Новые метанотрофы и филогенетически родственные им бактерии болотных экосистем

Данилова, Ольга Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые метанотрофы и филогенетически родственные им бактерии болотных экосистем
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые метанотрофы и филогенетически родственные им бактерии болотных экосистем"

На правах рукописи

, 7

Данилова Ольга Витальевна

НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2014

005549641

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН).

Научный руководитель: доктор биологических наук,

заведующий лабораторией микробиологии болотных экосистем, ИНМИ РАН Дедыш Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник лаборатории радиоактивных изотопов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) Хмеленина Валентина Николаевна

доктор биологических наук, доцент кафедры Биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова Манучарова Наталья Александровна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный Университет

Защита состоится 25 июня 2014 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского Российской академии наук по адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН

Автореферат разослан «_» мая 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

^ Хижняк Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Метан (СН4) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и П типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986; Гальченко, 2000; Trotsenko, Murreil, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009).

Крупнейшим природным источником метана являются северные болотные экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (pH 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerirtckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al., 2008; Dedysh, 2009). Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых — способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005; Belova et al., 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013).

В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было. По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Все же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ртоА, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas- и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа (Kip et al., 20116).

Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной.

Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (К^ЬоеЬагагщ е1 а1., 2005). Последовательности генов 165 рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к А1ркарго1еоЬас1епа и филогенетически равноудален от семейств Ме1Иу1осу5(асеае и ВеуеппсЫасеае. Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам П типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.

Настоящее исследование было предпринято для восполнения вышеперечисленных пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем.

Цели и задачи исследования

Цель работы - оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в кислых сфагновых болотах, выделение и описание новых представителей болотных метанотрофов, а также филогенетически родственных им неметанотрофных организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение популяционной численности и молекулярная идентификация метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота.

2. Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рН-предпочтений и установление таксономической принадлежности.

3. Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах А1рИарго1еоЬас1епа, родственного метанотрофным бактериям семейств \iethylocystaceae и Веуегтскгасеае.

Научная новизна и значимость работы

Впервые проведена детальная оценка филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России.

Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода МеЛуЬтопаз МеЙту1отопаз ра1шИз ер. поу., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства МегкуЬэсоссасеае. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (рН 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов йв^Е и ВКМ.

Впервые из нескольких болот переходного типа получен в накопительных культурах метанотроф необычной спиралевидной формы Candidatus Methylospira palustris, представляющий новый род и вид семейства Methylococcaceae. С помощью анализа библиотек клонов генов ртоА и 16S рРНК установлено присутствие этих метанотрофов в различных местообитаниях.

Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, микроаэрофильных бактерий-бродилыциков, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость

Существенно расширена база данных последовательностей генов ртоА и 16S рРНК метанотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank.

Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды для детекции новой группы метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. 4ft Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

2. УП Молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", ИНМИ РАН, Москва, 2011.

3. 14е1 International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

4. IX Молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", ИНМИ РАН, Москва, 2013.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 4 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 119 страницах, включая 11 таблиц, 25 рисунков и списка литературы из 223 наименований, из них 20 - на русском и 203 - на английском языке.

Место проведения работы и благодарности

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2010 по 2013 годы.

Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30T и Pf56T были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва). Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а энзимологический анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения - с В.В. Кевбриным (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00768).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами исследования были образцы кислого (pH 3.8-4.7) торфа, отобранные из типичных верховых олиготрофных болот бореальной и тундровой зон России: сфагновых болот Шумново, Тарлаковский мох и Старосельский мох Тверской области, болота Обуховское Ярославской области, болота Тасин Бор Владимирской области, а также трех болот Архангельской области - Шоля, Солза и Цигломень.

Определение метанокисляющей активности. 10 г сырого торфа помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 160 мл, герметично закрывали, вводили метан до концентрации 1 ООО ррт и инкубировали при 20°С. В периодически отбираемых из газовой фазы пробах (0.5 мл) определяли концентрацию метана на хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматек», Россия) с пламенно-ионизационным детектором. На основании полученных данных рассчитывали скорость окисления метана исследуемыми образцами торфа.

Детекцию и подсчет целевых организмов проводили с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами. Для этого микробные клетки экстрагировали из образцов сфагнового торфа с использованием гомогенизатора BgMixer 100 "MiniMix" (Interseience, Франция). К 2 г сырого торфа добавляли 10-20 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали в гомогенизаторе в течение 10 минут. 0.5 мл

полученной суспензии фиксировали с использованием 4%-ого раствора формальдегида в фосфатном буфере (NaCl - 8.0 г, KCl - 0.2 г, Na2HP04 - 1.44 г, NaH2P04 - 0.2 г, Н20 -1 л, pH 7.0) в течение 1.5 часов. Образец осаждали и промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в растворе 100% этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при -20°С. 1-2 мкл суспензии фиксированных образцов наносили на стекла с окошками и проводили гибридизацию с зондами в соответствии с методикой (Stahl, Amann, 1991) при 46°С. Учет численности клеток метанотрофов I типа осуществляли путем гибридизации с эквимолярной смесью СуЗ-меченых зондов М705+М84, метанотрофов П типа - с зондом М450 (Eller et al., 2001), эубактерий эквимолярной смесью зондов Eub338-mix (Daims et al., 1999). Общую численность микроорганизмов в торфе определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК-специфчного красителя ДА ФИ (4',6'-диамидино-2-фенилиндол).

Создание олигонуклсотидпых зондов для специфической детекции целевых групп бактерий осуществляли с использованием функции "Probe Design" пакета ARB. Специфичность полученных зондов проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.rnsu.edu).

Оценку разнообразия метанотрофов в торфе болот проводили на выделенных образцах тотальной ДНК. Выделение проводили с использованием набора "FastDNA SPIN kit for soil" (Biol 101, CIIIA). Полученную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оценку общего разнообразия метанотрофных бактерий в торфе проводили путем ПЦР-амплификации фрагментов гена ртаА, кодирующего полипептид, несущий активный центр мембраной ММО для чего использовали праймеры A189f и A682r (Holmes et al., 1995). Разнообразие метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в исследуемых образцах определяли с помощью праймерных систем typelF - typeIR и MethTldF - MethTlbR, специфично амплифицирующих фрагменты (~ 660 и 900 пар нуклеотидов, соответственно) генов 16S рРНК метанотрофов I типа (Chen et al., 2007; Wise et al., 1999). ПЦР проводили на термоциклере РЕ GeneAmp PCR System 9700 («Perkin-Elmer Applied Biosystems», США). Проверку продуктов ПЦР осуществляли путём их электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-трансиллюминатора. Полученные ампликоны были клонированы с помощью набора «pGem-T Easy Vector System П» (Promega) в соответствии с рекомендацией фирмы-производителя. Отбор рекомбинантных клонов осуществляли путём амплификации клонированных фрагментов с вектор-специфичными праймерами Т7 и SP6. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора «Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System» (Promega). Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе ABI 377А («Perkin-Elmer Applied Biosystems», CIIIA). Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы SeqMan (Laser Gene 7.0; DNA Star Package). Сравнение полученных

последовательностей с таковыми в базе данных GenBank осуществляли с использованием программы Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Построение филогенетических дендрограмм производили с использованием программного пакета ARB (http://www.arb-home.de). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали с использованием программного пакета Phylip с помощью "bootstrap'-анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Определенные в работе нуклеотидные последовательности генов ртоА болотных метанотрофов депонированы в GenBank под номерами KF543822-KF543864.

Для получения накопительных культур болотных метанотрофов использовали жидкую модифицированную минеральную среду N (Kip et а!., 2011) следующего состава (г/л): К2НГО4 -0.01; KN03 - 0.02; MgS04 х 7Н20 - 0.02; СаС12 ><2Н20 - 0.02; NaCl - 0.02; 1.5 мл раствора микроэлементов для метанотрофов (Гальченко, 2000), pH 6.0-6.3. 1 г торфа вносили во флаконы общим объемом 500 мл со 50-100 мл жидкой среды вышеописанного состава. В газовую фазу флаконов вводили метан до 10-20 об. % и инкубировали их либо в статических условиях, либо на шейкере (120 об./мин) при 20°С в течение 2-3-х недель.

Объектами настоящего исследования являлись 4 штамма метанотрофных бактерий. Штамм MG30T был предоставлен И.С. Куличевской, штаммы SH10,83А5, Spl были получены автором. В работе также был использован, предоставленный И.С. Куличевской штамм Pf56T нового фототрофного организма, принадлежащего к некультивируемому кластеру бактерий, близкородственному к метанотрофам П типа.

Культивирование полученных изолятов проводили на среде М2 (Dedysh et al., 1998; штаммы MG30T, SH10, 83A5), модифицированной среде N {Ca. Methylospira palustris) и среде МЗ следующего состава (г/л): КН2Р04, 0.1; NH4CI, 0.2; MgS04 х 7Н20, 0.1; СаС12х 2Н20, 0.02; дрожжевой экстракт, 0.1; глюкоза (или малат), 0.5; 1 мл раствора микроэлементов 'SLA' (Imhoff, 2006); pH 5.8-6.0. Рост культур оценивали путем измерения оптической плотности на биофотометре Eppendorf Biophotometer AG при длине волны 600 нм. Для определения ростового диапазона и оптимума pH изолятов использовали среды, варьирование кислотности которых осуществляли путем смешивания 0.1 М растворов Н3ГО4, КН2Р04, К2НГО4, К3ГО4 без изменения ионной силы.

Таксономическое описание штаммов MG30T и Р£56т проводили путем определения их морфологических, физиологических и генотипических характеристик в соответствии с правилами Международного комитета по систематике бактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Активность окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов I и II типов в торфе.

Скорость окисления метана образцами торфа исследованных болот варьировала в диапазоне 0.04-0.60 мкг СН4 г"1 сырого торфа ч"1 (Табл. 1). Наибольшая метанокисляющая активность была зарегистрирована в торфе болота Обуховское (рН 4.2). Прямой зависимости активности окисления метана от величины рН торфа не наблюдалось. In situ гибридизация фиксированных образцов торфа со смесью флуоресцентно-меченных зондов М84+М705, специфичных для метанотрофов I типа, выявила лишь единичные клетки целевых организмов (Рис.1).

Таблица 1. Активность окисления метана и численность метанотрофов в исследованных болотных экосистемах

Болото, расположение, время отбора образцов рн Трофность болота Активность окисления метана торфом, мкг СН« г1 ч 1 Число клеток, выявленных гибридизацией с зондами на метанотрофов I (М7051-М84) и II (М450) типов, г"1 сырого торфа

М705+М84 (NxlO5) М450 (NxlO4)

Солза, Архангельская обл., N 64°48"Е 039°56' 07.2012 3.9 Олиго-мезотрофное 0.25 0.96 ± 0.32 2.02 ± 1.54

Цигломень, Архангельская обл., N 64°52', Е 40°32" 07.2012 3.9 Олиго-мезотрофное 0.47 0.96 ±0.31 2.13 ± 1.24

Шоля, Архангельская обл., N 64°53", Е 40°16" 07.2012 4.1 Олиготрофное 0.04 0.05 ± 0.03 1.18 ±0.84

Шумново, Тверская обл., N 56°42', Е 36°52' 06.2012 4.7 Олиготрофное, в районе горелого леса 0.23 0.57 ±0.23 2.46 ± 1.51

Тарлаковский мох, Тверская обл., К56°37',Е36°52' 06.2012 3.9 Олиготрофное 0.20 2.16 ± 0.73 1.73 ± 0.92

Обуховское, Ярославская обл., N 57°, Е 39° 06.2010 4.2 Олиготрофное 0.60 1.01 ± 0.42 21.40 ±5.60

Тасин Бор, Владимирская обл., N 55°36', Е 40°06' 06.2013 3.9 Олиготрофное 0.09 1.12 ±0.45 2.20 ± 1.13

Численность метанотрофов I типа в исследованных болотах была низка и варьировала в диапазоне 0.05 - 2.16><105 клеток г"1 сырого торфа, достигая максимального значения в торфе олиготрофного болота Тарлаковский мох (рН 3.9) (Табл. 1). Численность метанотрофов П типа, выявленных в исследованных болотах зондом М450, на несколько порядков превышала популяционную плотность метаноторофных представителей ОаттарШеоЬаМепа и составляла 1.18 - 21.40хЮ6 клеток на г"1 сырого торфа. Общая численность бактериальных клеток, выявленных гибридизацией со смесью зондов ЕЦВ338-гшх в торфах изучаемых болот, составляла 0.54-7.23*Ю8 клеток на г"1 сырого торфа. Таким образом, метанотрофы I типа составляли лишь 0.4-12.5% от общего числа метанотрофов или 0.004-0.4% от общей численности бактерий в сфагновых болотах, что согласуется с опубликованными ранее данными (БеаувЬ еЫ., 2001; 2003).

Рис. 1. Детекция клеток метанотрофов I типа в микробном сообществе образца сфагнового торфа болота Щумново: (А) - торфяной конгломерат с адсорбированными на нем микробными клетками в фазовом контрасте; (Б) - флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью СуЗ-меченых зондов М705+М84, выявляющих клетки метанотрофов I типа; (В) -окраска ДАФИ. Маркер - 5 мкм.

2. Состав метанотрофного сообщества сфагнового торфа по данным анализа

генов ртоА.

Для более детального анализа разнообразия метанотрофов в сфагновом торфе была использована ДНК, выделенная из образца торфа болота Шумново (рН 4.7). ПЦР-продукты, полученные с использованием праймерной системы А189Г - А682г, были клонированы и секвенированы. Сформированная библиотека включала 52 клона, четыре из которых представляли нуклеотидные последовательности гена атоА (кодирующего аммоний-монооксигеназу) и были исключены из дальнейшего анализа. Оставшиеся 48 клонированных последовательностей представляли ген мембранной метанмонооксигеназы (мММО), причем подавляющее большинство их (92%) принадлежали метанотрофам рода Ме^ЬсуБИз. Из них, 28 клонов представляли ген

— Clone Sm13

— Clone Sm12 Clon» Sm19 Clon» Sm16 СЮп» Sm25 Clon» Sm33 Clon» Sm20(5) Clon» Sm7(3) Clone Sm29 Clone Sm48 Clone Sm3 Clone Sm41 Clone Sm72 Clone Sm30

Methytocystis bryophrlla H2s'. FN422003 Clone Sm27 Clone Sm46

_ Clon,

|- Cloi l— Clo

pmoA

Methylocystrs sp M. U81596

_P- Methytocystis parvus OBBP. U31651

J1 Methytocystis echinoidos IMET10491 . AJ459000

П_(— Methytocystis hirsuta CSCY. NR_0437M

J 1 Methytocystis roseae SV97',AJ4146S6

I_(— Clone Sm11

Clone Sm18 Г™— Clone Sm4 I- Clone Sm2 J Clone Sm61 _T Clone Sm6

L|- Clone Sm10

Tj Clone Sm56 Clone Sm64 Methytocystis Heyen H2\ AM283546

--- Methytocapsa acidiphila B2'. AJ278727

Melftylocapsa aurea KVG'. FN433470

С S ь

J Clone Sm15 lone Sm17 lone Sm22 lone Sm26(2)

lured methanotroph P12.8. AY080959 uni-uiiufed melhanotropti P13.6. AY080950 j— Clone Sm52 pmoA2

J"- Clone Sm14

_P- Clone Sm37

ll- Clone Sm8

Melhyfocystis b/yophrfa H2s . H£798546 i Clone 5m24

j- Clone Sm38

LrClone SmS ■ Clone Sm1

J— MothylosinustrKhosponumSm&.hiWUtt 1 Methytosinus sponumATCC 35069 . FJ713041

■ Clone Sm55 Clone Sm40 Clone Sm9

1- Methylocystis sp. SC2. AJ431387 Methylocystis sp. Sml6. AJ544095

— Melhylocaldum graale VKM-14L , U89301 Methytocaldum szegediense OR2'. U89303 Methylogaea oryzae E10T. EU359002

MethykKOCCus capsulatus Bath. 140804

- Methylothermus thermahs MYHT'. AY829010

" Meihylohalobius cnmeensis 10Ki', AJ581836

Meihytomicrobium buryalense 58'. AÍ307139 Methytovulum mtyakonense HT12", AB501285 Methytobacter tundripaludum SV96', AJ414658

————— Methylomonas koyamae Fw12E-Y'. AB538965 Methylomonas paludis MG30', HE801217

pmoA

с s

Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа 48 аминокислотных последовательностей фрагментов PmoA метанотрофов I (выделены красным цветом) и II типа (отмечены зеленым цветом), полученных из торфа сфагнового болота Шумново, а также некоторых известных метанотрофных представителей классов Gamma- и Alphaproteobacteria. Маркер - 0.1 замещений на аминокислотную позицию.

ртоА, а 16 клонов - ген ртоА2, кодирующий мММО высокого сродства к метану (Рис. 2). Значительная часть этих последовательностей обнаруживала высокое сходство и формировала общие кластеры с генами ртоА и ртоА2 Methylocystis bryophila H2sT -типичного обитателя верховых болот (Belova et al., 2013). Метанотрофы I типа были представлены четырьмя клонированными последовательностями (8% всех клонов), формирующими компактный и филогенетически обособленный кластер. Они обнаруживали лишь отдаленное родство (66 - 84% сходства транслированных аминокислотных последовательностей гена ртоА) с известными метанотрофными гаммапротеобактериями и, по всей видимости, представляли новый род метанотрофов. Наибольшее сходство (93-95%) последовательности ртоА этой группы обнаруживали с рядом клонов, полученных ранее из болотных экосистем и осадков пресноводных озер (КС817710, AY488074, AY488072, FN597134).

3. Оценка разнообразия метанотрофов I типа в сфагновом торфе с помощью анализа генов 16S рРНК.

Для проверки предположения о существовании в исследуемом торфе метанотрофов I типа, формирующих отдельный родовой кластер в пределах семейства Methylococcaceae, нами была сформирована библиотека клонов гена 16S рРНК этих бактерий с использованием праймерной системы typelF-typeIR (Chen et al., 2007). Эта библиотека насчитывала 53 клонированных фрагмента генов 16S рРНК, однако лишь три из них (6% всех клонов) принадлежали метанотрофам I типа. Две последовательности представляли роды Methylomonas и Methylovulum (клоны SmlD и Sm6D, соответственно) (Рис. 3). Третья клонированная последовательность, Sm8D, представляла собой отдельную филогенетическую ветвь родового уровня и обнаруживала лишь отдаленное сходство (87 - 93%) с последовательностями генов 16S рРНК известных метанотрофов I типа. Остальные 50 клонированных последовательностей генов I6S рРНК, полученные ПЦР-амплификацией с праймерами typelF-typeIR, принадлежали неметанотрофным гаммапротеобактериям родов Legionella, Coxiella, Steroidobacter и Pseudomonas (24 клона), ацидобактериям (16 клонов) и некоторым представителям Firmicutes (10 клонов). По всей видимости, данная праймерная система обладает малой специфичностью и малоэффективна для анализа разнообразия метанотрофов I типа в болотных экосистемах.

Попытка использования альтернативной праймерной системы для выявления метанотрофов I типа - MethTldF и MethTlbR (Wise et al., 1999) - была нерезультативной в случае нашего исследования, так как в ПЦР с этими праймерами и ДНК из торфа продукта получено не было.

г1

— С1опе ЭтЮ

Ме1Ьу1отопаз раЫя МСЗО', НЕ801216 МеЛу/отопэв ер. М5, НМ564016

Ме^отопав коуатае Fw12Е-УТ, АВ538964

- Ме(Лу/отопа5 Ыпагит JB13, Х72778

МеМу/отопаэ всапсИпа^са, АЛ31369

МеИ1у1отаппит \/асН 1Т-4',АВ301717

МвШуЮтопаэ твтаШса Б1, АР304196

Ме1Ьу1оЬас1ег ШпйпрвЫит ЗУ96', N^042107

сг,

Мету1оЬа&ег Шив, АР304195

- С1опе ЭплвО

С1опе ЭтбО

Ме(Лу/оиА/т т/уакопепве НТ12', АВ501287

Мв№1укяп1сгоЫит кепуепэе АМ01\ N^041959

МеШу1осаШт ягедесНепве СЖ2,1189300

- Мейу/осайит дгас//е УКМ-141_', N^026063

МеЩ!одаеа огугае ЕЮ7

МеПу!ососси$ сар$и1а!из. Х72771 Ме/Лу/о«р/7аега Лалзоли АМ6, N^026033

Рис. 3. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов рРНК метанотрофов I типа, полученных из торфа сфагнового болота Щумново и некоторых охарактеризованных метанотрофных представителей Оаттарго1еоЬас1епа. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 168 рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию.

4. Выделение метанотрофных представителей Оаттарго1еоЬас1ег 'ш из сфагновых болот.

Хотя Р18Н-анализ выявил низкую численность метанотрофов I типа в сфагновом торфе, нами были предприняты попытки выделения этих микроорганизмов. Получение накопительных метанотрофных культур на среде М2 и модифицированной среде N показало, что последняя является более благоприятной для развития метанотрофов I типа. Присутствие в полученных на этой среде накопительных культурах клеток метанотрофных гаммапротеобактерий было подтверждено т «'/«-гибридизацией с зондами М84+М705. Связавшиеся с зондами клетки были представлены тремя морфотипами: собранными в цепочки палочками, крупными кокками и спирилло-подобными клетками (Рис. 4А-В).

В результате дальнейшей работы по выделению чистых культур были получены изоляты метанотрофов I типа с аналогичной морфологией клеток (Рис. 4Г-Е).

0 г/ В

го 0 4 9 " # о, * = 0 с л о 0 " V * ' о 0 сч ^ Д ° о 0 О о 0 0 о Г / о ° о 0 о и л п Е о (5 ц % ^ в 4 \ в|;|0 *

Рис. 4. Идентификация метанотрофов I типа в накопительной культуре образца торфа болота Шумново (А-В) и морфология клеток полученных изолятов (Г-Е): (А) фазовый контраст клеток накопительной культуры; (Б) флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью зондов М84+М705, (В) - окраска ДАФИ; (Г-Е) фазово-контрастные фотографии изолятов метанотрофов I типа из сфагнового торфа. Маркер - 5 мкм.

4.1. Ацидотолерантные представители рода Ме&у1отопа5.

Первым морфотипом выявленных в торфе целевых организмов были крупные палочки, собранные в цепочки и покрытые слизистыми капсулами (Рис. 4Г, Рис. 5А). Изоляты этих бактерий, штаммы МХ330Т и вНЮ, были получены из образцов торфа болот Германовское (рН 3.9) и Шумново (рН 4.7). На ультратонких срезах клеток этих бактерий отчетливо выявлялись внутрицитоплазматические мембраны, типичные для метанотрофов I типа (Рис. 5Б). Фрагмент РтоА штамма 1УКгЗОт обнаруживал 92.9-95% идентичности с аналогичными фрагментами РтоА видов рода МеьИуЬтопаз. Нуклеотадные последовательности генов 168 рРНК штаммов МШ0Т и 8Н10 были идентичны друг другу и обнаруживали 94.7-96.9% сходства с таковыми у известных представителей рода (Рис. 6). От последних болотные изоляты отличались

отсутствием подвижности, способностью расти в кислых средах и низким содержанием пар Г+Ц в ДНК (48.5 мол%). На основании этих отличий штаммы МШОт и 8Н10 были отнесены к новому виду рода Ме1ку1отопаз - Ме^уЬтопая раЫсИв эр. поу. (ОапИоуа е1 а!., 2013).

Рис. 5. Морфология и ультратонкое строение клеток штамма МОЗОТ. (А) Фазово-контрастная фотография клеток в экспоненциальной фазе роста. Для визуализации капсул использован раствор туши. Маркер - 10 мкм; (Б) Электронная микрофотография ультратонкого среза клетки, демонстрирующая расположение внутрицитоплазматических мембран, характерное для метанотрофов I типа. Маркер - 1 мкм.

МеЩотопаз теМатса 31' (АР304196) Ме^отопаэ раЫЫ Мв30т (НЕ801216)

МвЙу/ототю ¡¡р. М5 (НМ564016) ШЛу/отолаз шЬгз'(АР304194) МеМу/стопав ¡сатИпапса ЭЯ5' (АЛ31369)

Мейу/отопав коуатае М2Е-У' (АВ538964)

_10М— МеЬукттпаь аигапИаса ,№103' (Х72776)

МеМу1отопа$ Ытапт 3613" (Х7277В)

МеН1у1оЬас1ег таппиз А45Г(АР304197)

Ме%/ойайегМещАСМЗЗМ' (АР304195) МеШук>Ьас1ег ¡ипбпра1идит ЭУЭб' (AJ414655)

Ме№у(ойас(ег рзусЬгор/иТив г-00211 (АР152597) Ме0\^от1сюЫт кепуепэе АМ01г (М132384)) Мейу/от/спзЬшт ]аралвпзе N1" (089279)

ШЬу1от'1сгоЫит Ьигуа1егие 5ВТ (АР307138) Мейу|05р/1вега Ьалаэга/АМб' (1167929)

91Г- Ме^осаМит ¡е^ит ЬКб' (и89279)

_100^ - Мейу/осаИит дгасИе VKM-14L (1189298)

ШЬуЬхаМит $гед ей'егае (Ж2Т (1)89300) МеЛу/ососсив сарвЫаЫ (Х72771)

Рис. 6. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК, показывающая филогенетическое положение МеЛуЬтопая рсйискз МОЗОТ относительно других метанотрофных представителей класса Оаттарго1еоЬас1епа. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16в рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию.

Характеристика Methylomonas paludis sp. nov. (pa.lu'dis. L. gen. n. paludis -болотный). Клетки представляют собой неподвижные палочки, длиной 1.0 - 4.0 мкм и шириной 1.0 - 1.5 мкм, одиночные или собранные в цепочки, покрытые хорошо развитой слизистой капсулой. Размножаются бинарным делением. Клетки содержат ВЦМ I типа. На агаризованной среде формируют крупные округлые слизистые колонии бледно-розового цвета. Способны расти в диапазоне температур от 8 до 30°С с оптимумом - 20 - 25°С, и в диапазоне pH 3.8 - 7.3, с оптимумом при 5.8 - 6.4. Метан и метанол - единственные используемые субстраты. Метанол используется в концентрации не выше 2% (об/об), при оптимуме 0.25% (об/об). Ассимилируют С1 соединения через рибулозо-монофосфатный путь. Источники азота - нитрат, аммоний и N2. NaCl подавляет рост в концентрациях выше 0.1%. Основные жирные кислоты -С16:1й>5г, С1б:1й)8с, С\6ЛаЛс и С14:0. Типовой штамм MG30T (=DSM 24973т = VKM В-2745т) изолирован из образца торфа кислого сфагнового болота Германовское, остров Валаам, Карелия (61° 22' N; 31° 07' Е).

4.2. Представитель Ме1ку1ти1ит miyakonen.se, выделенный из кислого торфа.

Второй морфотип метанотрофов I типа, выявленный в накопительных культурах, был представлен крупными кокками диаметром 1.5-3.5 мкм (Рис. 4А, Д). Изолят соответствующего морфотипа, штамм 83А5, был получен из торфа болота Шумново (Рис. 7А). Анализ нуклеотидной последовательности гена 168 рРНК штамма 83А5 показал 99% сходства с таковой у нейтрофильного метанотрофа Мей1у1ош1ит тхуакопете НТ12т (АВ501287), выделенного ранее из образца лесной почвы (Т^исЫ е! а1., 2011). Штамм 83А5 использовал метан и метанол в качестве источников углерода и энергии и рос в диапазоне температур от 10 до 30°С. Изучение скорости роста в зависимости от рН выявило существенную разницу в отношении штамма 83А5 и

Рис. 7. Морфология и особенности роста штамма 83А5: (А) Фазово-контрастная фотография клеток в экспоненциальной фазе роста. Маркер 5 мкм; (Б) Зависимость удельных скоростей роста (р.) штаммов МОЗОТ (1) и 83А5 (2) от величины рН среды.

Мегку^топая рсйисИя МОЗО к кислотности среды (Рис. 7Б). М. рЫисйв МОЗОТ был способен развиваться при достаточно низких значениях рН (3.8-4.5) и имел оптимум роста при рН 5.8-6.4. Штамм 83А5, напротив, был неспособен расти при рН ниже 5.5 и имел оптимум роста при рН 6.5-7.0. Факт выделения этого метанотрофа из сфагнового торфа можно объяснить лишь возможностью его локального развития в отдельных слабокислых или около-нейтральных микро-нишах болотного профиля.

4.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии.

Третьим морфотипом клеток, выявленных в метанотрофных накопительных культурах гибридизацией с зондами М84+М705, были спириллы шириной 0.5-1.0 мкм и длиной 2.0-15.0 мкм (Рис. 4А-В, Е; Рис. 8). Эти клетки были подвижны за счет жгутика, расположенного на одном из полюсов клетки (Рис. 8А). До настоящего времени, метанотрофы подобной морфологии описаны не были. Смешанная культура микроорганизмов с преобладанием (60-80%) спирилло-подобных клеток была способна к устойчивому росту на минеральной среде с метаном в качестве единственного источника углерода и энергии. В контроле без метана рост данных клеток не наблюдался. При анализе ультратонких срезов спирилло-подобных клеток были выявлены стопки внутрицитоплазматических мембран, характерные для метанотрофов I типа (Рис. 8Б).

Попытки выделить спирилло-подобный метанотрофный организм в чистую культуру с помощью стандартных методов рассева на плотные среды и предельных разведений в жидких средах успеха не имели, так как эти бактерии не формировали колоний и имели низкую скорость роста по сравнению с неметанотрофными спутниками, присутствующими в культурах.

Рис. 8. Морфология и ультратонкое строение спирилловидных метанотрофов: (А) Электронные микрофотографии клеток, полученные методом негативного контрастирования. Виден полярный жгутик; (Б) Ультратонкое строение клеток. Видны внутрицитоплазматические мембраны I типа. Маркер 1 мкм.

- Methylovulum miyakonense HT12'. AB501287

- Melhylosoma difficile LC2\ NR_043562

- Melhylobacler psychrophilus Z-0021'. AF152597

— Melhylobacler tundripaludum SV96'. NR_042107 " Melhyiomicrobium alcaliphilum 20Z'. NR„044253 Melhyiomicrobium kenyense AM01*. NR_041959 _r Methylomonas paiudis МСЗй\ HE801216

Methylomonas sp. SH10

Methylomonas koyamae Fw12E-Y\ AB538964 - Methylomonas scandinavica SR5', AJ131369

Methyiomarimim vadi IT-4T, AB301717

- Methylosphaera hansoniiAM6\ U67929 Methylococcus capsuiatus Bath. NR_074213 - lake sediment clone гРВЗб, HQ33062

lake clone BSB0101-14, HQ330622

wetland clone P-R49, JN038836

-Ca. Methylospira palustris

• Melhylocaldum szegediense OR2'. U89300

- Melhylocaldum gracile VKM-14L1, U89298

Melhylocaldum lepidum LK6", U89279

Methylothermus Ihermalis MYHT'. AY829009

Methylothermus subterraneus HTM55'. AB536747 - Methylohalobius cnmeensis 10КГ, NR_042198

0.05

Рис. 9. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК нового метанотрофа Candidatus Methylospira palustris и представителей метанотрофов I типа. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию.

Для установления филогенетической принадлежности нового метанотрофа была сформирована библиотека клонов генов 16S рРНК из образца ДНК, выделенного из исследуемой смешанной культуры бактерий. Нуклеотидные последовательности более половины полученных клонов представляли собой филогенетически обособленную ветвь родового уровня в пределах семейства Methylococcaceae (Рис. 9). К этой ветви принадлежал также ряд клонов, полученных ранее в ходе молекулярных исследований из болотных экосистем, почв и осадков пресноводных озер (HQ220622, JN397719, JN038836, EU335155, Ж434189, НМ243844).

Для проверки принадлежности полученной уникальной последовательности гена 16S рРНК организмам спирилло-подобной морфологии были разработаны два флуоресцентно-меченных зонда - Sp206 (5'-CCGGCGGGAGGTCTTGCG-3') и Sp845 (5'-GCTGCGCCACTGACAGCT-3'). Гибридизация смешанной культуры с этими зондами показала специфическое связывание последних исключительно с клетками спирилло-подобной морфологии (Рис. 10).

Из ДНК исследуемой смешанной культуры были также ПЦР-амплифицированы, клонированы и секвенированы фрагменты гена ртоА. Полученные последовательности принадлежали к филогенетически обособленному кластеру клонов ртоА, обнаруженных в торфе болота Шумново (Рис. 2). Таким образом, метанокисляющие бактерии, выявленные в ходе молекулярного анализа исходного торфа, были идентифицированы в качестве новых метанотрофов спирилло-подобной морфологии.

Рис. 10. Идентификация спирилло-подобных клеток в накопительной культуре образца торфа болота Тасин бор помощью метода FISH: (А) фазовый контраст клеток смешанной культуры; (Б) флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью СуЗ-меченых зондов Sp206+Sp845; (В) - окраска ДАФИ. Маркер - 5 мкм.

Изучение ростовых характеристик нового метанотрофа в составе смешанной культуры показало его принадлежность к мезофилам (оптимум роста в диапазоне 18-30°С). Хотя оптимум pH лежал в около-нейтральном диапазоне (pH 6-6.5), эти бактерии были способны к росту и при pH 4.2-5.5. На основании данных филогении ртоА и 16S рРНК генов, а также уникальной морфологии клеток, выявленные в болотах организмы спирилло-подобной морфологии предложено описать в качестве кандидата в новый род и вид метанотрофов - Candidatus Methylospira palustris.

5. Первый представитель нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофам II типа.

В ходе анализа накопительной метанотрофной культуры, выделенной из торфа сфагнового болота Старосельский мох (pH 3.8), был получен изолят изогнутых неподвижных палочковидных бактерий, штамм Pf56T (Рис. И А). Клетки этого изолята связывались с зондом М-450, специфичным для метанотрофов П типа, вследствие чего он был предварительно идентифицирован как представитель семейства Methylocystaceae. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма Pf56T показал ее принадлежность к отдельному кластеру в предела-я Alphaproteobacteria, филогенетически равноудаленному (92.7-94.7% сходства) от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Рис. 12). Этот кластер сложен последовательностями некультивируемых организмов, полученными ранее из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Примечательно, что к этой группе некультивируемых микроорганизмов принадлежат также бактерии, описанные голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (последовательность АY163571) (Raghoebarsing et al., 2005).

Рис. 11. Морфология и ультратонкое строение клеток штамма Р^6Т: (А) Фазово-контрастная фотография клеток в экспоненциальной фазе роста. Маркер - 10 мкм. (Б) Электронная микрофотография ультратонкого среза клетки, демонстрирующая присутствие везикулярных внутрицитоплазматических мембран. Маркер - 1 мкм.

Дальнейшие исследования физиологических характеристик штамма Р£56т показали, однако, что он неспособен к росту на метане. ПЦР-тесты на присутствие в ДНК этой бактерии генов, кодирующих мембранную и растворимую метанмонооксигеназы (ртоА и ттоХ), дали отрицательные результаты. Штамм РГ56Т был также неспособен к росту на метаноле, однако использовал широкий спектр Сахаров и органических кислот, а также фитагель. Предпочтительными субстратами роста являлись глюкоза, фруктоза и ксилоза. Новый изолят рос в аэробных условиях, однако оптимальный рост (со временем генерации 30-35 час) наблюдался в микроаэробных условиях, во флаконах, наполненных жидкой средой до 9/10-х общего объема. Инкубация на свету вызывала некоторую стимуляцию (около 30%) роста культур. На ультратонких срезах клеток, выращенных на свету, были выявлены внутрицитоплазматические мембраны везикулярного типа, характерные для ряда пурпурных бактерий (Рис. 11Б). Спектральный анализ экстракта клеток, выращенных на свету, показал наличие бактериохлорофилла а (Рис. 13), тогда как в темноте образования бактериохлорофилла а не происходило.

Хотя по характеру ВЦМ и образованию бактериохлорофилла а на свету штамм РГ56Т обнаруживал сходство с пурпурными бактериями, он кардинально отличался от последних неспособностью к фототрофному росту в анаэробных условиях. Клеточные суспензии штамма РГ56Т, выращенные на свету в микроаэробных условиях были бледно-розового, а не пурпурного цвета, как это характерно для пурпурных бактерий. Анализ культуральной жидкости этих суспензий показал наличие продуктов брожения -ацетата и пропионата, а в газовой фазе флаконов происходило накопление Н2. Аналогичный спектр продуктов брожения был выявлен в культурах, выращенных в микроаэробных условиях в темноте.

92.

94,

tropical peal forest done PW265, GQ402716

- wetland soil done C.la-76, JX504960

boreal peat bog done PC-20-5, FR720624

strain Pf56T

volcanic deposit done 1700-6. AY425766 forest soa done HFC.21, FJ624894 tropical peat forest done FW362, GQ402766 boreal pest bog done P44, FR720611 tropical peat forest done PW469, GQ402819 boreal peat bog done 18, AY163571 boreal peat bog done B83. AM162440 boreal peat bog done 829, AM162438 boreal peat bog done B49, AM 162438 99r Methylocystis rosea SV97T, AJ414656

'- Methylocystis hirsute CSCf, DQ364433

100/ Methylocystis bryophila H2s'. NR_108474

Methylocyslis bryophila F10V-2a, AJ458504 Meftytocysis heyeri H2'. AM283543

Methylocyslis heyeri SakM. AM285681 Methylocystis echinddes sp. IMET10491', AJ458473 Methylocystis parvus OBBP', Y18945 Methylosinus sporium NCIMB11126', Y16946 Methylosims (richosporium ОВЗЬ', Y18947

Betjerinckia Mica subspJacficojenes DSM1719', AJ 563931 Beijerinckia Mica subsp. Mica ATCC 9039', AJ563930 Beijerinckia denii subsp. venezuelae DSM 2329', AJ563934 Beijerinckia derxS subsp. denii DSM 2328', AF563933 Beijerinckia mobilis DSM 2326'. AJ563932 Beijerinckia doebereinerae LMG 2819', EU401905 >f Methylotewla stellata SOP9, FR686344 T Methylofenila stellata AR4', FR686343

1Q0l

Methytorosuia polaris V-22', EU5S6035

100i

Methylocella tundrae CM, AJ563929 Methylocella tundrae T4', AJ555244 ~ Meihytocefe silwslns BL2', АИ91847

Г Methylocella palustris Ж. AJ563927

1- Methylocella palustris K', Y17144

Methykxapsa aurea KYG', FN433469 — Methykcapsa addiphila B2', AJ278726 100ф Meifiytovirgula figni BW863', FM252034 " Methylovirgula tigra BW872, FM252035

Methylocystaceae

Beijerinckiaceae

lOOx

Rhodoblastus sphaqnicola RS', AM040096 Rhodoblastus acidophilus DSM 137', FR733696

0.05

Рис. 12. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК штамма РГ56Т и представителей семейств МеМуЬсуяЮсеае и ВеуеппсИасеае. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16Б рРНК метанотрофов I типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию.

Поглощение 5

4 -

3 -

363

Alb

2 -

1 -

300 400 500 600 700 800 900 1000

Длина волны, nm

Рис. 13. Спектр поглощения ацетон-метанольного экстракта клеток штамма Pf56T, выращенного на свету. Пики 363 и 770 nm соответствуют бакгериохлорофшшу а.

Фототрофного роста на ацетате и сукцинате не наблюдалось. Таким образом, несмотря на синтез бактериохлорофилла а, рост штамма Pf56T в микроаэробных условиях происходил за счет брожения. Штамм Pf56T был способен к фиксации N2. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена nißi этой бактерии была наиболее близка (90-92% сходства) к таковым у представителей Rhodopseudomonas palustris. По основным физиологическим характеристикам (ростовой диапазон pH 4.0-7.0 с оптимумом при pH 5.5-6.5 и диапазон температур 15- 30°С с оптимумом при 22-28 °С) штамм Pf56T относился к умеренно ацидофильным и мезофильным микроорганизмам.

Основными жирными кислотами (ЖК) штамма Pf56T были 19:0 CYCLO coSc и 18:1<о7с. Последняя ЖК типична для многих альфапротеобактерий. ЖК 19:0 CYCLO <и8с, однако, отсутствует у представителей Methylocystaceae (Bodelier et al., 2009) и была обнаружена лишь у одного представителя Beijerinckiaceae — Metylocella tundra (Dedysh et al., 2004).

Содержание пар Г+Ц в ДНК штамма Pf56T составило 70.0 мол%, что выше такового у известных представителей Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (55-65 мол%).

Таким образом, фенотипические характеристики штамма Pf56T отличались от таковых у филогенетически родственных представителей Alphaproteobacteria. Отсутствие способности к метанотрофии не позволяет отнести его к семейству Methylocystaceae. Способность к росту в микроаэробных условиях за счет брожения отличает его от строго аэробных представителей семейства Beijerinckiaceae. От наиболее близких фототрофных организмов - пурпурных бактерий Rhodoblastus - штамм Pf56T отличается способностью к брожению и неспособностью к фототрофному росту в анаэробных условиях. На основании вышеперечисленных отличий было предложено выделить штамм Pf56 т в отдельный род и вид - Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov., принадлежащий к новому семейству - Roseiarcaceae fam. nov.

Характеристика Roseiarcus gen. nov.

Roseiarcus (Ro.se.i.ar'cus. M.L. adj. roseus, роза, розовый; L. mase. n. arcus, свод, дуга; M.L. mase. п. Roseiarcus, розовая дуга). Грамотрицательные неподвижные изогнутые палочки. Размножаются бинарным делением. При росте на свету содержат везикулярные мембраны, характерные для пурпурных бактерий, и бактериохлорофилл а. Способны использовать широкий спектр органических субстратов, в том числе сахара и органические кислоты. Микроаэрофилы, способные к медленному росту в аэробных условиях. В микроаэробных условиях растут за счет брожения. Свет стимулирует рост. Cl соединения не используют. Умеренные ацидофилы и мезофилы. Фиксируют N2. Основные жирные кислоты - 19:0 CYCLO <м8с и 18:1гу7с. Полярные липиды представлены фосфатидилхолином, фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицеролом, кардиолипином и сфингогликолипидами. Основной хинон - Q10. Принадлежат к семейству Roseiarcaceae, классу Alphaproteobacteria. Места обитания - болота и почвы. Типовой вид - Roseiarcus fermentans.

Roseiarcus fermentans sp. nov.

Roseiarcus fermentans (fer.men'tans. L. part. adj. fermentans ферментирующий). Основные характеристики указаны при описании рода. Клетки размером 2.7-4.0 мкм в длину и 0.6-1.2 мкм в ширину. Жидкая культура имеет бледно-розовый цвет при росте на свету. В темноте культура бесцветна. Спектр поглощения живых клеток имеет максимумы поглощения при 455, 489, 528, 593, 806 и 865 нм. Бактериохлорофилл а синтезируется только на свету. Основные каротиноиды представлены спириллоксантином, родопином и 3,4-дидегидрородопином. В качестве источников углерода используют глюкозу, фруктозу, ксилозу, трегалозу, малат, сукцинат, пируват, соли галактуроновой кислоты, а также фитагель. Не утилизируют метан, метанол и формиат. В качестве источников азота используют соли аммония, N2, дрожжевой экстракт, а также ряд аминокислот. Растут в диапазоне pH 4.0-7.0 (оптимум 5.5-6.5) и температуры 15-30°С (оптимум 22-28°С). NaCl подавляет рост в концентрации выше 0.5%. Содержание пар Г+Ц в ДНК 70.0 мол%. Типовой штамм Pß6T (=DSM 24875T=VKM В-2876т) выделен из кислого сфагнового болота Старосельский мох Тверской обл. (56°34' N, 32°46' Е).

Характеристика Roseiarcaceae fam. nov.

Roseiarcaceae (Ro.se.i.ar.ca'ce.ae. N.L. masc. n. Roseiarcus типовой род семейства; -aceae окончание, указывающее семейство; N.L. fem. pl. n. Roseiarcaceae - семейство рода Roseiarcus).

Грамотрицательные неспорообразуюгцие бактерии. Микроаэрофилы и аэробы. Мезофиллы, умеренные ацидофилы. Семейство Roseiarcaceae принадлежит классу Alphaproteobacteria. Типовой род - Roseiarcus.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования подтверждают опубликованные ранее данные

0 низкой популяционной численности метанотрофов I типа в сфагновых болотах (Dedysh et al., 2001, 2003). В пользу этого факта свидетельствуют как данные учета клеток этих бактерий с помощью метода FISH, так и относительно малая доля последовательностей метанотрофов I типа в библиотеках клонов генов ртоА. В некотором противоречии с этими данными находятся результаты нескольких недавних исследований разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах Европейских стран, выполненные с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования генов ртоА (Kip et al., 2011а; Bragina et al., 2012). В этих работах, существенная доля идентифицированных в торфе последовательностей ртаА принадлежала метанотрофам

1 типа. По всей видимости, в структуре метанотрофных сообществ болот густонаселенных стран могут происходить существенные изменения вследствие высокого антропогенного влияния на эти экосистемы. Такое предположение подтверждается данными сравнительного анализа состава сообществ метанотрофов в сфагновых болотах различного географического положения, выявивших значительную долю метанотрофов I типа в сообществах европейских болот и их практическое отсутствие в болотах Сибири (Kip et al., 2010). Это позволяет рассматривать метанотрофов I типа в качестве индикаторов антропогенных нарушений сфагновых болотных экосистем.

В настоящей работе были получены и детально охарактеризованы культуры болотных метанотрофов I типа, способные расти при низких значениях pH Два штамма этих бактерий были описаны в качестве представителей нового вида рода Methylomonas, Methylornonas paludis sp. nov. Это первые таксономически охарактеризованные ацидотолерантные метанотрофы в пределах Methylococcaceae. Другой метанотрофный организм, имеющий клетки спиралевидной формы и способный к росту в кислых средах был описан в качестве кандидата в новый род и вид метанотрофов - Candidates Methylospira palustris. Последовательности генов ртоА, сходные с таковой у метанотрофа-спириллы, были ранее выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из различных местообитаний (Pester et al., 2004; Kip et al., 201 la).

Факт присутствия клеток метанотрофов I типа в гиалиновых клетках сфагновых мхов впервые был установлен в лаборатории академика Г.А. Заварзина (Васильева и др., 1999). Голландским микробиологам удалось доказать тесную метаболическую связь между метанотрофами и мхами (Raghoebarsing et al., 2005). По результатам молекулярной идентификации «метанотрофы-симбионты» были определены как принадлежащие к группе ранее некультивируемых бактерий, филогенетически близких семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Полученный в настоящей работе первый изолят этой группы бактерий, вопреки ожиданиям, оказался микроаэрофилом-бродилыциком, синтезирующим бактериохлорофилл а и неспособным к росту на метане. Он был описан в качестве нового рода и вида Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Природу остальных организмов данной группы еще предстоит выяснить, однако очевидно, что в ее составе имеются неметанотрофные представители.

выводы

1. Численность клеток метанотрофов I типа, выявленных в торфе сфагновых болот гибридизацией с флуоресцентно-мечеными зондами М84+М705, составила 0.05 -2.16* 105 клеток г"1 сырого торфа, что соответствовало 0.4-12.5% от общего числа метанотрофов или 0.004-0.4% общей численности бактерий.

2. Нуклеотидные последовательности ртоА метанотрофов I типа составляли лишь 8% общего пула этих генов, выявленного в сфагновом торфе. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК выявила присутствие представителей родов Methylomonas и Methylovulum, а также метанотрофов новой филогенетической ветви родового уровня (87 - 94% сходства с последовательностями генов 16S рРНК известных метанотрофов I типа).

3. Выделенные из кислого торфа изоляты метанотрофов рода Methylomonas описаны в качестве нового вида, Methylomonas paludis sp. nov. Представители этого вида являются ацидотолерантными бактериями, способными развиваться в средах с достаточно низкими значениями pH (около 3.8-4.5), но имеющими оптимум роста в слабокислых средах с pH 5.8-6.4. Это первые таксономически охарактеризованные ацидотолерантные метанотрофы в пределах Methylococcaceae.

4. В болотах выявлены метанотрофы I типа с необычной, спиралевидной формой клеток, обнаруживающие отдаленное родство (92-94% сходства генов 16S рРНК) с ветвью родов Methylococcus-Methylocaldum. Последовательности РтоА этих бактерий формируют филогенетически обособленный кластер и обнаруживают лишь 66-84% сходства с таковыми у ранее охарактеризованных метанотрофных гаммапротеобактерий. Новые метанотрофы-спириллы условно отнесены к таксону Candidatus Methylospira palustris.

5. Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, микроаэрофильных бакгерий-бродилыциков, обладающих бактериохлорофиллом а, но не способных к фототрофному росту в анаэробных условиях, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov., который предложено отнести к новому семейству Roseiarcaceae fam. nov. Несмотря на филогенетическую близость к метанотрофам семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, эти болотные бактерии не способны к росту на С1 соединениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи

1. Danilova O.V., Kulichevskaya I.S., Rozova O.N., Detkova E.N., Bodelier P.L.E., Trotsenko YA., Dedysh S.N. (2013) Methylomonas paludis sp. nov., the first acid-tolerant member of the genus Methylomonas, from an acidic wetland. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 63: 2282-2289.

2. Данилова O.B., Дедыш C.H. (2014) Численность и разнообразие метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в северных болотных экосистемах. Микробиология, т.83 (2), с.204-214.

3. Kulichevskaya I.S., Danilova O.V., Tereshina V.M., Kevbrin V.V., Dedysh S.N. (2014). Descriptions of Roseiarcus fermentans gen. nov. sp. nov., a bacteriochlorophyll a -containing fermentative bacterium phylogenetically related to alphaproteobacterial methanotrophs, and of the family Roseiarcaceae fam. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, doi: 10.1099/ijs.0.064576-0.

Тезисы конференций

1. Kulichevskaya I.S., Danilova O.V., Dedysh S. N. Novel phototrophic bacteria are closely related to alphaproteobacterial methanotrophs. 4th Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland, 2011.

2. Данилова O.B., Куличевская И.С. Первый представитель метанотрофных бактерий I типа из сфагновых болот. Материалы VII Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, ИНМИРАН, 24-26.10.2011. МАКС Пресс, Москва. С. 69-70.

3. Danilova O.V., Dedysh S. N. Gammaproteobacterial methanotrophs are rare biosphere members in acidic wetlands of Nothern Russia. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

4. Данилова O.B. Метанотрофы Gammaproteobacteria в микробном сообществе сфагновых болот. Материалы IX Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, ИНМИ РАН. 2123.10.2013. МАКС Пресс, Москва. С. 32-34.

Формат 60x90/16. Заказ 1768. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Данилова, Ольга Витальевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

На правах рукописи

04201459226

Данилова Ольга Витальевна

НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03 — микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Д.б.н. С.Н. Дедыш

Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

Актуальность проблемы..............................................................................5

Цель и задачи работы.................................................................................6

Научная новизна и значимость работы...........................................................7

Практическая значимость............................................................................7

Апробация работы.....................................................................................................8

Публикации...............................................................................................8

Объем и структура......................................................................................8

Место проведения работы и благодарности....................................................8

Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................10

Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот...................................10

1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере................10

1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий...........................15

1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов.................................................17

1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов.................................................22

1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов........................................25

Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий...........................................................................29

2.1.Амплификация и анализ филогенетических генов.........................................30

2.2. Амплификация и анализ функциональных генов........................................32

2.3. Количественная ПЦР...........................................................................36

2.4. Микрочипы.......................................................................................37

2.5. Метод FISH........................................................................................38

2.6. Метод стабильных изотопов (SIP)...........................................................39

Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот.......................................................................................42

3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью

молекулярных методов..............................................................................43

3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных

метанотрофов..........................................................................................46

3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот...............50

Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................52

Глава 4. Объекты и методы исследования.....................................................52

4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании...........................52

4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа........................52

4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH......52

4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа....................................................52

4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами.................54

4.3.3. Использование ранее разработанных олигонукяеотидных зондов для детекции метанотрофов.......................................................................54

4.3.4. Разработка новых зондов и проверка га специфичности........................55

4.3.5. Микроскопический анализ...............................................................56

4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа..................56

4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦР-анализа..............................................................................................................56

4.4.1. Экстракция тотальной ДНК га образцов торфа.................................56

4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток.............................................56

4.4.3. ПЦР-амплификация филогенетических и функциональных генов исследуемых культур............................................................................57

4.4.4. Получение библиотек клонов геновртоА болотных метанотрофов

и генов 16SрРНКметанотрофов I типа...................................................59

4.4.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование..........................59

4.4.6. Филогенетический анализ...............................................................59

4.5. Культивирование болотных бактерий.........................................................60

4.5.1. Получение накопительных культур метанотрофов 1 типа....................60

4.5.2. Получение изолятов метанотрофов.................................................60

4.5.3. Выделение других бактерий - компонентов метанотрофных сообществ..........................................................................................61

4.6. Изучение свойств изолятов болотных бактерий.........................................61

4.6.1. Методы изучения морфологических и физиологических

характеристик....................................................................................61

4.6.2. Аналитические методы................................................................62

4.6.3. Электронная микроскопия.............................................................62

4.6.4. Этимологические исследования......................................................63

4.6.5. Определение состава хинонов.........................................................63

4.6.6. Анализы состава жирных кислот илипидов.......................................63

4.6.7. Анализ пигментов........................................................................64

4.6.8. Определение нуклеотидного состава ДНК.........................................64

4.6.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных....................64

Глава 5. Оценка активности окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов в кислых сфагновых болотах......................................65

5.1. Активность окисления СН4 сфагновым торфом........................................65

5.2. Учет клеток метанотрофов I и II типов в сфагновых болотах различного

географического положения......................................................................65

Глава 6. Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах......................................................................................................68

6.1. Состав метаногрофного сообщества по данным анализа геновртоА..............68

6.2. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов ШрРНК.............................................................................................68

Глава 7. Выделение метанотрофных представителей Саттарг(ИеоЬас(епа из сфагновых болот.................................................................................71

7.1. Представители рода МейгуЪтопаз.........................................................71

7.1.1. Морфология.......................................................................................71

7.1.2. Физиологические характеристики...................................................72

7.1.3. Пути ассимиляции углерода............................................................75

7.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов..............................76

7.2. Представители рода Ме1ку1отйит.........................................................79

7.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии................................80

7.3.1. Морфология................................................................................80

7.3.2. Анализ филогенетической принадлежности.......................................81

7.3.3. Разработка и применение зондов для детекции нового метанотрофа спирилло-подобной морфологии........................................................................82

7.3.4. Анализ функциональных генов.........................................................83

7.3.5. Физиологические характеристики...................................................84

Глава 8. Выделение первого представителя нового филогенетического кластера организмов в пределах А1р!гарго(еоЬа&ег'ш, родственного метанотрофам II типа..............................................................................85

8.1. История выделения и первичный анализ.................................................85

8.2. Изучение морфо-физиологических особенностей......................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................95

ВЫВОДЫ.................................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................98

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Метай (CIL)) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и II типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986; Гальченко, 2000; Trotsenko, Murreil, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009).

Крупнейшим природным источником метана являются северные болотные экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (pH 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лег позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al., 2008; Dedysh, 2009). Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых - способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005; Belova et al., 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013).

же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ртоА, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas- и Methylovuhim-nojxo6ubix бактерий из кислого торфа (Kip et al., 20116). Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной.

Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.

Цели и задачи исследования

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Определение популяционной численности и молекулярная идентификация

метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота.

2. Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рИ-предпочтений и установление таксономической принадлежности.

3. Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофным бактериям семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Научная новизна и значимость работы

Впервые проведена комплексная оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России.

Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода Methylomonas - Methylomonas paludis sp. nov., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства Methylococcaceae. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (pH 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, микроаэрофильных бактерий-бродилыциков, Roseiarcus fermentam gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость

Существенно расширена база данных последовательностей генов ртоА и 16S рРНК метапотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

2. VII Молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", ИНМИ РАН, Москва, 2011.

3. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

4. IX Молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", ИНМИ PAII, Москва, 2013.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 4 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации

Место проведения работы и благодарности

Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С.

т г

Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30 и РГ56 были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва). Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а

энзимологичсский анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения — с В.В. Кевбриным (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот.

Метанотрофы представляют собой уникальную группу прокариотных микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана (СН4) в качестве единственного источника углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murreil, 2008). Первый мстаиотроф был описан в 1906 году немецким исследователем Зенгеным, который выделил с поверхности растений пресноводного пруда бактерию, способную расти на метане, и назвал ее 'Bacillus methanicus'' (Söhngen, 1906).

Метанотрофы играют ключевую роль в глобальных циклах углерода и азота. Не менее важное свойство данных организмов заключается в способности к деградации опасных загрязнителей (Singleton et al., 2007), что побуждает ученых более внимательно взглянуть на них как на потенциальные агенты биоремедиации загрязненных тер

Информация о работе

Данилова, Ольга Витальевна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Новые метанотрофы и филогенетически родственные им бактерии болотных экосистем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы