Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, исследование и кристаллизация РНК-связывающих рибосомных белков из THERMUS THERMOPHILUS

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, исследование и кристаллизация РНК-связывающих рибосомных белков из THERMUS THERMOPHILUS"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В Ломоносова

На правах рукописи УДК 577. 963. 3

ТИЩЕНКО Светлана Викторовна

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИССЛЕДОВАНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ ИЗ ТНЕИМиЗ ТНЕИМОРНГЬиЗ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -

1995

Работа выполнена в Институте белка Раи

Научный руководитель:

кандидат биологических наук М.Б.ГАРБЕР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук А.М.КОПЫЛОВ

кандидат химических наук Т.А.МУРАНОВА

Ведущая организация: Институт биохимии им.Баха РАН

Защита диссертации состоится " ' / " 1995 г.

в 40 час 00 мин на заседании диссертационного совета Л 053.05.70 при Московском государственном университете им. И.В.Ломоносова, по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, ИГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 1995 Г,

Ученый секретарь /■'/

диссертационного совета /у1

/^ /

кандидат химических наук В. Н. Каграманов

Х /

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение структуры рибосомы очень важно пя понимания механизма биосинтеза белка. К настоящему времени олучены кристаллы рибосом и рибосомных субчастиц из термофильных галофильных микроорганизмов, таких как Bacillus tearoüermophilus, Thermus thermophilus, Halobacterium

arismortui. Определение пространственной структуры такого ложного объекта как рибосома представляет собой сложную задачу, оэтому очень актуальными являются структурные исследования тдельных компонентов рибосомы, в частности рибосомных белков, а акже их комплексов с рРНК.

В Институте белка РАН ведётся работа по выделению, ристаллизации и рентгеноструктурным исследованиям рибосомных елков из экстремально термофильной бактерии Thermus hermophilus. Белки и нуклеиновые кислоты из термофильных актерий очень стабильны и поэтому перспективны для структурных сследований. Были получены кристаллы ряда рибосомных белков (S6, 1, L30, S15, S7, L22) и определена пространственная структура елков S6 и LI с разрешением до 2 Ü. Параллельно ведётся работа о клонированию, секвенированию и суперэкспрессии генов ибосомных белков иэ этого микроорганизма.

Некоторые из рибосомных белков играют ключевую роль в сборке ибосомы и являются репрессорами трансляции. Такие белки особенно нтересны для изучения РНК-белковых взаимодействий и механизмов вгуляции трансляции. В основном это белки, связывающиеся с рРНК рочно и специфично, так называемые «сердцевинные» белки. Очень нтересным объектом исследования РНК-белковых взаимодействий вляется также структурно независимый домен 50S субчастицы - 5S РНК-белковый комплекс. Настоящая работа является частью омплексных исследований РНК-связывающих рибосомных белков из .thermophilus, ведущихся в Институте белка.

Цель работы - выделение, исследование и кристализация ибосомных РНК-связывающих белков из Т.thermophilus.

Основные задачи работы: Разработка метода выделения сердцевинного», белка-репрессора S8 из Т. thermophilus из клеток гамма-суперпродуцента E.coli. Изучение его РНК-связывающих войств, кристаллизация белка и первые этапы структурных ^следований. Получение стабильных 5S рРНК-белковых комплексов и

их исследование.

Научная новизна и практическая ценность работы: Разработана методика выделения белка S8 T.thermophilus из клето! штамма-суперпродуцента E.coli и найдены оптимальные условш связывания белка со специфическим фрагментом 16S рРНК. Результать работы используются при выделении других рибосомных белков и: клеток штаммов - суперпродуцентов. Получены кристаллы белка S8, пригодные для рентгеноструктурного анализа с разрешением не мене< 3 X. Проведены предварительные кристаллографически!

исследования. Кроме того, получены стабильные гибридные комплекс! 5S рРНК из E.coli и В. stearott^rmophilus и белков TL4 и TL5 и: Г. thermophilus. Показано, что белок TL4 конкурирует за связыванш с 5S рРНК с белком L5 из рибосом E.coli, а белок TL5 - с белкам! L18 и L25 ИЗ Е. coli.

Структура диссертации: Диссертация состоит из трё: частей: 1) обзор литературы, 2) экспериментальная часть, 3 результаты и их обсуждение. Работа завершается выводами и списко: цитируемой литературы ( ссылка). Работу иллюстрируютd'

рисунков и 2 таблицы. Общий объём диссертации страницы.

Апробация работы и публикации. Результаты докладывались н: научных конферещиях Института белка РАН (Пущино, 19ЭЗ, 1995) : на международной конференции «Структура и функция рибосом: (Виктория, Канада, май 1995). По теме диссертации опубликован! четыре печатные работы.

Обзор литературы посвящен исследованиям «сердцевинных РНК-связывающих белков 30S субчастицы и 5S рРНК-белковог комплекса из рибосом E.coli." Приводятся данные об участка: связывания на РНК и белках, рассмотрены особенност пространственной структуры РНК-связывающих белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕН Глава 1. Гибридные 5S рРНК-белковый комплексы.

Данная часть настоящей работы посвящена получению и исследованию стабильных 5S рРНК-белковых комплексов. Нами были получены гибридные комплексы 5S рРНК E.coli или 9. stearottermophilus с белками из рибосом Т. thermophilus. Было локазано, что только два рибосомных белка TL4 и TL5 образуют стабильный комплекс с 5S рРНК E.coli (рис. 1).

I

TL«

»TU

_ *пл

Т1.'# _ Т1.6 I TL8

TL7 J19

IUI TLJO TLlITP^^nu

TLi5._ TL16TI i?

tlS ,UtH*

„ П.21

TL23

ri :</

ТЧГ'П

Зис. 1. Двумерные электрофореграммы рибосомных белков Г. thermophilus: (А) белки из 50S субчастиц, (Б) из гибридного 5S эРНК-белкового комплекса.

Комплекс с таким же белковым составом мы получили, используя 5S рРНК из В. stearoü-ermopíiilus. Эти белки связываются с 5S рРНК независимо друг от друга со стехиометрическим соотношением белков < 5S рРНК примерно 1:1. Содержание белков TL4 и TL5 в гибридном 5S зРНК- белковом комплексе выше, чем белков L5, L18 и L25 в 5S эРНК-белковом комплексе из E.coli (Рис.2). Это указывает на то, но в одних и тех же условиях рибосомные белки из Т. thermophilus гвязываются с 5S рРНК. прочнее, чем рибосомные белки Е. coli.

ABODE

TL5-EL5— TL4-

EL18- — EL25""

te

Рис.2. Белки из 5S рРНК белкового комплекса из Е. coli (А, Е) ; и гибридного SS рРНК-белкового комплекса (В); белки, связанные с 5 рРНК после центрифугирования в градиенте сахарозы смеси 5 рРНК-белкового комплекса из Е.coli и белка TL5 (С) или белка TL

Белки TL4 и TL5 - это большие рибосокные белки с молекулярно массой около 20 ООО Да (рис 2В). На двумерных электрофорегракма видно, что белок TL5 один из наиболее кислых белков в 50 рибосомной субчастице T. thermophilus (рис. 1А). Аналогичного белк в 50S субчастицах Е. coli нет. Возможно, белок TL5 являете эволюционным приобретением экстремально термофильных бактерий.

Нами было установлено, что белок TL4 конкурирует з связывание с 5S рРНК с белком L5 из рибосом Е. coli, а белок TL5 белками L18 и L25 из Е. coli (рис. 2, линии С, D). Белки TL4 и TI вытесняют белки L5, L18 и L25 из 5S рРНК-белкового комплекс E.coli. Эти результаты позволяют предположить, что белки TL4 иТХ также как ' L5 и L18 и L25 имеют схожие участки связывания^ молекуле 5S рРНК. Гонгадзе совместно со Шрёдером ( Гонгадзе и др статья в печати) показали, что N-концевая аминокислотна последовательность белка TL4 (39 аминокислот) идентич1 аминокислотной последовательности белка L5 из Г.thermophilus определённой по соответствующему гену (Jahn et al., 1991). Беле

(D).

5 из Т. thermophilus является гомологом белка L5 из E.coli (56Х окологии) и имеет аминокислотную последовательность полностью дентичную последовательности белка L5 из T.flavus. С белком L5 из hermus aquaticus гвмвлогия по первичной структуре составляет 95% Jahn et al., 19»1).

Что касается белка TL5, то к настоящему времени определены 50 кинокислот с N-конца его полипептидной цепи. В этом участке белка омологии ни с рибосомными белками L18 и L25, ни с другими ибосомными белками не обнаружено (Гонгадзе и др. статья в ечати). Для тщательного сравнения необходима полная минокислотная последовательность белка.

Глава 2. Выделение белка S8 Т. thermophilus из суперпродуцентного штамма.

Белок S8 из рибосом Т. thermophilus впервые был выделен лисейкиной (Reinbolt et al., 1993). По подвижности в двумерном лектрофорезе этот белок сначала был обозначен как белок TS7 рис.3), позднее по N-концевой аминокислотной последовательности н был идентифицирован как гомолог белка S8 из E.coli. минокислотная последовательность данного белка была определена в аборатории Эресманна во Франции (Reinbolt et al., 1993).

1V.4 __

4P т:,'0

Рис. 3.

Двумерная электрофореграмма белков из 30S субчастицы Г. thermophilus.

30S

Ген рибосомного белка S8 из Г, therrnophilus был клонирован, секвенирован л экспрессирован в клетки E.coli BL21(DE3) под контролен Т7-промотора Высоцкой (Vysotskaya et al. , 1994). Рибосокный белок S8 из Т.thermophilus является основный: изоэлектрическая точка, рассчитанная по аминокислотной последовательности, равна 11. Чтобы предотвратить соосаждение суперэкспрессированного белка с мембранами, рибосомами, РНК и белками E.coli, при разрушении клеток использовали высокук концентрацию соли (О,8-IM NaCl). Первые этапы очистки белка S8 (осаждение мембранной фракции, рибосом и прогрев при 70°с) привели к значительному увеличению его содержания относительно содержани* других белков (рис.4).

"1

1 2 3 4 5 Б 7 8 9 10 11 12,

Рис.4. БОЗ-электрофореграмма выделения рибосомного белка Б8 Т therлюphilus из клеток штамма-суперпродуцента.

1-клеточный лизат после осаждения мембран, 2- препарат белка Б8 выделенный из ркбосок Т. ^егторЫ 1иэ, 3- безрибосомный экстрак после прогревания при 70°С, 4-12- фракции, содержащие белок Б8 после хроматографии на СИ-Тоуореаг1.

Дальнейшая очистка белка проводилась на катионообменнии (СМ-Тоуореаг1). Перед нанесением на колонку раствор бел* переводили в Ка-ацетатный буфер (рН 5,5) с 0,25 М ИаС1 разведение соответствующим буфером Мы использовали на данном этапе очисть разведение, так как понижение концентрации ИаС1 до 0,25 М пут€

б

диализа или гельфильтрации приводило к образованию груднорастворимого осадка, содержащего преимущественно белок Б8. Зелок 58 элюировали с колонки градиентом концентрации ЫаС1 от 0,25 до 1М в ^-ацетатном буфере (рН 5,5). В результате был получен 5елок 38 с чистотой 95-98'/. (рис. 4). Спектр поглощения рекомбинантного белка Э8 в ультрафиолетовой области был идентичен спектру поглощения белка Б8, выделенного из рибосом Т.СЪегторМ1цз (рис. 5).

¿60 230 300 320

длина волны.нм

Рис.5. Спектр поглощения белка Б8 из Т. ЬЬегторЬИив в ультрафиолетовой области.

Методы БОБ (рис.4) и двумерного электрофореза (рис. 6В) показали, что эти белки совпадают по подвижности. Необходимо отметить, что на двумерном электрофорезе белок Б8 всегда (как выделенный из рибосом Т. ЬЬегторЫ1иБ (рис. 3) так и рекомбинантный (рис. 6А) представлен двумя пятнами, которые отличаются по заряду. Причём, мажорной обычно является форма с более положительным зарядом. Скорее всего это явление связано с посттрансляционной модификацией белка, возможно, с

дезамидированием или метилированием лизинов. В присутсвии тиогликолевой кислоты при двумерном электрофорезе белка Э8 также наблюдаются два пятна, следовательно, эта модификация не связана с карбомоилированием белка. Мы пытались разделить две формы белка Б8 с помощью хроматографии, но пока нам это не удалось сделать. По-видимому, разница между двумя формами настолько мала, что только такой чувствительный метод как двумерный электрофорез способен её выявить. *

А Б

Рис.Б. Двумерные электрофореграммы А) рекомбинантного белка бв, В того же белка с добавлением тотального белкового препарата 30 субчастицы Т. ^егторМ1иг.

Глава 3. Взаимодействие белка S8 из Т. thermophilus со специфическими фрагментами 16S рРНК из Т.thermophilus и из

В. coli.

Область связывания белка S8 на 16S рРНК Е. coli была определе довольно давно (Ungewickell et al., 1975). Взаимодействие белка S из E.coli с 16S рРНК было тщательно исследовано в лаборатори Эресманна во Франции. Были определены кинетические

термодинамические характеристики связывания (Mougel et al., 1986 и локализован минимальный фрагмент 16S рРНК, необходимый дл узнавания и связывания белка S8 (Mougel et al. , 1987; Mougel e al., 1993; Wu et al., 1994). Этот фрагмент содержит нерегулярну спиральную область (588-605/633-651) с неканонической U-V парой окружённой тремя выпяченными аденинами (рис. 7А). В 16S рРН T.thermophilus был также локализован гомологичный участо связывания белка S8 ( с 571 по 634 нуклеотид) (Vysotskaya et al. 1994) (рис. 7Б). Хотя эти фрагменты 16S рРНК, по-видимому, имею схожую вторичную структуру, участок рРНК из Т.thrmophilus вероятно, более стабилен вследствие высокого содержания G-C пар.

и ° А

С А

S -С G -С

а • и с - а с -а

ис а

А .

о - а

* G • и

и * G

G — С

и — А

А -и

G — С

А -и

С

и • и

G — С л

ДА — G

и • 1)

и • G

G —с

и — А

и — А

и • G

see G — С 65

и " с

G — G — С —

А — С —

АС -

а

G

A G ОА°

и • G

G — С

и » G

А — и

С — G

С — G

С

и

а -СА

— G

G — С

G • и ,

а — С

и — А

с — G

0 — G

571 G — С 634

А

Рис. 7. Сравнение вторичных структур участков 16S рРНК, предположительно узнаваемых белкой S8. (а) в Е. coli, (b) гомологичнал область в IBS рРНК T.thermophilus. В рамку заключены участки, определяющие связывание с белком S8.

Фрагменты рРНК из Т. ЬЬегторЬИиз и из Е.соИ, содержащие участки связывания белка Б8 были нами наработаны, используя метод транскрипции, и исследовано их взаимодействие с велком Я8 из Т. гЛегторЬИив.

Для изучения взаимодействия белка из Т. thermophilus с фрагментами РНК мы использовали широко известный метод связывания на нитроцеллюлозных фильтрах (Эрасег еЪ а1., 1977).

Константу связывания (Ка) определяли путём титрования меченой РНК белком Б8. В расчётах использовали следующую формулу [И.Р] / [Шо1а1 ]= п [Р]/(Ка + п [Р]), где [И.Р]- процентное содержание связанной РНК, [Ню1а1]- общее количество РНК, [Р]-концентрация белка, Ка-константа диссоциации, п-количество центров связывания на молекуле белка, [№ошЗ пренебрежимо мала (ЮрМ) по сравнению с концентрацией белка, п принимали равным 1 как для белка Б8 из Е.соИ ( Моиде1 et а1., 1986). Степень насыщения при максимальной концентации белка принимали за 100Х. Когда величина [Р] равна Ка, то [И.Р] равно 0,5 (50%). Кл определяли как концентрацию белка, которая требуется для 50%

насыщения, а Ка как величину, обратную Ка.

Формирование специфического комплекса (белок S8 * фрагмент рРНК из Г.themophilus) исследовали путём сравнения кривых насыщения белком родственной рРНК и неродственной РНК в качестве отрицательного контроля. Неродственная РНК соответствовала части ThrS гена из E.coli длиной 270 нуклеотидов (Moine et al.,1989). Эксперименты проводили в присутствии различных концентраций KCl: 250, 500 и ЭООмМ. Было обнаружено, что увеличение ионной силы, с одной стороны, уменьшает сродство белка к родственной рРНК (рис.8), отражая вклад ионных взаимодействий в стабильность комплекса.

[S8] (М)

Рис.8. Влияние концентрации KCl на образование комплекса РНК-белок. Кривые насыщения для специфического фрагмента 16S рРНК T.thermophilus (А, •, ■) и фрагмента мРНК ThrS (Д, о, □). Бело» S8 инкубирован с меченной РНК в присутствии 250 мМ KCl (А, Д), 500 КМ KCl (•, о) И 900 КМ KCl (■, о).

Ка уменьшается в 5 раз с увеличением концентрации KCl с 250Mi до 500мМ. С другой стороны, при увеличении ионной силы возрастав! специфичность взаимодействия белка с РНК: отношение Кг

специфичного связывания к Ка неспецифичного связывания возрастает от 40 до 250 при увеличении концентрации КС1 от 250мМ до 500мМ. Таким образок, высокие концентрации моновалентных ионов дестабилизируют преимущественно неспецифические взаимодействия. Это наблюдение согласуется с полученными ранее данными сб участии гидрофобных взаимодействий в формировании специфичных комплексов тРНК/аминоацил-тРКК синтетаза наряду с электростатическими взаимодействиями (Florentz et al., 1990). Необходимо отметить, что специфическое связывание белка S8 из E.coli с 16S рРНК очень чувствительно к природе аниона: было показано, что Ка увеличивается в 10 раз при замене К.С1 на СНзСООК от 5 х 107 М"1 до 3 х 10® М"1 (Mougel et al., 1986, Mougel et al.,1993). Однако, когда мы в экспериментах по связыванию белка S8 из Т. thermophilus заменили КС 1 на СНзСООК, Ка белка S8 из Т. thermophilus с родственной РНК осталась такой же как и в присутствии КС1, но при этом неспецифическое связывание с неродственной РНК возросло на порядок. Увеличение же концентрации ацетата К от 250 до 500мМ не влияло ни на специфические, ни на неспецифические взаимодействия белка S8 из Т.thermophilus с РНК. Такое сильное неспецифическое связываение в присутствии ацетата К не наблюдалось для белка S8 из E.coli. вероятно, это можно обьяснить тем, что, судя по расположению на электорофорегракках двумерного электрофореза, белок S8 из Т. thermophilus является более основным, чем белок S8 из Е.сОИ и , следовательно, неспецифическое связывание с РНК у термофильного белка выше.

Мы показали, что повышение температуры инкубации смеси белка S8 из Т. thermophilus и РНК до 55°С практически не влияло на специфическое связывание, но слегка ухудшало неспецифическое связывание с фрагментом ThrS мРНК. В дальнейшем мы прогревали инкубационную смесь при 45°С в течение 20 кинут. При понижении концентрации Мд** от 20 до О,5мМ Ка белка S8 из Т.thermophilus со специфическим фрагментом рРНК постепенно уменьшалась до 107 М"1.

Таким образом, оптимальными условиями связывания белка S8 из Т.thermophilus со специфическим фрагментом рРНК оказались следующие: 50мМ какодилата Na, рН 7,5, 500мМ КС1, 20мМ ацетата Мд и прогрев в течение 20 минут при 45°С. Далее инкубационную смесь охлаждали до 4°С и фильтровали при комнатной температуре. При этих условиях белок S8 из Т.thermophilus связывается с рРНК с Ка

+ 7-1

5-1x10 Н . Это значение соответствует константе связывания белка

St их E.coli с 16S pPHK. Подбор оптимальных условий связывания и еяределение К» белка S8 со специфическим фрагментом РНК представлямт для нас большой интерес в связи с тем, что мы планируем в дальнейшем эксперименты по кристаллизации этого комплекса..

Белек 3« их Г.thermophilus также проверяли на связывание с фрагментам Iis pPHK E.coli (с S89 по 650 нуклеотид) при оптимальных условиях связывания, (рис.9).

(SSKM)

Рис.9. Связывание белка S8 из т.thermophilus с фрагментом 16S рРНК из Е. coli. Белок S8 выделен из рибосом Г. thermophilus (о) или из штамма-суперпродуцента (Д).

Видно, что фрагмент ISS pPHK Е. coli связывается с белком S8 из Т.thermophilus практически с такой же эффективностью как и родственный фрагмент рРНК из Т.thermophilus. Отсюда иожно предположить, что РНК-связывающие участки на обоих белках похожи. По первичной структуре белки S8 из Т.thermophilus и из E.coli обнаруживают 48 % гомологии (Reinbolt et al., 1993). Участки в аминокислотной последовательности белка S8 из T.thermophilus, которые обнаруживают наивысшую гомологию с белком S8 из E.coli.

расположены в областях, участвующих в узнавании РНК белком S8 из Е. coli (Wower et al., 1992). Эти консервативные участки, расположение в центре и по краям полипептидной цепи белка S8 из Е.coli, важны для связывания специфического фрагмента 16S рРНК (Wower et al., 1992).

Исследование методом кругового дихроизма вторичной структуры белка S8 из Т. thermophilics, выделенного из суперпродуцентного штамма E.coli) показало, что содержание а-спиралей и /3-структуры в белках S8 из Т.thermophilics и из Е. coli ( Wu et al., 1993) примерно одинаково и составляет около 56-60% /3-структурных участков и 10-13% а-спиралей. Для вторичной структуры белков S8 из этих двух микроорганизмов характерно высокое содержание fi-структуры и небольшое количество ot-спиралей.

Для того чтобы убедиться в том, что белок S8 из Т. thermophilus, выделенный из суперпродуцентного штамма, имеет те же биологические свойства что и белок S8, выделенный из рибосом, мы сравнили Ка со специфическим фрагментом рРНК для обоих белков. Было обнаружено, что белки S8, выделенные из суперпродуцентного штамма и из рибосом, связываются с рРНК с примерно одинаковой Ка (рис. 9).

Глава 4. Кристаллизация белка S8 Т.thermophilus, выделенного из суперпродуцентного штамна, и предварительные кристаллографические исследования.

Кристаллы получены методом диффузии паров в варианте «висящая капля». Капли, содержащие белок S8 с концентрацией 24 мг/мл в К фосфатном буфере, рН 6, 0( уравновешивали против смеси 40% (от насыщения) сульфата аммония (незабуференный) и 7% МПД (2-метил, 2,4-пентандиол). Добавление МПД в приивораствор является решающим фактором для образования кристаллов. Кристаллизацию вели при комнатной температуре. В данных условиях белок выпадал в виде аморфного осадка, который после диффузии против паров воды в течение 2-3 суток образовывал хорошо огранённые кристаллы бипирамидальной формы, которые достигали размеров 0, 4 х О, 2 х 0,2 мм (рис.10). Для того чтобы кристаллы не растворились, через неделю после выпадения кристаллов меняли воду в прсгиворастворе на 10% ( от насыщения) сульфат аммония. В настоящее время ведётся работа по получению изоморфных производных белка S8.

I я

Рис.10. Кристаллы белка Б8.

Предварительные рентгенографические исследования были прведены в Институте белка РАН совместно с Н. П. Фоменковой и С. В. Никоновым. Прецессионная рентгенограмма ., полученная с кристаллов белка Б8 представлена на рис. 11. Было установлено, что кристаллы принадлежат к прстранственной группе "Р4кз)212 и имеют следующие размеры элементарной ячейки: а-67,65 X; Ь«67,65 X; Ст 171,12 X. Ассиметрическая часть ячейки содержит две молекулы с массой 13,7 кЭа, поскольку в этом случае параметр Метыоза (V») равен 3 Х/Да. По рентгенограммам покоя установлен предел разрешения, составляющий не менее 3 £ и время жизни кристалла в рентгеновской пучке. При комнатной температуре дифракционная картина с указанным разрешением сохраняется в течение 40 часов.

Рис.11. Прецессионная рентгенограмма, полученная с кристаллов рибосомного белка 58 из ТЪегтия гЬегторЬИиз.

Расстояние кристалл-плёнка -75 мм; угол прецессии-8, 9°, экспозиция 40 часов, плоскость Ьо1.

выводы

1. Получрны стабильные гибридные комплекс,! 5S рРНК. из Е. coli и В. stearotliernophi lus с рибосомными б ел im ми TL4 и TL5 из Т. thermophilas.

2. Показано, чхо рибосомные белки TL4 к TLS специфически вытесняют белки LS. L18 « L25 из 5S рРНЛ- бплковото комплекса E.coli: белок TL4 вытесняет белок L5, т белок TL5 - белки L18 и L25.

3. Разраоотана методика выделения и очистки рибосомного белка S8 из Т. thermophilus, экспрессируемого в E.coli.

4. Найдены условия специфического связывания рибосомного белка S8 из Т.thermophilus с фрагментом 16S рРНК Т.thermophilus.

5. Получены кристаллы рибосомного белка S8 из Т. thermophilas, пригодные для рентгеноструктурного анализа с разрешением не менее

з X.

6. Проведены предварительные рентгенографические исследования кристаллов белка S8. Кристаллы принадлежат к пространственной группе P4i(2)2i2 с размерами элементарной ячейки: а-Ь-67, 65

с-171, 12 X. В независимой части элементарной ячейки содержится две молекулы белка.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Garber M.B., Agalarov S.Ch., Eliseikina I.A., Tifchenko S.V., Sedelnikova S.E., Shirokov V.A., Yusupov M.M., Reshetnikova L..S., Trarhanov S.D., Tukalo M.A., Yaremchuk A.D., Purifikation and crystallization of components of the protein - synttesizing system from Thermus thermophilics.- J.Cryst.Growth, 1991, v.110, p.228-236.

2. Gongadze G.M., Tishchenko S.V., Sedelnikova S.E., Garber M.B. Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hibrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms. FEBS Lett., 1993, v.330, No.l, p.46-48.

3. Vysotskaya V., Tischenko S., Garber M.B., Kern D., Mougel.M., Ehresmann C., Ehresmann B. The ribosomal protein E8 from Thermus thermophilus VK1: seguencing of the gene, overexpression of the protein in E.coli dnd interaction with rRNA. Eur.J.Biochem., 1994, v.288, No.2, p.437-445.

4. Garber M., Avliyakulov N., Gongadze G., Gryaznova J., Davydova N., Eliseikina I., Ossina N., Sedelnikova S., Serganov A., Shikaeva O., Tishchenko S., Vysotskaya V., Liljas A., Jonson B-H., Kern D., Ehresmann B. , Ehresmann Ch. , Reinbolt J., Portier C. Ribosomal proteins from Thermus thermophilus. Abstracts of International conference on the structure and function of the ribosome, 20-25 May, 1995, University of Victoria (Canada).

9.08.95 г. Зак.6677Р. Тир.100 экз. Усл.печ.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ГЩ РАН