Фенотипическое разнообразие и функциональный потенциал метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae

Воробьев, Алексей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипическое разнообразие и функциональный потенциал метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическое разнообразие и функциональный потенциал метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae"

На правах рукописи

Ои-з

Воробьев Алексей Викторович

ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕТАНО- И МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА ВЕиЕИШСКМ СЕЛЕ

Специальность 03.00.07 - микробиология

1 з ш ш

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003483230

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Н. Дедыш

доктор биологических наук Д.Ю. Сорокин

доктор биологических наук А.Л. Степанов

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится «30» ноября 2009 г. в 1200 ч. на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан «_» октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /у/Ц . Т.В. Хижняк

Актуальность проблемы.

Аэробные метано- и метилотрофные бактерии - это уникальные группы прокариотных микроорганизмов, способных использовать метан и его одноуглеродные производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Söhngen, 1906; Anthony, 1982; Whittenbury, Krieg, 1984; Hanson, Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Lidstrom, 2006). Ключевым ферментом метанотрофов является метанмонооксигеназа (ММО), катализирующая окисление СН4 до СН3ОН и существующая в двух формах - мембранной (мММО) и растворимой (рММО). Окисление метанола до формальдегида осуществляется другим ключевым ферментом - метанолдегидрогеназой (МДГ), которым обладают как метанотрофы, так и метилотрофные бактерии. Эти микроорганизмы формируют естественный бактериальный фильтр, регулирующий поступление метана в атмосферу, а также определяют баланс Сгсоединений в природных экосистемах (Заварзин, 1979,1984; Conrad, 1996).

Метилотрофия широко распространена среди представителей различных филогенетических групп домена Bacteria, тогда как способность к росту на метане на настоящий момент выявлена лишь у организмов двух групп, Proteobacteria и Verracomicrobia (Hanson, Hanson, 1996; Op den Camp et al., 2009). Метанотрофные Verrucomicrobia открыты недавно, и сведения об их биологии пока ограничены. Гораздо лучше изучены метанотрофные представители Proteobacteria, формирующие филогенетически тесные кластеры в пределах Alpha- и Gammaproteobacteria и не обнаруживающие близкого родства с гетеротрофными бактериями. Единственным исключением является семейство Beijerinckiaceae класса Alphaproteobacteria, которое объединяет умеренно ацидофильные, аэробные бактерии с различными типами метаболизма - гетеротрофов, метано- и метилотрофов. С момента формирования (Alston, 1936; Starkey et al., 1939) и до недавнего времени все представители этого семейства считались гетеротрофными азотфиксаторами, использующими широкий спектр органических соединений. Эти представления изменились после описания умеренно ацидофильных метанотрофных бактерий родов Methylocella и Methylocapsa, которые оказались ближайшими филогенетическими родственниками гетеротрофов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2000, 2002). Единственный описанный представитель рода Methylocapsa, Methylocapsa acidipMla, является облигатным метанотрофом, обладающим мММО. Род Methylocella ныне насчитывает три вида, М. palustris, М. silvestris и М. tundrae (Dedysh et al., 2000, 2004, Dunfíeld et al, 2003), представители которых, в отличие от остальных ныне известных метанотрофов, обладают одной только рММО. Еще одной уникальной для метанотрофов особенностью бактерий рода Methylocella является их способность к росту не только на С i-соединениях, но и на ацетате, пирувате, сукцинате, малате и этаноле (Dedysh et al., 2005а; Theisen et al., 2005). Представления о метаболическом потенциале бактерий рода Beijerinckia также были пересмотрены после выявления у В. mobilis способности к автотрофной

метилотрофии (Dedysh et al., 20056). Итак, в настоящий момент семейство Beijerinckiaceae включает в себя истинных гетеротрофов, облигатных метанотрофов, а также организмы с различными типами "промежуточного" метаболизма -факультативных метано- и метилотрофов.

Применение молекулярных подходов для изучения экологии микроорганизмов выявило чрезвычайно широкое распространение представителей Beijerinckiaceae. Это объясняется тем, что большинство наземных экосистем Северного полушария характеризуются кислой реакцией среды, к которой хорошо адаптированы организмы этого семейства. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК представителей Beijerinckiaceae были обнаружены в лесных почвах и почвах агроценозов, в болотах различных типов, а также в покрывающих почвах свалок (Radajewski et al., 2000, 2002; Morris et al., 2002; Knicf et al., 2003; Raghoebarsing et al., 2005; Lau et al., 2007; Cebron et al., 2007; Chen et al., 2007, 2008). Анализ этих последовательностей, однако, не позволяет сделать однозначных заключений о метаболическом типе тех организмов, которым они принадлежат, из-за гетерогенности этой группы бактерий. Количество культивируемых метилотрофных представителей этого семейства также очень мало, что объясняется, в частности, сложностью работы по их выделению.

Таким образом, микробные агенты окисления Ci-соединений в кислых наземных экосистемах остаются изучены недостаточно. Устранению этого пробела было посвящено настоящее исследование, направленное на расширение спектра культивируемых метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae и изучению их метаболического потенциала и особенностей биологии.

Цели и задачи исследования.

Цель работы - изучение фенотипического и филогенетического разнообразия метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae и выявление различий в метаболическом потенциале и экологических стратегиях бактерий этой группы. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Получение новых изолятов метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae, изучение их физиологии, спектра используемых субстратов, а также составление полной таксономической характеристики этих бактерий.

2. Определение функционального потенциала и ростовых характеристик облигатно- и факультативно- метанотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae для вьивления различий экологических стратегий, используемых этими организмами.

3. Оценка роли факультативных метанотрофов в общей структуре бактериального метанокисляющего фильтра болотных экосистем.

Научная новизна и значимость работы.

Значительно расширено разнообразие культивируемых представителей семейства Beijerinckiaceae с метано- и метилотрофными типами метаболизма.

Показано, что эти бактерии широко распространены в наземных экосистемах с кислой реакцией среды. Впервые выявлен существенный вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность торфа сфагновых болот.

Описан и узаконен новый род и вид облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae - Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov. Два новых таксона факультативно метанотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae ■ 'Methyloferula sphagni' gen. nov., sp. nov. и 'Methylocapsa aurea' sp. nov. находятся в процессе узаконивания. Типовые штаммы этих бактерий депонированы в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ, NCIMB, LMG и ВКМ.

Практическая значимость.

Показано широкое распространение факультативной метаногрофии в микробном мире, что вносит коррективы в ранее принятое представление о том, что доступность СН4 является единственным энергетическим фактором, регулирующим процессы его микробного окисления в природе.

Существенно дополнена база данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, рпюА, ттоХ, mxaF и niJH метилотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Получены новые культуры ацидофильных метанотрофных микроорганизмов, обладающих растворимой формой ММО, имеющих хороший потенциал для применения в биотехнологии очистки кислых природных сред от загрязнения галогенированными алканами и ароматическими углеводородами.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных к российских конференциях и симпозиумах:

1. Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии: III Международная молодежная школа-конференция», Москва, ИНМИ РАН, 2007.

2. 12th International Symposium on Microbial Ecology, Cairns, Australia. August 17-22, 2008.

3. XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, МГУ, 2009.

4. 3th Congress of European microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и 5 тезисах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на _131_страницах, включая _9_ таблиц, _37_ рисунков и списка литературы из _176_ наименований, из них _12_ - на русском и _164_ - на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем отдела Микробных сообществ Учреждения Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН с 2006 по 2009 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш.

Образцы торфа болот различного географического расположения были предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской, к.б.н. Т.А. Панкратовым (ИНМИ РАН), а также отобраны самим автором.

Исследованные в работе изоляты метано- и метилотрофных бактерий были получены и предоставлены автору д.б.н. С.Н. Дедыш (ИНМИ РАН), P. Dunfield (University of Calgary, Canada), L. Folman (NIOO-KNAW, The Netherlands), а также были выделены самим автором. Исследования ультратонкого строения клеток метилотрофов были проведены совместно с к.б.н. Н.И. Сузиной (ИБФМ РАН, г. Пущино). Анализ ферментного состава метилотрофных бактерий был проведен д.б.н. Дорониной Н.В. (ИБФМ РАН, г. Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б.П. Баскуновым (ИБФМ РАН, г. Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены к.б.н. E.H. Детковой (ИНМИ РАН).

Работа была выполнена при финансировании в рамках программ Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Биоразнообразие», проекта РФФИ-ННИО 09-04-91332, а также работ по Гос. контракту с Роснаукой № 02.740.11.0023.

Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и акад. Г.А. Заварзину за полезные практические советы и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Образцы торфа для получения накопительных культур метано- и метилотрофов, а также для количественного учета клеток этих микроорганизмов были отобраны из сфагновых болот Торфяное, Архангельской обл. (65°0Ш, 35°44'Е), и Бакчарское, Томской обл. (56051'N, 82°51'Е).

Накопительные культуры метанотрофных бактерий получали путем инокулирования торфом жидкой минеральной среды М2 (pH 5.0-5.5) следующего состава (г/л): MgS04x7H20-0.05; КН2Р04-0.1; СаС12х2Н20-0.01; NaCl-0.02; раствор микроэлементов для метанотрофов (Гальченко, 2001) - 1мл. В качестве источника

азота в среду вносили (г/л): (NH4)2S04-0.05, KNO3-O.I или же использовали среду М2 без источника связанного азота. Для культивирования метилотрофных бактерий в среду добавляли метанол в концентрациях 0.01-5 об. %, тогда как для метанотрофов в газовую фазу опытных флаконов вводили метан до 10-20 об. % и инкубировали их в статических условиях или на шейкере (120 об./мин.). Чистые культуры метано- и метилотрофных бактерий выделяли путем многократных рассевов на плотной среде М2 с высокоочищенным агар-агаром, Gellun Gum или PhytaGel, или методом предельных разведений в жидких средах вышеуказанного состава.

Объектами настоящего исследования являлись 8 штаммов метано- и метилотрофных бактерий. Штаммы KYG и LAY были предоставлены Р. Dunfíeld (University of Calgary, Canada), штаммы BW863 и BW872 - L. Folman (NIOO-KNAW, The Netherlands), штамм AR4 - Дедыш C.H. (ИНМИ РАН). Штаммы SOP9, RP01 и ESY были выделены автором работы.

В качестве тест-организмов использовали культуры Beijerinckia indica (АТСС 9039Т), Beijerinckia mobilis (DSM 2326т), Methylocapsa acidiphila (DSM 13967х), Methylocella palustris (АТСС 700799T), Methylocella silvestris (DSM 15510х) и Methylocella tundrae (DSM 15673 T).

Культивирование изолятов проводили на вышеописанной среде М2, а также на пятикратно разведенной среде NMS (Dunfíeld et al., 2003). Динамику роста культур прослеживали путем определения оптической плотности суспензий на Eppendorf Biophotometer (длина волны 600 нм). Для определения ростового диапазона и оптимума pH изолятов использовали среды, варьирование кислотности которых осуществляли добавлением 0.1М растворов H2S04 и NaOH. Активность окисления метана образцами торфа и чистыми культурами метанотрофных бактерий определяли газохроматографически на хроматографе Кристалл 5000 ("ЗАО Хроматэк", Россия) с пламенно-ионизационным детектором.

Выделение ДНК из клеток микроорганизмов производили по ранее описанной методике (Dedysh et al., 1998). В ходе работы производили ПЦР-амплификацию фрагментов следующих филогенетических и функциональных генов метано- и метилотрофов: а) гена I6S рРНК изолятов с использованием универсальных праймеров, предложенных Weisburg et al. (1991); б) гена ртоА, кодирующего полипептид, несущий активный центр мембраной ММО (Holmes et al., 1995; Kolb et al., 2005); в) гена ттоХ, кодирующего а-субчастицу растворимой ММО (Auman et al., 2000); г) гена mxaF, кодирующего большую субъединицу МДГ (McDonald, Murrell, 1997); д) гена nifH, кодирующего редуктазный компонент нитрогеназного комплекса (Auman et al., 2001; Булыгина и др., 2002). ПЦР реакции проводили на термоциклере РЕ GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США). Проверку продуктов ПЦР осуществляли путем их электрофореза в 1.1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-трансиллюминатора.

Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей

осуществляли с использованием программы SeqMan (Lasergene 7.0; DNA Star Package). Сравнение полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank проводили с использованием программы Blast2 (http://www.ebi.ac.uk/blast2/). Построение филогенетических дендрограмм производили с использованием программного пакета ARB (http://www.arb-home.de'). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали с использованием программного пакета Phylip с помощью "bootstrap''-анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Поиск уникальных последовательностей в 16S рРНК новых изолятов метанотрофных бактерий и создание олигонуклеотидных зондов для их детекции осуществляли с использованием функции "Probe Design" пакета ARB. Специфичность зондов проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu). Синтез зондов, меченых флуоресцентным красителем СуЗ, осуществлялся компанией "Синтол" (Москва, Россия).

Экстракцию микробных клеток из сфагнового торфа для дальнейшего анализа методом FISH проводили с использованием гомогенизатора BagMixer 100 "MiniMix" (Interscience, Франция) и прилагающихся к нему стерильных пакетов BagFilter®. К 2 г торфа добавляли 20 мл стерильной дистиллированной воды, обрабатывали с помощью гомогенизатора в течение 10 минут при максимальной частоте. Затем отбирали 0.5 мл полученной суспензии и фиксировали с использованием 4%-го раствора формальдегида в фосфатном буфере (NaCl - 8.0 г, KCl - 0.2 г, Na2HP04 -1.44 г, NaII2P04 - 0.2 г, Н20 - 1 л, pH 7.0) в течение 1.5 часов. Образец осаждали и промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в растворе 100% этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при 20°С.

Для гибридизации использовали набор 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов: зонды для детекции метанотрофов I и II типов (Eller et al., 2001), зонды для дифференцированной детекции метанотрофов группы Methylocystis-Melhylosinus, а также бактерий родов Methylocapsa и Methylocella (Дедыш, 2006). Гибридизацию препаратов с зондами проводили в соответствии с методикой Stahl & Amann (1991) при температуре 46°С или 50°С. Общую численность микробных клеток в торфе определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК-специфичного красителя ДАФИ (4',6'-диамидино-2-фенилиндол).

Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Йена, Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для СуЗ-меченных зондов и Zeiss 02 для окраски ДАФИ. Определение численности целевых групп в образцах торфа и почвы осуществляли путем учета количества гибридизованных с зондами клеток в 100 полях зрения, с последующим расчётом численности популяций на 1 г влажного торфа.

Результаты исследований

1. Новые изоляты облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae.

1.1. Изоляты, выделенные из кислой лесной почвы.

В ходе изучения микробного сообщества, участвующего в разложении древесины бука в кислой (рН 3.3-3.6) лесной почве, L. Folman, сотрудницей лаборатории W. de Boer (NIOO-KNAW, The Netherlands) было выделено 2 штамма ацидофильных бактерий - BW863T и BW872 (Folman et al., 2008). Анализ последовательностей гена 16S рРНК изолятов выявил их принадлежность к семейству Beijerinckiaceae, причем ближайшим филогенетическим родственником штаммов BW8637 и BW872 из числа ранее описанных организмов была ацидофильная облигатно метанотрофная бактерия Methylocapsa acidiphila В2 (96.5-97% сходства последовательностей гена 16S рРНК) (Рис. 1). Так как для дальнейшей характеристики новых изолятов требовалось их детальное сравнение с М. acidiphila В2, культуры новых штаммов было переданы для изучения в лабораторию микробиологии болотных экосистем ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, где была выделена и описана вышеупомянутая метанотрофная бактерия.

100

F Methylocella tundrae

100

98 f

- Methylocella sllvestris BL2

100 I—

-1/ Methylocella palustris

Штамм LAY Штамм SOP9 Штамм AR4T

100 r

/ Beijerinckia spp.

f Штамм BW863* Штамм BW872 Штамм ESY Штамм RP01 Штамм KYG1 Methylocapsa acidiphila B2T

Methylosinus/Methylocystis spp.

0.05

Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК представителей семейств Веуегтскшсеае и МеАуЬсу^июеае. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 168 рРНК метанотрофов I типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию. Жирным шрифтом показаны штаммы, исследованные в настоящей работе.

Эксперименты по определению спектра утилизируемых субстратов показали, что, несмотря на близкое родство с Methylocapsa acidiphila В2, штаммы BW863T и BW872 не были способны к использованию метана, но хорошо росли на метаноле в диапазоне концентраций 0.01-2 об. % с оптимумом 0.5-1 об. %.

Анализ гена mxaF, кодирующего большую субъединицу МДГ, выявил, что последовательности MxaF новых штаммов существенно отличались от всех описанных ранее последовательностей MxaF культивируемых метилотрофов (Рис. 2). Однако они обнаруживали высокое сходство (95.6-97.5%) с транслированными аминокислотными последовательностями генов mxaF, выявленными методом стабильных изотопов (SIP) в кислых лесных почвах, обогащенных 13СН3ОН (Radajewski et al., 2000, 2002) и принадлежащими ранее некультивируемой группе ацидофильных метилотрофов.

Methytocella silvestris

Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа транслированных аминокислотных последовательностей гена mxaF, показывающая филогенетическое положение штаммов BW863T и BW872 относительно других метилотрофных представителей Proteobacteria и последовательностей MxaF, выявленных в кислых почвах методом стабильных изотопов. Маркер, 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

Штаммы В\У863Т и В\У872 были представлены грамотрицательными клетками палочковидной формы, размножающимися бинарным делением. Размер клеток составлял 1.2-2.5 мкм в длину и 0.4-0.65 мкм в ширину (Рис. 3). Клетки, выращенные на плотной среде, имели тонкие пили-подобные структуры диаметром 5 нм (Рис. 36.).

Рис. 3. (а) Фазово-контрастная фотография клеток штамма В\¥863т в 10-суточиой жидкой культуре на среде с метанолом, (б-г) Электронные микрофотографии ультратонких срезов клеток, выращенных на агаризованной среде. ПГБ, поли-р-гидроксибутират; П, пили-подобные структуры. Маркеры - 5 мкм (а); 0.5 мкм (б-г).

Кроме метанола, эти изоляты хорошо росли на этаноле (Рис. 4). Слабый рост наблюдался также на малате, сукцинате и пирувате, однако штаммы не росли на ацетате, сахарах и других полиуглеродных соединениях. Штаммы Ви'вбЗ7 и В%'872 являлись мезофильными и облигатно ацидофильными организмами, способными к росту при рН 3.1-6.5 и в диапазоне температур от +4 до +30°С, причем оптимальный рост наблюдался при рН 4.5-5.0 и в интервале температур 15-18°С (Рис. 5 А, Б).

В составе клеточных жирных кислот у штаммов В\У863Т и В\¥872 доминировали 18:1ш7с кислоты, что характерно для представителей родов МеЛу1осе11а и МеЛу1осар5а (Табл. 1).

Анализ морфологических, хемотаксономических и генотипических характеристик новых изолятов позволил установить их принадлежность к новому роду и виду семейства ВеуеппсМасеае - Ме№у1оу1г^1а \igni £еп. поу., ер. поу (УогоЬ'еу й а!., 2009).

-А—ацетат малат ж пируват -в—сукцинат —о—этанол —•—метанол А контроль

Сутки

Рис. 4. Рост штамма В\У863тна средах с разными источниками углерода.

Рис. 5. Зависимость удельной скорости роста штамма В\У863Т от величины рН (А) и температуры (Б) при росте на среде с метанолом.

Характеристика Methylovirgula gen. nov. (Me.thy.lo.vir'gu.la. N.Gr. n. methyl от Gr. n. methu, вино и Gr. n. hulé, дерево, метальная группа; L. fem. n. virgula, маленькая палочка; N.L. fem. n. Methylovirgula, метилотрофная палочковидная клетка). Одиночные, образующие розетки или скопления неправильной формы грамотрицательные палочки. Размножаются бинарным делением. Колонии выпуклые, непрозрачные, кремово-белые, диаметром 0.5-1 мм, плотной консистенции с ровным краем и гладкой поверхностью. Рост в жидких средах гомогенный. Аэробные, ограниченно факультативные метилотрофы. Предпочтительный субстрат - метанол. Наблюдается рост на этаноле, а также слабый рост на малате, пирувате, и сукцинате. Облигатные ацидофилы и мезофилы. Чувствительны к концентрациям NaCl выше 0.7%. Основной хинон - менахинон Q-10. Доминирующая жирная кислота -18:1су7с. Содержание пар Г+Ц в ДНК 61.8-62.8 моль %. Род принадлежит к классу Alphaproteobacteria, семейству Beijerinckiaceae. Типовой вид - Methylovirgula ligni.

Таблица 1. Состав клеточных жирных кислот новых метило- и метанотрофных бактерий, выделенных из сфагнового торфа и кислой лесной почвы, а также ранее описанных представителей родов Ме1Иу1осе11а и МеНгуЬсаряа.

Кислота % общего содержания жирных кислот

Метилотрофы Метанотрофы

Methylovirgula ligni (BW863tH BW872) *** 'Methyloferula sphagni' (AR4T, SOP9)*** Methylocapsa spp. (M acidiphila B2*, KYG***) Methylocella spp.** (M. palustris, M. silvestris, M. tundrae)

14:0 0 0.23-0.28 0 0-4.1

¡15:0 0 0.73-0.85 0.1-0.3 0.2-1.2

16:0 1.80-1.96 7.89-5.05 5.9-7.3 3.0-7.7

16:1 wie 0.33-0.36 1.82 4.7-6.3 4.7 -11.3

16:ltw7i 0 0 0 0-5.8

а17:0 0-0.21 0 0 0-0.3

17:0 0.53-0.64 0 0.1 0-0.1

¡17:0 0-0.23 0.66-0.87 0.6-0.9 0-2.5

brl7:0 0.23-0.25 0 0 0

су 17:0 0-0.18 1.85 0 0-6.5

M:\mlc 0.16-0.19 0.28 1.0 0

¡18:0 0 0.43 0 0-0.5

18:0 0.831-0.9 0.61 0.8-7.6 0.4-1.2

18:1üj9C 0-0.41 0.32-0.42 0-0.4 0

18:Шс 0 0 0 0

18:1 ml с 87.07-92.76 83.22-85.69 78.3-81.5 59.2-82.2

cyl9:0 1.39-2.57 0 0 0

cyl9:l®8c 0 1.32-3.77 0 0 -13.6

20:0 0.11-0.13 0.58 0 0

* Данные Dedysh et al. (2002).

** Данные Dedysh et al. (2000,2004a) и Dunfield et al. (2003). *** Определено в настоящем исследовании.

Methylovirgula ligni sp. nov. Methylovirgula ligni (lig'ni. L. gen. n. ligni, из дерева, изолирован из древесины). Основные характеристики указаны при описании рода. Размер клеток 1.2-2.5 мкм в длину и 0.4-0.65 мкм в ширину. Источники азота -аммоний, нитрат, дрожжевой экстракт и мочевина. Нуждаются в дрожжевом экстракте в качестве фактора роста (50 мг/л среды). Растут при температуре от 4 до

30°С, с оптимумом при 15-18°С, и в диапазоне рН 3.1-6.5, с оптимумом при 4.5-5.0. Местообитания - болота и почвы с низкими значениями рН. Типовой штамм В\У863Т (=Э5М 19998т = N01МВ 14408т), изолирован из разлагающейся древесины бука, инкубированной на поверхности кислой лесной почвы.

1.2 Изоляты, выделенные из сфагновых болот.

В ходе дальнейшей работы из кислых сфагновых болот нами было выделено 2 штамма метилотрофных бактерий, ЯР01 и ЕБУ, гены 16Б рРНК которых обнаруживали 98.5-99% сходства с таковыми у штаммов ВХУЯбЗ1 и В\У872 (Рис. 1). Штаммы [1Р01 и ЕБУ были представлены грамотрицательными клетками палочковидной формы, размножающимися бинарным делением. Размер клеток штамма КР01 достигал 1.25-2.6 мкм в длину и 0.4-0.7 мкм в ширину, то есть был сходным с таковым у штаммов В\У863Т и В\У872. Размеры клеток штамма ЕБУ были значительно меньше и варьировали в зависимости от условий культивирования. При росте в оптимальных условиях размеры клеток составляли 0.25-0.6x0.4-2.1 мкм, а средний объем клеток был равен 0.15 мкм3. При росте в неоптимальных условиях или на субстратах, не являющихся предпочтительными, клетки штамма ЕБУ были короче (0.4-1.5 мкм) (Рис. 6), а их объем варьировал в диапазоне 0.02-0.09 мкм3, что позволяет отнести их к категории ультрамикроформ (МогПа, 1981,1985,1997).

Рис. 6. Электронно-сканирующая микрофотография клеток штамма ESY. Маркеры - 5 мкм.

Штаммы RP01 и ESY являлись аэробными метилотрофными бактериями, предпочтительным источником углерода и энергии для которых являлся метанол. Он использовался в диапазоне концентраций от 0.01 до 3 %, с оптимумом при 0.1-0.5%. Помимо метанола, новые изоляты обнаруживали слабый рост на этаноле, малате, валерате и капронате (Рис. 7). Таким образом, спектр утилизируемых штаммами RP01 и ESY субстратов отличался от такового у штаммов BW8631 и BW872.

Рис 7. Рост штамма ESY на средах с разными источниками углерода.

Штаммы RP01 и ESY являлись ацидофильными организмами, способными к росту при рН от 4 до 7, с оптимумом при рН 4.7-5.3. Они росли в диапазоне температур от +4 до +30°С, с оптимумом при 18-22°С. Ингибирование роста происходило при содержании NaCI > 0.7 %. Содержание пар Г+Ц в ДНК - 60.6 моль %. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов BW8637 и ESY составлял 35%, что свидетельствует о принадлежности последнего к новому виду рода Methylovirgula.

Таким образом, можно заключить, что метшотрофныв бактерии рода Methylovirgula населяют кислые наземные экосистемы различных типов и представляют ранее некультивируемую группу бактерий, важная роль которых в процессе окисления метанола в данных местообитаниях была установлена молекулярными методами.

2. Новые факультативно метанотрофные бактерии семейства Beijerinckiaceae.

2.1. Метанотрофы с растворимой формой ММО.

Из образцов торфа двух сфагновых болот бореальной зоны России - болота Торфяное, Архангельской обл. и болота Бакчарское, Томской обл. - были получены стабильные метанотрофные сообщества, из которых были выделены 2 штамма

метанотрофных бактерий - AR4T и SOP9, соответственно. Еще один штамм - LAY -был выделен P. Dunfield из кислой лесной почвы около Марбурга, Германия. Все три

штамма представляли собой образующие розетки клетки палочковидной формы размером 1.1-2.9 мкм в длину и 0.4-0.65 мкм в ширину (Рис. 8а). Анализ ультратонких срезов клеток, выращенных на метане, продемонстрировал отсутствие внутрицитоплазматических мембран (Рис. 8в), что характерно только для

факультативных метанотрофов рода Methylocella, обладающих растворимой ММО. Однако морфология клеток новых изолятов была принципиально отлична от таковой у Methylocella spp. (Рис. 86).

Рис. 8. Морфология клеток штамма ЛК4Т (а) по сравнению с МеЛу1осеИа эрр. (б). Ультратонкое строение клеток штамма АГ14Т (в). Маркеры - 2 мкм.

—»—Метан -о—Контроль —•— AR4 -о—Контроль

Рис. 9. Рост штамма AR4T на метане в качестве единственного источника углерода и энергии. Черные круги - рост штамма AR4' на метане (OD6oo)> черные квадраты -убыль субстрата (метана), белые круги - рост в контроле без метана, белые квадраты -динамика концентрации метана в контрольном варианте без бактериальной культуры.

Ближайшими филогенетическими родственниками штаммов LAY, AR4T и SOP9 оказались метанотрофы рода Methylocella и гетеротрофы рода Beijerinckia (96-96.5% сходства последовательностей гена 16S рРНК) (Рис. 1). Подобно Methylocella spp., новые изоляты были способны расти на метане как единственном источнике углерода и энергии (Рис. 9).

Попытки амплифицировать ген ртоА, кодирующий полипептид, несущий активный центр мембраной ММО, со всеми ныне разработанными парами праймеров результата не дали. Подобно представителям Methylocella spp., у новых изолятов

присутствовала только растворимая форма этого фермента, что было подтверждено амплификацией гена тгпоХ, кодирующего а -субчастицу растворимой ММО (Рис. 10). Среди известных метанотрофов, последовательности ттоХ новых изолятов были наиболее близки таковым у рода Methylocella, но формировали отдельный кластер, обнаруживая высокое сходство с группой последовательностей ттоХ клонов, полученных ранее из кислых болот различных типов (Chen et al, 2008).

Methylocella siivestris

Methylocella tundrae T4

- Acidic peat dona MHPC12

...... Acidic peat clone MHPC16

r- Acidic peat cloneMHPC6

'— Acidic peat clone MHPE9

■ Methylocella palustris К

Штамм LAY Штамм SOP9 ■ Штамм AR4'

415

~ 111

0.05

Methylocystis sp. M Methylosinus sp. LW4 Methylosinus sporium SC8 Methylosinus sporium D15

Methylosinus trichosporium OB3 Methylosinus trichosporium KS1 Methylocystis sp. 51 Methylocystis sp. LR1

Рис. 10. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена ттоХ, показывающая положение новых штаммов AR4T, LAY и SOP9 относительно некоторых метанотрофных представителей Proteobacteria, а также последовательностей, выявленных в кислых болотах молекулярными методами (Chen et al., 2008). В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов ттоХ метанотрофов I типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию.

Помимо метана, штаммы хорошо росли на метаноле, а также обнаруживали способность к росту на некоторых органических кислотах: ацетате, малате, пирувате и сукцинате. Таким образом, спектр субстратов, используемых штаммами AR4T, LAY и SOP9, был близок к таковому у представителей рода Methylocella. Единственным отличием явилось отсутствие роста новых изолятов на этаноле.

Штаммы AR4T, LAY и SOP9 являлись мезофильными и ацидотолерантными организмами, растущими в диапазоне температур от +4 до +33°С и при рН от 3.5 до 7.2. Оптимальный рост наблюдался при 20-23°С и при рН 4.8-5.2 (Рис. 11 А, Б).

По сравнению с представителями Methylocella spp., новые изоляты являлись более ацидотолерантными организмами. Кроме того, они оказались первыми известными факультативными метанотрофами, способными к росту при рН ниже 4. Отличия в морфологии клеток, спектре используемых субстратов, ростовом диапазоне значений рН, составе клеточных жирных кислот (Таблица 1) и генотипических характеристиках позволили предложить описать штаммы AR4T, LAY

и S0P9 в качестве нового рода и вида семейства Beijerinckiaceae - 'Methyloferula sphagni' gen. nov., sp. nov.

Рис. 11. Зависимость удельной скорости роста штамма AR4T от величины рН (А) и температуры (Б). Для сравнения пунктирной линией и белыми кругами показана зависимость удельной скорости роста Methylocella spp. от величины рН.

Характеристика 'Methyloferula' gen. nov. Methyloferula (methyl от Gr. n. methu, вино и Gr. n. hule, дерево, метальная группа; L. fern. n. ferula, палочка; N.L. fem. n. Methyloferula, метилотрофная палочковидная клетка).

Одиночные грамотрицательные клетки палочковидной формы, образующие розетки или скопления неправильной формы. Размножаются неравномерным делением. Колонии выпуклые, непрозрачные, кремово-белые, диаметром 0.3-1.2 мм, плотной консистенции, с ровным краем и гладкой поверхностью. Рост культур в жидких средах гомогенный, но в старых культурах наблюдается образование хлопьев. Аэробные факультативные метанотрофы с растворимой формой ММО. Предпочтительный субстрат - метанол. Способны использовать ряд органических кислот: ацетат, малат, пируват, сукцинат. Ацидотолерантные, мезофильные организмы. Чувствительны к концентрациям NaCl выше 0.7%. Преобладающие жирные кислоты - 18:1<»7с и су 19:1 а&с. Содержание пар Г+Ц в ДНК 55.6-57.5 моль %. Род принадлежит к классу Alphaproteobacteria, семейству Beijerinckiaceae. Типовой вид - Methyloferula sphagni.

'Methyloferula sphagni' sp. nov. Methyloferula sphagni (sphag'ni. L. gen. n. sphagni, из сфагнума, изолирован из сфагнового торфа). Основные характеристики указаны при описании рода. Размер клеток 1.1-2.9 мкм в длину и 0.4-0.65 мкм ширину. Источники азота - аммоний, нитрат, дрожжевой экстракт и мочевина. Не нуждаются в факторах роста. Растут при температуре от 4 до 33°С и в диапазоне рН 3.5-7.2. Оптимальный рост при 20-23°С, и при рН 4.8-5.2. Местообитания - болота и почвы с низкими значениями рН. Типовой штамм AR4T (ВКМ В-25431), изолирован из кислого сфагнового болота Торфяное Архангельской обл. (65°01Т<1, 35°44'Е).

2.2. Новые метанотрофы с мембранной формой ММО.

Еще один изолят факультативно метанотрофной бактерии, штамм КУОт был выделен Р. ОипйеЫ из осадков ручья в лесном массиве близ Марбурга, Германия. Ближайшим филогенетическим родственником (98% сходства последовательностей гена 16Б рРНК) этого изолята являлся облигатный метанотроф МеЛуЪсарьа аЫШркПа В 2 (Рис. 1). Морфологически, штамм КУОт представлял собой короткие изогнутые палочки с биполярно расположенными гранулами поли-Р-гидроксибутирата (Рис. 12а, б). Клетки содержали стопки хорошо развитых внутрицитоплазматических мембран, что характерно и для М. acidiph.Ua (Рис. 126).

Рис. 12. Морфология и ультратонкое строение клеток штамма КУСТ: (а) фазово-контрастная микрофотография клеток, маркер - 2 мкм; (б) электронная микрофотография ультратонкого среза клетки, маркер - 1 мкм.

Предпочтительным источником углерода и энергии для штамма KYGT являлся метан. Однако, в отличие от М. acidiphila, у нового изолята была обнаружена способность к росту не только на С [-соединениях, метане и метаноле, но также на ацетате (Рис. 13). Факультативные метанотрофы рода Methylocella, не имеющие мембранной формы ММО, также способны к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005). Однако, в отличие от представителей Methylocella spp., которые предпочитают расти на ацетате, штамм KYGT гораздо лучше рос на метане (ODmax=1.2, ju=0.018 час"1), чем на ацетате (OD1Tm=0.3, ц=0.006 час"1). Новый изолят обладал только мембранной формой ММО. Сравнительный анализ гена ртоА показал, что последовательности РтоА штамма KYGT наиболее близки транслированным аминокислотным последовательностям ртоА Methylocapsa acidiphila В2 (Рис. 14).

На основании анализа морфологических, хемотаксономических и генотипических характеристик было предложено отнести новый изолят к новому виду рода Methylocapsa - 'Methylocapsa aurea' sp. nov.

Характеристика Methylocapsa aurea sp nov. Methylocapsa aurea (au're.a. L. fem. adj. aurea золотой, желтый цвет колоний). Грамотрицательные палочковидные клетки

10 12 14

~ér~ КОНТРОЛЬ

Сутки

Рис. 13. Рост штамма КУСтна средах с разными источниками углерода.

0.10

-bacterium V4 "Methylaridiphilum inlemorum" pmoAí

-bacterium V4 ^Methylacidiphilum internorunf pmoA2

611 Methylomonas melhan/ca S1

l-1- Meihyiobacter psychrophiius Z-00215

'- Melhylomicrobium buryalense 5B*

- Methylocaldum gracile NCIMB 11912* Methylococcus capsulalus Bath

Methylohalobius crimeensis 10Kir Nitrosococcus oceani C-107r

991- Methylocystis sp. SC2 pmoA2

"i- Methylosinus sporium 20/3 pmoA2

88,— Methylocystis sp. SC2. pmoA 1 67M— Methylocystis heyeri H2' ~~V- Methylosinus sporium 20/3, pmoA 1

— Methylosinus trichosporium OB3bT 991- uncultured bacterium peat soil

991 '- uncultured bacterium, soil

uncultured bacterium, forest soil о", uncultured bacterium, peat soil ЭРГ"*- uncultured bacterium, soda lake бОГТ— Штамм KYG'

<- Methylocapsa acidiphila B2'

uncultured bacterium, soil

Verrucomicrobia

^ Метанотрофы I типа

)■ Метанотрофы II типа

> Группа Methylocapsa

Рис.

14. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного транслированных аминокислотных последовательностей гена ртоЛ штамм; других метанотрофов. Маркер, 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.

размером 0.7-1.2 мкм на 1.8-3.1 мкм, содержащие стопки ВЦМ и биполярно расположенные гранулы поли-|3-гидроксибутирата. Колонии желтоватого цвета. Используют метан, метанол и ацетат. Источника азота - аммоний, нитрат, мочевина, Ь-пролин, Ь-аланин, Ь-аргинин, пептон и дрожжевой экстракт. Фиксируют молекулярный азот посредством кислород-чувствительной нитрогеназы. Оптимальный рост при значениях температуры 25-30°С и рН 6.0-6.2. Рост ингибируется при содержании №С1 в среде выше 0.2-0.3%. Преобладающая жирная кислота - 18:1(у7с. Содержание пар Г+Ц в ДНК 60.2 моль %. Типовой штамм КУСТ (НОБМ 22158х =УКМ В-2544т), выделен из кислой лесной почвы окрестностей Марбурга, Германия.

3. Оценка роли факультативных метанотрофов в общей структуре метанокисляющего фильтра болотных экосистем.

3.1 Численность факультативных метанотрофов родов Methylocella и 'Methyloferula' в сфагновом торфе.

Для целей детекции in situ новых факультативных метанотрофов рода 'Methylofei-ula' был разработан зонд Mfer-431 (5-TTCCCGGGCAAAAGAGCT-3), который был применен для определения численности целевой популяции в образцах торфа, отобранных из слоя 0-10 см болота Бакчарское, Томской области. Новый зонд использовали в сочетании с ранее предложенными для метанотрофов олигонуклеотидными зондами разного уровня специфичности (см. Материалы и методы). Общая численность выявленных в образцах метанотрофных бактерий варьировала от 4.6x106 до !.4х107 клеток г"1 торфа, составляя до 15% общего числа I

клеток бактерий. Численность метанотрофов I типа (гибридизация с зондами М84 + М705) была незначительной (0.3 - б.ЗхЮ5 клеток г"1 торфа). Обнаруженные в торфе метанотрофы II типа были представлены двумя группами: MethylosimislMethylocystis (детекция зондом М-450) и Methylocella/Methylocapsa (зонды Mcell-1026/Mcaps-1032). В составе сообщества доминировали представители группы Methylosinus/Methylocystis, составляя до 76% клеток всех метанотрофов. Численность клеток рода Methylocapsa составляла около 1% общего числа метанотрофов. Применение нового зонда Mfer-431 показало, что численность ' Methyloferula sphagni' достигает 3.5х 106 клеток г"1 торфа. Таким образом, доля факультативных метанотрофов родов Methylocella и 'Methyloferula' составляла 20-25% всех метанотрофных бактерий, выявленных в торфе методом FISH (Рис. 14).

■ Метанотрофы I типа □ Methylocapsa spp. ИЗ Метанотрофы II типа Э Methylocella spp. ш 'Methyloferula sphagni'

Рис. 14. Соотношение численности клеток отдельных групп метанотрофных бактерий, выявленных методом FISH в образцах сфагнового торфа болота Бакчарское.

3.2 Вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность сфагнового торфа.

Особенность регуляции окисления метана у факультативных метанотрофов с растворимой ММО (Methylocella и 'Methyloferula') состоит в ингибировании активности ММО при наличии в среде органических субстратов роста, например, ацетата (Dedysh et al., 2005; Theisen et al., 2005). Это дает возможность оценить вклад этих факультативных метанотрофов в общую активность окисления метана в сфагновом торфе путем внесения ацетата. Результаты такого модельного эксперимента показаны на Рис. 15. Как видно на графике, внесение ацетата в образец сфагнового торфа до концентрации 0.5 мМ вызывало снижение общей скорости окисления метана в 2 раза, свидетельствуя о переключении факультативных метанотрофов с метанотрофного типа метаболизма на гетеротрофный. Таким образом, вклад факультативных метанотрофов с растворимой формой ММО в общую активность окисления метана в кислых экосистемах может быть весьма значительным. Возможно также, что разнообразие этих организмов не исчерпывается представителями родов Methylocella и ' Methyloferula', и существуют бактерии с аналогичным типом метаболизма, которые не выявляются ныне имеющимися олигонуклеотидными зондами.

Рис. 15. Влияние внесения ацетата (показано стрелкой) на активность окисления СН4 в образцах сфагнового торфа. Черные круги - динамика убыли метана в образцах торфа без ацетата, белые круги - динамика убыли метана в образцах после внесения ацетата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование значительно расширило разнообразие известных представителей семейства ВеуегтсИасеае и показало, что эти бактерии являются функционально-значимым компонентом микробного сообщества кислых наземных экосистем. Уникальность этого семейства состоит в том, что оно объединяет филогенетически близкородственные организмы (с уровнем сходства генов 16Б рРНК 96% и выше), обладающие различными типами метаболизма - от типично гетеротрофного до облигатно метанотрофного (Таблица 2). Это обстоятельство делает невозможным установление способности микроорганизма из Веуегтскгасеае к использованию С [-соединений на основании одних только данных анализа генов 168 рРНК и требует обязательной идентификации функциональных генов, кодирующих ММО или МДГ.

Выделенные и охарактеризованные в настоящем исследовании микроорганизмы - два новых рода и три новых вида - представляют собой метано- и метилотрофные бактерии, ближайшими филогенетическими родственниками которых являются метанотрофы родов Ые1ку\осарт и МеМуЬсеЦа, а также гетеротрофы рода Ве]егтск'ш. Эти бактерии хорошо адаптированы к существованию при низких значениях рН, характерных для большинства наземных экосистем Северного полушария. Представители вновь описанного рода 'Ме1ку1о/еги1а' обладают одной только растворимой формой ММО, а предпочтительными субстратами этих организмов являются метанол и ряд органических кислот. Наличие последних в среде ингибирует окисление метана. Другая группа метанотрофов семейства ВеуегтсШсеае, представленная родом МеЛу1осарва, характеризуются обладанием только мембранной формой ММО и предпочтением метана в качестве ростового субстрата. Тем не менее, в отсутствие метана эти метанотрофы способны к медленному росту на ацетате. Таким образом, разнообразие метаболических подтипов метанотрофных бактерий в природе оказалось шире такового, представленного ранее в культурах коллекций. Вклад облигатно- и факультативно метанотрофных бактерий в суммарную активность окисления метана в различных экосистемах еще предстоит оценить, но настоящее исследование показывает, что вклад факультативных метанотрофов может быть весьма существенен в местообитаниях с кислой реакцией среды.

Таблица 2. Дифференцирующие характеристики представителей семейства Beijerinckiaceae.

Характернсти ка ВеЦеппск'ш Methylovir-guía 'Meíhyloferula' МеАгуЬсарха МеЛу1осе11а

Морфология клеток Биполярные прямые или изогнутые палочки Прямые или изогнутые палочки Прямые или изогнутые палочки Изогнутые кокковидные клетки Биполярные прямые или изогнутые палочки

Размер клеток, мкм 0.5-1.5 х 1.7-4.5 0.4 - 0.65 х 1.2-2.5 0.4 - 0.65 х 1.1-2.9 0.7-1.2 х 0.8-3.1 0.6-1.0 х 1.0-2.5

Образование розеток - + + - -

Тип метаболизма Гетеротрофия или метил отрофия Факультати вная метилотроф ия Факультативная метанотрофия Облигатная или факультативн ая метанотрофия Факультативная метанотрофия

Рост на метане - - + + +

Форма ММО - - рММО мММО рММО

Используемые органические субстраты Сахара, орг. кислоты, спирты Этанол, пируват, сукцинат, малат Ацетат, пируват, сукцинат, малат Нет или ацетат Ацетат, пируват, сукцинат, малат, этанол

Потребность в факторах роста - + - - -

Рост при: 35°С рН 7.0 рН 3.5 0.5% №С1 + + + + + + + + + +

Содержание в+С (мол%) 54.7-59.1 61.8-62.8 55.6-57.5 57.3 60-63.3

выводы

1. Расширено таксономически охарактеризованное разнообразие метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae, включающего филогенетически близкие организмы с различными типами метаболизма. В отличие от семейств Methylococcaceae и Methylocystaceae, установление способности микроорганизма из Beijerinckiaceae к использованию С ^соединений невозможно на основании одних только данных анализа генов 16S рРНК.

2. Выделенные из кислой почвы штаммы облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий описаны в качестве нового рода и вида Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov. Они являются первыми представителями выявленной ранее молекулярными методами некультивируемой группы метилотрофных бактерий, осуществляющих окисление метанола в кислых почвах.

3. Три штамма факультативно метанотрофных бактерий с растворимой формой ММО, изолированные из сфагновых болот и кислой почвы, предложено описать в качестве нового рода и вида 'Methyloferula sphagni' gen. nov., sp. nov. Эти организмы являются единственными ныне известными факультативными метанотрофами, способными к росту при значениях pH ниже 4.

4. Один штамм факультативно метанотрофных бактерий с мембранной формой ММО предложено описать в качестве нового вида рода Methylocapsa, 'Methylocapsa aurea' sp. nov. Впервые показана способность использования ацетата в качестве субстрата роста представителями рода Methylocapsa, ранее считавшимися облигатными метанотрофами.

5. Выявлена высокая численность и установлен значительный вклад факультативных метанотрофов с растворимой формой ММО в общую активность окисления метана в кислых сфагновых болотах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Воробьев А.В., Дедыш С.Н. Использование накопительных культур для оценки структуры сообществ метанотрофов: проблема репрезентативности результатов. Микробиология, 2008, Т. 77, № 4, С. 566-569.

2. Vorob'ev А.V., de Boer W., Folman L.B., Bodelier P.L.E., Doronina N.V., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov., an obligately acidophilic, facultatively methylotrophic bacterium with highly divergent mxaF gene. Int J Syst Evol Microbiol, 2009, V. 59 (10), p. 2538 - 2545.

3. Dunfield P.F., Belova S.E., Vorob'ev A.V., Cornish S.L., Dedysh S.N. Methylocapsa aurea sp. nov., a facultatively methanotrophic bacterium possessing a particulate methane monooxygenase. Int J Syst Evol Microbiol (submitted).

1. Воробьев A.B., Дедыш С.Н. Эмиссия метана и численность метанотрофных бактерий в различных локусах сфагнового болота: влияние доминирующих растительных ассоциаций. Материалы II Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН. 1-3.11.2007. МАКС Пресс, Москва. С. 58-60.

2. Vorob'ev A.V., de Boer W., Dedysh S.N. Characterization of novel acidophilic methylotrophic bacteria with highly divergent mxaF genes. 12th International Symposium on Microbial Ecology. August 17-22, 2008, Cairns, Australia. Abstract book, p.35.

3. Vorob'ev A.V., Glagolev M.V., Dedysh S.N. Methane fluxes and methanotroph community structures in wetland sites with different vegetation covers. 12th International Symposium on Microbial Ecology. August 17-22, 2008, Cairns, Australia. Abstract book, p.202.

4. Воробьев A.B. Новые метило- и метанотрофные бактерии из кислых наземных экосистем бореальной зоны. Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2009», Секция Биология». М. МГУ. 2009.

5. Vorob'ev A.V., Dedysh S.N. Novel facultatively methanotrophic bacteria from acidic sphagnum weatlands. 3 Congress of European microbiologists. June 28 - July 2, 2009, Gothenburg, Sweden. Abstract book, p. 183.

Тезисы

Заказ № 127-а/10/09 Подписано в печать 23.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

¿FN ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

\ www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьев, Алексей Викторович

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна и значимость работы.

Практическая ценность.

Апробация работы.

Публикации.

Объем и структура.

Место проведения работы и благодарности.

Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Метан и метанол: круговорот в биосфере и экологическое значение.

ГЛАВА 2. Аэробные метилотрофные бактерии.

2.1. Общая характеристика.

2.2. Энергетический метаболизм метано- и метилотрофов.

2.3. Конструктивный метаболизм метано- и метилотрофов.

2.4. Биохимическая основа облигатной метанотрофни.

2.5. Методы оценки разнообразия и распространении метилотрофных бактерии.

ГЛАВА 3. Общая характеристика семейства Beijerinckiaceae.

3.1. Род Beijerinckia: история, таксономия и физиология.

3.2. Открытие способности к метилотрофии в семействе Beijerinckiaceae.

3.3. Роль метано- н метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae как компонентов микробного сообщества природных экосистем и как объектов для анализа эволюционной основы облигатной метанотрофии.

3.3.1. Роль представителей Beijerinckiaceae как агентов окисления метана.

3.3.1:1. Кислые торфяные болота.

3.3.1.2. Кислые почвы.

3.3.2. Роль представителей Beijerinckiaceae как агентов фиксации азота.

3.3.3. Изучение эволюционной основы облигатной метанотрофии путем сравнительного анализ геномов представителей Beijerinckiaceae.

Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Получение накопительных культур и изолятов метано- и метилотрофных бактерий.

4.1.1. Образцы торфа.

4.1.2. Методика получения накопительных культур.

4.1.3. Методика получения изолятов метано- и метилотрофов.

4.2. Составление таксономической характеристики изолятов.

4.2.1. Методы исследования морфологических и физиологических характеристик культур.

4.2.2. Аналитические методы.

4.2.3. Электронная микроскопия.

4.2.4. Энзимологические исследования.

4.2.5. Определение состава хипонов.

4.2.6. Анализы состава жирных кислот и лшшдов.

4.2.7. Экстракция ДНК из микробных клеток.

4.2.8. Определения пуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК гомологии.

4.2.9. ПЦР-амплнфикация.

4.2.10. Редактирование полученных нуклеотндных последовательностей.

4.2.11. Фотодокументирование материалов и обработка данных.

4.3. Оценка численности метанотрофных бактерии в болотах с использованием метода FISH.

4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа.

4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами

4.3.31 Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов.

4.3.4. Разработка новых олигонуклеотидных зондов и проверка их специфичности.

4.3.5. Микроскопический анализ.

4.3.6. Детекция и учет клеток метанотрофов в нативных образцах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Новые изолнты облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae.

5.1. Изоляты, выделенные из кислой лесной почвы.

5.1.1. Морфология.

5.1.2. Физиологические характеристики.

5.1.3. Пути ассимиляции углерода.

5.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов.

5.2. Штаммы, выделенные из сфагновых болот.

5.2.1. Морфология.

5.2.2. Физиологические характеристики.

5.2.3. Анализ филогенетических и функциональных генов.

Глава 6. Новые факультативно метаногрофные бактерии семейства Beijerinckiaceae.

6.1. Метанотрофы с растворимой формой ММО.

6.1.1. Морфология.

6.1.2. Физиологические характеристики.

6.1.3. Анализ филогенетических и функциональных генов.

6.2. Новые метанотрофы с мембранной формой ММО.

6.2.1. Морфология.

6.2.2. Физиологические характеристики.

6.2.3. Анализ филогенетических и функциональных генов.

Глава 7. Оценка роли факультативных метанотрофов в общей структуре метанокисляющсго фильтра болотных экосистем.

7.1. Численность факультативных метанотрофов родов

Methylocella и Methyloferula в сфагновом торфе.

7.2. Вклад факультативных метанотрофов в общую метанокисляющую активность сфагнового торфа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипическое разнообразие и функциональный потенциал метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae"

Актуальность проблемы.

Аэробные метано- и метилотрофные бактерии - это уникальные группы прокариотных микроорганизмов, способных использовать метан и его одноуглеродные производные в качестве единственного источника углерода и энергии (Sohngen, 1906; Anthony, 1982; Whittenbury, Krieg, 1984; Hanson, Hanson, 1996; Bowman, 2000; Гальченко, 2001; Lidstrom, 2006). Ключевым ферментом метанотрофов является метаимонооксигеназа (ММО), катализирующая окисление СН4 до СН3ОН и существующая в двух формах, мембранной (мММО) и растворимой (рММО). Окисление метанола до формальдегида осуществляется другим ключевым ферментом, метанолдегидрогеназой (МДГ), которым обладают как метанотрофы, так и метилотрофные бактерии. Эти микроорганизмы слагают естественный бактериальный фильтр, регулирующий поступление метана в атмосферу, а также определяют баланс Ci-соединений в природных экосистемах (Заварзин, 1979, 1984; Conrad, 1996).

Метилотрофия широко распространена среди представителей различных филогенетических групп домена Bacteria, тогда как способность к росту на метане на настоящий момент выявлена лишь у организмов двух групп, Proteobacteria и Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1996; Op den Camp et al., 2009). Метанотрофные Verrucomicrobia открыты недавно, и сведения об их биологии пока ограничены. Гораздо лучше изучены метанотрофные представители Proteobacteria, формирующие филогенетически тесные кластеры в пределах Alpha- и Gammaproteobacteria и не обнаруживающие близкого родства с гетеротрофными бактериями. Единственным исключением является семейство Beijerinckiaceae класса Alphaproteobacteria, которое объединяет умеренно ацидофильные, аэробные бактерии с различными типами метаболизма - гетеротрофов, метано- и метилотрофов. С момента формирования (Alston, 1936; Starkey et al., 1939) и до недавнего времени все представители этого семейства считались гетеротрофными азотфиксаторами, использующими широкий спектр органических соединений. Эти представления изменились после описания умеренно ацидофильных метанотрофных бактерий родов Methylocella и Methylocapsa, которые оказались ближайшими филогенетическими родственниками гетеротрофов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2000, 2002). Единственный описанный представитель рода Methylocapsa, Methylocapsa acidiphila, является облигатным метанотрофом, обладающим мММО. Род Methylocella ныне насчитывает три вида, М. pahistris, М. silvestris и М. tundrae (Dedysh et al., 2000, 2004, Dunfield et al., 2003), представители которых, в отличие от остальных ныне известных метанотрофов, обладают одной только рММО. Еще одной уникальной для метанотрофов особенностью бактерий рода Methylocella является их способность к росту не только на Сi-соединениях, но и на ацетате, пирувате, сукцинате, малате и этаноле (Dedysh et al. 2005а; Theisen et al., 2005). Представления о метаболическом потенциале бактерий рода Beijerinckia также были пересмотрены после выявления у В. mobilis способности к автотрофной метплотрофии (Dedysh et al., 20056). Итак, в настоящий момент семейство Beijerinckiaceae включает в себя истинных гетеротрофов, облигатных метанотрофов, а также организмы с различными типами "промежуточного" метаболизма — факультативных метано- и метилотрофов.

Применение молекулярных подходов для изучения экологии микроорганизмов выявило чрезвычайно широкое распространение представителей Beijerinckiaceae. Это объясняется тем, что большинство наземных экосистем Северного полушария характеризуются кислой реакцией среды, к которой хорошо адаптированы организмы этого семейства. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК представителей Beijerinckiaceae были обнаружены в лесных почвах и почвах агроценозов, в болотах различных типов, а также в покрывающих почвах свалок (Radajewski et al., 2000, 2002; Morris et al. 2002; Knief et al., 2003; Raghoebarsing et al., 2005; Lau et al., 2007; Cebron et al., 2007; Chen et al., 2007, 2008). Анализ этих последовательностей, однако, не позволяет сделать однозначных заключений о метаболическом типе тех организмов, которым они принадлежат, из-за гетерогенности этой группы бактерий. Количество культивируемых метилотрофных представителей этого семейства также очень мало, что объясняется, в частности, сложностью работы по их выделению.

Таким образом, микробные агенты окисления С i-соединений в кислых наземных экосистемах остаются изучены недостаточно. Устранению этого пробела было посвящено настоящее исследование, направленное на расширение спектра культивируемых метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae и изучению их метаболического потенциала и особенностей биологии.

Цель и задачи исследования.

2. Определение функционального потенциала и ростовых характеристик облигатно- и факультативно- метанотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae для выявления различий экологических стратегий, используемых этими организмами.

Научная новизна и значимость работы.

Значительно расширено разнообразие культивируемых представителей семейства Beijerinckiaceae с метано- и метнлотрофными типами метаболизма. Показано, что эти бактерии широко распространены в наземных экосистемах с кислой реакцией среды. Впервые выявлен существенный вклад факультативных метанотрофов в общую метанокнсляющую активность торфа сфагновых болот.

Описан и узаконен новый род и вид облигатно ацидофильных метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae - Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov. Два новых таксона факультативно метанотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae 'Methyloferula sphagni' gen. nov., sp. nov., и 'Methylocapsa aurea' sp. nov. находятся в процессе узаконивания. Типовые штаммы этих бактерий депонированы в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ, NCIMB, LMG и ВКМ.

Практическая значимость.

Показано широкое распространение факультативной метанотрофии в микробном мире, что вносит коррективы в ранее принятое представление о том, что доступность СН.) является единственным энергетическим фактором, регулирующим процессы его микробного окисления в природе.

Существенно дополнена база данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, ртоА, ттоХ, mxaF и nifH метилотрофных бактерий, которая может быть использована для разработки молекулярных методов детекции этих микроорганизмов, основанных на использовании ПЦР или микрочипов.

Апробация pa6oibi.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

2. 12th international symposium on microbial ecology, Cairns, Australia. August 17-22, 2008.

3. XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, МГУ, 2009.

4. 3th Congress of European microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и 5 тезисах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 129 страницах, включая 9 таблиц, 37 рисунков и списка литературы из 177 наименований, из них 13 — на русском и 164 — на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Воробьев, Алексей Викторович

выводы

1. Расширено таксономически охарактеризованное разнообразие метано- и метилотрофных представителей семейства Beijerinckiaceae, включающего филогенетически близкие организмы с различным типом метаболизма. В отличие от семейств Methylococcaceae и Methylocystaceae, установление способности микроорганизма из Beijerinckiaceae к использованию Сi-соединений невозможно на основании одних только данных анализа генов 16S рРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование значительно расширило разнообразие известных представителей семейства Beijerinckiaceae и показало, что эти бактерии являются функционально-значимым компонентом микробного сообщества кислых наземных экосистем. Уникальность этого семейства состоит в том, что оно объединяет филогенетически близкородственные организмы (с уровнем сходства генов 16S рРНК 96% и выше), обладающие различными типами метаболизма - от типично гетеротрофного до облигатно метанотрофного (Таблица 9). Это обстоятельство делает невозможным установление способности микроорганизма из Beijerinckiaceae к использованию Ci-соединений на основании одних только данных анализа генов 16S рРНК и требует обязательной идентификации функциональных генов, кодирующих ММО или МДГ. Выделенные и охарактеризованные в настоящем исследовании микроорганизмы — два новых рода и три новых вида - представляют собой метано- и метилотрофные бактерии, ближайшими филогенетическими родственниками которых являются метанотрофы родов Methylocapsa и Methylocella и гетеротрофы рода Beijerinckia. Эти бактерии хорошо адаптированы к существованию при низких значениях рН, характерных для большинства наземных экосистем Северного полушария. Представители вновь описанного рода 'Methyloferula'' обладают одной только растворимой формой ММО, а предпочтительными субстратами этих организмов являются метанол и ряд органических кислот. Наличие последних в среде ингибирует окисление метана. Другая группа метанотрофов семейства Beijerinckiaceae, представленная родом Methylocapsa, характеризуется обладанием только мембранной формой ММО и предпочтением метана в качестве ростового субстрата. Тем не менее, в отсутствие метана эти метанотрофы способны к медленному росту на ацетате. Таким образом, разнообразие метаболических подтипов метанотрофных бактерий в природе оказалось шире такового, представленного ранее в культурах коллекций. Вклад облигатно- и факультативно метанотрофных бактерий в суммарную активность окисления метана в различных экосистемах еще предстоит оценить, но настоящее исследование показывает, что вклад факультативных метанотрофов может быть весьма существенен в местообитаниях с кислой реакцией среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьев, Алексей Викторович, Москва

1. Андреев JI.B., Гальченко В.Ф. Жнрнокиелотный состав и идентификация метанотрофных бактерий//Доклады АН СССР. 1978. Т. 239. С. 1465-1468.

2. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий// Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 1-9.

3. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС, 2001. 500с.

4. Гальченко В.Ф., Андреев JI.B., Троценко Ю.А. Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986. 96с.

5. Дедыш С.Н. Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов// Труды института микробиологии им. С.Н. Виноградского / Ред. Гальченко В.Ф. М.: Наука. 2006. Т. 13. С. 192-224.

6. Ешинимаев Б.Ц. Новые умеренно галоалкалофильные и термофильные метанотрофы. Дис. канд. биол. наук. Пущино. 2006. 143 с.

7. Заварзин Г.А. (ред.) Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М.: Наука. 1979. 285с.

8. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука. 1984. 192с.

9. Заварзин Г.А., Васильева JI.B. Цикл метана на территории России// Круговорот углерода на территории России. М.: Изд-во Моск. Правительства, 1999. С. 202-230.

10. Ю.Соколов А.П., Троценко Ю.А. Циклический путь окисления формальдегида у Pseudomonas oleovorans// Микробиология. 1977. Т. 46. №6. С. 1119-1121.

11. П.Соколов И.Г., Романовская В.А., Механизмы облигатной метилотрофии// Микробиол. журнал. 1992. Т. 54. №5. С. 87-104.

12. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников А.С., Сузипа Н.Е. Троценко Ю.А. Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем// Труды института микробиологии им. С.Н. Виноградского / Ред. Гальченко В.Ф. М.: Наука. 2006. Т. 13. С. 147-171.

13. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А., Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофными бактериями// Микробиология. 1986. Т. 55. №3. С. 377-382.

14. ACIA (Arctic Climate Impact Assessment) Impacts of a wanning climate: arctic climate impact assessment. Cambridge: Cambridge University. 2004. Press, http://amap.no/acia/.

15. Alston R.A. Studies on Azotobacter in Malayan soils// J. Agric. Sci. 1936. V. 26. P. 268-280.

16. Amann R., Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology//FEMS Microbiol. Reviews. 2000. V. 24. P. 555-565.

17. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation// Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.

18. Anthony C. Biochemistry of Methylotrophs. Academic Press, London. 1982.

19. Anthony C. The stmcrure of bacterial quinoprotein dehydrogenases// Int. J. Biochem. 1992. V. 24. P. 29-39.

20. Anthony C., Ghosh M. The structure and function of PQQ-containing quinoprotein dehydrogenases// Prog. Biophys. Mol. Biol. 1998. V. 69. P. 1-21.

21. Anthony C., Ghosh M., Blake C.C.F. The structure and function of methanol dehydrogenases and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinone// Biochem. J. 1994. V. 304. P. 5674.

22. Anthony C., Williams P. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase// Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1647. P. 8-23.

23. Auman A.J., Speake C.C., Lidstrom M.E. nifH sequence and nitrogen fixation in type I and type II methanotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4009-4016.

24. Auman A J., Stolyar S., Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P. 5259-5266.

25. Baani M., Liesack W. Two isozymes of particulate methane monooxygenase with different methane oxidation kinetics are found in Methylocystis sp. strain SC2// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 10203-10208.

26. Balk M., Weijma J., Stams A.J.M. Thermotoga lettingae sp. nov., a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor// Int. J. Syst. Evol. Micr. 2002. V. 52. P. 1361-1368.

27. Balk M., Weijma J., Friedrich M.W., Stams A.J.M. Methanol utilization by a novel thermophilic homoacetogenic bacterium, Moorella mulderi sp. nov., isolated from a bioreactor// Arch. Microbiol. 2003. V. 179. P. 315-320.

28. Basticn C., Machlin S., Zhang Y., Donaldson K., Hanson R.S. Organization of Genes Required for the Oxidation of Methanol to Formaldehyde in Three Type II Methylotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. №12. P. 3124-3130.

29. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L., Kovacs K.L., Embley T.M., Prosser J.I., Murrell J.C. The ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath)//Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 279-289.

30. Becking J.H. Nitrogen-fixing bacteria of the genus Beijerinckia in South African Soils// Plant and Soil. 1959. V. 11. P. 193-206.

31. Becking J.H. Studies on nitrogen-fixing bacteria of the genus Beijerinckia. I. Geographical and ecological distribution in soils// Plant and Soil. 1961a. V. 14. P. 49-81.

32. Becking J.H. Studies on nitrogen-fixing bacteria of the genneus Beijerinckia!I Plant and Soil. 19616. V. 14. P. 297-322.

33. Becking J.H. Nitrogen fixing bacteria of the genus Beijerinckia!I Soil Science. 1974b. V. 118. P. 196-212.

34. Becking J.H. The genus Beijerinckia. In The Prokaryotes, 2006. V. 5. P. 151-162. Edited by M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer & E. Stackebrandt.Ne w York: Springer.

35. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell C.J., Radajewski S., Weiharter A., Sessitsch A. Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs// Environ. Microbiol. 2003. V. 5 № 7. P. 566-582.

36. Boetius A., Ravenschlag K., Schubert C. J., Rickert D., Widdel F., Gieseke A., Amann R., Jorgensen B.B. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane// Nature. 2000. V. 407. P. 623-626.

37. Bowman J.P., Skerratt J.H., Nichols P.D., Sly L.I. Phospholipid fatty acid and lipopolysaccharide fatty acid signature lipids in methane-utilizing bacteria// FEMS Microbiol. Ecol. 1991. V.85. P. 15-22.

38. Bussmann I., Pester M., Brune A., Schink B. Preferential cultivation of type II methanotrophic bacteria from littoral sediments (Lake Constance)// FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 47. P. 179189.

39. Chen Y., Dumont M.G., Cebron A., Murrell J.C. Identification of active methanotrophs in a landfill cover soil though detection of expression of 16S rRNA and functional genes// Environ. Microbiol. 2007. V. 9. P. 2855-2869.

40. Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M.G., Marx C.J., Lapidus A., Vorholt J.A., Staley J.T., Lidstrom M.E. The enigmatic planctomycetes may hold a key to the origins of methanogenesis and methylotrophy// Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21. P. 1234-1241.

41. Conrad R., Claus P. Contribution of methanol to the production of methane and its C13-isotopic signature in anoxic rice field soil// Biogeochemistry. 2005. V. 73. P. 381-393.

42. Conrad R. The global methane cycle: recent advances in understanding the microbial processes involved// Environ. Microbiol. Rep. 2009. V. 1. №5. P. 285-292

43. Conrad R. Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2, and NO)// Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 609-640.

44. Dalton H., Whittenbury R. The acetylene reduction technique as an assay for the nitrogenase activity in the methane oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus strain Bath// Archives of Microbiology. 1976. V. 109. P. 147-151.

45. De Le J., Park I.W. Molecular biological taxonomy of some free-living nitrogen-fixing bacteria// Antonie van Leeuwenhoek, Journal of Microbiology and Serology. 1966. V. 32. P. 616.

46. De Smedt J. Bauwens M., Tytgat R., De Ley J. Intra- and intergeneric similarities of ribosomal ribonucleic acid cistrons of free-living, nitrogen-fixing bacteria// Int. J. of Syst. Bacteriol. 1980. V. 30. P. 106-122.

47. DeBont J.A., VanDijken M.J.P., Harder W. Dimethylsulphoxide and dimethyl sulphide as a carbon, sulphur and energy source for growth of Hyphomicrobium// J. Gen. Microbiol. 1981. V. 127 P. 315-323.

48. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W„ GroBkopf R., Zhou J., Tiedje J.M. Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands// Science 1998b. V. 282. P. 281-284.

49. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs// Appl. Environ. Microbiol. 1998a. V.64. № 3. P.922-929.

50. Dedysh S.N., Ricke P., Liesack W. NifH and NifD phylogenies: an evolutionary basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria// Microbiology 2004b. V. 150. P. 1301-1313.

51. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Liesack W., Trotsenko Y.A. Methylotrophic autotroph)' in Beijerinckia mobilisll J. Bacteriol. 2005. V.187. P. 3884-3888.

52. Dedysh S.N., Knief C., Dunfield P.F. Methylocella species are facultatively methanotrophic// J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 4665^1670.

53. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 2110-2117.

54. Derx H.G. Beijerinckia, a new genus of nitrogenfixing bacteria occurring in tropical soils// Proceedings Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 1950a. Ser. С. V. 53. P. 140-147.

55. Derx H.G. Further researches on Beijerinckia!I Annales Bogorienses. 1950b. V. 1. P. 1-12.

56. Dobereiner J. Nitrogen-fixing bacteria of the genus Beijerinckia Derx in the rhizosphere of sugar cane// Plant and Soil. 1961. V. 15. P. 211-216.

57. Dobereiner J., Ruschel A.P. Uma nova espe'cie de Beijerinckia!7 Rev Biol. 1958. V. 1. P. 261272.

58. Donnelly M.I. Dagley S. Production of methanol from aromatic acids by Pseudomonas putida!! J. Bacteriol. 1980. N. 142. P. 916-924.

59. Dunfield P.F. The soil methane sink. In Greenhouse Gas Sinks. Reay D., Hewitt C.N., Smith K„ Grace J. (eds.)// Wallingford, UK: CABI Publishing. 2006. P. 152-170.

60. Dunfield P.F., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. Dedysh S.N. Methylocella silvestris sp. nov., a novel methanotroph isolated from an acidic forest cambisol// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1231-1239.

61. Fall R., Benson A. A. Leaf methanol the simplest natural product from plants// Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 296-301.

62. Ferry J.G. Enzymology of one-carbon metabolism in methanogenic pathways// FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23. P. 13-38.

63. Folman L.B., Klein Gunnewiek P.J.A., Boddy L., de Boer W. Impact of white-rot fungi on numbers and community composition of bacteria colonizing beech wood from forest soil// FEMS Microbiol. Ecol. 2008. V. 63. P. 181-191.

64. Frenzel P. Plant-associated methane oxidation in rice fields and wetlands// Advances in Microbial Ecology/ Ed. Schink B. Kluwer Academic Plenum Publ., N.-Y. 2000. P. 85-114.

65. Galbally I.E., Kirstine W. The production of methanol by flowering plants and the global cycle of methanol// J. Atmos. Chem. 2002.V. 43. P. 195-229.

66. Ghosh M., Anthony C., Harlos K., Goodwin M.G., Blake C. The refined structure of the quinoprotein methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens at 1.94 A// Structure. 1995. V. 3.P. 177-187.

67. Gilbert В., McDonald I.R., Finch R., Stafford G.P., Nielsen A.K., Murrell J.C. Molecular analysis of the pmo (particulate methane monooxygenase) operons from two type II methanotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 966-975.

68. Gorham E. Northern peatlands: role in the carbon cycle and probable response to climatic warming// Ecol. Appl. 1991. V. 1. P. 182-195.

69. Green J., Dalton H. Steady-state kinetic analysis of soluble methane mono-oxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// Biochem. J. 1986. V. 236. P. 155-162.

70. Guckert J.B., Ringelberg D.B., White D.C., Hanson R.S., Bratina B.J. Membrane fatty acids as phenotypic markers in the polyphasic taxonomy of methylotrophs within the Proteobacteria// J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2631-2641.

71. Hanson R.S., Hanson Т.Е. Methanotrophic bacteria// Microbiol. Rev. 1996. V.60. N. 2. P. 439471.

72. Henckel Т., Jackel U., Schnell S., Conrad R. Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil oxidizing atmospheric methane// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V.66. P.1801-1808.

73. Heyer J., Berger U., Hardt M., Dunfield P.F. Methylohalobius crimeensis gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic, methanotrophic bacterium isolated from hypersaline lakes of Crimea// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1817-26.

74. Hoehler T.M., Alperin M.J., Albert D.B., Martens C.S. Field and laboratory studies of methane oxidation in an anoxic marine sediment: evidence for a methanogen-sulfate reducer consortium// Global Biogeochem. Cycles. 1994. V. 8. P. 451-463.

75. Holmes A.J, Costcllo A. Lidstrom M.E., Murrell J.C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related// FEMS Microbiol. Lett. 1995a. V.132. P. 203-208.

76. Holmes A.J., Roslev P., McDonald I.R. Iversen N., Henriksen K. Murrell J.C. Characterization of methanotrophic bactcrial populations in soils showing atmospheric methane uptake// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3312-3318.

77. Horz H.P., Raghubanshi A.S., Heyer J., Kammann C., Conrad R., Dunfield P.F. Activity and community structure of methane-oxidising bacteria in a wet meadow soil// FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 41. P. 247-257.

78. Kato Y., Asahara M., Arai D., Goto K., Yokota A. Reclassification of Methylobacterium chloromethanicum and Methylobacterium dichloromethanicum as later subjective synonyms of

79. Methylobacterium extorquens and of Methylobacterium lusitanum as a later subjective synonym of Methylobacterium rhodesianum// J. Gen. Appl. Microbiol. 2005. V. 51. P. 287-299.

80. Kelly D.P., Murrell J.C. Microbial metabolism of methanesulfonic acid// Arch. Microbiol. 1999. V. 172 P. 341-348.

81. Kitmitto A., Myronova N., Basu P., Dalton H. Characterization and structural analysis of an active particulate methane monooxygenase trimer from Methylococcus capsulatus (Bath)// Biochem. 2005. V. 44. P. 10954-10965.

82. Klotz M.G., Norton J.M. Multiple copies of ammonia monooxygenase (шоато) operons have evolved under biased AT/GC mutational pressure in ammonia-oxidizing autotrophic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 168. P. 303-311.

83. Knief C., Lipski A., Dunfield P.F. Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 11. P. 6703-6714.

84. Kolb S., Knief C., Dunfield P.F., Conrad R. Abundance and activity of uncultured methanotropnic bacteria involved in the consumption of atmospheric methane in two forest soils// Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1150-1161.

85. Kolb S. Aerobic Methanol-Oxidizing Bacteria in Soil// FEMS Microbiol. Lett. 2009. V. 300 P. 1-10.

86. Lau E., Ahm ad A., Steudler P.A., Cavanaugh C.M. Molecular characterisation of methanotrophic communities in forest soils that consume atmospheric methane// FEMS Microbiol. Ecol. 2007. V. 60. P. 490-500.

87. Lees V., Owens N.J.P., Murrell J.C. Nitrogen metabolism in marine methanotrophs// Arch. Microbiol. 1991. V. 157. P. 60-65.

88. Leisinger Т., Braus-Stromeyer S.A. Bacterial growth with chlorinated methanes// Environ. Health Perspect. 1995. Y. 103. P. 33-36.

89. Lelieveld J., Crutzen P.J., Dentener F.J. Changing concentrations, lifetime and climate forcing of atmospheric methane// Tellus 50B. 1998. P. 128-150.

90. Lidsrom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes. In The Prokaryotes. 2006. V. 2. P. 618634. Edited by M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer & E. Stackebrandt. New York: Springer.

91. Lidstrom M.E., Stirling D.I. Methylotrophs: genetics and commercial applications// Annu. Rev. Microbiol. 1990. Y. 44. P. 27-58.

92. Liebcrman R.L., Rosenzweig A.C. Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenasc// Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 39. P. 147-164.

93. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3218-3224.

94. McDonald I.R., Bodrossy L., Chen Y., Murrell J.C. Molecular Ecology Techniques for the Study of Aerobic Methanotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 1305-1315.

95. McDonald I.R., Hall G.H., Pickup R.W., Murrell J.C. Methane oxidation potentials and preliminary analysis of methanotrophs in a blanket bog peat using molecular ecology techniques// FEMS Microbiol. Ecol. 1996. V. 21. P. 197-211.

96. Morita R.Y. Bacteria in oligotrophic environments. Starvation-survival lifestyle. Chapman & Hall, New York, N.Y. 1997.

97. Morris S.A., Radajewski S., Willison T.W., Murrell J.C. Identification of the functionally active methanotroph population in a peat soil microcosm by stable-isotope probing// Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 1446-1453.

98. Murrell J.C., Dalton H. Nitrogen fixation in obligate methanotrophs// J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 3481-3486.

99. Murrell J.C., Gilbert В., McDonald I.R. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase// Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 325-332.

100. Murrell J.C., Radajewski S. Cultivation-independent techniques for studying methanotroph ecology// Res. Microbiol. 2000. V.151. P. 807-814.

101. Nguyen H.H.T., Elliott S.J., Yip J.H.K., Chan S.I. The particulate methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper-containing three-submit enzyme — isolation and characterization//J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 7957-7966.

102. Oakley C.J., Murrell J.C. niftl genes in the obligate methane oxidizing bacteriaII FEMS Microbiol. Lett. 1988. V. 49. №1. P. 53-57.

103. Patel R.N, Felix A. Microbial oxidation of methane and methanol: crystallization and properties of methanol dehydrogenase from Methylosinus sporiumll J. Bacteriol. 1976. V. 128 (1) P. 413—424.

104. Patt Т.Е., Cole G.C., Bland J., Hanson R.S. Isolation and characterization of bacteria that grow on methane and organic compounds as sole sources of carbon and energy// J. Bacteriol. 1974. V. 120(2). P. 955-964.

105. Prior S.D., Dalton H. Acetylene as a suicide substrate and active site probe for methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// FEMS Microbiol. Lett. 1985. V. 29. P. 105-109.

106. Quayle J.R., Ferenci T. Evolutionary aspects of autotrophy// Microbiol Rev. 1978. V. 42 (2). P.251-273.

107. Quayle J.R. Aspects of the regulation of methylotrophic metabolism// FEBS Lett. 1980. V. 117. suppl: K16-K27.

108. Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology//Nature. 2000. V. 403. P. 646-649.

109. Radajewski S., Webster G., Reay D.S., Morris S.A., Ineson P., Nedwell D.B., Prosser J.I., Murrell J.C. Identification of active methylotroph populations in an acidic forest soil by stable-isotope probing// Microbiology. 2002. V. 148. P. 2331-2342.

110. Reeburgh W.S. Global methane biogeochemistry// In Keeling, R. F., editor. The Atmosphere, Volume 4 of H. D. Holland and К. K. Turekian (eds.) 2003. P 65-89. Treatise on Geochemistry. Elsevier: Pergamon. Oxford, UK.

111. Reeburgh W.S. Oceanic methane biogeochemistry Review.// Chem. Rev. 2007. V. 107. P. 486-513.

112. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy// J. Cell. Biol. 1963. V.17. P. 208-212.

113. Rosch C., Mergel A., Bothe H. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil//Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3818-3829.

114. Sawers G. The hydrogenases and formate dehydrogenases of Escherichia colill Antonie Van Leeuwenhoek. 1994. V. 66. P. 57-88.

115. Schink В., Zeikus J.G. Microbial methanol formation a major end product of pectin metabolism// Curr. Microbiol. 1980. V. 4. P. 387-389.

116. Schink В., Ward J.C., Zeikus J.G. Microbiology of wetwood — importance of pectin degradation and Clostridium species in living trees// Appl. Environ. Microb. 1981. V. 42. P. 526-532.

117. Segers R. Methane production and methane consumption: a review of processes underlying wetland methane fluxes// Biogeochemistry. 1998. V. 41. P. 23-51.

118. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple methabolic lesions in obligate methanotrophic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1982. V.13. № 2. P. 237-242.

119. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Pathways of ammonia assimilation in obligate methane-utilizers// FEMS Microbiol. Lett. 1979. V. 5. № 2. P. 187-191.

120. Smith A.J., Hoare D.S. Specialist phototrophs, lithotrophs, and methylotrophs: a unity among a diversity of prokaryotes// Bacteriol. Rev. 1977. V. 41. P. 419^448.

121. Sohngen N.L. Uber Bacterien, welche Methan als Kohlenstoffhahrung und Energiequelle gebrauchen// Z. Bakteriol. Parazitenk. Abt. II. 1906. V. 15. P. 513-517.

122. Stafford G.P., Scanlan J., McDonald I.R., Murrell J.C. rpoN, mmoR and mmoG, genes involved in regulating the expression of soluble methane monooxygenase in Methylosinus trichosporium OB3b// Microbiology. 2003. V. 149. P. 1771-1784.

123. Starkey R.L., De P.K. A new species of Azotobacterll Soil Science. 1939. V. 47. P. 329-343.

124. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., Lidstrom M.E. Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath// Microbiology. 1999. V. 145. P. 1235-1244.

125. Taylor S., Dalton H., Dow C. Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and carbon assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath)// J. of Gen. Microbiol. 1981. V. 122. P. 89-94.

126. Tchan Y.T. Studies of nitrogen-fixing bacteria. 1957. P. 129-139. Transactions, 9th International Congress of Soil Science. V. 2. Adelaide. Australia.

127. Yimga M.T., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., Liesack W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs and its expression in Methylocystis strain SC2//Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 5593-5602.

128. Torella F., Morita R.Y. Micro cultural study of bacteria size changes and microcolony and ultramicrocolony formation by heterotrophic bacteria in seawater// Appl. Environ.Microbiol. 1981. V. 41. P. 518-527.

129. Toukdarian A.E., Lidstrom M.E. DNA hybridization analysis of the nif region of Methylosinus 6// J. Bacteriol. 1984. V. 157. P. 925-930.

130. Trotsenko Y.A., Murrell J.C. Metabolic aspects of aerobic obligate methanotrophy// Adv. Appl. Microbiol. 2008. V. 63. P. 183-229.

131. Trotsenko Y.A., Shislikina V.N., Govorukhina N.I., Sokolov A.P. Biochemical basis for obligate methylotrophy and obligate autotrophy; comparative aspects// Winogradsky Symp. On Lithoauotrophy. 1987. P. 26.

132. Tsubota J., Eshinimaev B.T., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Methylothermus thermalis gen. nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1877-1884.

133. Valentine D.L., Reeburgh W.S. New perspectives on anaerobic methane oxidation Review.// Environ. Microbiol. 2000. V. 2. P. 477^184.

134. Wang Y., Hammes F., Boon N., Chami M., Egli T. Isolation and characterization of low nucleic acid (LNA)-content bacteria// The ISME journal. 2009. V. 3 (8). P. 889-902.

135. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study//J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697-703.

136. Whittenbury R. The interrelationship of autotrophy and methylotrophy as seen in Methylococcus capsulatus (Bath)// In: Microbial growth on Ci compounds. H. Dalton et al. (Eds.) Heyden, London. P. 181-190.

137. Whittenbury R., Kelly D.P. Autotrophy: a conceptual phoenix// Symposia of the Society for General Microbiology. 1977. V. 27. P. 121-149.

138. Whittenbury R., Krieg N.R. Family IV. Methylococcaceae In: N.R. Krieg and Holt J.G. (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology. The Williams & Wilkins Co., Baltimore. 1984. V. LP. 256-261.

139. Woodland M.P., Cammack R. in Microbial Gas Metubolism: Mechanistic, Metabolic and Biotechnological Aspects (Poole, R. K., and Dow, C. S., eds). 1985. P. 209-213, Academic Press, New York.

140. Zahn J. A., DiSpirito A. A. Membranc-associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1018-1029.

141. Zani S., Mellon M.T., Collier J.L., Zehr J.P. Expression of nifH genes in natural microbial assemblages in Lake George, New York, detected by reverse transcriptase PCR// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3119-3124.

142. Zhan J.A., Bergman D.J., Kunz J.M., DiSpirito A.A. Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6832-6840.

143. Zhang G.S., Tian J.Q., Jiang N., Guo X.P., Wang Y.F., Dong X.Z. Methanogen community in Zoige wetland of Tibetan plateau and phenotypic characterization of a dominant uncultured methanogen cluster ZC-I// Environ. Microbiol. 2008. V. 10. P. 1850-1860.

144. Zhou J., Fries M.R., Chee-Sanford J.C., Tiedje J.M. Phylogenetic analyses of a new group of denitrifiers capable of anaerobic growth on toluene and description of Azoarcus tolulyticus sp. nov.// Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P.500-506.

Информация о работе

Воробьев, Алексей Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Фенотипическое разнообразие и функциональный потенциал метано- и метилотрофных бактерий семейства Beijerinckiaceae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы