Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности регуляции биосинтеза полигидроксибутирата у Methylobacterium extorquens

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белова, Лариса Леонидовна, Б. м.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

им. Г.К. СКРЯБИНА

на правах рукописи УДК 577.171

БЕЛОВА ЛАРИСА ЛЕОНИДОВНА

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА У МЕТНУЬОВАСТЕЫиМ ЕХТСЖ()иЕ№

03.00.04-БИОХИМИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н, проф. Ю.А. Троценко

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1 Продуценты ПГБ 7

1.2 Метаболические пути синтеза ПГБ 9 /. 3 Метаболизм ПГБ 1 о

1.4 Характеристика ферментов синтеза ПГБ 11 1.4. fi-кетотгюлаза 11

1.4.2 НАДФН-зависимая ацетоацетш-КоА редуктаза 13

1.4.3 ПГА-синтаза 15

1.5 Взаимосвязь ЦТК и биосинтеза ПГБ 18

1.5.1 Свойства цитратсинтаз 19

1.5.2 Цитратсинтаза аэробных метшобактерий 22

1.6 Изоцитратдегидрогеназа и ее регуляция 24

1.7 Контроль синтеза полимера у продуцентов ПГБ 26

1.7.1 Регуляция синтеза ПГБ у Alcaligenes eutrophus 26

1.7.2 Регуляция синтеза ПГБ у Zoogloea ramigera . ■ ' •. ■ 29

1.7.3 Синтез ПГБ представителялтрода Azotobacter ■ ■ • 29

1.7.4 Регуляция синтеза ПГБ у Methylobacterium rhodesianum 34

1.8 Организация генов синтеза ПГБ 36

1.9 Влияние внутрицитоплазматических включений ПГБ на клеточный объем микроорганизмов 39

1.10 Заключение 40

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

2.1 Объект исследования и культивирование 41

2.2 Приготовление бесклеточных экстрактов 41

2.3 Гель-фильтрация экстрактов на сефадексе G-25 42

2.4 Определение активностей ферментов 42

2.5 Очистка НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы 44

2.6 Очистка цитратсинтазы 45

2.7 Очистка НАДФ'-изоцитрлтдегидрогеназы 46

2.8 Определение кинетических параметров НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы, цитратсинтазы и НАДФ+-изоцитратдегидрогеназь1 46

2.9 Определение оптимального значения рН. 47

2.10 Определение молекулярной массы нативных ферментов. 47

2.11 Измерение интенсивности дыхания 48

2.12 Определение включения 2С14-ацетата в ГТГБ 48

2.13 Экстракция и определение внутриклеточного содержания метаболитов 48

2.14 Аналитические методы. 50

2.15 Реактивы 50

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 50

3.1 Метаболические изменения у М. Ехтояоитя при синтезе ПГБ 51

3.2 Очистка и характеристика НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы 51

3.2.1 Процедура получения препарата НАДФН-ацетоацетш-КоА редуктазы 53

3.2.2 Свойства НАДФН- ацетоаъ^етил-КоА редуктазы 53

3.3 Очистка и характеристика цитратсинтазы 57

3.3.1 Процедура получения гомогенного препарата цитратсинтазы 57

3.3.2 Свойства цитратсинтазы 58

3.4 Очистка и характеристика НАДФ+-изоцитратдегидюгеназы 60

3.4.1 Получение препарата НАДФ+-изоцитратдегидрогеназы 60

3.4.2 Свойства НАДФ -изоцитратдегидрогеназы 61

3.5 Влияние специфических ингибиторов на включение 214 С-ацетата в ПГБ 63

3.6 Внутриклеточные концентрации пиридиннуклеотидов и АТФ 65

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 68

4.1 Метаболический путь синтеза ПГБ у М. Ехтоядитя 68

4.2 Роль изоцитратдегидрогеназы и формиатдегидрогеназы в обеспечении синтеза ПГБ НАДФН 68

4.3 Регуляция синтеза ПГБ у М. Ехтсжожт 73

4.3.1 Свойства НАДФН-ацетоацетш-КоА редуктазы 73

4.3.2 Свойства цитратсинтазы 75

4.3.3 Свойства НАДФ -изоцитратдегидрогеназы 75

4.3.4 Динамика активностей ферментов и внутриклеточных концентраций пиридиннуклеотидов и АТФ во время синтеза ПГБ 76

4.4 Сравнительный анализ регуляторных моделей сериновых метилотрофов 79

4.5 Роль ЦТК в биосинтезе ПГБ 81

5. ВЫВОДЫ 82

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

83

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПГБ - полигидроксибутират

ИДГ - изоцитратдегидрогеназа

АКР - ацетоацетил-КоА редуктаза

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЦС - цитратсинтаза

КоА - коэнзим А

А-КоА - ацетил-КоА

Аа-КоА - ацетоацетил-КоА

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотреитол

ДТНБ - дитионитробензоат

ДХФИФ - дихлорофенолиндофенол

ФМС - феназинметосульфат

ОРС - открытая рамка считывания

кДа - килодальтон

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ПЭГ-6000 - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ицл - изоцитратлиаза

СССР - карбонилцанид-т-хлорофенилгидразон

ХЕПЕС - Н-[2-гидроксиэтил]пиперазин->Г[2-этан]сульфоновая кислота

ОЕАЕ - диэтиламиноэтил

ТГФ - тетрагидрофолат

МПТ - метаноптерин

МТГФ - метилентетрагидрофолат

МТГМПТ - метилентетрагидрометаноптерин

ТХУ - трихлоруксусная кислота

808 - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

ДА мин"1 - изменение оптического поглощение в минуту

ВВЕДЕНИЕ

Полигидроксибутират (Iii Б) - широко распространенный среди бактерий биополимер, выполняющий функции запасания углерода и энергии, резервирования полифосфата и кальция (Anderson and Dawes, 1990; Steinbüchel, 1991, 1995).

Будучи близок по свойствам химически синтезированным полимерными материалам, ПГБ отличается от них биосовместимостью и биоразлагаемостью. Это открывает широкие перспективы применения ПГБ в медицине, сельском хозяйстве и быту (Holmes, 1985, Anderson and Dawes, 1990, Page, 1995). В последнее десятилетие идет активный поиск различных продуцентов ПГБ, в том числе среди аэробных метилотрофных бактерий. Для создания эффективного биотехнологического процесса получения ПГБ из метанола необходимо детальное знание структурно-функциональной организации и регуляции его биосинтеза, которая у аэробных метилобактерий исследована в меньшей степени, чем у гетеротрофных продуцентов.

К началу нашей работы метаболические аспекты биосинтеза ПГБ у метилобактерий изучались только у Methylobacteriwn rhodesianwn, реализующего сериновый путь ассимиляции метанола. Было показано, что синтез ПГБ осуществляется трех- и/или пятистадийным путем при участии ß-кетотиолазы, НАД(Ф)Н-ацетоацетил-КоА редуктазы, D(-) и L(+) -гидроксибутирил-КоА дегидратаз и ПГБ-синтазы (Ackermann and Babel, 1989; Mothes and Babel, 1995; Mothes et al., 1997). Поскольку центральным продуктом сери нового пути является ацетил-КоА, за который конкурируют инициирующие ферменты цитратного цикла (цитратсинтаза) и синтеза ПГБ (ß-кетотиолаза), подразумевалось, что у метилобактерий должен существовать механизм, координирующий работу этих метаболических участков. Тем не менее о свойствах и регуляции ферментов цитратного цикла и синтеза ПГБ у М. rhodesianwn имелись весьма фрагментарные сведения. Предполагалось также, что НАДФт-изоцитратдегидрогеназа и Н АД-форм и атд е г и д ро г еназа обеспечивают биосинтез ПГБ восстановительными эквивалентами (Mothes and Babel, 1995, Yamane, 1990), однако соответствующие экспериментальные доказательства отсутствовали.

Ранее в нашей лаборатории был выделен перспективный метилотрофный продуцент с сериновым путем Methylobacterium extorquens, способный накапливать до 80% ПГБ, (Trotsenko et al., 1993). Представлялось логичным и актуальным провести исследование метаболической организации и регуляции у данного продуцента для выявления степени сходства и(ли) возможных отличий от М. rhodesianwn.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было получить более полное представление о принципах организации и регуляции биосинтеза ПГБ у серинового мети-лотрофа М. extorquens. Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

- определить основные метаболические изменения у М. extorquens во время биосинтеза

ПГБ;

- очистить и изучить свойства ключевых ферментов синтеза Iii Б (ацетоацетил-КоА редуктазы) и цитратного цикла (цитратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы);

- исследовать зависимость накопления ill Б от внутриклеточных уровней аденин- и пиридиннуклеотидов;

- выявить возможные источники восстановительных эквивалентов для синтеза ПГБ.

Научная новизна. Впервые у продуцента ПГБ с сериновым путем ассимиляции

метанола показано, что биосинтез ПГБ сопровождается определенными метаболическими перестройками, благоприятствующими включению ацетил-КоА в цепь биосинтетических реакций и выражающимися в увеличении активностей ферментов биосинтеза полимера и некоторых ферментов ЦТК, уменьшением уровней ферментов прямого окисления метанола и понижением внутриклеточной концентрации АТФ.

Установлено, что в биосинтезе ПГБ у М. extorquen* не участвуют D(-) и L(+)-3-гидроксибутирил-КоА дегидратазы, что указывает на трехстадийный путь синтеза ПГБ.

Впервые экспериментально показано, что НАДФ+ - изоцитратдегидрогеназа может формировать пул НАДФН для биосинтеза полимера, тогда как роль формиатдегидрогеназы в этом процессе маловероятна.

Впервые очищены и подробно охарактеризованы ПАДФН-ацетоацетил-КоА редуктаза, цитратсинтаза и НАДФ+-изоцитратдегидрогеназа M. extorquens.

Сравнение экспериментальных и литературных данных свидетельствует о существенных различиях в организации и регуляции биосинтеза ПГБ у M. extorquens и таксо-номически близкого метилотрофа M. rhodesianum. Предложена схема координированного контроля ЦТК и биосинтеза ПГБ у M. extorquens.

Практическая ценность. Полученные результаты позволяют глубже понять особенности биосинтеза ПГБ у M. extorquens, что дает возможность усовершенствовать биотехнологию получения полимера с использованием данного продуцента. Сравнение свойств ферментов и принципов регуляции метаболизма M. extorquens и M. rhodesianum свидетельствует о разнообразии регуляторных механизмов у таксономически близких метило-трофов и создает научную основу для разработки биотехнологического процесса биосинтеза ПГБ.

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на международных и отечественных конференциях и симпозиумах: 8tn International Symposium «Microbiological Growth on Ci Compounds», 1995, San Diego; «Биосинтез и биодеградация микробных биополимеров», 1995, Пущино; «Автотрофные микроорганизмы», 1996, Москва; городская конференция молодых ученых, 1996, Пущино; International Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates, 1996, Davos, Российский биохимический съезд, 1997, Москва. Материалы диссертации оформлены в виде 3 научных статей и 6 тезисов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1,1 Продуценты ПГБ

ПГБ был впервые обнаружен в 1927 году Лемойном и позднее описан как важный бактериальный продукт, принимающий участие в спорулядии Bacillus spp (Lemoigne, 1927, цитируется по Anderson and Dawes, 1990). К настоящему времени известно около 100 видов бактерий, синтезирующих ПГБ как запасное вещество. (Steinbüchel, 1991). Синтез и накопление полимера у бактерий происходит в ответ на несбалансированные условия роста, вызванные недостатком важных питательных веществ: азота, фосфора, калия и некоторых других, и одновременно при избытке углеродного субстрата (Anderson and Dawes, 1990, Steinbüchel, 1991). У азотфиксирующей бактерии Azoiohacler hejermkui синтез полимера индуцируется недостатком кислорода (Senior et al., 1972). Некоторые бактерии в определенных условиях способны накапливать полимер во время экспоненциального роста и не нуждаются для этого в индуцирующих условиях. К ним принадлежат Alcali genes latus (Hrabak, 1992), M. rhodesianum при росте на фруктозе (Mothes et al., 1998).

Большинство работ по биосинтезу ПГБ опубликованных за последние 10=15 лет выполнены на Alcaiigenes eutrophus, мутант которого использует глюкозу и накапливает до 80% ПГБ (Holmes, 1985). Созданные научные основы позволили компании ICI создать промышленную технологию производства к получения ПГБ.

Получение рекомбинантных микроорганизмов открывает дополнительные перспективы в поиске новых продуцентов. Новое генетическое окружение, отсутствие обычных механизмов контроля может дать неожиданные преимущества, Гены синтеза ПГБ клонированы в растениях, про- и эукариотических клетках (Poirier et al, 1992, Schubert et al, 1988; Slater et al, 1988; Williams et al., 1996; Leaf et al., 1996; Hahn et al, 1997). Большое количество работ посвящено экспрессии генов метаболического пути синтеза ПГБ A. eutrophus в Escherichia coli. Получены рекомбинанты, способные накапливать полимер на минеральных средах, на комплексных средах без Сахаров, регулирующие экспрессию генов в зависимости от температуры (Wang and Lee, 1997, Kalousek and Lubitz, 1995, Kidwell et al., 1995). У большинства подобных организмов продуктивность образования ПГБ невелика, хотя у рекомбинантного штамма Е. coli, не способного к образованию жгутиков, продуктивность ПГБ достигает 3,4 г л"1 ч"1 (Wang and Lee, 1997).

Большая группа аэробных бактерий, растущих на метане и метаноле, способны к индуцированному синтезу ПГБ (Говорухина и Троценко, 1989; Bourque et al., 1992; Zhao, et al., 1993). Эти бактерии ассимилируют С,-соединения одним из трех биосинтетических

путей: сериновым, рибулозобисфосфатным (РБФ) и рибулозомонофосфатным (РМФ). Мегилотрофы с РМФ-путем почти не синтезируют ПГБ, а в основном - эк юполисахари-ды. Известные на сегодняшний день металотрофные продуценты ПГБ с сериновым путем принадлежат к группе розовоокрашенных факультативных метилотрофов (род Methylo-bacîerium), Paracoccus denitrificans и Paracoccus panthotrophus, которые ассимилируют метанол РБФ-путем, также синтезируют и накапливают ПГБ. Таким образом, существует до конца не известный биохимически обоснованный механизм корреляции между путями С; ассимиляции и типом накапливаемого запасного вещества (Babel, 1992). Однако недавно появилось сообщение о том, что мутант M. -rhodesianum, не способный синтезировать повышенные количества ПГБ, продуцирует экзополисахариды в условиях лимита по азоту. Это свойство мутанта полностью отсутствует у родительского штамма (Breuer et al., 1995), что, по мнению авторов, связано с перенаправлением энергии, прежде запасавшейся в ПГБ, на синтез углеводов.

Несмотря на преобладающее внимание к гетеротрофным продуцентам ПГБ, метанотрофы и метилобактерии имеют высокий биотехнологический потенциал. Большая группа продуцентов принадлежит к метанотрофам П типа. Теоретически содержание ПГБ у метанотрофов II типа с сериновым путем может превышать 67% (Asenijo and Suk, 1986). У Methylosinus trichosporium было достигнуто содержание полимера 20-25%, хотя у другого серинового метанотрофа Methylocystisparvus максимальное содержание ПГБ составило 68% (Scott et al., 1981). В условиях периодического культивирования сериновые метилобактерии способны накапливать высокомолекулярный (до 1300-1800 кДа ПГБ (Suzuki et al., 1986) с высоким выходом - ОД9-0,2т г"11, содержание полимера при этом достигало в среднем 25-35% (Bourque et al, 1992, 1995). В оптимизированных условиях содержание ПГБ может составить 40-45% (Bourque et al., 1995) и даже 50-55% (Kim et al., 1996). При непрерывном культивировании наивысшая продуктивность 0,64 г л'-ч1 получена для Hyphomicrobiian zavarznit subsp. chengdueme, а содержание ПГБ варьировало от 40 до 59% (Zhao et al, 1993). Некоторые штаммы M -extorquens в колбах накапливали до 80% ПГБ (Trotsenko et al., 1993). При îlvpïî О JX йЧС око м культивировании с контролируемым соотношением С/М M. extorquais sp.K накапливал ПГБ до 60% с выходом 0,2г г"1. Получение рекомбинантных метилотрофов позволило в 2,5 раза увеличить содержание полимера у Mycoplana rubra (Föllner et al., 1995).

1 Примечание: единицы измерения выхода ПГБ даны в г ПГБ на г потребленного метанола.

Бактерии с РБФ-путем накапливают несколько меньшие количества полимера, чем сериновые метилобактерии. При использовании метода импульсного введения ацетата в непрерывную культуру P. panthotrophus содержание ПГБ составило 36% (van Aalst-van Leeuwen et al., 1997). Содержание сополимера (полигидроксибутирата-валерата) при добавлении к метанолу «-амилового спирта у Par. denitrificans достигало 58%, а выход повышался до 0,968 г г"1 (Ueda et ai., 1992).

Образование ацетил-КоА, предшественника мономеров для синтеза ПГБ, из метанола через сериновый путь не требует притока энергии. Однако для восстановления ацетоацетил-КоА в гидроксибутирил-КоА необходимы восстановительные эквиваленты, которые у сериновых метилобактерий образуются благодаря окислению дополнительного количества метанола. Одним из способов оптимизации синтеза ПГБ является использование смесей субстратов, при этом один из них служит источником углерода, а другой расходуется на получение энергии. Теоретически около 80% углерода пар г л ю ко э а/ацетат или ацетат/метанол может превратиться в ПГБ при использовании мутантных штаммов сериновых метилобактерий (Babel, 1992).

* .2 Метаболические пути синтеза ПГБ

Синтез ПГБ происходит в результате конденсации двух молекул ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, последующего восстановления в гидроксибутирил-КоА и его полимеризации. По характеру и последовательности ферментативных реакций синтез ПГБ напоминает синтез жирных кислот с некоторыми исключениями:

- интермедиа™ синтеза ПГБ находятся в виде КоА-производных, а не ацил-иереносящего белка (Ritchi and Dawes, 1969);

- синтез ПГБ протекает стереоспецифично: в полимер включается только D(-)3-гидроксибутират (Merrick and Doudoroff, 1961), в ряде случаев в синтез ПГБ специфичен к НАДФН (Fukui et al, 1987):

- ферменты синтеза ПГБ, по-видимому, не объединены в комплекс, как синтаза жирных кислот (Anderson and Dawes, 1990);

31 рС£1КЦИЯ ПОЛЙМСрИЗ^ЦИИ ПрОИСХСДИТ На ГраШЩС поверхностного СЛОЯ ГраНуЛ ПГБ.

отделяющего водонерастворимый полимер от цитоплазмы (Page, 1995).

У большинства исследованных микроорганизмов синтез ПГБ происходит трехста-дийно из ацетил-КоА, благодаря действию трех ферментов: ацетил-КоА:ацетил-КоА С-ацетилтрансферазы (ß-кетотиолазы; НФ 2.3Л.9), ацетоацетил-КоА редуктазы

(гидрокеибутирил-КоА дегидрогеназы; НФ 1.1.1.36) и поли(З-гидроксибутират) синтазы (номер не определен):

КоА НАДФН

t i

2ацетил-КоА —Ацетоацетил-КоА » 3-гидроксибутирил-КоА-► ПГБ+КоА

\

НАДФ+

Ацетоацетил-КоА редуктаза существует в двух изоформах, специфичных к НАДФН или НАДН. Соответственно, продукт реакции (3-гидроксибутирил-КоА) имеет либо D(-), �