Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Систематика грамотрицательных метилотрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 5s рибосомных РНК

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Систематика грамотрицательных метилотрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 5s рибосомных РНК"

рЛ

„ к

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи ., УЖ 579.22:577.113.5 + 579.84

БУЛЫГИНА Евгения Станиславовна

СИСТШАТЙКА ГРАЫОТРИЦАГЕЛЬНЫХ МЕТШЮТРОШХ БАКТЕРИИ НА ОСНОВЕ . АНАЛИЗА КУКЛЕОТШНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 5Э РИБОСОМНЫХ ИИ

Специальность 03.00.ff7 - кнкробнология

АВТОРЕФЕРАТ

лпссзртацал иа соисканпэ ученой степэпи кандидата биологических паук

Москва - 1991

Работа выполнена в Ыежфакультетской ПНИД ш. А.Н.Белозерского МГУ и Институте микробиологии АН СССР

Научшэ руководители: доктор биологических наук К.VI.Чумаков и.

доктор биологических наук А.И.Не трусов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.М.Горленко,

кандидат биологических наук А.В.Троицкий Ведущая организация: ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

на заседании Специализированного совета Д 002.64.01 при Институте ' микробиологии АН СССР по адресу 117811, г. Цосква, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л.Е. Никитин

• *

ч } |.;|Ц|ДУ уальность задачи. Метилотрофные бактерии - мшсроорганизмн,

чИИЫшзз шив метан и его производные в качестве единственного ис-

иссатция

тйчяйка 'углерода и энергии. Облигатныэ метилотрофы могут использовать только (^-соединения, в то время как факультативные способны также расти и на полиуглеродных субстратах, примем последних микроорганизмов значительно больше. Так как метилотрофные бактерии относятся к разним систематическим группам, то естественно, что и пх морфология, физиологические и биохимические свойства достаточно разнообразны. Некоторые представители способны расти з хемолито-автотрофгах условиях, другие одновременно являются и фототрофами. Известны также строгие анаэроба, растущие в автогрофных условиях, окисляя молекулярный водород.

С развитием биотехнологии интерес к этой группе микроорганизмов значительно поеысился, поскольку мегилотроды оказались крайне перспективными в качестве продуцентов микробной биомассы - заменителя растительного и животного белка, различных аминокислот, а также ферлэптпых комплексов для трансформации различных химических веществ.

Интенсивное изучение метилотрофннх бактерий, их метаболизма, а также возможностей их промышленного использования привело к появлению обширней литературы. Однако существующая номенклатура ме-тллотрофов неудовлетворительна, поскольку существуют случаи появления дублнрупцих наименований для различных видов или использования нескольких наименований для одного вида. Большие сложности возникают и при идентификации облигатннх метилотрофных бактерий, поскольку для них оказались непригодны?™ многие классические т<.е-ты. К тому го в последнее время описано много новых штаммов мотани метанолиспользуших микроорганизмов, которых невозможно причислить ни к одному из известных родов. Кроме того, способность к

ыетилотрофии обнаруживают микроорганизмы, ухе отнесенные к той или иной таксономической группе. Такая неопределенность в номенклатуре в таксономии метилотрофов требует наведения порядка, поскольку без этого невозможно детальное поникание биологии этих бактерия, б такие решение некоторых Сиотехнологических проблем.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение систематики грамотрицательных метилотрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 58 рибосомных РНК, успешно применявшегося для таксономических исследований других групп бактерий. Конкретно задача исследования сводилась к следующему:

- определить нукпэотидные последовательности Бе рибосомных .РИС

л

различных видов и родов'грамотрицательных метилотрофных бактерий;

- провести филогенетический анализ полученных последовательностей с цель» выяснения уровня генетического родства изучаемых штаммов;

- сравнить полученные последовательности с последовательностями немэтилотрофных бактерий, имеющихся в банке данных с целью выяснения филогенетического положения метилотрофов;

- попытаться идентифицировать отдельные штамма метилотрофов на основе сравнения последовательностей их 53 рРНК о банком;

- использовать даиный геносастематический метод для определения состава конкретной микробной популяции.

Научная новизяа работа. В данной работе впервые для решения вопросов таксономии метилотрофных бактерий был использован один из методов геносистематики, а именно, метод изучения таксономии бактерий на основе сравнения нуклеотидных последовательностей 53 рибосомных РНК. Кроме того, были проведет исследования по выяснению степени филогенетического родства метилотрофов с другими группами бактерий, а такжэ было взучэво пгроисхсадениэ пршика котало-

трофга. С помсщью указанного метода было определено таксономическое -положзние ряда вновь выделенных груш бактерий.

Практическая ценность. В ряде случаев били выявлены неточности при первичной идентификации микроорганизмов. Была предпринята попытка использовать данный метод для более точной идентификации облпгатных метилотрофянх бактерий, что особенно важно в силу высокого биотехнологического потенциала данной группы микроорганизмов. Использование данного метода позволило определить состав микробной популяции, используемой в промышленном биореакторе, • что позволяет рекомендовать данный метод для использования в экологических исследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации бнли представлены на конференции шлодых ученых "Физиология, генетика и биохимия метилотрофянх микроорганизмов" (Канев, 1986), на Всесоюзной школе-конференции колодых учете "Систематика и эволюции микроорганизмов" (Пущино-на-Оке, 1988), на Мепдународноя симпозиуме то метилотроф-ним бактериям (Геттинген, 1989).

Публикации. По тэке диссертации опубликовано 6 статей и тезисы 1 доклада.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введопня, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы.

Работа пзлогена па 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами я 18 рисунками. Список литературы включает 150 работ отечественных а зарубежных авторов.

Место проведения работа. Работа выполнена в секторе взаимодействия вируса с клеткой МеифакультетскоЯ ПНИЛ им. А.Н. Белозерского МГУ и в лаборатории гэносистематики ц эволиции бактерий Института микробиология АН СССР.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты и методы исследований. Объектами служили 72 штамма грамотрицательных метилотрофных бактерий, принадлежащих различным видам и родам, и .10 штаммов неыетилотрофных бактерий, взятых для сравнения. Работа проводилась в сотрудничестве с исследователями из 6 институтов Москвы, Пущино, Киева и университета штата Миннесота (OLA), предоставившими биомассу микроорганизмов.

Для определения- последовательностей 5S рРНК бактерий брали приблизительно 1 г сырой биомассы культур в конце экспоненциальной фазы роста, суспендировали в 0,01 Ы Na-ацетатном буферном растворе рН 5,1 и экстрагировали фенолом при 60°С (Чумаков, 1972). РНК осаждали и промывали этанолом и метили in vitro {32Р1-цитидин- 1 (3*,5')-дифосфатом при помощи РНК-лигазы бактериофага Тд (England ; 4 Uhlenbeok, 1978). Фракцию 53 рРНК получали при помощи очистки высоковольтным электрофорезом в 8S полиакриламидном геле (ПААГ) (Маниатис и др., 1984). Специфическую деградацию РНК проводили химическим методом с незначительными модификациями (Feattie, 1979). Набор полученных фрагментов фракционировали электрофорезом в 20%, 1255 и В% ПААГ. . . '

На основе сравнения полученных последовательностей нуклеоти-дов 5S рРНН рассчитывали полную матрицу взаимных мутационных расстояний (Md), которую использовали для построения предполагаемого филогенетического дерева с применением принципа максимального топологического подобия (Чумаков и Юшманов, 1988). Построение проводили при помощи специально разработанного алгоритма, реализованного в компьютерной программе, написанной на языке "С" в операционной системе UNIX iDimshoe и Чумаков, 1938). При построения ' дендрограмм использовала метода кластерного анализа

(шчш-мэтод).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУВДЕЙИЕ 1. Таксономия метанотрофных бактерий

Для изучения таксономии метанотрофных бактерий были исследованы 26 штаммов, полученных из различных коллекций и представляющих практически все описанные на сегодня вида метанотрофных бактерий. По наиболее признанной на сегодняшний день схеме, разработанной Виттенбари (1970), этих бактерий относят к трем группам, пяти родам и 15 видам. Их состав и названия варьируют у разных авторов.

Первоначальные исследования проводились на штаммах, полученных от проф. В.А.Романовской (Ин-т микробиологии и аирусологш АН УССР). Предполагаемое филогенетическое дерево, построенное па основе сравнения нуклеотидных последовательностей 5Э рРНК этих штаммов представлено на рис.1.

■»ВДмияа ероп я

Рис.1. Филогенетическое дереве, основанное на сравнении нуклеотид-еых последовательностей штаммов метанотрофов из музея ИМВ АН УССР.

Проведенный анализ показал, что эти штаммы, за исключением kothv-loetnua «portum 5W, представляют собой очень компактную грушу. Однако в данном случае образованные кластеры не соответствую родовой принадлежности образуицих их цтаммов.

Неадекватность полученшх результатов и явное несоответствие их с физиолого-биохимнческиыи данными заставили нас продолкить филогенетическое исследование данной группы бактерий. Дальнейшая работа проводилась на штаммах, полученных от д.О.н. В.Ф. Гальчанко (ИНЫМ АН СССР) и проф. Р. Хансона (ун-т от. Миннесота СШ}. эти коллекции в основной представлены типовыми шташами, на которых были проведены многочисленные физаолого-биохимиче ские, нммуноло-гические и хемотаксономические исследования. Филогенетическое, дерево, построенное на основе сравнения этих штаммов (рис. 2),

Рис.2. биогенетическое дерево, осаованое на сравнении нухлео-твдных последовательностей типовых штампов мэтадагрофшх Оактаряй.

выявило иные эволюционные отношения внутри группы облигатных метанотрофных бактерия. В данном случае наблюдается практически полная корреляция меяду полученными нами результатами, схемой Виттенбари и таксономическими исследованиями, проведенными В.Ф. Гальченко и др. (1986). На представленном дереве данные штаммы образуют три четко различимых кластера, соответствующих группам I, II и X по классификации Виттенбари. Tárate ясно дифференцируются подкластеры, соответствующие 5 описанным родам мотанотрофов.

С целью сопоставления результатов филогенетических исследований различных коллекций метанотрофных бактерий било построено общее, филогенетическое дерево, отражающее эволюционные отношения между всеми исслздовзшшмя нами ■ штаммами метанотрофных бактерий (рис. 3),

¡'tl>jc ,4, . у ° «ítmioooccv» КЬПМП(Л)ГЯ Т

I "^^Sc^V I МРИ1М.Я S»

'сл. Ote». I Гр3 -----•— ОП

llatbylobflcter сЬпюсоссш 90

SW»in ЫО»

^ у ^ Ч

f о.» «а

Piíc.3. Филогенетическое дерево, отражавдзе эволюционные отношения мевду всеми исследованными штаммами мвтанотрсфшх бактерий. •

s

Проведенный анализ выявил, с одной стороны, идентичность штаммов

UethvlomonoB rubrum 23 И 15S, Uathvicainua врогЧяа 22 И 5W И ряда

других, что абсолютно логично и лишь еще раз подтверждает правомерность применения метода сравнения нуклеотидаых последовательностей 5S рРНК для филогенетических построений. С другой стороны, абсолютное отсутствие гомологий между типовым штаммом *ethvioe<mie trtchoeporium овзь и штаммом 4е того же вида можно объяснить лишь неточностью идентификации последнего. Аналогичное заключение можно

СДелаТЬ ОТНОСИТеЛЬНО ТИПОВОГО ШТаММа Uethylocyette рагииа OBBF И'

штамма 492 этого же вида. Это заключение подтверждается результатами наших исследований, свидетельствующих о филогенетической близости типовых штаммов данных видов к другим видам соответству-. итех родов. Кроме ТОГО, у Ив. trichoeporCuw 49 И Ысв. parvua 492 обнаружена 4.5S рРНК, отсутствующая у других представителей родов Methyioetnue и Uathyiooyana и характерная для других трех родов метанотрофша бактерий. Наличие этого типа рРНК является важным диагностическим признаком, поскольку этот тип рРНК обнаружен лишь. у 'представителей 7-шдгрупш протеобактерий.

Сравнение нуклеотидаых последовательностей метанотрофных бак- ' терий с банком данных показало, что метанотрофы групп I и X принадлежат к 7-подгруше протеобактерий, а мэтанотрофи группы II - к а-подгруппе, что свидетельствует о полифилетнче скоп происхождении, этих микроорганизмов. Высокий уровень генетической дивергенции между указанными группами метанотрофов. а также высокая степень различий а физиолого-бяохимическкх и хемотаксономических свойствах не позволяет объединить' этих бактерий в одау группу, а скорей всего свидетельствует об их принадлежности к различным семействам. 2. Изучение состава смешанной метанотрофной культуры. Смешанная мэтаногрофная культура, обозначенная на рисунках г

и з как strain BioR, получена нами из лаборатории проф. Р. Хансона. Она используется для очистки сточных вод от трихлорэтилена (ТХЭ),

являющегося высоко токсичным для человека соединением.

) -

Для того, чтобы лучие нонять процессы биодеградации ТХЭ метанотрофами, была предпринята попытка изучить микробный состав данной культуры. Микроскопические исследования свидетельствовали о наличии по меньшей мере двух морфологических типов клеток в данном сообществе: первый представлял собой небольшие изогнутые палочки, второй - клетки, имеющие гифоподобные выросты и напомилаицие по виду гифомикробов. Многочисленные попытки раздолить данную популяцию или выделить хотя ба мвтанотрофный компонент данного симбиотического комплекса не привели к положительным результатам.

Тогда были предприняты попытка определить состав данной популяция с помо:цьп методов молекулярного зондирования, но гребущих выделения организма из состава популяции. Для этого были использованы универсальные зонды, комплиментарные к 16S рРНК эубактеряй, я группоспеЦЕфпеские зонды для метанотрофов I и II типов (Tslen et al., 1990). Результаты показали, что микроорганизмы данной популяции принадлежат к эубактериям и один из них относится к мэтанотрофам II группы. Из-за отсутствия родо- и видоспецифичннх зондов я крайне малого числа полных нуклеотидных последовательностей 16S рРНК метано- и метилотрофннх бактерий более точная идентификация состава дашюй популяции с помощью этого метода в настоящее время невозможна.

Поэтому нами была предпринята попытка определить более точно состав исследуемой популяции путем сравнения нуклеотидных последовательностей 5S рРНК, поскольку составленный нами банк таких последовательностей метилотраЦшх бактеругй на порядок прешкаэт аналогичный банк для 16S рРНК и практически полностью

охватывает видовой состав мзтанотрофов, что в данном случае явилось большим преимуществом.

Препаративное разделений суммарной РНК, выделенной из данного сообщества, обнарухило две полосы в зоне 5Б рРНК. Однако включение радиоактивной метки в одну из полос было намного слабее, что не позволило нам, к сожалению, определить одну из нуклеотидныг последовательностей. Сравнение другой полученной нами последовательности с банком выявило практически полную ее идентичность с ив. tг^-сНоарагIит. Это позволило предположить, что иэттотрскцаш коыао-нентом данной микробной популяции является штамм, принадлежащий к данному виду.

Хотя подобный вывод нельзя признать окончательным, его ! достоверность достаточно велика. Таким образом, именно анализ нуклэотидных последовательностей 5Э рРШ позволил в данном случае определить хотя бы частичный состав данного микробного сообщества, что оказалось невозможным при пошил других методов.

3.Таксономия облнгатных мотилотрсх^ых бактерий.

Систематика сблигагных метилотрофных бактерий также несовершенна: из-за невозможности применения классических диагностических тестов идентификация таких микроорганизмов часто носила формальный характер. -В результате эти бактерии оказались отнесены к 7 родам. Позже было предложено морские формы этих бактерий объединить в род ывгьу1арПаеа., ограничешо-<1акультативные виды, способные использовать отдельные полиуглэродные соединения, отнесли к роду ЫеИ\у1орЬ,1Ыа, а ОСТаЛЬШД - К роду ОДНАКО ДО

сих пор два последних рода включают лишь по одному виду, а таксономический статус других облигатных метилотрофных бактерий неопределен. .

В нашей работе мы-провели филогенетическое исследование 14

штаммов обжгатных и ограниченно-факультативных метилотрофшх бактерий с целью выяснения их таксономического статуса. Как видно из приведенного на pic. 4 дерева,

Ч ч о-

чч

Нл°иш Ъ. ♦

чДОи «TCO в,-Ъ ♦ 4vV

'> \ У л

Чч \

.„<•' У/ V Ч

У // \ \ N

^ \

**

- // ■

Рис.4. Дерево, отракакщее эволюционные отношения между облигатнн-ми и ограниченно-факультативными мегилотрофными бактериями.

исследованные штаммы образовали два очень компактных кластера, соответствующих облитатаим и ограниченно-факультативным мотило-трофным бактериям. Группа истинно облигатных бактерий компактна и представлена несколькими ветвями, соответствующими, видгмо, различным видам рода tfetHyiobaouiua. Это предположение подтвердилось результаташ ДНК-ДНК гибридизации и радом других • исследований (Говорухина п др., 1989). Аналогичные результата были получены при исследовании группы ограниченно-факультативных бактерий, образовавших такав компактные подкластеры, соотввтствупдае отдельным видом. Такт/ образом проведенный анализ позволил уточнить таксономл-

ческий статус целого ряда оОлигатных метилотрофных бактерий, ранее ошибочно отнесенных К родам Раеисктопаа. Рг^ат1поЬасгвг. ЫеЬНапо-попав И ДРУГИМ.

Исключение составили лишь два штамма: бы и 14, которые по своим фюзиолого-биохимическим признакам являются ограниченно-факультативными, но по результата« ДНК-ДНК гибридизации, фосфолипвд-ному составу и ряду других свойств сильно отличаются от представителей обоих групп, на основании чего они были наделены в новый род Ыаьнцгоиотя. Филогенетически эти штаммы оказались более близкими к облигатным метилобактериям, но уровень генетической дивергенции не противоречит вышеуказанным данным.

Сравнение нуклеотидша последовательностей исследованных штаммов облигатшх и ограниченно-факультативных метклотрофншс бактерий с банком данных заявило их эволюционное родство с представителями р-подгруша цротеоОактерий. Однако высокий уровень генетической дивергенции между ниш свидетельствует об относительно раннем обособлении этой группы от общего ствола эволюции. С другой стороны этот анализ показал существенную филогенетическую обособленность облигатных ыетилотрофов от метанотрофов, что ставит под сомнение правомерность объединения некоторыми исследователями всех этих бактерий в единую группу.

4.Систематика факультативных мегялогрсфных бактерий. 4.1. Таксономия рода Ие^^оьскнег^ия и идентификация штамма КИ-4.

Факультативные грамотрицательные метилотрофные бактерии представлены широким спектром бактерий, отнесенных к родам Асогоъа.с1ог,

В1аегоЪасЬег, Че ЬН\/1сЬас1вг1ип. РвемЗлиюпав И ДРУГИМ. ИцЭНТИфйКЗ-

ция этих бактерий значительно проще, однако в последнее время все чаще возникают сомнения р правомерности объединения метило- и шмвтилотрофов. К тому же для многих таких родов остается неопро-

деленным их систематическое положение. Мы провели филогенетическое исследование 33 штаммов факультативных метилотрофных бактерий, а также ряда близкородственных штаммов неметилотрофных бактерий, которые использовали для сравнения, вилогенетическоэ дерево, представленное на рис.5, отражает эволюционные отношения мекду видами рода иегки1оЪоса>г(ил и наиболее близкими им представителями других родов.

Рис.5. Филогенетическое дерево, отрааапцее взаимоотношения между штаммами в вида?® рода ttathyiobact»nuvi и рядом близких ему видов.

В этот род были выделены факультагивша, розовоокрашенные палочковидные бактерии, использующие сериновий путь Gt-ассимиляции. Анализ ДКК-ДНК гибридизации 36 итаммов этого рода выявил большое количество гомологичных групп, 8 из которых соответствовали описанным видам (Hood et ai., 1987). Однако ока, по мнению авторов, огракзют МЁНьиуя часть видового разнообразия данного рода.

Мы провели филогенетическое исследование 8 штаммов, принадлежащих данному роду, в том числе штамма теешитопав ер. рр, не включенного в исследование английских ученых, и неидевтифицирован-ного штамма КИ-4, по ряду физиолого-биохимическкх свойств сходного с представителями рода неьь.у1оЪасгегнт. Этот анализ выявил высокий уровень генетического родства между штаммом РР и видами вышеуказанного рода, однако величина взаимных мутационных расстояний не превышала меквидового уровня, характерного для данного рода. Из-за отсутствия у нас типовых штаммов четырех других известных видов рода ие1К\/1оЪасгег1\м мы не можем утверждать, что штамм РР представляет собо? новый вид, однако он отличается от описанных видов по ряду физиологических свойств. По крайней мере, принадлег-ность его к данному роду сомнений не вызывает.

Анализ нуклеотндной последовательности штамма КИ-4 выявил практически ее полную идентичность с иь. гьомгшл, однако отсутствие данных по ДНК-ДНК гибридизации, необходимых для точкой видовой диагностики, а также некоторые различия в спектре используемых субстратов не позволяют сделать окончательного вывода. Но вывод о родовой принадлежности денного штамма вполне надежен.

4.2. Филогенетический анализ рода лоеюъасЬвг.

Филогенетическое исследование организмов, отнесенных к роду лсвьоьасгег также дало интересные результаты. Этот род объединял аэробные ацидофильные палочки, способные утилизировать целый ряд органических соединений. Некоторые отачмы были способны использовать метанол, что вместе с рядом хемотаксономических особенностей послу гало для их выделения в самостоятельный род АсЮоштаз (игакалй еЪ а!., 1939). Однако, при детальном рассмотрений, критерии, выдвинутые в качестве дифференциальных признаков, оказались неправомочны. Единственным свойством, действительно отличавшим

данные штамщ, была способность использовать метанол. Остальные признаки нивелировались с учетом характеристик всех видов данного рода. Однако проведенный нами филогенетический анализ изучаемых таксонов показал, что уровень сходства геномов между неметилотроф-ными видами рода ¿с^оЪаогег и наиболее близким к нему родом аы-

оопаЪааХег суЩеСТВвННО ВЫШ8, ЧвМ М9ВДУ МвТИЛОТрофНЫМИ И НвМеТИЛО-

трофшми видами первого рода (рис. 6).

1о«1оЬшг1г «р. Я4 до*гов*с(*г »(Ьшопси» К8 68 Асвгоь»сл«г вр. зд — 4о«1оЬ»с1»г 1р. вбТ Ав«1оЬ*сгяг в р.

АО«(Об»с11Г «р. ка 68/«

С1ис<Мюиоиг Охуйым ДХСв 1986Т С1исоооЬмиг окуйш КМ 122Т

ПСИ 8бг1 1с»1оЬ*с1«г В£«и вяи 8Т9 Ас«1оьмиг р&ИтПиш ИСЦ 1(22* ДиШжсМг гу11пш ш асо

М, 0.20 О,и 0,10 О.05

Рмс.6. Кластерная дэндрограмма, отрахавдая взаимоотношения представителей родов АсПоЪасЮг И СПисапоЪасгег.

Таким образом, ато подтвердило хоть и несколько необоснованное предложение о выделении мзтилотрофшх штаммов рода ¿»вгоъааег в самостоятельный род. В данном случае именно анализ последовательностей 53 рРИК стал единственным генотипкческим способом, двКСе-ренцирущиы роды Х»»<оЬао<вг И Ае1&огюпае, О такСОНОМИЧвСКИЙ Вес

такого признака как метилотрофия для данной группы бактерий оказался довольно высоким, позволив дифференцировать таксоны родового уровня.

4.3. Определение таксономического статуса ряда почкупдося бактерий

До сих пор остается невыясненным таксономическое положение псевдомонадогодобных штаммов, используювдах сериновай путь -ассимиляции И размножающихся почкованием, например Pseudomonas" ер. HS и UA. На основании проведенного анализа ДШгрРНК гибридизации было установлено, ЧТО родственный ЭТИМ.штаммам ВИД Pseudomonas amtnovorane бЛИЗОК К КОМПЛбКСУ RMzobtum-A^robactertUKi (Green & oiiiis, 1939). Результаты проведенного наш исследования такта подтвердили филогенетическое родство исследованных нами штаммов с указанными родами, определив таким образом систематические позиции данных двух штаммов. Следует также отметить, что примерно равный уровень значений коэффициента взаимных мутационных расстояний между родами яыгоыит и Agrobacta-rivm и исследованными штачыами позволяет огрести последних к семейству ямгомaceae.

Проведенный анализ выявил также близкое эволюционное родство между семейством Rhizoblocmo И родом Syvhonicrobiwn, стнесеннш в последней руководстве Берги к груше почкующихся и стебельковых бактерий, причем систематическое положение этой группы не определено. Поэтому объединение указыиого рода с представителями комплекса Fjiizabium-Agrobacteriim црояскяет филогенетические позиции данного рода.

4.4. Таксономия родов Blaotobactor И Xanthobaoter•. Да сих пор остается неопределенным таксономическое положение бактерий, автотрофно использующих восстсновленныо Ct -субстраты п ОТНОСОННЫХ К родам Blaetcbacter И Xantiiobacter. КмОШЩеСЯ В

мт-рвгурв данные указывают на большую гетерогенность первого рода.

; В проведенном нами исследовании мы попытались выяснить систематическое положение указанных родов и проверить высказанное предположение. На приведенном на рис.7 филогенетическом дереве

Рис.7. Филогенетическое дерево, выявляющее гетерогенность рода

, BlaвtoЬactвт^.

видно, что отдельные виды рода В1ов1оьоо1»г относятся к различным кластерам. Кроме того, два вида этого рода оказались эволющгснно очень близки с хапгьаъасьег аиюггорЫсив. Сравнение морфологических и физиологических свойств этих видов показало, что основным отличием этих видов является способ деления. Однако их объединяет ряд таких особенностей, как способность к автотрофии'и метилотро-фяи, отсутствующая у видов в. сарви1аЫа п В. а&агвваЬ\хв. РаНвО было показано филогенетическое родство почкующихся и Ношчхупцихся бактерия па примере рзвилолюпав ыз и на я комплекса ям^омит-ддгаЬаагеПиа. Тек что мовно предположить, что в данной случае

этот признак также не обладает большим таксоюмическЕЫ весом.

Еще один вид рода вгавгаьаогег оказался филогенетически близким к яигоъасЬвг т1поега&вы1, однако в данном случае величина взаимных мутационных расстояний выше межвидового уровня, что указывает на принадлежность данных микроорганизмов к близким, но разным родам. Сравнение нуклеотидных последовательностей в. сарви-1аЫв и в. аевгееаЫв с банком данных выявило отдаленное филогенетическое родство первого вида с представителями таких родов как днодоьсы^вг и соигоЪасгег, относящихся к а-3 подгруппе прогеобак-терий; в. авягееаши оказался болев близким к фотобактериям -представителям 7-подгруппы.

Таким образом, проведенный анализ выявил большую филогенетическую дивергенцию рода вгавюьамег, позволив отнести виды данного рода к четырем различным грушам бактерий, и установил генетическое родство между ХотьоЪасгег аиЮггорМсиа и двумя видами Олзстобактерий. Остается открытым вопрос, какой же из видов действительно должен быть отнесен к указанному роду?

4.5. Эволюционные аспекты метилотрофщ.

Проведенный филогенетический анализ показал, что группа мэтн-ж>тро$ше бактерий в целом является крайне гетерогенной, представители коталотрофов встречаются в большинстве основных филогенетических линий эубактерий. Следовательно придание признаку метилот-рэфии высокого таксономического веса п выделение на этой основе единого естественно таксона высокого ранга нам кажется необоснованным.

Выявленная филогенетическая гетерогенность группы моталотро-фов в совокупности с существованием различных путей утилизации С, -соединений в отдельных филогенетических линиях аубактерий скорее Есегс свидетельствует о поляфшштичном происховдении признака

метилотрофии, т.е. его возникновении в эволюции более одного раза. В процессе дальнейшей эволюции в отдельннх Знлогенетических линиях могла происходить независимая потеря этой способности, на что указывает эволюционное родство ряда метилотрофных и неметилотрофных видов, свидетельствующее ой их недавней дивергенции.

Го, что метилогрофше микроорганизмы оказались представленными в трех основных подклассах протеобактерий, объединивших многие физиологические типы эубвктерий, по-видимому, ставит свойство ме-тнлотрофии в один ряд с автотрсфяэй п гетеротрофией, возможно как переходный тип метаболизма.

Естественно, что для окончательных выводов нашего исследования недостаточно, и сама задача восстановления филогении организмов на основе последовательностей биополимеров предполагает использование как фэнотаютескпх, так и других гепотипических метод-дев, и потому полученные нами результаты следует рассматривать как предварительные. Однако и в таком относительном виде получаемая информация является полезпой, позволяя правильнее подходить к систематизации микроорганизмов ,п рационально строить стратегию исследования свойств и использования микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

.1. Проведенный филогенетический анализ группы метанотрофянх бактерий подтвердил в основном схему, предлогепяую Виттенбари, п выявил высокий уровень генетической дивергенции моаду кэтанотрофами 1 и И групп, что позволяет отнести их к резким семействам.

2. Изучение филогении облигатньх в ограшпонно-факулътатнвпнх кетплотрофнах бактерий выявило генетическую обособленность данной группы макроорганизмов. Сопоставление полученных результатов с хемотяксоношпескими данными позволило определить таксономический

статус целого ряда бактерий этой группы, ошибочно отнесенных ранее

К родам Peeudcmionae. Protamtnobacter. Kethylomonas. Hethanomonae Й Bacterium.

3. Применение анализа нуклеотидных последовательностей 5s рРКЕС ПОЗВОЛИЛО УТОЧНИТЬ родовую принадлекность Рвэийстопав ер. шт. РР и идентифицировать штаммы КИ-4 и одного из членов микробной популяции из биореактора, продемонстрировав тем самым эффективность данного метода для идентификации микроорганизмов как в чистой культуре, так и для популяционного анализа.

4. Проведенное филогенетическоа исследование рода Acetobacter подтвердило правомочность. выделения метилотрофных сидов данного рода в новый род Acidcmanae, причем в данном случае анализ сравнения 5S рРНК оказался единственным генотишлеским способом, дафференцируюсш рода семейства Acetobacteraceae.

5. Применение анализа сравнения последовательностей 5S рРНК позволило определить таксономический статус таких микроорганизмов, как РевиЛзиктлв MS И ЫА, Xanthobacter autotroph(cue И рода «»thvioniorobitm, в также установить высокую гетерогенность рода Biaetobaoter, позволяющую отнести включенные в данный род вида к различным семействам. Обнаруженная корреляция полученных результатов с данными фено- и хемотаксонсмичесюп анализов подтверждает обоснованность сделанных филогенетических заключений.

6. Исследование филогения метилотрофных бактерий в целом обнаружило принадлежность отдельных групп этих микроорганизмов к разным лшкж эволюции, что указывает на полифилетическоз происхождение признака мэтклотрофшг.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации. 1. Еулигина E.G., Чумаков К.М., Нетрусов А. И. Определение нуклеотидных последовательностей 5S рибосомных РНК ряда метилотрофных

бактерий. В сб. докладов конференции молодых ученых "Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов", 1986, Киев, Наукова думка, стр. 11-16.

2. Булыгина Е.С., Гальчеяко В.Ф., Говорухина Н.И., Нетрусов А.И., Никитин Д.И., Романовская В.А., Троценко Ю.А., Чумаков К.М. Классификация метилотрофных бактерий на основе секвенирования 55 рибо-сомных РНК. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, 4, стр. 18-24.

3. Булыгина Е.С., Нетрусов А.И., Чумаков К.М. Изучение таксономии кетилотрофных бактерий путем сравнения нукпеотидных последовательностей 5S рибосомннх РНК. Эволюция и систематика прокариот: Тр. 1 Всесоюз, школы-конф. мол. ученых, Пущино, 1990. Деп. ВИНИТИ 21-01-90, стр. 2-8.

4. Bulygina E.S., Govorukhina Я.1., Hstrusov A.I., Trotsenko У.А., Chumakov К.И. Studies on 53 RHA sequences ot RuMP-type obligate and restricted facultative methylotrophio baoteria. Abetr. 6th Int. Syrap. "Miorobial growft on C,-compounds", Gottingen, 1989, P103.

5. Bulygina B.S., Galohenkc Y.I1., Gororukhim H.I., Netrusov A.I., Illicit in O.I., Troteenko Yu.A., Chumakov Х.Ы. Taxonomio studies on raethylotrophio baoteria by 5Б riboeomal HHA eequenoing. J. Oen. Hiorobiol., 1990, 136, 441-446.

6. Bulygina B.S., Ocvrorukhixia M.I., NetniBOv A.I., Troteenko Y.A., Chumakor X.M. Comparative etudies on 5S RHA sequences and ША-ША homologies of obligate and restricted facultative methylotrophio baoteria. Systematic and applied microbiology (в печати).

7. Bulygina S.S., Oulikora O.K., DiJcanskaya B.U., Uetruaov A.I., Гигота Т.P., Chuma&ov K.lt. Taxonomio studies cf the genera Ao0tobaet»r by 53 riboBOffial RNA eequenoing. J. Oen. Hlorobiol. (B

печати).