Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий

Розова, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий"

На правах рукописи

РОЗОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

СВОЙСТВА И РОЛЬ ПИГОФОСФАТ-ЗАВИСИМЫХ 6-ФОСФОФРУКТОК1ШАЗ У АЭРОБНЫХ МЕТАНОТРОФОВ И МЕТШГОБАКТЕРИЙ

03.01.04 - биохимия

005005728

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2011

005005728

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.А. Головлева

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru./ и http://www.ibpm.ru./

Автореферат разослан _ А7 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических паук " Т.В. Кулаковская

Защита состоится «01» декабря

2011 г. в 10:00 час, на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Углеводный метаболизм многих организмов основан на гликолизе, функционирующем во всех трех доменах - Bacteria, Archaea и Еикагуа. У большинства из них ключевую стадию этого пути - фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата, катализирует аллостерически регулируемая АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (АТФ-ФФК). У архей эту реакцию осуществляет АДФ-зависимый фермент из семейства глюкокиназ, не проявляющий сходства аминокислотной последовательности с 6-фосфофруктокиназами (ФФК), но имеющий аналогичную кристаллическую структуру (Sakuraba, Ohshima, 2002; Ronimus, Morgan, 2001; Ito et al., 2001). Однако у ряда про- и эукариот - фототрофных бактерий, анаэробов, паразитических микроорганизмов, Euglena gracilis, а также у высших растений присутствует пирофосфат-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ПФК), гомологичная по аминокислотной последовательности АТФ-ФФК. Реакция, катализируемая ПФК, обратима, что предполагает участие фермента как в гликолизе, так и глюконеогенезе:

Mg2+

Фруктозо-6-Ф + ФФ„ ч * Фруктозо-1,6-Ф2 + Ф„ Причины и следствия замены АТФ на ФФн в ключевой реакции гликолиза неясны. Предложены альтернативные гипотезы, рассматривающие присутствие ПФК как проявление "ископаемого метаболизма", который сохранился в качестве рудимента у небольшого числа организмов, или, напротив, ПФК могли возникнуть из АТФ-зависимых ферментов под давлением условий обитания, и это приобретение явилось адаптивным приспособлением к анаэробным условиям (Bapteste et al., 2003; Siebers et al., 1998; Chi, Kemp, 2000).

Ранее ПФК была обнаружена у аэробных метанотрофов - специализированной группы бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Считалось, что ПФК нехарактерна для не растущих на метане метилобактерий, что указывало на ее возможную связь с метаболизмом метана (Шишкина, Троценко, 1990; Бесчастный и др., 1992), за исключением актиномицета Amycolatopsis methanolica, растущего на метаноле (Alves et al., 1994). Однако недавно в геномах Methylibium petroleiphilum РМ1 (Капе et a!., 2007) и ризосферных фитосимбионтов Methylobacterium nodularis ORS 2060 и Methylobacterium sp. 4-46 найдены гены-гомологи ПФК.

Метанотрофы и метилобактерии ассимилируют углерод метана и метанола посредством двух альтернативных циклических путей - рибулозомонофосфатного (РМФ) (метанстрофы I типа) или серинового (II тип), в которых первичными продуктами биосинтеза являются, соответственно, С6-фосфосахара или С3-соединения. Кроме того, метилобактерии могут ассимилировать углерод метанола после окисления до С02 через цикл Кальвина. Особую группу представляют метанотрофы X типа, реализующие одновременно три пути Cj-ассимиляции - РМФ, сериновый и минорный

цикл Кальвина, где в числе первых продуктов образуются С(- и С3-соединения. Как следствие, у метилотрофов с различными путями первичного Срметаболизма значение гликолиза в биосинтезе фосфотриоз или фосфогексоз различно, что обусловило их перспективность для изучения функциональной роли ПФК и ФФн. Доступность нуклеотидных последовательностей геномов ряда облигатных метанотрофов и факультативных метилобактерий Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (I тип), Methylococcus capsulatus Bath (X тип), Methy'.osinus trichosporium ОВЗЬ (II тип), а также Methylobacterium nodularis ORS 2060, позволила использовать основанную на клонировании современную методологию очистки рекомбинантных ПФК для последующей характеристики и филогенетического анализа.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - изучить свойства и роль ПФК в метаболизме метилотрофных бактерий, реализующих различные пути Ср метаболизма. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (ФБА) из Methylococcus capsulatus Bath.

2. Изучение организации кластера (возможности котранскрипции) генов pfp и hpp в хромосоме Мс. capsulatus Bath.

3. Очистка и характеристика рекомбинантной ПФК из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

4. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК из Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodularis ORS 2060.

5. Проведение филогенетического анализа ПФК.

Научная новизна. Обнаружено, что ПФК Мс. capsulatus Bath, кроме фруктозо-6-фосфата (Фр-6-Ф), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (С-7-Ф) и рибулозо-5-фосфат (Py-5-Ф), проявляет наиболее высокое сродство и активность с С-7-Ф, и имеет наибольшее сходство аминокислотной последовательности с ортологами из хемолитоавтотрофных бактерий. Предложена схема модифицированного цикла Кальвина с участием ПФК в реакциях восстановительного пентозофосфатного пути. Впервые установлено, что у Мс. capsulatus Bath гены pfp и hpp, кодирующие ПФК и мембранную РГ-транслоцирующую пирофосфатазу, транскрибируются в виде бицистронной мРНК, на основании чего предположено участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Показано, что ФБА Мс. capsulatus Bath обратимо катализирует расщепление как фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ), так и седогептулозо-1,7-бисфосфата (СБФ).

Доказано, что ПФК Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивна в направлении гликолиза и глюконеогенеза, но неэффективна в реакции с С-7-Ф. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060 проявляют более высокое сродство к ФБФ, чем :< Фр-6-Ф, что указывает на преимущественное участие данных ферментов в глюконеогенезе.

Найдено, что ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ ингибируется АМФ и АДФ, что подразумевает участие фермента в регуляции синтеза и распада углеводов в зависимости от энергетического статуса клеток. Индуцибельность ПФК при росте Mb. nodularis ORS 2060 на арабинозе и более высокое сродство с С-7-Ф, чем с Фр-б-Ф, указывают на специфическую функцию фермента при использовании Сахаров в анаэробных условиях фитосимбиоза.

Установлено, что ПФК Мс. capsulatus Bath и Ms. trichosporium ОВЗЬ проявляют наибольшее сходство аминокислотных последовательностей с ортологами хемолитоавтотрофов и принадлежат к филогенетической подгруппе «В2» группы И 6-фосфофруктокиназ. Ферменты Mm. alcaliphilum 20Z и Mb. nodularis ORS 2060 отнесены к ФФК филогенетической подгруппы «Р», для большинства которых доказана гликолитическая функция.

Научно-практическое значенне. Благодаря высокой активности и стабильности, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z может быть использована в аналитической биохимии как специфический реагент для определения ФБФ в качестве сопрягающего фермента при измерении скорости реакции альдольной конденсации, катализируемой ФБА, а также для измерения скорости образования ортофосфата или пирофосфата. Уникальная способность ПФК Мс. capsulatus Bath обратимо фосфорилировать С-7-Ф может найти применение в синтезе СБФ и С-7-Ф.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2006-201 Orr), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), на международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на I и III школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008; Нижний Новгород, 2010), на III и IV международном конгрессе европейских микробиологов (FEMS; Гётеборг, Швеция, 2009; Женева, Швейцария, 2011), на XIII международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на VIII международном конгрессе экстремальных микроорганизмов (Понта-Дельгада, Португалия, 2010), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010), на научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», посвященной памяти акад. E.H. Кондратьевой (МГУ, 2010).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН и ИБ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Решетникову A.C., к.б.н. Бесчастному А.П., Глухову A.C. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 ссылки, из них 16 на русском и 181 на английском языках, содержит 11 таблиц и 41 рисунок.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили чистые культуры облигатных метанотрофов Мс. capsulatus Bath, Mm. alcaliphilum 20Z, Ms. trichosporium ОВЗЬ и факультативной метилобактерии Mb. nodularis ORS 2060. Облигатных метанотрофов выращивали на минеральной среде «П» в атмосфере СН4 и воздуха (1:1) (Гальченко и др., 1986), a Mb. nodularis ORS 2060 на минеральной среде «К» (Doromna et al., 2004) с метанолом (1%) или арабинозой (1 г/л). Для выращивания Мгл. alcaliphilum 20Z в среду дополнительно вносили Na-карбонатный буфер к 3% NaCl. Штаммы Escherichia coli BL21(DE3) й Rosetta (DE3) выращивали при 37°С на жидкой или агаризованной средах "LB" с добавлением при необходимости хлорамфеникола и/или ампициллина (100 мкг/мл).

Молекулярно-бнологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Marmur, 1961). Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию, определение стартовой точки транскрипции, нозерн-блот анализ проводили стандартными методами (Sambrook, Russell, 2001). Тотальную РНК выделяли модифицированным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (vi.62b). Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura et al., 2007). Последовательности генов pfp получены из незавершенных геномов Mm. alcaliphilum 20Z и Methylocaldum szegediense 0-12 (http://mvw. eenoscope. ens. fr/externe/Enslish/corps anglais, html).

Клонирование и экспрессия генов. Гены pfp амплифицировали из геномной ДНК Мс. capsulatus Bath, Mm. alcaliphilum 20Z, Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060 и клонировали в векторах pET22b+ или pHUE. Полученную рекомбинантную плазмиду pET22h:pfpBath трансформировали в клетки Е. coli BL21(DE3), pET22b:pfp20Z

- в клетки Е. coli Rosetta (DE3), a pE722b:pfpOB3b и рШЕ-.pfpnod - в клетки Е. coli BL21(DE3), содержащие дополнительную плазмиду pT-groE. Ген fla Мс. capsulatus Bath амплифицировали с геномной ДНК и клонировали в векторе рЕТ22Ь+. Полученную плазмиду рЕТ22Ь:/Ья трансформировали в штамм Е. coli BL21 (DE3). Экспрессию генов в штаммах Е. coli индуцировали добавлением ИПТГ. Рекомбинантные ферменты ПФК-Hise, ПФК-убиквитин-His,; и ФБА-Hisc очищали из Е. coli с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с №2+-ЫТА-агарозой, согласно протоколу фирмы "Quiagen" (Германия). После очистки, ПФК-убиквитин-Hiss Mb. nodularis ORS 2060 обрабатывали деубиквитинирующей протеазой Usp2, затем снова очищали на колонке с Ni2+-NTA. В результате получали ПФК без дополнительных навесок. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц белков определяли электрофорезом в 12%-ном SDS-ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Молекулярные массы нативных ПФК и ФБА определяли с помощью градиентного 4-30% ПААГ электрофореза. Для ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и ФБА Мс. capsulatus Bath дополнительно проводили гель-фильтрацию на колонках с Ультрагелем АсА 34 и сефакрилом S-200, соответственно ("Pharmacia", США).

Характеристика ПФК. Активность ПФК определяли в прямой и обратной реакциях непрерывно (с сопрягающими ферментами) и периодически (по образованию Фн) по начальной скорости реакции при 30°С (Bertagnolli, Cook, 1984). За единицу активности ферментов принимали количество, вызывающее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту. При исследовании влияния pH на активность и стабильность ПФК использовали следующие буферные растворы (50 мМ): MES-NaOH (pH 5,56,5), имидазол-HCl (pH 6,0-8,0), HEPES-HC1 (pH 7,0-8,0), Трис-HCl (pH 7,0-9,0), глицин-NaOH (8,5-10). В качестве потенциальных эффекторов были проанализированы пируват, цитрат, ФЕП, АТФ, АДФ, АМФ, НАДФ, НАД, НАДФН, рибозо-5-фосфат, глюкозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат, серин, фосфогликолат, фосфоглицерат. Для тестирования возможности замены Mgz+другими двухвалентными металлами добавляли водные растворы ВаС12, MnCl2, CoCI2, CuCI2. Значения Кт каж и

рассчитывали с помощью программы SigmaPlot 10.

Характеристика ФБА. Расщепляющую активность ФБА по отношению к ФБФ и СБФ измеряли с помощью сопрягающего фермента а-глицерофосфатдегидрогеназы ("Sigma", США) по окислению НАДН при 30°С. Влияние pH на активность ФБА изучали с использованием следующих буферов: ацетатного (pH 5,0-5,5), фосфатного (pH 6,0-6,5), Трис-HCl (pH 7,0-9,0) и глицин-NaOH (pH 9,5-10,0). Активность ФБА в направлении синтеза ФБФ оценивали спектрофотометрически, используя в качестве сопрягающих ферментов глюкозофосфатизомеразу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу ("Sigma", США) и рекомбинантную ПФК из Methylomonas methanica 12, полученную, как описано в работе Решетникова с соавторами (2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика ПФК и ФБА Methylococcus capsulatus Bath 1.1. Характеристика n®K-His6

Для получения рекомбинантной ПФК из Мс. capsulatus Bath, ген pfp (МСА1251) клонировали в экспрессионном векторе рЕТ22Ь+. Плазмиду pET22h:pfpBath трансформировали в клетки Е. coli BL21(DE3). Аффинной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA агарозой получен гомогенный препарат n<J>K-His6 с удельной активностью в прямой реакции 7,6 Б/мг белка и обратной - 9,0 Е/мг белка.

* кДа М 1 2 к кПя М

( ь .......... Рис. 1. ПААГ-электрофорез ПФК Мс.

94,6 U __ ' capsulatus Bath (А) в присутствии ДСП

2 М 11 (Б) в натнвных условиях прп

232 градиенте пористости 4-30%. 1,2-3 и

45,0 tri' ■ • j 5 мкг ПФК. М - маркеры молекулярных

масс.

31,0 ' '

21,5 ^

14,4 §(|

ПААГ-электрофорезом в денатурирующих и нативных условиях показано, что ПФК Мс. capsulatus Bath является гомодимером с м. м. субъединицы около 45 кДа (рис.

1), что характерно для большинства изученных бактериальных ПФК. Активность фермента зависела от ионов Mg2+, с ионами Со2+ или Мп2+ (50 мкМ) составляла 69% и 50%. ПФК наиболее активна при pH 7,0, строго специфична к ФФн как фосфатному донору (табл. 1). Аллостерические эффекторы фермента не обнаружены.

Кривые насыщения фермента субстратами в прямой и обратной реакциях подчинялись уравнению Михаэлиса-Ментен. При этом полученные значения Кт каж сопоставимы с таковыми для ПФК из других организмов, за исключением более высокого Кткш для Фр-6-Ф (табл. 1). ПФК Мс. capsulatus Bath использует в качестве субстратов С-7-Ф и СБФ, а также Ру-5-Ф/РБФ, при этом сродство и активность с С-7-Ф выше (АГткзж 0,03 мМ, Ктах31 Е/мг белка), чем с Фр-6-Ф (Кткаж 2,27 мМ) или Py-5-Ф (Кт каж 4,05 мМ). Ранее активность с С-7-Ф обнаружена у ПФК Entamoeba histolytica (Susskind et al., 1982) (табл. 1), а также у факультативного анаэроба Propionibacterium freudenreichii и золотистой фасоли Phaseolus aureus (Bertagnolli et al., 1986), однако, специфичность и активность этих ферментов с Фр-6-Ф были выше, чем с С-7-Ф.

Поскольку у Мс. capsulatus Bath функционирует цикл Кальвина, но отсутствуют гены, кодирующие ключевые для этого пути СБФ/фруктозо-1,6-бисфосфатазу (СБФ/ФБФазу) или седогептулозо-1,7-бисфосфатазу (СБФазу), логично предположить, что ПФК может участвовать в превращениях пентозофосфатов в цикле Кальвина (рис.

2). Кроме того, у Мс. capsulatus Bath отсутствуют гены АТФ-ФФК и фруктозо-1,6-бисфосфатазы (ФБФазы), катализирующих необратимые стадии гликолиза и

глюконеогенеза. Следовательно, функционально ПФК заменяет эти ферменты. На основании свойств ПФК и данных анализа генома А/с. capsulatus Bath, нами предложена схема метаболизма углерода, отражающая участие ПФК в гликолизе, глюконеогенезе и перестроечных реакциях модифицированного цикла Кальвина (рис. 2).

XII,

°\ммо">0* Р0°

PQQH

X ХНг .ФЛЦГ.

НАД* НАДН,

НАДН,

•мм О адг ФДГ

сн4 —4. НСН0Н^НС00^4 СО,

\ГФС V » Геке,

/ ффн*ч|

> К / J

\Ж/ Фн

Рибулозо-5Ф

фруктозо-бф ^ ФГИ ПФК

Полисахариды t t

ФФн > ПФК.

Ксилулоза-5Ф

"V4 Фруктозо-1,6Ф2 Фрустозо-бФ Эритрозо-4Ф j f0BA

ФБА

Ь-^ДОАФ

Седогептулозо -1,7Ф2

ГА-ЗФ

Глюкозо-бФ

КДФГ - КДА

ГА-ЗФ

i-* Фн

IIVH I

ФФн COi Седогептулозо -7Ф

у РБФ(Л

Рибулозо-1,5Ф2"

АТФ, Фн

Пируват

3"ФКГ п^//-

,Рибозо-5Ф Ксилулозо -5Ф РФИ\ I РФЭ

Рибулозо-5Ф

f АМФ, ,/ /

I Фн-«'/ А

2-фосфоглицерат т j t АДФ

L- 2-ФГК / [ЦТК

/ Сериновый L цикл

ФЕП

Глицин CHjff * Серии

Рис. 2. Предполагаемая схема Ci-асснмиляции у Metltylococcus capsulatus Bath.

О способности ПФК обратимо фосфорилировать Py-5-Ф до сих пор не сообщалось. У Мс. capsulatus Bath имеется АТФ-зависимая фосфорибулокиназа (ФРК), катализирующая необратимую реакцию синтеза РБФ из Py-5-Ф. При этом известно, что активности ключевых ферментов цикла Кальвина у Мс. capsulatus Bath и других метанотрофов X типа модулируются ростовой температурой (Ешинимаев и др., 2004). Поэтому при зависимых от температуры флуктуациях уровней интермедиатов цикла Кальвина ПФК может вовлекать избыточный РБФ в основной метаболизм (рис. 2).

1.2. Изучение транскрипционной организацииpfp и hpp генов

У Мс. capsulatus Bath в непосредственной близости к гену pfp (2133 п.н.) обнаружена ОРС (МСА1252), продукт которой гомологичен Н+-ФФн-азам V-типа из Geobacter sulfureducens (62% идентичности транслированных аминокислотных

Параметры Methylomtcrobium alcaliphilum Methylobacterium nodularis Methylomonas methanica Propionibacterium freudenreichii \iethylococcus сарзиШиз МегЬу1о51пиБ МсИозрогшт Rhodospirill um rubrum Amycolatopsis methanolica Entamoeba histolytica

К„„, Е/мг белка Фр-6-Ф ФБФ С-7-Ф мМ: ФФн Фр-6-Ф С-7-Ф Фн ФБФ В прямой реакции В обратной реакции Мг ,кДа Число субъединиц Оптимум рН Оптимум температуры, °С Эффекторы Ссылки 577 805 0,18 0,118 ±0,006 0,64 ± 0,02 1,01 ± 0,09 3,4 ± 0,2 0,095 ±0,017 0,22 ± 0,02 0,33 ± 0,04 180 4x45 7,5 30 нет Данная работа 86,89 74,7 46,56 0,0060 ± 0,0003 0,65 ± 0,11 0,21 ± 0,02 1,04 ±0,10 0,043 ±0,001 0,047 ±0,001 0,32 ± 0,01 180 4x45 7,5 30 нет Данная работа 840 850 но. 0,051 0,39 H.O. I,7 0,1 0,038 0,35 92 2x45 8,0 40 нет (Beschastny et al., 1992) 258 232 HO. 0,069 0,1 HO. 0,6 0,051 0,008 0,083 95 2x48 7,4 25 нет (O'Brien et al., 1975) 7,6 9,0 31 0,027 ±0,005 2,27 ± 0,24 0,030 ±0,004 8,69 ± 1,22 0,328 ±0,012 0,028 ± 0,005 2,00 ±0,31 90 2x45 7,0 30 нет Данная работа 88 89 85 0,011 ±0,001 0,24 ±0,04 0,51 ± 0,26 2,4 ±0,2 0,074 ± 0,008 0,030 ±0,001 0,363 ± 0,007 270 6x45 7,5 50 АМФ, АДФ Данная работа 20 24,2 но. 0,025 0,38 н.о. 0,82 0,02 и.о. но. 95(40/360) 2x40 7,2/8,6 H.O. АМФ, АТФ, АДФ (Pfleiderei, Klemme, 1980) 107 но. но. 0,2 0,4 H.O. 0,84 0,025 0,04 0,77 170 4x45 7,5 35-46 нет (Alves et al., 1994) 45,7 45,0 но. 0,014 0,038 0,064 0,8 0,018 но. 0,5 100 2x60 7,0 20 нет (Reeves et al., 1976; Susskind et al., 1982)

н о. - не определяли

последовательностей) и Rhodospirillum rubrum (58%). Для изучения возможной котранскрипции генов pfp и hpp, проводили ПЦР с применением обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР). кДНК, синтезированную с лраймером RT-Mcapl, использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами McapF2 и RT-Mcap2. В результате был получен фрагмент ожидаемой длины, что указывало на котранскрипцию генов pfp и hpp в виде одной бисцистроиной мРНК (рис. 3, А).

|—^

CGCCAGCCAACGATACTCAAAOGOüäGGCOGTICATGGCGGCGCGGÄ

пфк -fr-

Рис. 3. Транскрипцнонная организация pfp и hpp генов Мс. capsulatus Bath. (А) ОТ-ПЦР для определения межгенного участка pfp-hpp генов. 1 - молекулярные маркеры; 2 - ПЦР-продукг, полученный с хромосомной ДНК; 3 - ПЦР-продукт, полученный с кДНК, 4 - продукт ПЦР с мРНК. (Б) Картирование стартовой точки транскрипции pfp-hpp-оперона. Стрелкой обозначен +1 нукпеотид. (В) Схематическое представление результатов картирования. Последовательности -10 и -35 предполагаемого промотора выделены и подчеркнуты; последовательность Шайн-Дальгарно выделена курсивом.

Методом удлинения праймера установлено, что транскрипция оперона pfp-hpp осуществляется с единственного промотора, причем стартовой точкой транскрипции является нуклеотид А, находящийся на расстоянии 30 н.п. от стартового кодона гена pfp (рис. 3, Б). Анализ in silico нуклеотидной последовательности выше стартового транскрипционного сайта выявил области -10 (TAAGTT) и -35 (TTGTAA) предполагаемого промотора, сходные с консервативными последовательностями, узнаваемыми субъединицей ст-70 РНК-полимеразы Е. coli (рис. 3, В). З'-область гена hpp содержала ГЦ-богатый инвертированный повтор (5'-ccctcctgcctcctccgcccggcgggaggg-3'), который, возможно, формирует шпильку со свободной энергией AG = -18.3 кКал/моль. Этот участок может функционировать как р-независимый транскрипционный терминатор, однако поли-Т в данной последовательности отсутствует.

Таким образом, нами обнаружено, что гены, кодирующие два пирофосфат-зависимых фермента, являются сцепленными и транскрибируются с одного промотора

как одна бисцистронная мРНК (рис. 3). Можно предположить, что ФФн, синтезируемый в реакции, катализируемой ПФК, а также как побочный продукт анаболических реакций, у Мс. capsulatus Bath и ряда автотрофных бактерий гидролизуется мембранной Н+-ФФн-азой. Создаваемый при этом протонный градиент на мембране, в свою очередь, может обеспечивать энергией синтез АТФ в обход дыхательной цепи. Таким образом, ПФК Мс. capsulatus Bath является многофункциональным ферментом, участвующим в конструктивном и энергетическом метаболизме метанотрофа.

Анализ транслированной аминокислотной последовательности показал, что ПФК Мс. capsulatus Bath принадлежит к филогенетической подгруппе "В2" II типа 6-фосфофруктокиназ, согласно принятой классификации (Bapteste et al., 2003). При этом составляющие данную подгруппу б-фосфофруктокиназы имеют в активном центре аминокислоты Lysi04 и Aspi24 (данные относительно аминокислотной последовательности АТФ-ФФК Е. coli). Следовательно, подгруппа "В2" представлена только ФФн-зависимыми ферментами. ПФК Мс. capsulatus Bath на 80% идентична ферменту из другого метанотрофа X типа - термофильного Methylocaldum szegediense 012, и проявляет также высокую гомологию (70-74% идентичности) с ортологами из литоавтотрофных /?-протеобактерий: нитрификаторов Nitrosomonas europaea и Nitrosospira multiformis, денитрификатора Thiobacillus denitrißcans, а также факультативного метилотрофа Methylibium petroleiphilum РМ1 (рис. 4). Перечисленные бактерии обладают сходными метаболическими особенностями: у них функционирует цикл Кальвина (или, по крайней мере, в геномах присутствуют гены ключевых ферментов этого пути), а окисление энергетического субстрата осуществляется по монооксигеназному механизму. Кроме того, анализ геномов Т. denitrißcans, N. europaea и N. multiformis выявил, что гены pfp у этих бактерий локализованы в одном кластере с геном, кодирующим мембрансвязанную Н+-ФФн-азу. Резонно полагать, что ПФК Мс. capsulatus Bath и автотрофных протеобактерий имеют близкие свойства и аналогичные функции.

1.3 Характеристика ФБА-Hiss

У Мс. capsulatus Bath изучали свойства фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (ФБА) -фермента гликолиза/глюконеогенеза, сопряженного с ПФК. Гомогенный рекомбинантный фермент с 6 гистидинами на С-конце получен клонированием гена fba (МСА3041) в экспрессионном векторе рЕТ22Ь+, трансформацией полученной плазмиды рЕТ22Ь;/Ьл в клетки Е. coli BL21(DE3) и использованием аффинной хроматографии. Согласно данным электрофореза и гель-фильтрации ФБА является гексамером {Mr = 240 кДа). Для ФБА II класса характерны двумерные, тетрамерные или октамерные формы, однако о шести-субъединичных ферментах ранее не сообщалось. Фермент Мс.

*i| Nitrosomonas europaea (CAD85845) 9jJ Nitrosospira multiformis (ABB74047)

1_)-Methvlibium petroleiphilum (ABM95730)

-Thiobacillus denitrificans (AAZ97455)

~Methvlococcus capsulatus (AAU92465)

Methvlocaldum szezediense* Beggiatoa sp. PS (EDN70902) Nitrosococcus oceani (ABA59292) — Chromohalobacter salexigens (ABE58887) Hahella chejuensis (ABC32449)

~ Marinobacter aqttaeole: (ABM19478)

Legionella pneumophila (AAU27983) —Nitrococcus mobilis (EAR21417)

-Xylella faslidiosa (AAF83087)

1 Xanthomonas oryzae (BAE67633)

-Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7 (ACL71381)

~ Saccharophagus degradans (ABD80197)

—Moorella thermoacetica (ABC19548)

-Opitulus terrae (ACB74686)

55-Clostridium difficile (CAJ70002)

-Gallionella capsi/erriformam (ZP 04831102)

Mariprofundus ferrooxydans (EAU55532)

-Magnetococcus sp. MC-1 (ABK44425)

-Methvlosinus trichosrorium (ZP 06888368)

92J— Polaromonas naphthalenivorans (ABM38853) Rhodoferax ferrireducens (ABD6 81! 6) Leptothrix cholodnii (ACB32316) Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7 (ACL71453)

Magnetospirillum magnetotacticum (ZP 00055860)

Rhodospirillum rubrum (ABC24201) Hoefleaphotolrophica (EDQ35137) Labrenzia alexandrii (EEE44488) Nakamurella multipartite (ACV78222) 6!J Rhizobium leguminosarum (ACS57129)

[К^Ц-Agrobacterium radiobacter (ACM27062)

~ Sinorhizobium medicae (ABR60939) j Methvlobacterium nodularis (ACL55713) loo1—Methvlobacterium sp. 4-46 (ACA16250) Methvlomicrobium alcaliphilum* Methvlobacter tundripaludum (EFOQ3887) Methvlomonas methanica (AAY28468) Opitutus terrae (ACB 73441) Rkodopirellula baltica (CAD78962) Mastigamoeba balamuthi (AAF70463) Nocardioides sp. JS614 (ABL82600) Kribbellaflavida (ADB35868)

Propionibacterium freudenreichii (AAA25675) Propionibacterium acnes (AAT82837) Beutenbergia cavernae (ACQ80161) Cellulomonasflavigena (EEN39659) "Jonesia denitrificans (ACV09088) Sanguibacter keddieii (ACZ21515) Xylanimonas cellulosilylica (ACZ31018)

Rhodopirellula baltica (CAD75440)

{

"Entamoeba histolytica (EAL47787)

'Escherichia coli (ATP; POA796)

SHORT LONG

чВ!

—Methvlacidiphilum infernorum (ATP; ACD84176)

-Rhodospirillum rubrum (ATP; ABC21848) щ

Planctomyces maris (EDL56936) -Amycolatopsis methanolica (AAB01683)

Рис. 4. Филогенетическое дерево ПФК прокариот и эукарнот. Подчеркнуты метилотрофные бактерии. В скобках указаны номера аминокислотных последовательностей, депонированных в ОепВапк.

capsulatus Bath был активен в широком диапазоне рН от 5,5 до 8,5, увеличиваясь на 25% при рН 9,0-9,5. Активность фермента обнаруживалась в отсутствие металла, но увеличивалась в 2,5 раза в присутствии Со2+, при этом инкубация с 1 мМ ЭДТА полностью ингибировала активность ФБА. Таким образом, фермент Мс. capsulatus Bath принадлежит ко II классу фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаз.

В отсутствие металла в реакционной смеси зависимость скорости реакции от концентрации ФБФ соответствовала кинетике Михаэлиса-Ментен (А^ткажФБФ 0,018 мМ, Утях 1,26 Е/мг белка) (рис. 4, А). Однако добавление 20 мкМ Со2+ приводило к появлению двух значений Кт каж. При концентрациях субстрата 0,008-0,5 мМ Кт кажФБФ = 0,0052 (Ктах = 4,46 ± 0,11). При концентрациях субстрата 0,5-1,5 мМ^ткажФБФ=1,1 мМ (^тах =13,9 ± 2,8 Е/мг белка) (рис. 5, Б). ФБФ при концентрации >2 мМ ингибировал активность фермента в присутствии добавленного Со2+ (20 мкМ), но не в отсутствие металла. Вероятно, Со2+ изменяет степень агрегации субъединиц фермента, что оказывает влияние на кинетические константы.

012345 01234

[Фруктзо-1,6-Ф2], (мМ) [Фруктозо-1,6-Ф2], (ИМ)

Рис. 5. Зависимость активности ФБА Мс. capsulatus Bath от концентрации ФБФ как субстрата в отсутствие Со2+ в реакционной смеси (А) и в присутствии 20 мкМ Со1* (Б).

В обратной реакции зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции имела гиперболический характер (АГт каж Д0АФ 0,095 ± 0,027 мМ, А"ткажГАФ 1,17 ± 0,12 мМ, Ктах 0,46 Е/мг белка). Фермент не имеет аллостерических эффекторов, следовательно направленность реакции регулируется соотношением С^- и С3-интермедиатов. Важно отметить, что реакция конденсации ДОАФ и ГАФ, катализируемая ФБА, редко исследовалась из-за сложности измерения ФБФ. Проблема детекции образующегося ФБФ была нами решена с использованием в качестве сопрягающего фермента рекомбинантной ПФК, катализирующей обратимую реакцию образования фруктозо-6-фосфата из фруктозо-1,6-бисфосфата.

ФБА также катализировала расщепление СБФ (АГт каж =0,19 мМ, =0,71 Е/мг белка). При этом активность фермента увеличивалась в 2 раза в присутствии 20 мкМ Со2+, однако ингибирования высокими концентрациями СБФ (2-4 мМ) не наблюдалось как при добавлении, так и в отсутствие Со2+ в реакционной смеси. Таким образом,

помимо гликолиза и глюконеогенеза ФБА Мс. capsulatus Bath может участвовать в восстановительных реакциях пентозофосфатного цикла (рис. 2).

В хромосоме Мс. capsulatus Bath ген ft/a, кодирующий ФБА, расположен в окружении генов, кодирующих ферменты цикла Кальвина и специфические ферменты РМФ-пути. С помощью нозерн-блот анализа показано, что ген fba транскрибируется как моноцистронная мРНК размером 1,5 т.п.н. (размер гена 1,06 т.п.н.) (рис. 6). При этом уровень экспрессии гена fba выше при росте Мс. capsulcatus Bath при 45°С, по сравнению с клетками, растущими при 27°С и 37°С. Аналогичная прямая зависимость от температуры роста показана для активности РубисКО в экстрактах клеток метанотрофа. Эти данные косвенно указывают на роль ФБА в цикле Кальвина.

1 2 3

Рис. 6. Нозерн-блот анализ транскрипции гена fia. Тотальную РНК выделяли из клеток Мс. capsulatus Bath, выращенных при 27°С (1), 37°С (2) и 45°С (3).

Транслированная аминокислотная последовательность гена fba метанотрофа имеет наиболее высокую идентичность с ФБФ-альдолазами из автотрофных бактерий Magnetospirillum magnetotacticum (72%), Xanthobacter autotrophics, X. flavus и Nitrosomonas europaea, а так же метилотрофа Methylibium petroleiphilum (71%). Эти бактерии также содержат пирофосфат-зависимые 6-фосфофруктокиназы, высоко гомологичные ПФК Мс. capsulatus Bath. Ген fba у этих бактерий (аннотируется как cbbA) входит в состав оперона ebb, кодирующего ферменты цикла Кальвина. Полученные результаты указывают на эволюционный тандем ФБА и ПФК, необходимый для функционирования цикла Кальвина.

2. Характеристика ПФК Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Электрофоретически гомогенный препарат ПФК-Hisc, получен клонированием гена pfp Mm. alcaliphilum 20Z в экспрессионном векторе рЕТ22Ь+, трансформацией плазмиды рЕТ22Ь\pfp20Z в клетки продуцента Е. coli Rosetta (DE3) и аффинной хроматографией клеточного лизата Е. coli на колонке с Ni2+-NTA агарозой. Удельная активность фермента в прямой и обратной реакциях составила 577 и 805 Е/мг белка. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z является гомотетрамером с м.м. субъединицы 45 кДа (рис. 7). Ранее тетрамерная структура была показана только для ПФК факультативного метилотрофа Amycolatopsis methanolica (Alves et al., 1994). Гиперболический характер кривых насыщения субстратами указывает на подчинение ПФК Mm. alcaliphilum 20Z

1500 п.н.

10 20 10 20 10 20 МКГ МКГ МНГ МКГ MKT MKT

кинетике Михаэлиса-Ментен (рис. 8). Основные характеристики ПФК Mm. alcaliphilum 20Z представлены в таблице 1.

М кДа

Рис. 7. 12% SDS-ПААГ-электрофорез (А) и градиентный 430% ПААГ-электрофорез (Б) рекомбинантной ПФК Mm alcaliphilum 20Z. 1, 2, 3 -3, 5, 15 мкг ПФК, соответственно. М - маркеры молекулярных масс.

В отличие от ПФК Мс. capsulatus Bath, фермент Mm. alcaliphilum 20Z проявлял незначительную активность с С-7-Ф (0,18 ± 0,01 Е/мг белка), а также имел низкое сродство к данному субстрату (А'ткаж =1,01 ± 0,09 мМ). Фермент не активен с Py-5-Ф.

Высокая удельная активность ПФК Mm. alcaliphilum 20Z в прямой и обратной реакциях и отсутствие аллостерических эффекторов указывают на активное участие фермента в гликолизе и глюконеогенезе (рис. 9).

Ю 600

г 0,2 0,4 0,6 0,8 1

[Фруктозо-1,6-Ф21, мМ

[Фн], мМ

£ <

1200 н

X <

0,6 1,0 [ФФн], мМ

2,0

Рис.

1Фруктозо-6-Ф], мМ

Зависимость активности ПФК Mm. alcaliphilum 20Z от концентрации

субстратов прямой (А) и обратной (Б) реакций.

У Мт. а1саИрЫ1ит 20Ъ отсутствует АТФ-зависимая ФФК, следовательно, ПФК является единственным ферментом, катализирующим ключевую реакцию гликолиза.

Однако в геноме имеется ген ФБФазы, катализирующей необратимое дефосфорилирование ФБФ. Мт. а1саИрЫ1ит 20Z - галотолерант, и в качестве одного из осмопротекторов синтезирует сахарозу, что сопровождается образованием ФФн. Возможно, при росте метанотрофа в условиях высокой солености сопряженная работа ПФК и ФБФазы формирует футильный цикл, в котором удаляется избыток ФФн и происходит регенерация Фр-6-Ф - субстрата для синтеза сахарозы (рис. 9).

хнг, о2

СН.

.. vivuviyj.

Н20 PQQнг PQQ НАД* НАДН НАД*

неон

НСНО £

НАДН, 02 РЬ®40 НАД*. Нг0 ^Рибулозо-5Ф_.

ФЛДГ

НСООН

ФДГ

НАДН

-J:

СОг

Сахароза-бР

УДФ

3-Гексузоло-6Ф .

Рибулозо-5Ф

¡НСНО —^3-,

НСНО

3 -Гек сулозо-6Ф-*—

Рнбулозо-5Ф-ФРИ

3-Гексулозо-6Ф

ФФн ПФК Фн

Фруктозо-бФ Фруктозо-1,6Ф2

УДФ-глюкоза

ФФн УТФ

удф-гпф

Рибозо-5Ф Седогегпулозо-7Ф

Ссилул озо-5 Ф

ФЕА

Фруктозо-бР f \' ( ДОАФ

Глюкозо-1Ф 1 ФГМ

Глюкозо-бФ ^^ ГФДГ

»А

НАД(Ф)Н "

6-Ф-глюконат

2-Кето-3-дезокси-6-Ф-гтоконат

КЦА

Пируват

НАДФ* С^НАДФН

Ацетил-КоА

Рис. 9. Предполагаемая схема Ci-ассимиляции у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

Биосинтез

ПФК Mm. alcaliphilum 20Z принадлежат к филогенетической подгруппе «Р» II типа 6-фосфофруктокиназ, включающей хорошо изученные ферменты из М. methanica 12 и Pr. freudenreichii. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z наиболее близка (87-89% идентичности) с ферментами из метанотрофных у-протеобактерий, также реализующих РМФ путь (Mm. album, Methylobacter tundripaludum). Следует отметить, что подгруппа «Р» в основном представлена ферментами из гетеротрофных микроорганизмов, для ПФК которых доказана гликолитическая функция, в том числе амитохондриалъного простейшего Mastigamoeba balamuthi.

3. Характеристика ПФК Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodularis О RS 2060

Гены pfp Ms. trichosporium ОВЗЬ (EFH03142) и Mb. nodularis ORS 2060 (Mnod_0681) клонировали в экспрессионных векторах pET22b+ или pHUE, соответственно. Полученные плазмиды рЕТ22Ь:/?#ЮВЗЬ и pHUE \pfpnod трансформировали в клетки Е. coli BL21 (DE3), с предварительно внесенной плазмидой pT-groE. Аффинной хроматографией на Ni2+-NTA агарозе были получены гомогенные препараты ПФК-Hiso Ms. trichosporium ОВЗЬ и ПФК Mb. nodulans ORS 2060. ПФК Mb. nodulans ORS 2060 - гомотетрамер с м. м. 180 кДа, тогда как фермент Ms. trichosporium ОВЗЬ - гомогексамер с м. м. 270 кДа (рис. 10). Ранее о гексамерной структуре ПФК не сообщалось. Показано, что ПФК R. rubrum в растворе может быть в виде мономера, димера и октамера (Pfleiderer, Klemme, 1980).

кДа М 1 2 Б _2_......1_......М_ кДа р„с. ю. 12% SDS-ПААГ-

44Q электрофорез (А) и градиентный

4-30% ПААГ-электрофорез (Б) 232 рекомбинантных ПФК. 1 - ПФК-

I4Q Hise Ms. trichosporium ОВЗЬ, 2 -

ПФК Mb. nodulans ORS 2060. M -g7 молекулярные маркеры.

Основные биохимические и кинетические характеристики ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060 представлены в таблице 1. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060 фосфорилировали также С-7-Ф (табл. 1 и 2, рис. 11). Несмотря на то, что активность ПФК Mb. nodulans ORS 2060 с С7-фосфосахаром ниже, специфичность фермента к этому субстрату, как показал расчет соотношения Кса1/Кткж, выше, чем к Фр-6-Ф (табл. 2).

Таблица 2. Специфичность ПФК метилотрофных бактерий к С6- и С7-фосфосахарам

116,0 66,8 ■ м

45,0 35,0 ■И

25,0

18,0 14,4 ¡шщяш

Метилотрофные бактерии Фруктозо-6-фосфат Седогептулозо-7-фосфат Фруктозо-1,6-бисфосфат

К'.у, каж, мМ Kçj l^nt каж Km каж, мМ Кы KcJ Km каж А'„, каж, мМ -^cat KçJ Km каж

Methylomicrobium alcaliphilum 0,64 104 163 1,01 0,032 0,03 0,095 145 1526

Methylococcus capsulatus г,il 0,68 0,3 0,03 2,8 93 0,328 0,8 2,4

Methylobacterium nodulans 0,65 16 24 0,21 8,3 40 0,043 13,4 312

Methylosinus trichosporium 0,24 24 99 0,51 23 45 0,070 24 343

S 60

fe 50

0 12 3

[Седогептулозо-7-Ф], мМ

0 12 3

[Седогептулозо-7-Ф], мМ

Рис. 11. Зависимость активности ПФК Ms. tricliosporium ОВЗЬ (А) и Mb. nodulans ORS 2060 (Б) от концентрации С-7-Ф.

Более высокая специфичность ПФК к С-7-Ф коррелирует со способностью этого фитосимбионта расти на сахарах, при этом участие ПФК в реакциях пентозофосфатного цикла увеличивает возможность получения С3-соединений (рис. 12). Кроме того, в экст-

Арабиноза

У изпмепаш

Рибулоза

' киназа j (ACL62836)

РФЭ Рибулозо-5Ф (ACL56729),.

РФЭ

(ACL56729)

Ксилулозо-5Ф

фосфокетолазсА

(ACL62773)<t/\k

Апетил-Ф

ГАФ

Ксилулозо-5Ф ■*—► Рибозо-5Ф

ï транскетолаза A. (ACL59258)

ГАФ

Седогептулоз§-7Ф трапсальдолазау n<i)K £

(ACL62182)/ „ Фн

Фруктозо-бФ'/л Седогептулозо-1,7Ф2

V у\ФБА Эритрозо-4Ф ГАФ Ксилулозо -5Ф -*ч у*

транскетолаза Y (ACL59258W\

^ *■ Фруктозо-бФ ГАФ Ф&н .

"Н пфк

Фн -4-Y

Фруктозо-1,6Фг

Биосинтез - Пируват"

ДОАФ

ФБА

*АФ

ТФИ

Рис. 12. Предполагаемая схема метаболизма арабинозы у Mb. nodulans ORS 2060.

рактах клеток Mb. nodularis ORS 2060, выращенных с L-арабинозой в качестве субстрата, выявлена в два раза более высокая активность ПФК (50 мЕ/мг белка), по сравнению с клетками, выращенными на метаноле (22 мЕ/мг белка).

Активность ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ с С-7-Ф и Фр-6-Ф оказалась практически одинаковой - 85 и 88 Е/мг белка, соответственно, однако специфичность к С6-фосфосахару была выше, чем к С-7-Ф (табл. ! и 2). Интересно, что ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ может фосфорилировать Py-5-Ф (1,4% от активности с Фр-6-Ф), тогда как ПФК Mb. nodulans ORS 2060 не проявляла активности с данным субстратом.

Тестирование влияния различных интермедиатов на активность ферментов выявило, что ПФК Mb. nodulans ORS 2060, как и большинство представителей ФФн-зависимых ФФК, не имеет аллостерических регуляторов. Напротив, на активность ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ влияли АМФ и АДФ. Так, в прямой реакции 1 мМ АМФ фактически полностью ингибировал фермент, а АДФ в той же концентрации снижал активность до 57%. В обратной реакции АМФ и АДФ полностью ингибировали активность ПФК.

СН4

НАДН, рММО СНзОН

миг

_ Ц1ГТ С

vMMO

Серин

стом Г

/ N.N-метилен- ^_А

Глицин

тнмп

ФАДГ Ч

НАД(Ф)Н2 <\Jk

* над(ф)н2

ТГФ

со2

-НСООН

V ФДГ НАДН3

НАДНг Оксипируват —\ опр

Полисахариды,

сахароза ♦

Фруктозо-бФ

ФФн

Глицерат

фн

ФБФаза

ПФК

S Фн

ь—АТФ фруктозо-1,6Фг

АДФ

Глицерапьдегид-ЗФ

^ АМФ, ФФн АТФ, Фн

Фосфоенолпируват *

—*

СО, ПК

УДФ УТФ

ДОАФ

Пирува"

ФЕП-КО f

Оксалоацетат t

Малат АТФ-МТк) Малил-КоА ♦-'Ч

Ацетил-КоА

1'ис. 13. Предполагаемая схема Ci-ассимиляции у Methylosinus trichosporium ОВЗЬ.

Ацетил-Ко/

Метанотроф Ms. trichosporium ОВЗЬ и не растущий на метане фитосимбионт Mb.

nodularis ORS 2060 представляют класс альфапротеобактерий. Обе культуры ассимилируют Срсоединепия -хриновым путем, первичным интермедиатом в котором является серии. Образовавшиеся Сз-сединения затем направляются на синтез как шестиуглеродных Сахаров, так и интермедиатов цикла Кребса. Свойства ПФК, в частности, более высокое сродство к ФБФ, соответствуют доминирующей функции ПФК в реакциях глюконеогенеза (рис. 13). Однако ПФК этих бактерий принадлежат к различным филогенетическим подгруппам "В2" и "Р" (рис. 4) и имеют низкую идентичность аминокислотных последовательностей (16%). При этом ПФК Mb. nodulans ORS 2060 проявляет наиболее высокое сходство (64-65% идентичности) с ферментами из неметилотрофных протеобактерий, находящихся в симбиотических отношениях с высшими растениями (рис. 4). Итак, филогенетический анализ позволяет предположить специфическую роль ПФК у бактерий-фитосимбионтов. Напротив, фермент Ms. trichosporium ОВЗЬ имеет наибольшее сходство (75-77% идентичности) с ПФК альфа- и бетапротеобактерий (R. rubrum, Polaromonas naphthalenivorans и Rhodoferax ferrireducens), но проявляет также невысокое сходство с ПФК гаммапротеобактерии Мс. capsulatus Bath (34% идентичности).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ имеющейся в Database информации свидетельствует о том, что наличие ПФК у микроорганизмов, как правило, коррелирует с отсутствием или дефектами в механизмах аэробного синтеза АТФ в дыхательной цепи. Так, у анаэробных бактерий и амитохондриальных простейших ПФК катализирует одну из основополагающих реакций модифицированного ФФн-зависимого гликолиза, который более эргономичен по сравнению с классической гликолитической последовательностью (5 молекул АТФ вместо 2) (Slamovits, Keeling, 2006).

Анализ секвенированных геномов показал присутствие генов pfp у всех аэробных метанотрофов, окисляющих СН4 мембранной метанмонооксигеназой (мММО), за исключением филогенетически обособленной группы термоацидофильных метанотрофов рода Methylacidiphilurn. Поскольку окисление метана с участием мММО сопряжено с потреблением кислорода и энергии восстановленных цитохромов, этот процесс составляет конкуренцию синтезу АТФ в реакциях окислительного фосфорилирования. Очевидно, что использование метанотрофами ФФн, в качестве фосфорильного донора в ряде метаболических превращений - один из путей экономии АТФ и решения данной биоэнергетической проблемы.

Исследования свойств ФФн-зависимой 6-фосфофруктокиназы у различных метанотрофов выявили многофункциональность ПФК в метаболизме этих бактерий. У метанотрофов I типа {Mm. alcaliphilum 20Z), ассимилирующих углерод метана на уровне формальдегида в РМФ-цикле, где в качестве первичных продуктов образуются фосфогексозы, основная роль ПФК, вероятнее всего, связана с синтезом фосфотриоз в

гликолитической последовательности. Однако примечательной особенностью Mm. alcaliphilum 20Z и других метанотрофов I и X типов является наличие двух путей распада С6-фосфосахаров - кроме гликолитического пути, у них функционирует путь Энтнера-Дудорова, приводящий к образованию глицеральдегид-ЗФ и пирувата. Присутствие ПФК обеспечивает обратимость реакций одного из этих путей -гликолитической последовательности, а высокое сродство фермента к ФБФ и отсутствие аллостерических эффекторов свидетельствуют о том, что направленность реакций зависит от концентраций субстратов и продуктов. Поэтому очевидна роль фермента в регуляции необходимого для клетки соотношения фосфотриоз и фосфогексоз.

Mm. alcaliphilum 20Z способен расти при высоких концентрациях NaCl, аккумулируя в качестве одного из осмопротекторов сахарозу, синтез которой происходит с образованием ФФн. Присутствие в геноме метанотрофа гена, кодирующего ФБФазу, указывает на возможность функционирования футильного цикла, в котором сопряженное действие ФБФазы и ПФК может осуществлять сток ФФн, активно образуемого в условиях повышенной осмолярности среды.

У метанотрофов II типа первичными продуктами серинового пути Ср ассимиляции являются С3-соединения, что предполагает участие ПФК преимущественно в глгоконеогенезе. С такой ролью фермента согласуется более высокое сродство ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ к ФБФ, чем к субстрату прямой реакции - Фр-6-Ф. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ - уникальный фермент, поскольку, в отличие от большинства исследованных ФФн-зависимых ФФК, ингибируется АДФ и АМФ, причем, в большей степени в направлении глюконеогенеза. Следовательно, поток углерода на биосинтез углеводных компонентов замедляется в условиях пониженного энергетического статуса клеток, при этом важную регуляторную роль играет ПФК.

У метанотрофа X типа Мс. capsulatus Bath, реализующего одновременно РМФ-, РБФ- и сериновый пути, первичными продуктами биосинтеза являются Сз- и Сб-соединения. Для ПФК Мс. capsulatus Bath аллостерические эффекторы не найдены, поэтому следует ожидать, что фермент участвует в регуляции внутриклеточной концентрации фосфотриоз и фосфогексоз. Поскольку в хромосоме данного метанотрофа отсутствует ген, кодирующий ФБФазу, ПФК у Мс. capsulatus Bath -единственный фермент, катализирующий взаимопревращение ФБФ и Фр-6-Ф.

Примечательной особенностью ПФК Мс. capsulatus Bath является в 103 раз более высокая специфичность и более высокая активность с С-7-Ф, чем с Фр-6-Ф. Следовательно, фермент у данного метанотрофа является 7-фосфоседогептулозокиназой (табл. I и 2). У Мс. capsulatus Bath функционирует цикл Кальвина, в котором реакция фосфорилирования С-7-Ф является важной стадией восстановительного пентозофосфатного цикла, ведущего к регенерации РБФ -

акцептора С02. Ген pfp, кодирующий ПФК, филогенетически «родственную» ПФК Мс. capsulatus Bath, обнаружен также у группы автотрофных протеобактерий (рис. 4). Напротив, у Mm. alcaliphilum 20Z и М. methanica 12, реализующих только РМФ цикл, ПФК имеет лишь следовую активность с С-7-Ф, и близок по аминокислотной последовательности ферментам гетеротрофных микроорганизмов, для которых доказана функция ПФК в гликолизе.

Способность ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodularis ORS 2060 фосфорилировать С-7-Ф также коррелирует с наличием в геномах этих метилотрофов генетических элементов цикла Кальвина. Так у Mb. nodularis ORS 2060 присутствуют два гена, кодирующие большую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы (РубисКО) и ген предполагаемой фосфорибулокиназы (ФРК), хотя активность РубисКО в грубом экстракте не обнаружена (Капаруллина и др., 2011). В геноме Ms. trichosporium ОЬЗВ имеется ген, кодирующий ФРК, но отсутствуют гены для большой и малой субъединиц РубисКО. Указанные данные согласуются с гипотезой о том, что автотрофные и метилотрофные бактерии имеют общее происхождение. При этом Мс. capsulatus, реализующий одновременно три пути Ci-ассимиляции, рассматривается в качестве аналога «Розеттского камня» (Whittenbury, 1981), дающего ключ к расшифровке феномена метилотрофии в целом. Очевидно, гены, кодирующие ферменты для некоторых метаболических путей, были утеряны в процессе дивергентной эволюции и специализации их углеродного метаболизма.

Нами обнаружено, что у Мс. capsulatus Bath гены, кодирующие ПФК и Н+-транслоцирующую мембрансвязанную пирофосфатазу (Н+-ФФн-азу), находятся в одном опероне pfp-hpp. Можно полагать, что ФФн - продукт реакции, катализируемой ПФК, гидролизуется мембранной Н+-ФФн-азой. При этом, благодаря создаваемому протонному градиенту, синтез АТФ становится возможным в обход дыхательной цепи. Более того, BLAST анализ выявил наличие гена hpp во всех секвенированных геномах метанотрофов, что указывает на участие ФФн и ПФК в энергетическом метаболизме этих бактерий.

Анализ геномов выявил у метанотрофов ген пируват-фосфатдикиназы (ПФДК), которая катализирует синтез АТФ из АМФ за счет энергии и фосфора ФЕП и ФФн. Два ФФн-зависимых фермента, ПФК и ПФДК, могут обеспечить полностью обратимый ФФн-зависимый гликолиз, ранее описанный у анаэробных бактерий и амитохондриальных простейших (Slamovits, Keeling, 2006). Присутствие генетических основ для функционирования ФФн-зависимого гликолиза у метанотрофов коррелирует с микроаэрофильной природой этих бактерий, у которых лишь первая стадия окисления субстрата - окисление метана, облигатно зависит от кислорода. Реутилизация энергии ФФн, очевидно, дает метанотрофам преимущество, позволяя выживать в неблагоприятных условиях дефицита кислорода (и метана) за счет эндогенных

резервных соединений, что ранее было показано на примере Ms. trichosporium ОВЗЬ (Roslev, King, 1995). Таким образом, для метанотрофов характерна эффективная реутилизация ФФн - побочного продукта анаболических реакций, что отличает эту специализированную группу бактерий от большинства микроорганизмов, расщепляющих ФФн высокоактивной растворимой неорганической пирофосфатазой с диссипацией энергии данного макроэрга.

Ярким примером связи ПФК с анаэробиозом является функционирование этого фермента у Mb. nodularis ORS 2060. Присутствие ПФК у не растущих на метане метилобактерий является скорее исключением, чем правилом. Mb. nodulans ORS 2060 -ризосферный метилотрофный фитосимбионт, жизненный цикл которого включает стадию бактероида, существующего в клубеньках бобового растения за счет продуктов фотосинтеза (Renier et al., 2011). Для процесса азотфиксации, осуществляемого бактероидами в анаэробных условиях, требуется большое количество АТФ. В этом случае переключение углеводного метаболизма на ФФн-зависимый гликолиз -наиболее эффективный способ получения энергии для азотфиксации. Анализ представленных в DataBase геномов выявил, что ПФК Mb. nodulans ORS 2060 наиболее близка по первичной последовательности ферменту из других (неметилотрофных) фитосимбионтов, что подтверждает его важную роль в фитосимбиозе бактерий.

Несмотря на отличия в свойствах и возможной роли, метилотрофные ПФК (за исключением актиномицета A. methanolica) филогенетически принадлежат к двум подгруппам II типа ФФК - «Р», включающую в основном гетеротрофов и бактерий-фитосимбионтов, и «В2», представленную автотрофными и гетеротрофными микроорганизмами. ПФК Мс. capsulatus Bath (y-proleobacteria) и Ms. trichosporium ОВЗЬ (a-proteobacteria) из подгруппы «В2» имеют лишь 34% идентичности аминокислотных последовательностей и значительно отличаются по своим биохимическим свойствам, что указывает на гетерогенность этой подгруппы ФФК. Ферменты Mb. nodulans ORS 2060 (a-proteobacteria) и Mm. alcaliphilum 20Z (y-proteobacteria) являются представителями подгруппы «Р», проявляют между собой 60% гомологии, но также обладают низким сходством биохимических свойств. Между ферментами подгрупп «Р» и «В2» имеется всего 12-16% идентичности. Полученные результаты дают основание сделать вывод, что в эволюции ПФК имел место не только «неупорядоченный» латеральный перенос генов (Bapteste et al., 2003), но также специализация фермента к определенному типу метаболизма бактерий.

выводы

1. Впервые очищены и охарактеризованы рекомбинантные пирофосфат-зависимые 6-фосфофруктокиназы облигатных метанотрофов Methylococcus capsulatus Bath, Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylosinus trichosporium OB3b (ПФК-Hisr,) и факультативного метилотрофа Methylobacterium nodularis (ПФК).

2. ПФК Mc. capsulatus Bath - гомодимер (2><45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фоефат (Кт каж 0,03 мМ, Ктах 31 Е/мг белка), фруктозо-б-фосфат (Кт каж 2,27 мМ, Гтах 7,6 Е/мг белка) и рибулозо-5-фосфат {Кт кш 4,05 мМ), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие фермента в гликолизе, глюконеогенезе и в регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата в минорном цикле Кальвина.

3. Установлено, что ген р/р, кодирующий ПФК Mc. capsulatus Bath, котранскрибируется с геном hpp, кодирующим предполагаемую Н+-транслоцирующую пирофосфатазу V-типа, что указывает на участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме метанотрофа.

4. Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза Mc. capsulatus Bath - гомогексамер (6x40 кДа), обратимо катализирует расщепление фруктозо-1,6-бисфосфата и седогептулозо-1,7-бисфосфата, не имеет аллостерических эффекторов. Предположено, что ФБА совместно с ПФК регулирует соотношение С6, С5 и С3 интермедиатов в клетках метанотрофа.

5. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z - гомотетрамер (4x45 кДа), высокоактивна и специфична в направлении глюконеогенеза (Áfm К0Ж11'['"6'Ф 0,64 мМ, Fmax 577 Е/мг белка; Кт кaж'1>в'1, 0,095 мМ, Утах 805 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие ПФК в гликолизе и глюконеогенезе Mm. alcaliphilum 20Z и регуляции внутриклеточного уровня ФФн.

6. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ - гомогексамер (6x45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (А'т ш 0,51 мМ, V^ 85 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Кт каж 0,24 мМ, Гп,„ 88 Е/мг белка), ингибируется АМФ и АДФ. Предположено участие ПФК преимущественно в глюконеогенезе.

7. ПФК Mb. nodulans ORS 2060 - гомотетрамер (4x45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Кт каж 0,21 мМ, Кти 46,6 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Кт кш< 0,65 мМ, Утах 786,9 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предполагается, что фермент играет важную роль при гетеротрофном росте метилотрофа в анаэробных условиях фитосимбиоза.

8. На основании филогенетического анализа и выявленных различий в биохимических свойствах ПФК постулировано, что, наряду с «неупорядоченным» горизонтальным переносом гена р/р, происходила адаптация ПФК к специализированному метаболизму метанотрофов и некоторых метилобактерий.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1) Reshetnikov A.S., Rozova O.N., Khmelenina V.N., Mustakhimov I.I., Beschastny A.P., Murrell J.C., Trotsenko Y.A. Characterization of the pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase from Methylococcus capsulatus Bath. FEMS Microbiol. Lett. 2008. V. 288(2), P. 202-10.

2) Бесчастный А.П., Хмеленина B.H., Розова O.H., Троценко Ю.А. Активности 6-фосфофруктокиназ и неорганической пирофосфатазы у аэробных метилотрофных бактерий. Микробиология. 2008. Т. 77, № 5, с. 713-715.

3) Розова О.Н., Хмеленина В.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С., Троценко Ю.А, Характеристика рекомбинантной фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы Methylococcus capsulatus Bath, Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 1014-1022.

4) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Vuilleumier S„ Trotsenko Y.A. Characterization of the recombinant pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase from halotolerant methanotroph Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 2010. Research. Microbiol.V. 161, P. 861-868.

5) Khmelenina V.N., Rozova O.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the recombinant pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinases from Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and Methylococcus capsulatus Bath. Methods Enzymol. 2011. V. 495, P. 1-14.

Тезисы:

1) Розова ОН., Мустахимов И.И., Решетников А.С. Пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа Methylomonas methanwa 12 и Methylococcus capsulatus Bath. Ill Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2007, с. 97.

2) Розова ОН., Мустахимов И.И., Решетников А.С, Пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа Methylococcus capsulatus Bath. VI Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2008, с. 220.

3) Розова О.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С. Свойства и роль рекомбинантной пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы термотолерантного облигатного метаноторфа Methylococcus capsulatus Bath. I Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008». Казань, КГУ, 2008, с. 27.

4) Rozova O.N., Reshetnikov A.S., Mustakhimov I.I., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Properties of the pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase from Methylococcus capsulatus Bath. The 3rd International Congress of Microbiologist FEMS 2009. Sweden, Gothenburg.

5) Розова О Н. Пирофосфатзависимая фосфофруктокиназа и ее роль в метаболизме облигатных метанотрофов, 14 Международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2010, с. 58.

6) Розова ОН. Роль пирофосфатзависимой 6-фосфофрукгокиназм в метаболизме метанотрофов I и X типов. III Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2010». Нижний Новгород, ННГУ, 2010, с. 27.

7) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A.. PPi-dependent 6-phosphofructokinases from two methanotrophs, halotolerant Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and thermotolerant Methylococcus capsulatus Bath. 8th International Congress on Extremophiles. Azores, Ponta-Delgada. 2010, p. 283.

8) Розова O.H., Хмеленина B.H., Троценко Ю.А. Роль пирофосфат-зависимых ферментов у облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Тула, ТулГУ, 2010, с. 40.

9) Хмеленина В.Н., Розова О.Н., Троценко Ю.А. Функции пирофосфат-зависимой 6-фосфофруктокиназы в метаболизме аэробных метанотрофов: факты и гипотезы. 4-ый научный симпозиум «Автотрофные микроорганизмы», посвященный памяти ак. РАН, Е.Н. Кондратьевой (1925-1995), и приуроченный к 80-летию биологического факультета МГУ. Москва. 2010, с. 111.

10) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Multifunctional pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase (PPi-PFK) in the metabolism of aerobic methylotrophic bacteria The 4th International Congress of Microbiologist FEMS 2011. Geneva, Switzerland.

Подписано в печать:

26.10.2011

Заказ № 6117 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Розова, Ольга Николаевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа.

1.1. Свойства и метаболическая роль ПФК.

1.2. Характеристика ПФК метилотрофных бактерий.

1.3. Структурный анализ ПФК.

1.4. Классификация и филогенетический анализ ФФК.

1.5. Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза.

Глава 2. Характеристика аэробных метилотрофных бактерий.

2.1. Энергетический метаболизм.

2.2. Конструктивный метаболизм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Культивирование бактерий.

3.2. Выделение геномной ДНК.

3.3. Выделение плазмидной ДНК.

3.4. Выделение РНК.

3.5. Определение стартовой точки транскрипции методом удлинения праймера.

3.6. ОТ-ПЦР анализ.

3.7. Нозерн-блот анализ.

3.8. Получение компетентных клеток и их трансформация.

3.9. Клонирование и экспрессия геновр/р я/Ьа.

3.10. Выделение рекомбинантных белков аффинной металлхелатной хроматографией.

3.11. Измерение активности ПФК.

3.12. Измерение активности ФБА.

3.13. Определение субъединичного состава белков и молекулярной массы субъединиц.

3.14. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ.

3.15. Определение нативной массы белка с помощью гель-фильтрации.

3.16. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

3.17. Аналитические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Характеристикарекомбинантных ПФК и ФБА Methylococcus capsulatus Bath.

4.1. Клонирование гена pfp и очистка ПФК-HiSô.

4.2. Характеристика рекомбинантной ПФК.

4.3. Изучение транскрипционной организации pfp и hpp генов.

4.4. Клонирование гена fba и очистка ФБА-Шэб.

4.5. Характеристика рекомбинантной ФБА.

4.6. Изучение транскрипции гена fba.

4.7. Филогенетический анализ ФБА.

4.8. Роль ПФК и ФБА в метаболизме Methylococcus capsulatus Bath.

Глава 5. Характеристика рекомбинантной ПФК Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

5.1. Клонирование гена pfp и очистка ПФК-HiSô.

5.2. Характеристика рекомбинантной ПФК.

5.3. Роль ПФК в метаболизме Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

Глава 6. Характеристика рекомбинантных ПФК Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodularis ORS 2060.

6.1. Клонирование генов pfp и очистка рекомбинантных ПФК.

6.2. Характеристика рекомбинантных ПФК.

6.3. Роль ПФК в метаболизме Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodularis ORS 2060.

Глава 7. Филогенетический анализ ПФК метилотрофных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий"

Актуальность проблемы. Углеводный метаболизм многих организмов основан на гликолизе, функционирующем во всех трех доменах — Bacteria, Archaea и Eiikarya. У большинства из них ключевую стадию этого пути — фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата катализирует аллостерически регулируемая АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (АТФ-ФФК). У архей эту реакцию осуществляет АДФ-зависимый фермент из семейства глюкокиназ, не проявляющий сходства аминокислотной последовательности с 6-фосфофруктокиназами (ФФК), но имеющий аналогичную кристаллическую структуру (Sakuraba, Ohshima, 2002; Ronimus, Morgan; 2001; Ito et al., 2001). Однако у ряда про- и эукариот - фототрофных бактерий (Rhodospirillum rubrum), анаэробов, паразитических микроорганизмов (Treponema pallidum, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis), Euglena gracilis, а также высших растенийг присутствует пирофосфат-зависимая- 6-фосфофруктокиназа (ПФК), гомологичная по первичной аминокислотной' последовательности АТФ-ФФК. Реакция, катализируемая ПФК, обратима, что предполагает участие фермента как в гликолизе, так и глюконеогенезе: Фруктозо-6-Ф + ФФН < " Фруктозо-1,б-Ф2 + Фн

Причины и следствия замены АТФ на ФФн в ключевой реакции гликолиза неясны. Предложены альтернативные гипотезы, рассматривающие присутствие ПФК как проявление "ископаемого метаболизма", который сохранился в качестве рудимента у небольшого числа организмов, или, напротив, ПФК могли возникнуть из АТФ-зависимых ферментов под давлением условий обитания, и это приобретение явилось адаптивным приспособлением к анаэробным условиям (Bapteste et al., 2003; Siebers et al., 1998; Chi, Kemp, 2000).

Ранее ПФК была обнаружена у аэробных метанотрофов - специализированной группы бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии (Шишкина, Троценко, 1990; Trotsenko, Shishkina, 1990; Бесчастный и др., 1992). Считалось, что ПФК нехарактерна для« не растущих на метане метилобактерий, что указывало на ее возможную связь с метаболизмом метана, за исключением актиномицета Amycolatopsis methanolica, растущего на метаноле (Alves et al., 1994; 1996; 2001). Однако недавно в геномах Methylibium petroleiphiliim PMI (Капе et al., 2007) и ризосферных фитосимбионтов Methylobacterium nodulans ORS 2060 и Methylobacteriiim sp. 4-46 найдены гены-гомологи ПФК.

Метанотрофы и метилобактерии ассимилируют углерод метана и метанола посредством двух альтернативных циклических путей - рибулозомонофосфатного (РМФ) метанотрофы I типа) или серинового (II тип), в которых первичными продуктами биосинтеза являются, соответственно, Сб-фосфосахара или Сз-соединения. Кроме того, метилобактерии могут ассимилировать углерод метанола через цикл Кальвина после окисления до СО2. Особую группу представляют метанотрофы X типа, реализующие одновременно три пути С i-ассимиляции — РМФ, сериновый и минорный цикл Кальвина, где в числе первых продуктов образуются Сб- и Сз-соединения. Как следствие, у метилотрофов с различными путями первичного С i-метаболизма значение гликолиза в биосинтезе фосфотриоз или фосфогексоз различно, что обусловило их перспективность для сравнительного изучения функциональной роли ПФК и ФФн. Доступность нуклеотидных последовательностей геномов облигатных метанотрофов Methylomicrobium alcäliphilum 20Z (I тип), Methylococcus capsulatus Bath (X тип), Methylosinus trichosporium ОВЗЬ (II тип) и факультативной метилобактерии Methylobacterium nodularis ORS 2060 позволила нам использовать основанную на клонировании современную методологию очистки рекомбинантных ПФК для последующей характеристики и филогенетического анализа.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - изучить свойства и роль ПФК в метаболизме метанотрофов и метилобактерий, реализующих различные пути С1-метаболизма. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК и фруктозобисфосфатальдолазы (ФБА) из Methylococcus capsulatus Bath.

2. Изучение организации кластера (возможности котранскрипции) генов pfp и hpp в> хромосоме Мс. capsulatus Bath.

3. Очистка и характеристика рекомбинантной ПФК из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

4. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК из Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodularis ORS 2060.

5. Проведение филогенетического анализа ПФК.

Научная новизна. Обнаружено, что ПФК Мс. capsulatus Bath, кроме фруктозо-6-фосфата (Фр-6-Ф), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (С-7-Ф) и рибулозо-5-фосфат (Py-5-Ф), проявляя наиболее высокое сродство и активность с С-7-Ф, и имеет наибольшее сходство аминокислотной последовательности с ортологами из хемолитоавтотрофных бактерий. Предложена схема модифицированного цикла Кальвина с участием ПФК в реакциях восстановительного пентозофосфатного пути. Впервые установлено, что у Мс. capsulatus Bath гены pfp и hpp, кодирующие ПФК и мембранную Н+-транслоцирующую пирофосфатазу, транскрибируются в виде бицистронной мРНК, на основании чего предположено участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Выявлено, что ФБА Мс. capsulatus Bath обратимо катализирует расщепление как фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ), так и седогептулозо-1,7-бисфосфата (СБФ).

Доказано, что ПФК Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивна в направлении гликолиза и глюконеогенеза, но неэффективна в реакции с С-7-Ф. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodularis ORS 2060 проявляют более высокое сродство к ФБФ, чем к Фр-6-Ф, что указывает на преимущественное участие данных ферментов в глюконеогенезе. Найдено, что ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ ингибируется АМФ и АДФ; что подразумевает участие фермента в регуляции синтеза и распада углеводов в зависимости от энергетического статуса клеток. Индуцибельность ПФК при росте Mb. nodularis ORS 2060 на арабинозе и более высокое сродство с С-7-Ф, чем с Фр-6-Ф, указывают на специфическую функцию фермента при использовании Сахаров в анаэробных условиях фитосимбиоза.

Установлено, что ПФК Мс. capsulatus Bath и Ms. trichosporium ОВЗЬ проявляет наибольшее сходство с ортологами хемолитоавтотрофов и принадлежит к филогенетической подгруппе «В2» группы II 6-фосфофруктокиназ. Ферменты Mm. alcaliphilum 20Z и Mb. nodulans ORS 2060 отнесены к 6-фосфофруктокиназам филогенетической подгруппы «Р», для большинства которых доказана гликолитическая функция.

Научно-практическое значение. Благодаря высокой активности и стабильности, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z может быть использована в аналитической биохимии как специфический. реагент для определения, ФБФ в качестве сопрягающего фермента при измерении скорости реакции альдольной конденсации, катализируемой ФБА, а также для измерения скорости образования ортофосфата или пирофосфата. Уникальная способность ПФК Мс. capsulatus Bath обратимо фосфорилировать С-7-Ф может найти применение в синтезе СБФ и С-7-Ф.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробных метилотрофов» (№ Госрегистрации 01.20.0403398)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН и ИБ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Решетникову A.C., к.б.н. Бесчастному А.П., Глухову A.C., а также Соболевой Т.А. за предоставленную плазмиду pHUE. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 ссылок, из них 16 на русском и 181 на английском языках, содержит 11 таблиц и 41 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Розова, Ольга Николаевна

выводы

1. Впервые очищены и охарактеризованы рекомбинантные пирофосфат-зависимые 6-фосфофруктокиназы облигатных метанотрофов Methylococcus capsulatus Bath, Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylosinus trichosporium OB3b (IIOK-Hise) и факультативного метилотрофа Methylobacterium nodularis (ПФК).

2. ПФК Mc. capsulatus Bath - гомодимер (2x45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Кт каж 0,03 мМ, Vmax 31 Е/мг белка), фруктозо-б-фосфат (Кт каж 2,27 мМ, Vmax 7,6 Е/мг белка) и рибулозо-5-фосфат (Кт каж 4,05 мМ), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие фермента в гликолизе, глюконеогенезе и в регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата в минорном цикле Кальвина.

3. Установлено, что ген pfp, кодирующий ПФК Mc. capsidatus Bath, котранскрибируется с геном hpp, кодирующим предполагаемую Н4"-транслоцирующую пирофосфатазу V-типа, что указывает на участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме метанотрофа.

4. Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза Mc. capsulatus Bath - гомогексамер (6x40 кДа), обратимо катализирует расщепление фруктозо-1,6-бисфосфата и седогептулозо-1,7-бисфосфата, не имеет аллостерических эффекторов. Предположено, что ФБА совместно с ПФК регулирует соотношение Сб, С5 и Сз интермедиатов в клетках метанотрофа.

5. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z - гомотетрамер (4x45 кДа), высокоактивна и специфична в направлении глюконеогенеза (Кт кажфр'6"ф 0,64 мМ, Утах 577 Е/мг белка; Кт кажФБФ 0,095 мМ, Vmax 805 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие ПФК в гликолизе и глюконеогенезе Mm. alcaliphilum 20Z и регуляции внутриклеточного уровня ФФн.

6. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ - гомогексамер (6x45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Кт каж 0,51 мМ, Vmxx 85 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Кт каж 0,24 мМ, Vmax 88 Е/мг белка), ингибируется АМФ и АДФ. Предположено участие ПФК преимущественно в глюконеогенезе.

7. ПФК Mb. nodulans ORS 2060 - гомотетрамер (4x45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Кт каж 0,21 мМ, Vmax 46,6 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Кт каж 0,65 мМ, Vmax 786,9 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предполагается, что фермент играет важную роль при гетеротрофном росте метилотрофа в анаэробных условиях фитосимбиоза.

8. На основании филогенетического анализа и выявленных различий в биохимических свойствах ПФК постулировано, что, наряду с «неупорядоченным» горизонтальным переносом гена pfp, происходила адаптация ПФК к специализированному метаболизму метанотрофов и некоторых метилобактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ информации, имеющейся в Database, свидетельствует о том, что наличие

ПФК у микроорганизмов, как правило, коррелирует с отсутствием или дефектами в механизмах аэробного синтеза АТФ в дыхательной цепи. Так, у анаэробных бактерий и амитохондриальных простейших ПФК катализирует одну из основополагающих реакций модифицированного ФФн-зависимого гликолиза, который) более эргономичен, по сравнению с классической гликолитической последовательностью (5 молекул АТФ вместо i

2) (Slamovits, Keeling, 2006).

Анализ секвенированных геномов выявил pfp гены, кодирующие ПФК, у всех аэробных метанотрофов, окисляющих СН4 мембранной метанмонооксигеназой (мММО), за исключением филогенетически обособленной группы термоацидофильных метанотрофов рода Methylacidiphilum (М. infernorum,'М. kamchatkensis, М. fumariolicum).

Окисление метана с участием мММО происходит на ЦМ и ВЦМ и сопряжено с потреблением кислорода, а также энергии в виде восстановленных цитохромов, поэтому составляет конкуренцию синтезу АТФ в реакциях окислительного фосфорилирования. Использование метанотрофами ФФн в качестве фосфорильного донора в ряде метаболических превращений — один из путей экономии АТФ и решения данной биоэнергетической проблемы.

Сравнительные исследования свойств ПФК у различных метанотрофов выявили многофункциональную роль фермента в центральном метаболизме углерода у этих бактерий. У метанотрофов I типа (Мт. а1саИрЫ1ит 20Т), ассимилирующих углерод метана на уровне формальдегида в РМФ-цикле, где в качестве первичных продуктов образуются фосфогексозы, основная роль ПФК, вероятнее всего, связана- с синтезом фосфотриоз в гликолитической последовательности. Примечательной особенностью Мт. а1саИрЫ1ит 20Ъ и других метанотрофов I и X типов является-наличие двух путей распада Сб-фосфосахаров - кроме гликолитического пути, у них функционирует путь Энтнера-Дудорова, приводящий к образованию глицеральдегид-ЗФ и пирувата. Обратимость реакции, катализируемой^ ПФК, высокое сродство фермента к ФБФ и отсутствие аллостерических эффекторов свидетельствуют о том, что направленность реакции зависит " от концентраций субстратов/продуктов, поэтому очевидна роль фермента в регуляции необходимого для клетки соотношения фосфотриоз и фосфогексоз.

Мт. а1саИрЫ1ит способен расти при высоких концентрациях ИаС1, аккумулируя в* качестве одного из осмопротекторов сахарозу, синтез которой сопряжен с образованием ФФн. Присутствие А>р гена, кодирующего ФБФазу, указывает на возможность функционирования» футильного цикла, осуществляющего сток дополнительно образуемого ФФн.

У метанотрофов II типа первичными продуктами серинового пути С1-ассимиляции являются* Сг- и Сз-соединения, что предполагает участие ПФК преимущественно в глюконеогенезе. С такой ролью фермента согласуется более высокое сродство ПФК Му. Мскояропит ОВЗЬ к ФБФ, чем к субстрату прямой реакции - фруктозо-бФ. ПФК Мя. Мскоьропит ОВЗЬ — уникальный фермент, поскольку, в отличие от большинства исследованных аналогов, ингибируется АДФ и АМФ, причем, в большей степени в направлении глюконеогенеза. Следовательно, поток углерода на биосинтез углеводных компонентов замедляется в условиях пониженного энергетического статуса клеток, при этом важную регуляторную роль играет ПФК.

У Мс. сарБиШт ВаЙг, реализующего одновременно РМФ-, РБФ- и сериновый пути, первичными продуктами биосинтеза являются Сз- и Сб-соединения. Для ПФК Мс. capsulatus Bath аллостерические эффекторы не найдены, поэтому следует ожидать, что ключевая роль ПФК в С i-метаболизме связана с регуляцией внутриклеточной концентрации фосфотриоз и фосфогексоз. Поскольку в хромосоме данного метанотрофа отсутствует ген, кодирующий ФБФазу, ПФК у Мс. capsulatus Bath - единственный •> фермент, катализирующий взаимопревращение ФБФ и Фр-6-Ф. о

Примечательной особенностью ПФК Мс. capsulatus Bath является в 10 раз более высокое сродство и более высокая активность с С-7-Ф, чем с Фр-б-Ф. Следовательно, фермент у данного метанотрофа скорее является 7-фосфоседогептулозокиназой (табл. 9, 11). У Мс. capsulatus Bath функционирует минорный цикл Кальвина, в котором реакция фосфорилирования С-7-Ф является важной стадией восстановительного пентозофосфатного сегмента, ведущего к регенерации РБФ — акцептора С02. Ген pjp, кодирующий ПФК, филогенетически «родственную» ферменту Мс. capsulatus Bath, обнаружен нами также у группы автотрофов (рис. 41). Напротив, у Mm. alcaliphilum 20Z и М. methanica 12, реализующих только РМФ-цикл, ПФК имеет лишь следовую активность с С-7-Ф и близка по первичной последовательности гликолитическим- ферментам гетеротрофов, для которых доказана функция ПФК.

Ранее способность фосфорилировать С-7-Ф была выявлена у ПФК амитохондриального простейшего Entamoeba histolytica (Susskind et al., 1982), при этом Km каж для1 С-7-Ф была всего в два раза выше, чем для Фр-6-Ф. ПФК факультативного анаэроба P. freudenreichii и золотистой фасоли Phaseolus aureus также катализировали реакцию с Суфосфосахаром, однако, с очень низкой активностью (Bertagnolli et al., 1986). Способность фосфорилировать С-7-Ф показана нами у ПФК из Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060, а также из пропионовокислой бактерии Pr. acnes КРА171202.

Однако, как правило, активность (или специфичность) фермента с С-7-Ф ниже, чем с Фр-б-Ф. По-видимому, способность фосфорилировать С-7-Ф является общим свойством всех ПФК, утраченным вместе с потерей цикла Кальвина или зависящим от особенностей их метаболизма.

Нами доказано, что у Мс. capsulatus Bath гены, кодирующие ПФК и транслоцирующую мембрансвязанную пирофосфатазу (Н+-ФФн-азу), находятся в одном опероне hpp-pfp. Можно полагать, что ФФн - продукт реакции, катализируемой ПФК, гидролизуется мембранной Н+-ФФн-азой. При этом, благодаря создаваемому протонному градиенту, синтез АТФ! становится возможным в обход дыхательной цепи. Более того, BLAST анализ выявил наличие гена hpp во всех секвенированных геномах метанотрофов, что указывает на участие ФФн и ПФК в энергетическом метаболизме этих бактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Розова, Ольга Николаевна, Пущино

1. Бесчастный А.П., Соколов А.П., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (1992) Очистка и некоторые свойства пирофосфат-зависимой фосфофруктокиназы облигатного метанотрофа Methylomonas methanica 12. Биохимия. Т. 57. № 8. С. 1215-1221.

2. Гальченко В.Ф., Андреев Л.В'. и Троценко Ю.А. (1986) Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино: Изд. НЦБИ, С. 1-96.

3. Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС 500 с.

4. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. (1984) Уровни ассимиляции углекислоты у бактерий с различными путями Сi-метаболизма. Микробиология. Т.53. № 6. С. 885-889.

5. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Осипов Г.О., Лысенко A.M.", Троценко Ю.А. (2004) Новые1 термофильные метанотрофы рода Meth.yloca.ldum. Микробиология. М. 73. №4. С. 448-456.

6. Капаруллина E.H., Быкова Т.В., Федоров Д.Н:, Доронина Н.В., Троценко Ю:А. (2011)« Метаболизм метанола у ризосферного фитосимбионта methylobacteriiim- nodularis. Микробиология. Т. 80. №6. с.847-849.

7. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. (1979) Карбоксилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. //Микробиология. Т.42. №2. с.202-207.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.- (1986) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М.: Мир-480'с.

9. Решетников A.C., Мустахимов И.И., Хмеленина В.Н., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. (2005) Идентификация и клонирование гена, кодирующего пирофосфатзависимую 6-фосфофруктокиназу из Methylomonas methanica. Докл. АН. Т. 405. С. 468-470.

10. Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Романовская В.А. (1981) Цепь транспорта электронов у термофильной метанокисляющей культуры Methylococcus thermophilus. Микробиология. Т. 50. №Г. С. 3-29.

11. Троценко Ю.А., Четина Е.В. (1988) Энергетический метаболизм метилотрофных бактерий. Успехи микробиологии. Т.22. С.3-34.

12. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. (2010) Аэробные метилобактерии.111

13. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН- 325 с.

14. Троценко > Ю.А., Хмеленина В.Н. (2008) Эстремофильные метанотрофы. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН 206 с.

15. Четипа Е.В., Троценко Ю.А. (1986) Активность окислительного фосфорилирования в мембранах метилотрофных бактерий. Микробиология. Т.55. № 4. с.539-5421

16. Шишкина В.Н., Троценко- Ю.А. (1986) Уровни ассимиляции углекислоты, метанотрофньши бактериями. Микробиология: Т.55. № 3. G.377-382.

17. Anderson: R.E., Sabularse:D:G. (1982) Inorganic pyrophosphate: D-iructoseT6-phosphate 1-phosphotransferase from mung bean: Methods Enzymol. V. 90? Pi 9Г-97.

18. Anthony С. (1992) The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenases^ Int: J. Biochem. V. 24. P. 29-39. Г

19. Baker R.T., Catanzariti A.-M., Karunasekara Y., Soboleva.T.A., Sharwood R., Whitney S., Board.P: (2005) Using deubiquitylating; enzymes as research tools. Methods Enzymol. V.398: P. 540-554.

20. Bapteste E., Moreira D., Philippe H. (2003) Rampant horizontal gene transfer and phospho-donor change in the evolution of the phosphofructokinase. Gene. V. 318: P. 185-191.

21. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L., Kovacs K.L., Embley T.M., Prosser J.I., Murreil J.C.2002) The ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase gene cluster ofMethylococcus capsulatus (Bath): Arch: Microbiol. V. 177. P. 279-289.

22. Belouski E., Watson D.E., Bennett G.N. (1998) Cloning,- sequence, and expression of the phosphofructokinase: gene of Clostridium acetobutylicum ATCG 824 in Escherichia coli. Curr. Microbiol; V. 37. P. 17-22.

23. Bencini' D;A.,- Wild J:R:, O'Donovant G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of orthophosphate. Anal; Biochem. V. 132. P: 254-258:;

24. Berg I.A. (20 IT) Ecological aspects of the distribution of differentiautotrophic GÖ2fixatiolir pathways. Appl. Environ; Microbiol. V: 77(6). P. 1925-1936.

25. Bertagnolli B.L., Youriathan E.S., Voll R.J., Pittman C.E., Cook P.F. (1986) Carbohydrate; substrate specificity of bacterial and plant pyrophosphate:dependent phosphofructokinases. Biochemistry. V. 25. P. 4674-4681. • . '

26. Bruchhaus I., Jacobs T., Denart Mi, Tannich E. (1996) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase of Entamoeba histolytica: molecular cloning, recombinant; expression and inhibition by pyrophosphate analogues. Biochem. J. V. 316. P. 57 63.

27. Carnal N.W., Black.C.C. (1983) Phosphofructokinase activities in photosynthetic organisms: the occurrence of pyrophosphate-dëpendent 6-phosphofructokinase in plants and algae. Plant Physiol. V. 71. № 1. P. 150-155.

28. Chistoserdova L., Vorholt J.A, Thauer R.K., Lidstrom M.E. (1998) Ci transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic and methanogenic archaea. Science. V. 281. P. 99-102.

29. Chistoserdova L., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E. (2009) The expanding world of methylotrophic metabolism. Annu Rev. Microbiol. V. 209. P. 477-499;

30. Chi A., Kemp R.G. (2000) The primordial high energy compound: ATP or .inorganic pyrophosphate? J: Biol. Chem. V. 275. P: 35677-35679.

31. Chi A. S., Deng Z., Albach R. A., Kemp R. G. (2001) The two phosphofructokinase gene products of Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. V. 276. P. 19974-19981. •.

32. Chomczynski P., Sacchi N. (1987) Single step of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Anal; Biochem.V. 162. P. 156-159:

33. Dalton H. (1992) Methane: oxidation by methanotrophs: physiological; and mechanistic implications. In Methane and Methanol utilizers . Eds. Murreir J.C. and Dalton II., Plenum Press, New York. P. 85-114.

34. Dedysh S.N., Knief C., Dunfield P.F. (2005) Methylocella species are facultatively methanotrophic. J. Bacteriol. V. 187. P. 4665^670.

35. De Motigny C., Sygusch J. (1996)t Functional characterization of an extreme thermophilic class II fructose-1,6-bisphosphate aldolase. Eur. J. Biochem. V. 241. P. 243-248.

36. Deng Z., Huang M., Singh K., Albach R.A., Latshaw S.P:, Chang K.-P., Kemp R.G. (1998) Cloning» and expression of the gene for the active PPi-dependent phosphofructokinase of Entamoeba histolytica. Biochem. J. V. 329. P. 659-664.

37. Deng Z., Roberts D., Wang X\, Kemp R.G. (1999) Expression, characterization, and crystallization of the pyrophosphate-dependent phosphofructo-1 -kinase of Borrelia burgdorferi. Arch. Biochem. Biophys. V. 371. P. 326-331.

38. Deng-Z.*, Wang X., Kemp R.G. (2000) Site directed mutagenesis of the fructose 6-phosphate binding site of the pyrophosphate-dependent phosphofructokinase of Entamoeba histolytica. Arch. Biochem. Biophys. V. 380. P. 56-62.

39. Ding Y.-H.R., Ronimus R.S., Morgan H.W. (1999) Purification and properties of the pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Dictyoglomus thermophilum*Rt46 B'.l. Extremophiles. V. 3. P.' 131-137.

40. Ding Y.-H.R., Ronimus R.S., Morgan H.W. (2001) The phosphofructokinases of Thermotoga maritima', expression and characterisation of two unique enzymes. J. Bacteriol. V. 183. Pi 791-794.

41. DiSpirito A.A., Zahn J.A., Bergmann D.J., Boyd J.M., Kunz R. (2001) Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus Bath. J. Bacteriok V. 183. P. 6832-6840.

42. Ertunga N.S., Colak A., Belduz A.O., Canakci S;, Karaoglu H:, Sandalli C. (2007) Cloning, expression, purification: and characterization of fructose-1,6-bisphosphate aldolase from Anoxybacillusgonensis G2. J. Biochem. V. 141. P; 817-825.

43. Ferenci T., Stroem T., Quayle J.R. (1974) Purification and properties; of 3-hexulose phosphate synthase and; phospho-3-hexuloisomerase- from Methylococcus capsulatus. Biochem. J. V. 144. P. 477-486.

44. Grammel H;, Gilles-E.-D., GKoshiRv (2003) Microaerophilic; cooperations of reductive and." oxidative pathways allows maximali photosynthetic membrane; biosynthesis- in : Rhodospirillum rubrum; App\. Environ. Microbiol. V. 69. Pi 6577-6586:. "

45. Green L., Prior Dalton H:. (1985) Copper ions as inhibitor of protein C-of ; soluble metKane^monoxygenase' of Methylococcus .-'capsulatus-- (Bath).- Eur;. J:Biochemf.:V.:.153;; Pi 137-144: : ■ ,:

46. Green L., Dalton H: (1986) Steady-state kinetic analysis of soluble methane mono-oxygenase from Methylococcus capslatus (Bath): Biochem. J. V. 236. P. 155-162:

47. Green P.C., Trijpathi; R.L., Kemp R.G. (1993) Identification of active site: residues in pyrophosphate-dependent phosphofhxcto-l-kinase by site-directed mutagenesis; J. Biol. Chem. V. 268: P. 5085-5088.

48. Groenewald J.H., Botha; F.C. (2008) Down-regulation of: pyrophosphate: fructose 6-phosphate: 1-phosphotransferase (PFP)'activity in sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internodes. Transgenic. Res. V. 17. P. 85-92.

49. Hannaert V., Saavedra E., Duffieux F., Szikora J.P., Rigden DJ., Michels P.A., Opperdoes F.R. (2003) Plant-like traits associated with metabolism of Trypanosoma parasites. Proc. Natl. Acad. Sei. USA V. 100. P. 1067-1071.

50. Hanson R.S., Hanson T.E. (1996) Methanotrophic bacteria. Microbiol. Rev. V.60. №2. P.439-471.

51. Heinonen J.K., Honkasalo S.H., Kukko E.I. (1981) A method for the concentration, for the colorimetric determination of nanomoles of inorganic pyrophosphate. Anal. Biochem. V. 117. P. 293-300.

52. Henze K., Morrison H.G., Sogin M.L., Mueller M. (1998) Sequence and phylogenetic position of a class II aldolase gene in the amitochondriate protist, Giardia lamblia. Gene. V. 222. P. 163-168.

53. Horecker B.L. (2002) The pentose phosphate pathway. J. Biol. Chem. V 277. №. 47. P. 965-971.

54. Huang M., Albach R.A., Chang K.-P., Tripathi R. L., Kemp R.G. (1995) Cloning and sequencing a putative pyrophosphate-dependent phosphofructokinase gene from Entamoeba histolytica. Biochim. Biophys. Acta. V. 1260. P. 215-217.

55. Ito S., Fushinobu S., Yoshioka I., Koga S., Matsuzawa H., Wakagi T. (2001) Structural basis for the ADP-specificity of a novel glucokinase from a hyperthermophilic Archaeon. Structure. V. 9. P. 205-214.

56. Joergensen L. (1985) Methane oxidation by Methylosinus trichosporium measured by membrane-inlet mass spectrometry. In: Microbial gas metabolism. Ed. Pool R.K and Dow C.S., Acad. Press, London. P. 287-295.

57. Kato N., Yurimoto H., Thauer R.K. (2006) The physiological role of ribulose monophosphate pathway in bacteria and archaea. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 70. P. 1021.

58. Kemp R.G., Gunasekera D. (2002) Evolution of the allosteric ligand sites of mammalian phosphofructo-1-kinase. Biochemistry. V. 41. P. 9426-9430.

59. Korotkova N., Chisterdova L., Kuksa V., Lidstrom M.E. (2002) Glyoxylate regeneration pathway in the methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. V. 184. P. 1750-1758.

60. Korotkova N., Lidstrom M.E., Chisterdova L. (2005) Identification of genes involved in the glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AMI, including two new genes, meaC and meaD. J. Bacteriol. V. 187. P. 1523-1526.

61. Kovacs G., Sorvari S., Scott P., Toldi O. (2006) Pyrophosphate:fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase operates in net gluconeogenic direction in taproots of cold and drought stressed carrot plants. Acta Biol. Szeged. V. 50. P. 25-30.

62. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V. 227. P. 680-685.

63. Lees V., Owens N.J.P., Murrell J.K. (1991) Nitrogen metabolism in marine methanotrophs. Arch. Microbiol. V. 157. P.60-65.

64. Li Y.L., Rivera D., Ru.W., Gunasekera D., Kemp R.G. (1999) Identification of allosteric sites in rabbit phosphofructo-1-kinase. Biochemistry. V. 38. P. 16407-16412.

65. LI Z., Phillips N.F. (1995) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Giardia lamblia: purification and characterization. Protein Expr. Purif. V. 6: P: 319-328.

66. Loftus B:, Anderson I., Davies R., Aismark U.G.M., et al., 50 coauthors (2005) The genome of the protist parasite Entamoeba histolytica. Nature. V. 433; P. 865-868.

67. Lopez C., Chevalier N., Hannaert-V., Rigden D.J., Michels P.A., Ramirez J.L. (2002) Leishmania donovani phosphofructokinase. Gene characterization,* biochemical properties and structure-modeling studies. Eur;JlBiochem; V. 269; P. 3978^-3989;

68. Mertens E. (1991) Pyrophosphate-dependent phosphofhictokinase, an'anaerobic glycolytic enzyme? FEBS Lett. V, 285; P. 1-5.

69. Mertens E. (1993) ATP versus pyrophosphate: glycolysis revisited in parasitic protists. Parasitology Today. V. 9. P. 122-126.

70. Mertens E., De Jonckheere J., Van* Schaftingen E. (1993) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from the amoeba Naegleria fowleri, an AMP-sensitive enzyme. Biochem. J. V. 292. P.797-803.

71. Michels P.A., Chevalier N. Opperdoes F.R., Rider M.H., Rigden D.J. (1997) The glycosomal ATP-dependent phosphofructokinse of Trypanosoma brucei must have evolved from an ancestral pyrophosphate-dependent enzyme. Eur. J. Biochem. V. 250. P. 698-704.

72. Mitsui R., Kusano Y., Yurimoto H., Sakai Y., Kato N., Tanaka M. (2003) Formaldehyde fixation contributes to detoxification for growth of a nonmethylotroph, Burkholderia cepacia TM1 on vanillic acid. Appl. Environ. Microbiol. V. 69. P. 6128-6132.

73. Mony B.M., MehtaM., Jarori G.K., Sharma S. (2009) Plant-like phosphofructokinase from Plasmodium falciparum belongs to a novel class of ATP-dependent enzymes. Int. J. Parasitol. V. 39. P. 1441-1453.

74. Morton J.D., Hayes K.F., Semrau J.D. (2000) Effect of copper speciation on whole-cell soluble methane monooxygenase activity in Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. P. 1730-1733.

75. Moore S.A., Ronimus R.S., Roberson R.S., Morgan H.W. (2002) The structure of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Structure (Camb.). V. 10. P. 659-671.

76. Mueller M., Lee J. A., Gordon P., Gaasterland T., Sensen C.W. (2001) Presence of prokaryotic and eukaryotic species in all subgroups of the PPi-dependent group II phosphofructokinase protein family. J. Bacteriol. V. 183. P. 6714-6716.

77. Murrell J.C, Dalton H. (1983) Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. J. Gen. Microbiol. V. 129. P. 3481-3486.

78. Murrell J.C., McDonald I.R., Gilbert B. (2000) Regulation of expression of methane monooxygenases by copper ions. Trends Microbiol. V. 8(5). P. 21-225.

79. Mustroph A., Albrecht G., Hajiresaei M., Grimm B., Biemelt S. (2005) Low levels of pyrophosphate in transgenic potato plants expressing E. coli pyrophosphatase lead to decreased vitality under oxygen deficiency. Ann. Bot. V. 96. V. 717-726.

80. Nakahara К., Yamamoto H., Miyake, G., Yokota A. (2003) Purification and characterization of class-I and class-II fructose-1,6-bisphosphate aldolases from the cyanobacteriumSynechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. V. 44. P. 326-333.

81. Nguyen H.H., Elliott S.J., Yip J.H., Chan S.I. (1998) The particulate methane monooxygenase. from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper-containing three-subunit enzume; Isolationand characterization.- J: Biol. Chem. V.273. P: 7957-7966.

82. Nielsen A.K., Gerdes K., Murrell J.Ci (1997). Copper-dependent reciprocal transcriptional regulation of methane monooxygenase genes iъ Methylococcus capsulatus andMethylosinus trichosporium. Mol.Microbiol.V. 25. P. 399-409.

83. OakleyC.J;, Murrell; J.C. (1988) nifH genes in the obligate-methane oxidizing bacteria. HEMS Microbiol. Lett. V. 49. P. 53-57.

84. O'Brien W. E., Bo win S., Woods Hi G. (1975) Isolation and: characterization of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase fvomPropionibacteriumshermanii.i. Biol. Chem. V. 250: P. 8690-8695. • !

85. Pelzer-Reith!B;, Wiégand S;, Schnarrenberger C.I. (1994) Plastid class I and cytosol class Il aldolase of Euglena gracilis. Plant(Physiol. V. 106. P. 1137-1144.

86. Peng Z.-Y., Mansour Т.Е. (1992) Purification and properties of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Toxoplasmagondii.Mol. Biochem. Parasitol. V. 54. P*223.230.

87. Pfleiderer G., Klemme J.H. (1980) Pyrophosphate-dependent D-fructose-6-phosphate-phosphotransferase in Rhodospirillaceae. Z. Naturforsch. V. 35. P: 229-238.

88. Phillips N.F.B;, Li Z., Lindmark D.G. (1997) Isolation of a pyrophosphate-dependentphosphofructokinase from Hexamita inflata, Mol. Biochem. Parasitol. V. 90. P. 377-380.

89. Pollack J.D., Williams M.V. (1986) PPi-dependent phosphofructotransferase (phosphofructokinase) activity in the mollicutes (mycoplasma) Acholeplasma laidlawii. J. Bacterid. V. 165. P. 53-60.

90. Poorman R.A., Randolf A., Kemp R.G., Heinrikson R.L. (1984) Evolution of phosphofructokinase gene-duplication and creation of new effector sites. Nature. V. 309. P. 467-469.

91. Quayle J.R., Ferenci T. (1978) Evolutionary aspects of autotrophy. Microbiol. Rev. V. 42. P. 251-273.

92. Reese M.G. (2001) Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila melanogaster genome. Comput. Chem. V. 26. P. 51-56.

93. Reeves R. E., Serrano R., South D. J. (1976) 6-Phosphofructokinase (pyrophosphate). Properties of the enzyme from Entamoeba histolytica and its reaction mechanism. J. Biol. Chem. V. 25l.P. 2958-2962.

94. Reeves R. E., South D. J., Blytt H. J. Warren L. G. (1974) PyrophosphaterD-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase. A new enzyme with the glycolytic function of 6-phosphofructokinase. J. Biol. Chem. V. 249. P. 7737-7741.

95. Renier A., De Faria S.M., Jourand P., Giraud E., Dreyfus B., Rapior S., Prin Y. (2011) Nodulation of Crotalaria podocarpa DC by Methylobacterium nodulans displays very unusual features. J. Exp. Botany. Mar 21 doi:10.1093/jxb/err083.

96. Roberson R.S., Ronimus R.S., Gephard S., Morgan, H.W. (2001) Biochemical characterization of an active pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Treponema pallidum. FEMS Microbiol. Lett. V. 194. P. 257-260.

97. Rogers M„ Keeling P. (2004) Lateral transfer and recompartmentalization of Calvin cycle enzymes of plants and algae. J. Mol. Evol. V. 58. P. 367-375.

98. Ronimus R.S., Morgan H.W., Ding Y.-H.R. (1999) Phosphofructokinase activities within the order Spirochaetales and the characterisation of the phosphofructokinase from Spirochaeta thermophila. Arch. Microbiol. V. 17. P.401-406.

99. Ronimus R.S., Morgan H.W. (2001) The biochemical properties and phylogenies of phosphofructokinases from extremophiles. Extremophiles. V. 5. P. 357-373.

100. Roslev P., King G.M. (1995) Aerobic and anaerobic starvation metabolism in methanotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. P. 1563-1570.

101. Sakuraba H., Ohshima T. (2002) Novel energy metabolism in anaerobic hyperthermophilic archaea: a modified Embden-Meyerhof pathway. J. Bacterid. V. 93. P. 441-448.

102. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 3rd ed Cold Spring-Harbor Laboratory, New-York:

103. Sato T., Atomi-H., Imanaka T. (2007) Archaeal type III RuBisCOs function in a pathway for AMP metabolism. Science. V. 315. P. 1003-1006.

104. Say R.F., Fuchs G. (2010) Fructose 1,6-bisphosphate aldolase/phosphatase may be an, ancestral gluconeogenic enzyme. Nature. V. 464. P. 1077 — 1081.

105. Semrau J.D., DiSpirito A.A., Yoon< S. (2010) Methanotrophs and copper., FEMS Microbiol. Rev. V. 34. P. 496-531.

106. Shacterle G.R., Pollack R.L. (1973) A simplified method for quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem. V. 51. P. 654-657.

107. Schirmer T., Evans P.R. (1990) Structural basis of the allosteric behavior of phosphofructokinase. Nature. V. 343. P. 140-145.

108. Shirakihara Y., Evans P.R. (1988) Crystal structure of the complex of phosphofructokinase from Escherichia coli with its reaction products. J. Mol. Biol. V. 204. P. 973-994.

109. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1979) Pathways of ammonia assimilation in obligate methane utilizers. FEMS Microbiol. Lett. V.5. P.l87-191.

110. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1982) Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V.13. P. 237-242.

111. Siebers B., Klenk H.P., Hensel R. (1998) PPi-dependent phosphofructokinase from Thermoproteus tenax, an archaeal descendant of an ancient line in phosphofructokinase evolution. J. Bacteriol. V. 180. P. 2137-2143.

112. Slamovits C.H., Keeling P.J. (2006) Pyruvate-phosphate dikinase of oxymonads and parabasalia and the evolution of pyrophosphate-dependent glycolysis in anaerobiceukaryotes. Eukaryot. Cell. V. 5. P. 148-154.

113. Slater G.G. (1969) Stable pattern formation and determination of molecular size by porelimit electrophoresis. Anal. Chem. V. 41. P. 1039-1041.

114. Smith T.J., Slade S.E., Buron N.P., Murrell J.C., Dalton H. (2002) Improved system for protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V.68. P. 5268-5273.

115. Stechmann A., Baumqartner M., Silberman J.D., Roqer A.J. (2006) The glycolytic pathway of Trimastixpyriformis is an evolutionary mosaic. BMC Evol. Biol. Y. 23. P. 101118.

116. Stitt M. (1990) Fructose 2,6-bisphosphate as a regulatory metabolite in plants. Annu Rev. Plant Physiol. V. 41. P. 153-185.

117. Stitt M. (1998) Pyrophosphate as an alternative energy donor in the cytosol of plant cells: an enigmatic alternative to ATP. Bot. Acta. Y. 111. P. 167-175.

118. Stroem T., Ferenci T., Quayle J.R. (1974) The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium OB3B during growth on methane. Biochem. J. V. 144. P. 465-472.

119. Susskind, B.M., Warren.L.G., Reeves. R.E. (1982) A pathway for the interconversion of hexose and pentose in the parasitic amoeba Entamoeba histolytica. Biochem. J. V. 204. P. 191-196.

120. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and volutionl 0.1093/molbev/msm092.

121. Theodorou M.E., Plaxton W.C. (1996) Purification and characterization of pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from phosphate-starved Brassica nigra Suspension Cells.

122. Plant Physiol. V. 112. P. 343-351.

123. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. (1997) The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. V. 24. P. 4876-4882.

124. Tjaden B., Plagens A., Dorr C., Siebers B., Hensel R. (2006) Phosphoenolpyruvate synthetase and pyruvate, phosphate dikinase of Thermoproteus tenax: key pieces in the puzzle of archaeal carbohydrate metabolism. Mol. Microbiol. V. 60. P. 287-298.

125. Tripodi K.E.J., Podesta F.E. (1997) Purification and structural and kinetic characterization of the pyrophosphate: fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase from the Crassulacean acid metabolism plant, pineapple. Plant Physiol. V. 113. P. 779-786.

126. Trotsenko Y.A. (1983) Metabolic features of methane- and methanol-utilizing bacteria. Acta Biotechnol. V.3. P.301-304.

127. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Govorukhina N.I. (1986) Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria. FEMS Microbiol.Lett. V.33. P. 293-297.

128. Trotsenko Y.A., Shishkina V.N., Govorukhina N.I., Sokolov A.P. (1987) Biochemical basis for obligate methylotrophy and obligate autotrophy: comparative aspects. Winogradsky Symp. on Lithoautotrophy. P. 26.

129. Trotsenko Y.A., Shishkina V.A. (1990) Studies on phosphate metabolism in obligate methylotrophs. FEMS Microbiol. Rev. V. 87. P. 267-271.

130. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N., Beschastny A.P. (1996) The Ribulose Monophosphate (Quayle) cycle: News and Views. Proc. Int. Symp. Microbial Growth on Ci compounds. Eds: M.E. Lidstrom, R.Tabita, Kluwer Publishers. P. 4-8.

131. Trotsenko Y.A. Murrell J.C. (2008) Metabolic aspects of obligate aerobic methanotrophy. Adv. App. Microbiol. V. 63. P. 183-229.

132. Turner W.L, Plaxton W.C. (2003) Purification and characterization of pyrophosphate- and ATP-dependent phosphofructokinases from banana fruit. Planta V. 217. P. 113-121.

133. Van den Bergh E.R.E., van der Kooij T.A.W, Dijkhuizen L., Meijer W.G. (1995) Fructosebisphosphatase isoenzymes of the chemoautotroph Xanthobacter jlavus. J. Bacteriol. V. 177. P. 5860-5864.

134. Verhees C.H., Tuininga J:E., Kengen W.M., Stams S.M., J. van der Oost, W.M; de Vos. (2001) ADP-dependent phosphofructokinses in mesophilic and thermophilic methanogenic Archea. J. Bacteriol. V. 12. P: 7145-7153.

135. Vorholt J. A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., ThauerR.K. (1998) The N ADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AML J.Bacteriol: V.180: P.5351-5356?

136. Vorholt J;A. (2002) Cofactor-dependent pathways of formaldehyde, oxidation in methylotrophic bacteria. Arch; Microbiol: V;178i P: 239-49;

137. Wang X., Deng Z., Kemp R.G. (1998) An essential methionine residue involved in substrate binding by phosphofructokinases; Biochem. Biophys.,Res. Gommun. V. 250. P.' 466-468;

138. Wang X., Kemp R.G. (1999) Identification of residues of Escherichia coli phosphofructokinase that contribute to nucleotide binding and specificity. Biochemistry. V. 38. P. 4313-4318. .

139. Whittaker: A., Botha- F.G. (1997) Carbons partitioning during; sucrose' accumulation; in sugarcane internodali;issue. PlantsPhysioh V. 115: P. 1651-1659t

140. Whittaker A., Botha F.G. (1999) Pyrophosphate: D-fructose-6-phosphate 1: phosphotransferase activity patterns in relation to sucrose storage across sugarcane varieties: Physiol. Plant. V. 107. P. 379-386.

141. Whittenbury R. (1981) The interrelationship of autotrophy and methylotrophy as seen in Methylococcus capsulatus (Bath). Ed Dalton H. Int Symp; Microbial growth on Gj compounds. W&G Baird Ltd. P. 181-190.

142. Wong J.H., Kiss F., Wu M.X., Buchanan, B.B. (1990) Pyrophosphate fhictose-6-p'1-phosphotransferase from tomato fruit: evidence for change during ripening. Plant Physiol: V.94. P. 499-506:

143. Wu L.-F., Reizer A., Reizer J., Gai B., Tomich J:M., Saier M.H.J. (1991) Nucleotide sequence of the capsulatus fruK gene, which encodes fructose-1-phosphate kinase: evidence for a kinase superfamily including both phosphofructokinases from

144. Escherichia coli. J. Bacterid. V. 173. P. 3117-3127.

145. Yasueda H., Kawahara K., Sugimoto S. (1999) Bacillus subtilis yckG and yckF encode two key enzymes of the ribulose monophosphate pathway used by methylotrophs, and yckH is required for their expression. J. Bacteriol. V.181. P. 7154-7160.

146. Yimga T.M., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., Liesack W. (2003) Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl. Environ. Microbiol. V. 69. P. 5593-602.

147. Yoch D.C., Chen Y.P., Hardin M.G. (1990) Formate dehydrogenase from the methane oxidizer Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V.172. P. 4456-4463.

148. Yuan X.H., Kwiatkowska D., Kemp R.G. (1988) Inorganic pyrophosphate: fructoses-phosphate 1-phosphotransferase of potato tuber is related to the major ATP-dependent phosphofructokinase of E. coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 154. P. 113-117.

Информация о работе

Розова, Ольга Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Свойства и роль пирофосфат-зависимых 6-фосфофруктокиназ у аэробных метанотрофов и метилобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы