Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Короткова, Наталья Анатольевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМЕНИ Г.К. СКРЯБИНА

КОРОТКОВА НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОСИНТЕЗА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА/ВАЛЕРАТА АЭРОБНЫМИ МЕТИЛОБАКТЕРИЯМИ

03.00.23 - Биотехнология

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Диссертация

Научные руководители: д.б.н., проф. Ю.А. Троценко к.б.н. Н.В. Доронина

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПБ - ацилпереносящий белок

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГХ - газовая хроматография

ДЦТ - 1,4-дитиотреитол

ДТНБ - 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислота

ДХФИФ - 2,4-дихлорфенолиндофенол

ицл" - отсутствует изоцитратлиаза

МФ - метанофуран

ОП - оптическая плотность

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГА - поли-3-гидроксиалканоаты

ПГБ - поли-3-гидроксибутират

ПГВ - поли-3-гидроксивалерат

ПГБВ - сополимер З-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата

ТГМП - тетрагидрометаноптерин

ТГФ - тетрагидрофолат

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ФЕП - фосфоенолпируват

ФМС - феназинметосульфат

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

3ГБ - 3-гидроксибутират

ЗГВ - 3-гидроксивалерат

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биосинтез бактериальных полигидроксиалканоатов

1.1. История вопроса 8

1.2. Внутриклеточная локализация ПГА 10

1.3. Пути биосинтеза ПГА у микроорганизмов 12

1.4. Деградация ПГБ 15

1.5. Биосинтез ПГА при культивировании бактерий на различных субстратах 17

1.6. Регуляция биосинтеза ПГБ 22 Глава 2. Биотехнологические аспекты синтеза биополимера

2.1. Методы анализа ПГА 25

2.2. Физико-химические свойства и сферы применения ПГА 26

2.3. Факторы, определяющие экономику производства ПГА 29

2.4. Способы культивирования различных бактерий - продуцентов ПГА 31

2.5. Перспективы производства ПГА 32

2.6. Метилотрофные бактерии как продуценты ПГБ/В 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объекты исследования и условия культивирования 37

3 2. Изучение влияния различных компонентов среды на биосинтез ПГБ 37

3.3. Биосинтез ПГБВ 37

3.4. Культивирование в ферментере 38

3.5. Анализ распределения 14С в ССЬ, ПГБ/В и клеточных компонентах 38

3.6. Динамика включения радиоуглерода 40

3.7. Ингибиторный анализ 40

3.8. Экстракция и измерение внутриклеточного содержания НАД(Ф)Н 41

3.9. Методы определение активности ферментов 42

3.10. Нативный электрофорез 47

3.11. Гель-хроматография 47

3.12. Методы количественного анализа ПГБ/В 47

3.13. Определение метаболитов в культуральной жидкости 49

3.14. Методы анализа физико-химических свойств ПГБ/В 50

3.15. Аналитические методы 50 РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 4. Новый метод анализа ПГБ/В с использованием ВЭЖХ 52 Глава 5. Биосинтез ПГБ/В метилобактериями

5.1. Отбор штаммов-продуцентов ТТГБ 57

5.2. Влияние компонентов минеральной среды на синтез ПГБ у метилобактерий 59

5.3. Биосинтез ПГБВ M.extorquens, M.helvetica и P.methylutens при культивировании

на различных соединениях 60

5.4. Подбор оптимальных концентраций пропанола и пентанола для биосинтеза ПГБВ 63

5.5. Свойства ПГБ/В: температура плавления и молекулярный вес 65

5.6. Ферменты биосинтеза и деградации ПГБ у M.extorquens и M.helvetica 66

5.7. Ферменты метаболизма пропанола и пентанола у M.extorquens, M.helvetica 67 Глава 6. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза ПГБ/В у M.extorquens

6.1 Биосинтез ПГБ/В M.extorquens при периодическом культивировании в ферментере 71

6.2. Метаболические изменения при культивировании M.extorquens на метаноле и

на смеси метанола/пентанола 73

6.3.Уровни внеклеточных метаболитов при культивировании M.extorquens на метаноле 77

Глава 7. Анализ углеродных потоков в С02, ПГБ/В и биомассу при

росте метилобактерий на различных субстратах 80

7*1. Анализ углеродных потоков при росте на метаноле, ацетате и бутирате 80

7.2. Математическая модель метаболизма метанола и ацетата 83

7.3. Влияние ингибиторов на биосинтез ПГБ и внутриклеточное содержание НАД(Ф)Н 88

7.4. Включение 14С из пропанола, пентанола, пропионата и валерата в СО2, ПГБВ и биомассу 90 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 93 ВЫВОДЫ юо СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Многие прокариоты синтезируют и запасают поли-3-гидроксибутират (ПГБ) при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфатов, кислорода или магния) в виде цитоплазматических гранул. Биополимер обладает полезными свойствами - биоразлагаемостью, биосовместимостью, термопластичностью - и поэтому имеет очевидное практическое значение для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины. Введение 3-гидроксивалерата (ЗГВ) в ПГБ существенно улучшает физико-химические свойства полимера. Сополимер 3-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата (ГТГБВ) обладает большей прочностью и эластичностью (уменьшается модуль Юнга с увеличением фракции ЗГВ в ПГБВ), чем ПГБ, и поэтому более перспективен как биоразлагаемый заменитель персистентных химических полимеров (Anderson and'Dawes, 1990).

До сих пор себестоимость ГГГБ/В служит основным препятствием широкому использованию в промышленном масштабе. Одной из причин является высокая цена субстратов для культивирования микроорганизмов, которая достигает треть стоимости биополимера (Вугош, 1987). Как известно, метилотрофные бактерии с сериновым путем Ci метаболизма накапливают значительное количество ПГБ (Trotsenko et al., 1992). Метанол является одним из потенциальных субстратов для производства биополимера, так как имеет низкую цену, высокую чистоту, небольшую плотность и хорошую растворимость в воде. Однако физиолого-биохимические основы биосинтеза ПГБ/В у аэробных метилобактерий до сих пор не ясны, что существенно ограничивает возможности реализации этого перспективного процесса в биотехнологии.

Создание промышленных производств на основе микробиологического синтеза биополимера требует детального и всестороннего изучения штаммов-продуцентов, в том числе исследования метаболизма субстратов. Это позволит оценить потенциальные возможности штаммов и разработать подходы к улучшению их производственных характеристик, снизить себестоимость биополимера.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным понимание принципов метаболической организации метилотрофных продуцентов ПГБ/В было предпосылкой и целью данного исследования.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Разработать быстрый и чувствительный метод определения ПГБ/В в микробной биомассе.

2. Подобрать метилотрофные продуценты и оптимальные условия их культивирования для биосинтеза ПГБ/В. Оценить физико-химические свойства биополимера.

3. Установить пути биосинтеза и деградации ПГБ/В и пути метаболизма косубстратов у метилотрофных продуцентов.

4. Определить источник НАД(Ф)Н для биосинтеза ПГБ/В у сериновых мепгилобактерий.

Научная новизна работы.' Разработан простой чувствительный метод количественного определения ПГБ/В в микробной биомассе с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Ci8 в изократическом режиме элюции.

В результате скрининга отобраны 3 продуцента ПГБ - Methylobacterium extorquens, Methylopila helvetica и Paracoccus methylutens. Обнаружено, что метилобактерии накапливают ПГБВ в присутствии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, при этом добавление С5-субстратов приводит к более высокому содержанию ЗГВ в составе сополимера, нежели внесение Сз-соединений. P.methylutens синтезирует ГГГБВ также в присутствии глицерина и гептана.

Впервые установлены пути метаболизма пропанола и пентанола у M.extorquens и M.helvetica. Радиоизотопным методом показано у M.extorquens существование нового альтернативного пути окисления пропионил-КоА и валерил-КоА, связанного с декарбоксилированием первого углеродного атома.

У M.extorquens и M.helvetica определены ферменты биосинтеза и деградации ПГБ, Обнаружено, что только НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза участвует в биосинтезе полимера. Выявлены различия в путях деградации ПГБ.

Впервые определены скорости образования С02, ПГБ/В и биомассы при росте на С! и Cn-субстратах. Разработана математическая модель, описывающая метаболизм этих субстратов у сериновых метилобактерии. Показано, что при росте бактерий на метаноле скорость образования НАДФН в цикле Кребса не обеспечивает скорость биосинтеза ПГБ и биомассы.

У M.extorquens и M.helvetica выявлены активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ метилентетрагидрометаноптерина и метилентетрагидрофолата. Результаты радиоуглеродного, энзимологического, ингибиторного анализа и математического моделирования метаболических потоков у сериновых метилобактерий свидетельствуют об участии тетрагидрофолатного и/или тетрагидрометаноптеринового/метанофуранового путей

переноса одноуглеродных фрагментов в генерировании НАДФН для биосинтеза ПГБ при метилотрофном росте.

Практическое значение работы. Разработанный нами метод анализа ПГБ/В достаточно прост и чувствителен, что позволяет оперативно проводить серийные анализы микробной биомассы и контролировать кинетику накопления биополимера в процессе ферментации.

Отобраны метилотрофные штаммы, активно синтезирующие ПГБ/В. Установлен спектр косубстратов, культивирование на которых приводит к биосинтезу ПГБВ, подобраны их оптимальные ростовые концентрации. В связи с этим результаты работы могут представлять практическую ценность при разработке способов получения ПГБВ.

Полученные данные по метаболической организации у штаммов-продуцентов ПГБ/В могут служить основой для их направленного культивирования с целью повышения эффективности биотехнологического процесса.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пущино, 1995 г.) и "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996 г.), на международных симпозиумах "Bacterial Polyhydroxyalcanoates" (Davos, 1996 г.) и "Biochemical principles and mechanisms of biosynthesis and biodégradation of polymers" (Munster, 1998 г.), a также на стендовых сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 1995, 1997, 1998 гг.). В целом работа обсуждена на совместном семинаре отдела биохимии микроорганизмов и лаборатории радиоактивных изотоповю

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения результатов (4 главы), обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 27 таблиц, 16 рисунков. Список литературы содержит 146 источников литературы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биосинтез бактериальных полигидроксиалканоатов 1.1. История вопроса

Многие микроорганизмы обладают способностью накапливать различные внутриклеточные материалы, а именно - полисахариды, полифосфаты, липиды. Такие соединения чаще всего синтезируются организмом при несбалансированных ростовых условиях, при недостатке какого-либо элемента питания (за исключением углерода), и деградируются во время голодания, для поддержания жизнеспособности.

Полиэфиры 3-гидроксиалканоатов (ПГА) могут накапливаться в цитоплазма-тических гранулах многих прокариот и служат резервными источниками углерода и энергии, а также способствуют образованию спор и цист. Они имеют общую формулу:

[ — О — СН — СН2 — С — ]п 7

I II

R О

где R - СНз для поли-3-гидроксибутирата (ПГБ), R - СН3СН2 для поли-3-гидроксивалерата (ПГВ), R - СНз(СН2)2 для поли-3-гидроксигексаноата (ПГТ), R - СН3(СН2)4 для поли-3-гидроксиоктаноата (ПГО).

Поли-З-гидроксибутират - линейный эфир /?-оксимасляной кислоты - был впервые обнаружен Lemoigne (1926) в бактериях Bacillus megaterium. Много поздее было показано, что полимер накапливается во внутриклеточных гранулах большого количества грам-положительные и грам-отрицательные бактерий. При этом максимальные концентрации ПГБ зарегистрированы в клетках Alcaligenes eutrophus, до 76% к весу сухого вещества (Kim et al, 1994), Azotobacler vinelandii, до 80% (Page and Cornish, 1993) и рекомбинанта Escherichia coli, до 80% (Lee et al., 1994).

Развитие различных методов анализа внутриклеточных метаболитов - ИК-спектроскопии, ЯМР и ЭПР - позволило установить, что, помимо ПГБ микроорганизмы способны синтезировать и другие полигидроксиалканоаты. Wallen и Rohwedder (1974)

впервые определили, что полимер, открытый Lemoigne, может содержать также некоторое количество других 3-гидроксикислот. Они экстрагировали из активного ила полимер, состоящий из 3-гидроксибутирата (3ГБ) и 3-гидроксивалерата (ЗГВ) как главных компонентов, а также Сб и С? 3-гидроксикислот в незначительном количестве. Позднее в клетках Bacillus sp (Findlay and White, 1983) и A.eutrophus (Holmes et al., 1981) были обнаружен полимер, содержащий ЗГВ и 3-гидроксигексаноат (ЗГГ), а в клетках Pseudomonas oleovorans (De Smet et al., 1983) - 3-гидроксиоктаноат (ЗГО) и 3-гидроксидеканоат (ЗГД).

В последнее десятилетие использование необычных ростовых субстратов для культивирования бактерий позволило совершить настоящий прорыв в обнаружении новых строительных блоков биополимера - найдено около 100 различных мономеров. Среди них насыщенные 3-гидроксиалканоаты (ЗГА) с длиной цепи от 5 до 15 углеродных атомов, ненасыщенные ЗГА с длиной цепи от 5 до 13 углеродных атомов с одной или двумя двойными связями. У бактерий выявлена также способность накапливать изоцепные, ароматические, галогензамещенные ПГА, содержащие различные функциональные группы: карбокси-, циано-, ацетокси-, эпокси-, циклогексил-. Кроме ЗГА, в составе мономеров установлены 4-, 5- и 6-гидроксиалканоаты (Steinbüchel and Valentin, 1995). Единственный водорастворимый ПГА - поли-^-Ь-малат - синтезируют грибы Pénicillium cyclopium (Shimada et al., 1969), Physarum polycephalum (Fischer et al., 1989) и Aureobasidium pullutans (Lie and Steinbüchel, 1996). Необходимо отметить, что все найденные ПГА, имеющие хиральный атом, находятся в Щ-)-конфигурации. Можно ожидать, что в будущем будут обнаружены новые мономеры благодаря использованию разнообразных субстратов и успешному скринингу бактерий.

Несмотря на то, что в литературе описано огромное количество ПГА, только несколько из них было получено в количествах, достаточных для исследования их физических, химических и биологических свойств, и выявления области их потенциального применения. Это ПГБ, сополимер З-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата (ПГБВ) (Lee and Chang, 1995), поли-3-гидроксивалерат (Steinbüchel and Schmack, 1995), поли-4-гидроксибутират (П4ГБ) (Steinbüchel et al., 1994) и сополимер 3-гидроксигексаноата/3-гидроксиоктаноата (ЗГГ/ЗГО) (Preusting et al., 1993а). Остальные ПГА получены в небольших количествах, поскольку субстраты (чаще всего аналоги

мономеров) являются дорогими, или токсичными для бактерий, или их содержание в клетках очень низкое.

1.2. Внутриклеточная локализация ПГА

У большинства микроорганизмов ПГА находятся в клетках в виде гранул, подобно накоплению крахмала в растениях. Гранулы ПГА окрашиваются черным Суданом и хорошо видны в фазовом контрасте светового микроскопа. Размеры гранул различны, их диаметр составляет от 0.2 до 0.8 мкм. Исследования ультраструктуры клеток показало, что количество гранул может колебаться от 6 до 8, и все они локализованы в цитоплазме (Ellar et а!., 1968).

Нативная структура гранул и физическое состояние ПГА в них пока не полностью определены. В гранулах помимо полимерных цепей ПГА, которые составляют 93.8-94.9% от веса сухих гранул, обнаружено 1.87% белков, 0.46% липидов и фосфолипидов (Lundgren et al., 1964; Griebel et al., 1968). Гранулы остаются в мобильном состоянии при выделении, только если окружены белками и липидными компонентами. При удалении фосфолипидов и денатурации белков полимер кристаллизуется (Stuart et al, 1995). На основании всех этих данных была предложена гипотетическая модель гранулы ПГА (Fuller et al., 1992; Hocking and Marchessault, 1994). Считалось, что плотность и высокая гидрофобность полимера в гранулах связана с наличием ограничивающих фосфолипидных оболочек, которые расположены монолинейно и укреплены белками. Таким образом, фосфолипиды должны играть важную роль в компартментации полимера и поддержании его в жидком, аморфном состоянии в живых клетках. Однако в предложенной модели гранулы по математическим расчетам фосфолипиды должны составлять 5.1-6.2% от веса сухой гранулы, что не совпадает с экспериментальными данными.

В мембранном слое гранул всегда присутствуют белковые включения. Их можно разделить на 4 класса. Первый класс белков представляют ПГА-синтазы - ферменты, катализирующие образование эфирных связей между мономерами ПГА. Второй класс белков - это деполимеразы, участвующие во внутриклеточной деградации ПГА. Третий класс белков состоит из небольших амфифильных белков - фазинов. Они обнаружены во всех бактериях, синтезирующих биополимер. Установлено, что фазины играют важную

роль в накоплении ПГА, контролируя размер, форму, количество гранул в клетках, а также скорость биосинтеза полиэфиров. Steinbüchel предположил, что именно фазины составляют главную основу мембранного слоя гранул, создавая монопленку между гидрофобными цепями ПГА и гидрофильной цитоплазмой. (Steinbüchel et al., 1995), К четвертому классу белков отн