Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Систематика грамотрицательных метилтрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 5s рибосомных РНК

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Систематика грамотрицательных метилтрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 5s рибосомных РНК"

академ/я наук ссср институт микробиологии

На правах рукописи

УДК 579.22:577.113.5 + 579.84

БУЛЫГША Евгения Станиславовна

систематика грамотрицательных метилотрофннх бактерии на основе

. АНАЛИЗА 1ШШЮТЦДШХ ПОСЛЩКВАТЕЯЬНОСШ 53 РИБОСОМНЫХ ИИ Спэцвальность 00.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссортацш па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Ыежфакультетской ПНИЛ им. А.Н.Белозерского ИГУ и Институте микробиологии АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук К.М.Чумаков и, доктор биологических наук А.И.Петрусов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Ы.Горленко,

кандидат биологических наук А.В.Троицкий Ведушая организация: ВШИ генетика и селекция промышленных микроорганизмов

Защита состоится "_"_ 19Э1 г. в_час._ман.

на заседании Специализированного совета Д 002.64.01 при Институте ; микробиологии АН СССР по адресу 117811, г. Иосква, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан "_* '_ 1991г. •

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

1.Е.

Никитин

Актуальность задачи. Метилотрофные бактерии - микроорганизмы, использующие метан и его производные в качестве единственного источника углерода и энергии. Облигатные метилотроф* могут использовать только С,-соединения, в то время как факультативные способны такта расти и на полиуглеродных субстратах, причем последних микроорганизмов значительно больше. Так как метилотрофные бактерии относятся к разным систематическим группам, то естественно, что и их морфология, физиологические и биохимические свойства достаточно разнообразны. Некоторые представители способны расти з хемолито-автотрофных условиях, другие одновременно являются и фототрофами. Известны также строгие анаэроба, растущие в автотрофных условиях, окисляя молекулярный водород.

С развитием биотехнологии интерес к этой группе микроорганизмов значительно повысился, поскольку метилотроды оказались крайне перспективными в качестве продуцентов микробной биомассы - заменителя растительного и хивотного белка, различных аминокислот, а также ферментных комплексов для трансформации различных химических веществ.

Интенсивное изучение метклотрофшх бактерий, их метаболизма, а такке возмокностей их промышленного использования привело к появлении обширней литературы. Однако существующая номенклатура ме-тллотрофов неудовлетворительна, поскольку существует случаи появления дублирующих наименований для различных видов или использования нескольких наименований для одного вида. Большие сложности возникают и при идентификации оОлигатных метилотрофннх бактерий, поскольку для них оказались непригодными многие классические т<.с-ты. К тому гэ в последнее время описано много новых штаммов метан-и метанолиспольдущих микроорганизмов, которых невозможно причислить ни к одному из известных родов. Кромг» того, способность к

метилотрофии обнаруживают микроорганизмы, уже отнесенные к той им иной таксономической груше. Такая неопределенность в номенклатуре н таксономии метилотрофов требует наведения порядка, поскольку без этого невозможно детальное понимание биологии этих бактерий, а также решение некоторых биотехнологмческих проблем.

Цель и задачи исследования. Целью нестоящей работа явилось изучение систематики грамотрицательных ыетилотрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей Б8 рибосомшх РНК, успешно применявшегося для таксономических исследований других групп бактерий. Конкретно задана исследования сводилась к следующему:

- определить нуклеотидннр последовательности &з рибосомных .РНК различных видов и родсй-' грамотрицательных ыетилотрофшх бактерий;

- провести филогенетический анализ полученных последовательностей о целью выяснения уровня генетического родства изучаемых штаммов;

- сравнить полученные последовательности с последовательностями веметилотрофвых бактерий, имеющихся в банке данных с целью выяснения филогенетического положения метилотрофов:

- попытаться идентифицировать отдельные штаммы метилотрофов на основе сравнения последовательностей их 53 рйЖ о банком;

- использовать данный геносистематический метод для определения состава конкретной микробной популяции.

Научная новизна работы. В данной работе впервые для решения вопросов таксономии метилотрофных бактерий был использован один из методов геносистоматики, а именно, метод изучения таксономии бактерий на основе сравнения нуклеотидных последовательностей 53 рибосомных РНК. Кроме того, Сшш проведены исследования по выяснению степени филогенетического родства метилотрофов с другими группами бактерий, а также было изучено происхождение признака метило-

трофии. С помощью указанного метода было определено таксономическое -положение ряда вновь выделенных групп бактерий.

Практическая ценность. В ряде случаев били выявлены неточности при первичной идентификация микроорганизмов. Была предпринята попытка использовать данный метод для более точной. идентификации облигатных метилотрофннх бактерий, что особенно важно в силу высокого биотехнологичэского потенциала данной группы микроорганизмов. Использование данного метода позволило определить состав микробной популяции, используемой в промышленном биореакторе, ■ что позволяет рекомендовать данный метод для использования в экологических исследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых "Физиология, генетика и биохимия метя-лотрофных микроорганизмов" (Канзв, 1986), на Всесоюзной школе-конференции молодых ученых "Систематика и эволюции микроорганизмов" (Пуцино-на-Окв, 1988), на Международной симпозиуме по метилотроф-ным бактериям (Геттинген, 1989).

Публикагдаи. По теме диссертации опубликовано б статей я тезисы 1 доклада.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, шводов, списка цитируемой литературы.

Работа изложена па 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 18 рисунками. Список литературы включает 150 работ отечественных а зарубеяних авторов.

Несто проведения работы. Работа выполнена в секторе взаимодействия вируса с клеткой Мегфакультетской ПНИЛ им. А.Н. Белозерского (¡!ГУ и в лаборатории геносистематики и эволюции бактерий Института микробиология АН СССР.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекта и методы исследований. Объектами служили 72 штампа грамотрицательных мегилотрофных бактерий, принадлежащих различным видам и родам, и .10 штаммов неметилотрофыых бактерий, взятых для сравнения. Работа проводилась в сотрудничестве с исследователями из 6 институтов Москвы, Пущино, Киева и университета штата Миннесота (США), предоставившими биомассу микроорганизмов.

Для определения- последовательностей 5S рРНК бактерий брали приблизительно 1 г сырой биомассы культур в конце экспоненциальной фазы роста, суспендировали в 0,01 М Ns-ацетатном буферном растворе рН 5,1 и экстрагировали фенолом при 60°С (Чумаков, 1972). РНК осаждали и промывали этанолом и метили in vitro [32Р]-цитидин- ' (3*,5' )-дифосфатом при помощи РНК-лигазы бактериофага Тд (England ; & Uhlenbeok, 1978). Фракцию 5S рРНК получали при помощи очистки высоковольтным электрофорезом в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) (Ыаниатис и др., 1984). Специфическую деградацию РНК проводили химическим методом с незначительными модификациями (Peattie, 1979). Набор полученных фрагментов фракционировали электрофорезом в 20%, 12% и 8« ПААГ. . !

На основе сравнения полученных последовательностей нуклеотн-дов 5S рРНК рассчитывали полную матрицу взаимных мутационных расстояний (ad), которую использовали для построения предполагаемого филогенетического дерева с применением принципа максимального топологичзского подобия (Чумаков и Ювманов, 1988). Построена проводили при помощи специально разработанного алгоритма, реализованного в компьютерной програше, написанной на языке "С" в операционной системе unix Лиманов и Чумаков, 1938). При построения ' дендрограмм использовали методы кластерного анализа (ОРОМА-МОТОД). ,, .

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Таксономия метанотрофных бактерий

Для изучения таксономии метанотрофных бактерий были исследованы 26 штаммов, полученных из различных коллекций в представляющих практически все описанные на сегодня вида метанотрофных бактерий. lio наиболее признанной на сегодняшний день схеме, разработанной Виттенбари (1970), этих бактерий относят к трем группам, пяти родам и 15 видам. Их состав н названия варьируют у разных авторов.

Первоначальные исследования проводились на штамма;;, полученных от проф. В.А.Романовской (Ин-т микробиологии и вирусологии АН УССР). Предполагаемое филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения нуклеотидных последовательностей 5S рРНК этих штампов представлено на рис.1.

BttfcrlMUra. «роли, 55 ___

■tethrlmruo п*п 15?

Рис.1. Филогенетическое дереве, основанное на сравнении нуклеотид-ных последовательностей штаммов метэнотрофов из музея ИМВ АН УССР.

Проведенный анализ показал, что эти штаммы, за исключением Uethy-loeinua врогtum 5W, представляют собой очень компактную группу. Однако в данном случав образованные кластеры не соответствуют родовой принадлежности образующих их атамюв.

Неадекватность полученных результатов и явное несоответствие их с физиолого-биохимическими данными заставили нас продолжить филогенетическое исследование данной группы бактерий. Дальнейшая работа проводилась на штаммах, полученных от д.б.н. В.Ф. Гальченко (ИНМИ АН СССР) и проф. Р. Хансона (ун-т от. Миннесота США). Эти коллекции в основном представлены типовыми штатами. на когорт были проведены многочисленные фиаиолого-биохимические, иммунологический и хемотаксоноыические исследования. Филогенетическое - дерево, построенное на основе сравнения этих штаммов (рис. 2),

Рис.2. Филогенетическое дерево, освованое на сравнении нукдео-тадных последовательностей типовых штаммов метадотрофннх бактерий.

выявило иные эволюционные отношения внутри группы облигатных метанотрофных бактерий. В данном случав наблюдается практически полная корреляция между полученными нами результатами, схемой Виттенбари и таксономическими исследованиями, проведенными В.Ф. Гальченко и др. (1986). На представленном дереве данные штаммы образует три четко различимых кластера, соответствующих группам I, II и X по классификации Виттенбари. Также ясно дифференцируются подкластеры, соответствующие 5 описанным родам метанотрофов.

С целью сопоставления результатов филогенетических исследований различных коллекций метанотрофных бактерий било построено общее филогенетическое дерево, отралащее эволюционные отношения между всеии исследованными нами штаммами метзнотрефшх бактерий (рис. 3).

. У^ЛЧ. ¿>0

и. У В»ОД1«оссо» имию&этП I

'Ьча??''* ^ I !%,, . I ЛитуКймНг а»р««1«и» 5»

^Цц/Эф^ /1\*з1аг1оЪ«<Нег сйгоососст 90

!1Г»1П

; 0 , /\ Х\ Хь V

л \

Рис.3. Филогенетическое дерезо, отражающее эволюционные отношения мекду всеми исследованными штаммают метанотрофшх бактерий. •

Проведенный анализ выявил, с одной стороны, идентичность штаммов

Methylononae rubrum 23 И 155, Methyloeinu« eporium 22 И 5* И ряда других, что абсолютно логично и лишь еще раз подтверждает правомерность применения метода сравнения нуклеогидных последовательностей 5S рРНН для филогенетических построений. С другой стороны, абсолютное отсутствие гомологий меаду тшовым штаммом jfetbyioetrma trtohoBporiutn овзь и штаммом 4е того же вида можно объяснить лишь неточностью идентификации последнего. Аналогичное заключение можно сделать относительно ТИПОВОГО Штамма Methylocyatie paruua ОВВР И" штамма 492 этого же вида. Это заключение подтверждается результатами наших исследований, свидетельствующих о филогенетической близости типовых штаммов данных видов к другим видам ссютветству-. ИДИХ родов. Кроме того, у J/в. trlahoeporlim 4е И lies, parvue 492 * обнаружена 4,5s рРНК, отсутствующая у других представителей родов Kethyioeinue и iiethyloayetia и характерная для других трех родов метанотрофных бактерий. Наличие этого типа рРНК является важным диагностическим признаком, поскольку этот тип рРНК обнаружен лишь, у представителей 7-подгрушш протеобактерий.

Сравнение нуклеотидаых последовательностей метанотрофных бах-терий с банком данных показало, что метанотрофы груш I и х принадлежат к f-подгруше протеобактерий, а метанотрофы группы II - к a-подгруппе, что свидетельствует о полифилетиче ском происхождении этих микроорганизмов. Высокий уровень генетической дивергенции между указанными группами мвтанотрофов, а также высокая степень различий в физиолого-биохимических и хемотаксономических свойствах не позволяет объединить 'этих бактерий в одну группу, а скорей всего свидетельствует об их принадлежности к различным семейства».

Д. Изучение состава смешанной метвнотрофиой культура.

Смешанная метанотрофная культура, обозначенная но рисунках г

И 3 как strain BioR, получека нами из лаборатории проф. Р. Хансона. Она используется для очистки сточных вод от трихлорэтилена (ТХЭ),

являющегося высоко токсичным для человека соединением.

j

Для того, чтобы лучше понять процессы биодеградации ТХЭ метанотрофами, была предпринята попытка изучить микробный состав данной культуры. Микроскопические исследования свидетельствовали о наличии по меньшей мере двух морфологических типов клеток в данном сообществе: первый представлял собой небольшие изогнутые палочки, второй - клетки, имеющие гифоподобные выросты и напоминающие по виду гифомикробов. Многочисленные попытки раздолить данную популяцию или выделить хотя бы метанотрофшй компонент данного симбиотического комплекса не привели к положительным результатам.

Тогда были предприняты попытки определить состав данной популяции с помощью методов молекулярного зондирования, не требующих выделения организма из состава популяции. Для этого были использованы универсальные зонды, комплиментарные к 16s рРНК эубактерий, и группоспецифяческне зонда для метанотрофов I и II типов (T3ien et al., 1990). Результаты показали, что микроорганизмы данной популяции принадлежат к эубактериям и один из них относится к метанотрофам II группы. Из-за отсутствия родо- и видоспеци?ячных зондов и крайне малого числа полных нуклеотидных последовательностей 16S рРКК мотано- и метилотрофных бактерий более точная идентификация состава данной популяции с помощью этого метода в настоящее время невозможна.

Поэтому нами бала предпринята попытка определить более точно состав исследуемой популяции путем сравнения нуклеотидных последовательностей 5S рРНК, поскольку составленный нами банк таких последовательностей метилотрофннх бактерий на порядок превыказт аналогичный банк для 16S рРНК и. практически полностью

охватывает видовой состав метанотрофов, что в данном случав явилось большим преимуществом.

Препаративное разделение суммарной РНК, выделенной из данного сообщества, обнаружило две полосы в зоне 5э рРНК. Однако включение радиоактивной метки в одну из полос было намного слабее, что не позволило нам, к сожалению, определить одну из нуклеотидных последовательностей. Сравнение другой полученной нами последовательности с банком выявило практически полную ее идентичность с иа. сПоврог1ит. Это позволило лредполозкить, что мэтанотрофыым компонентом данной микробной популяции является штамм, принадлежащий к данному виду.

Хотя подобный вывод нельзя признать окончательным, его достоверность достаточно велика. Таким образом, именно анализ нуклеотидных последовательностей 53 рРНК позволил в данном случае определить хотя бы частичный состав данного микробного сообщества, что оказалось невозможным при помощи других методов.

3.Таксономия облигатных мэгилотрофных бактерий.

Систематика облигатных метлотрофных бактерий также несовершенна: из-за невозможности применения классических диагностических тестов идентификация таких микроорганизмов часто носила формальный характер. В результате эти бактерии оказались отнесены к 7 родам. Позже было предложено морские формы этих бактерий объединить в род орьлеа, ограниченно-факультативные виды, способные использовать отдельные полиуглеродные соединения, отнесли к роду Не^у1орМ 1иа, а ОСТЭЛЬНЫХ - к роду И»1Ьц1оЪа.е1Мив. Однако до сих пор два последних рода включают лишь по одному виду, а таксономический статус других облигатных метило трофт бактерий неопределен.

В нашей работе мы "Провели филогепэтическое исследование 14

штаммов облигатных и ограниченно-факультативных метилотрофшх бактерий с целью выяснения их таксономического статуса. Как видно из приведенного на рис. 4 дерева.

» .»V

г \ .чо^ »„о

\\ е+р

х —«пшяч.

"1УУИ -Ь: \

/о \ Ч Ч

/ // Ч ч

« С, 0.1 »«

Г -Г -

//

Рис.4. Дерево, отражающее эволюционные отношения между облитатнн-ми и ограничешо-факультативннми метилотрофными бактериями.

исследованные птамш образовали два очень компактных кластера, соответствующих облигатннм и ограниченно-факультативным кетило-трофным бактериям. Группа истинно облигатных бактерий компактна и представлена несколькими ветвями, соответствующими, видчмо, различным видам рода и»хьу1оъаотив. Это предположение подтвердилось результатами ДНК-ДНК гибридизации и рядом других ■ исследований (Говорухина п др., 198Э). Аналогичные результаты были получены при исследовании группы ограниченно-факультативных бактерий, образовавших таске компактные пожластеры. соответствующие отдельным видам. Таким образом проведенный анализ позволил уточнить таксоногга-

чвский статус целого ряда облигатных мегшотрофных бактерий, ранее ошибочно отнесенных к родам Рвешклпопоа. Тгогст1поЬас1вг, НегНапа-

топам И ДРУГИМ.

Исключение составили лишь два штамма: бВ1 и Р1, которыз по своим физиолого-биохимическжы признакам являются ограниченно-факультативными, но по результатам ДНК-ДНК гибридизации, фосфолотид-ному составу и ряду других свойств сильно отличаются от представителей обоих групп, на основании чего они были выделены в новый род жегнугоиагия. Силогенэтически эти штаммы оказались более близ-' кими к облигатным метилобактериям, но уровень генетической дивергенции не противоречит вышеуказанным данным.

Сравнение нуклэотидаых последовательностей исследованных штаммов облигатных и ограниченно-факультативных метилотрофшя. бактерий с банком данных выявило их эволюционное родство с представителями р-подгруппы протеобактерий. Однако высокий уровень генетической дивергенции мэкду ниш свидетельствует об относительно раннем обособлении этой группы от общего ствола эволюции. С другой стороны этот анализ показал существенную филогенетическую обособленность облигатных ыетилотрофов от метаногрофов, что ставит под сомнение правомерность объединения некоторыми исследователями всех 8тих бактерий в единую группу.

4.Систематика Факультативных метилогрсфшх бактерий. 4.1. Таксономия рода негнр^ъаавгЫт и идентификация штамма КИ-4.

Факультативные грамотрицательные метилотрофные бактерии представлены широким спектром бактерий, отнесенных к родам Acвtaъactor

В1асЛоЪас1вг, ЫethvlcЪacteг{и!Ц, Рвеийотспав И ДРУГИМ. ИдвИТИфИКЗ-

ция этих бактерий значительно проще, однако в последнее время все чаще возникают сомнения в правомерности объединения метило- и ниметилотрофов. К тому же для многих таких родов остцется неолро-

деленным их систематическое положение. Мы провели филогенетическое исследование 33 штаммов факультативных метилотрофных бактерий, а также ряда близкородственных штаммов неметилотрофных бактерий, которые использовали для сравнения. Филогенетическое дерево, представленное на рис.5, отражает эволюционные отношения между видами рода Иег1-.у1оъоаег1ит и наиболее близкими им представителями других родов.

рягаа ОВЕГ

Ьшваош

■р. П

Мг»1п 114, Гмиюши Поля Я 001 о

,0.00*»

ар. «II

ч

Рис.5. Филогенетическое дерево, отражающее взаимоотношения между штаммами и видами рода кв^игоЬаавпиа и рядом близких ему видов.

В этот род были выделены факультативнее, роэовоокрашенные палочковидные бактерии, использующие сериновий путь (^-ассимиляции. Анализ ДКК-ДНК гибридизации 36 ытамаов этого рода выявил большое количество гомологичных групп, 8 из которых соответствовали описанным видам (Ноой еЬ а1., 1987). Однако они, по мнению авторов, отражают меньпуя часть видового разнообразия данного рода.

Мы провели филогенетическое исследование 8 штаммов, принадлежащих ДаННОМу рОДУ, В ТОМ ЧИСЛ9 ШТаММа Pseudomonas ер. РР, не включенного в исследование английских ученых, и неидентифицирован-ного штамма КИ-4, по ряду физиолого-биохимических свойств сходного С представителями рода Jfethi/lobacterlum. Этот анализ выявил высокий уровень генетического родства между штаммом РР и видами вышеуказанного рода, однако величина взаимных мутационных расстояний не превышала межвидового уровня, характерного для данного рода. Из-за отсутствия у нас типовых штаммов четырех других известных видов рода ¿íethiiiobac ter сита ш не мокем утверждать, что штамм РР представляет coöoi* новый вид, однако он отличается от описанных видов по ряду физиологических свойств. По крайней мере, принадлежность его к данному роду сомнений не вызывает.

Анализ нуклеотидной последовательности штамма КИ-4 выявил практически ее полную идентичность с иь. rhodtnura, однако отсутствие данных по ДНК-ДНК гибридизации, необходимых для точеой видовой диагностики, а также некоторые различия в спектре используемых субстратов не позволяют сделать окончательного вывода. Но вывод о родовой принадлежности данного штамма вполне падекэн.

4.2. Филогенетический анализ рода ¿oetobacter.

СЕилогенетическое исследование организмов, отнесенных к роду

Acotobacter тзкжэ ДЭЛО ЕНТОрвСНШ рвзуЛЬТаТЫ. ЭТОТ рОД ОбЪвДИПЯЛ аэробные ацидофильные палочки, способные утилизировать целый ряд органических соединений. Некоторые штаммы были, способны использовать метанол, что вместе с рядом хемотаксономических особенностей

ПОСЛУЖИЛО ДЛЯ их БиДелеНИЯ В СаМОСТОЯТелЬНЫЙ рОД Aoidononas (Urakami et al., 1989). Однако, при детальном рассмотрении, критерии, выдвинутые в качестве дифференциальных признаков, оказались неправомочны. Единственным свойством, действительно отличавшим

данные штаммы, была способность использовать метанол. Остальные признаки нивелировались с учетом характеристик всех видов данного рода. Однако проведенный нами филогенетический анализ изучаемых таксонов показал, что уровень сходства геномов между неметилотроф-ными видами рода лаогоЪаогег и наиболее близким к нему родом 01и-сопоЪаахег существенно выше, чем между метилотрофными и неметпо-трофными видами первого рода (рис. 6).

ЮИоЪм1и- »р. 914 кслХЛлсХт мгьапонсш ИВ 60 *р . 924

— 40,№Ь*01»Г ,р. С6Т

лесиьвсгаг «р. 91Э

1СИ0Ь4СЧГ »р. ИВ ЬО/4

СХисоОсЬаеиг ОХТОШМ АТСС 1935Т схцвшоьмиг охуваш НШ 1221 Лмиьииг «4,11 МОП 8621 1с,1оЫс1,г «СШ вш 879 Дсв1о(]«о1аг (и1аиг1адиа НС1В 1*22$ 1о,МЬ«и«г ЦГ11Ш ММ его

0,20 0,19 0,10 0,09

-I

Рис.6. Кластерная дендрограмма, отражающая взаимоотношения

Представителей РОДОВ АсагоЪасгег И 01исопаЬас1вг.

Таким образом, это подтвердило хоть и несколько необоснованное предложение о выделении мзтилотрофных штаммов рода лов^ьаавг в самостоятельный род. В данном случае именно анализ последовательностей 5з рРНК стал единственным генотиличзским способом, двФХю-ренцирухаиа рода лаагоъсинег и лсЮотопао, а таксономический вес

такого признака как метилотро$ия для денной группы бактерий оказался довольно высоким, позволив дифференцировать таксоны родового уровня.

4.3. Определение таксономического статуса ряда почкущихся бактерий

До сих пор остается невыясненным таксономическое положение псевдомонадоподобных штаммов, использующих сериновый путь Ct-ассимиляции и размнозкащихся почкованием, например тавиЛстстав ap. us и НА. На основании проведенного анализа ДНКгрРНК гибридизации было установлено, ЧТО родственный ЭТИМ .штаммам ВИД Paeudowmoa amlnovorane бЛИЗОК К КОМПЛвКСУ Rhtzobium-J^robaotertua (Oreen & Oiiiis, 19В9). Результаты проведенного нами исследования такте подтвердили филогенетическое родство исследованных нами штаммов с указанными родами, определив таким образом систематические позиции данных двух штаммов. Следует также отметить, что примерно равный уровень значений коэффициента взаимных мутационных расстояний между родами яыеоыип и Agrabacterium и исследованными штаммами позволяет отнести последних к семейству mizobiaceae.

Проведенный анализ выявил также близкое эволюционное родство между семейством имгоыас&ов и родом Bi/phonicrobium, отнесенным в последнем руководстве Берги к группе почкующихся и стебельковых бактерия, причем систематическое положение этой группы не определено. Поэтому объединение указанного рода с представителями комплекса pJiíeobíuw-Asrobactertun проясняет филогенетические позиции данного рода.

4.4. Таксономия родов Bloatobocter И Xanthabacter. До сих пор остается неопределенным таксономическое положение бактерий, автотрофно использущкх восстановленные -субстраты и

ОГКОСОННЫХ к родам Blaetcbacter И Xantíwjbocter. КМЭОДИВСЯ В

литературе данные указывают на большую гетерогенность первого рода.

В проведенном нами исследовании мы попытались выяснить систематическое положение указанных родов и проверить высказанное предположение. На приведенном на рис.7 филогенетическом дереве

Рис.7. Онтогенетическое дерево, внявлящее гетерогенность рода

1 , -

видно, что отдельные вида рода вхоаюьо^ег относятся к различным кластерам. Кроме того, два вида этого рода оказались эволюционно очень близки с ХапгьаЪасюг сшгспгормсиа. Сравнение морфологических и физиологических свойств этих видов показало, что основным отличием этих видов является способ деления. Однако их объединяет ряд таких особенностей, как способность к автотрофш'и метнлотро-фот, отсутствующая у видов в. сарвигаги» и в. ажзгевогив. Ранее было показано филогенетическое родство почкующихся и непочкупцихся бактерий на примере Рзвмистопаа кз и НА и комплекса дмяомшп-AsraЬaotert\a^. Тек что можно предположить, что в данном случае

этот признак также не обладает большим таксономическим весом.

Еще один вид рода Biœtobacter оказался филогенетически слизким к wttrobaв ter winogradskn, однако в данном случае величина взаимных мутационных расстояний выше межвидового уровня, что указывает на принадлежность данных микроорганизмов к близким, но разным родам. Сравнение нуклеотадных последовательностей в. сарви-îatue и в. aggregatue с банком данных выявило отдаленное (филогенетическое родство первого вида с представителями таких родов как XHodobaotar И Cauîobactar, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЬЗ ШДГруШЮ ПрОТбобЭК-

терий; в. asgrogatuB оказался более близким к фотобактериям -представителям 7-подгруппы.

Таким образом, проведенный анализ выявил большую филогенетическую дивергенцию рода Bioatobocter, позволив отнести виды данного рода к четырем различным группам бактерий, и установил генетическое родство мевду Xanthobacter autotrophtcue И ДВУМЯ ВИДаМЗ бластобактерий. Остается открытым вопрос, какой же из видов действительно должен быть отнесен к указанному роду?

4.5. Эволюционные аспекты метилотрофии.

Проведенный филогенетический анализ показал, что группа мети-лотрофше бактерий в целом является крайне гетерогенной, представители мотилотрофов встречаются в большинстве основных филогенетических линий эубактерий. Следовательно придание признаку метилот-рофии высокого таксономического веса и выделение на этой основе единого естественно таксона высокого ранга нам кажется необоснованным.

Выявленная филогенетическая гетерогенность группы метшютро-фов в совокупности с существованием различных путей утилизации С, -соединений в отдельных филогенетических линиях эубактерий скорее всего свидетельствует о полифалетичном происхождении признака

метилотрофии, т.е. его возникновении в эволюции более одного раза. В процессе дальнейшей эволюции в отдельных филогенетических линиях могла происходить независимая потеря этой способности, на что указывает эволюционное родство ряда метилотрофных п неметилотрофных видов, свидетельствующее об их недавней дивергенции.

То, что метилотрофные микроорганизмы оказались представленными в трех основных подклассах протеобактерий, объединивших многие физиологические типы эубактерий, по-видимому, ставит свойство ме-тилотрофии в один ряд с автотрофией п гетеротрофной, возможно как переходный тип метаболизма.

Естественно, что для окончательных выводов нашего исследования недостаточно, к сама задача восстановления филогении организ-гюв на основе последовательностей биополимеров предполагает использование как фенотипических, так и других генотипических метод-дев, и потому полученные нами результаты следует рассматривать как предварительные. Однако и в таком относительном виде получаемая Егформация является полезной, позволяя правильнее подходить к систематизации микроорганизмов и рационально строить стратегию исследования свойств и использования микроорганизмов.

ЕЫВОДЫ

1. Проведенный филогенетический анализ группы мвтанотрофпнх бактерий подтвердил в основном схему, предложенную Виттенбари, и выявил высокий уровень генетической дивергенции между штанотрофами I и 11 групп, что позволяет отнести их к разным семействам.

2. Изучение филогении облигатных и ограниченно-факультативных иетнлотрофных бактерий выявило генетическую обособленность данной группы микроорганизмов. Сопоставление полученных результатов с хемотаксономичоскими данными позволило определить таксономический

статус целого ряда бактерий этой группы, ошибочно отнесенных ранее

К родам Pseudomonas. Frotamlnobacter. Hethylomonaa, Methanomonaa В Bacterium.

3. Применение анализа нуклеотидных последовательностей 5s рРНК ПОЗВОЛИЛО уточнить родовую принадлежность Pseudomonas ар. ШТ. РР И идентифицировать штаммы КИ-4 и одного из членов микробной популяции из биореактора, продемонстрировав тем самым эффективность данного метода для идентификации микроорганизмов как в чистой культуре, так и для популяционного анализа.

4. Проведенное филогенетическое исследование рода .icetobactor подтвердило правомочность. выделения метилотрофшх видов данного рода в новый род Acidomonae, причем в данном случае анализ сравнения 5S рРНК оказался единственным генотипическим способом, дифференцирующим рода семейства Acetobacteraceae.

5. Применение анализа сравнения последовательностей 5S рРНК позволило определить таксономический статус таких микроорганизмов, как ТваиОочитае MS И МЛ, Xanthobacter autotrophtcue И рода »ethyiomtorobium, а также установить высокую гетерогенность рода Biaetobacter, позволяющую отнести включенные в данный род виды к различным семействам. Обнаруженная корреляция полученных результатов с данными фено- и хемотаксонсмичеасих анализов подтиерждает обоснованность сделанных филогенетических заключений, в. Исследование филогении метилотрофных бактерий в целом обнаружило принадлежность отдельных групп этих микроорганизмов к разным линиям эволюции, что указыЕзет на полифилетическое происхождение признака м&тилотрофаи.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации. 1. Б/лыгина Е.С., Чумаков K.M., Нетрусов А.И. Определение нуклео-тшшх последовательностей 5S рибосомных - РНК ряда метилотрофных

бактерий. В сб. докладов конференции молоди ученых "Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов", 1986, Киев, Наукова думка, стр. 11-16.

2. Булыгина Е.С., Галъченко В.Ф., Говорухина Н.И., Нетрусов А.И., Никитин Д.И., Романовская В.А., Троцёнко Ю.А., Чумаков K.M. Классификация метилотрофных бактерий на основе секвенирования 5S рибо-сомных РНК. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, 4, стр. 18-24.

3. Булыгина E.G., Нетрусов А.П., Чумаков K.M. Изучение таксономии метилотрофшх бактерий путем сравнения нуклеотидных последовательностей 5S рибосомных РНК. Эволюция и систематика прокариот: Тр. 1 Всесоюз. школи-конф. мол. ученых, Пущино, 1990. Деп. ВИНИТИ 21-01-90, стр. 2-8.

4. Bulygina E.S., Govoruktoina M.I., Hetrusov A.I., Trotsenko Y.A., Chumakov К.II. Studies on 5S RNA sequences of RuMP-typa obligate and restricted facultative methylotrophio baoteria. Abstr. 6th Int. Symp. "ïîicr-obial grov/A on C,-compounds ", Gottingen, 1989, P103.

5. Bulygina E.S., Galohenkc V.Ï., Govorukhina N.I., Netrusov A.I., Nikitin D.I., Trotsenko Yu.A., Chumakov Х.Ы. Taionomio etudièe on methylotrophio baoteria by 5S ribosomal RHA eequenoing. J. Oen. Hiorobiol., 1990, 136, 441-446.

6. Bulygina E.S., Ocvorukhina W.I., Netmsov A.I., Trotsenko Y.A., Chumakov K.M. Comparative studies on 5S RHA sequences and ША-DNA homologies of obligate and restrioted facultative methylotrophio baoteria. Systematio and applied microbiology (в печати).

7. Bulygina E.S., Gulikova O.M., Dlkanakaya B.U., Hetrusov A.I., Purova T.P., Chumakov К.Ы. ïaxonoaio studies of the genera Aootobaot&r by 53 ribosomal ENA oequenoing. J. Oen. HioroMol. (B печати).