Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии генов эндотоксинов Bacillus Thuringiensis в клетках облигатных метилтрофных бактерий Metylobacillus Flagellatum

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии генов эндотоксинов Bacillus Thuringiensis в клетках облигатных метилтрофных бактерий Metylobacillus Flagellatum"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINQIENSIS В КЛЕТКАХ ОБЛИТ AT ПЫХ МЕТ ИЛОТ РОФНЫХ БАКТЕРИЯ METHYLOBACILWS FLAGELLATUM.

03.00.15. - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Для служебного пользования

Марченко Наталья Дмитриевна

Москва - 1994

Работа выполнена в НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Р. Р. Азизбекян

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор Б. Н. Ильяшенко; кандидат биологических наук Ю. Е Йомантае

Ведущая организация: кафедра генетики, МГУ им. М. К Ломоносова

Защита состоится "17" мая 1994г. в 14.00. часов на заседании Специализированного совета Д 098.12.01. при НИМ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 11354, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан "15" <

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

1994г.

Общая характеристик работы.

Актуальность теьы. Производство биологических средств борьбы с насекомыми-вредителями является в настоящее время одним ив наиболее перспективных направлений биотехнологии. 95% всего объема выпускаемых в мире бактериальных биоинсектицидов созданы на основе различных штаммов Bacillus thuringiensis. Инсектицидные свойства В. thuringiensis определяются, в основном, присутствием параспоральных включений, состоящих из белковых эндотоксинов, способных к кристаллизации. Оснозными достоинствами биоинсектицидов в сравнении с традиционными химическими препаратами являются: высокая избирательность действия (эндотоксины активны только в отношении определенных видов насекомых и безвредны для растений или животных), экологическая безопасность производства и применения. Природное разнообразие эндотоксинов В. thurt ngiensis создает возможность их применения против широкого спектра насекомых-вредителей. В настоящее время создан ряд коммерческих препаратов ка основе различных природных штаммов В. thuringiensis. Однако, вследствие высокой себестоимости таких препаратов доля биоинсектицидов в общем объеме производства средств защиты растений остается незначительной. В связи с этим многие биотехнологические фирмы развивают новые направления в создании биологических пестицидов с использованием методов генетической инженерии. Одним из таких направлений является создание штаммов-продуцентов дельта-эндотоксинов В. thuringiensis на основе микроорганизмов, обладающих биотехнологическими преимуществами в сравнении с природными штаммами В. thuringiensis.

В настоящей работе исследованы возможности экспрессии генов синтеза двух классов дельта-эндотоксинов с различной специфичностью инсектицидного действия (crylAa и cryl VB) в облигатных ме-тилотрофных бактериях Net hylobacillus fl age ¡latum. Выбор данного объекта обусловлен следующими свойствами Ы. flagellatum непато-генность; способность расти на простых средах, используя относительно дешевые и доступные субстраты (метанол); рост при повышенной температуре культивирования; отсутствие фагов. Облигатная зависимость от присутствия метанола в среде исключает выливание клеток в неселективных условиях, что позволяет рассматривать эти бактерии в качестве экологически безопасных продуцентов.

Цель и аадачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности экспрессии генов дельта-эндотоксинов с различной биологической специфичностью действия (CrylAa активен в отношении отряда чешуекрылых насекомых, CryJVB - в отношении двукрылых) в облигатных метилотрофных бактерия* и оптимизация условий их экспрессии.

Для оеущэствления поставленной цели решались следующие задачи:

1. Скрининг коллекции изолятов В. thuringiensis с целью поиска штаммов, наиболее активных в отношении представителей двукрылых насекомых. Изучение их физиологических, биохимических, серологических свойств.

2. Конструирование эффективной векторной системы широкого круга хозяев, позволяющей изучение ' экспрессии клонированных в ее составе генов в грамотрица ?льных микроорганизмах.

3. Изучение экспрессии гена cryIAa В. thuringiensis ku'rstaki HD1 в составе сконструированных векторов широкого круга хозяев в различных граштрицательных микроорганизмах.

4. Клонирование гена москитоцидного эндотоксина В. thuringiensis israelensis штамма 1-5, продукт которого токсичен для личинок комаров Aedes и Anopheles,

5. Определение нуклеотидной последовательности клонированного гена, сравнительный анализ с нуклеотидными последовательностями ранее клонированных генов других штаммов В. thuringiensis. israelensis со сходным спектром инсектицидного действия.

6. Клонирование гена москитоцидного дельта-эндотоксина в составе векторов широкого круга хозяев и изучение его экспрессии в клетках Escherichia coli и метилотрофных бактерий М. Hagel latum.

7. Разработка эффективной системы экспрессии гена москитоцидного эндотоксина в метилотрофных микроорганизмах с использованием регуляторных областей лгсА гена M.flagel latum.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведен скрининг коллекции изолятов В. thuringiensis с целью поиска новых штаммов, наиболее активных в отношении личинок комаров различных видов. Отобрано 2 штамма, обладающих наибольшим токсическим эффектом на личинки комаров. Из одного из отобранных штаммов клони-

рован ген дельта-эндотоксина, продукт которого токсичен для личинок комаров видов Anopheles stephensi и Aedes aegypti. Определена полная нуклеотидная последовательность структурной и прилегающих областей гена синтеза мосюггоцидного эндотоксина. Сравнение нук-леотидной последовательности клонированного гена с ранее опубликованными последовательностями генов москитоцидных эндотоксинов В. thiringiensis позволило отнести клонированный ген к CryIVB классу. Выявлены нуклеотидные замены, приводяпдае к отличию первичной структуры белка в сравнении с другими белками CryIVB класса. Для изучения экспрессии генов эндотоксинов в грамотрица-тельных хозяевах сконструирована серия векторов широкого крута хозяев различного функционального назначения, позволяющих: 1) PNGM130, PNGM131, pNGMISOK, pNGM131K- вести прямой визуальный отбор рекомбинантов на индикаторных средах; 2) pNGM130rec - получать высокую продукцию интересующего белка в клетках облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatún. В составе вектора pNGMISOK клонированы гены энодоксинов В. thiringiensis cryIAa и cryIVB с различной инсектицидной специфичностью действия. Изучена экспрессия генов в клетках E.coli и М. fläge 1 latum. Максимальная продукция CryIAa белка в клетках E.coli и М. flage 11 atum получена при экспрессии гена cryIAa в составе единой рамки считывания с N-концевой частью гена р-галактозидазы. Максимальная продукция CryIVB белка в клетках М. Hagel latum выявлена при экспрессии гена под контролем промотора гена гесА М. flagellatum в составе единой рамки считывания с N-концевой частью гена гесА.

Наблюдаемая продукция CryIVB белка в клетках М. flagellatum позволяет рассматривать сконструированный штамм М. flagellatum в качестве перспективного для биотехнологии продуцента москитоцидного эндотоксина. Впервые определен спектр инсектицидного действия индивидуального CryIVB белка на личинках комаров 7 видов. Показано, что видом, наиболее чувствительным к воздействию CryIVB белка, является A stephensi.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разде^ лов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждения, выводы, список литературы (128 наименований). Содержит 18 рисунков и 11 таблиц. Обьем работы. 113 сгр.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции "Производство и применение биологических средств защиты растений вредителей и болезней" (Одесса,1993), 17-ом Международном конгрессе генетики (Бирмингем, Англия, 1993), семинаре отдела молекулярной генетики НИИ генетика (1993), научно-практической конференции "Здоровье населения России и пути его улучшения" (Москва, 1994), научноГ конференции НИИ гентика (Москва, 1993).

Результаты и нг обсуждение.

1. Еы^влашеэ м харздстеристса новых ага&аюв Я toiringiensis, ойвдакщнх коскитоцидной актнвдастьа

Штаммы JE и 1-5 отобраны из коллекции спорообразукщих бацилл как наиболее активные в отношении личинок комаров разных видов. На основании совокупности данных серологического анализа, биохи мических и морфологических свойств штаммы JE и 1-5 отнесены В. thuringiensis ssp. israejensis. Анализ белкового состава спорок ристаллической смеси штаммов Л2 и 1-5 выявил, по крайней мере три белка с молекулярными массами 130, 70, и 28 кДа Энтомоцидна активность штаммов на личинках комаров родов Aedes, Anopheles Culex составила LC501. минимальная концентрация препарата, вызыва шэя гибель 50% тестируемых насекомых) - 101 - 10 ( спор/мл) Электронно-микроскопическое исследование споро-кристаллическс смеси показало, что клетки исследуемых штаммов образуют гипичнь для подвида israelensis споры и кристаллы.

2. Конструирование векторов вирокого круга хозлез прямого визуального отбора рекомбинанатов.

Серия векторов широкого круга хозяев прямого визуального отб< ра рекомбинантов сконструирована на основе репликона плаз ми, PAYC32 (производная плазмиды RSF1010). Фрагмент ДНК бактериофа] M13tgl30, кодирующий структурную часть lacZ' гена с промоторной операторной последовательностями, был субклонирован в соста плазмиды pAYC32 (Рис.1). Результирующая пдазмида pNGM130 имеет основе репликон RSF1010 и обеспечивает возможность комплемектац р-галактозидазной активности в ряде штаммов Е. coli (TGI, JM10 J Ml 09 и др.). Плазмида pNGM131 о обратной ориентацией полилинке ной последовательности относительно iас-промотора была получе

заменой внутреннего Pvu II участка вектора pNGMISO на аналогична участок ДНК бактериофага M13tgl31. Для удобства проведения экспб рименгов по коньюгационному переносу в составе плазмид cepv pNGM130/l31 был субклонирован ген кап из вектора pUC4K. Результ1 рующие конструкции обозначены, как pNQM130K и рШМ131К.

Сконструированная нами серия векторов обладает рядом пренмз ществ перед используемыми ранее: 1) подилинкерный участок плазш PNGM130/131 и PNGM130K/131K обеспечивает широкий выбор сайтс рестрикции для клонирования фрагментов ДНК; 2) использование да! ных конструкций позволяет вести быстрый отбор рекомбинантш плазмид на индикаторных чашках с Х-Gal и IPTG; 3) Jac-промотс обеспечивает эффективную транскрипцию клонированных фрагменте ДНК и обеспечивает высокий уровень продукции целевого белка j многих грамотрицательных микроорганизмах; 4) вектора этой сер: обладают высокой репликативной емкостью. В наших эксперимент; были клонированы фрагменты ДНК до 30 т. п.н.

3. Клишроващшз crylAa гена & t/ajríngiensis ssp. kurstaki составе векторов кзфохого круга хозяев. Изучение гетероЕогичю зкскрессми в клетках Е. coli и iL flagollatim. В составе вектора pNQM130 субклонирован ранее клонированный п crylAa из плазмиды рОК2. Результирующая плазмида обозначе! PKUR131 (Рис.2). Плазмиду pKUR131 из штамма E.coli TG1CRV5: коныогацией переводили в клетки М. Hagel latum. Продукцию энд токсина клетками Е. coli и tí. flagel latum, несущими плаз ми, pKURISl, анализировали при помощи иммуноблота и биотестированш на гусеницах непарно го шелкопряда. Данные иммуноблота и результ; ты биотестирования свидетельствуют об экспрессии эндотоксина клетках hl. riagellatum, однако уровень продукции в клетках мет: лотрофа значительно ниже, чем в клетках E.coli. Предполагаете: что низкий уровень продукции эндотоксина в клетках метилотро' обусловлен присутствием в составе клонированного фрагмента Д протяженной 5'-нетранслируемой области, примыкающей к структурн части гена и негативно влияющей на экспрессию гена в клегк W. flageJ latum. Получен делеционный вариант плазмиды pKUR13 обозначенный как pKUR132, в котором структурная часть cryIAa re слита с 5'-концевой частью гена р-галактозидазы, в результате ч го получено слияние первых 11 кодонов N-концевой части ^-галак

Рис.2. Схема субклонирования гена сгу1Аа в составе векторов широкого круга хозяев рШМ130 и- рМСМЗОК. Конструирование генетической системы Трансляционного слияния

1ас2:: Сгу1Аа.

зидазы с последовательностью crylAa гена от 8 кодона. Проверка инсектицидной активности клеток Е.colJ и М. flagellatum, несущих плазмиду pKUR132 показала значительное увеличение продукции CrylAa' белка в сравнении с рекомбинантными штаммами, несущими плазмиду pKUR131 (Табл.1). Результаты биотестирования подтверждаются данными иммуноблота лизатов клеток Б. coli и М. flagellatum, несущих плазмиды pKUR131 и pKUR132.

Таблица 1. Инсектицидная активность рекомбинантных клонов Е. col i и М. flagel latum, продуцирующих CrylAa белок, на гусеницах непарного шелкопряда.

Штаммы LC50, мкг общего белка/г корма

Е. col i TGI

PKUR131 124

PKUR132 42

М. flagellatum

PKUR131 850

PKUR132 140

4. Конструирование и анализ библиотеки 72 ыДа плазмиды из В. ШиЧпг^епзЛБ уаг. <£гаэ1ел£Цг иг. 1-5. Кэширование сгуХУВ гена.

Согласно данным литературы ген егу1УВ В. thur}nglensís Бэр. ¡Бгае1епБ1в локализован на 72 мДа плазмиде. Для клонирования гена сгу1УВ сконструирована библиотека генов 72 мДа плазмиды на плазмидном векторе рЦС19. Библиотеку анализировали с помощью оли-гонуклеотидного зонда, синтезированного на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ранее клонированных генов москитоцидных эндотоксинов. Обнаружено два клона, дававших положительный гибридизационный ответ с зондом и проявлявших активность против личинок комаров Аайеэ aegyptí. Выявлен фрагмент

В С X Р

I I I

ХЕР X

с мхе Н

Р!ас

РЬ сЕЭХЕ

сгу/ИЭЛ

Р1ос 50 ш Оссг) *

о*»- щ»

-А^Аа о с д д с 1А ТС /АС С /АТС /АТТ/АС С /ААТ/ ТС А /ввС / - - - ГС /5

Р«с.з.

С1в»а кхонровани сгчИв гева » составе «ектора и*ро-кого круга гозяв» рИ6М1ЗОХ.Ковс»ру«ро»ая*в гв«»т»«веко! сшствии »раведяавоввого сшни Ьаог:: Сгу 1*В.

ДНК. рестрикционная карта которого соответствовала сгуIVB гену, описанному ранее. Минимальный фрагмент ДНК, содержащий ген иоски-тоцидного эндотоксина был субклонирован на плазмиде pUC19. Результирующая' плазмида обозначена pISRl (Рис.3). Клетки £.coi. (pISRl) были использованы в биотестировании с личинками комаро] A aegypti, A stephensi, Culex pipieos. Наибольшую чувствительность к действию эндотоксина показали личинки An.stephensi (LC50-0.070 мкг/мл), Клетки EcoJí(pISRl) не оказывали влияния ш развитие личинок С. pipiens.

5. Определима ну-.изэотиднай последовахелькоетм cry IVB гена.

Дня определения нуклеотидной последовательности cry IVB генг R thuringiensis vaг. israelensis (1-5) построена подробная рестри-ционная карта фрагмента клонированного в составе плазмидь pISRl. На Рис. 4 представлена физическая карта и стратегия сикве-нирования гена cry IVB. _

»ol £ccR¡ P»tl BsuRI M»l Mphl Pvull CIol XBal

I I I I I I I i II

д i ¡ i Iii i i и . i i а П ■ С ■ I ■ I . ......... .11

0 1 2 3(kb) ■-,-!_I_,_I-

Рис.4 Стратегия определения нуклеотибноо послеЭоЬстелы-юсти гена ccyíVQ В. turiengiensis vor. ¡sroe/ensis шт. 1-5

Шлная нуклеотидная последовательность этого участка приведена нг Рис. 5. Структурная часть гена составляет 340S н. п. от инициирующего ATQ-кодона в положении 159 до терминирующего кодона TGA в положении 3667 и кодирует белок молекулярной массой 187,8 кДа. На расстоянии 7 н. п. перед инициирующим кодоном расположена последовательность (GGASG), которая может служить последовательность«; Шайно-Дольгарно гена В 3' -нетранслируемой области гена обнаружен протяженный инвертированный повтор, способный формировать, в последовательности мРНК структуру, состоящую из 18-нуклеотидногс стебля и 6-нуклеотидной петли c¿G - -106 кДж. Эта структура, по-видимому, выполняет роль терминатора транскрипции, по аналогии

• -if

1 11 21 31 41 31 il 71 ei 91 101

UiâîïtiâiiittîttcitiiîaâtccîtitciittttttciaïgiitàtatâttlgcacttttggtcttmiiatcgtitsJittciâiitÉjtttj »•I

l',l 111 121 151 HI Sí 111 171 181 191 201

titcaacttt9ttacac(i9iuugatqtitC[iat9t9iatag^HMtiia«r^rr[A6SCrATCCSIT№CEA«TG№TTACAAeG6[

íciRl

201 211 221 211 241 231 261 271 281 271 301 ШГ6ШШкССМСТАТШМ11ЖТ1«М:бШ!БМШШ:СААСА61А16ССЕ11(А1СС№С1ИЕ911ААТ1СТТСТТСА61ТА51АС

30t 311 321 331 341 351 361 371 381 371 401 С£)СШАААА6ТАБСТБ£АБС1ЙТССТ1АЛАТ1ТБТАААСССЙССТ6СА5БТАСТЁТСТ1ААСС61АС!ТА5С6СБ6!6СТТСС1А1ТСТ1ТББСС6АСТ

401 411 121 43) 441 451 461 471 4SI 491 501 ШАСТССААС6СС1БАА№«6И1ББАА16АП1СА16КШ,АСШЙАТС1!П16АТСШСТ61ААСА6С1ТАТБТАСБААСАБАТБСАААТ6

501 511 521 531 541 551 561 57 1 581 571 Ш CWtfAAI6ACE6TTST6AAA6ATTATIÍAGATCAATATñCfiACTAAATITAACACÍTEGAAÍA6ñ6ñ6CCTAATAftCCASTCCIAfASAACAeCfi6TWí

¿01 Ml «21 631 ¿41 651 661 '(71 681 671 701

701 711 721 ' 711 741 751 761 77 1 781 771 601 6ТАБСАШПСШИАСПШАТЙАБАЁАТБ5ШСЙТШТШ1ШБААТББТСТШБСАС(ПАБТШ66Т8АССАШАТАТААСАСТЙТЁБ

801 811 821 931 841 SSI eil 871 8S1 871 701 T5CASÎACACTAAAGAftTATATToCACAtASCAITftCATGSTAîftAlftAAS61TTftSAT6tACï3A6AAATMiATC)AATËSArAAT£BATTACSH7fiA

701 711 721 731 941 751 761 771 731 771 . 1001 TMtIArAAAA6íEA6AI6AC!AlICSASTAIIA6AT»IACTCGCTCTltIIGCCf,STIA!6ArcCACBTCtATACCCTSCE£ACAAMTAGflTAAIACS

1001 1011 1021 1031 1041 1031 lOil 1071 lOBl 1071 1101 ААА£1АГСАШ№АМ1!ГКА№даб«1ПА!«;йН;11Т»61АЕШСТа:1ТСТ(|51Щ1СТИА6СА6СА:ТБ6АББСАеСАС7ШАС6А6

1101 IUI 1121 IUI 1141 Ml 11Ы 1171 UBI 1171 1201 А1БТТСАТТТЙТТСАСТТББСТАА|^6АбАбТАБАПГСТ65пССАА}АС1ЙТАТАТСАА5йТТТААбйТТТТТАТС1БССААТААААТГБ65ТГ1ТЕАТА

1201 1211 1221 1231 1241 1251 1261 1271 1281 1271 1301 ТАСАААТТСТ1С1БСАА16САМАМТ6ШТ1ТАТБ6ААБ1ТСТЕ{1111Б6ТТСМАТСТ1АСТСА7СШ1ТСМС77АА11СТААТБ117АТААЛ '

1301 13U 1321 Ш1 1341 1351 1361 1371 1381 1371 1401 AClTCÎAUACA£fiATCÏftGC7CCCCCTCÏAATCEA67TACAAitAATBBATlTC]ACAAAAî7EA7B6TACTCTlBCCTCTlATAAllCAAATAlAACAC

14)1 1411 1421 1431 1441 1451 1461 1471 1481 1471 1501 СЛАС1СС1БАА£БГ1Ш6ЕКСАСНии;Бй1и1СМШМ»АСШ1ССЗШСААССА»СТБиШЮ7А1АСВСА1А771иАЗПА

1501 1511 1521 1531 1541 1351 1561 1571 1531 1571 1601 ГДТАААААСТбА1БТТА1А6А1ТАТйАСЛ6ТААСА26ВТТТСД1ТТБСТТБ6АСАСАТААБй1ТБТТБпСССТАЛТААТСАААТй1АСАСЛБАТБСТАГС

1631 lili 1621 1631 1641 1651 1661 1671 1681 1671, ' IM АСАСААБ1ТСС6БССБ1ААййТС1ААС1ТСТТБААГ6СААСАБСТАААБТАА1СпА6ББАССТББТЕАШАББ6666БАТС7АБПБС1СТ7йСААБСА

1701 1711 1721 1731 1741 1751 17Ы 1771 1781 1771 IBM А168ТАСТС1АТСАоБСА5ААТ6БА6АТ1САА16ТАЛААСААБТАТТТийАТБАТССТАСААЁйАЁТТАСББйТТАСБСАТйСБТТАТБСТБСАААТА0

1801 1811 1821 1831 1341 1851 1861 1971 1881 1971 1701 1СШИ£1А11ШТ51ЙТСЙ1А161А1Т0ЩШПС1АБАББА«;ААСБАТШ1АСЙ6АА1ПАС6ИПС(Л6АСС1№ТААТЙТАА71,СС1

1701 mi 1721 1711 174t 1751 1761 1771 1781 1771 2001 АСАБА11ШМТАГБААМ1Г1А6АТЙШАБЙ1СС7111М16СААТТЕТАССБА1БЙ6ЙТТАТСТ1С1АА1САЙ:ТБАТААСТЙ1АБСТАГТСА«

2001 2ы1 2021 2031 2041 2031 2041 2071 2091 2071 2101 CATrAAACATÈACnCAAATfiAÎCAAGTGATTA[TfiACAGAAICEAMTTAITCCfiATCACTCAATCT61ftTTftBATËftSACA&A6AftCCAAAATTlAËA

21С1 2Ш 2121 2131 2141 2151 2161 2171 2181 2171 2201 А1^ШСИБААБ!1Б(6М1БСАС1БТ1Т1ШАШСК6ААА6ДГ;САГ1ШУГ15БААС6ЙСА6А1!НБМА1А6Й1САА5СС6СААА!СТ1

2201 2211 1221 2231 2241 2251 2241 2271 2281 2291 2301 . 675БШШ7Т7СТ6ААЕШ7А7А7С!:ААЙА6АААААА75С1Б77А7ТАВА76ААЕ7ШАА7БС6АААСААС77А67СААТС7С6ААА76ТАС77С

2301 2311 2321 2331 2341 1351 2341 2371 2381 2391 2*01 АйААС6Е66А7тбйАТ[ЖТАСВСТ7БВ77ег;,ЭДАСААБ7БА7АА7А7САСАА77СЙА6АА6А76А7СС7ЛТ7777ААА88БСА77ЙССТ7ША7

2401 1411 2411 2431 2441 2451 2461 2471 2431 2491 250!

в7С75шттшшев7кттксшш1А1Шшттмкттшсштсюжшмв5

25« 251! 2521 2531 2541 2351 2541 2571 2581 25?! 2401 Б6А777В7АВБАА67А87АААБА767А6ААС7ЙБ7567Т7САС6С7АТБЕБ6ААБААД776А76ССА1СА76АА7Б71ССА6СТ6й771АААайГС7БТ

2601 2111 2621, 2631 2641 2451 2441 2471 2481 2041 2701 АГССГГСНССПГ6вГГ5Т5вД665ТСГААГС8ТГ615№ЙС61СС6СГ6Т6СС65СГЙКАГТ686ААСАСТТСТ6(1ГйТ5ТГ6ГЙ1ТСАГ6ССАА«

2701 2711 2721. 2731 2741 2751 2741 2771 2781 2791 2801 ТЕАТАСА0ББААААШСАТБТ[:БТАТ6ТСАЕ&АТТСССАТСААТТТАвТТТ1:АСТйТТБЙТАСА€ЕвБС«ТТйБ4ТЙСАА4Т6«АААТАТА5ЕбеТТГЕб

2801 1811 2821 2831 2841 2851 2341 2871 2881 2841 2901 5ТСйТ6ПТАААЙТй1С11СТССй6АТ66АТАС6С»ТСЙПА8АГААТПАБМВТАА116А«ЗААВ5ВССААТАеАТ8668АА8САСТ61САС6СЕ16А

2901 2911 2921. 2'31 2941 2951 2961 2971 2981 2191 3001 ААСА£А76БАБАА6А(1АТББААСЁАТСЙААТ66ЙА&СААААСБ77С6БАААСАСЙАСААБСАТАТБАТБТАВС8АААСААБССА7Г6А76С777А77САС

»01 ЗОИ 3021 ' . 3031 3041. 3951 3041 3071 3081 3091 3101 АМ67АСАА5А76АБЕС777АСА67778А7ЙС6АСАС7СБС?СААА77САБТАС6СТ8А8ТА777Е67АСАА7С8А7ТССАТА7Б7Е7АСАА76ЙТ7БВ

3101 ЯП 3121 3131 ' 3141 3151 3141 3171 3181 3191 3201 1ТБТСА8АТ67ТССАБ6ТАТШТТА75АГАТС7А7БТАБАВТТБ5А7БСАС5Д57Б5ГДСААБС6С8ТТАГТТ5ГАГ8АГАСАА5ЙААГЙ77ДГТДДАД

3201 3111 3221 '3.231. . 3241 3251 3241 3271 Ш Ш 33« А16БТБА7777АСАСАА6ВБ67АА7ББ6616ВСМеГйА,СТ66ААА7ЕСАЕАС6ТвСААСАААТА6А7Б6ТБ777СТЕ7А77ВБИС7А7С7ЙА776БАВ

3301 3311 3321 3331 3341 3351 . 3361 3571 3381 3391 3401 7ЕС78БС5ГАГС7ИАйАГЕГССАГС7ССАКАТААГСА76ББ7А7БТСГ7«СБГ617|!Г76ССА«АААА5ААгааГ6БА«Г65Б7А7г7САСБСГ7

3401 3411 3421 3431 .3441 ' 3451 3461 3471 3481 3491 3501 АТ6БАТ7БТБАББА6ЙАТСААЕААААА7Т5АС8Т7ТАСБТС77675ААБААЕБАТАТАТ7АС6ААЕАСА67АБАТБТА77СССАБАТЙСЙБА7С6767ЙС

3501 3511 3521 3531 .3541 3551 3561 3571 3581 3691 3601 6Ай77ЕАБА7А85СЕАйАСС6АА6877СЕ7Т71А7А7С6АААЕСАТ1ВАА71ААТ17еСАТ6«АС6А67БА11ааин»Паасег»азс!Цга1а1

Ксо! 3611 3421 3631 3641 3651 3661 3471 3481 3691 7М

Рис. 5. . Нуклеотидная последовательность гена сгу1УВ В. Ых1П лег1еш*э уаг. 15гае1епз15 1-5. Пояснения в тексте.

с .rho-независимым терминатором E.coli. Сравнение нуклеотидных последовательностей клонированного гена с описанными ранее генами cryIV, типа позволило отнести его к CryIVB классу и выявило нукле-отидные замены, приводящие к изменению аминокислотной последовательности белка в сравнении с описанными белками CryIVB класса

5. Субклоиированме cry IVB rem в составе вектора, янрокого круга хозяев рШШЗОК. Мзучеииэ гетерояагичиой экспрессии гена мосюггоцидного эадотоксига в клетках £ coli н Al fîageilabun.

Для изучения экспрессии клонированного гена в метилотрофных бактериях фрагмент ДНК, содержащий полноразмерный ген, субклониро-вали в составе вектора широкого крута хозяев pNGM130K Гибридная плазмида pISR130K мобилизована в клетки облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum. Продукцию эндотоксина клетками E.coli и té. flagellatum, несущими плазмиду plSR130K, проверяли биотестированием и иммунологическими методами. Данные биопробы с личинками комаров Ае. aegypti и An. stephensi представлены в Таблице 2. Токсичность клеток М. flagellatum, экспрессируюших эндотоксин, для обоих видов комаров более чем в 100 раз ниже, чем токсичность клеток £ coi i (pISR130K), "выращенных в условиях индукции ШТ. Результаты биотестирования подтверждаются данными иммуноблота. Предположительных причин низкой экспрессии cryIVB гена в клетках tí. flagel latum может быть несколько: 1) Jac-промотор малоэффективен в системе транскрипции ДНК М. flagellatum, 2) протяженная 5'-нетранслируемая область, пришкашэя к структурной части гена, содержит специфические регуляторные элементы, необходимые для экспрессии гена в клетках В. thuringiensis, и негативно влияющие на экспрессию гена эндотоксина в клетках M. flagellatum.

Получен делеционный вариант плагмиды pISR130K, в котором удалена 5'-нетранслируемая область гена, а кодирующая часть гена слита в единой рамке считывания с первыми 4 кодонами lacT гена (Рис.3). Экспрессия cryIVB гена в составе плаэмиды pISR130K определяется регуляторными элементами lacZ' гена Уровень продукции Cry IVB белка определяли биотестированием и иммунологическими методами. Показано, что делеция нетранслироемой области, прилегающей к инициирующему кодону гена не приводит к значительному изменению продукции эндотоксина ни в клетках Е. col i, ни в клетках W. flagellatum (Таб.2). Таким образом, низкая продукция эндотоксина в клетках М. flagellatum обусловлена, по-видимому, неэффективностью lac- промотора в клетках метилотрофов.

& Конструирование вектора широкого круга хозяев, обеспечивающего экспрессию клонированных в его составе генов под контролем промотора гена reck Uethylobaclllus tlagellatua.

Для увеличения продукций москитоцидного эндотоксина клетками

отбор гол>€*»х клоисб

но среОе Ap.X-goJ.

ig/gat/s^/mc/aga/agc/aaa/gc)A/TCG/CM

< J

отбор голубил клоиоб // S •« cpiSe ДрЛт.Х-во| ff-V

о 1 ы

pNGM130Krее

v^o

Рис. 6. Схема конструирования плазмидного вектора pNGM130rec, определяющего экспрессию клонированных в его составе генов под контролем регуляторных областей гена гесА М. Г1 age!latum.

М. П age ¡latum сконструирована векторная система, обеспечивающая экспрессию клонированных в ее составе генов под контролем промотора гена грсА И. f1 agel 1 atum {recA-M, f.). Ранее было показано, что промотор гена гесА ;колститутивен в клетках М. flagellatum и обеспечивает высокий уровень продукции RecA даже в отсутствие ДНК-повревдающих агентов.) Для конструирования вектора pNGM130reo использовали плазмиду pREC6, в составе которой клонирован ген гесА М. flage 11 atum с прилегающим областями. Фрагмент ДНК, содержащий 8 первых колонов структурной части гена и 5'-прилегающую область (0.8 т. п. н.), субклонировали в составе вектора pUCBM21 таким образом, что единая рамка считывания гена р-галактозидазы была сохранена. В виду того, что промотор гена гесА-М. f. функционален в клетках Е. cof i, трансформанты, несущие рекомбинантную плазшду pUCBM21rec, имели голубую окраску на селективной среде с X-g-al без индуктора лактозного оперона ЙПТГ.

Таким образом, селекция рекомбкнантов на индикаторных средах при использовании такой векторной системы была сохранена. Заменой внутрейнего Pvull фрагмента рЦСВШ1гес на аналогичный фрагмент плазмиды pNüM130K, получен вектор широкого круга хозяев pNGM130rec (Рис.6). \Полученная плазмида pNGM130rec 1) способна мобилизоваться в широкий круг грамотрицательных хозяев, 2) содержит полшшнкерный участок, обеспечивающий широкий выбор сайтов рестрикции для клонирования; 2) позволяет вести отбор рекомбииан-тов на селективной среде с Х-gal; 3) транскрипция клонированных в составе плазмиды гёнов определяется двумя тандемно расположенными промоторами Plac-Prec. Сконструированная векторная система может быть использована для конструирования генно-инденерных штаммов-продуцентов на основе облигатных метилотрофных бактерий.

7. Конструирование сязстеш экспрессии гена cry IVB под кот

ролен промотора гека necA-Hf.

Ген cry IVB субоонирован в составе вектора pNGM13Qrec. результирующая плазмида обозначена как pISR130rec (рис. 7). Плазмида pISR130rec конъюгацией была переведена в клетки М. Flagellatum, Анализ продукции эндотоксина рекомбинантными клетками Е col Я рI5R1ЗОгес), биотестированием и с помощью иммунобло-тинга свидетельствует о снижении продукции CryIVB белка в сравнении с Е. coli (pISR130K). Экспрессия cryIYB гена в составе pISR130rec практически не зависела от индукции Ш1ТГ, и, по-види-

рис. 7. Схема субклонирования гена сгу1УВ в составе вектора рШШЗОгес.

Таблица 2. Энтомоцидная активность рекомбинантных' штаммов Ecoli и Af. flagellatum .

Штамм LC50 мкг общего белка /мл

An. stephertsi Ae. aegypti

£ col i

р13И30К(+ИПТГ) 0,095 0.420

р I SRI ЗОК(-ИТОГ) 4,400 19,10

pISR130delC +ИПТГ) 0,078 0,370

pISR130rec(+ИПГГ) 1,700 13,75

pISR130recf( +ИПТГ) 0,044 1,470

pISR130recf(-y!irrr) 0,064 2,940

M. fiagellatujn

PISR130K 126,60 >500

plSR130del 62,70 >500

pISRlЗОгес 35,70 >500

pISR130recf 0,060 1,700

1) Плазмида р13И30К определяет экспрессию сгу\УВ гена под контролем 1 ас- промотора;

2) Плазмида р13И30Кс1е1 определяет экспрессию ■ химерного

1асг':: сгу1УВ гена под контролем 1 ас-промотора;

3) Плазмида р 131?!ЗОгес определяет экспрессию сгу1УВ гена под контролем промоторов р]ас-ргес; •

4) Плазмида рГБИЗОгесГ определяет экспрессию химерного гесА:: сгу 1УВ гена под контролем промоторов р1ас-ргес\

го СЛИЯНИЯ йесА-М. Г.:: Сгу1УВ. (Е1-ЕсоИ; N-N001; К-Крп1; Е-ЕсИЗб; А-АуаП; В-Ваш- Н1; 'ЗЬЗрЫ; Р-РбЬ!).

мому, транскрипция гена, глазным образом определяется гесА-промо-тором. Продукция эндотоксина клетками М. flagellatum (pISR130rec) была низкая незначительно отличалась от М. fiagreiiatun<pISR13GK).

Для создания экспрессионной системы, обеспечивающей транскрипцию и трансляцию crylVB гена непосредственно под контролем регу-ляторных элементов гесА-Л/. f. гена, была сконструирована плазмида plSR130recf. Схема конструирования плазмиды pISR130recf представлена на Рис.7. Ген cry IVB в составе плазмиды pISR130recf находится в единой рамке считывания с первыми 8 кодонами гена recA-M. f. Известно, что 28 N-концевых аминокислот не оказывали влияния на проявление токсических свойств CrylVB белка. Появление 8 дополнительных аминокислот в N-концевой части белка в наших экспериментах таю® не привело к изменению токсических свойств эндотоксина. Плазмида pISR130recf из клеток E.coli TQ1(R751) коньюгацией была переведена в клетки И. flagellatum. Возросшая более чем в 2000 раз токсичность клеток И. flagellatum (pISRlSOrecf) для личинок A. stephonsi свидетельствует об усилении экспрессии гена crylVB' л составе полученной конструкции. Увеличение токсичности клеток E.coli Tül(pISR130recf), выращенных в условиях индукции ИТГГ и без индукции, в сравнении с ранее полученными конструкциями свидетельствует о том, что экспрессия гена в составе pISR13Qrecf определяется двумя промоторами Plac - Preс. Тогда, как в клетках И. flagellatum наиболее функционален Ргес. Эти выводы подтверждаются данными иммунологического анализа (Таб. 2.)

а Электронная микроскопия рекомбикантных клеток

SL flagellatum, продуцкруювра иосгаггсцидньй эндотоксин.

Проведено электронно-микроскопическое исследование клеточных препаратов М. flagellatum, продуцирующих москитоцидный эндотоксин, в сравнении с исходным бесплазмидным штаммом М. flagellatum. В препаратах рекомбинантных клеток М. fl ago! 1 atum(pISR130recf) обнаружены крупные включения, резко отличающиеся по электронной плотности от остального содержимого клетки. Включения имеют округлую или неправильную форму и занимают от 1/3 до 2/3 внутреннего объема клетки. По электронной плотности, форме и размерам включения клеток W. fiageJJatum(pISR130recf) соответствуют кристаллическим включениям исходного штамма R thuringiensis var. israelensis (1-5).

Рис. 9. Кристаллические включения в клетках М. flagel 1 atum (pISR130recf) - (1). Увеличение*80000. Контрольный препарат клеток бесплаз мидного штамма И. flagel latum - (2). УвеличениехЭОООО.

9. Ояредэлекиа спектра инсектицидного действия Cry IVB бежа.

Традиционным тест-обьектом для изучения токсичности CrylVB белка являются личинки комаров A. aegypti, лишь в некоторых работах приведены данные о токсичности CryIVB белка для личинок A. stephensl И A. ganbiae без указания точных данных LC50.

В наших экспериментах видом, наиболее чувствительным, к воздействию CrylVB являлись личинки комаров A.stephensi. Личинки комаров Aß. aegypti были в 5-200 раз менее чувствительны к воздействию препарата Поскольку комары рода Anopheles являются основными переносчиками возбудителей малярии, определен уровень инсектицидного действия CrylVB белка на личинках комаров 5 видов этого рода (Табл.3). В данном эксперименте использовали препарат клеток- М. fJageJiata/r<pISR130recf). Личинки всех 5 испытанных видов комаров рода Anopheles были чувствительны к воздействию ре-комбинантных клеток. Наибольший токсический эффект проявлялся на личинках A. stephensl и A. pulcherriims.

Таблица 3. Уровень инсектицидной активности клеток U. flagellatum pISR130recf на комарах рода Anopheles.

Тест-обьеет

LC50 мкт(общего белка /мл)

A stephensi A atroparvus

0,033 0.177 0,182 0,087 0,275

A superpictus A pulcherrinus A sacharovi

Результаты опытов по определению биологической активности М. Па{ге1 Л а(;шл(р13!?130гесГ) позволяют предложить сконструированный штамм для создания высокорентабельного, экологически безопасного препарата для борьбы с малярийными комарами.

1. Выделены 2 новых штамма Я thuringiensis ssp. israelensis -Л2 и 1-5, обладающих высокой москитоцидной активностью.

2. Сконструирована серия векторов широкого круга грамотрица-гельных хозяев, позволяющих вести прямой визуальный отбор реком-бинантов на индикаторных средах.

3. В составе сконструированных векторов клонирован ген crylAa a t/iiring-iensis ssp. kurstaki HD-1. Максимальная продукция Cry] ha белка в клетках E.coli и U. flagellatum получена при экспрессии гена crylAa в составе единой рамки считывания с N-концевой частью гена ß-галактозидазы.

4. Из штамма В. thuringiensis ssp. israelensis (1-5) клонирован ген москитоцидного эндотоксина Определена полная нуклеотидная последовательность гена, что позволило отнести его к Cry IVB классу генов инсектицидных кристаллических белков. Выявлены нук-леотидные замены, определяющие аминокислотные замены в первичной структуре белка, в сравнении с другими белками Cry IVB класса.

5. Ген сг/IVB субклонирсван в составе сконструированных векто-

вшда

ров широкого круга хозяев. Максимальная продукция OylVB белка в клетках М. flagellatum выявлена при экспрессии гена под контролем промотора гена гесА М. Падь Л a tum в составе единой рамки считывания с N-концевой частью .гена гесА.

6. Исследован спектр инсектицидного действия Cry IVB белка на личинках комаров 7 видов. Наибольший токсический эффект обнаружен на личинках комаров рода Anopheles.

7. Злектронномикроскопически выявлено присутствие включений в клетках М. И age 1 latum (plSR130recf). Включения по электронной плотности, форме и размерам соответствуют кристаллическим включениям исходного штамма В. thjrtngiensis ssp. israelensis(l-5).

Список работ, опубликованных го теме диссертации.

1. Марченко Е Д., Смирнова Т. А., Ганушкина Д 0., Николаенко М. А. , Аз избеган P.P. Характеристика новых штаммов В. thuringi ensis обладающих москитоцидной активностью. - Биотехнология. - 1994.-N 11-12.-с. 8-12.

2. Марченко Е Д., Марченко Г. Е , Азизбекян Р. Р. , Конструирование векторов широкого круга хозяев различного функционального назначения. Экспрессия генов инсектицидных эндотоксинов В. thuringiensls в грамотрицательных микроорганизмах. - 1994.-Биотехнология (в печати).

, 3. Azizbekyan R. R. , Marchenko N. D. , Ganyshkina L. О, Cloning of mosquitocidal endotoxin gene from B. thuringiensls var. israelensis. - Seventeenth International Congress of Genetics. - Birmingham U.K. - 1993.,p. 185.

4. Марченко E Д. , Азизбекян P. P. Клонирование и изучение ге-терологичной экспрессии гена москитоцидного эндотоксина В. thuringiensis var. israelensis. Международная научно-практическая конференция "Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней", Одесса, 1994.

5. Марченко Е Д., Ганушкина Л 0., Азизбекян Р. Р. Создание экологически безопасного штамма для борьбы с личинками комаров. Научно-практическая конференция "Здоровье населения России и пути его улучшения", Москва, 1994.