Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика нового гена cry 28Аа и изучение факторов, определяющих локализацию дельта-эндотоксинов в спорулирующих клетках Bacillus thuringiensis ssp. finitimus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Войцеховская, Яна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Факторы, определяющие энтомопатогенность В. thuringlensls.

I. Структура и классификация дельта-эндотоксинов.

1. Общая структура дельта-эндотоксинов.

2. Классификация дельта- эндотоксинов.

3. Доменная структура, механизм действия дельта-эндотоксинов и эволюция доменной структуры.

II. Особенности В.thuringiensis как энтомоцидного микроорганизма и его экологическая ниша.

1. Действующие энтомоцидные агенты В.thuringiensis.

2. Cry белки, синтезируемые другими энтомопатогенными бактериями. Экологическая ниша В. thuringiensis.

III. Организация генома В. thuringiensis.

1. Организация генома В. thuringiensis.

2. Положение cry-генов в геноме В.thuringiensis.

IV. Регуляция синтеза- дельта- эндотоксинов.

1. Промоторы.

2. Копийность плазмид, включающих cry гены.

3 . Стабильность мРНК.

V. Споруляция В. thuringiensis.

1. Общая морфология споруляции у бацилл.

2.Особенности споруляции В. thuringiensis.

Экзоспориум.

VI. Характеристика В. thuringiensis ssp. finitimus и его особенности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ:.

I. Клонирование и характеристика гена нового дельта-эндотоксина сгу28Аа из В. thuringiensis ssp. finitimus.

1. Конструирование геномного банка и клонирование гена сгу28Аа.

2. Анализ последовательности клонированного фрагмента и структура геномного локуса гена сгу28Аа.

II. Исследование функциональности генов сгу26Аа и сгу28Аа, клонированных из В. thuringiensis ssp. finitimus.

1. Анализ продуктов экспрессии генов дельта-эндотоксинов сгу26Аа и сгу28Аа в клетках акристаллического штамма В. thuringiensis ssp. kurstaki.

2. Изучение функциональности предполагаемой промоторной последовательности сгу28Аа.

III. Анализ исходного штамма В. thuringiensis ssp. finitimus.

1. Доказательство существования двух морфологических форм «СЦ» «СВ» исходного штамма В. thuringiensis ssp. finitimus, способных к образованию соответственно только сцепленных или только свободных кристаллических включений.

2. Анализ геномов двух морфологических форм «СВ» и

СЦ» В. thuringiensis ssp. finitimus на наличие генов cry2 6Aa и сгу28Аа.

IV. Изучение локализации кристаллических включений при экспресссии реперного гена сгу9Аа в клетках двух морфологических форм «СВ» и «СЦ».

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика нового гена cry 28Аа и изучение факторов, определяющих локализацию дельта-эндотоксинов в спорулирующих клетках Bacillus thuringiensis ssp. finitimus"

Грамположительные бактерии рода Bacillus широко распространены в природе, имеют важное хозяйственное и медицинское значение, а также используются в производстве антибиотиков, ферментов и других биологически активных веществ. Один из видов бацилл, Bacillus thurlngiensis, известен своими энтомоцидными свойствами и широко используется для создания биопестицидов с высокой избирательностью в отношении различных видов насекомых.

Значительная доля энтомопотогенного действия В. thurlngiensis определяется классом родственных белков, называемых Cry - белками или дельта- эндотоксинами. Во время споруляции из дельта- эндотоксинов формируются видимые в световой микроскоп кристаллические включения, расположенные обычно рядом со спорой внутри материнской клетки. После лизиса материнской клетки смесь кристаллических включений и спор высвобождается во внешнюю среду.

В настоящее время клонировано и секвенировано большое количество cry-генов, в результате чего появилась реальная возможность создавать штаммы В.thurlngiensis с комбинированными энтомоцидными свойствами. Для создания таких штаммов необходимо обеспечивать эффективную продукцию рекомбинантных белков в спорулирующих клетках В. thurlngiensis. Это важная практическая задача, вызывающая повышенный интерес исследователей к проблемам регуляции синтеза дельта- эндотоксинов В.thurlngiensis, а также к механизмам формирования кристаллических включений.

Несмотря на интенсивное изучение регуляции транскрипции дельта- эндотоксинов, механизм формирования кристалла все еще не ясен. Формирование энтомоцидных кристаллов у бацилл, видимо, не воспроизводит кристаллизацию белков in vitro, так как на всем протяжении процесса роста кристаллов концентрация находящегося в растворе эндотоксина ничтожно мала. В ряде работ (Somerville, 1971, Ar orison, 1976) показано, что в самом начале своего образования кристалл связан с мембраной экзоспориума, хотя впоследствии утрачивает эту связь и свободно располагается в цитоплазме материнской клетки. Эти и некоторые другие данные позволяют предположить существование структуры, выполняющей роль инициатора образования кристаллов эндотоксинов.

У большинства представителей вида В. thuringiensis белковые кристаллы образуются только с внешней стороны экзоспориальной оболочки и освобождаются в среду при автолизе спорангиев. Тем не менее, существуют подвиды В.thuringiensis, образующие кристаллические включения как снаружи, так и внутри экзоспориума. Кристаллы, сформированные с внутренней стороны экзоспориума, после лизиса материнской клетки остаются связанными со спорой, в то время как кристаллы с обычным местом закладки остаются «свободными». Такой способ закладки кристаллов встречается у В.thuringiensis ssp. finitimus, у В. thuringiensis ssp. lewin и у некоторых других (Debro, 1986).

Подвид finitimus уже привлекал к себе внимание исследователей. В работе Debro (1986) указывалось на связь локализации кристаллов внутри экзоспориума с наличием 98-МДа плазмиды. В этой же работе сообщалось о том, что эндотоксины, образующие свободные и связанные кристаллы, обладают уникальными антигенными свойствами, отличаясь при этом друг от друга. Для другого штамма подвида finitimus также показана иммунологическая уникальность дельта-эндотоксинов (Ревина, 1999), но в отличие от работы Debro (1986), белковый состав свободных и связанных кристаллов оказался сходным.

Целью настоящей работы было клонирование и секвенирование одного из генов дельта-эндотоксинов из В. thuringiensis ssp. finitimus, характеристика его геномного локуса в сравнении с ранее клонированным из данного подвида геном дельта-эндотоксина сгу26Аа, а также исследование влияния некоторых факторов, таких как природа Cry белка, положение гена дельта-зндотоксина в геноме и время начала его экспрессии, на локализацию синтезирующихся белковых кристаллов в спорулирующих клетках В.thuringiensis ssp. finitimus.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структура и классификация дельта-эндотоксинов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Войцеховская, Яна Александровна

выводы

1. Клонирован и секвенирован фрагмент генома В. thuringiensis ssp. finitimus 1166 ВКПМ, содержащий ранее неизвестный ген дельта-эндотоксина. Соответствующий ему Cry - белок на основании анализа первичной структуры выделен в отдельную группу эндотоксинов В. thuringiensis и ему присвоено номенклатурное название Сгу28Аа1.

2. В 54-фланкирующей области гена cry28Aal в положении -280 обнаружена последовательность, сходная с промотором гена сгуЗАа, обеспечивающим раннее начало экспрессии в ходе споруляции, не характерное для большинства известных дельта-эндотоксинов. Получено экспериментальное подтверждение функциональности данной промоторной области.

3. Показана возможность гомологичной экспрессии гена cry26Aal в акристаллическом штамме В. thuringiensis ssp. kurstaki под контролем собственной 54-фланкирующей области размером 900 п.н. Отсутствие в пределах данной области консенсусных последовательностей промоторов известных дельта-эндотоксинов дает основание предполагать наличие в .ней промотора нового типа.

4. При экспрессии гена cry26Aal в акристаллическом штамме В. thuringiensis ssp. kurstaki кристаллы дельта-эндотоксина образуются только вне экзоспориума, из чего следует, что природа Cry белка является недостаточным условием для его адресации внутрь экзоспориального пространства в клетках В. thuringiensis.

5. Появление не связанных со спорой кристаллов при экспрессии рекомбинантного гена cry26Aal в штамме В. thuringiensis ssp. finitimus, образующем только кристаллы внутри экзоспориального пространства,, свидетельствует о том, что правильное функционирование системы, контролирующей адресацию белка Cry2 6Aal в спорулирующей клетке ssp. finitimus, требует определенного местоположения или определенной копийности соответствующего гена в геноме. б. На примере экспрессии реперного гена сгуЭАа в штамме В. thuringiensis ssp. finitimus, образующем кристаллы, сцепленные со спорой, показано, что время начала экспрессии гена не является. основным фактором, определяющим адресацию Cry белков в клетке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кристаллические тела включения В. thuringiensis, состоящие из белковых дельта-эндотоксинов, являются одним из примеров крупных организованных белковых структур. Вместе с тем, механизм, обуславливающий строгую пространственную организацию кристаллических тел включения дельта-эндотоксинов остается неясным. Можно надеяться, что данная работа внесет некоторый вклад в изучение механизма специфической адресации и укладки белков в макромолекулярные комплексы. Кроме того, исследование новых групп токсинов В. thuringiensis ssp. finitimus представляет интерес с точки зрения поиска новых белковых инсектицидов.

Более ранние исследования специфичности пространственной закладки кристаллов в клетках штаммов В. thuringiensis ssp. finitimus предполагали, что локализация кристаллических тел включения может определяться либо только природой дельта-энодотоксина, либо только свойствами штамма. В представляемой работе впервые показана возможность образования двух типов белковых кристаллов (свободных и сцепленных) одним и тем же белком в одной клетке в зависимости от локализации гена данного дельта-эндотоксина в геноме, причем для формирования сцепленного кристалла требуется действие дополнительных факторов, в отсутствие которых происходит формирование свободного кристалла.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор хотел бы выразить благодарность

И.А.Залунину, Л.П. Ревиной, Е.И. Левитину, С.И. Новиковой, А.Б. Шевелеву за помощь в работе, В.В. Алешину за ценные советы при обсуждении, Д. Цайглеру за помощь в анализе последовательности клонированного гена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Войцеховская, Яна Александровна, Москва

1. Шлегель. Общая микробиология. М., «Мир», 1987.

2. Adams, L. F. , К. L. Brown, and Н. R. Whiteley. 1991. Molecular cloning and characterization of two genes encoding sigma factors that direct transcription from a Bacillus thuringiensis crystal protein gene promoter. J. Bacterid. 173:384 6-3854

3. Adams L.F., Visick J.E. and Whiteley H.R. A 20-kilodalton protein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 27-kilodalton crystal protein in Escherichia coli. J Bacterid, 1989, 171: 521.

4. Agaisse, H., and D. Lereclus. 1994. Structural and functional analysis of the promoter region involved in full expression of the crylllA toxin gene of Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. 13:97-107.

5. Agaisse H and Lereclus D,-SD: a Shine-Dalgarno sequence in the 5' untranslated region is a determinant of mRNA stability. 1996 Mol Microbiol. 20 (3) :633-43.

6. Agaisse, H., Lerecluse, D. How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein. (1995) J. Bacterid. 177, 6027-6032.

7. Aronson, A.I. and Fitz-James, P., Structure and morphology of bacterial spore coat. (1976) Bacterid. Rev. 40, 360-402.

8. Baillie A, Thomson RO, Batty I, Walker PD Some preliminary observations on the location of esterases in Bacillus cereus. J Appl Bacterid 1967 Aug;30(2):312-6.

9. Baum, J. A. 1994. 1n5401, a new class II transposable element from Bacillus thuringiensis. J. Bacteriol. 176:2835-2845.

10. Baum, J. A., D. M. Coyle, M. P. Gilbert, C. S. Jany, and C. Gawron-Burke. 1990. Novel cloning vectors for Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 56:3420-3428.

11. Baum JA, and Malvar,T., Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 1995 Oct;18(1):1-12.

12. Beaman TC, Pankratz HS, Gerhardt P J Paracrystalline sheets reaggregated from solubilized exosporium of Bacillus cereus. Bacteriol 1971 Jul;107(1):320-4

13. Bernhard K.P, Jarett M Meadows J Butt, Ellis J, RobertsS, Pauli P, Rogers and Burges Natural isolates of Bacillus thuringiensis world wide isolationdistribution and activity against inserct pest. 1997 J. Inver. Pathology 70;59-68.

14. Bradley, D., M. A. Harkey, M.K. Kim, D. Biever, and L.s. Bauer, 1995. The insecticidal CrylB protein of Bacillus thuringiensis ■ has dual specificity to coleopteran and lepidopteran larvae. J.Invertebr.Pathol.65: 162-173.

15. Bravo A. Phylogenetic Relationship of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. 1997, J. Bacterid. 179: 2793-2801.

16. Brown KL, Whiteley HR. Isolation of the second Bacillus thuringiensis RNA polymerase that transcribes from a crystal protein gene promoter. J Bacterid 1990 Dec;172(12):6682-8.

17. Brown KL, Whiteley HR Isolation of a Bacillus thuringiensis RNA polymerase capable of transcribing crystal protein genes. Proc Natl Acad Sci USA 1988 Jun;85(12):4166-70.

18. Carlson CR, Kolsto AB A small (2.4 Mb) Bacillus cereus chromosome corresponds to a conserved region of a larger (5.3 Mb) Bacillus cereus chromosome. Mol Microbiol 1994 Jul;13(1):161-9.

19. Carlson CR, Johansen, M.M Lecadet and А.В Colsto.The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMS Microbiol Lett. 1996 Aug 1;141 (2-3) :163-7.

20. Chapman JS, Carlton ВС Conjugal plasmid transfer in Bacillus thuringiensis. Basic Life Sci 1985;30:453-67.

21. Crickmore N and Ellar D, Involvement of a possible chaperoning in the efficient expression of a cloned CryllA delta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. Molecular Microbiology, 1992, 6 (11), 1533-1537.

22. Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev 1998 Sep;62(3):807-13.

23. Debro L.-J., Fitz-James P.C., Aronson A. The different parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis ssp finitimus. J. of Bacterid., 1986, 165: 258-268.

24. Donovan WP, Gonzalez JM Jr, Gilbert MP, Dankocsik C, Isolation and characterization of EG2158, a new strain of Bacillus thuringiensis toxic to coleopteran larvae, and nucleotide sequence of the toxin gene. Mol Gen Genet. 1988 (a)Nov;214(3):365-72.

25. Donovan WP, Dankocsik C, Gilbert MP.,Molecular characterization of a gene encoding a 72-kilodalton mosquito-toxic crystal protein from Bacillusthuringiensis subsp. israelensis. J Bacteriol. 1988 (b) 0ct;170(10):4732-8.

26. Estruch JJ, Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 May 28;93(11):5389-94.

27. Fonstein M, Haselkorn R Physical mapping of bacterial genomes. J Bacteriol 1995 Jun;177(12):3361-9,

28. Garcia-Patrone M, Tandecarz JS A glycoprotein multimer from Bacillus thuringiensis sporangia: dissociation into subunits and sugar composition.Mol Cell Biochem. 1995 Apr 12; 145 (1) :29-37.

29. Ge AZ, Rivers D, Milne R, Dean D Functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Refinement of Heliothis virescens and Trichoplusia ni specificity domains on CrylA(c) . Biol Chem 1991 Sep 2 5;2 6 6(27) :17954-8.

30. Ginard M, Lalucat J, Tummler B, Romling U Genome organization of Pseudomonas stutzeri and resulting taxonomic and evolutionary considerations. Int J Syst Bacteriol 1997 Jan;47(1):132-4 3.

31. Glatron M.F., Rapoport G. Biosynthesis of the parasporal inclusions of Bacillus thuringiensis: half-life of its corresponding mRNA. Biochmie, 1972, 54: 1291-1301.

32. Gonzalez Jr., J.M., Dulmage H.T. and' Carlton B.C. Correlation between specific plasmids and d-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. Plasmid, 1981, 5: 351-365.

33. Green, B. D. , L. Battisti, and С. B. Thorne. 1989. Involvement of Tn4430 in transfer of Bacillus anthracis plasmids mediated by Bacillus thuringiensis plasmid pX012. J. Bacterid. 171:104-113.

34. Grochulski P.I, Maason S., Borisova, M., Pusztai-Carey.J., L., Schwartz, R., Brousseau and M.Cygler.Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. J Mol Biol. 1995 Dec 1;254 (3) :447-64.

35. Haldenwang W.G., The sigma factors of Bacillus thuringiensis.1995. Micob.Rev.59,1: 1-30.

36. Hallet В., Rezsohazy R. and Delcour J. IS231A from Bacillus thuringiensis is functional in Escherichia coli: transposition and insertion specifity. J Bacterid, 1991, 173: 4526-4529.

37. Hierson, A.I, Sieden A., Kivaisi and H.G.Boman. Bacteriohage resistant mutants of Bacillus thuringiensis with decreased virulense in pupae of Hyalophora cecropia .J. Bacteriologyl67:18-24.

38. Hofte H. and Whiteley H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev, 1989, 53: 242-255.46.1taya M Stability and asymmetric replication of the Bacillus subtilis 168 chromosome structure. J Bacterid 1993 Feb;175(3):741-9.

39. Jarrett, P., and M. Stephenson. 1990. Plasmid transfer between strains of Bacillus thuringiensis infecting

40. Galleriae mellonella and Spodoptera littoralis. Appl. Environ. Microbiol. 56:1608-1614.

41. Jumas-Bilak E, Michaux-Charachon S, Bourg G, O'Callaghan D, Ramuz M Differences in chromosome number and genome rearrangements in the genus Brucella. Mol Microbiol 1998 Jan;27(1):99-106.

42. Kaneko 1, Nozaki R, Aizawa K. Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Microbiol Immunol 1978;22 (10) :639-41.

43. Kolsto AB Dynamic bacterial genome organization. Mol Microbiol 1997 Apr;24(2):241-8.

44. Koshikawa T, Yamazaki M, Yoshimi M, Ogawa S, Yamada A, Watabe K, Torii M Surface hydrophobicity of spores of Bacillus spp J Gen Microbiol 1989 Oct; 135 ( Pt 10):2111-22.

45. Kozuka S, Tochikubo К Properties and origin of filamentous appendages on spores of Bacillus cereus. Microbiol Immunol 1985;29(1):21-37.

46. Kronstad, J. W., and H. R. Whiteley. 1984. Inverted repeat sequences flank a Bacillus thuringiensis crystal protein gene. J. Bacterid. 160:95-102.

47. Lee MK, Milne RE, Ge AZ, Dean DH Location of a Bombyx mori receptor binding region on a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin. J Biol Chem 1992 Feb 15;2 67(5) :3115-21.

48. Leonard, С., Y. Chen, and J. Mahillon. 1997. Diversity and different distribution of IS232, IS232 and IS240 among Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis and Bacillus mycoides. Microbiology 143:2537-2547.

49. Lereclus D. , Mahillon J., Menou G. and Lecadet M.-M. Identification of Tn4430, a transposon of Bacillus thuringiensis functional in E.coli. Mol. Gen. Genet., 1986, 204: 52-57.

50. Lereclus D., Ribier J. , Klier A., Menou G. and Lecadet M.-M. A transposone-like structure related to the d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis. EMBO J., 1984, 3: 2561-2567.

51. Lereclus, D., M. Vallade, J. Chaufaux, 0. Arantes, and S. Rambaud. 1992. Expansion of the insecticidal host range of Bacillus thuringiensis by in vivo genetic recombination. Bio/Technology 10:418-421.

52. Li J., Carroll J. and Ellar J.D. Crystall structure of insecticidal 8-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution. Nature, 1991, 353.

53. Liu SL, Sanderson KE Highly plastic chromosomal organization in Salmonella typhi. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Sep 17; 93 (19) :10303-8.

54. Lovgren A, Zhang M, Engstrom A, Dalhammar G, Landen R Molecular characterization of immune inhibitor A, a secreted virulence protease from Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol 1990 Dec; 4 (12).: 2137-4 6.

55. Lu H, Rajamohan F, Dean DH Identification of amino acid residues of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CrylAa associated with membrane binding and toxicity to Bombyx mori. J Bacterid 1994 Sep;176(17):5554-9.

56. MacKinnon, R. , and C. Miller. 1989. Mutant potassium channels with altered binding of charybdotoxin, a pore-blocking peptide inhibitor. Science 245:1382-1385.

57. MacKinnon, R. , and G. Yellen. 1990. Mutations affecting TEA blockade and ion permeation in voltage-activated K+ channels. Science 250:276-279.

58. Mahillon J, Rezohazu R, Hallet B. and Delcour J. IS231 and other Bacillus thuringiensis transposable elements: a review. Genetica. 1994;93(1-3):13-26.

59. Margolis PS, Driks A, Losick R Sporulation gene spoIIB from Bacillus subtilis. : J Bacterio.l 1993 Jan;175(2):528-40.

60. Matz LL, Beaman TC, Gerhardt P Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J Bacteriol 1970 Jan;101(1):196-201.

61. Meadows M.P., Bacillus thuringiensis in the environmental ecology and risk assessment.1993, In Entwistle P.F., Cory M.G., Bailey M.G., and Higgs

62. Bacillus thuringiensis an environmentalbiopesticide:theory and practice.Wiley.NY.

63. Okstad OA, Hegna I, Lindback T, Rishovd AL, Kolsto AB Genome organization is not conserved between Bacillus cereus and Bacillus subtilis. Microbiology 1999 Mar;145 ( Pt 3):621-31.

64. Rossler, D., W. Ludwig, К. H. Schleifer, C. Lin, T. J. McGill, J. D. Wisotzkey, P. Jurtshuk, Jr., and G. E. Fox. 1991. Phylogenetic diversity in the genus Bacillus as seen by 16S rRNA sequencing studies. Syst. Appl. Microbiol. 14:266-269.

65. Rosso, M.-L., and A. Delecluse. 1997. Distribution of the insertion element IS240 among Bacillus thuringiensis strains. Curr. Microbiol. 34:348-353.

66. Salamitou S, Agaisse H, Bravo A, Lereclus D. Genetic analysis of crylllA gene expression in Bacillus thuringiensis Microbiology 1996 Aug;142 ( Pt 8):2049-55.

67. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

68. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D. , Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D. and Dean, D. Bacillus thuringiensis and its pesticidal protein. 1998, Microbiol. Mol.Biol.Rev., 62, 775-806.

69. Schnepf HE, Tomczak K, Ortega JP, Whiteley HR Specificity-determining regions of a lepidopteran-specific insecticidal protein produced by Bacillus thuringiensis. J Biol Chem 1990 Dec 5;265(34):20923-30.

70. Shevelev А.В., Lewitin E., Novikova S.I., Wojciechowska Ya.A., Usacheva E.A., Chestukhina G.G., and Stepanov V.M. A new universal PCR-based approach for fast search of Bacillus thuringiensis strains for cryl, cry4 and cry9 genes MMBI,1998,Vol.45.No.6.

71. Smith, G. P., D. J. Ellar, S. J. Keeler, and С. E. Seip. 1994. Nucleotide sequence and analysis of an insertion sequence from Bacillus thuringiensis related to IS150. Plasmid 32:10-18.

72. Smith GP, Ellar DJ Mutagenesis of two surface-exposed loops of the Bacillus thuringiensis

73. CrylC delta-endotoxin affects insecticidal specificity. Biochem J 1994 Sep 1;302 ( Pt 2):611-6.

74. Somerville, H.J. (1971) Formation of the parasporal inclusions of Bacillus thuringiensis Eur. J. Biochem., 18, 226-237.

75. Stephens, J. M. 1952. Disease in codling moth larvae produced by several strains of Bacillus cereus. Can. J. Zool. 30:30-40.

76. Stragier P, Kunkel B, Kroos L, Losick R Chromosomal rearrangement generating a composite gene for a developmental transcription factor. Science 1989 Jan 27;243 (4890) :507-12.

77. Suwanto A, Kaplan S Physical and genetic mapping of the Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 genome: presence of two unique circular chromosomes. J Bacterid 1989 Nov; 171(11) :58 50-9.

78. Von Tersch MA, Slatin SL, Kulesza CA, English LH Membrane-permeabilizing activities of Bacillus thuringiensiscoleopteran-active toxin CryIIIB2 and CryIIIB2 domain Appl Environ Microbiol 1994 Oct; 60 (10) :3711-7 I peptide.

79. Walters FS, Slatin SL, Kulesza CA, English LH Ion channel activity of N-terminal fragments from CrylA(c) delta-endotoxin. Biochem Biophys Res Commun 1993 Oct 29; 196 (2) :921-6.

80. Wehrli E, Scherrer P, Kubler О The crystalline layers in spores of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis studied by freeze-etching and high resolution electron microscopy. Eur J Cell Biol 1980 Feb;20(3):283-9.

81. Widner WR, Whiteley HR Two highly related insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki possess different host range specificities. J Bacteriol 1989 Feb;171(2):965-74.

82. Wojciechowska J.A., Lewitin E.,.Revina L.P,.Zalunin I.A, Chestukhina G.G. Two novel genes families of delta-endotoxin cry26 and cry28 from Bacillus thuringiensis ssp. finitimus. FEBS Letters 1999, (453) 1-2 pp 46-48.

83. Wong, H. С., H. E. Schnepf, and H. R. Whiteley. 1983. Transcriptional and translational start sites for the Bacillus thuringiensis crystal protein gene. J. Biol. Chem. 258:1960-1967.

84. Wong HC, et al. Identification of a positiveretroregulator that stabilizes mRNAs in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 May;83(10):3233-7.

85. Wu, D. and A.I. Aronson. 1992. Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis delta-endotoxin involved in toxicity and specificity. J.Biol.Chem. 267: 2311-2317.

86. Wu, D. and D.H. Dean. 1996. Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylllA delta-endotoxin. J.Mol.Biol. 255:628-640.

87. Y00I AJ Block of the inactivating potassium channel by clofilium and hydroxylamine depends on the sequence of the pore region. Mol Pharmacol 1994 Nov;46(5):970-6.

88. Yu CG, Mullins MA, Warren GW, Koziel MG, Estruch JJ The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. Appl Environ Microbiol 1997 Feb; 63 (2) :532-6.

89. Zhang J, Hodgman TC, Krieger L, Schnetter W, Schairer HU Cloning and analysis of the first cry gene from Bacillus popilliae J Bacterid 1997 Jul;179(13):4336-41.

90. Zhang, J., H. U. Schairer, W. Schnetter, D. Lereclus, and H. Agaisse. Bacillus popilliae cryl8Aa operon is transcribed by sigmaE and sigmaK forms of RNApolymerase from a single initiation site.Nucleic Acids Res. 1998 Mar 1;26 (5):1288-93.

91. Zhang MY, Lovgren A, Low MG, Landen R Characterization of an avirulent pleiotropic mutant of the insect pathogen Bacillus thuringiensis: reduced expression of flagellin and phospholipases. Infect Immun 1993 Dec;61(12):4947-54.

92. Zheng LB, Donovan WP, Fitz-James PC, Losick R Gene encoding a morphogenic protein required in the assembly of the outer coat of the Bacillus subtilis endospore. Genes Dev 1988 Aug;2(8):1047-54.