Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и секвенирование кДНК рибосомных белков S13, S26, Lii, L19 и L30 человека. Картирование генов рибосомных белков S17, S26, L19 и L32 на хромосомах человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и секвенирование кДНК рибосомных белков S13, S26, Lii, L19 и L30 человека. Картирование генов рибосомных белков S17, S26, L19 и L32 на хромосомах человека"

р V ь Oft

О Ц М1Р Российская Академия наук

Сибирское отделение НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи УДК 577.212.3;.577.217.343'112

ФИЛИПЕНКО МАКСИМ ЛЕОНИДОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ кДНК РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ S13, S26, Lll, L19 И L30 ЧЕЛОВЕКА. КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ S17, S26, L19 И L32 НА ХРОМОСОМАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск,1995 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители -, доктор химических наук,

профессор Карпова Г.Г. - кандидат биологических наук Муравлев А.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.К.Янковский

доктор биологических наук С.В.Нетесов

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Защита состоится

1995 года в ".

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

О.С.Федорова

^12§льность_проблемы. Рибосома как главный компонент аппарата трансляции, является единственной консервативной органеллой эукариотических и прокариотических клеток. Рибосомы животных, растений и микроорганизмов несмотря на имеющиеся различия в количестве и первичных структурах, входящих в их состав молекул белков и РНК, устроены, в общем, по единому плану. Все рибосомы состоят из двух субчастиц - большой и малой, обязательными компонентами которых являются белки и РНК, и имеют сходно организованные активные центры. Прогресс в понимании молекулярных механизмов функционирования рибосом невозможен без знания принципов генетического контроля компонентов аппарата трансляции. В последнее время пристальное внимание исследователей в этой области направлено на изучение структурной организации генов ри-босомных белков и регуляции их экспрессии, а также на исследование функций рибосомных белков как в составе рибосомы, так и вне ее. К настоящему времени показано, что несмотря на значительную консервативность аминокислотных последовательностей рибосомных белков разных организмов, организация их генов может иметь значительные отличия (Mager, 1983; Maki et al, 1989). Наиболее полно исследованы гены рибосомных белков бактерий (в основном Escherihia coli), и в значительно меньшей степени изучены гены рибосомных белков животных и растений.

Клонирование и картирование генов рибосомных белков человека имеет значение для биомедицинских исследований. Ранее считалось, что мутации, затрагивающие гены рибосомных белков, являются летальными для организма и поэтому не имеют связи с наследственными заболеваниями. Однако недавние исследования показали, что мутации в генах рибосомных белков могут вести к целому ряду мутантных фенотипов (Fisher et al, 1990; Stewart, Denell, 1993; Wilson et al, 1993). При этом предполагается, что рибосомные белки требуются не только для выполнения структурных рибосомных функций, но могут играть регуляторяую роль, выполнять ряд стресс-специфических функций, а также участвовать в процессе развития клетки.

Таким образом, структурный анализ генов рибосомных белков человека является в настоящее время весьма перспективной областью исследований, имеющей как фундаментальное, так и биомедицинское значение.

Целью настоящей работы было: I) клонирование и

секвенирование кДНК рибосомных белков S13, S26, 111, L19 и L30 человека; 2) разработка методов картирования функциональных генов рибосомных белков на хромосомах человека; 3) картирование генов рибосомных белков S17. S26, 119 и L32 на хромосомах человека.

Цэдчшш.ноышна. впервые проведено клонирование кДНК рибосомных белков S13, S26. L11 и ъзо человека. Установлена полная первичная структура клонированных кДНК, проведен сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями кДНК соответствующих рибосомных белков крысы. Показано, что секвенированные участки кДНК рибосомных белков S13, S26. Ы1, L19 и L30 человека имеют высокую степень гомологии с кДНК соответствующих рибосомных белков крысы (87%, 88%, 88%, 91% и 92%, соответственно). Впервые осуществлена локализация интрон-содержащих генов рибосомных белков S17, S26, 119 и L32 на хромосомах человека.

Пр^тическая_ценность_работы. Предложен новый способ картирования транскрипционно активных генов рибосомных белков на хромосомах человека, основанный на детекции экспрессии мРНК рибосом-ного белка человека в гибриднчх клетках грызун-человек, несущих разные хромосомы человека. Метод может быть использован для картирования других конститутивных функциональных генов в присутствии их множественных псевдогенов. Получены молекулярные маркеры (sts) для генов рибосомных белков S17, S26, Ы9 и L32. Данные маркеры могут быть использованы для построения генетических карт и, в частности, для выявления сцепления этих маркеров с ранее картированными генами, кодирующими наследственные заболевания человека. Создан уникальный набор молекулярных зондов для генов рибосомных белков человека (20 зондов для генов 13 рибосомных белков), которые могут быть использованы для изучения структурно-функциональной организации генов рибосомных белков человека и механизмов регуляции их экспрессии. Апробация_работы. Результаты работы докладывались на конференциях "Human Genome Diversity" (Италия, 1992), "Геном человека-93" (Черноголовка, 1993), "Геном человека-94" (Черноголовка, 1994), Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура_работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и' спис-

ка цитируемой литературы из 170 наименований и содержит 0 таблиц и 28 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Таблица I

Структуры использованных олигонуклеотидных праймеров

Праймер Нуклеотидная Позиция Ссылка на нуклеотид-

последовательность ную последовательность

праймера гена

р19а - GCTGCGTCTGCAGCCATG (13-31)

p19b - GACACGAGGGACGCTTCA ■ (617-635)

рЗОа - ACCTAAGGCaGGAAGATG (162-180)

рЗОЬ - ITGGAAAACTTICTTGATTA (2670-2690)

р1За - CCAGACCICCGCCAICATG p13b - GTGTACGCAACAGCAITTA р19-1 - ACAGCCAATGCCCGAATGC р19-2 - CTTCAGCTTGTGGATGTGTT P19-3 - GCCCGCAAGAAGCTCCTG Р19-4 - GAGGCGCTCTTCACGGCG р26-1 - CTCTCCGGTCCGTCCGTGCC р26-2 - GAATAGGCTGCACGTGGC Р26-3 - GGCGCAGTTCGTGCAGCGTT Р26-4 - CTAACTGTGCCCGATGCGT Р26-5 - GACGCTCGCTTCAGAAATG М357 - AGCAAAGTAGTCAGGAATCGA М347 - CTAACTGTGCCCGAIGCGIGC М355 - TAGCTTCACATACAGCTTGGG р32а - CGATATGTGAAAATTAAGGT p32b - GGGTTTCCGCCAGTTTCGCT р32с - GGGITAGCGTCTGTGCAGA Mill - ATGGCGCAGGATCAAGGT MI12 - GATCAAGGTGAAAAGGAG М246 - TAAAACGACGGCCAGTGCGGCCGC(T)

M228 - TAAAACGACGGCCAGTG M345 - GCCAGTGCGGCCGCTTTT M247 - TGCTTC'fTGTTGGCAGCTCGAG(C)

M346 - TGCTTCTTGTIGGCAGCTCGA p14a - AACCATCTGCCGTGTGACTG p14B - TTCCIGCGAGTGCTGTCAGA pi 7a - ITGATCTTTTACCAAGGACC p17B - CCGTTGTCCCAGATTTATTG p17C - GTGCATTGAGTTAGTTCGCC p17d - CACCCAAGTATGCAAAAGGAC p1-s26- CGAGTCTTGGCTCCAATATG p2-s26- TGAAATCACCTCTTTA

(8-27)

(482-501)

(231-250),

(401-420),

(430-447),

(495-513),

(2-21 ),

(69-86),

(85-104),

(94-112),

(179-197),

(264-285)

(94-115)

(215-236)

(1275-1295)

(1938-1958)

(4-22) (12-30)

15

15

(185-205) (452-472) (1-21 ) (458-478) (2310-2330) (2606-26260 (9-27) (371-389)

(Chan et al., 1987) (Chan et al., 1987) tWiedermarm, Perry,

1984) (Wiedemann, Perry. 1984)

(Suzuki et al., 1990) (Suzuki et al., 1990)

(Dudov, Perry, 1984) (Dudov, Perry, 1984)

(Bhat, unpublished) (Bhat, unpublished)

(Ehoads et al., 1986) (Rhoads et al., 1986) (Chen et al., 1986) (Chen et al., 1986) (Chen, Eoufa, 1988) (Chen. Eoufa, 1988) (Kuwano et al., 1985) (Kuwano et al., 1985)

I. Клонирование и секвенирование кДНК рибосомных белков S26, L11, Ы9. S13. и ЬЗО человека

Исследования структурной организации гена, его экспрессии, а также определение его локализации на хромосомах возможны только при наличии специфического молекулярного зонда. К моменту начала настоящей работы была накоплена значительная информация о структурах кДНК рибосомных белков крысы. Однако, как гены, так и мРНК рибосомных белков человека были исследованы в значительно меньшей степени. Поэтому была предпринята попытка клонировать и секвенировать несколько кДНК рибосомных белков человека. Известна высокая консервативность структур мРНК рибосомных белков у млекопитающих (Wittman-liebold et al., 1990). Учитывая этот факт, предполагалось использовать известные нук-леотидные структуры кДНК крысы для приготовления олигонуклео-тидных праймеров, которые можно использовать для амплификации кодирующей части кДНК одноименного рибосомного бежа из суммарной кДНК человека.

Этот подход был опробован наш на примере клонирования кДНК рибосомного белка S26 человека. Белок S26 представляет интерес с точки зрения функциональной топографии рибосомы, так как входит в состав мРНК-связывапцего центра рибосом из печени крысы (Stahl, Karpova, 1985) и плаценты человека (Malygin et al., 1994).

Б результате анализа известной первичной структуры мРНК крысиного рибосомного белка S26 (Кшгапо et al., 1985) были выбраны и синтезированы два дезоксирибоолигонуклеотида, которые использовались в качестве праймеров для амплификации: P1-S26 и P2-S26. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали одноцепочечную кДНК, синтезированную при помощи АЫУ-ревертазы на плацентарной ро1у(А)-мРНК с затравки Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в полиакрила-мидном геле с последующей визуализацией ДНК бромистым этидием. Фрагмент ожидаемого размера (378 п.н.) выделяли из геля и лиги-ровали с плазмидой рТ219КЛ2, линеаризованной эндонуклеазой Smal. Нуклеотидная последовательность вставок из четырех независимых клонов была определена методом Сэнгера. Все четыре структуры оказались полностью идентичными.

Для получения более полной информации о 5'-UTR и 3'-UTR мРНК рибосомного белка S26 была проведена так называемая

"заякориващая" амплификация. Для синтеза кДНК был использован специальный праймер М246, содержащий на 3' конце олиго(йТ)-тракт, а на 5' конце- последовательность MI3 универсального праймера. К полученной одноцепочечной кДНК с помощью терминальной трансферазы достраивали олиго( dO-тракт на 3' конце. Синтез второй цепи осуществляли Taq-полимеразой, используя в качестве затравки праймер М247, содержащий на 3' конце олиго(ас)-тракт, а на 5' конце- последовательность праймера М346. Для амплификации 5'-UTE мРНК использовали кДНК-ЕРБ2б-специфичный праймер М355 и неспецифичный 5'-кДНК-"гнездовой" праймер М34б. Соответственно, для амплификации З'-UTB мРНК брали KflHK-EPS26- специфичный праймер М357 и неспецифичный 3'кДНК-"гнездовой" MI3 универсальный праймер М228. В качестве матрицы использовали предварительно синтезированную двухцепочечную кДНК. Продукты амплификации размером около 280 п.н. (З'-UTR) и 260 п.н. (5'-UTK) были клонированы и секвенированы. Полная структура мРНК рибосомного белка S26, а также его аминокислотная последовательность (выведенная из структуры кДНК) приведены на рисЛА.

Результаты блот-гибридизации с EcoRI- и Pvull- гидролиза-тами плацентарной человеческой геномной ДНК с использованием полученного фрагмента кДНК (размером 378 п.н.) в качестве молекулярного зонда позволяют предположить наличие нескольких копий гена рибосомного бежа S26 е гено'ме человека. Это согласуется с имеющимися литературными данными о наличии в геноме млекопитающих множественных псевдогенов рибосомных белков (Wiedemann, Perry, 1984).

Сходная схема была использована для клонирования кодирующих областей мРНК рибосомных белкой человека S13, 119, L30. На основе известных нуклеотидных структур мРНК крысы и мышы (Suzuki et al., 1990; Chan et al., 1987; Wiedermann, Perry, 1984) были приготовлены праймеры и была проведена амплификация кДНК соответствующих белков человека. Полученные кДНК были клонированы в плазмидном векторе и секвенированы.

Кроме того, в данной работе было проведено клонирование и секвенирование полноразмерной кДНК рибосомного белка ыi человека, для которой ранее, при сиквенсе случайных клонов из библиотеки кДНК человека, была установлена нуклеотидная последовательность ее 5'-конца (H.Bhat, 1993, регистрационный номер в

ЕМВЪ банке нуклеотидных последовательностей L05092). При клонировании кДНК RPL11 мы также использовали "заякоривающую" поли-меразную цепную реакцию. В качестве матрицы для ПЦР брали одно-цепочечную кДНК, синтезированную на суммарной плацентарной поли(А) -мРНК с праймера М246. В результате анализа известной первичной структуры 5'-области мРНК рибосомного бежа L11 человека были выбраны два частично перекрывающихся дезоксирибооли-гонуклеотида MIII и MII2, которые использовали в качестве 5'-концевых праймеров при амплификации кДНК KPL11. В качестве 3'-концевых праймеров для амплификации использовали пару частично перекрывающихся олигонуклеотидов, комплементарных олиго(<1Т)-содержащему праймеру ("гнездовые" праймеры М228 и М345). Для повышения специфичности амплификации кДНК RPL11 ПЦР проводили в две стадии. На первой стадии использовали праймеры MIII и М228 и суммарную кДНК в качестве матрицы. На втором этапе полученные продукты ПЦР повторно амплифицировали с "внутренней" пары праймеров MII2 и М345. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле. Фрагмент ожидаемого размера (около 600 п.о.) выделяли из геля и клонировали в плаз-мидом векторе. Нуклеотидная последовательность вставок из четырех независимых клонов была определена методом Максама-Гилберта. В результате была установлена нуклеотидная структура кДНК RPL11 длинной 546 п.н., начиная с положения 28 до поли(А)-тракта.

Нуклеотидные последовательности клонированных кДНК рибосомных белков Ы9 (585 п.н.), ьзо (368 п.н.), S13 (456 п.н.) и LII (546 п.н.), а также первичные структуры этих белков приведены на рис.1Б,В,Г,Д, соответственно.

Рис.1. Первичные структуры рибосомного белков S26 (А), Ы9 (Б), ЬЗО (В), S13 (Г) и Ы1 (Д) человека, выведенные из нуклеотидных последовательностей клонированных кДНК. *** - стоп-кодон

1 Met îhr lys Lys Arg Arg Asn 7

1 TCT CCG GTC CGT GCC TCC AAG ATG ACA AAG AAA AGA AGG AAC 42

8 Asn Gly Arg Ala Lys Lys Gly Arg Gly His Val Gin Pro Ile 21 43 AAT GGT CGT GCC AAA AAG GGC CGC GGC CAC GTG CAG CCI ATT 84

21 Arg Cys Thr Asn Суз Ala Arg Oys Yal Pro Lys Asp Lys Ala 35 85 CGC TGC ACT AAC IGT GCC CGA TGC GTG CCC AAG GAC AAG GCC 126

36 Ile Lys Lys Phe Yal lie Arg Asn lie Yal Glu Ala Ala Ala 49 127 ATT AAG AAA TTC GTC ATT CGG AAC ATA GTG GAG GCC GCA GCA 168

50 " al Arg Asp Ile Ser Glu Ala Ser Yal Phe Asp Ala Туг Val 63 169 GTC AGG GAC ATT TCT GAA GCG AGC GTC TTC GAT GCC TAT GTG 210

64 Leu Pro Lys Leu Tyr Yal Lys Leu His Туг Cys Yal Ser Cys 77 211 CTT CCC AAG CTG TAT GTG AAG СТА CAT TAC TGT GTG AGT TGT 252

78 Yal lie His Ser Lys Yal Yal Arg Asn Arg Ser Arg Glu Ala 91

253 GTA ATT CAC AGC AAA GTA GTC AGG AAT CGA TCT CGT GAA GCC 294

92 295 Arg CGC Lys AAG Asp GAC Arg CGA Thr АСА Pro CCC Pro CCA Pro CCC Arg CGA Phe TTT Arg AGA Pro CCT Ala GCG Gly GGT 105 336

106 337 Ala GCT Ala GCC Pro CCA Pro CCT Pro CCC Pro CCA Pro Lys CCA AAG Pro : CCC Met ATG *•* TAA GGA GCT GAG 378

379 TTC TTG AAG ACT GAA GAC AGG СТА TTC CCT GGA GAA AAA TAA 420

421 AAC GGA AAT TGT ACT 435 Б

1 1 Met ATG Ser AGT Met ATG Leu CTC Arg AGG Leu CTT Gin CAG Lys AAG Arg AGG Leu CTC Ala GCC Ser TCT Ser AGT Yal GTC 14 42

15 43 Leu CTC Arg CGC Cys TGT Gly GGC Lys AAG Lys AAG Lys AAG Yal GTC Trp TGG Leu TTA Asp GAC Pro CCC Asn AAT Glu GAG 28 84

29 85 Thr ACC Asn AAT Glu GAA Ile АТС Ala GCC Asn AAT Ala GCC Asn AAC Ser ТСС Arg CGT Gin CAG Gin CAG Ile АТС Arg CGG 42 126

43 127 Lys AAG Leu CTC Ile АТС Lys AAA Asp GAT Gly GGG Leu CTG Ile АТС Ile АТС Arg CGC Lys AAG Pro CCT Yal GTG Thr ACG 56 168

57 Yal His Ser Arg Ala Arg Cys Arg Lys Asn Thr Leu Ala Arg 70

169 GTC CAT ТСС CGG GCT CGA TGC CGG AAA AAC ACC TTG GCC CGC 210

71 211 Arg CGG Lys AAG Gly GGC Arg AGG His CAC Met ATG Gly GGC Ile ATA Gly GGT Lys AAG Arg CGG Lys AAG Gly GGT Thr АСА 84 252

85 253 Ala GCC Asn AAT Ala GCC Arg CGA Met ATG Pro CCA Glu GAG Lys AAG Yal GTC Thr АСА Trp TGG Met ATG Arg AGG Arg AGA 98 294

99 295 Met ATG Arg AGG Ile ATT Leu TTG Arg CGC Arg CGG Leu CTG Leu CTC Arg Arg AGA AGA Tyr TAC Arg CGT Glu GAA Ser TCT 112 336

113 337 Lys AAG Lys AAG Ile АТС Asp GAT Arg CGC His CAC Met ATG Tyr TAT His CAC Ser AGC Leu CTG Tyr TAC Leu CTG Lys AAG 126 378

ro Yal GTG Lys AAG Gly GGG Asn AAT Yal GTG Phe TTC Lys AAA Asn AAC Lys AAG Arg CGG Ile ATT Leu CTC Met ATG Glu GAA 140 420

141 421 His CAC Ile АТС His CAC Lys AAG Leu CTG Lys AAG Ala GCA Asp GAC Lys AAG Ala GCC Arg CGC Lys AAG Lys AAG Leu CTC 154 462

155 463 Leu CTG Ala GCT Asp GAC Gin CAG Ala GCT Glu GAG Ala GCC Arg CGC Arg AGG Ser TCT Lys AAG Thr ACC Lys AAG Glu GAA 168 504

169 505 Ala Arg GCA CGC Lys AAG Arg CGC Arg CGT Glu GAA Glu GAG Arg CGC Leu CTC Gin CAG Ala GCC Lys AAG Lys AAG Glu GAG 182 546

183 547 Glu GAG Ile АТС Ile АТС Lys AAG Thr ACT Leu TTA Ser TCC Lys AAG Glu GAG Glu GAA Glu GAG Thr ACC Lys AAG Lys AAA 196 588

197 *»♦

589 TAA

В

1 Met Val Ala Ala Lys Lys Ihr Lys Lys Ser Leu Glu Ser Ile 14'

1 ATG GTG GCT GCA AAG AAG ACG AAA AAG TCG CTG GAG TCG АТС 42

15 Asn Туг Arg Leu Gin Leu Val Met Lys Ser Gly Lys Туг Val 28

43 AAC TAT AGG CTC CAA CTC GTT ATG AAA AGT GGG AAG TAC GTC 84

29 Leu Gly Туг Lys Gin Thr Leu Lys Met Ile Arg Gin Gly Lys 42

85 CTG GGG TAC AAG CAG ACT CTG AAG ATG АТС AGA CAA GGC AAA 126

43 Ala Lys Leu Val Ile Leu Ala Asn Asn Суз Pro Ala Leu Arg 56 127 GCG AAA TTG GTC ATT CTC GCT AAC A¿C TGC CCA GCT TTG AGG 168

57 Lys Ser Glu Ile Glu Туг Туг Ala Met Leu Ala Lys Thr Gly 70 169 AAA ICT GAA ATA GAG TAC TAT GCT ATG TTG GCT AAA ACT GGT 210

71 Val His His Туг Ser Gly Asn Asn Ile Glu Leu Gly Thr Ala 84 211 GTC CAT CAC TAC AGT GGC AAI AAT ATT GAA CTG GGC ACA GCA 252

85 Cys Gly Lys Туг Туг Arg Val Cys Thr Leu Ala Ile Ile Asp 98 '253 TGC GGA AAA TAC TAC AGA GTG TGC АСА CTG GCT АТС ATT GAT 294

99 Pro Gly Asp Ser Asp Ile Ile Arg Ser Met Pro Glu Gin Thr 112 295 CCA GGT GAC TCT GAC АТС ATT AGA AGC ATG CCA GAA CAG ACT 336

113 Gly Glu Lys ♦*•

337 GGT GAG AAG TAA АСА AGA AAG TTC TCC TTI AA 363

Г

1 Met Gly Arg Met His Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ser Gin Ser 14

1 ATG GGT CGC ATG CAT GCT CCC GGG AAG GGC CTG TCC CAG TCG 42

15 Ala Leu Pro Туг Arg Arg Ser Val Pro Thr Trp Leu Lys Leu 28

43 GCT TTA CCC TAT CGA CGC AGC GTC CCC ACT TGG TTG AAG TTG 84

29 Thr Ser Asp Asp Val Lys Glu Gin Ile Туг ra £ Leu Ala Lys 42

85 АСА TCT GAC GAC GTG AAG GAG CAG ATT TAC AAA CTG GCC AAG 126

43 Lys Gly Leu Thr Pro Ser Gin Ile Gly Yal Ile Leu Arg Asp 56 127 AAG GGC CTT ACT CCT TCA CAG АТС GGT GTA АТС CTG AGA GAT 168

57 Ser His Gly Val Ala Gin Val Arg Phe Val Thr Gly Asn Lys 70 169 TCA CAT GGT GTT GCA CAA GTA CGT TTT GTG ACA GGb AAT AAA 210

71 Ile Leu Arg Ile Leu Lys Ser Lys Gly Leu Ala Pro Asp Leu 84 211 ATT TTA AGA ATT CTT AAG TCT AAG GGA CTT GCT CCT GAT CTT 252

85 Pro Glu Asp Leu Туг His Leu Ile Lys Lys Ala Val Ala Val 98 253 CCT GAA GAT CTC TAC CAT TTA ATT AAG AAA GCA GTT GCT GTT 294

99 Arg Lys His Leu Glu Arg Asn Arg Lys Asp Lys Asp Ala Lys 112 295 AGA AAG CAT CTT GAG AGG AAC AGA AAG GAT AAG GAT GCT AAA 336

113 Phe Arg Leu Ile Leu Ile Glu Ser Arg Ile His Arg Leu Ala 126 337 TTC CGT CTG ATT СТА ATA GAG AGC CGG ATT CAC CGT TTG GCT 378

127 Arg Туг Туг Lys Thr Lys Arg Val Leu Pro Pro Asn Trp Lys 140 379 CGA TAT TAT AAG ACC AAG CGA GTC CTC CCT CCG AAT TGG AAA 420

141 Туг Glu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Val Ala ♦«* 421 TAT GAA TCA TCT ACA GCC TCT GCC CTG GTC GCA TAA 456

Д

1 Met Ala Gin Asp Gin Gly Glu Lys Glu Asn Pro Met Arg Glu 14 1 ATG GCG CAG GAT CAA GGT' GAA AAG GAG AAC CCC ATG CGG GAA 42

15 Lea Arg Ile Arg Lys Leu Cys Leu Asn Ile Cys Val Gly Glu 28 43 CTT CGC АТС CGC AAA CTC TGT CTC AAC АТС TGT GTT GGG GAG 84

29 Ser Gly Gly Arg Leu Thr Arg Ala Ala Lys Val Leu Glu Gin 42 85 AGT GGA GGC AGA CTG ACG CGA GCA GCC AAG GTG TTG GAG CAG 126

43 Leu Thr Gly Gin Thr Pro Val Phe Ser Lys Ala Arg Туг Thr 56 127 CTC АСА GGG CAG ACC CCT GTG TTT TCC AAA GCT AGA TAC ACT 168

57 Val Arg Ser Phe Gly Ile Arg Arg Asn Glu Lys Ile Ala Val 70 169 GTC AGA TCC TTT GGC АТС CGG AGA AAT GAA AAG ATT GCT GTC 210

71 His Cys Ala Val Arg Gly Ala Lys Ala Glu Glu Ile Leu Glu 84 211 CAC TGC GCA GTT CGA GGG GCC AAG GCA GAA GAA АТС TTG GAG 252

85 Lys Gly Leu Lys Val Arg Glu Leu Glu Leu Arg Lys Asn Asn 98 253 AAG GGT СТА AAG GTG CGG GAG TTG GAG TTA AGA AAA AAC AAC 294

99 Phe Ser Asp Thr Gly Asn Phe Gly Phe Gly Ile Gin Glu His 112 295 TTC TCA GAT ACT GGA AAC TTT GGT TTT GGG АТС CAG GAA CAC 336

113 Ile Asp Leu Gly Ile Glu Туг Asp Pro Ser Ile Gly Ile Туг 126 337 ATT GAT CTG GGT АТС GAA TAT GAC CCA AGC ATT GGT АТС TAC 378

127 Gly Leu Asp Phe Туг Val Val Leu Gly Arg Pro Gly Phe Ser 140 379 GGC CTG GAC TTC yAT GTG GTG CTG GGT AGG CCA GGT TTC AGC 420

141 421 Не АТС Ala GCA Asp GAC bys AAG bys AAG Arg Arg CGC AGO Thr АСА Gly GGC Cys TGC He ATT Gly Ala GGG GCC Lys AAA 154 462

155 463 His САС Arg AGA lie АТС Ser AGC Lys AAA Glu GAG Glu GAG Ala GCC Met ATG Arg CGC Trp TGG Phe TTC Gin CAG Gin CAG 168 504

169 505 lys AAG Туг TAT Asp GAT Gly GGG lie АТС lie АТС Leu CTT Pro CCT Gly Lys GGC AAA **• TAA ATT CCC GTT 546

547 ТСС АТС CAA AAG AGC AAT AAA AAG TTT TCA GTG AAA TGT GCA 588

589 AAA

Сравнительный анализ показал, что секвенированные участки кДНК рибосомных белков S13, S26, L11, L19 и L30 человека имеют высокую степень гомологии с кДНК соответствующих рибосомных белков крысы (87%, 83$, 88$, 90.9$ и 93.8$, соответственно). Замены аминокислотных остатков обнаружены: для RPS26 в позиции 38 (Ser->Vai); для L11 - в позициях 91 (Asp->Gly), 217 (Thr->А1а), 352 (bys->Glu) И ДЛЯ RFL30 в ПОЗИЦИИ 46 (Ser->Tyr).

2. Картирование генов рибосомных белков на хромосомах человека

В мультигенном семействе каждого рибосомного белка только один ген является транскрибируемым, остальные же представляют собой псевдогены, т.е. ревертированные копии процесси-рованной мРНК данного рибосомного белка (Wideeman, Perry, 1984). Из-за наличия в геноме млекопитающих множественных псевдогенов использование полученных первичных структур кДНК для непосредственного картирования генов рибосомных белков стандартными гибридизационными методами крайне неэффективно. В настоящей работе было проведено клонирование интронов генов рибосомных белков с помощью ПЦР с последующим использованием их для картирования.

2.1. Картирование генов рибосомных белков на хромосомах человека с использованием клонированных интронов их генов

Схема клонирования интрон-содержащих фрагментов генов рибосомных белков приведена на рис.2.

Предварительно проведенный анализ известных первичных структур генов рибосомных белков млекопитающих показал, что нуклеотидное окружение их интронов зачастую имеет следующий вид: aag-интрон-с либо (a/t)TC-hhtpoh-(g/a). Учитывая эту осо-

бенность, пары праймеров для амплификации интронов выбирали таким образом, чтобы между соответствующими последовательностями в мРНК находились ААСй или (А/ШТОСС/А). В случае удачного подбора праймеров, когда между участками геномной ДНК, комплементарными выбранным праймерам, действительно, располагался интрон, в продуктах амплификации выявлялось два фрагмента. Один, меньшего размера, соответствовал фрагменту псевдогена. Другой, большего размера, - интрон-содержащему фрагменту транскрипционно активного гена. Фрагмент большего размера клонировали по тупым концам в плазмидном векторе рТ719И«/Ы и проводили концевой анализ его первичной структуры методом Сэнгера. Полученные структуры подвергали компьютерному анализу для выявления участков, гомологичных консенсусным последовательностям акцепторного и доноркого сайтов сплайсинга. При наличии вышеуказанных последовательностей в нужной ориентации считали, что амплифицировэнный фрагмент ДНК содержит интрон гена исследуемого рибссомного белка.

ГЕН РИБОСОМНОГО БЕЛКА ПСЕВДОГЕН

ЭКЗОН 2 ЭКЗОН 3

ПР I—> <—ПР 2 | ПР I—> <— ПР 2

АМПЛИФИКАЦИЯ

шш^шт шшш

КЛОНИРОВАНИЕ И СИКВЕНС

■РС/СТНАСГ^^^...

донорный сайт

...^^штс/оия

^ акцепторный сайт

ПОИСК КОНСЕНСУСНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ САЙТОВ СПЛАЙСИНГА

Рис.2. Схема клонирования, интрон-содериащих фрагментов генов рибосомных белков в присутствии множественных псевдогенов.

2.1. Клонирование и секвенироваше интрон-содержащего фрагмента гена рибосомного белка ы 9 человека, картирование гена на хромосомах человека

На основе полученной первичной структуры кДНК еры 9 было подобрано 4 праймера: р19-1, Р19-2, р19-3. р19-4. При амплификации с праймерами р19-3/р19-4 детектировалось три основных амплифицированных фрагмента ДНК. Два фрагмента большего, размера были клонированы и секвенированы. Анализ первичной структуры фрагмента с размером около 460 п.н. показал, что на его "концах" содержатся участки последовательности кДНК ЕРЫ 9. между которыми находится фрагмент анонимной ДНК размером около 400 п.н., фланкированный последовательностями, высокогомологичными консенсусным последовательностям акцепторного и донорного сайтов сплайсинга (рис.3).

экзон донорный сайт акцепторный сайт экзон ЕРЫ 9 -------тсс4с/стелете... ... стссссссас/осюа------

консенсус АТС/стслетс ссссссысас/оз

СА А I ТТТТТТ 1 АТ

Рис.3. Сравнительный анализ концевых нуклеотидных последовательностей амплифицированного фрагмента гена ЕРЫ 9 и консенсусных последовательностей акцепторного и донорного сайтов сплайсинга.

На основе этого можно заключить, что клонированный нами фрагмент ДНК содержит интрон гена рибосомного белка 119.

Для проверки возможности использования пары праймеров р19-3/ р19-4 для картирования транскрипционно активного гена ЕРЫ 9 на хромосомах человека с применением панели ДНК из гибридных клеток человек-грызун была проведена амплификация на геномных ДНК человека, мыши и китайского хомячка с использованием этих праймеров. Было обнаружено, что соответствушие интроны белка Ы9 указанных видов имеют разные размеры. Это позволило специфично детектировать амплификацию интрон-содержащего фрагмента гена БРЫ9 человека в ДНК из гибридов человек-грызун, несущих разные наборы хромосом человека. Результаты амплификации интро-на гена ЕРЫ9 человека представлены в табл.2. Видно, что наличие амплифицируемого фрагмента гена белка Ъ19 строго связано с на-

личием в гибридных клетках хромосомы 17 человека. Это позволяет заключить, что интрон-содержащий функциональный ген ЕРЫ9 локализован на этой хромосоме.

Таблица 2

Хромосомный состав гибридных клеток картирующей панели и результаты амплификации фрагментов интронов генов РВЫ 9, ЕРБ26 и ВРЬ32 на препаратах ДНК из этой Панели. + - наличие фрагмента ожидаемого размера в амплификационной смеси

Клон Хромосомный состав Ы9 Б26 Ь32

NA09925 1,2,4,5,6,7,8,12,14,15.16,17, 18. 19, ,20. 22 + + -

NA09927 1,2,3,4,6,7,8,10,13,14,15,17, 18, 19, ,20 + - +

NA09928 2,3.5,6,8,14,15,17,19,21,22,Y + - +

NA09929 3,4,6,8,11,12,14,17,20 + + +

NA09331 5,7,10.12,14,17.20,21,Y + + -

ЫА09932 4,5,6,8,11,12,17,21 + + -

NA09933 1,3,4,5,6,7,8,12.13,14,15,17, 18, 19, ,20, 21,22,Y о. + +

NAC9934 2,5,6,8,11,12,15,17,18,20,21 + + -

NA09936 4,6,7,8,10,11,14,17,19,20,22 + - -

ЫА09937 2,4.6,7,8,12,14,15,17,18 + + -

ЫА09938 4,5,6,7,11,12,14,17,20,21,22 + + -

NA09940 3,7,8,15,17 + - +

7SM01 10.11.14,18,19,21,22.x - - -

5L27 4,11,16,20.22.Х - - -

8SM22-2 1,4,5,9,12,18,20,X - + -

6Ь05 5,8,21,Х - + -

6L04 10,13.19.Х - - -

NAIME91 Human line IME91 + + +

ЫА00347а Mouse line B-82 - - -

2.2. Клонирование и секвенирование интрон-содержащего фрагмента гена рибосомного белка Б26 человека, картирование гена на хромосомах человека

На основе нуклеотидной последовательности кДНК рибосомного белка Б2б человека нами были выбраны 5 олигонуклеотидных прай-меров для амплификации интронов данного гена р2б-1, р26-2, р26-3, р26-4, р26-5 . При анализе продуктов амплификации для двух

пар праймеров (p26-1/p26-2 и р2б-1/р2б-3) детектировалось по два основных амплифицированных фрагмента. Больший фрагмент ДНК, образующийся в случае пары р2б-1/р2б-2, был клонирован и секве-нирован. Концевой анализ вставки показал, что клонированный фрагмент, как и в случае с фрагментом гена бежа L19, содержит участки последовательности кДНК бежа S26, между которыми находится фрагмент анонимной ДНК размером 255 п.н., фланкированный последовательностями, гомологичными консенсусным последовательностям сайтов сплайсинга (рис.4).

экзон донорный сайт

консенсус ATG/GTGAGTC

СА А Т

ЭКЗОН -------AGATG/GIGAGTCTTCTTGCGTGGTGAGGGTGGGGGTICGGGIGCAGA

CTCTGGGATTGTGGGGAAGTGAGAGCCTGGAGCACGGCTGAGGGGTGGACCGAGTGTACATT

TCATTTGCTCTGGGGGTCGGCGGGATTTGCGGAGAAACAGGAGATCCGAGCGGCGCCITCCT

GGAGGCTGCCGGTGCGGCTTGTGGCCGGAAAGGGACTGAGGCTGGGTGAGTTGCGCCGTTTT

CCTAACAGTTTTCCCATCCTGCCGCAG/ACAAA------ ЭКЗОН

CCCCCCNCAG/GG ТТТТТТ Т AT

акцепторный сайт экзон

Рис.4. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента гена RPS26 и консенсусных последовательностей акцепторного'и донорного сайтов сплайсинга

Таким образом, можно заключить, что клонированный нами фрагмент ДНК содержит интрон гена рибосомного бежа S26.

Поскольку структуры праймеров р2б-1 и р2б-3 не имеют полной гомологии с последовательностями кДНК крысы и других грызунов, путем варьирования условий ПЦР нам удалось добиться специфичной амплификации интрон-содержащего фрагмента гена S26 на ДНК человека. Это позволило провести картирование транскрип-ционно активного гена S26 методом амплификации на панели ДНК из гибридов человек-грызун, несущих разные наборы хромосом человека.

Результаты амплификации интрона „гена бежа S26 человека,

представленные в табл.2, позволяют заключить, что интрон-содержэщий функциональный ген RPS26 находится на хромосоме 12.

2.3. Клонирование и секвенировакие интрон-содержащего фрагмента гена рибосомного белка L32 человека, картирование гена на хромосомах человека

Используя ранее опубликованную нуклеотидную последовательность интрон-содержащего гена рибосомного белка L32 мыши (Dudov, Perry, 1984), мы выбрали два олигонуклеотида р32а и р32Ь для амплификации интрона 2 этого гена. В продуктах амплификации на ДНК человека был обнаружен фрагмент ДНК размером около 700 п.н.. Этот фрагмент был клонирован и секвенирован. Анализ показал, что на концах амплифицированного фрагмента находятся нуклеотидные последовательности, комплементарные праймерам р32а и р32Ъ, между которыми находится фрагмент анонимной ДНК размером около 700 п.н., фланкированный последовательностями, гомологичными последовательностям сайтов сплайсинга гена L32 мыши, а также консенсусным последовательностям акцепторного и донорного сайтов сплайсинга (рис.5).

экзон донорный сайт акцепторный сайт экзон экзон RPL32

Рис.5. Сравнительный анализ концевых нуклеотидных последовательностей амплифицированного фрагмента гена ЕРЪ32 и консенсус-ных последовательностей акцепторного и донорного сайтов сплайсинга.

На основании этого можно заключить, что клонированный фрагмент ДНК является интроном гена рибосомного белка Ь32 человека. Для картирования функционального гена RPL32 на хромосомах человека на основе полученной структуры мы выбрали еще один олигонуклеотидный праймер р32с, не имеющий гомологии с интроном мыши. Это позволило специфично детектировать амплификацию интрон- содержащего фрагмента ДНК человека в ДНК из гибридов чело-

•AGAAG/GTATGTG

TTTCCCGCAG/ACAAA-

консенсус ATG/GTGAGTC СА AT

век- грызун, используя пару праймеров р32а/р32с. Результаты амплификации интрона гена белка L32 человека на панели ДНК из гибридов человек-грызун, несущих разные наборы хромосом человека, представлены в табл.2. На основании этих результатов можно заключить, что интрон-содержащий функциональный ген RPL32 находится на хромосоме 3.

2.4. Картирование транскрипционно активных генов рибосомных белков методом ПЦР на панели суммарных кДНК из гибридных клеток грызун х человек, несущих разные хромосомы человека

Известно, что гены рибосомных белков принадлежат к группе конститутивных генов (house-keeping genes) и являются высоко консервативными (Wool et al., 1990). Основываясь на этом факте, логично предположить, что синтез мРНК рибосомного белка, локализованного на хромосоме человека, не подавляется в гибридной клетке (грызун х человек), несущей эту хромосому человека. Таким образом, тестируя суммарную мРНК из моносомных гибридных клеток на наличие мРНК рибосомных белков человека, можно локализовать транскрибируемый ген. Такое тестирование может быть осуществлено методом ПЦР на панели суммарных кДНК из гибридных клеток грызун х человек, несущих разные хромосомы человека, с использованием пары праймеров к кДНК исследуемого рибосомного белка (рис.6).

Для проверки такого способа картирования нами были выбраны рибосомные белки человека S14 и S17 (RPS14 и RPS17, соответственно), гены которых уже картированы на хромосоме 5 (Nakamishi et al., 1986). Информации о функциональности гена RPS17 в отличие от RPS14 до настоящего времени не имелось. На основе известных нуклеотидных последовательностей мРНК RPS14 (Rhoads et al., 1986) человека нами была синтезирована пара праймеров: р14а, р14Ъ (для амплификации фрагмента кДНК RPS14 размером 279 п.н.). В качестве матрицы для ПЦР использовали одноцепочечную кДНК, синтезированную при помощи AMV ревертазы на суммарных РНК из гибридных клеток грызун х человек, из плаценты человека и из мышиной клеточной линии А9. Продукты амплификации с праймерами, специфичными к кДНК RPS14, подвергали гидролизу рестриктазой Apal и анализировали гель-электрофорезом. Наличие рестрикцион-ных фрагментов размером 174 и 103 п.н.(что совпадает с рестрик-ционной картой фрагмента кДНК человека) в Ара1-гидролизате

амплификанионной смеси с кДНК из гибридных клеток, несущих хромосому 5 человека, свидетельствует о присутствии мРНК и, соответственно, функционального гена рибосомного белка Б14 человека в этих клетках.

ГИБРИДНЫЕ КЛЕТКИ ГРЫЗУН-ЧЕЛОВЕК, НЕСУЩИЕ РАЗНЫЕ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА клон I клон 2 клон 3

ВЫДЕЛЕНИЕ мРНК, ПОСТРОЕНИЕ кДНК \

НР мРНК

АМПЛИФИКАЦИЯ С ИР кДНК -СПЕЦИФИЧНЫМИ ПРАИМЕРАМИ

I

ДЕТЕКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО АМШМФИЦИРОВАННОГО ФРАГМЕНТА

Рис.6. Схема картирования транскрипционно активных генов рибо-сомных белков на хромосомах человека с использованием детекции экспрессии мРНК рибосомного белка человека в гибридных клетках грызун-человек, несущих разные хромосомы человека

Таким образом, используя предложенный нами метод, мы подтвердили локализацию функционального гена ЕРБ14 на хромосоме

5 человека.

Далее этот же подход был применен нами для картирования на хромосомах человека функционального гена RPS17. Для этого были выбраны праймеры к 5'- и 3'- нетранслируемым Областям мРНК RPS17. где гомология человеческой и мышиной мРНК минимальна. В результате нам удалось добиться специфической амплификации с праймеров р17а и р17Ъ только человеческой кДНК. Продукты амплификации фрагмента кДНК RPS17 на панели кДНК из гибридных клеток, а также на суммарных человеческой и мышиной кДНК подвергали электрофоретическому анализу. Мы не наблюдали среди продуктов амплификации с кДНК из гибридных клеток, несущих хромосому 5 человека, фрагмента размером 478 п.н.. Однако, этот фрагмент появлялся в амплификационной смеси на кДНК из клеток, несущих хромосому 15 человека, и на суммарной кДНК человека. Следовательно, можно заключить, что функциональный ген RPS17 находится на хромосоме 15 человека .

Кроме того мы провели картирование гена RPS17 более традиционным методом с использованием амплификации фрагмента интрона на панели ДНК из гибридных клеток грызун х человек, несущих разные хромосомы человека. Были выбраны две пары праймеров для амплификации фрагментов интрона 4 этого гена: pl7c/pi7d, фрагмент размером 316 п.н. (2310-2626) и р17с/р17Ь, фрагмент размером 1364 п.н. (2310-3674) (Chen, Roufa, 1988). Пара праймеров p17c/pl7d была использована для амплификации на панели ДНК из гибридных клеток грызун х человек, несущих разные хромосомы человека. В полученных амплификационных смесях проверяли наличие фрагмента ДНК нужного размера. Хромосомный состав гибридных клеток, а также результаты амплификации приведены в табл.3.

Видно, что наличие амплифицируемого фрагмента наблюдается только в случае ДНК из гибридных клеток, несущих хромосому 15 человека. Таким образом, полученные данные позволяют отнести интрон-содержащий функциональный ген RPS17 к этой хромосоме.

Картирование гена RPS17, описанное в (Nakamishi et al., 1986), осуществляли методом блот-гибридизации кДНК RPS17 с гид-ролизатэми ДНК из Панели гибридных клонов, несущих хромосомы человека. Этот метод должен с большей вероятностью выявлять множественные псевдогекы рибосомных белков, являющиеся, фактически, копиями мРНК, разбросанными по разным хромосомам. Принимая во внимание отсутствие интронов у гена RPS17,

Таблица 3

Хромосомный состав гибридных клеток картирующей панели и результаты амплификации фрагмента интрона гена PPS17 на препаратах ДНК из этой панели. + - наличие фрагмента ожидаемого размера в амплификационной смеси

Клон Хромосомный состав S17

панель ДНК п1

NA09925 1,2.4,5,6,7.8,12,14,15,1-. .17,18,19,20,22

NA09927 1,2,3,4,6,7,8,10,13,14,15,17,18,19,20

NA09928 2,3,5,6,8,14,15,17,19,21,22,Y

NA09929 3,4,6,8,11,12,14,17,20

NA09931 5,7,10,12,14,17,20,21,Y

NA09932 4.5,6,8,11,12,17,21

NA09933 1,3,4,5,6,7,8,12,13,14,15,17,18,19,20,21,22,Y

NA09934 2,5,6,8,11,12,15,17,18,20,21

NA09936 4,6,7,8,10,11,14,17,19,20,22

NA09937 2,4,6,7,8,12,14,15,17,18

NA09938 4,5,6,7,11,12.14,17,20,21,22

NA09940 3,7,8,15,17

ЫА10324 X

NA10611 9

NAIME91 Human line IMR91

NA00347a Mouse line B-82

+

+

+

панель ДНК n2

7SM01 10,11,14,18,19,21,22,X

8M14 1,3,5,6,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.19,21.22.X +

6SL07-TG1 3,4,8,9,10,12,13,14,16,17,18.19,21

6L01 1,2q,4,5,6,8,9,10,11,12,13.14.15.16,18,19,20,22,X +

8SM22-2 1,4,5,9,12,18,20.x

6L05 5,8,21,X

6SL01 1,2,3,4,5,6,8,9,10.11,13,14,16.17,18,19.20,21.X -

6Ь04 10,13.19.Х

локализованного на хромосоме 5 человека, а также отсутствие транскрипции, можно сделать вывод, что на этой хромосоме ранее был локализован один из псевдогенов ЕРБ17 .

Предложенный нами методический подход, по-видимому, может быть применен для картирования других генов человека, экспрессия которых не подавляется в гибридных клетках.

Мы показали, что четыре исследованных интрон-содержащих гена рибосомных белков человека находятся на разных хромосомах. Полученные данные подтверждают предположение об отутствии кластеров генов рибосомных белков на хромосомах млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Проведено клонирование фрагментов кДНК рибосомных белков эгб (размером 440 п.н.: 5'-ШЖ - 21 п.н., кодирующая часть - 348. п.н., З'-итл - 71 п.н.), Б13 (кодирующая часть - 456 п.н.), Ы1 (размером 546 п.н.: неполная кодирующая часть - 509 п.н., З'-ита - 71 п.н.), Ъ19 (кодирующая часть - 585 п.н.), ЬЗО (размером 368 п.н.: кодирующая часть - 348 п.н., З'-ига - 20 п.н.) человека.

2. Определена первичная структура рибосомных белков человека, выведенная из нуклеотидных последовательностей соответствующих кДНК. С помощью сравнительного анализа показано, что секвенированные участки кДНК рибосомных белков 326, 313, Ы1, Ы9, ЬЗО человека имеет высокую степень гомологии с кДНК соответствующих рибосомных белков крысы (83$, 87$, 88$, 91$ и 92$, соответственно).

3. Проведено клонирование интрон-содержащего фрагмента гена рибосомного белка ггб человека размером 326 п.н.. Определена полная нуклеотидная последовательность интрона I этого гена размером 255 п.н.. Проведено клонирование и частичное секвенирование интрон-содержащих фрагментов генов рибосомных белков Ы9 и Ь32 человека.

4. С использованием панели ДНК из гибридов человек-грызун, несущих разные наборы хромосом человека, осуществлена локализация интрон-содержащих генов рибосомных белков Ы9, Б26 и Ь32 на хромосомах 17, 12 и 3 человека, соответственно.

5. Предложен новый способ картирования транскрипционно активных генов рибосомных белков на хромосомах человека. Метод основан на детекции экспрессии мРНК рибосомного бежа человека

в гибридных клетках грызун-человек, несущих разные хромосомы человека. С помощью этого метода на хромосоме 15 был локализован функциональный ген рибосомного белка S17 человека и подтверждена локализация гена рибосомного белка S14 на хромосоме 5.

6. Первичные структуры кДНК рибосомных белков S13, S26, Ы1, и ъзо, а также нуклеотидная последовательность интрона I гена рибосомного белка S26 зарегистрированы в ШВЪ банке нуклеотидных последовательностей под номерами Х77770, Х79234, Х79239, Х79238 и Х79236, соответственно. Локализация генов рибосомных белков S26, L19 и 132 на хромосомах человека зарегистрирована в Genome Data Base под номером GOO-388-547, интрон-содержащего гена рибосомного белка S17 - под номером GOO-311-036. Молекулярные маркеры (STS) для генов рибосомных белков S26, L19, L32 -и S17 человека зарегистрированы в Genome Data Base под номерами G00-388-548, GOO-388-558, G00-388-554, G00-388-551, соответственно.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Филипенко М.Л., Владимиров С.Н., Муравлев А.И., Карпова Г.Г., Мертвецов Н.П.. Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующих рибосомные белки человека S8, S13, S26 и L19; картирование генов на хромосомах человека.// Тез. докл. конференции "Геном человека - 93". - Москва.- 1993.- С.34.

2. Филипенко М.Л., Владимиров С.Н., Муравлев А.И., Карпова Г.Г., Мертвецов. Н.П.. Клонирование кДНК рибосомного бежа S26 человека и определение ее первичной структуры.// Биоорган, химия. 1994. Т.20. N.6. С.564-569.

3. Мишин В.П., Филипенко М.Л., Муравлев А.И., Карпова Г.Г., Мертвецов Н.П.. Клонирование и определение первичной структуры ДНК, комплементарной мРНК рибосомного белка L11 человека.// Биоорган, химия. 1995. Т.21. N.2. С.158-160.

4. Филипенко М.Л., Янцен Е.И., Муравлев А.И.. Копанцев Е.А, Карпова Г.Г., Мертвецов Н.П.. Картирование генов рибосомных белков S14 и S17 на хромосомах человека с использованием кДНК из панели гибридных клеток. // Биоорган, химия. 1995. Т.21. N.5. С.349-353.