пониженного парциального давления кислорода (р02 0.01-0.15 bar). Это сходство физиологии также нашло подтверждение данными молекулярного анализа, т.к последовательности NifH и NifD у Methylocella оказались значительно более близки к таковым у Methylococcus и Methylosinus/ Methylocystis, чем к Methylocapsa

(A) NifH

NifD (В)

г

Stiffrinckia Мка nfb*p. ' Srijerinckia Indies setup. lucticoxntr* 54- Semifuku mohdti ^ BeijennckiM dtrxii llbip. dtrxij Щ Seijtnnckia dcrxu >ubip. тпчПн

\iKkybcipa ссШрЫЫ B2

Mt&ybcOtiiHiintSl ' Mfihflxtllt ptltom H< I ShdvbcaipakaihUi I ШАукЫк pebutrb К Mdhytxefla palatini YS 76' МШфсеИм ытЬге'Т* _P MahtfxtUtmintCkl KL MrtkjitK*!!* tUmtrii BL1

VrtMimm« tponum 22 AF4&4W I HethjkniMS tnchmptmum SM6

97 L HUkfMim trkhosporium ОВЗк

- UKkfbmus ¡forum SM27»

- 1ЦМп sporiuM 44/2

90r »ahflacytb KbauUts 1MET11491 Mrlkyhcjm ф H9a

1 Mttkpbcecna rtpaletat Тая

----HerbaxfnrtUm leropeiicac Р77Я7Э*

651- Bnrkhalderiapngorum. AAAJ02000158*

j-ЛагШрЬЫтстйяоЛт

— BnjyrM&btwfoomaim ■— Sinttrhaithim mehbn, NP435635

'-----MesorkiobiM medttirrsiKm, AJ457916

Rhizobim etb, NP_659T79 ^ Cimiiidalii!. dommbtlcKT glgnil AAK26105* Azusptnllum brasitmi СЛА35868 _ -Rhodtibiicler саршЬгПи, MI5270

'---Ahnfaipinltwn nibrw, M33774

__971 — RhiMmtercapstikm X07866

98! — ЮххкрншЬтот! palustr«, NZ_AAAFOIOOOOOI " -JWoWrtiu ШврЫЬ

- Azadxaer сктхассж, M73020

-Azatobacttr melandu, M11579

-mmJhBanfloaa,AfUim

-PiaimauilUBmMi AJ297529

_i—Erwima скгуямтй, №03916

- Klebsiella рттотаг, )01740

_|— ШЛуЬваш мЛтка 68, ЛГ48Ш2

П-•ИпЫмит пАп'13, AF4««73

ilabfMitiertom -Мцмткшф MC-I,NZ.AAAK'01000I95

_OJO

а

Biijtriiicku яюЬШз I SajeriKckia indite iab$p. indii-u J Hn}m«ckia h&m nbip. taeiko^nas Utij/nnckin drill subsp. ven/:u<lae

UMfbaff KtiipUle 82 —"

Mahyhcdla sityeam BL2 Makfbailt чаФк T4 — Mttkfloallt pdtstrb К —

МвкуШгш qxrhim SM27i МеФуШлш irichinponum 0B3bl Mtthyhnlnui tridtospsrium SM6 193

Mrtkyloqsta rchiiwulrs IMCT104Ч1___( "

Metfyxpriisp. HH

Methyiococcus cuasuhoa Balh. КС 002977 Д00 MtAfitmeaa apmbbis Теш

•Hcrbvipinllum ¡стрЫиас CAA90933--

'SurkhiMmaJimga-m ЛЛАДЙОООЩ ---

Rhizobim sp IRj.78. M15401-,]QQ

Bnufyrbiiobam ¡aponicum AAG60729 —

Rlxdapseiidcmiimpobalm 4Z_AAAFOIOOOOOI----

McobimetU, AAM547S1--;_

ИетНаяЫтЬо N? 106490---- 97

Smarhijobtvm mthloti, AAK6510H . ---Г "

94

RhtHlohacleriapwlatus Ш717---

KMobaaersphadtuiki, ZP_00007i25

SWoi/nn/ta ruhnrn ZP 00014414 - --

Uip nwgMtotortiaon, ¿P_000S4386 - --

Glucowcetabacter diazotrophicus A \DOS047 _

*t'and]diiiifi Giomenlxicltr gigau, AAK26I06--

Azoipmllum brasiiem P253I3--

КШяЧчрмтояШ, CAA68413-.

400

T

Enumdnysrnumi HC_0039I6-1

МакуМаЯегЬПж -MttgneloctKCUs sp MC-l.ZP 00044348 — ЛШкШ vmlamfh, M20568 —

Р.1Д.

Рис. 8. Деидрограмма, построенная на основе сравнительного анализа фрагментов аминокислотных последовательностей NifH (А) и NifD (В) ацидофильных метанотрофов, бактерий рода Beijerinckia, метанотрофов I и II типов, а также других азотфиксирующих представителей Alpha- и Gammaproteobacteria.

Таблица 5. Основные характеристики новых родов ацидофильных

метанотрофных бактерий, МеЛу1осе11а и МеИгуЬсарэа

Характеристика р. МеЛу1осеЧа р. Ме1ку1осарза

Морфология клеток Биполярные, прямые и изогнутые палочки, 0.6-1.0x1.0-2.0 мкм; одиночные или собраны в скопления Коккобациллы, 0.7-1.0 * 0.81.2 мкм; часто собраны в агрегаты, окруженные полисахаридным матриксом

Подвижность Неподвижны Неподвижны

Тип покоящихся клеток Экзоспоры Цисты

Тип организации ВЦМ Система везикулярных мембранных образований Сюпки мембран, лежащих параллельно ЦМ, только на одной стороне клетки (тип III)

рН диапазон роста 4.5-7.5 4.2 - 7.2

рН оптимум роста 5.5 5.0-5.5

Ростовые субстраты Метан, метанол, метиламин Метан, метанол

Рост при 30/ 37 °С + /- + /-

Тип метанмонооксигеназы Только растворимая ММО Только мембранная ММО

Путь ассимиляции формальдегида Сериновый Сериновый

Способность к фиксации N2 + +

Преобладающие фосфолипиды Фосфатидилметил-этаноламин Фосфатидилглицерол

Преобладающие жирные кислоты 18:1ш7с 18:1ш7с

Содержание Г+Ц в ДНК (%) 60-63 63

Филогенетическая принадлежность А 1ркаргогеоЬаШг1а А1рИарго1еоЬас1епа

Характеристики, дифференцирующие представителей родов Ме1ку1осарна и МеЛуЬсеЦа, приведены в Таблице 5 Несмотря на сходство экофизиологических характеристик двух ацидофильных метанотрофов, их более детальное сравнение

дас1 основания полагать, что эти организмы используют различные экологические стратегии и занимают различные экологические ниши. Так, Methylocella более зависима от присутствия в среде источника связанного азота, чем Methylocapsa. Последняя, помимо полной автономности в снабжении себя азотом, обладает и большей ацидотолерантностью. Сродство к метану у Methylocapsa acidiphila (Ks = 1-2 jiM) значительно выше, чем у Methylocella (Ks - 40-60 цМ). Преимуществом же Methylocella может быть обладание растворимой формой ММО Синтез мембранной ММО зависит от присутствия в среде Си2+, входящей в активный центр этого фермента. При падении концентрации Си2+ ниже 0.05 мг/л происходит экспрессия растворенной формы ММО (Stanley et al., 1983). В верховых же болотах содержание Си2+ обычно не превышает 0.04 мг/л (Richardson, 1990), и обладание растворимой ММО может обуславливать экологическое преимущество Methylocella в заселении этих местообитаний. Таким образом, Methylocapsa и Methylocella обладают различным набором адаптивных свойств, которые, в зависимости от конкретных условий микроэкониши могут обеспечивать конкурентное преимущество той или иной метанотрофной бактерии.

4. Молекулярная экология ацидофильных метанотрофов.

Для детекции или определения численности ацидофильных метанотрофов в природных средах неприменимы ни традиционные культуральные подходы (высев на агаризованньте среды или метод MPN), ни метод экстракции и последующего анализа жирных кислот. Несравнимо большие возможности для этих целей предоставляют методы молекулярной экологии. Подходы, основанные на использовании ПЦР, разработанные ранее для детекции МБ I и II типов, имеют лишь ограниченное применение для детекции ацидофильных метанотрофов. Несмотря на то, что Methylocella и Methylocapsa относятся к Alphaproteohacteria. филогенетически они четко обособлены от группы родов Methylosinus и Methylocystis, поэтому группо-специфичные праймеры для амплификации генов, кодирующих 16S рРНК, разработанные для детекции метанотрофов И типа неприменимы для ацидофильных МБ. Использование генов ртоА и ттоХ как маркеров ограничено, так как ртоА ген отсутствует у всех представителей рода Methylocella, а ттоХ ген отсутствует у Methylocapsa. Подход с использованием в

качестве маркера гена mxaF, присутствующего у всех грамотрицательных метилотрофов, также не лишен недостатков, так как он не позволяет дифференцировать ацидофильные метанотрофы от метилотрофных бактерий, таких как Methylobacterium. В завершение перечня проблем, клетки ацидофильных метанотрофов устойчивы к лизису, что затрудняет процедуру экстракции ДНК и делает невозможными любые количественные исследования, основанные на использовании ПЦР. Таким образом, для исследования экологии ацидофильных метанотрофов потребовалась разработка прямых молекулярных подходов.

4.1. Метод in situ-гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. Этот метод в зарубежной литературе обозначается аббревиатурой FISH - fluorescent in situ hybridization. Он совмещает в себе возможности прямой специфической детекции и определения численности целевой популяции микроорганизмов в любых природных средах (Ашапп et al., 1990, 1995). Для метанотрофов I и II типов ранее уже был разработан ряд олигонуклеотидных зондов (Brusseau et al., 1994; Bourne et al., 2000; Filler et al., 2001), однако ни один из них не подходил для детекции ацидофильных МБ. Поэтому, для каждого из описанных в настоящей работе ацидофильных организмов был создан соответствующий олигонуклеотидный зонд (Табл. 6). В целях повышения надежности идентификации клеток в образцах, гибридизацию проводили одновременно с двумя олигонуклеотидными зондами различной степени специфичности, мечеными различными флуоресцентными красителями. Например, для детекции Methylocella palustris использовали комбинацию видоспецифичного зонда Mcell-1026, меченого СуЗ, с FLUOS-меченым зондом AcidM-181, специфичным для Methylocella palustris и Methylocapsa acidiphila.

4.2. Идентификация популяций метанотрофов, населяющих сфагновые болота бореальной зоны. Метод FISH был применен для идентификации популяций метанотрофов в образцах торфа ряда сфагновых болот различного географического расположения в пределах бореальной зоны (Табл. 7). Для анализа был использован расширенный спектр зондов, включающий как разработанные в настоящем исследовании зонды для ацидофильных метанотрофов (Табл. 6), так и группо-специфичные зонды для известных метанотрофов I и II типов (см. Материалы и методы). In situ гибридизация позволила обнаружить клетки Methylocella palustris и

Таблица 6. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды для детекции

метанотрофных бактерий, разработанные в данном исследовании

Зонд Целевой организм Нуклеотидная последовательность (5'-3') Целевой участок 16S pPHK Ф, т, %' т6

Mcell-1026 Methylocella palustris GTTCTCGCCACCCGAAGT 1026-1043 0 45-50

Mcaps-1032 Methylocapsa acidiphila CACCTGTGTCCCTGGCTC 1032-1049 0 45-50

AcidM-181 M. palustris + M acidiphila TCTTTCTCCTTGCGGACG 181-198 0 45-50

Mcells-1024 Methylocella silvestris TCCGGCCAGCCTAACTGA 1024-1041 0 50

Mcellt-143 Methylocella tundrae TTCCCCGAGTTGTTCCGA 143-160 0 50

Msint-1268 Methylosinus trichosporium TGGAGATTTGCTCCGGGT 1268-1285 20 46

Msins-647 Methylosinus sporium TCTCCCGGACTCTAGACC 647-664 30 46

Mcyst-1432 Methylocystis spp. CGGTTGGCGAAACGCCTT 1432-1449 0 50

Mcyst-1261 ацидофильные Methylocystis TTGCTCGAGGTCGCCCTT 1261-1278 0 50-55

4 - концентрация формамида в гибридизационном буфере, 6 - температура гибридизации.

Methylocapsa acidiphila практически во всех исследованных образцах торфа сфагновых болот бореальной зоны (Табл. 7). Их популяционная численность была достаточно высока и составляла 105 - 106 клеток/г сырого торфа. Общая численность клеток метанотрофов I типа оказалась на несколько порядков ниже -103 - 104 клеток/г торфа, а в ряде случаев их численность была ниже предела детекции метода FISII, составляющего 103клеток/г торфа. Помимо этого исследование сфагновых торфов выявило некую многочисленную группу бактерий, показавших гибридизацию с группо-специфичным зондом для метанотрофов II

Таблица 7. Популяционная численность различных групп МБ в сфагновых болотах различных географических регионов, определенная методом гибридизации с олигонуклеотидиыми флуоресцентно-мечеными зондами

Болото, время отбора образцов Численность клеток метанотрофов, обнаруженных зондами в г сырого торфа Общее число клеток МБ % от числа эубактерий

Ацидофильные Methylo-cystis МБ I типа Methylo- cello palustris Methylo- capsa acidiphila MethyU) -cella tundrae

Болото Бакчарское, Томская обл., VIII.2001 г. 1.8xl06 1.6x1 о3 1.2х106 1.4х105 HO 3 ЛхЮ6 0.8

Болото Куровское, Московская обл., VII.2001 г. 4.4x106 2.8x106 HO 7.2хЮ6 11.6

Сфагновый торфяник озера Kleine Fuchskuhle, Германия, VII.2002 г. 5.7хЮ6 б.ОхЮ4 5 7хЮ4 1 4x105 HO 5.8хЮ6 10.8

Болото Männikjärve, Эстония, V.2002 г. З.бхЮ4 З,5х103 6.6x106 l.lxlO4 HO ббхЮ6 3.6

Сфагновый торфяник тундры, Воркута, VH.2002 г. 1.7хЮ5 2.2x104 1.3хЮ5 1.4x105 5.7xl04 5.3x10' 1.0

Сфагновый торфяник тундры, Воркута, VIII.2003 г. 0.9хЮ4 2.3* 105 1.2хЮ5 9.2x104 4 5хЮ5 0.5

но - не определяли.

типа (представителей родов Methylosinus и Methylocystis) - зондом М-450 Для более точной идентификации этой населяющей кислые болота популяции метанотрофов был дополнительно разработн ряд олигонуклеотидных зондов более узкого спектра детекции, а именно, зонды, специфичные для Methylosinus trichosporium (Msint-1268), Methylosinus sporium (Msins-647), всех Methylocystis spp (Mcyst-1432) и некоторых филогенетически обособленных подгрупп в пределах рода Methylocystis (Табл. 6). Идентификация обнаруженных в болотах клеток метанотрофов II типа была осуществлена путем комбинированного применения группо-специфичного зонда М-450 и каждого из вновь разработанных зондов более узкого спектра детекции, меченых разными флуоресцентными красителями Было установлено, что эта многочисленная (до 106 клеток/ г торфа) популяция «болотных» метанотрофов представлена филогенетически обособленной группой бактерий, относящихся к роду Methylocystis, но не принадлежащих ни к одному из его узаконенных видов. Именно эта популяция Methylocystis была обнаружена в первоначальных исследованиях ДНК, экстрагированной из сфагновых торфов (McDonald et al., 1996; McDonald, Murrell, 1997). Таким образом, в составе метанокисляющего фильтра сфагновых болот бореальной зоны были идентифицированы три основные компонента - популяции метанотрофов рр Methylocella, Methylocapsa, и Methylocystis. Численность клеток метанотрофов I типа не превышала 1% общей численности метанотрофных бактерий, обнаруженных в образцах. Универсальность такого компонентного состава метанотрофного сообщества в сфагновых торфяниках бореальной зоны была подтверждена исследованиями образцов торфа болот Западной Сибири и Европейской части России, севера Германии и Эстонии (Табл. 7) Во всех случаях доминирующая популяция метанотрофов была представлена одним из трех вышеперечисленных родов. Общая численность метанотрофных бактерий, обнаруженных в торфе сфагновых болот бореальной зоны методом флуоресцентных зондов варьировала в диапазоне 3.1 - 7.2 х 106 клеток/ г торфа, что соответствовало 0.8 - 11.6% от общей численности эубактерий в этих образцах

4.3. Распределение популяций метанотрофных бактерий по профилю болота.

Для исследования вертикальной структуры метанпоглощающего фильтра сфагнового болота был проведен дифференцированный учет численности популяций метанотрофов по профилю болота Бакчарское (Западная Сибирь). Для сравнения, аналогичному анализу были подвергнуты образцы, отобранные по профилю торфяной почвы окружающего болото леса (Рис. 9). Общая численность бактерий и ее распределение по профилю болота и почвы леса не имели существенных различий (Рис. 9А). Однако сфагновое болото и лесная почва кардинально отличались по численности и характеру профильного распределения популяций метанотрофных бактерий (Рис. 9Б). Численность клеток метанотрофов в болоте превосходила таковую в почве окружающего леса более чем на порядок. В образцах болотного торфа клетки метанотрофов составляли 1.2-2.4% общего числа эубактерий. Этот же показатель, определенный для торфяной почвы леса, составил 0.1-0.7%. Все болотные слои, вплоть до глубины 50-60 см, были «заселены» метанотрофами, составляя мощный метанпотребляющий фильтр, тогда как в профиле лесной торфяной почвы лишь единственный слой, приуроченный к УГВ, содержал значимое (> 105 клеток/ г почвы) число метанотрофных бактерий. Состав популяций метанотрофов в болоте был более разнообразен и включал Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и представителей Methylocystis, тогда как в лесной почве были обнаружены только Methylocapsa acidiphila и Methylocystis. Таким образом, в болоте метанпотребляющий фильтр развит в значительно большей степени, чем таковой в почве окружающего болото леса, что, безусловно, является отражением более интенсивного протекания в болоте процессов метаногенеза и, как следствие, более мощного потока метана, поступающего в аэробные слои болотного профиля.

4.4. Компонентный состав и профильная структура метаиокисляющего фильтра сфагнового болота тундры. Общая численность метанотрофных бактерий в образцах сфагновых болот тундры была в среднем на порядок ниже таковой в горфе болот бореальной зоны и достигала 5.3 х 105 клеток/ г торфа (Табл. 7). Компонентный состав метаиокисляющего сообщества в тундре был более разнообразен, по сравнению с таковым в сфагновых болотах бореальной зоны, и

А. сфагновое болото

О.МБЮО 1.00ЕЦ» 2.00Е+08

Б. сфагновое болот о

ОЛОЕ+ОО 4.00Е+05 8.00К+А5

10-20 сш

Methylocapw acidiphila MatliyiiKL-lij palwrij мегежлрофн 11 Tuna

О жгамснрофы i 1иш

А. лес

ОЛОЕНЮ 1.00L+08 2.ООЕ+08

Б. лес

О.ООЕ+ОО 4.00Е+05 8.00Е+05

10-20 cm

20-30 cm

Рис.9. Распределение общей численности бактерий (А) и популяций метанотрофов (Б) по профилю сфагнового болота Бакчарское (Западная Сибирь) и по профилю торфяной почвы окружающего болото леса (N клеток/ г сырого торфа). (А) Учет общей численности бактерий произведен с использованием универсального флуоресцирующего красителя DAPI. Штриховкой выделена доля клеток, идентифицируемых универсальным зондом на эубактерии - EUB338. Б. Состав популяций, составляющих метанпотребляющее сообщество болота. Идентификация отдельных популяций метанотрофных бактерий и определение их численности осуществлены путем in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными олигопуклеотидными зондами на различные группы метанотрофов. УГВ в болоте и лесной почве находился на глубине 10-12 см и 25 см, соответственно.

А Активность окисления метана, чкг С-СН,/(ч г торфа) Б. Численность клеток метанотрофов в г торфа

О 05 1 1 5 0 ООЕ+ОО 2 00Е-Ю5 4 00£-»05

Рис. 10. Активность окисления метана образцами торфа, отобранными по профилю сфагнового болота зоны тундры. Б. Состав и численность популяций метанотрофных бактерий, обнаруженных в этих же образцах торфа путем in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами на различные группы метанотрофов.

включал представителей не только II, но и I типа метанотрофов. Это, по-видимому, объясняется более высокими значениями pH (5.0-5.5) тундровых болот, что позволяет развиваться гораздо более широкому спектру метанотрофных организмов. Основным же фактором, определяющим доминирование в составе метанокисляющих сообществ тундры, становится способность организмов развиваться при низких температурах. Поэтому, наряду с ацидофильными метанотрофами - Methylocella palustris и Methylocella tundrae - способными развиваться при довольно низких температурах, в торфах тундры в значительном количестве были обнаружены МБ I типа. Это неудивительно, так как до сих пор представители исихрофильных МБ- Methylobacter psychrophilus и Methylosphaera hansonii - были обнаружены только среди метанотрофов I типа (Omelchenko et al., 1996; Bowman et al„ 1997).

Характер распределения численности метанотрофных бактерий по профилю болота тундры полностью соответствовал характеру распределения метанокисляющей активности торфа (Рис. 10). Наибольшая активность окисления метана, а также максимальная численность клеток метанотрофов были зарегистрированы в слое общей мощностью 15 см, находящемся непосредственно под уровнем грунтовых вод. В составе метанокисляющего сообщества этого слоя были идентифицированы метанотрофные бактерии I типа, а также ацидофильные

метанотрофы Methylocella palustris и Methylocella tundrae (Рис. 10Б) Роль температуры как регулятора состава такого сообщества была установлена в лабораторных экспериментах с инкубацией образцов торфа этого слоя при 5 и 15°С и последующем определении состава популяций МБ в образцах. Доля клеток метанотрофов р. Methylocella в сообществе возрастала с повышением температуры, так как температурный оптимум их роста приходится на диапазон 15-20°С. При температуре же 5°С в составе метанокисляющего сообщества доминировала популяция МБ I типа, представленная, по всей видимости, психрофильными организмами.

Заключение

Настоящие исследования доказывают, что метанотрофные бактерии являются численно- и функционально-значимым компонентом микробного сообщества северных сфагновых болот. Экологическая функция этого компонента состоит в окислении метана, образующегося в анаэробных слоях болотного профиля, и снижении его эмиссии в атмосферу. Процесс этот осуществляет неизвестная ранее, специализированная группа метанотрофных бактерий, адекватно адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях, характерных для сфагновых болот Северного полушария. Выделение этих организмов стало возможным лишь благодаря принципиальной модификации сред и условий, традиционно используемых для культивирования МБ. В результате применения нового подхода, из кислых сфагновых болот бореальной зоны и зоны тундры, а также кислых лесных почв впервые изолированы культуры ацидофильных метанотрофных бактерий Они описаны как два новых рода и четыре новых вида МБ - Methylocella palustris, Methylocella tundrae, Methylocella silvestris и Methylocapsa acidiphila.

Ацидофильные МБ составляют филогенетически обособленную группу метанотрофных организмов в пределах Alphaproteobacteria, находящихся лишь в отдаленном родстве с ранее известными МБ II типа, рр Methylosinus и Methylocystis, что подтверждает и анализ генов, кодирующих ММО этих двух групп метанотрофов. Ацидофильные метанотрофы рр. Methylocella и Methylocapsa образуют общую эволюционную группу с ацидофильными органотрофными

азотфиксирующими бактериями р. Beijerinckia и ацидофильными фототрофными бактериями р. Rhodoblastus, являющимися типичными обитателями кислых почв и болот.

Ацидофильные метанотрофные бактерии широко распространены в кислых наземных экосистемах Северного полушария. Это удалось установить путем применения метода in «¿и-гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. Несмотря на многолетнюю историю применения метода FISH в молекулярно-экологических исследованиях, приоритет его использования для количественных исследований метанотрофных бактерий в природном местообитании принадлежит данной работе. Применение этого метода позволило впервые идентифицировать основные популяции - компоненты метанокисляющего сообщества ультрапресных сфагновых болот бореальной зоны и зоны тундры. Как было установлено, состав сообществ метанотрофов в географически удаленных болотах бореальной зоны сходен и включает, в основном, популяции ацидофильных метанотрофов II типа -Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и Methylocystis spp. Численность клеток метанотрофов I типа в образцах торфа болот бореальной зоны не превышает 1% общей численности МБ, что, по-видимому, обусловлено неспособностью представителей метанотрофов I типа к росту при низких значениях pH. Таким образом, основным фактором, определяющим состав метанотрофных сообществ сфагновых болот бореальной зоны, является высокая кислотность среды (pH 3.54.5), характерная для этих экосистем. В сфагновых болотах зоны тундры, где кислотность среды ниже (pH 5.0-5.5), определяющим фактором становится способность организмов развиваться при низких температурах. Поэтому, помимо ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris и Methylocella tundrae, численно значимым компонентом метанокисляющего сообщества в тундре являются психрофильные метанотрофы I типа.

Исследования ацидофильных МБ позволили существенно расширить знания о биологии, экологии и эволюционной истории метанотрофных бактерий, а также значительно пополнить арсенал культуральных приемов и молекулярных методов, используемых в изучении этой группы микроорганизмов.

выводы

1. Установлено, что естественный контроль над эмиссией метана из северных сфагновых болот осуществляется неизвестной ранее, специализированной группой ацидофильных метанотрофных бактерий, хорошо адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях.

2. Ацидофильные метанотрофные бактерии pp. Methylocella и Methylocapsa составляют филогенетически обособленную группу организмов в пределах Alphaproteobacteria, находящихся лишь в отдаленном родстве с ранее известными метанотрофами II типа. Впервые показано, что метанотрофные бактерии, использующие сериновый путь ассимиляции формальдегида, не являются монофилетичной группой, а представляют две различные эволюционные группы бактерий - группу Metkylosinus -Methylocystis и группу Methylocella - Methylocapsa. Гены, кодирующие ММО этих двух групп метанотрофов также принадлежат к различным эволюционным линиям ртоА и ттоХ генов, соответственно.

3. Для культивирования ацидофильных метанотрофных бактерий или определения их популяционной численности в природных средах непригодны подходы, разработанные ранее для нейтрофильных МБ. Наиболее точным количественным методом исследования экологии ацидофильных МБ является метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными флуоресцентно-мечеными зондами, разработанными для каждого из описанных в настоящей работе микроорганизмов.

4. Метанотрофные бактерии являются численно значимым компонентом микробного сообщества северных болот, составляя до 11% численности эубактерий. Состав организмов, слагающих метанокисляющий фильтр сфагновых болот бореальной зоны универсален, и включает, в основном, популяции ацидофильных метанотрофов II типа - Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и Methylocystis spp. В сфагновых болотах зоны тундры состав метанокисляющего сообщества более разнообразен и включает представителей не только II, но и I типа метанотрофов. Помимо

ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris и Methylocella tundrae, важным компонентом метанокисляюшего сообщества в тундре являются психрофильные МБ I типа.

S. Ацидофильные метанотрофные бактерии широко распространены в кислых наземных экосистемах Северного полушария, в том числе в сфагновых болотах бореальной зоны и зоны тундры, а также в кислых лесных почвах, и играют важную роль в процессах микробной трансформации метана в этих экосистемах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи

1. Дедыш С.Н., Паииков Н.С. Влияние концентрации метана на скорость его бактериального окисления в сфагновом торфе. Микробиология. 1997. Т.66, вып.4. С. 563-568.

2. Дедыш C.II., Паников Н.С. Кинетика окисления метана в сфагновом торфе в зависимости от рН, температуры и концентрации солей. Микробиология. 1997. Т.66, вып.4. С. 569-573.

3. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs. AppI Environ. Microbiol. 1998. V.64 (3). P. 922-929.

4. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W., GroBkopf R., Zhou J., and Tiedje J.M.

Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands Science 1998. V.282. P. 281-284.

5. Dedysh S.N., Liesack W., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Bares A.M., Panikov N.S., and Tiedje J.M. Methylocella palustris gen. nov., sp. nov., a new methane-oxidizing acidophilic bacterium from peat bogs representing a novel subtype of serine-pathway methanotrophs. Int. J Syst. Evol Microbiol. 2000. V. 50. P. 955-969.

6 Panikov N.S., Dedysh S.N. Cold season CH4 and C02 emission from temperate peat bog (West Siberia): winter fluxes and thaw activation dynamics. Global Biogeochem Cycles. 2000. V.14 (4). P. 1071-1080.

7. Dedysh S.N., M. Derakshani, and W. Liesack. Detection and enumeration of methanotrophs in acidic Sphagnum peat by 16S rRNA fluorescence in situ hybridization, including the use of newly developed oligonucleotide probes for Methylocella palustris Appl. Environ. Microbiol. 2001. V.67. P. 4850-4857.

8. Panikov N.S., S.N. Dedysh, O.M. Kolesnikov, A.I. Mardini, M.V. Sizova.

Metabolic and environmental control on methane emission from soils: mechanistic

studies of mesotrophic fen in West Siberia. Water, Air, and Soil Pollution. 2001 P.132: 1-15.

9. Dedysh S.N., H.-P. Horz, P.F. Dunfield, and W. Liesack. A novel pmoA lineage represented by the acidophilic methanotrophic bacterium Methylocapsa acidophila B2 Arch. Microbiol. 2001. V.177. P. 117-121.

10. Dedysh S.N., V.N. Khmelenina, N.E. Suzina, Y.A. Trotsenko, J.D. Semrau, W.

Liesack, and J.M. Tiedje. Methylocapsa acidiphila gen. nov., sp. nov., a novel methane-oxidizing and dinitrogen-fixing acidophilic bacterium from Sphagnum bog Int J Syst Evol. Microbiol. 2002. V.52. P. 251-261.

11. Dunfield P.F., Tchawa Yimga M., Dedysh S.N., Berger U., Liesack W., Heyer J.

Isolation of a Methylocystis strain containing a novel pmoA-like gene copy FEMS Microbiol Ecol. 2002. V.41. P. 17-26.

12. Dedysh S.N., Dunfield P.F., Derakshani M., Stubner S., Heyer J., Liesack W. Differential detection of type II methanotrophic bacteria in acidic peatlands using newly developed 16S rRNA-targeted fluorescent oligonucleotide probes. FEMS Microbiol Ecol. 2003. V. 43. P. 299-308.

13. Dunfield P.F., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N

Methylocella silvestris sp. nov, a novel methane-oxidizing bacterium isolated from an acidic forest cambisol. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1231-1239.

14. Dedysh S.N., Berestovskaja Y.Y., Vasylieva L.V., Belova S.E., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Liesack W., Zavarzin G.A. Methylocella tundrae sp. nov., a novel methanotrophic bacterium from acidic tundra peatlands. Int J Syst Evol Microbiol. 2004. V. 54. P. 151-156.

15. Dedysh S.N., Ricke P., Liesack W. Niffl and NifD phylogenies: an evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria Microbiology. 2004. V. 150. P. 1301-1313.

16. Колесников O.M., Дедыш C.H., Паников H.C. Ингибирование солями роста и метанотрофной активности Methylocapsa acidiphila. Микробиология. 2004 Т. 73(4). С. 574-576.

17. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Liesack W., Trotsenko Y.A. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilis. J. Bacteriol. 2005 (in press).

Обзоры

18 Дедыш C.H. Метанотрофные бактерии кислых сфагновых болот Микробиология. 2002. Т. 71(6). С. 741-754.

19. Дедыш С.Н. Ацидофильные метанотрофные бактерии. Труды Института микробиологии РАН. Т. 12. Москва, Изд-во «Наука». 2004. С. 109-125.

Тезисы конференций

20. Dedysh S.N. Methane cycle in ombrotrophic bog as effected by drainage. Abstracts, XII International Symposium on Environmental Biogeochemistry "Biosphere and Atmospheric Changes". 3-8.09.1995. Rio de Janeiro, Brazil.

21. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W., Großkopf R., and Tied je J.M. Novel acidophilic methanotrophic bacteria from peat bogs: isolation and characterization. Abstracts, 98th ASM Meeting. 17-21.05.1998. Atlanta, USA. P.312.

22. Dedysh S.N., Liesack W., Horz H.-P., and Tiedje J. A novel methane-oxidizing strain from methanotrophic community capable of growth at pH 4. Abstracts, Kongreß der VAAM "Mikrobiologie 2000". 12-16.03.2000. München, Germany. P. 147.

23. Дедыш С.Н. Ацидофильные метанотрофные бактерии и молекулярные методы их детекции в природных местообитаниях. Материалы международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы К 75-летию со дня рождения академика РАН E.H. Кондратьевой». Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова. 1315.12.2000. МАКС Пресс, Москва. С.67-68.

24. Dedysh S.N., М. Derakshani, and W. Liesack. The population size of well-known and novel methanotrophs in acidic Sphagnum peat. Abstracts, 9th International Symposium on Microbial Ecology 28-31.08.2001. Amsterdam, the Netherlands. P 127

25. Dedysh S.N. Methanotrophic bacteria inhabiting acidic northern wetlands. Abstracts of International Workshop: Microbial responses to environmental challenges. 31.101.11.2001. Marburg, Germany. P.53.

26. Dunfleld P.F., Dedysh S.N. A novel, facultatively methanotrophic Methylocella species isolated from an acidic forest soil. Abstracts, 103rd ASM Meeting. 18-22.05.2003. Washington, USA. P.60.

27. Dunfield P.F., Dedysh S.N. Methylocella silvestris is a facultative methanotroph. Abstracts, FEMS Congress of European microbiologists. 29.06-3.07.2003. Ljubljana, Slovenia. P. 326.

28. Frenzel P., Dedysh S., Karofeld E. Methane oxidation in mudbottoms: rates, localization, and organisms. Abstracts, International Symposium Structure and function of soil microbiota. 18-20.09.2003. Marburg, Germany. P. 76.

29. Берестовская Ю.Ю., Васильева JI.B., Полякова A.B., Дедыш C.H., Заварзии Г.А. Микробное сообщество заполярной тундры России. Материалы Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения». 31.08-3.09.2004. Апатиты. С. 7-8.

30. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Анализ микробных сообществ сфагновых болот путем in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. «Болота и биосфера». Материалы 3-ей научной школы. 13.09-16.09.2004. Томск. С. 231-238.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 27.12.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 2,5. Тираж 100 экз. Заказ 1251. Тел. 939-3890, Тел./факс 939-3891. 119992, ГСГ1-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

1 $30 РНБ Русский фонд

2006-4 1916

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Дедыш, Светлана Николаевна

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна и значимость работы.

Практическая ценность.

Основные защищаемые положения диссертации.

Публикации.

Структура и объем.

Часть 2. МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК УНИКАЛЬНАЯ ГРУППА ПРОКАРИОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ И ИСТОРИЯ ПОИСКА

АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТАНОТРОФОВ.

Глава 1. Общая характеристика метанотрофных бактерий как уникальной метаболической группы прокариотных организмов.

Глава 2. Современное состояние таксономии метанотрофных бактерий.

Глава 3. Известные экофизиологические типы метанотрофных бактерий.

Глава 4. История поиска метанотрофных организмов, осуществляющих процессы окисления метана в кислых болотах Северного полушария.

2.4.1. Основные характеристики сфагновых болот как среды обитания микроорганизмов.

2.4.2. Изучение процессов окисления метана в кислых торфах.

2.4.3. Применение различных подходов для идентификации метанотрофных организмов кислых северных болот.

2.4.3.1. Культуральные методы.

2.4.3.2. Анализ жирных кислот, экстрагированных из природного образца.

2.4.3.3. Молекулярные методы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Часть 3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ МЕТАНА В

КИСЛЫХ СФАГНОВЫХ БОЛОТАХ.

Глава 1. Объекты и методы исследования.

3.1.1. Характеристика мест отбора образцов.

3.1.2. Измерение активности окисления метана образцами торфа сфагновых болот.

3.1.3. Модельные эксперименты по выявлению оптимума процесса окисления метана в торфе.

Глава 2. Динамика потребления СН4 образцами сфагнового торфа и вклад абиотических процессов.

Глава 3. Активность потребления СН4 в северных болотах различных типов и ее распределение по профилю болота.

Глава 4. Кинетика окисления метана в сфагновом торфе в зависимости от различных экотопических факторов.

3.4.1. Влияние концентрации СН4.

3.4.2. Влияние кислотности среды (рН).

3.4.3. Влияние температуры.

3.4.4. Влияние концентрации солей.

Часть 4. АЦИДОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК ОСОБАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГРУППА ОРГАНИЗМОВ.

Глава 1. Материалы и методы исследования.

4.1.1. Выделение и исследование ацидофильных метанотрофных сообществ.

4.1.1.1. Образцы торфа, использованные для получения накопительных культур болотных метанотрофов.

4.1.1.2. Методика получения накопительных культур.

4.1.1.3. Культивирование метанотрофных сообществ и изучение их ростовых характеристик.

4.1.1.4. Аналитические методы.

4.1.1.5. Молекулярный анализ компонентного состава сообществ.

4.1.1.6. Сканирующая электронная микроскопия.

4.1.2. Изучение чистых культур ацидофильных метанотрофов.

4.1.2.1. Методика получения изолятов ацидофильных метанотрофов и их культивирование.

4.1.2.2. Контроль чистоты изолятов.

4.1.2.3. Методы исследования морфологических, физиологических и хемотаксономических характеристик культур.

4.1.2.4. Электронная микроскопия.

4.1.2.5. Энзимологические исследования.

4.1.2.6. Определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК гомологии.

4.1.2.7. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей филогенетических и функциональных генов.

4.1.2.8. Бактерии, использованные в качестве тест- культур.

Глава 2. Ацидофильные метанотрофные сообщества.

4.2.1. Новый подход к получению накопительных культур метанотрофных бактерий сфагновых болот.

4.2.2. Ростовые характеристики метанотрофных сообществ болот.

4.2.3. Идентификация метанотрофного компонента сообществ.

Глава 3. Ацидофильные метанотрофные бактерии и их свойства.

4.3.1. Морфологические и физиологические характеристики ацидофильных метанотрофов.

4.3.1.1. Род Methylocella.Ill

4.3.1.2. Род Methylocapsa.

4.3.2. Состав клеточных жирных кислот и фосфолипидов.

4.3.3. Метаболическая характеристика.

4.3.4. Филогенетическая принадлежность.

4.3.5. Функциональные гены ацидофильных метанотрофных бактерий.

4.3.4.1. Ген ртоА.

4.3.4.2. Ген ттоХ.

4.3.4.3. Ген mxaF.

4.3.4.4. Гены nifH и niJD.

4.3.6. Характеристики, дифференцирующие Methylocapsa и Methylocella.

Часть 5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ АЦИДОФИЛЬНЫХ

МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ.

Глава 1. Молекулярные методы исследования экологии метанотрофных бактерий и их применимость для детекции ацидофильных метанотрофов.

5.1.1. Молекулярные подходы, используемые для идентификации и определения численности метанотрофных бактерий в природных местообитаниях.

5.1.2. Применимость ранее разработанных молекулярных методов для детекции ацидофильных метанотрофов.

5.1.2.1. Методы, основанные на использовании ПЦР.

5.1.2.2. Метод FISH.

5.1.3. Свидетельства широкого распространения ацидофильных метанотрофных бактерий, полученные в молекулярных исследованиях других авторов.

Глава 2. Материалы и методы.

5.2.1. Разработка новых олигонуклеотидных зондов и проверка их специфичности.

5.2.2. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов.

5.2.3. Процедура фиксации образцов для последующего анализа методом FISH.

5.2.3.1. Фиксация культур бактерий.

5.2.3.2. Фиксация образцов торфа.

5.2.4. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами.

5.2.5. Микроскопический анализ.

5.2.4. Детекция и учет клеток метанотрофов в нативных образцах.

Глава 3. Разработка молекулярных подходов для специфической детекции представителей ацидофильных метанотрофов и их применение для исследования популяций этих бактерий in situ.

5.3.1. Создание 16S рРНК-специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для детекции ацидофильных метанотрофных бактерий.

5.3.1.1. Дизайн зондов.

5.3.1.2. Оптимизация условий гибридизации.

5.3.1.3. Апробация зондов на смешанных культурах метанотрофов и нативных образцах торфа.

5.3.2. Идентификация и определение популяционной численности метанотрофов, населяющих сфагновые болота бореальной зоны.

5.3.2.1. Оценка эффективности процедуры экстракции клеток из торфа.

5.3.2.2. Оптимизация процедуры учета клеток метанотрофов для получения статистически достоверных результатов.

5.3.2.3. Влияние формамида на результаты определения численности ацидофильных метанотрофов in situ.

5.3.2.4. Анализ состава популяций метанотрофных бактерий в сфагновом торфе.

5.3.2.5. Идентификация метанотрофных бактерий II типа, обнаруженных в кислых торфах, и выделение репрезентативной культуры этих организмов.

5.3.2.6. Состав популяций метанотрофов в сфагновых болотах бореальной зоны.

5.3.3. Распределение популяций метанотрофных бактерий по профилю болота бореальной зоны.

5.3.4. Компонентный состав и профильная структура метанокисляющего фильтра сфагнового болота зоны тундры.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ацидофильные метанотрофные бактерии"

Актуальность проблемы. Метан является одним из наиболее активных парниковых газов, быстрые темпы накопления которого в атмосфере Земли (до 1% в год) (Cicerone, Oremland, 1988; IPCC, 2001) вызывают обоснованную тревогу мирового сообщества (Рамочная конвенция ООН об изменении климата, 1992). В глобальном бюджете атмосферного СН4 выделяют два крупнейших его источника - естественные болота и заболоченные земли, а также рисовники (Matthews, Fung, 1987; Aselmann, Crutzen, 1989; Hein et al., 1997). Значимость каждого из этих источников варьирует в различных географических регионах. Основные площади рисовников сосредоточены в юго-восточной Азии, низовые болота расположены по большей части в тропических регионах, тогда как северные широты (выше 60°N) заняты массивами верховых и мезотрофных болот. Вклад этих северных болот в бюджет атмосферного СН4 особенно значителен для России, стран Скандинавии, Канады и севера США (Matthews, Fung, 1987; Hein et al., 1997; Panikov, 1999; Заварзин, Васильева, 1999). Наиболее обширные массивы болот — 161 млн. га - расположены в России, причем большая их часть сосредоточена в Западной Сибири, где они составляют до 80% территории (Вомперский и др., 1999; Land resources of Russia, 2002). Полевые измерения величин эмиссии метана из западносибирских болот показали, что они достаточно высоки и варьируют от 0.5 до

40 мг СН4-С ч"1 м"2 (Паников и др. 19936,1995,1997; Гальченко и др. 2001), причем эмиссия метана из нейтральных низовых болот незначительна, а максимальные ее значения регистрируются в верховых и мезотрофных кислых сфагновых болотах.

Метан, поступающий из северных болот в атмосферу, имеет биогенное происхождение, о чем свидетельствует его легкий изотопный состав (Quay et al., 1988). Продукция биогенного метана обусловлена деятельностью двух специфических групп прокариотных организмов - метаногенных и метанотрофных бактерий (Заварзин, 1979,

1984), а эмиссия СН4 из болот в атмосферу есть результат дисбаланса в их функционировании. Однако природа как метаногенных, так и метанотрофных организмов, осуществляющих реакции цикла метана в сфагновых болотах, долгое время оставалась неизвестной. Причиной тому являлись специфические характеристики этих болот как среды обитания микроорганизмов, прежде всего, их высокая кислотность. Значения рН торфяной влаги в верховых сфагновых болотах лежат в диапазоне 3-4.5, а в мезотрофных болотах - в диапазоне 4-5.5. Помимо этого, для сфагновых болот характерны низкая буферность воды, низкое содержание минеральных солей (< 50 мг/л) и преобладание пониженных температур. Совокупность этих характеристик не позволяла соотнести процессы биогенного образования и потребления СН4 в этой экосистеме с каким-либо из ранее известных микроорганизмов цикла метана.

Определенный прогресс в исследовании закономерностей метаногенеза в сфагновых болотах и идентификации микроорганизмов - агентов этого процесса был достигнут лишь в последние годы (Nercessian et al., 1999; Horn et al., 2003; Galand et al., 2003; Sizova et al., 2003; Kotsyurbenko et al., 2004), однако чистые культуры ацидофильных метаногенов не описаны и поныне. Настоящая же работа была посвящена исследованию метанотрофных бактерий, слагающих «бактериальный газовый фильтр», который перехватывает образованный в анаэробных слоях сфагновых болот СН4 на его пути в атмосферу. Именно эффективность работы метанокисляющего микробного сообщества является тем естественным механизмом, который контролирует величину эмиссии метана из северных болот (Panikov et al., 2001). В противоположность достаточно хорошо изученным метанотрофным сообществам низовых болот (Намсараев, 1973) и рисовников (Henckel et al., 1999; Frenzel, 2000; Eller, Frenzel, 2001), представленных известными метанотрофами I и II типов, состав этих сообществ в сфагновых болотах долгое время оставался «белым пятном» в экологии метанотрофных бактерий. Актуальность обнаружения и исследования этих организмов была продиктована самой глобальностью распространения кислых торфяных болот, являющихся доминирующими наземными экосистемами бореальной зоны Северного полушария и одним из наиболее характерных для России ландшафтов.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось выявление и изучение метанотрофных бактерий, слагающих метанокисляющий фильтр северных кислых ультрапресных болот и снижающих эмиссию парникового газа СН4 в атмосферу.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать закономерности процессов окисления СЕЦ образцами кислых торфов для выявления физиологического оптимума населяющих их метанотрофных бактерий.

2. Разработать адекватные культуральные подходы для выделения ацидофильных метанотрофных микробных сообществ и изучить их состав.

3. Выделить чистые культуры ацидофильных метанотрофных бактерий из сфагновых болот различного географического расположения, исследовать особенности их биологии и установить их филогенетическую принадлежность и таксономический статус.

4. Осуществить сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ключевых ферментов ацидофильных метанотрофов - растворимой и мембранной ММО, метанолдегидрогеназы и нитрогеназы - с таковыми у ранее известных метанотрофов.

5. Разработать молекулярные подходы, позволяющие идентифицировать и определять численность ацидофильных метанотрофных бактерий в природных средах.

6. Определить состав и численность популяций метанотрофных бактерий, слагающих метанотрофный фильтр сфагновых болот различного географического расположения, и оценить вертикальную структуру этого фильтра.

Научная новизна и значимость работы. Установлена природа микробного блока, осуществляющего естественный контроль над эмиссией метана из северных болот, и выявлены микроорганизмы - агенты процессов окисления метана в кислых, холодных и ультрапресных природных экосистемах.

Описана неизвестная ранее группа ацидофильных метанотрофных бактерий, составляющих филогенетически обособленную ветвь метанотрофных организмов в пределах класса Alphaproteobacteria. Установлен и узаконен таксономический статус представителей этой группы - двух новых родов, Methylocella и Methylocapsa, и четырех новых видов метанотрофных бактерий, Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila. Типовые штаммы этих новых бактерий депозитированы в международных коллекциях микроорганизмов — АТСС, DSMZ и NCIMB.

Исследования ацидофильных МБ позволили существенно расширить знания о биологии метанотрофных бактерий, в частности, их физиологии, ультраструктуре клеток, хемотаксономических и генотипических характеристиках.

Впервые для количественных исследований популяций метанотрофов в природном местообитании применен метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH). Идентифицированы основные микробные популяции, слагающие метанокисляющий фильтр сфагновых болот, а также определена их популяционная численность в болотах бореальной зоны и зоны тундры.

Практическая ценность. Разработаны концептуально-новые приемы выделения микроорганизмов из ультрапресных местообитаний, позволившие изолировать представителей функционально важной, но некультивируемой ранее группы ацидофильных метанотрофных бактерий.

Создана база данных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, а также ртоА, ттоХ,, mxaF, nifH и nifD генов ацидофильных метанотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Разработан и апробирован наиболее полный из существующих на сегодняшний день набор 16S рРНК-специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для дифференцированной детекции метанотрофных бактерий. Он включает зонды различного уровня специфичности: от видо-специфичных зондов для ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae и Methylocapsa acidiphila, до родо- и группо-специфичных зондов для известных ранее МБ I и II типов. Разработана также модификация метода FISH для анализа образцов торфа, применимая для оценки популяционной плотности не только метанотрофных, но и любых других групп бактерий.

Получена коллекция изолятов ацидофильных МБ, обладающих растворимой формой ММО и, в силу этого, имеющих хороший потенциал для применения в биотехнологии очистки кислых природных сред от загрязнения.

Основные защищаемые положения диссертации.

1. Окисление метана в сфагновых болотах осуществляется неизвестной ранее, специализированной группой ацидофильных метанотрофных бактерий, хорошо адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях.

2. Ацидофильные МБ представляют филогенетически обособленную группу бактерий в пределах класса Alphaproteobacteria, которая находится лишь в отдаленном родстве с представителями ранее известных метанотрофов II типа.

3. Культуральные подходы и молекулярные методы детекции, разработанные ранее для нейтрофильных метанотрофов, не могут быть использованы или имеют лишь ограниченное применение для исследования ацидофильных МБ. Единственным строго количественным из доступных на настоящий момент методов исследования популяционной экологии ацидофильных МБ является метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными зондами. 4. Ареал распространения ацидофильных МБ довольно широк и включает сфагновые болота бореальной и тундровой зон, а также кислые лесные почвы бореальной зоны

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 30 печатных работах: 17 экспериментальных статьях, 2 обзорах и 11 тезисах.

Структура и объем. Работа изложена на 235 страницах и содержит 49 рисунков и 20 таблиц. Список цитируемой литературы включает 294 наименования, из них 54 - на русском, 2 - на немецком и 238 — на английском языках.

Часть 2. МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК УНИКАЛЬНАЯ ГРУППА ПРОКАРИОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ И ИСТОРИЯ ПОИСКА АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТАНОТРОФОВ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дедыш, Светлана Николаевна

выводы

1. Установлено, что естественный контроль над эмиссией метана из северных сфагновых болот осуществляется неизвестной ранее, специализированной группой ацидофильных метанотрофных бактерий, хорошо адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях.

2. Ацидофильные метанотрофные бактерии pp. Methylocella и Methylocapsa составляют филогенетически обособленную группу организмов в пределах класса Alphaproteobacteria, находящихся лишь в отдаленном родстве с ранее известными метанотрофами II типа. Впервые показано, что метанотрофные бактерии, использующие сериновый путь ассимиляции формальдегида, не являются монофилетичной группой, а представляют две различные эволюционные группы бактерий - группу Methylosinus -Methylocystis и группу Methylocella - Methylocapsa. Гены, кодирующие ММО этих двух групп метанотрофов также принадлежат к различным эволюционным линиям ртоА и ттоХ генов, соответственно.

3. Для культивирования ацидофильных метанотрофных бактерий или определения их популяционной численности в природных средах непригодны подходы, разработанные ранее для нейтрофильных метанотрофов. Наиболее точным количественным методом исследования экологии ацидофильных метанотрофных бактерий является метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными флуоресцентно-мечеными зондами, разработанными для каждого из описанных в настоящей работе микроорганизмов.

4. Метанотрофные бактерии являются численно значимым компонентом микробного сообщества северных болот, составляя до 11% численности эубактерий. Состав организмов, слагающих метанокисляющий фильтр сфагновых болот бореальной зоны универсален, и включает, в основном, популяции ацидофильных метанотрофов II типа - Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и Methylocystis spp. В сфагновых болотах зоны тундры состав метанокисляющего сообщества более разнообразен и включает представителей не только II, но и I типа метанотрофов. Помимо ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris и Methylocella tundrae, важным компонентом метанокисляющего сообщества в тундре являются психрофильные метанотрофные бактерии I типа.

5. Ацидофильные метанотрофные бактерии широко распространены в кислых наземных экосистемах Северного полушария, в том числе в сфагновых болотах бореальной зоны и зоны тундры, а также в кислых лесных почвах, и играют важную роль в процессах микробной трансформации метана в этих экосистемах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящие исследования доказывают, что метанотрофные бактерии являются численно- и функционально-значимым компонентом микробного сообщества северных сфагновых болот. Экологическая функция этого компонента состоит в окислении метана, образующегося в анаэробных слоях болотного профиля, и снижении его эмиссии в атмосферу. Процесс этот осуществляет неизвестная ранее, специализированная группа метанотрофных бактерий, адекватно адаптированных к росту в кислых, холодных и ультрапресных условиях, характерных для сфагновых болот Северного полушария. Выделение этих организмов стало возможным лишь благодаря принципиальной модификации сред и условий, традиционно используемых для культивирования метанотрофных бактерий. В результате применения нового подхода, из кислых сфагновых болот бореальной зоны и зоны тундры, а также кислых лесных почв впервые изолированы культуры ацидофильных метанотрофных бактерий. Они описаны как два новых рода и четыре новых вида метанотрофов - Methylocella palustris, Methylocella tundrae, Methylocella silvestris и Methylocapsa acidiphila.

Ацидофильные метанотрофы составляют филогенетически обособленную группу метанотрофных организмов в пределах класса Alpharoteobacteria, находящихся лишь в отдаленном родстве с ранее известными метанотрофными бактериями II типа, pp. Methylosinus и Methylocystis, что подтверждает и анализ генов, кодирующих ММО этих двух групп метанотрофов. Как ни парадоксально, ацидофильные метанотрофы Methylocella и Methylocapsa образуют общую эволюционную группу с ацидофильными органотрофными азотфиксирующими бактериями p. Beijerinckia и ацидофильными фототрофными бактериями p. Rhodoblastus, являющимися типичными обитателями кислых почв и болот.

Ацидофильные метанотрофные бактерии широко распространены в кислых наземных экосистемах Северного полушария. Это удалось установить путем применения метода in situ-гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. Несмотря на многолетнюю историю применения метода FISH в молекулярно-экологических исследованиях, приоритет его использования для количественных исследований метанотрофных бактерий в природном местообитании принадлежит данной работе. Применение этого метода позволило впервые идентифицировать основные популяции — компоненты метанокисляющего сообщества ультрапресных сфагновых болот бореальной зоны и зоны тундры. Как было установлено, состав сообществ метанотрофов в географически удаленных болотах бореальной зоны сходен и включает, в основном, популяции ацидофильных метанотрофов II типа - Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и Methylocystis spp. Численность клеток метанотрофов I типа в образцах торфа болот бореальной зоны не превышает 1% общей численности метанотрофных бактерий, что, по-видимому, обусловлено неспособностью представителей метанотрофов I типа к росту при низких значениях рН. Таким образом, основным фактором, определяющим состав метанотрофных сообществ сфагновых болот бореальной зоны, является высокая кислотность среды (рН 3.5-4.5), характерная для этих экосистем. В сфагновых болотах зоны тундры, где кислотность среды ниже (рН 5.0-5.5), определяющим фактором становится способность организмов развиваться при низких температурах. Поэтому, помимо ацидофильных метанотрофов Methylocella palustris и Methylocella tundrae, численно значимым компонентом метанокисляющего сообщества в тундре являются психрофильные метанотрофы I типа.

Исследования ацидофильных метанотрофов позволили существенно расширить знания о биологии, экологии и эволюционной истории метанотрофных бактерий, а также значительно пополнить арсенал культуральных приемов и молекулярных методов, используемых в изучении этой группы микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Дедыш, Светлана Николаевна, Москва

1. Андреев J1.B., Гальченко В.Ф. Жирнокнелотный состав и идентификация метанотрофных бактерий// Доклады АН СССР. 1978. Т. 239. С. 1465-1468.

2. Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В., Честных О.В., Заварзин Г.А. Метанотрофы психрофильных микробных сообществ арктической тундры России// Микробиология. 2002. Т. 71. С. 538-544.

3. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий// Микробиология. 2002. Т. 71. №4. С. 1-9.

4. Буторова И.А. Микробное сообщество на природном газе и возможности его регуляции. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Л., 1991. 20 с.

5. Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю., Заварзин Г.А. Психрофильные ацидофильные метанотрофы из сфагнетты зоны вечной мерзлоты// Доклады Академии Наук. 1999. T.368.N 1.С. 125-128.

6. Вомперский С.Э., Цыганова О.П., Ковалев А.Г., Глухова Т.В., Валяева Н.А. Заболоченность территории России как фактор связывания атмосферного углерода // Круговорот углерода на территории России. М.: Изд-во Моск. Правительства, 1999. С. 124-145.

7. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Выделение и свойства новых штаммов облигатных метанотрофов// Микробиология. 1977. Т. 46. Вып. 5. С. 890-897.

8. Гальченко В.Ф. Сульфатредукция, метанобразование и метанокисление в различных водоемах оазиса Бангер Хиллс, Антарктида// Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 4. С. 683-698.

9. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии водных экосистем. Диссертация на соискание ученой степени доктора биол. наук. 1989. М., ИНМИ АН, 381 с.

10. Гальченко В.Ф. Бактериальный цикл метана в морских экосистемах// Природа. 1995. №6. С. 35-48.

11. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС, 2001. 500с.

12. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова JI.B., Соколова Е.Н., Иванов М.В. Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры Черного моря// Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 2. С. 305-310.

13. Гальченко В.Ф., Андреев J1.B., Троценко Ю.А. Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986. 96 с.

14. Гальченко В.Ф., Дулов J1.E., Крамер Б., Конова Н.И., Барышева С.В. Биогеохимические процессы цикла метана в почвах, болотах и озерах Западной Сибири//Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 215-225.

15. Гвоздев Р.И., Акентьева Н.П. Современные представления о структуре и функции метанмонооксигеназы// Биохимия и физиология метилотрофов. Сб. научн. трудов. ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино. 1987. С. 33-50.

16. Дедыш С.Н., Паников Н.С. Влияние концентрации метана на скорость его бактериального окисления в сфагновом торфе// Микробиология. 1997а. Т.66. № 4. С. 563-568.

17. Дедыш С.Н. Метанотрофные бактерии кислых сфагновых болот// Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С.1-14.

18. Добровольская Т.Г., Полянская Л.М., Головченко А.В., Смагина М.В., Звягинцев Д.Г. Микробный пул в торфяных почвах// Почвоведение. 1991. N 7. С. 69-76.

19. Заварзин Г.А. (ред.) Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М.: Наука. 1979. 285с.

20. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука. 1984. 192с.

21. Заварзин Г.А. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты// Микробиология. 1993. Т. 62. № 5. С. 789-800.

22. Заварзин Г.А. Психрофильный цикл ЗенгенаУ/ Экол. химия. 1995. Т.4 (1). С.З.

23. Заварзин Г.А., Васильева JI.B. Цикл метана на территории России// Круговорот углерода на территории России. М.: Изд-во Моск. Правительства, 1999. С. 202-230.

24. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие// Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 579-599.

25. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Головченко А.В., Зенова Г.М., Смагина М.В. Структура сапротрофного комплекса микроорганизмов в торфяниках// Микробиология. 1991. Т. 60. Вып. 6. С. 155-164.

26. Иванов М.В., Нестеров А.И., Намсараев Б.Б., Гальченко В.Ф., Назаренко А.В. Распространение и геохимическая деятельность метанотрофных бактерий в водах угольных шахт//Микробиология. 1978. Т. 47. С. 489-494.

27. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Баранова С.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Новый умеренно галофильный метанотроф рода Methylobacterll Микробиология. 1998. Т. 67. Вып. 4. С. 532-539.

28. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья// Микробиология. 1999. Т. 68. Вып. 5. С. 689-697.

29. Кевбрина М.В., Охапкина А.А., Ахлынин Д.С., Кравченко И.К., Ножевникова А.Н., Гальченко В.Ф. Рост мезофильных метанотрофов при низких температурах// Микробиология. 2001. Т. 70. Вып. 4. С. 444-451.

30. Лысенко A.M., Гальченко В.Ф., Черных Н.А. Таксономическое изучение облигатных метанотрофных бактерий методом ДНК-ДНК гибридизации// Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 5. С. 816-822.

31. Малашенко Ю.Н., Романовская В.А., Богаченко В.Н., Швед А.Д. Термофильные и термотолерантные бактерии, ассимилирующие метан// Микробиология. 1975. Т. 44. Вып. 5. С. 855-862.

32. Малашенко Ю.Н., Романовская В.А., Троценко Ю.А. Метанокисляющие микроорганизмы/Под ред. ЗаварзинаГ.А. М.: Наука, 1978. 197 с.

33. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Будкова Е.Н., Исагулова Ю., Бергер У., Криштаб Т.П., Чернышенко Д.В., Романовская В. А. Метанокисляющая микрофлора в пресных и соленых водоемах// Микробиология. 1987. Т. 56. Вып. 1. С. 134-139.

34. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Романовская В.А., Бергер У., Будкова Е.Н., Шатохина Э.С. Синтез и окисление метана бактериями в гипергалинных озерах// Микробиол. журнал. 1995. Т. 57. № з. с. 24-28.

35. Намсараев Б.Б. Взаимоотношения микроорганизмов при окислении метана. 1973. Дисс. канд. биол. наук. М. 131 с.

36. Намсараев Б.Б., Жилина Т.Н., Кулырова А.В., Горленко В.М. Бактериальное образование метана в содовых озерах Юго-Восточного Забайкалья// Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 671-676.

37. Омельченко М.В., Савельева Н.Д., Васильева JI.B., Заварзин Г.А. Психрофильное метанотрофное сообщество из почвы тундры// Микробиология. 1992. Т.61. Вып.6. С. 1072-1077.

38. Омельченко М.В., Васильева JI.B., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофильного метанотрофа// Микробиология. 1993. Т. 62. С. 849-854.

39. Омельченко М.В., Васильева JI.B., Заварзин Г.А., Савельева Н.Д., Лысенко A.M., Митюшина JI.JI., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Новый психрофильный метанотроф рода Methylobacter!I Микробиология. 1996. Т. 65. Вып. 3. Р. 384-389.

40. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. М.: Наука. 1992. 311 с.

41. Паников Н.С., Палеева М.В., Куличевская И.С., Глаголев М.В. Вклад бактерий и грибов в эмиссию СО2 из почвы//Дыхание почвы. Сб. научн. трудов. Пущино, 1993а. С. 33-51.

42. Паников Н.С., Титлянова А.А., Палеева М.В., Семенов A.M., Миронычева-Токарева Н.П., Макаров В.И., Дубинин Е.В., Ефремов С.П. Эмиссия метана из болот юга Западной Сибири// Доклады Академии Наук. 19936. Т. 330 (3). С. 388-390.

43. Паников Н.С., Сизова М.В., Зеленев В.В., Махов Г.А., Наумов А.В., Гаджиев И.М. Эмиссия СН4 и СО2 из болот юга Западной Сибири: пространственное и временное варьирование потоков// Ж. Экол. Химии. 1995. Т.4. С. 13-24.

44. Романовская В.А., Малашенко Ю.Р., Богаченко В.Н. Уточненные диагнозы родов и видов метаниспользующих бактерий//Микробиология. 1978. Т. 47. Вып. 1. С. 120129.

45. Романовская В.Н. Новый род Methylovarius gen. nov. // Микробиология. Т. 53. Вып. 5. С. 777-784.

46. Слободкин А.И., Заварзин Г.А. Образование метана в галофильных цианобактериальных матах лагун озера Сиваш// Микробиология. 1992. Т. 61. № 2. С. 294-299.

47. Слободкин А.И., Паников Н.С., Заварзин Г.А. Образование и потребление метана микроорганизмами в болотах тундры и средней тайги// Микробиология. 1992. Т. 61. Вып. 4. С. 683-691.

48. Старостина Н.Г., Кощаев А.Г., Ратнер Е.Н., Циоменко А.Б. Характеристика гидрофобности клеточной поверхности метанотрофных бактерий по ихспособности к адгезии на углеводородах// Микробиология. 1997. Т.66. № 2. С.185-191.

49. Сузина Н.Е., Четина Е.В., Троценко Ю.А., Фихте Б.А. Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата и поверхностных трубчатых структур клеток Methylocystis echinoides!7 Микробиология. 1985. Т. 54. Вып. 2. С. 214-221.

50. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. Ультраструктурная организация метанотрофных бактерий. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1986. 115с.

51. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии и осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов// Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 1-11.

52. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Метанотрофные бактерии соленых водоемов Украины и Тувы// Микробиология. 1996. Т. 65. № 5. С. 696-703.

53. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. Потенциальная активность окисления метана и аммония метанотрофными сообществами содовых озер Южного ЗабайкальяII Микробиология. 2000. Т. 69. № 4. С. 553-558.

54. Adamsen A.P.S., King G.M. Methane consumption in temperate and subarctic forest soils: rates, vertical zonation and responses to water and nitrogen// Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 485-490.

55. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology// J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 762-770.

56. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation// Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143169.

57. Amann R., Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology// FEMS Microbiol. Reviews. 2000. V. 24. P. 555-565.

58. Amann R., Snaidr J., Wagner M., Ludwig W., Schleifer K.-H. In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community// J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 34963500.

59. Anthony C. Biochemistry of Methylotrophs. Academic Press, London. 1982.

60. Anthony C. Bacterial oxidation of methane and methanol// Adv. Microb. Physiol. 1986. V. 27. P. 113-210.

61. Approved Lists of Bacterial Names. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. (ed.)// Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. P. 225-420.

62. Aselmann I., Crutzen P.J. Global distribution of natural freshwater wetlands and rice paddies, their net primary productivity, seasonality and possible methane emissions// J. Atmos. Chemistry. 1989. V. 8. P. 307-358.

63. Auman A.J., Stolyar S., Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P. 5259-5266.

64. Becking J.H. The genus Beijerinckia. In The Prokaryotes, 3rd edn. Edited by M. Dworkin et al. New York: Springer-Verlag. 1999. http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125.

65. Bedard C., Knowles R. Physiology, biochemistry and specific inhibitors of CH4, NHV" and CO2 oxidation by methylotrophs and nitrifiers// Microbiol. Rev. 1989. V.53. N 1. P. 68-84.

66. Bender M., Conrad R. Kinetics of CH4 oxidation in oxic soils exposed to ambient air or high CH4 mixing ratios// FEMS Microbiol. Ecol. 1992. V. 101. N 4. P. 261-276.

67. Best D.J., Higgins I.J. Methane-oxidizing activity and membrane morphology in a methanol-grown obligate methanotroph, Methylosinus trichosporium OB3b// J. Gen. Microbiol. 1981. V. 125. P. 73-84.

68. Bodrossy L., Kovacs K.L., McDonald I.R., Murrell J.C. A novel thermophilic methane-oxidizing y-Proteobacterium// FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 170. P. 335-341.

69. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell C.J., Radajewski S., Weiharter A., Sessitsch A. Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs// Environ. Microbiol. 2003. V. 5(7). P. 566-582.

70. Bourne D.G., Holmes A.J., Iversen N., Murrell J.C. Fluorescent oligonucleotide rDNA probes for specific detection of methane oxidizing bacteria// FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 31. P. 29-38.

71. Bowman J.P., Sly L.I., Cox J.M., Hayward A.C. Methylomonas fodinarum sp. nov. and Methylomonas aurantiaca sp. nov.: two closely related type I obligate methanotrophs// Syst. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. P. 278-286.

72. Bowman J.P., Skerratt J.H., Nichols P.D., and Sly L.I. Phospholipid fatty acid and lipopolysaccharide fatty acid signature lipids in methane-utilizing bacteria// FEMS Microbiol. Ecol. 1991. V.85. P. 15-22.

73. Bowman J.P., Sly L.I., Stackebrandt E. The phylogenetic position of the family Methylococcaceaell 1995. Int. J. Syst. Bacterid. V. 45. P. 182-185.

74. Bowman J.P., McCammon S.A., & Skerratt J.H. Methylosphaera hansonii gen. nov., sp. nov., a psychrophilic, group I methanotroph from Antarctic marine-salinity, meromictic lakes//Microbiology. 1997. V. 143. P. 1451-1459.

75. Brantner C.A., Buchholz L.A., McSwain C.L., Newcomb L.L., Remsen C.C., Collins M.L.P. Intracytoplasmic membrane formation in Methylomicrobium album BG8 is stimulated by copper in the growth medium// Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 672-676.

76. Brantner C.A., Remsen C.C., Owen H.A., Buchholz L.A., Collins M.L.P. Intracellular localization of particulate methane monooxygenase and methanol dehydrogenase in Methylomicrobium album BG8//Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 59-64.

77. Brown L.R., Strawinski R.J., McCleskey C.S. The isolation and characterization of Methanomonas methano-oxidans Brown and Stravinski// Can. J. Microbiol. 1964. V. 10. P. 791-799.

78. Brusseau G.A., Tsien H.-C., Hanson R.S., Wackett L.P. Optimization of trichloroethylene oxidation by methanotrophs and the use of a colorimetric assay to detect soluble methane monooxygenase activity//Biodegradation. 1990. V. l.P. 19-29.

79. Bull I.D., Parekh N.R., Hall G.H., Ineson P., Evershed R.P. Detection and classification of atmospheric methane oxidizing bacteria in soil//Nature. 2000. V. 405. P. 175-178.

80. Biirgmann H., Widmer F., von Sigler W., Zeyer J. New molecular screening tools for the analysis of free-living diazotrophs in soil// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 240247.

81. Burrows К. J., Cornish A., Scott D., Higgins I.J. Substrate specificities of the soluble and particulate methane mono-oxygenases of Methylosinus trichosporium ОВЗЬ// J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 3327-3333.

82. Cardy D.L.N., Laidler V., Salmond G.P.C., Murrell J.C. Molecular analysis of the methane monooxygenase (MMO) gene cluster of Methylosinus trichosporium ОВЗЬ// Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 335-342.

83. Cicerone R., Oremland R. Biogeochemical aspects of atmospheric methane// Global Biogeochem. Cycles. 1988. V.2 (4). P.299-327.

84. Colby J., Stirling D.I., Dalton H. The soluble methane mono-oxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath). Its ability to oxygenate и-alkanes, и-alkenes, ethers, and alicyclic, aromatic and heterocyclic compounds// Biochem. J. 1977. V. 165. P. 395-402.

85. Colby J., Dalton H. Resolution of the methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath) into three components: purification and properties of component С, a flavoprotein// Biochem. J. 1978. V. 171. P. 461-468.

86. Conrad R., Frenzel P., Cohen Y. Methane emission from hypersaline microbial mats: lack of aerobic methane oxidation activity// FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 16. P. 297-306.

87. Conrad R. Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2, and NO). Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 609-640.

88. Conti S.F., HirschP. Biology of budding bacteria. III. Fine structure of Rhodomicrobium and Hyphomicrobium spp.// J. Bacteriol. 1965. V. 89. P. 503-512.

89. Costello A., Lidstrom M.E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5066-5074.

90. Crill P.M., Martikainen P J., Nykanen H., Silvola J. Temperature and N fertilization effects on methane oxidation in a drained peatland soil// Soil Biol. Biochem. 1994. V.26. N10. P. 1331-1339.

91. Dalton H. Structure and mechanism of action of the enzymes involved in methane oxidation// In: Applications of enzyme biotechnology. J.W. Kelley (ed.), 1991, Plenum Press, New York. P. 55-68.

92. Dalton H. Methane oxidation by methanotrophs: physiological and mechanistic implications// In: Methane and methanol utilizers. J.C. Murrell and H.Dalton (ed.), 1992. Plenum Press, New York. P.85-114.

93. Dalton H., Leak D.J. Methane oxidation by microorganisms// In: Microbial gas metabolism. S.R.K. Poole, C.S. Dow (ed.), 1985. Academic Press Ltd., London. P. 173200.

94. Davies S.L., Whittenbury R. Fine structure of methane and other hydrocarbon-utilizing bacteria// J. Gen. Microbiol. 1970. V. 61. P. 227-232.

95. Davis J.B., Coty V.F., Stanley J.P. Atmospheric nitrogen fixation by methane-oxidizing bacteria Ps. methanitrificansll J. Bacteriol. 1964. V. 83. P. 468-472.

96. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs// Appl. Environ. Microbiol. 1998a. V.64. N 3. P.922-929.

97. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W., GroBkopf R., Zhou J., Tiedje J.M. Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands// Science 1998b. V. 282. P. 281-284.

98. Dedysh S.N., Horz H.-P., Dunfield P.F., Liesack W. A novelpmoA lineage represented by the acidophilic methanotrophic bacterium Methylocapsa acidophila B2// Arch. Microbiol. 2001b. V.177. P.l 17-121.

99. Dedysh S.N., Ricke P., Liesack W. NifH and NifD phylogenies: an evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria// Microbiology 2004b. V. 150. P. 1301-1313.

100. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Liesack W., Trotsenko Y.A. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilisll J. Bacteriol. 2005 (in press).

101. DeLong E.F., Wickham G.S., Pace N.R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells// Science 1989. V. 243. P. 13601363.

102. DeLong E.F., Taylor L.T., Marsh T.L., Preston C.M. Visualization and enumeration of marine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5554-5563.

103. Dunfield P.F., Conrad R. Starvation alters the apparent half-saturation constant for methane in the type II methanotroph Methylocystis strain LR1// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. N. 9. P. 4136-4138.

104. Dunfield P., Knowles R. Kinetics of inhibition of methane oxidation by nitrate, nitrite and ammonium in a humisol// Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. N 8. P. 3129-3135.

105. Dunfield P., Knowles R., Dumont R., Moore T.R. Methane production and consumption in temperate and subarctic peat soils: response to temperature and рН// Soil Biol. Biochem. 1993. V. 25. N. 3. P. 321-326.

106. Dunfield P.F., Liesack W., Henckel Т., Knowles R., Conrad R. High-affinity methane oxidation by a soil enrichment culture containing a type II methanotroph// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. N. 3. P. 1009-1014.

107. Dunfield P.F., Tchawa Yimga M., Dedysh S.N., Berger U., Liesack W., Heyer J. Isolation of a Methylocystis strain containing a novel pmoA-Wkt gene copy// FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V.41. P.17-26.

108. Dworkin M., Foster J.M. Studies of Pseudomonas methanica (Sohngen) nov. comb.// J. Bacterid. 1956. V. 72. P. 646-659.

109. Elango N., Radhakrishnan R., Froland W.A., Wallar B.J., Earhart C.A., Lipscomb J.D., Ohlendorf D.H. Crystal structure of the hydroxylase component of methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b// Protein Sci. 1997. V. 6. P. 556-568.

110. Eller G., Frenzel P. Changes in activity and community structure of methane-oxidizing bacteria over the growth period of rice// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2395-2403.

111. Eller G., Stubner S., Frenzel P. Group specific 16S rRNA targeted probes for the detection of type I and type II methanotrophs by fluorescence in situ hybridisation// FEMS Microbiol. Lett. 2001. V.198. P. 91-97.

112. Fang J., Barcelona M.J., Semrau J.D. Characterization of methanotrophic bacteria on the basis of intact phospholipid profiles// FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 189. P. 67-72.

113. Felsenstein J. PHYLIP phylogeny inference package (version 3.2)// Cladistics. 1989. V.5. P. 164-166.

114. Foster J.W., Davis R.H. A methane-dependent coccus, with notes on classification of obligate, methane-utilizing bacteria// J. Bacteriol. 1966. V. 91. P. 1924-1931.

115. Frenzel P. Plant-associated methane oxidation in rice fields and wetlands// Advances in Microbial Ecology/ Ed. Schink B. Kluwer Academic Plenum Publ., N.-Y. 2000. P. 85114.

116. Fuchs B.M., Glockner F.O., Wulf J., Amann R. Unlabeled helper oligonucleotides increase the in situ accessibility to 16S rRNA of fluorescently labeled oligonucleotide probes//Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3603-3607.

117. Galand, P.E., Fritze, H. and Yrjala, K. Microsite-dependent changes in methanogenic populations in a boreal oligotrophic fen// Environ Microbiol. 2003. V. 5. P. 1133-1143.

118. Giani D., Giani L., Cohen Y., Krumbein W.E. Methanogenesis in the hypersaline Solar Lake (Sinai)// FEMS Microbiol. Lett. 1984. V. 25. P. 219-224.

119. Gilbert В., McDonald I.R., Finch R., Stafford G.P., Nielsen A.K., Murrell J.C. Molecular analysis of the pmo (particulate methane monooxygenase) operons from two type II methanotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 966-975.

120. Goodwin S., Zeikus J.G. Ecophysiological adaptation of anaerobic bacteria to low pH: analysis of anaerobic digestion in acid bog sediments// Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. N1. P. 57-64.

121. Graham D.W., Korich D.G., LeBlanc R.P., Sinclair N.P., Arnold R.G. Applications of a colorimetric plate assay for soluble methane monooxygenase activity// Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2231-2236.

122. Green J., Dalton H. Steady-state kinetic analysis of soluble methane mono-oxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// Biochem. J. 1986. V. 236. P. 155-162.

123. Green J., Dalton H. Substrate specificity of soluble methane monooxygenase. Mechanistic implications//J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 17698-17703.

124. Guckert J.B., Ringelberg D.B., White D.C., Hanson R.S., and Bratina B.J. Membrane fatty acids as phenotypic markers in the polyphasic taxonomy of methylotrophs within the Proteobacteria// J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2631-2641.

125. Gulledge J., Ahmad A., Steudler P.A., Pomerantz W.J., Cavanaugh C.M. Family- and genus-level 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for ecological studies of methanotrophic bacteria// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4726-4733.

126. Hahn D., Amann R.I., Ludwig W., Akkermans A.D.L., Schleifer K.-H. Detection of micro-organisms in soil after in situ hybridization with rRNA-targeted, fluorescently labelled oligonucleotides//J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 879-887.

127. Hanson R.S., Hanson Т.Е. Methanotrophic bacteria// Microbiol. Rev. 1996. V.60. N. 2. P. 439-471.

128. Hazeu W., Batenburg van der Vegte W.H., de Bruyn J.C. Some characteristics of Methylococcus mobilis sp. nov.//Arch. Microbiol. 1980. V. 124. P. 211-220.

129. Hein R., Crutzen P.J., Heinmann M. An inverse modeling approach to investigate the global atmospheric methane cycle// Global Biogeochem. Cycles. 1997. V.l 1 (1). P. 4376.

130. Henckel Т., Jackel U., Schnell S., Conrad R. Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil oxidizing atmospheric methane// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P.l 801-1808.

131. Henckel Т., Jackel U., Conrad R. Vertical distribution of the methanotrophic community after drainage of rice field soil// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 34. P. 279291.

132. Heyer J., Suckow R. Ecological studies of methane oxidation in an acid bog lake. Limnologica 1985. V.l6. P. 247-266.

133. Higgins I.J., Quayle J.R. Biochem. J. 1970. V. 118. P. 201-208.

134. Holmes A.J, Costello A., Lidstrom M.E., Murrell J.C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related// FEMS Microbiol. Lett. 1995a. V.l32. P. 203-208.

135. Holmes A. J., Owens N.J.P., Murrell J.C. Detection of novel marine methanotrophs using phylogenetic and functional gene probes after methane enrichment// Microbiol. 1995b. V. 141. P. 1947-1955.

136. Holmes A.J., Roslev P., McDonald I.R., Iversen N., Henriksen K., Murrell J.C. Characterization of methanotrophic bacterial populations in soils showing atmospheric methane uptake// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3312-3318.

137. Horn M.A., Matthies C., Ktisel K., Schramm A., Drake H.L. 2003. Hydrogenotrophic methanogenesis by moderately acid-tolerant methanogens of a methane-emitting acidic peat//Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 74-83.

138. Hyder S.L., Meyers A., Cayer M.L. Membrane modulation in a methylotrophic bacterium Methylococcus capsulatus (Texas) as a function of growth substrate// Tissue and Cell. 1979. V. 11. P. 597-610.

139. Hyman M.R., Wood P.M. Methane oxidation by Nitrosomonas europaeall Biochem. J. 1983. V. 212. P. 31-37.

140. IPCC (Intergovernmental Panel on Climate Change) Third Assessment Report -Climate Change 2001, http://www.ipcc.ch/

141. Imhoff J.F. Transfer of Rhodopseudomonas acidophila to the new genus Rhodoblastus as Rhodoblastus acidophilus gen. nov., comb, nov.// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1863-1866.

142. Jensen S., Holmes A. J., Olsen R.A., Murrell J.C. Detection of methane oxidizing bacteria in forest soil by monooxygenase PCR amplification// Microbial Ecology 2000. V. 39. P. 282-289.

143. Joergensen L., Degn H. Mass spectrometric measurements of methane and oxygen utilization by methanotrophic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 20. P. 331-335.

144. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. Microbial diversity of soda lakes// Extremophiles. 1998. V. 2. P. 191-200.

145. Khmelenina V., Kalyuznaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes// Curr. Microbiol. 1997. V. 35. P. 257-261.

146. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Gottschalk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs// Arch. Microbiol. 1999. V. 172. P. 321-329.

147. King G.M. Ecological aspects f methane oxidation, a key determinant of global methane dynamics//Adv. Microb. Ecol. 1992. V. 12. P. 431-461.

148. King G.M., Schnell S. Effect of increasing atmospheric methane concentration on ammonium inhibition of soil methane consumption// Nature. 1994. V. 370. P. 282-284.

149. Kluyver A. J., van Niel C.B. Prospects for a natural system of classification of bacteria// Z. Bacteriol. Parasitenk. Abt. II. 1936. V. 369-403.

150. Knief C., Lipski A., Dunfield P.F. Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. N 11. P. 6703-6714.

151. Kolb S., Knief C., Stubner S., Conrad R. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. N. 5. P. 2423-2429.

152. Krumholz L.R., Hollenback J.L., Roskes S.J., and Ringelberg D.B. Methanogenesis and methanotrophy within a Sphagnum peatland// FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 18. P. 215-224.

153. Land resources of Russia. CD-ROM database created by International Institute for Applied Systems Analysis. Russian Academy of Sciences. 2002.

154. Lawrence A.J., Quayle J.R. Alternative carbon assimilation pathways in methane-utilizing bacteria//J. Gen. Microbiol. 1970. V. 63. P. 371-374.

155. Leadbetter E.R., Foster J.W. Studies on some methane utilizing bacteria// Arch. Microbiol. 1958. V. 30. P. 91.

156. Leahy J.G., Batchelor P. J., Morcomb S.M. Evolution of the soluble diiron monooxygenases//FEMS Microbiol. Reviews. 2003. V. 27. P. 449-479.

157. Lidstrom M.E. Isolation and characterization of marine methanotrophs// Antonie van Leeuwenhoek. 1988. V. 54. P. 189-199.

158. Lipscomb J.D. Biochemistry of the soluble methane monooxygenase// Annual Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 371-399.

159. Lloyd J.S., Finch R., Dalton H., Murrell J.C. Homologous expression of soluble methane monooxygenase genes in Methylosinus trichosporium OB3b// Microbiology. 1999a. V. 145. P. 461-470.

160. Lloyd J.S., De Marco P., Dalton H., Murrell J.C. Heterologous expression of soluble methane monooxygenase genes in methanotrophs containing only particulate methane monooxygenase// Arch. Microbiol. 1999b. V. 171. P. 364-370.

161. Ludwig W., Amann R., Martinez-Romero E., Schonhuber W., Bauer S., Neef A., Schleifer K.-H. rRNA based identification system for rhizobia and other bacteria// Plant & Soil. 1998. V. 204. P. 1-19.

162. Lufit J.H. Electron microscopy of cell extraneous coats as revealed by ruthenium red staining// J. Cell. Biol. 1964. V. 23. P. 54A 55A.

163. Lund J., Woodland M.P., Dalton H. Electron transfer reactions in the soluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath)// Eur. J. Biochem. 1985. V. 147. P. 297-305.

164. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.-H. Phylogenetic oligonucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions. Syst. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. P. 593-600.

165. Matthews E., Fung I. Methane emissions from natural wetlands: global distribution, area, and environmental characteristics of sources// Global Biogeochem. Cycles. 1987. V.l. P. 61-86.

166. McConaughy B.L., Laird C.D., McCarthy B.J. Nucleic acid reassociation in formamide. Biochemistry»} 1969. V. 8. P. 3289-3295.

167. McDonald I.R., Kenna E.M., Murrell J.C. Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR// Appl. Environ.Microbiol. 1995. V.61. P. 116-121.

168. McDonald I.R., Hall G.H., Pickup R. W., and Murrell J.C. Methane oxidation potential and preliminary analysis of methanotrophs in blanket bog peat using molecular ecology techniques//FEMS Microbiol. Ecol. 1996. V. 21. P. 197-211.

169. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3218-3224.

170. McDonald I.R., Murrell J.C. The particulate methane monooxygenase genepmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs// FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 156. P. 205-210.

171. McDonald I.R., Uchiyama H., Kambe S., Yagi O., Murrell J.C. The soluble methane monooxygenase gene cluster of the trichloroethylene-degrading methanotroph Methylocystis sp. strain Mil Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 1898-1904.

172. Meyer J., Haubold R., Heyer J., Bockel W. Contribution to the taxonomy of methanotrophic bacteria: correlation between membrane type and GC-value// J. Basic Microbiol. 1986. V. 26. N 3. P. 155-160.

173. Morita R.J. Low-temperature environments. In: Lederberg J. (ed.) Encyclopedia of microbiology. 2-nd edn. 2000. Vol. 1. Academic Press, San Diego. P. 93-98.

174. Morris S.A., Radajewski S., Willison T.W., Murrell J.C. Identification of the functionally active methanotroph population in a peat soil microcosm by stable-isotope probing//Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 1446-1453.

175. Moter A., Gobel U.B. Fluorescence n situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms// J. Microbiol. Methods. 2000. V. 41. P. 85-112.

176. Murrell J.C., Dalton H. Nitrogen fixation in obligate methanotrophs// J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 3481-3486.

177. Murrell J.C., McDonald I.R., and Bourne D.J. Molecular methods for the study of methanotrophs ecology// FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 103-114.

178. Murrell J.C., Gilbert В., McDonald I.R. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase//Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 325-332.

179. Murrell J.C., Radajewski S. Cultivation-independent techniques for studying methanotroph ecology// Res. Microbiol. 2000. V.151. P. 807-814.

180. Nedwell D.B., Watson A. CH4 production, oxidation and emission in a U.K.лombrotrophic peat bog: influence of SO4 " from acid rain// Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P. 893-903.

181. Nercessian D., Upton A., Lloyd D., Edwards C. Phylogenetic analysis of peat bog methanogen populations//FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 173. P. 425-429.

182. Nguyen H.H.T., Elliott S.J., Yip J.H.K., Chan S.I. The particulate methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper-containing three-subunit enzyme isolation and characterization// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 7957-7966.

183. Oelze J., Drews G. Membranes of photosynthetic bacteria// Biochem. Biophys. Acta 1971. V. 265. P. 209-239.

184. Omelchenko M.V., Vasilyeva L.V., Zavarzin G.A. Psychrophilic methanotroph from tundra soil// Current Microbiol. 1993. V. 27. P. 255-259.

185. Orla-Jensen S. Die Hauptlinien des natiirlichen Bacteriensystems// Z. Bakteriol. Parasitenk. Abt. II. 1909. V. 22. P. 305-346.

186. Owen R.J., Lapage S.P., Hill L.R. Determination of base composition from melting profiles in dilute buffers// Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503-516.

187. Pace N.R., Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences// Advances in Microbial Ecology. 1986. V. 9. P. 1-55.

188. Pacheco-Oliver M., McDonald I.R., Groleau D., Murrell C.J., Miguez C.B. Detection of methanotrophs with highly divergent pmoA genes from Arctic soils// FEMS Microbiol. Lett. 2002. V. 209. P. 313-319.

189. Panikov N.S. Microbial growth kinetics. 1995. Chapman&Hall, Ltd., London, United Kingdom.

190. Panikov N.S. Fluxes of C02 and CH4 in high latitude wetlands: measuring, modeling and predicting response to climate change// Polar Research. 1999. V. 18 (2). P. 237-244.

191. Panikov N.S., Semenov A.M., Tarasov A.A., Belyaev A.S., Kravchenko I.K., Smagina M.V., Palejeva M.V., Zelenev V.V. and Skupchenko K.V. Methane production and uptake in soils of the European part of the USSR// J. Ecol. Chem. 1993. N.l. P. 7-18.

192. Pfennig N. Rhodopseudomonas acidophila, sp. п., a new species of the budding purple nonsulfur bacteria// J. Bacterid. 1969. V. 99. P. 597-602.

193. Prior S.D., Dalton H. Acetylene as a suicide substrate and active site probe for methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// FEMS Microbiol. Lett. 1985. V. 29. P. 105-109.

194. Quay P.D., King S.L., Lansdown J.M., Wilbur D.O. Isotopic composition of methane released from wetlands: implications for the increase in atmospheric methane// Global Biogeochem. Cycles. V. 2. No 4. P. 385-397.

195. Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. 2000. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology// Nature 2000. V. 403. P. 646-649.

196. Radajewski S., Webster G., Reay D.S., Morris S.A., Ineson P., Nedwell D.B., Prosser J.I., Murrell J.C. Identification of active methylotroph populations in an acidic forest soil by stable-isotope probing// Microbiology 2002. V. 148. P. 2331 -2342.

197. Rappe M.S., Giovannoni S.J. The uncultured microbial majority// Annual Rev. Microbiol. 2003. V. 57. P. 369-394.

198. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy// J. Cell. Biol. 1963. V.l7. P. 208-212.

199. Ribbons D.W., Michalover J.L. Methane oxidation by cell-free extracts of Methylococcus capsulatus// FEBS Lett. 1970. V. 11. P. 41-44.

200. Richardson C.J. Biogeochemical cycles: regional// Wetlands and shallow continental water bodies/ Ed. Patten B.C., SPB Acad. Publ., The Hague, 1990. P. 259-279.

201. Rosenzweig A.C., Frederick C.A., Lippard S.J., Nordlund P. Crystal structure of a bacterial non-haem iron hydroxylase that catalyses the biological oxidation of methane// Nature. 1993. V. 366. P. 537-543.

202. Roslev P., Iversen N. Radioactive fingerprinting of microorganisms that oxidize atmospheric methane in different soils// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 40644070.

203. Sabra W., Zeng A.P., Lunsdorf H., Deckwer W.D. Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenase// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 4037-4044.

204. Scott D., Brannan J., Higgins I.J. The effect of growth conditions on intracytoplasmic membranes and methane mono-oxygenase activities in Methylosinus trichosporium ОВЗЫ/J. Gen. Microbiol. 1981. V. 125. P. 63-72.

205. Segers R. Methane production and methane consumption: a review of processes underlying wetland methane fluxes// Biogeochemistry. 1998. V. 41. P. 23-51.

206. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J., Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R., Murrell J.C., Lidstrom M.E. Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs// J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 3071-3079.

207. Semrau J.D., Zolandz D., Lidstrom M.E., Chan S.I. The role of copper in the pMMO of Methylococcus capsulatus (Bath): a structural vs catalytic function// J. Inorg. Biochem. 1995. V.58. P. 235-244.

208. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Pathways of ammonia assimilation in obligate methane-utilizers//FEMS Microbiol. Lett. 1979. V.5, No 2. P. 187-191.

209. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple methabolic lesions in obligate methanotrophic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1982. V.13. No 2. P.237-242.

210. Sieburth J.M., Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M., Laux D. The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixing layer of the deep ocean: Methylomonaspelagica sp. nov. // Current Microbiol. 1987. V. 14. P. 285-293.

211. Siefert E., Pfennig N. 1979. Chemoautotrophic growth of Rhodopseudomonas species with hydrogen and chemotrophic utilization of methanol and formate// Arch. Microbiol. 1979. V. 122. P. 177-182.

212. Sizova M.V., Panikov N.S., Tourova T.P., Flanagan P.W. Isolation and characterization of oligotrophic acido-tolerant methanogenic consortia from a Sphagnum peat bogII FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V.45. P. 301-315.

213. Smith D.D., Dalton H. Solubilisation of methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)//Eur. J. Biochem. 1989. V. 182. P. 667-671.

214. Smith L.C., MacDonald G.M., Velichko A.A., Beilman D.W., Borisova O.K., Frey K.E., Kremenetski K.V., Sheng Y. Siberian peatlands a net carbon sink and global methane source since the early Holocene// Science. 2004. V. 303. P. 353-356.

215. Sohngen N.L. Uber Bacterien, welche Methan als Kohlenstoffnahrung und Energiequelle gebrauchen//Z. Bakteriol. Parazitenk. Abt. II. 1906. V. 15. P. 513-517.

216. Socolofsky M.D., Wyss O. Cysts of Azotobacter И J. Bacteriol. 1961. V. 81. P. 946954.

217. Sokolov A.P., Trotsenko Y.A. Methane consumption in (hyper)saline habitats of Crimea (Ukraine)//FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 18. P. 299-304.

218. Sorokin D.Y., Jones B.E., Kuenen J.G. An obligate methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment// Extremophiles. 2000. V.4.P. 145-155.

219. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA:DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology// Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 846-849.

220. Stahl D.A., Amann, R. Development and application of nucleic acid probes// In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York, N.Y. P. 205-248.

221. Stainthorpe A.C., Lees V., Salmond G.P.C., Dalton H., Murrell J.C. The methane monooxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath)// Gene. 1990. V. 91. P. 27-34.

222. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., Lidstrom M.E. Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath// Microbiology. 1999. V. 145. P. 1235-1244.

223. Stolyar S., Franke M., Lidstrom M.E. Expression of individual copies of Methylococcus capsulatus Bath particulate methane i^onooxygenase genes// J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 1810-1812.

224. Strom Т., Ferenci Т., Quayle J.R. The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica, and Methylosinus trichosporium OB3b during growth on methane//Biochem. J. 1974. V. 144. P. 465-476.

225. Sullivan J.P., Dickinson D., Chase H.A. Methanotrophs, Methylosinus trichosporium OB3b, sMMO, and their application to bioremediation// Critical Rev. Microbiol. 1998. V. 24. P. 335-373.

226. Sundh I., Nilsson M., Granberg G., Svensson B.H. Depth distribution of microbial production and oxidation of methane in northern boreal peatlands// Microb. Ecology. 1994. V.27. P.253-265.

227. Sundh I., Borda P., Nilsson M., and Svensson Bo H. Estimation of cell numbers of methanotrophic bacteria in boreal peatlands based on analysis of specific phospholipid fatty acids. FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 18. P. 103-112.

228. Sundh I., Mikkela C., Nilsson M., and Svensson В. H. Potential aerobic methane oxidation in a Sphagnum-dominated peatland — controlling factors and relation to methane emission// Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P. 829-837.

229. Sundh I., Nilsson M., and Borga P. Variation in microbial community structure in two boreal peatlands as determined by analysis of phospholipid fatty acid profiles// Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P. 1476-1482.

230. Takeda К. Characteristics of a nitrogen-fixing methanotroph, Methylocystis ТЛИ Antonie Leeuwenhoek. 1988. V.54. P. 521-534.

231. Taylor S.C. Evidence for the presence of ribulose-l,5-biphosphate carboxylase and phosphoribulokinase in Methylococcus capsulatus (Bath)// FEMS Microbiol. Lett. 1977. V. 2. P. 305-307.

232. Tchawa Yimga M., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., Liesack W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 5593-5602.

233. Tellez C.M., Gaus K.P., Graham D.W., Arnold R.G., Guzman R.Z. Isolation of copper biochelates from Methylosinus trichosporium OB3b and soluble methane monooxygenase mutants// Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1115-1122.

234. Tonge I.M., Higgins I J., Knowles C.J., Harrison D.E.F. Properties and partial purification of the methane-oxidizing enzyme system from Methylosinus trichosporium!I FEBS Letters. 1975. V. 58. P. 293-299.

235. Trotsenko Y.A., Shishkina V.N. Studies of phosphate metabolism in obligate methanotrophs//FEMS Microbiol. Rev. 1991. V.87. P.267-271.

236. Trotsenko Y. A., Khmelenina V. N. Biology of extremophilic and extremotolerant methanotrophs//Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 315-326.

237. Tsien H.C., Bratina B.J., Tsuji K., and Hanson R.S. Use of oligodeoxynucleotide signature probes for identification of physiological groups of methylotrophic bacteria// Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 2858-2865.

238. Tsuji К., TsienH.C., Hanson R.S., DePalma S.R., R. Scholtz, LaRoche S. 16S ribosomal RNA sequence analysis for determination of phylogenetic relationship among methylotrophs// J. Gen. Microbiol. 1990. V. 136. P. 1-10.

239. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 5// Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. P. 676-677.

240. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 15// Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. V. 34. P. 355-357.

241. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 24// Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 136-137.

242. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 35// Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P. 470-471.

243. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 64// Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 327-328.

244. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List No. 66// Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 631-632.

245. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSEM. List No. 73// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 423-424.

246. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSEM. List No. 74// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 949-950.

247. Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSEM. List No. 83// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V.51.P. 1945.

248. Vecherskaya M.S., Gal'chenko V.F., Sokolova E.N., Samarkin V.A. Activity and species composition of aerobic methanotrophic communities in tundra soil// Curr. Microbiol. 1993. V. 27. P. 181-184.

249. Ward B.B. Kinetic studies on ammonia and methane oxidation by Nitrosococcus oceanusll Arch. Microbiol. 1987. V. 147. C. 126-133.

250. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study// J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697-703.

251. Whalen S.C., Reeburgh W.S., Sandbeck K.A. Rapid methane oxidation in a landfill cover soil// Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. N. 11. P. 3405-4311.

252. Whittenbury R., Phillips K.C., and Wilkinson T.F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria// J. Gen. Microbiol. 1970a. V. 61. P. 205-218.

253. Whittenbury R., Davies S.L., Davey J.F. Exospores and cysts formed by methane-utilizing bacteria//J. Gen. Microbiol. 1970b. V.61. N2. P. 219-226.

254. Whittenbmy R. The interrelationship of autotrophy and methylotrophy as seen in Methylococcus capsulatus (Bath). In: Microbial growth on CI compounds. H. Dalton et al. (Eds.) Heyden, London. P. 181-190.

255. Whittenbury R., Dalton H. The methylotrophic bacteria. In: M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Truper, A. Balows, H.G. Schlegel (Eds.) The prokaryotes. Springer, Heidelberg. 1981. P. 894-902.

256. Whittenbury R., Krieg N.R. Family IV. Methylococcaceae In: N.R. Krieg and Holt J.G. (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology. The Williams & Wilkins Co., Baltimore. 1984. Vol. 1. p. 256-261.

257. Wise M.G., McArthur J.V., Shimkets L.J. Methylosarcina fibrata gen. nov., sp. nov. and Methylosacrina quisquiliarum sp. nov., novel type I methanotrophs// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V.51. P. 611-621.

258. Woese C. R., Stackebrandt E., Weisburg W.G., Paster B.J., Madigan M.T., Fowler V.F., Hahn C.M., Blanz P., Gupta R., Nealson K.H., Fox G.H. The phylogeny of purple bacteria: The alpha subdivision// Syst. Appl. Microbiol. 1984a. V. 5. P. 315-326.

259. Woese C. R., Weisburg W.G., Paster B.J., Hahn C.M., Tanner R.S., Krieg N.R., Koops H.P., Harms H., Stackebrandt E. The phylogeny of purple bacteria: the beta subdivision// Syst. Appl. Microbiol. 1984b. V. 5. P. 327-336.

260. Woese C. R., Weisburg W.G., Hahn C.M., Paster B.J., Lewis B.J., Маске T.J., Ludwig W., Stackebrandt E. The phylogeny of purple bacteria: the gamma subdivision// Syst. Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 25-33.

261. Woese C.R. Bacterial evolution//Microbiol. Rev. 1987. V. 51. P. 221-271.

262. Yamamoto S.J., Alcauskas J.B., Crozier Т.Е. Solubility of methane in distilled water and seawater// J. Chemical and Engineering Data. 1976. V.21. N 1. P. 78-80.

263. Yavitt J.B., Lang G.E., Downey D.M. Potential methane production and methane oxidation rates in peatland ecosystems of the Appalachian Mountains, United States// Global Biogeochem. Cycles. 1988. V.2. N.3. P. 253-268.

264. Yavitt J.B., Downey G.E., Lancaster E., Lang G.E. Methane consumption in decomposing Sphagnum-derived peat// Soil Biol. Biochem. 1990a. V.22. P. 441-447.

265. Yavitt J.B., Downey G.E., Sexstone A.J., Lang G.E. Methane consumption in two temperate forest soils// Biogeochemistry. 1990b. V.9. N 1. P.39-52.

266. Zahn J.A., DiSpirito A.A. Membrane-associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) //J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1018-1029.

267. Zehr J.P., McReynolds L.A. Use of degenerate oligonucleotides for amplification of nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodesmium thiebautiill Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 2522-2526.

268. Zhou J., Fries M.R., Chee-Sanford J.C., Tiedje J.M. Phylogenetic analyses of a new group of denitrifiers capable of anaerobic growth on toluene and description of Azoarcus tolulyticus sp. nov.//Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P.500-506.

269. Zhou J., Davey M.E., Figueras J.B., Rivkina E., Gilichinsky D., Tiedje J.M. Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA// Microbiology. 1997. V. 143. P. 3913-3919.