Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и секвенирование генов рибосомных белков S10 и SPC оперонов THERMUS THERMOPHILUS

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и секвенирование генов рибосомных белков S10 и SPC оперонов THERMUS THERMOPHILUS"

р ¡5 мазовский ордена Ленина, ордена октябрьской революции и ордена трудового красного знамени государственный

фрр университет им. н.в.ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи Высоцкая Валентина Семеновна

УДК: 577.113.5

КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ S10 И SPC ОПЕРОНОВ Thermus thermophilus

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук М. Б. Гарбер

Официальные оппоненты: доктор химических наук, академик Л.А.Богданов доктор биологических наук С. Г. Камзолова

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.Н.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится "¿8 " /р€//)виЛ 1995 г. в час. на

заседании Специализированного ученого совета Я 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан "¿¿"А^буЛ 1995 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

I. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Для понимания механизма биосинтеза белка необходимы функциональные и структурные исследования рибосом. Наиболее изученныни являются бактериальные рибосомы, и в первую очередь, рибосомы Escherichia coli. Все белки из рибосон Е. coli (их свыше 50) были выделены и охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов, кроме того определены их первичные структуры. Однако попытки кристаллизации рибосомных белков Е. coli я определения их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа натолкнулись на серьезные трудности. В связи с этим в последние годы начались исследования рибосомных белков из двух других микроорганизмов - термофильных эубактерий: Bacillus stearothermophilus и Thermus thermophilics, белки которых более стабильны и поэтому более перспективны для кристаллизации. В Институте белка РАН было выделено и охарактеризовано свыше 40 рибосомных белков Т. thermophilics, для рибосомных белков S6, S7, S12, S15, LI, L11 определена первичная структура, несколько белков закристаллизовано и для белка S6 определена пространственная структура с высоким разрешением.

Настоящая работа является частью комплексных исследований рибосомных белков из Т.thermophilus, ведущихся в Институте белка, и направлена на определение первичной структуры ряда рибосомных белков путем клонирования и секвеннрования кодирующих их генов. Установление первичной структуры легко кристаллизующихся рибосомных белков из Т. thermophilics и получение штаммов-суперпродуцентов для выделения этих белков в препаративных количествах приведут к новому качественному уровню исследований структуры рибосомных белков и рибосомы в целом.

Основные задачи работы:" Клонирование генов рибосомных белков S10 и spc оперонов Т.thermophilus. Определение первичной структуры генов rpsl7, rp!14, rp224, rpsl4, rps8, кодирующих рибосомные белки S17, L14, L24, S14, S8 Т. thermophilus. Анализ особенностей первичных структур генов S10 и spc оперонов Т. thermophilics и кодируемых ими рибосомных белков. Получение штамма-суперпродуцёнта для белка-репрессора S8 и определение его некоторых физико-химических характеристик.

Научная новизна. В настоящей работе клонированы полный S10 оперон и 10 генов рибосомных белков spc оперона Т. thermophilics. Определена полная последовательность гена rpsl7 из S10 оперона и

генов fplli, rpl24, rps14, rpsS из spc оперона. Обнаружено, что в отличие от кезофильных бактерий в Т. thermophilics S10 и spc опероны не разделены спейсером: терминирующий нодон последнего гена (rpsl7) S10 оперона перекрывается с инициирующим кодоном первого гена (грЛ4) spc оперона. В конце гена rpsl7 локализован участок предполагаемого связывания белка-репрессора S8. Проведено сравнение первичных структур рибосомных белков S17, L14, L24, S14, S8 Т. thermophilics с аналогичными белками из других зубактерий. Получен штамм-суперпродуцент для рибосомного белка S8 из Т. thermophilics и отработана методика выделения белка. Из спектров кругового дихроизма определено количественное содержание элементов вторичной структуры белка S8. Показано, что белок S8 из Т. thermophilics обладает высокой устойчивостью к денатурирующим агентам.

Структура диссертации. Диссертация состоит из трех основных частей: обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов и завершается выводами и списком цитируемой литературы ( ссылок). Работу иллюстрируют 32 рисунка и 6

таблиц, общий объем диссертации - JVV страниц.

Апробация работы и публикации. Результаты докладывались на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994). По теме диссертации опубликованы две печатные работы. В банк последовательностей нуклеотидов EMBL (г. Гейдельберг) помещены первичные структуры генов rps17 (accession NO.Z36971), rpil4 (accession NO.Z37993), rpI24 (accession NO.Z31717), rpsl4 (accession Ho.Z31553).

II.Основное содержание работы.

Литературный обзор посвящен проблеке регуляции экспрессии генов рибосомных белков в E.coli, а также организации генов spc и S10 оперонов у эу- и архебактерий.

Экспериментальная часть.

Материалы, методы и результаты исследования.

В работе применялись стандартные методы генной инженерии. Для секвенирования ДНК использовали Version -2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham) и TagTrack Sequencing Systems (Promega) в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Электрофорез в секвенирующем полиакриламиднои геле проводили на приборе

/

"Макрофор" фирмы Pharmacia-LKB (Швеция). Анализ

последовательностей нуилеотидов и аминокислот на персональном компьютере IBM PC/AT выполнен с помощью программы "MicroGenie" (Beckman, США).

1. Получение библиотеки генов Т.thermophilus и ее скрининг.

На основе известной N-концевой аминокислотной

последовательности рибосомного белка S8, выделенного из 30S рибосомных субчастиц т. thermophilus, была синтезирована смесь олигонуклеотидов (I): 5' ACG(C/G)GACCCG(C/G)ATCGCGCG(C/G)GACATG 3'. Чтобы уменьшить вырожденность смеси, было учтено преимущественное использование кодонов в генах рибосомных белков str оперона Т. thermophilus (Yakhnin et.al., 1990). Гибридизацией по Саузерну фрагментов расщепления хромосомной ДНК Г. thermophilus различными рестриктазами с Р32-меченным олигонуклеотидом I показали, что Pstl-фрагменты ДНК размером 8-10 тыс.пар оснований дают четкий положительный сигнал (рис.1). Для получения библиотеки генов Т. thermophilus линеаризованный рестриктазой Pstl и дефосфорилированный вектор pBR322 лигировали с Pstl-расщепленной ДНК Т.thermophilus и полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli К802. Селекцию

Рис. 1. А. Электрофорез в 0. 87. геле агарозы. Б. Автограф после гибридизации фрагментов рестрикции с меченным олигонуклеотидом I. 1- ДНК фага А, расщепленная EcoRI и Hindlll; 2,3, 4,5-хромосомная ДНК Т. thermophilus, расщепленная, соответственно, BamHI, Bell, Bglll, Pstl; 6-хромосомная ДНК Т. thermophilus.

з

рекомбинантных клонов вели на фенотип Ар"Тсг. Рекомбинантные клоны гибридизовали in situ с меченным олигонуклеотидом I, после чего был идентифицирован клон pBR322tthS8, содержащий ген рибосомного белка S8.

2. Карта рестрикции клонированного в pBR322 фрагмента геномной ДНЮ Т. thermophilus.

Для выделенного из клона pBR322tthS8 фрагмента геномной ДНК Т.thermophilus размером 9 тыс. пар оснований была составлена карта рестрикции (рис.2). Картированы сайты для рестриктаз Xbal, Nrul, Hindlll, Kpnl, Bglll, BamHI, HincII.

Ген белка S8 был локализован в районе двух близкорасположенных сайтов рестрикции эндонуклеазы BamHI. На основании размеров клонированного фрагмента и информации о S10 и spc оперонах из Е. coli мы предположили, что плазмида pBR322tthS8

01 2 3 4 5 6 7 8 9 т. П. о.

hincii hincii hl net i

1-1—1 pstl 1 i 1 bamhi ii bamhi 1 1

hindi i i

bg iii xbal bgl 11

nrul

bglll kpnl

Рис.2. Карта рестрикции клонированного в pBR322 Pstl-фрагмента геномной ДНК Т.thermophilus.

включает целиком S10 оперон и большую часть spc оперона из T.thermophilus. Дальнейшая работа подтвердила правильность нашего предположения.

3. Субклонирование и секвенирование генов rps!7, rpl14, rpI24, rps!4, rps8 T.thermophilus, кодирующих рибосомные белки

S17, L14, L24, S14, S8. Ген белка S8 был амплифицирован с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и субклонирован в фаг Н13 гар18. Праймеры для амплификации были синтезированы на основе опубликованной для T.aquaticus последовательности генов белков S14 и L6, расположенных соответственно в spc опероне перед и после гена белка S8 (Jahn et al., 1991). Учитывая возможные ошибки Tag полимеразы проводили три независимые реакции

амплификации гена грэ8 и продукты этих реакций объединяли. После чего была определена нуклеотидная последовательность гена грэа из 8 индивидуальных клонов. Первичная структура гена г рэ8 и кодируемого им белка Б8 показаны на рис.4.

Рестриктазой ВатН1 из рекомбинантной плазмиды рВЛЗгг^ЬБв был вырезан фрагмент размером 3 тыс. пар оснований, содержащий 3'-концевую часть эре оперона и 3'-концевую часть эю оперона, и клонирован в плазмиду рисиэ (клон рЦСЗВВ) , фрагменты плазмидной ДНК рисЗВВ, полученные после рестрикции №и1 и ВатН1, были субклонированы в фаг М13 тр18, тр19 (рис.3), и гены грв 17, грЛ4, гр124 и грз 14 Т. ЬЬегторЬИиз были секвенированы по обеим цепям.

BamHl Nrul BamHI

I__I ___1 риезвв

S3) LI б )129) S17)L14 1 L24 [ L5 [S14|S8 (3 ? д q }

Nrul BamHI .,,.„„

I_j 1.2 Т. П. o.

I I в M13mpl8, mpl9

-------> vi---->

<-------vil <------

V6---->

<-----Villa

VIII6----->

фр-т 1.8 т. п. о. в М13 mpl8, mpl9

Рис.3. Стратегия секвенирования генов rpsl7, rpll 4, rpl 24, rps 14 T.thermophilus. Va, V6, VI, VII, Villa, VIII6 олигонуклеотиды, использованные как праймеры для секвенирования.

На рис.4 приведены полученные первичные структуры генов rpsl7, rpl 14, rp!24, rpsl4 и кодируемых ими белков S17, L14, L24, S14 Т. thermophilus. 3'- и 5'-концевые участки гена rpl5 также были секвенированы. Никаких отличий от опубликованной ранее (Jahn et al., 1991) нуклеотидной последовательности гена rpl S из Т.thermophilus не обнаружено.

->S17

GAATGCCTAAGAAGGTCCTCACCGGGGTGGTGGTCAGCGACAAGATGCAGAAGACCGTCA ВО MPKKVLTGVVVSDKMQKTV

CGGTCTTGGTGGAGCGCCAGTTCCCCCACCCCCTCTACGGCAAGGTGATCAAGCGCTCCA 120 TVLVERQFPHPLYGKVIKRS

Рис. 4. (Продолжение на следующей странице)

agaagtacctggcccacgaccccgaggagaagtacaagctgggggacgtggtggagatca 180

KKYLAHDPEEKYKLGDVVEI

TTGAGTCCCGGCCCATCTCCAAGCGCAAGCGCTTCCGGGTGCTCCGCCTGGTGGAGTCGG 240

IESRPISKRKRFRVLRLVES

GCCGGATGGACCTGGTGGAGAAGTACCTCATCCGCCGCCAGAACTACCAGAGCCTTTCCA 300

GRMDLVEKYLIRRQNYQSLS ->L14

AGCGGGGAGGTAAGGCATGATCCAGCCGCAGACCTACCTCGAGGTGGCCGACAACACCGG 360 MIQPQTYLEVADNTG

К R G G К A U

GGCCCGGAAGATCATGTGCATCCGGGTGCTCAAGGGCTCCAACGCCAAGTACGCCACCGT 420 ARKIMCIRVLKGSNAKYATV

GGGGGACGTGATCGTGGCCAGCGTCAAGGAGGCCATCCCCCGGGGGGCGGTCAAGGAAGG 480 GDVIVASVKEAIPRGAVKEG

GGACGTGGTCAAGGCCGTGGTGGTGCGCACCAAGAAGGAGGTCAAGCGCCCCGACGGCTC 540 DVVKAVVVRTKKEVKRPDGS

CGCCATCGGCTTTGACGACAACGCCGCCGTGATCATCAACAACCAGCTGGAGCCCCGCGG 600 AIRFDDNAAVIINNQLEPRG

CACCCGCGTCTTCGGCCCCGTGGCCCGGGAGCTTCGCGAGAAGGGCTTCATGAAGATCGT 660 TRVFGPVARELREKGFMKI V ->L24

CTCCCTGGCGCCGGAGGTGCTCTAATGCGGGTGAAGATGCACGTGAAGAAGGGGGACACG 720 SLAPEVLUMRVKMHVKKGDT

GTTCTCGTGGCCTCCGGCAAGTACAAGGGCCGGGTGGGCAAGGTGAAGGAGGTCTTGCCC 780 VLVASGKYKGRVGKVKEVLP

AAGAAGTACGCCGTCATCGTGGAGGGGGTCAACATCGTGAAGAAGGCGGTGCGGGTGAGC 840 KKYAVIVEGVNIVKKAVRVS

CCTAAGTACCCCCAGGGCGGCTTCATTGAGAAGGAGGCCCCCCTGCACGCCTCCAAGGTC 900 PKYPQGGFI EKEAPLHASKV

CGCCCCATCTGCCCCGCTTGCGGCAAGCCCACCCGGGTGCGGAAGAAGTTCCTGGAGAAC 960 RPICPACGKPTRVRKKFLEN

GGCAAGAAGATCCGGGTCTGCGCCAAGTGCGGCGGGGCCCTGGACACGGAGGAGTGAGGT 1020 GKKIRVCAKCGGALDTEEU ->L5

ATGCCCTTGATGCCCTTGGACGTGGCCCTTAAGCGCAAGTACTACGAGGAGGTCCGCCCC 1080 MPLMPLDVALKRKYYEEVRP

GAGCTCATCCGCCGCTTCGGCTACCAGAACGTCTGGGAGGTGCCCAGGCTGGAGAAGGTG 1140 ELIRRFGYQNVWEVPRLEKV

GTCATCAACCAGGGGTTGGGCGAGGCCAAGGAGGACGCCCGCATCCTGGAGAAGGCGGCC 1200 V1NQGLGEAKEDARILEKAA

CAGGAGCTCGCCCTCATCACGGGGCAGAAGCCCGCGGTCACCCGGGCCAAGAAGTCCATC 1260 QELALITGQKPAVTRAKKSI

Рис.4. (Продолжение на следующей странице)

TCCAACTTCAAGCTCCGCAAGGGGATGCCCATCGGCCTCCGGGTCACCCTGCGGCGCGАС 1320 SNFKLRKGMPIGLRVTLRRD

CGGATGTGGATCTTCCTGGAAAAGCTCCTCAACGTGGCCCTTCCCCGCATCCGCGACTTC 1380 RMWI FLEKLLNVALPRI RDF

CGGGGGCTCAACCCCAACAGCTTTGACGGCCGGGGCAACTACAACCTGGGCCTGAGGGAG 1440 RGLNPNSFDGRGNYNLGLRE

CAGCTCATCTTCCCGGAGATCACCTACGACATGGrGGACGCCCTGCGGGGCATGGACATC 1500 QLIFPEITYDMVDALRGMDT

GCGGTGGTGACCACCGCCGAGACCGACGAGGAGGCCCGGGCCCTTTTGGAGCTTTTGGGC 1560 AVVTTAETDEEARALLELLG

->S14

TTCCCCTTCCGCAAGTGAGGTTGCGATGGCGAGAAAGGCGCTGATTGAGAAGGCCAAGCG 1620 FPFRKU MARK ALI EKAKR

GACCCCTAAGTTCAAGGTGCGGGCCTACACCCGCTGCGTGCGGTGCGGCCGCGCCCGGAG 1680 TPKFKVRAYTRCVRCGRARS

CGTGTACCGCTTCTTCGGGCTCTGCCGGATCTGCCTGCGGGAGCTCGCCCACAAGGGGCA 1740 VYRFFGLCRICLREL AHKGQ

GCTTCCCGGGGTGCGGAAGGCCAGCTGGTAGGCCGTGGTCCGGTCGGGGGGGTTCTCCCG 1800 LPGVRKASWU

—>S8

AGACCGCATGGGCCAGGAGTAGCGACAAAGGAGAGCGGAAATGCTGACGGATCCCATCGC 1860

M L T D P I А

CGACATGCTGACCCGGATCAGGAACGCCACCCGGGTCTACAAGGAGAGCACGGACGTGCC 1920 DMLTRIRNATRVYKESTDVP

CGCCTCCCGCTTCAAGGAGGAGATCCTGAGGATCCTCGCGCGGGAGGGGTTCATCAAGGG 1980 ASRFKEEILRILAREGFIKG

GTACGAGCGGGTGGACGTGGACGGCAAGCCCTACCTGCGGGTCTACCTGAAGTACGGCCC 2040 YERVDVDGKPYLRVYLKYGP

CCGGCGCCAAGGGCCTGACCCCAGGCCGGAGCAGGTGATCCACCACATCCGGCGGATCAG 2100 RRQGPDPRPEQVIHHIRRIS

CAAGCCGGGGCGGCGGGTGTACGTGGGGGTCAAGGAGATCCCCCGGGTGCGCCGGGGCCT 2160 KPGRRVYVGVKEIPRVRRGL

GGGGATCGCCATCCTCTCCACCTCCAAGGGGGTTCTCACCGACCGTGAGGCCCGGAAGCT 2220 GIAILSTSKGVLTDREARKL

->L6

GGGCGTGGGCGGCGAGCTCATCTGCGAGGTGTGGTGATGTC GVGGELICEVWU

Рис.4. Нуклеотидная последовательность конца S10 и начала spc оперонов Т. thermophilus. Открытые ранки считывания (позиции 3-320, 317-685, 685-1017, 1021-1578, 1586-1771, 1341-2257) соответствуют генам rps17, rp!14, гр124, rpl5, rpsl4, rps8, кодирующим рибосомные белки S17, L14, L24, L5, S14, S8. Нуклеотидная последовательность гена rplS была определена О. Яном (Jahn et al., 1991).

4. Локализация генов, расположенных на 3'-конце spc оперона

Г.thermophilus.

Частичное секвенирование BamHI-Pstl фрагнента размером 2. 2 тыс. пар оснований, вырезанного из плазмиды pBR322tthS8 и субклонированного в плазмиду pUCH9 (клон pUC2.2BP), показало, что 3'-концевая часть spc оперона Т. thermophilus, также как и в E.coli, включает гены рибосокных белков L6, L18, S5, L30 и L15 (рис. 8) .

5. Экспрессия в E.coli гена rps8, кодирующего рибосомный белок S8 т.thermophilus.

Получение штаммов-суперпродуцентов для рибосомных белков представляет собой достаточно сложную задачу, поскольку рибосомные белки в своем большинстве имеют сильно основной характер. Значительное "перепроизводство" рибосомного белка в клетке может приводить к серьезный повреждениям в аппаратах репликации, транскрипции и трансляции, так как эти белки могут образовывать неспецифические комплексы со всеми компонентами клетки нуклеиновой природы: РНК, ДНК и рибосомами.

Рис.5. Экспрессия в E.coli гена белка S8 Т.thermophilus. 1 - рибосомный белок S8, выделенный из рибосом Т.thermophilus; г суммарные белки из штамма E.coli BL21(DE3), содержащего плазмиду рЕТЗ-1 без встроенного гена rps8; 3, 4, 5 - суммарные белки из трех независимых рекомбинантных клонов BL21(DE3)/pET-tthS8. Образцы

подвергали электрофорезу в 15Х ПААГ/SDS.

Для получения штамма-суперпродуцента рибосомного белка Э8 была использована система экспрессии Штудиера, включающая

штамм-хозяин BL21(DE3) и вектор рЕТЗ-1 (Studier et al., 1990). Ген белка S8 был клонирован в плазмнду рЕТЗ-1 по сайтам Ndel и Xhol.

Рекомбинантные клоны BL21(DE3)/pET-tthS8 растили в среде M9ZB при 30°с до оптической плотности Л -о,8-1,0. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5-1,0 мМ и растили еде 3 часа. Уровень синтеза S8 проверяли электрофорезом в 15% .ПААГ в присутствии SDS (Рис.5). Продукция белка S8 составила до 10Х от суммарного клеточного белка. В основном белок накапливался в растворимой форме.

6. Выделение гомогенного препарата рибосомного белка S8 из суперпродуцентного штамна BL21(DE3)/pET-tthS8.

Выделение белка S8 из суперпродуцентного штамма проводили по следующей схеме: отмытые клетки разрушали ультразвуком, затем добавляли к клеточному лизату NaCl до конечной концентрации о. 8 М, чтобы уменьшить соосаждение белка S8 с белками Е.coli на последующих стадиях; от обломков клеточных стенок и рибосом освобождались последовательным центрифугированием клеточного лизата 10 мин при 13 ОООд и 3 часа при 100 ОООд; пострибосомный лизат прогревали 20 мин при 70°С, в результате чего белки Е. coli денатурируют и образуют нерастворимый осадок, тогда как основная часть термостабильного белка S8 остается в растворе. После этого одной хроматографии на колонке с СИ(carboxymethyl)- Toyopearl было достаточно, чтобы получить препарат белка S8 с чистотой 95-98% по данным электрофоретического анализа. Предложенная схема выделения белка S8 позволяет из 4-5 г клеток (1 л клеточной культуры) выделить 8-12 мг белка S8.

7. Физико-химические характеристики белка S8 из Т. thermophilus.

Выделенный нами рибосомный белок S8 из Т.thermophilus был охарактеризован методами кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии. Спектры КД позволяют оценить содержание элементов вторичной сруктуры в белке, спектры флуоресценции позволяют изучать конформационные превращения белка.

7.1. Вторичная структура белка S8 из Т. thermophilus.

Исследования спектров КД выполнены совместно с К. С. Василенко (Институт белка РАН). Спектры КД в дальней УФ области рибосомных белков S8 из Т. thermophilus и E.coli (Wu et al., 1993) показаны

на рис.6. Оба белка имеют схожие спектры: максимум около 195 нм и минимумы около 208 нм и около 220 нм. Содержание а-спиралей и 0-структуры, рассчитанное по методу Провенчер-Глукнера, составляет для белка ЭЗ из Т. 0]егторЛИив 12% и 60% соответственно; для белка Б8 из Е.соИ по данным, полученным в группе Зиммермана, - 10-13% а-спиралей и 56-60% ^-структуры.

7.2. Исследование устойчивости в8 к денатурации мочевиной.

Исследования денатурации мочевиной белка 88 из Т^ЬегшорЬИиз проводили на спектрофлуориметре "БРР-ЮООСБ" ("Алипсо", США) совместно с В.Н.Уверским и И.В. Нарижневой (Институт белка РАН).

10000

5000

-5000

fA

200

220

240 о

2 4 6 8

концентрация мочевины (М)

Рис. 6. Спектры кругового Рис. 7. Индуцированная мочевиной

дихроизма рибосомных белков S8 денатурация белков S8 из из Т. thermophilus (кривая 1) и Т. thermophilics (кривая 1) и Е.coli (кривая 2). Е.coli (кривая 2). На вставке

приведены спектры триптофановой флуоресценции белка S8 в нативных условиях (кривая 1) и полностью развернутом мочевиной состоянии (кривая 2).

Денатурационная кривая, полученная при исследовании индуцированного мочевиной конформационного перехода в белке S8 из Т. thermophilus, представлена на рис.7 (кривая 2). На этом же рисунке приведена денатурационная кривая (кривая 1), отражающая аналогичный конформационный переход в белке S8 из Е. coli (кривая

О

адаптирована из работы Wu et al., 1993). На вставке к рис.7 приведены спектры триптофановой флуоресценции белка S8 в нативном и полностью развернутом состояниях.

Как следует из рисунка 7, белок S8 из Т. thermophilus более устойчив к денатурации мочевиной, чем гомологичный белок из Е. coli - денатурационная кривая существенно сдвинута в сторону больших концентраций денатуранта.

III. обсуждение результатов.

1. Особенности организации S10 и spc оперонов Т. thermophilus.

Также как и в E.coli spc оперон в т. thermophiIns расположен на хромосоме сразу же после S10 оперона (рис. S). Однако, в отличие от E.coli, в Т. thermophi Ins, также как и в Т. aquaticus, не обнаружено спейсера между этими двумя оперонами: терминирующий кодон последнего гена (rpsl7) S10 оперона перекрывается с инициирующим кодоном первого гена (rpl14) spc оперона. Состав и

Pstl Bglll ВдШ Hindi Xbal

HincII BamHl

Bglll

L29

S10

L3

L4 L23

12

S19 L22

S3

L16

SI?

S10 оперон

HincII BamHI BamHI

Hindlll Kpnl Pstl

124 L5 V | S8 L6 LI 8 S5 L15

яре оперон 314 00

Рис.8. Схенатичное изображение генов рибосомных белков Б10 и врс оперонов, содержащихся в клонированном фрагменте геномной ДНК Т. ЫегторЫ1из размером э тыс. п. о. Гены, нуклеотидная последовательность которых полностью определена, представлены заштрихованными прямоугольниками.

расположение генов рибосомных белков в БЮ-эрс кластере Г. СЬегторЫДиэ полностью совпадает с организацией такового в исследованных эубактериях.

Подобно Т. адиа^сиэ для Т. ГйеглгарйНиз характерно полное отсутствие спейсеров между генами гр!14 и гр.124, грэ8 и гр1в. Между генами гр124 и гр15 расположен короткий спейсер. В случае полного отсутствия межгенного участка стоп-сигнал предыдущего

гена перекрывается с инициирующим кодоном последующего гена. По сравнению с Е. coli для термофильных бактерий прослеживается явная тенденция к уменьшению межгенных спейсеров, что, возможно, вызвано экстремальными условиями обитания этих бактерий.

Особый случай представляет собой межгенный участок S14-S8 размером в 69 пар оснований; длина соответствующего спейсера в Т. aquaticus - 67 пар оснований, в Е.coli - 35 пар оснований. Функциональное назначение такого длинного спейсера в термофильных бактериях пока неясно.

Для всех исследованных генов в 4-9 нуклеотидах перед инициирующим кодоном локализована последовательность

Шайна-Дальгарно. В Т.thermophilus расстояние между

последовательностью Шайна-Дальгарно и ATG кодоном уменьшается (4-7 нуклеотидов) по сравнению с E.coli (6-9 нуклеотидов).

2. Структура предполагаемого репрессорного участка spc оперона Т.thermophilus.

Для E.coli установлено, что синтез белков spc оперона регулируется белком S8, который при избыточном синтезе относительно X6S РНК связывается со своей кРНК в районе цистрона белка L5 и репрессирует ее трансляцию. Структуры участков spc мРНК и 16S РНК, связывающих белок S8, очень схож«.

Учитывая одинаковую организацию генов рибосомных белков spc оперона Т.thermophilus и E.coli, кы предположили, что и механизмы их регуляции могут быть достаточно похожи. Это предположение подтверждается также фактами, что белки S8 из этих бактерий имеют высокую гомологию по первичной и вторичной структурам и узнают в 16S РНК Т. thermophilus и Е. coli похожие участки.

На основе компьютерного анализа в конце цистрона белка S17 был локализован участок, представляющий собой несовершенную "шпильку" из трех спиральных и двух неспаренных участков и имеющий гомологию с Бв-связывающим участком 16S рРНК Т.thermophilus по первичной и вторичной структурам (рис.9). Возможно, что в Т.thermophilus белок S8 связывается с этой шпилькой и тек самым регулирует экспрессию генов рибосомных белков spc оперона.

с g g-u c-g c-g u-a c-g g-u„

g-c g-c c-g c-g u-a u-g

c"ga -G-Ca

g-c „AA-U

aa-u

c-g c-g u-a c-g u-a A A 195 262

С

u a С A c-g c-g g-c u-a g-c

spc оперон T. thermophilus

16s рнк T. thermophilus

CG

Рис.9. Сравнение вторичных структур участков spc оперона и 16S рРНК, предположительно узнаваемых белком S8. В рамку заключены консервативные участки, гомологичные РНК-связывающему сайту 16S рРНК Е.coli.

3. Особенности генов rps17, rpi14, rp!24, rps14, rpsS T. thermophilus и кодируемых ими белков.

Для генома т.thermophilus характерен высокий G+C состав -66,3%. G+C состав гена rpsl7 - 62%, гена rpil4 - 67%, гена rpi24 - 65%, генов rps14 и rps8 - 68%. В третьем положении кодонов процент G+C ещё выше - около 94%. Высокое содержание G+C нуклеотидов в генах рибосомных белков T. thermophilus, хорошо согласующееся с данными по G+C составу для других генов термофильных белков отражает, по-видимому, адаптацию термофилов к высокой температуре роста.

Были обнаружены небольшие различия по аминокислотному составу исследуемых нами белков spc оперона T. thermophilus и Е. coli (таблица 1).

< *

Таблица 1. Сравнение состава аминокислот рибосомных белков S17, L14, L14, S14, S8 из Т. thermophilics (Tth) и из Е. coli (Ее).

S17 L14 L24 S14 S8

Tt Ее Tt Ее Tt Ее Tt Ее Tt Ее

Ala 2 2 13 7 8 9 7 11 6 14

Arg 11 7 10 12 7 Ё 11 14 20 8

Asn 1 2 5 6 2 6 0 3 1 3

Asp 4 4 6 5 2 5 0 5 7 6

Cys 0 2 1 2 4 0 4 1 1 1

Gin 4 1 3 3 1 3 1 4 2 6

Glu 7 7 8 6 7 6 2 5 10 8

Gly 6 4 9 12 11 10 4 6 13 11

His 2 3 0 1 2 1 1 1 2 0

He 5 7 9 12 5 8 2 4 12 9

Leu 10 5 6 8 5 4 5 8 11 10

Lys 15 10 11 11 20 16 7 11 9 12

Met 3 2 3 4 2 1 1 3 2 6

Phe 2 2 3 3 2 5 3 3 2 3

Pro 5 2 6 5 7 3 2 4 9 5

Ser 7 4 4 6 3 5 2 7 5 7

Thr 3 6 5 5 3 3 2 2 6 6

Trp 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0

Tyr 5 1 2 1 3 0 2 1 6 3

Val 13 12 18 14 16 13 4 5 13 12

Кислые (Asp+Glu) 11 11 14 11 9 11 2 10 17 14

Основные (Arg+Lys) 26 17 21 23 27 22 18 25 29 20

Ароматические 7 4 5 4 5 5 6 5 9 6

(Phe+Trp+Tyr)

Гидрофобные 38 30 41 42 33 31 18 25 47 43

(аром. +Ile+Leu+Met+Val)

Всего 105 84 122 123 110 104 61 99 138 130

4. Гомология белков S17, L14 , L24 S14 И S8 из Т. thermophilics с

аналогичными белками из других эубактерий. В таблице 2 приведены данные по гомологии между рибосомными

белками S17, L14, L24, S14 и S8 из различных бактерий. Наиболее консервативным является белок L14, имеющий 100'/. гомологию с L14 из Т. aquaticus и 70Х гомологию с L14 из E.coli. Менее консервативными являются белки L24 и S17. Низкая гомология термофильного белка S14 с аналогом из Е.coli объясняется тем, что белок S14 из E.coli содержит дополнительные 38 аминокислот в центральной части белка, тогда как N - и особенно С - концы этого белка достаточно консервативны.

Таблица 2. Гомология в процентах между рибосомными белками S17, L14, L24, S14, S8 из T. thermophilus и их аналогами из T. aquaticus (Taq) , E.coli (Eco), B.subtilis (Bsu) .

Гомология, в У.

Рибосомный - Количество

белок Tth Taq Eco Bsu аминокислот

S17 Tth _ 93 . 4 37 39, . 1 105

Taq 93 . 4 - 48, .8 49. .4 105

Eco 37 48. 8 - 52. .3 84

Bsu 39. 1 . 49. 4 52 .3 - 87

L14 Tth _ 100 69, .9 64 , .8 122

Taq 100 - 69 .9 64, .8 122

Eco 69. 9 69. 9 - 64, .2 123

Bsu 64 . 8 64 . 8 64 .2 - 122

L24 Tth - 85 . 6 42 , .9 48. . 6 110

Taq 85. 6 - 45. .4 49. .5 110

Eco 42 . 9 45. 4 - 46. .7 104

Bsu 48 . 6 49 . 5 .7 " 103

S14 Tth _ 96. 7 : ■ 68 61

Taq 96. 7 - 26, .7 70. .5 61

Eco 25 26. 7 - 30. .7 99

Bsu 68 70. 5 30, .7 - 61

S8 Tth _ 94 48 _ 138

Taq 94 - 46. .8 - 138

Eco 48 46. 8 - - 130

5. Сравнение физико-химических свойств белков_S8

из T. thermophilus и из E.coli.

Исследования "сердцевинных" рибосомных белков, обладающих высоким сродством к РНК, затруднено из-за значительных проблем с их выделением в препаративных количествах. Использование экспрессирующей системы Штудиера (Studier et al., 1989) позволило получать белок S8 в препаративных количествах и начать его кристаллизацию и структурные исследования.

Анализ спектров КД белков S8 из Г. thermophilus и из E.coli (рис. 6) показал, что оба белка имеют высоко упорядоченную структуру и что содержание а- и р-структурных участков в них примерно одинаковое, несмотря на то, что их гомология по первичной структуре составляет лишь 47 7..

Характерной чертой белка S8 из T. thermophilus является высокая устойчивость к денатурирующим агентам (мочевине, температуре). Денатурация мочевиной белка S8 из термофила

протекает более кооперативно, а свободная энергия его стабилизации в отсутствие денатуранта почти втрое превосходит соответствующую величину, полученную для белка S8 из E.coli. Нагревание раствора белка до 94°С не приводило к заметным изменениям его структурных свойств, тогда как незофильный белок S8 был денатурирован с точкой полуперехода 57°С (Wu et al., 1993).

Структурные исследования белка S8 будут продолжены и уже получены первые кристаллы этого белка.

ОСНОВНЫЕ выводы.

1. Получена библиотека генов Г.thermophilus в плазмиде pBR322 и идентифицирован клон, содержащий полный S10 оперон и десять генов рибосомных белков spc оперона.

2. Определена полная первичная структура генов rps17, rpl14, rpI24, rpsl4 и rps8, кодирующих рибосомные белки S17, L14, L24, S14, S8 Т.thermophilus,

3. Показано, что содержание G+C нуклеотидов в исследованных генах рибосомных белков Т.thermophilus составляет 62-68%, а в третьем положении кодонов - 94-95У..

4. Показано, что рибосомные белки S17, L14, L24, S14, S8 Т.thermophilus очень близки по последовательности аналогичным белкам других эубактерий.

5. На основе компьютерного анализа локализован предполагаемый репрессорный участок spc оперона, гомологичный S8-связывающему участку 16S рРНК.

6. Получен штамм-суперпродуцент для рибосомного белка S8 из Т.thermophilus и белок выделен в препаративных количествах.

7. Показано, что белок S8 из Т.thermophilus обладает выраженной вторичной структурой и более устойчив к действию денатурирующих агентов, чей белок S8 из E.coli.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Vysotskaya V. , Tischenko S., Garber M.B., Kern D., Mougel M., Ehresmann C., Ehresmann B. The ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus VK1: sequencing of the gene, overexpression of the protein in E.coli and interaction with rRNA. Eur.J.Biochem., 1994, v.223, No.2, p.437-445.

2. В.С.Высоцкая, У. Ф. Насибуллин, В. Н. Уверский, К.С.Василенко, Н. В. Нарижнева, М. Б.Гарбер. Структурные свойства рибосомного

белка S8 из экстремального термофила Т. thermophilics. Биоорганическая химия, 1995, т. 21, в печати.

В банк последовательностей нуклеотидов (The EMBL Data Library) помещены первичные структуры генов rpsll, accession no,236971; rpl14, accession no.Z37993; rpl24, accession no.Z31717; rpsl4, accession no.Z315S8.

9.4.10.94 т1. '3ny. o4i7P. Tup.100 экз. Хч.-.-.з.^..-. 1,0 Отпоччтпно ня ротапринте в СНТ!! ГШ РАК