Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica

Бесчастный, Александр Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica"

На правах рукописи

БЕСЧАСТНЫЙ АЛЕКСАНДР ПАВЛОВИЧ

СВОЙСТВА И РОЛЬ ПИРОФОСФАТЗАВИСИМОЙ 6-ФОСФОФРУКТОКИНАЗЫ МЕТНУЮМОУЛЯ МЕТПАМСА

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в лаборатории радиоактивные изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю. А. Троценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т. В. Кулаковская

доктор биологических наук, профессор Р. Н. Ивановский

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится « 20 » декабря 2006г. в && час на заседании Диссертационного совета Д002.066.01 в Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адрес}': 142290, Московская область г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2006г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Бактерии, использующие метан в качестве источника углерода и энергии (метанотрофы), вносят существенный вклад в круговорот углерода и азота биосферы. Метанотрофы представляют потенциальный интерес для производства кормового белка и различных полезных продуктов, а так же биодеградации, биотрансформации алифатических и ароматических поллютантов, снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов [Малашенко с соавт., 1978, 1993; Murreil, Dalton, 1992; Гальченко, 2001; Троценко с соавт., 2006].

40 лет назад классические исследования Квейла в Шеффилдском университете (Англия) привели к открытию нового метаболического пути - рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции формальдегида у метанотрофов. Первые две реакции данного цикла катализируют специфические ферменты 3-гексулозофосфатсинтаза (ГФС) и фосфо-3-гексулоизомераза (ФГИ) с образованием фруктозо-6-Ф. Предполагалось, что последующее фосфорилирование фруктозо-6-Ф катализирует АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ФФК), являясь регуляторной стадией РМФ цикла. Однако факт очень низкой (2-8 мЕ/мг белка) активности ФФК у метанотрофов ставил под сомнение реальность и значимость гликолитического варианта РМФ цикла. Наличие небольшой активности ферментов пути Энтнера-Дудорова у данных бактерий привело к модификации схемы РМФ цикла, которая учитывала одновременное функционирование двух путей регенерации первичного акцептора формальдегида (рибулозо-5Ф). Это позволяло считать проблему «замкнутости» РМФ цикла условно решенной [Ström et al., 1974]. Однако обнаружение активности пирофосфатзависимой б-фосфофруктокиназы (ПФК) и высокой внутриклеточной концентрации пирофосфата (ФФн) у облигатных метаноторофов [Шишкина, Троценко, 1990; Trotsenko, Shishkina, 1990] реанимировало интерес к изучению особенностей организации и регуляции РМФ цикла и, в частности, специфической роли ПФК в Ci-метаболизме данных бактерий, что требовало экспериментальной проверки. Кроме того, изучение свойств ПФК облигатных метанотрофов важно для понимания структурно-функционального разнообразия и эволюции данного фермента.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы — определить свойства и роль ПФК в метаболизме облигатного метанотрофа Methylomonas methanica 12. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Определить активности ФФн- и АТФ- зависимой 6-фосфофруктокиназы, а также пирофосфатазы у аэробных метилотрофных бактерий различных таксономических групп.

2. Исследовать влияние условий культивирования на активность и локализацию ПФК, пирофосфатазы (ФФн-азы) и щелочной фосфатазы (ЩФ) у М, methanica 12. .

3. Выделить и изучить свойства ПФК и пирофосфатазы М. methanica 12. , ,. _

4. Идентифицировать и ссквснировать генpfk, кодирующий ПФК М. methanica 12.

Научная новизна. Установлено, что высокая активность ПФК сопровождается низкой активностью ФФн-азы и отсутствием ФФК у облигатных метанотрофов I, И и X типов. Напротив, у не использующих метан метилобактерий разного таксономического положения, независимо от реализуемых путей С i-ассимиляции, активность ФФн-азы выше, а ПФК отсутствует. Исключением является факультативный метилотоф Amycolatopsis methanolica, обладающий небольшими активностями ПФК, ФФК и ФФн-азы.

Выявлено высокое содержание ФФц в клетках М. methanica 12 при различных условиях культивирования, даже на среде, дефицитной по фосфору, наряду с присутствием конститутивных ПФК и ФФн-азы, что доказывает участие ФФн не только в резервировании фосфата, но и в конструктивном и энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Найдена секретируемая ЩФ, индуцируемая дефицитом фосфора. Обнаружено, что активность ФФн-азы М methanica 12 локализуется в цитоплазме и в мембранах в разном соотношении в зависимости от условий роста клеток. Растворимая ФФц-аза М. methanica 12 впервые очищена до гомогенного состояния и охарактеризована. Получены доказательства регуляторной природы растворимой ФФн-азы (олигомерная структура, положительная кооперативность, низкое сродство к ФФн» а также активирующее действие Mg2+).

Иммуноцитохимическим методом обнаружено присутствие ПФК в ассоциированном виде наряду с равномерным распределением в цитоплазме клеток М. methanica 12. Впервые очищена и охарактеризована ПФК М. methanica 12, близкая по основным молекулярным свойствам аналогичным ферментам других микроорганизмов (кроме ПФК из A. methanolica), но отличающаяся наибольшей удельной активностью. Секвенирован ген pfk М. methanica 12, кодирующий белок с высокой степенью дивергенции относительно ПФК Methylococcus capsulatus Bath и A. methanolica, но близкой ферменту из Propionibacterium freudenreichii. Предложен новый вариант РМФ цикла, сопряженного с ПФК, что имеет принципиальное значение для понимания метаболической организации и эволюции метанотрофов.

Научно-практическое значение. Определены условия культивирования для максимального проявления активности и разработана схема очистки ПФК, что позволяет рассматривать М. methanica 12 в качестве эффективного продуцента данного фермента для определения ФФн. С использованием препарата ПФК разработан простой метод биосинтеза меченного 32[Р]ФФН для научных исследований. Установлена способность М. methanica 12 расти на ФФн, что может найти применение в процессах биосинтеза и биоремедиации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на симпозиумах «Рост микроорганизмов на Ci-соединениях» (Уорик, Англия, 1992; Сан-Диего, США, 1995), научных конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров" (Пущино, 1995), "Автотрофные микроорганизмы", посвященной памяти акад. E.H. Кондратьевой (МГУ, 1996) и отчетных

конференциях ИБФМ РАН.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Структурно-функциональное и таксономическое разнообразие аэробных метилотрофов» (№ Госрегистрации 01.20.0403398) и в рамках целевых конкурсных грантов РФФИ «Исследование роли неорганического пирофосфата в метаболизме аэробных метилотрофных бактерий» (95-04-12514а), «Экстремофильные аэробные метилотрофы: физиолого-биохимические особенности и филогения» (98-04-48144а), а также грантов Дж. Сороса «Pyrophosphate metabolism in aerobic methylotrophic bacteria» (NJ 2000 и NJ 2300).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б статей и 4 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы, включающего 270 ссылок, из них 37 на русском и 233 на английском языках, содержит 19 таблиц и 31 рисунок.

Экспериментальная часть

Объекты исследований. В большинстве экспериментов использовали культуру облигатного метанотрофа Methylomonas methanica штамм 12 ВКМ В-2109 [Гальченко с соавт., 1975]. В работе также использовали культуры облигатных метанотрофов и метилобактерий из коллекции ИБФМ РАН. Облигатных метанотрофов культивировали на среде «П» [Гальченко и др., 1986] на смеси метана с воздухом (1:1). Метилобактерий выращивали на среде «К» [Kaneda, Roxburgh, 1959] с метанолом (0,5 %, о/о) или метиламином (0,3%, в/о) в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на роторной качалке (180 об/мин) при 30°С. Периодическое и непрерывное культивирование А/. methanica 12 проводили в ферментере «Ultraferm 1601» (LKB, Швеция) объёмом 10 л [Гаязов и др., 1985]. При замене в средах ортофосфата на ФФн концентрацию фосфора оставляли неизменной. Клетки отделяли от среды центрифугированием, промывали буфером и хранили при -20°С.

Получение бесклеточных экстрактов Клетки суспендировали в буфере и разрушали с помощью пресса ИБФМ из замороженного состояния или ультразвуком на аппарате MSE. Гомогенаты клеток центрифугировали (12000 g, 20 мин), получая бесклеточные экстракты. При выделении ПФК клетки М. methanica 12 разрушали замораживанием — оттаиванием. При субклеточном фракционировании клетки инкубировали с лизоцимом в изотонической среде с последующим разрушением сферопластов осмотическим шоком [Mizushima et al., 1966].

Активность ферментов определяли по начальной скорости реакции спектрофотометрически при +30 ± 0,1°С. За единицу активности ферментов принимали количество, вызывающее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту. Активность ПФК (КФ

2.7.1.90) определяли в прямой и обратной реакциях непрерывным (с сопрягающими ферментами) и периодическим (по образованию Фн) методами [Bertagnolli, Cook, 1984]. АТФ-зависимую 6-фосфофруктокиназу (ФФК) (КФ 2.7.1.11) определяли, используя сопрягающие ферменты [Roberton, Glucina, 1982], неорганическую пирофосфатазу (КФ 3.6.1.1) и полифосфатазу (КФ 3.6.1.11) по образованию Фн [Кулаев, Коношенко, 1971], щелочную фосфатазу (КФ 3.1.3.1) по гидролизу />-нитрофенилфосфата [Torriani, 1960], НАДН-дегидрогеназу (КФ 1.6.99.3) и метанолдегидрогеназу (КФ 1.1.1.99) по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) [Scholes, Smith, 1968], НАД+-зависимую формиатдегидрогеназу (КФ 1.2.1.2) по восстановлению НАД1" [Johnson, Quayle, 1964].

Аналитические методы. Концентрацию ортофосфата определяли методом Бенцини [Bencini et al., 1983], пирофосфата - методом Хейнонена [Heinonen et al., 1981], полифосфаты определяли методом Кларка [Clark et al.,1986]. Концентрацию АТФ оценивали с помощью люциферин-люциферазы на сцинтилляционном счетчике как описано [Четина, Троценко, 1985]. Содержание общего белка определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951] и Бредфорда [Spector., 1978]. Включение [32Р]Фн в продукты реакции ПФК анализировали ТСХ на ПЭИ-целлюлозе. Меченые соединения определяли авторадиографией, радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике «Intertechnique SL-30» (Франция). Электронно-микроскопические исследования проводились к.б.н. Сузиной Н.Е. [Сузина, Фихте, 1986].

Очистка ферментов. Все процедуры очистки ферментов были разработаны нами и проводились при 4°С, если не указаны другие условия. ПФК М. methanica очищали, фракционируя экстракт полиэтиленгликолем, затем колоночной хроматографией на фосфоцеллюлозе и фенилсефарозе и повторной хроматографией на фосфоцеллюлозе. Очистку пирофосфатазы М. methanica 12 проводили, фракционируя экстракт сульфатом аммония, затем ВЭЖХ на фенилсефарозе и ДЭАЭ-Toyperl и далее на гидроксиаппатите.

Результаты

Распространение ПФК у аэробных метилотрофных бактерий. С момента открытия РМФ цикла у облигатных метанотрофов низкая активность АТФ-ФФК (2-8 мЕ/мг белка) рассматривалась как единственная и ключевая реакция ФБФ-варианта этого пути. Когда у облигатных метанотрофов впервые обнаружили высокую активность ПФК, одновременно наблюдали также низкую активность АТФ-ФФК [Троценко, Шишкина, 1990]. Однако присутствие у метанотрофов двух ферментов, катализирующих фосфорилирование фруктозо-бФ, причем один из них (ПФК) катализирует обратимую реакцию, казалось сомнительным, поскольку наблюдаемая активность АТФ-ФФК могла быть обусловлена активностью ПФК за счет примеси ФФн в препаратах АТФ и/или за счет его образования из АТФ в экстрактах.

Таблица 1. Активности ПФК, АТФ-ФФК н ФФН - азы у аэробных метилотрофных бактерий

Мети т об Источник Путь Активность (мЕ/мг белка)

етилотроф углерода С] - ассимиляции ПФК - АТФФФК ФФН -аза

Облигатные метанотрофы

Methylomonas methanica 12 ВКМ В-2109 СН4 РМФ (ФБФ+КДФГ) 750 0 40

Methylomonas methanica 68 ВКМ В-2110 СИ, РМФ (ФБФ+КДФГ) 480 0 14

Methylobacter chroococcum 90 ВКМ В-2115 . CR, РМФ (ФБФ+КДФГ) 240 0 15

Methylosinus trichosporium ОВЗЬ ВКМ В-2117 сн4 Сериновый (ИЩГ) по 0 60

Methylosirrus trichosporium 44 ВКМ В-2118 СН4 Сериновый (ИЩГ) 200 0 40

Methylocystis echinoides 2 ВКМ В-2128 СИ, Сериновый (ИЦЛ") 210 0 25

Methylococcus capsulatus Bath NCIMB 111 32 СИ, РМФ+РБФ+сериновыЙ 86 0 20

Methylococcus capsulatus 874 СН4 РМФ+РБФ+сериновый 60 0 10

Метилобактерии

Amycolatopsis methanolica NCIMB 11946 СНзОН РМФ (ФБФ) 35 6 17

Mycobacterium methylovorum 915 СНзОН РМФ (ФБФ) 0 24 1500

Pseudomonas esterophilus 27 RD В KM B-1736 метилацетат РМФ (ФБФ) 0 152 1700

Arthrobacter sp. 2B2 NCIMB 11344 СНзОН РМФ (ФБФ) 0 0 120

Mycobacterium vaccae СНзОН РМФ (ФБФ) 0 0 320

Ancylobacter aquäticus Z 238 СНзОН РМФ (ФБФ) 0 0 870

Bacillus methanolicus M40 СНзОН РМФ (ФБФ) 0 200 2600

Bacillus methanolicus Mil СНзОН РМФ (ФБФ) 0 329 1500

Bacillus methanolicus PM6 NCIMB 11342 ch3nh2 РМФ (ФБФ) 0 0 336

Arthrobacter globiformis ВКМ В - 175 ch3nh2 РМФ (ФБФ) 0 0 90

Arthrobacter globiformis ВКМ В - 175 глюкоза РМФ (ФБФ) 0 0 320

Acidomonas methanolica ВКМ B-2104 СНзОН РМФ (ФБФ) 0 26 396

Methylophilus methylotrophus "4" ВКМ B-1447 СНзОН РМФ (КДФГ) 0 0 530

Methylophilus methylotrophus "B"BKM B-16077 СНзОН РМФ (КДФГ) 0 0 314

Methylophilus methylotrophus NCIMB 10515 СНзОН РМФ (КДФГ) 0 0 443

Methylophaga marina ВКМ B-2056 СНзОН РМФ (КДФГ) 0 0 660

Xanthobacter autotrophicum 32П B-2069 СНзОН РБФ 0 0 280

Xanthobacter autotrophicum 25П B-2068 СНзОН РБФ 0 0 200

Methylopila capsulata ИМ1 ВКМ B-l 606 СНзОН Сериновый (ИЩГ) 0 0 270

Aminobacter aminovorans ВКМ B-2058 CH3NH2 Сериновый (ИЦЛ+) 0 0 212.

Hyphomicrobium zavarzinii ZV IFAM 580 СНзОН Сериновый (ИЦЛ +) 0 0 50

Escherichia coli Kl2 глюкоза 0 225 1200

Примечание: РБФ - рибулозо-1,5-бисфосфат, ФБФ - фруктозо-1,6-бисфосфат, КДФГ- 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглкжонат, ИЦЛ - изоцитратлиаза

Для проверки этого в инкубационную смесь при измерении активности АТФ-ФФК у облигатных метанотрофов вносили ФФн-азу пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Как оказалось, в присутствии дрожжевой ФФц-азы активность АТФ-ФФК у всех исследованных метанотрофов отсутствовала. Напротив, активность ПФК была обнаружена у всех метанотрофов (Табл. 1). Наибольшая удельная активность ПФК (до 750 мЕ/мг) выявлена у метанотрофов I типа с РМФ путем, тогда как у метанотрофов II типа, реализующих сериновый путь, активность ПФК в экстрактах гораздо ниже (до 200 мЕ/мг). Обратимость реакции ПФК и необходимость синтеза гексозофосфатов из триозофосфатов предполагают участие ПФК в глюконеогенезе у метанотрофов II типа. Наименьшие значения удельной активности ПФК (до 70 мЕ/мг) отмечены у метанотрофов рода Methylococcus (X тип), реализующих одновременно РМФ, РБФ и сериновый пути. Активность ФФн-азы в бесклеточных экстрактах облигатных метанотрофов была

значительно ниже (10-60 мЕ/мг), чем у большинства исследованных метилотрофов и контрольной культуры Е. coli К12, обладающей АТФ-ФФК [Josse, 1966; Blangy et al., 1968].

Среди исследованных нами факультативных метилобактерий, использующих гликолитический вариант РМФ цикла, активность ПФК (35 мЕ/мг белка), наряду с низкими активностями ФФн-азы и АТФ-ФФК, наблюдали при росте на метаноле только у Amycolatopsis methanolica. У большинства исследованных нами метилобактерий с РМФ циклом или сериновым путем активности ПФК или АТФ-ФФК не найдены. Активности ПФК и АТФ-ФФК отсутствовали также в бесклеточных экстрактах факультативных метилобактерий с РБФ-путем. При этом активность ФФн-азы была высокой. Только у Bacillus methanolicus М40 и Mil, а также Pseudomonas esterophilus sp. 27RD были найдены высокие активности АТФ-ФФК (150-350 мЕ/мг) и ФФн-азы (1,5-2,5 Е/мг). Таким образом, нами впервые показано, что присутствие ПФК характерно для специализированной группы аэробных метилотрофных прокариот, а именно, для облигатных метанотрофов. Единственным исключением являются актинобактерии рода Amycolatopsis.

Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФн-азы

Культивирование в присутствии экзогенного ФФн. Культивирование М. methanica 12 в режиме рН-ауксостата (без внешнего лимитирования) проводили для определения максимальной удельной скорости роста в присутствии Фн или ФФн. Скорость роста была максимальной при культивировании на среде с Фн и, напротив, минимальной на среде с ФФн в качестве единственного источника фосфора. В присутствии смеси ФФн и Фц (1:1 по фосфору) удельная скорость роста М. methanica 12 была несколько ниже, чем на среде с ортофосфатом (Таблица 2). Возможно, снижение скорости роста культуры на среде с ФФн было вызвано дефицитом Фн в клетках, возникающим из-за недостаточной скорости транспорта ФФн и/или его гидролиза пирофосфатзависимыми ферментами. Как было показано, транспорт ФФн в клетки некоторых бактерий может происходить с участием систем, ответственных за транспорт Фн, и сопровождаться выходом из клеток ортофосфата [Munk, Rosenberg, 1969; Villiotte et al., 1991]. Активность ЩФ была выше у клеток, выращенных на ФФц и при лимитировании Фн, что подтверждает дефицит Фн в клетках при культивировании на ФФн- Напротив, ЩФ не экспрессировалась, если культура росла на смеси Фн и ФФн, что свидетельствует о достаточном снабжении клеток фосфатом. В условиях хемостатного культивирования в клетках М. methanica 12, независимо от природы ' лимитирующего субстрата, обнаружены высокие концентрации ФФн и низкая активность ФФн-азы. Высокий уровень ПФК несколько уменьшался только при снижении скорости протока, что указывает на связь фермента с биосинтетическими процессами. При использованных условиях культивирования у метанотрофа выявлены также невысокие концентрации АТФ (1-2,5 мМ), причем изменения уровня АТФ не коррелировали с содержанием внутриклеточного ФФн.

Таблица 2. Уровни метаболитов и активности ферментов при различных условиях непрерывного культивирования в клетках М. methanica 12

Параметр Хемостат, лимитирование по рН-ауксостат

Фн СН4 nh4+ о2 о2 Фн ФФн фн + ффн

Удельная скорость роста, ч"1 0,156 0,155 0,154 0,150 0,07 0,356 0,270 0,33

Пирофосфат, мМ 18 16 20 16 20 24 67 68

АТФ, мМ 0,99 2,32 2,00 2,50 1,73 1,08 0,86 1,63

Ортофосфат, мМ 4 6 11 10 9 10 3 24

ПФК 3200 3500 3100 4000 2700 3400 4200 4900

Пирофосфатаза 20 11 3 12 2 11 23 10

Щелочная фосфатаза 12 2 2 2 — 2 12 2

Метаноддегидрогеназа (ФМС) 202 325 202 132 91 242 60 412

Формиатдегидрогеназа (ФМС) 287 468 187 112 117 144 400 250

Примечание: Активность ферментов выражена в мЕ/мг белка; — данные отсутствуют.

Рис. 1. Динамика роста М. methanica 12 в периодическом режиме на среде с добавлением ФФн. На верхнем графике приведены концентрации Фд и ФФн в среде.

При периодическом культивировании М. methanica 12 на минеральной среде, содержащей смесь ФФн (1,5 мМ) и Фн (0,75 мМ), происходило снижение концентрации ФФн и Фн в среде (Рис. 1). При этом содержание Фн в среде вновь возрастало к стационарной фазе. Поскольку

исходного количества Фн в среде было недостаточно для прироста биомассы (9,1 г сухих клеток/л), можно заключить, что культура использовала ФФн и Фц одновременно.

Рис. 2. Динамика роста М. тегИамса 12 в периодическом режиме на среде с ортофосфатом. На верхнем графике приведены концентрации ФФн в клетках.

При периодическом культивировании М. теЛатса 12 на среде с ортофосфатом (3,2 мМ) в клетках обнаружен ФФн, концентрация которого возрастала, достигая 9 мМ в пересчете на клеточную воду в стационарной фазе. Поскольку исходная среда не содержала ФФн, очевидно, что его образование связано исключительно с метаболизмом клеток. Культура, выращенная на среде, содержащей смесь ФФн и Фн, имела на 45% больший урожай биомассы (9,1 г сухих клсток/л) и достигала стационарной фазы за 16 ч. Напротив, в стандартной среде с Фн урожай не превышал 6,3 г/л, при этом культура достигала стационарной фазы за 24 ч (Рис. 1,2). Таким образом, ФФн, добавляемый в ростовую среду совместно с Фн в соотношении 2:1, стимулирует рост М. теМатса 12.

Обнаружены относительно низкие активности ФФц-азы и щелочной фосфатазы, которые были выше при культивировании клеток на среде в присутствии ФФн, чем на среде с ортофосфатом. При культивировании на среде с ФФн активность пирофосфатазы заметно возрастала (до 90 мЕ/мг) только в стационарной фазе. Активность щелочной фосфатазы имела максимум в середине экспоненциальной фазы, что коррелировало с наименьшим содержанием Фн в среде (Рис. 1). При

росте на среде с Фн активности этих ферментов практически не изменялись (Рис. 2). Высокий уровень и динамика активности ПФК были одинаковы при культивировании М. теЛатса 12 на средах с ФФн или Фн- Очевидно, роль этого фермента не связана с особенностями фосфорного снабжения данной культуры. Активность формиатдегадрогеназы (ФДГ) возрастала, а метанолдегидрогеназы (МДГ) снижалась у клеток, выращенных на среде с пирофосфатом по сравнению с их уровнями на среде с ортофосфатом. Так как функция данных ферментов связана с обеспечением метанотрофов энергией за счет окисления С) -субстратов, вероятно, это отражает изменения энергетического баланса в клетках, вызванных присутствием ФФн в среде.

Культивирование М. теЬкатса 12 при дефиците фосфата. Показано, что облигатные метанотрофы наряду с высокой концентрацией ФФн также накапливают полифосфаты, содержание которых в клетках зависит от концентрации фосфатов в среде [Тго^епко, БЫзЬкша, 1990]. Однако влияние дефицита Фн в среде на содержание и активности ферментов метаболизма ФФн у облигатных метанотрофов до сих пор не изучалось. Культивирование М. тегкатса 12 в условиях дефицита по ортофосфату проводили на среде "П", но вместо солей фосфатов добавляли 10 мМ НЕРЕБ-КОН рН7,2 и 10 мМ КаС1. Культура начинала расти после лаг-фазы (~1,5 ч), которая отсутствовала при росте М. теЛатса 12 на среде "П" и на среде с ФФн, достигая стационарной фазы к 23 ч. Рост сопровождался уменьшением внутриклеточного содержания Фн и ФФн, однако после 12 ч роста уровни Фн и ФФн не изменялись до конца культивирования (Рис.3А). Поскольку ФФн является субстратом ПФК, мы предполагаем, что М. те^тса 12 имеет механизмы, регулирующие внутриклеточную концентрацию ФФн. Очевидно, ФФн у М. те(1ютса 12 может также частично использоваться как резерв ортофосфата при дефиците фосфора в среде.

Активность ПФК по кривой роста была ниже (не более 500 мЕ/мг белка), чем у клеток М. те^тса 12, не лимитированных по Фн (до 4 Е/мг белка), что отражает изменения в основном метаболизме и соответствует низкой скорости роста данной культуры. Очевидно, некоторое уменьшение активности ПФК является следствием общего снижения интенсивности метаболизма в несбалансированных условиях роста культуры, но не результатом репрессии, вызванной дефицитом фосфора.

Активность ФФн-азы имела тот же уровень и динамику по кривой роста (Рис. ЗБ), как на среде с Фн (Рис. 2), т. е. не индуцировалась дефицитом Фн в среде. Учитывая, что растворимая ФФн-аза - конститутивный фермент, а концентрация ФФн в клетках М. те(катса 12 не достигает нулевого значения. даже при- фосфорном голодании, можно предположить, что именно пирофосфатаза у данных бактерий осуществляет регуляцию внутриклеточного уровня ФФн-

оп600

зо часы ОП600 з

15 20 ФФн-аза

Рис. 3. Внутриклеточное содержание Фн и ФФН (А) и активности ферментов (Б) М. теЛатса 12 на среде "П", дефицитной по ортофосфату

25 30 часы ^— ПолиФн-аза

Известно, что микроорганизмы обладают неспецифическими фосфатазами, которые экспрессируются при дефиците фосфора [Тогпаш, 1960]. Анализ ЩФ М. теЖатса 12 показал, что между 5 и 6 ч культивирования активность возросла относительно первоначальной (0,26 мЕ/мг белка) на порядок (2,3 мЕ/мг белка) и сохранялась на этом уровне (Рис. ЗБ).

Присутствие ФФн-азы и ЩФ у лимитированных и нелимитированных по фосфору клеток доказывают зимограммы бесклеточных экстрактов М. теЛатса 12 (Рис. 4). Активность щелочной

фосфатазы у нелимитированных по Фн клеток присутствовала в виде одной полосы (практически на линии старта), тогда как у клеток, росших при дефиците Фн, проявлялась дополнительная полоса. В то же время активность ФФн-азы присутствовала у лимитированных и нелимитированных клеток в виде одной формы и значительно отличалась по электрофоретической подвижности от ЩФ. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии индуцибельных форм растворимой ФФн-азы, а также о том, что у М. теЖатса 12 активности ЩФ и ФФн-азы представлены различными

12 12

ФФ„-аза ЩФ

Рис. 4. Нативный электрофорез белками. Причем ни одна из полос, соответствующих ЩФ, не

экстрактов клеток М.теМатса проявлялась при инкубации геля с ФФН. 12, нелимитированных (1) и лимитированных по Ф„ (2)

Анализ содержания полифосфатов показал, что. фракции высокомолекулярных полифосфатов ПФ2 и ПФЗ после 28 ч культивирования уменьшились в 2 и 3 раза, соответственно, по сравнению с "нулевой" точкой, тогда как содержание низкомолекулярных полифосфатов (фракция ПФ1) увеличилось на 30% (Табл. 3). При этом общее содержание полифосфатов в клетках уменьшилось вдвое, при этом активность экзополифосфатазы (1,8 мЕ/мг белка) не возрастала (Рис. ЗБ). Таким образом, у М. теЛатса 12 при росте на среде без фосфатов высокомолекулярные полифосфаты могут являться не только источником Фн, но и низкомолекулярных ПФ.

Таблица 3. Содержание полифосфатов в клетках М. теЛапка 12 при культивировании на среде, лимитированной по фосфору (мг/г сухих клеток)

Фракция Время отбора пробы, ч

0 28

ПФ1 1,03 1,34

ПФ2 11,8 5,66

ПФЗ 3,53 1,18

Сумма 16,4 8,18

Внутриклеточная локализация ФФн-зависимых ферментов М. теОмшса 12

Учитывая, что клетки М. те&атса 12 имеют развитую систему внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ), участвующих в С]-окислении и энергетике [Четина, Троценко, 1981; Четина и др., 1988], представлялось логичным исследовать распределение основных ферментов метаболизма ФФн в растворимой и нерастворимой (мембраной) фракциях. Сферопласты получали с использованием лизоцима в присутствии 1 мМ ЭДТА и без него.

В присутствии ЭДТА максимальная удельная активность ПФК (1,6 Е/мг белка) обнаружена в цитоплазме, тогда как в периплазме и мембранах активность этого фермента не превышала 2% в каждой из фракций, что можно считать следствием неполного их отделения от цитоплазмы. Только 2,6% активности ФФн-азы от общего содержания в клетках была ассоциирована с фракцией суммарных мембран и 0,3% - в периплазме.

Таблица 4. Распределение активности ферментов в субклеточных фракциях М. теИштса 12, полученных в присутствии и отсутствие ЭДТА (1 мМ)

Фракция Периплазма Цитоплазма Мембраны

+ЭДТА -ЭДТА +ЭДТА -ЭДТА +ЭДТА -ЭДТА

Ферменты мЕ/мг белка мЕ/мг белка % мЕ/мг у белка 0 мЕ/мг белка % мЕ/мг белка % мЕ/мг белка %

ПФК 353 1,9 45 2,23 1676 96,1 1600 95,8 37 2,04 24 1,96

Пирофосфатаза 3,4 0,3 0,11 0,1 87 97,1 69 83,4 2,4 2,57 10 16,5

Щелочная фосфатаза 0 0 0,1 3,62 2 100 2,2 96,4 0 0 0 0

НАД*"- зависимая формиатдегидрогеназа 32 0,3 0 0 980 99,7 877 100 0 0 0 0

НАДН-дегидрогеназа 179 0,8 25 1,12 995 50,5 913 49,4 1000 48,7 670 49,5

% - доля относительно суммарной активности фермента в клетках.

Активность НАД+- зависимой ФДГ была также сосредоточена в цитоплазме и отсутствовала в мембранной фракции, что согласуется с результатами Четиной и Троценко (1981).

При фракционировании клеток без ЭДТА, в периплазме обнаружена активность ЩФ и

заметно возросла активность ФФн-азы в мембранах, что свидетельствует об ингибировании или 2+

инактивации Мщ -зависимых ферментов ЭДТА. Активности других ферментов и их распределение по фракциям не отличались от таковых в субклеточных фракциях, полученных в присутствии ЭДТА (Таблица 4).

В субклеточных фракциях М. теЛатса 12, выросших при фосфорном дефиците, распределение активностей ПФК и маркерных ферментов (НАДН-дегидрогеназа, НАД1"- зависимая формиатдегидрогеназа) было аналогичным. Напротив, большая часть активности ФФн-азы обнаружена в мембранной фракции (74%), тогда как в цитоплазме и периплазме присутствовало 20% и 5,6% активности, соответственно. Активность ЩФ найдена в цитоплазме (26,6%), в мембранах (57%) и 16% - в периплазме. Кроме того, активность ЩФ была обнаружена в культуральной жидкости (1,7 мЕ/мл), где после 24 ч роста на дефицитной по Фц оказалось 60% от ее общей активности. Следовательно, ЩФ М. теМатса 12 индуцируется и секретируется в

Рис. 5. Электронная микро-фотография срезов клеток М. теЛатса 12, обработанных антителами к ПФК. Области локального (1) и диффузного (2) расположения ПФК.

С использованием специфичных к ПФК поликлональных антител кролика методом электронной микроскопии выявлены зоны высокой концентрации фермента, наряду с диффузным расположением в цитоплазме (Рис. 5). Возможно, такая локализация ПФК в клетках связана с местами высокой концентрации ФФц, аналогично содержащим пирофосфат ацидокальцисомам, обнаруженным у некоторых бактерий [ЗеийегЬеИ й а1., 2004].

Очистка и свойства ПФК.

Были оптимизированы условия разрушения клеток и получения экстрактов М. техкатса 12, что позволило впервые получить гомогенный препарат ПФК из метанотрофных бактерий с удельной активностью 840 Ед/мг белка (Табл. 5).

ростовую среду при дефиците фосфора.

Таблица 5. Очистка ПФК из M. methanica 12

Стадия очистки

Белок, мг/мл

Объем, мл

Удельная активность, 17мг белка

Выход, Степень % очистки, раз

Бесклеточный экстракт

Осаждение ПЭГ 6000

Хроматография на фосфоцеллюлозе PI 1

Хроматография на фенилсефарозе CL-4B

Рехроматография на фосфоцеллюлозе PI 1

2,3 8,2

0,53 0,16 0,574

320 22

27 22 4

12,2 42,7

279,5 552,5 840

100 86

44 22 21

3,5 22

При электрофорезе в присутствии ДСН фермент, очищенный в 69 раз, мигрировал одной полосой (Рис. 6), соответствующей м.м. ~ 45 кДа, а в неденатурирующих условиях ~ 92 кДа. Таким образом, ПФК М. methanica 12 состоит, по-видимому, из двух идентичных субъединиц,

кДа - , ^

94 1 67 (яшм

Рис. 6. ПААГ-электрофорез ПФК М. methanica 12 в присутствии 45 ДСН. 1 - маркеры, 2 и 3 -1 и 10 мкг ПФК соответственно.

30 — 20,1

1 2 3

При изучении влияния рН на стабильность ПФК, белок инкубировали в 50 мМ буферных растворах с разными значениями рН в течение 1 ч при 30°С. ПФК М. methanica 12 теряла активность при отклонениях рН от нейтрального значения, сохраняя 90-100% активности в узком диапазоне рН от 6 до 7,2. Скорости прямой и обратной реакций ПФК при различных значениях рН исследовали по образованию Фн и Фр-6-Ф, соответственно. Активность ПФК в прямой и обратной реакциях имела четкий максимум при рН 8,0. Таким образом, рН-оптимум активности ПФК М. methanica 12 находится в более щелочной области рН, по сравнению с аналогичным ферментом из других микроорганизмов. Максимальная скорость реакции ПФК наблюдалась при 40°С, тогда как при 50 °С фермент терял 50% активности в течение 5 мин, а при 60°С - полностью и необратимо инактивировался.

Субстратную специфичность прямой реакции ПФК анализировали непрерывным методом по образованию Фр-1,6-Фг. ПФК проявляла абсолютную субстратную специфичность в отношении ФФн как фосфорильного донора. При замене в инкубационной смеси ФФн на АТФ, дАТФ, АДФ, УТФ, ГТФ, ЦТФ, триполифосфат или полифосфат п=65 активность отсутствовала. Глюкозо-6-Ф,

фруктозо-1-Ф не заменяли фруктозо-6-Ф. Специфичность ПФК в обратной реакции также определяли непрерывным методом^ но по образованию фруктозо-6-фосфата, а к бисфосфатам Сахаров - по образованию (32Р)ФФН из 32Р. Из исследованных анионов только арсенат способен частично заменять Фн. Глюкозо-1,6-Ф2 и рибулозо-1,5-Ф2 не являлись субстратами ПФК. Фермент каталитически неактивен в отсутствии двухвалентных катионов. Максимальную активность ПФК проявляла только в присутствии М§2+. 50%-ную активность ПФК в прямой реакции наблюдали при 0,012 мМ Mg2+, а в обратной реакции - при 0,47 мМ М§2+. Вплоть до концентрации 10 мМ М^^ не оказывал ингибирующего действия. Мп2+ и Со2+ (1 мМ) концентрации могли замещать Mg2+ в прямой реакции, но с меньшей эффективностью. Увеличение концентрации этих катионов до 5 мМ полностью ингибировало реакцию. Са2+, Сс12+ и 21п2+ не замещали Мд2+.

Кинетические свойства ПФК. Зависимости активности ПФК от концентрации субстратов прямой и обратной реакций при избытке второго субстрата и 5 мМ М£СЬ имели гиперболический вид (Рис. 7), соответствующий уравнению Михаэлиса-Ментен. Кинетические параметры ПФК представлены в Таблице 6. Значения коэффициентов Хилла для всех субстратов, включая магний, близки к единице, что указывает на отсутствие положительной или отрицательной кооперативности взаимодействия фермента с субстратами. Ингибирования активности субстратами в прямой реакции и обратной реакциях не наблюдали. Зависимость активности ПФК от концентрации ФФн при эквимолярной концентрации также имела гиперболический вид. При этом Утах =871 ±10 не отличалась от полученной при насыщающих концентрациях М§2+, только Км= 0,0644 ± 0,0037 к ФФн была незначительно выше.

Таблица 6. Значения кажущихся кинетических констант ПФК М. теЛатса 12

Субстрат Км, мМ Утст Е/мг белка Коэффициент Хилла

Пирофосфат 0,051 ±0,002 843,3 ± 7,8 0,963 ± 0,055

Фруктозо-бФ 0,394 ±0,019 853,7 ± 10,6 0,921 ± 0,056

Фруктозо-1,6Фг 0,102 ±0,006 870,3 ± 15,8 1,129 ±0,051

, Ортофосфат 1,563 ±0,087 . 886,4 ± 14,3 1,034 ±0,056

. Mg2+ прямой 0,038 ± 0,008 819,0 ±42,3 0,828 ± 0,229

Mg2+ обратной 0,349 ± 0,035 835,9 ± 17,1 0,926 ±0,095

Е/мг белка

0,25 0,75 1,25 1,75 ФФ„, мМ

0 1 2 3 4 5 6 Фруктозо-6-Ф, мМ

Е/мг белка

3 6 9 12 15 РО42", мМ

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Фруктозо-1,б-Ф2, мМ

Рис. 7. Зависимость активности ПФК от концентрации субстратов прямой (А) и обратной (Б) реакций. Внутри • графики Лайнуивера - Бэрка.

Для подтверждения образования ФФн в обратной реакции и определения субстратной специфичности ПФК исследовали распределение [32Р]Фн в продуктах реакции в присутствии Мп2+.

ФрбФ Фн

Фр1,6Ф2

ФФН ■ Старт

Рис. 8. Радиоавтограф инкубационной смеси после ТСХ: а - до внесения ПФК; б - после инкубации (ресуспендирована перед ТСХ); в - после центрифугирования; г - осадок, отмытый и растворенный в НС1; д - конечный препарат [^РЗ-ФФн. Положение старта и свидетелей отмечено стрелками.

Инкубационную смесь исследовали методом ТСХ (Рис. 8). После инкубации с ферментом основная часть метки проявлялась на хроматограмме в области, соответствующей ФФн (Рис. 86). При этом практически весь [32Р]ФФн находился в виде осадка, о чем можно судить по хроматограмме надосадочной жидкости после центрифугирования инкубационной смеси (Рис. 8в). Кроме пирофосфата, метка включалась также во фруктозо-1,6-Фг, который почти не осаждался при центрифугировании (Рис. 86,в). Поскольку реакция обратима, часть синтезированного [32Р]ФФН участвовала в обратной реакции, фосфорилируя фруктозо-б-Ф с образованием 32Р-фруктозо-1,6-Ф2, меченного по фосфору исключительно у 1С-атома. На хроматмрамме в области фруктозо-6-Ф метка отсутствовала.

Рис. 9. Гидролиз синтезированного препарата [32Р]-ФФц дрожжевой неорганической пирофосфатазой.

Фн —*■ '.Щг'-Щ'; а - инкубационная смесь до внесения фермента;

б - инкубационная смесь через 15 мин после внесения пирофосфатазы; в - [32Р]-ортофосфорная кислота.

ФФ„ —>§ ;

Старт > Для доказательства образования [32Р]-ФФн в обратной

реакции, катализируемой ПФК, полученный осадок отделяли а ® в центрифугированием, промывали, переводили в Ыа-форму и проводили его гидролиз дрожжевой неорганической пирофосфатазой. Радиоавтография хроматограммы инкубационной смеси до внесения (Рис. 9а) и через 15 мин после внесения ФФн-азы (Рис. 96) показала, что синтезированный препарат гидролизовался полностью. В результате удалось разработать метод получения меченного [32Р]ФФн, основанный на реакции ПФК из М. теЛатса 12 в присутствии 32Р-ортофосфата, фруктозо-1,6-Фг и Мп2+. Метод прост и не требует значительных затрат времени, что важно при работе с таким короткоживущим изотопом, как 32Р, или легко гидролизуемым неорганическим пирофосфатом. Предлагаемый способ позволяет получать [32Р]ФФн для биологических исследований в лабораторных условиях без сложной очистки. -

Для выяснения возможной регуляции ПФК мы изучали влияние потенциальных ингибиторов и активаторов (1 мМ) на активность реакции. Тестируемые соединения не вызывали изменений активности ПФК, характерных для реальных эффекторов (Таблица 7). Фруктозо-2,6-бисфосфат, аллостерический эффектор ПФК растений и АТФ-ФФК [Епото1о et а1., 1988], также не оказывал влияния на активность ПФК М, те&атса 12 при насыщающих или близких к Км концентрациях субстратов. Таким образом, кинетические данные свидетельствует об отсутствии аллостерической регуляции ПФК М. теАхатса 12, что характерно для всех известных микробных ПФК.

Таблица 7. Влияние метаболитов на активность прямой реакции ПФК М. methanica 12

Эффектор (1мМ) Активность ПФК, % Эффектор (1мМ) Активность ПФК, %

Без добавок 100 Глюкоза 100

Глицеральдегид-3 -фосфат 97 УДФ-глкжоза 98

Диоксиацетонфосфат 98 АТФ 95

Цитрат 100 , АДФ 96

Пируват 97 АМФ 99

2-Фосфоенолпируват 95 НАД* 98

З-Фосфоглицерат 99 НАДН 100

Глюкозо-1-фосфат 97 НАДФ+ 96

Глюкозо-6-фосфат 103 НАДФН 102

Рибозо-5-фосфат 96 КоА 95

Фруктозо-2,6-бисфосфат 97

Полученные значения кажущихся Км для субстратов прямой и обратной реакций так же незначительно отличаются от опубликованных данных для ПФК из других микроорганизмов. Исключением является более высокая Км к ортофосфату и Fmax прямой и обратной реакций М. methanica 12. Значение м. м. нативной ПФК М. methanica 12 близко таковому для фермента P. shermanii [O'Brien et al., 1975], но выше по сравнению с нативными ферментами Е. histolytica [Reeves et al., 1976] и Acholeplasma laidlawii [Pollack et al., 1986]. Напротив, ПФК факультативного метилотрофа Amycolatopsis methanolica значительно больше и является гомотетрамером [Alves et al., 1994]. Только ПФК растений являются а$2 гетеротетрамерами [Carlisle, 1990]. Проведенный анализ подтвердил абсолютную субстратную специфичность ПФК М. methanica 12 по отношению ФФн, показанную также для данного фермента из других источников [O'Brien et al., 1975; Reeves et al., 1976; Pollack et al., 1986; Alves et al., 1994].

Секвенирование гена ПФК M. methanica 12

На основе аминокислотных последовательностей ПФК Sinorhizobium meliloti (NC 003047), Agrobacterium tumefaciens (NC 003062) и Propionibacterium freuclenreichii (AJ 508922), представленных в GeneBank, были выявлены наиболее консервативные последовательности (PKTVDND и VQKSGYF) на основании которых сконструированы и синтезированы вырожденные праймеры PFKF и PFK2 (Рис. 10), использованные для амплификации ДНК М. methanica 12. Полученный ПЦР-продукт (~530 п.н.) был очищен и секвенирован, что позволило синтезировать праймеры PFKX, PFKY и PFKZ для определения N- и С- концевых последовательностей генаpflc методом инвертированной ПЦР.

Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных методами прямой и инвертированной ПЦР, выявил одну открытую рамку считывания (1227 пар оснований), кодирующую белок из 409 аминокислот с рассчитанной м. м. 44,5 кДа (Рис. 10).

CCATCCTATTCGTAAACAAACGGATAGCTTCGACTTGGCGACAACTTGCCTGAAAATATAAAACCTTGTG

TTAAAATCACTGATTAGCACACTCATAGTGCGAATGGCTGAGATGTGGTCACATGGCCCTATGAGTTAAC

m n к p к к

GGCTGATATTCGATTTTGTCATTGGTTITTTCTTAACTTTAACTTCTACACGCTCATGAACAAACCTAAAA

----- pfkn-►

va i ltagg l a pcl nsa i gs l ie r AAGTTGCAATACTGACAGCAGGCGGCTTGGCGCCTTGTTTGAATTCCGCAATCGGTAGTTTGATCGAACG

yteidpSi ei icyrggykglllg

TTATACCGAAATCGATCCTAGCATAGAAATCATTTGCTATCGCGGCGGTTATAAAGGCCTGTTGCTGGGC

■4 pfkx

dsy pvtae v rk kag vlqrf ggs v i GATTCTTATCCAGTAACGGCCGAAGTGCGTAAAAAGGCGGGTGTTCTGCAACGTTTTGGCGGTTCTGTGA gn s rvk lt nvkd с vkrglv к eg e TCGGCAACAGCCGCGTCAAATTGACCAATGTCAAAGACTGCGTGAAACGCGGTTTGGTCAAAGAGGGTG

pfky-►

dpq kv aad qlvkd gvd i lht i gg AAGATCCGCAAAAAGTCGCGGCTGATCAATTGGTTAAGGATGGTGTCGATATTCTGCACACCATCGGCG

dd t n t а aa dl aaf lar n nygltv GCGATGATACCAATACGGCAGCAGCGGATTTGGCAGCATTCCTGGCCAGAAATAATTACGGACTGACCG

igl pk tvdn d vf pi kqslgawta TCATTGGTTTACCTAAAACCGTCGATAACGACGTATTTCCGATCAAGCAATCACTAGGTGCTTGGACTGC

-►pfkf

a eq gary fmnvva e n nan p rm li CGCCGAGCAAGGCGCGCGTTATTTCATGAACGTGGTGGCCGAAAACAACGCCAACCCACGCATGCTGAT v he vmgrnc gwlt aa taq e y rkl CGTACACGAAGTGATGGGCCGTAACTGCGGCTGGCTGACCGCTGCAACCGCGCAGGAATATCGCAAATT

ld raewl p elgl t re syevha vf ACTGGACCGTGCCGAGTGGTTGCCGGAATTGGGTTTGACTCGTGAATCTTATGAAGTGCACGCGGTATTC vpemai dleaeakrlrevmdkvd GTTCCGGAAATGGCGATCGACCTGGAAGCCGAAGCCAAGCGCCTGCGCGAAGTGATGGACAAAGTCGAT с v n i fvs eg a g v ea i va emq a kg TGCGTCAACATCTTCGTTTCCGAAGGTGCCGGCGTCGAAGCTATCGTCGCGGAAATGCAGGCCAAAGGC qe v pr dafg hi kl davn pgkwfg CAGGAAGTGCCGCGCGATGCGTTCGGCCACATCAAACTGGATGCGGTCAACCCTGGTAAATGGTTCGGC

pf kz -*

eq faqm i g aek tlvq ksgy f ar а GACCAATTCGCGCAGATGATAGGCGCGGAAAAAACCCTGGTACAAAAATCGGGATACTTCGCCCGTGCT

pfk2 -

s asn vddmrli ksc adl ave ca fr TCTGCTTCCAACGTTGACGACATGCGTTTGATCAAATCGTGCGCCGACTTGGCGGTCGAGTGCGCGTTCC r e sgv i g hde dng n vl rai efpr GCCGCGAGTCTGGCGTGATCGGTCACGACGAAGACAACGGCAACGTGTTGCGTGCGATCGAGTTTCCGC

IKGG KPFN IDTDWFNSMLS E IGQ GCATCAAGGGCGGCAAACCGTTCAATATCGACACCGACTGGTTCAATAGCATGTTGAGCGAAATCGGCC

pk g gkvevsh* AGCCTAAAGGCGGTAAAGTCGAAGTCAGCCACTAAGGCTGGCGTAAGGGGCGGATTCTTCCGCCCCCCT pfkc4-

CTCTTTCAAAGTCCTAACTCGCTCAAGCCGGGATGTTCGTCTGGACGCCGCCCCAACGGCCAGTGGAA

CAGGCGCTCTTCAGGTTTTATCGGTAAATCGTTGATGCTGGACGAAGCGTCGTTGCATCAAGCCATATC

CATTGAATT

Рис. 10. Нуклсотидная последовательность гена pfk М. methanica 12 с указанием вырожденных праймеров и кодируемых аминокислот.

Сравнение транслированной аминокислотной последовательности ПФК М. methanica 12 с таковыми из других организмов показало 62,5% сходства с Rhodopirellula baltica, 60,6% -Propionibacterium freudenreichii, 60,1% - Sinorhizobium meliloti, 46,4% - Agrobacterium tumefaciens.

0,1

н ЯГ1

100

98.---Rhodopirellula baltica SHI (ФФ„, NP_869505)

• Methylomonas methanica 12 (ФФ„, AY9574021 - Propionibacterium freudenreichii (ФФ„, P29495)

60!

loop Sinorhizobiummeliloti(ФФ„, NP_386296)

'— Agrobacterium tumefaciens C58 (ФФ„, AAK87863) --Methylococcus capsulatus Bath (ФФ„, YP_113714)

!1-----Dictyoglomus thermophilum (АТФ, AAF80100)

>—I I-Synechocystis sp. PCC 6803 (АТФ, P77078)

I lp 82

j ,--Clostridium perfringens 13 ( BAB81173)

' I •

94 -----Mycobacterium tuberculosis (АТФ, 053275)

Streptomyces coelicolor A3 (АТФ, SCU51728) 94! loo — Amycolatopsis methanolica (ФФ„, Q59126) Amycolatopsis mediterranei (ФФ„, Q9AGC0) lOOj- Salmonella typhimurium (АТФ, P65692)

10 I1 L Escherichia coli K12 (АТФ, NP_418351)

i - ---Bacillus methanolicus (АТФ, NP_957655.1)

1----Thermus thermophilus HB27 (АТФ, YP_005566)

-Thermotoga maritima MSB8 (ФФ„, G72396)

Рис. 11. Филогенетическое дерево 6-фосфофруктокиназ некоторых бактерий. В скобках указаны фосфатный донор и номер последовательности в GeneBank.

Идентичность с ПФК Amycolatopsis methanolica и Methylococcus capsulatus Bath составила 22,8 % и 16,5 % соответственно. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых jofk, показал наибольшее родство ферментов Methylomonas methanica 12 и Rhodopirellula baltica, Propionibacterium freudenreichii, Agrobacterium tumefaciens и Sinorhizobium meliloti (Рис. 11), которые относятся к недавно классифицированной подгруппе "Р" II группы ФФК [Müller et al., 2001; Bapteste et al., 2003].

Высокая степень дивергенции ПФК М. methanica 12, Мс. capsulatus и А. methanolica предполагает значительные отличия кинетических свойств, что, возможно, обусловлено различной метаболической ролью фермента у данных метилотрофов. В настоящий момент мы располагаем кинетическими характеристиками ПФК М. methanica 12 и А. methanolica [Alves et al., 2001], которые существенно отличаются по сродству к субстратам (особенно велика разница в Км к ФФН и удельной активности.

Клонирование и очистка рекомбинантной ПФК. Ген pfk из М. methanica 12 клонировали в вектор системы рЕТ. Далее, полученной плазмидой рЕТpfk трансформировали клетки Е. coli BL-21(DE-3), в растворимой фракции которых после индукции ИПТГ, методом электрофореза в

присутствии ДСН, обнаружен белок с м.м. ~45 кДа, который отсутствовал в контрольных клетках Е.-coif, выращенных без индуктора.

Рис. 12. ПААГ-электрофорез ПФК М. methanica в присутствии ДСН. М - молекулярные маркеры, 1,2,3 —2, 5 и 7 мкг рекомбинантной ПФК, соответственно.

После аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе и дополнительной очистки белка на фосфоцеллюлозе был получен гомогенный препарат ПФК-Hise-tag (Рис. 12). Анализ активности рекомбинантной ПФК показал функциональную активность белка с кинетическими характеристиками, аналогичными таковым нативного фермента М. methanica 12.

Очистка и свойства ФФц-азы

Чтобы объяснить высокое содержание ФФн в клетках, растворимая ФФн-аза М. methanica 12 впервые была очищена в 1200 раз с использованием ВЭЖХ и охарактеризована. При ДСН-электрофорезе в 12% ПААГ выявлена одна полоса с м. м. ~28,4 кДа. По данным гель-фильтрации мим. нативного фермента ~ 90 кДа, т.е. ФФн-аза М. methanica 12 - гомотример. Судя по увеличению удельной активности в ходе очистки, содержание ФФн-азы в клетках М. methanica 12 не превышает 0,08 % от растворимого белка, что на порядок меньше, чем у Е. coli (0,2%), • Methanothrix soehngenii (0,2%), Thermoplasma acidophilum (0,4%), Acinetobacter johnsonii (0,5%) [Van Alebeek et al., 1994]. ФФн-аза M. methanica 12 гидролизовала наряду с ФФн триполифосфат с относительной скоростью 16%, но не использовала как субстраты нуклеотидфосфаты, р-нйтрофенилфосфат и полифосфаты (п = 5, 15, 65). ФФн-аза М. methanica 12 имела рН-оптимум при рН 8,5, подобно большинству растворимых ФФн-аз, тогда как мембранные протонтранслоцирующие ферменты имеют оптимум рН, близкий к нейтральному [Lahti, 1983]. ФФн-аза М. methanica 12 наиболее стабильна при рН от 7,5 до 8,5. При понижении или повышении рН происходила быстрая и необратимая инактивация, что отличает ФФн-азу М. methanica 12 от пирофосфатаз из других микроорганизмов [Ichiba, 1990].

Кинетические свойства ФФн-азы. При эквимолярном соотношении Mg2+ и ФФн фермент имел сигмоидную зависимость активности от концентрации ФФн (Рис. 13А) с коэффициентом Хилла пх - 2,96 ±0,31. При этом фермент проявлял низкое сродство к ФФн (Км ~ 0,63 ± 0,03 мМ). При двукратном избытке Mg2+ относительно ФФн данная зависимость приближалась к гиперболической (Рис. 13Б), повышалось сродство к ФФН {Км = 0,38 ± 0,04 мМ) и снижался

кДа - -М I 2 3 Г ' 94,6; •

66,2.

, : ■ • 45,0 «^Ц *•" »*<* к.-ад.

31,0 •»—■

21,5

14,4

ФФ„, мМ ФФН, мМ

Рис. 13. Зависимость активности ФФн-азы от концентрации пирофосфата при эквимолярной (А) и двукратном избытке Mg1+ относительно ФФН (Б).

коэффициет Хилла (пх = 1,84 ± 0,35). Учитывая олигомерную структуру и активирующее действие Mg2+, можно заключить, что ФФн-аза М. methanica 12 - регуляторный фермент, который обеспечивает регуляцию уровня ФФн в клетках, необходимого для работы ПФК.

Заключение

Высокие активности ПФК и уровни ФФн в клетках на фоне низкой активности ФФн-азы доказывают связь РМФ цикла М. methanica 12 с ПФК, катализирующей обратимую реакцию фосфорилирования фруктозо-6-Ф

Mg2*

Фруктозо-бФ + ФФИ * Фруктозо-1,6Ф2 + Фи Поэтому мы модифицировали постулированное ранее [Quayle, 1980] основное уравнение РМФ цикла ЗНСНО + АТФ -> Триозофосфат + АДФ, чтобы отразить участие ФФн вместо АТФ: ЗНСНО + ФФн -> Триозофосфат + Фн

Однако данное уравнение не отражает одновременного функционирования гликолиза и пути Энтнера-Дудорова у метанотрофов I типа [Ström et al., 1974]. Хотя нет экспериментальных данных о соотношении этих путей in vivo, судя по высокой активности ПФК, расщепление фруктозо-1,6-Фг доминирует у М. methanica 12, снабжая клетки глицеральдегид-3-фосфатом (ГАФ), необходимым для регенерации рибулозо-5-Ф в РМФ цикле, и ФЕП, который карбоксилируется в оксалоацетат и далее вовлекается в ЦТК (Рис. 14). Как было ранее показано [Shishkina, Trotsenko, 1982], облигатные метанотрофы не имеют ферментов, обеспечивающих взаимопревращение ФЕП <-> пируват, что приводит к меньшему выходу АТФ (один моль вместо двух) при гликолитическом распаде фосфогексоз. Чтобы компенсировать этот дефицит, М. methanica 12 использует независимый от АТФ фермент (ПФК), а также путь Энтнера-Дудорова, который является единственным способом синтеза пирувата, окисляемого до ацетил-КоА, поступающего в ЦТК.

НАДФ+--J

НАДФН-*^

2-Кето-З -дезокси-б-Ф-глюконат

НАД+ ///' >Ф^НАДН

" со2

НАДН 1,3-ФГК 1-~-АДФ

Ацетил~КоА

' / Л / / ,',-СОг

Рис. 14. Ключевая роль ПФК в метаболизме облигатного метанотрофа I типа М. methanica

Н[агф] Л! у(щк)

ФГА 'V' / / \ f

ФЕП Оксалоацетат Биосинтез

со2

Очевидно, одновременное функционирование двух путей распада фосфогексоз необходимо для работы разомкнутого ЦТК у М. methanica 12. Хотя ПФК не регулируется аллостерически, in vivo этот фермент поддерживает определенное соотношение своих субстратов и продуктов, и, находясь в точке разветвления путей метаболизма углеводов, обеспечивает распределение пула фруктозо-6-Ф между РМФ циклом, ФБФ- и КДФГ-альдолазным путями расщепления фосфосахаров, а также синтезом гликогена у облигатного метанотрофа I типа М. methanica 12. Следовательно, для лучшего понимания регуляции РМФ цикла предстоит определить факторы, влияющие на динамику внутриклеточных концентраций субстратов и продуктов ПФК.

ПФК присутствует у всех исследованных метанокисляющих бактерий, что позволяет предположить ее специфическую связь с метанотрофией. Хотя метанотрофы — аэробные бактерии, однако их дыхательная цепь участвует в первой реакции окисления метана, перенося электроны от НАДИ или восстановленных цитохромов к активному центру метанмонооксигеназного комплекса. Таким образом, энергозависимость окисления метана снижает доступность восстановительных эквивалентов для синтеза АТФ при окислительном фосфорилировании. Возможно, данная особенность энергетического обмена метанотрофов способствовала сохранению (или приобретению) в процессе эволюции АТФ-сберегающей стадии гликолиза (ПФК).

выводы

1. Активность пирофосфатзависимой 6-фосфофруктозокиназы (ПФК) обнаружена у аэробных метанотрофов I, П и X типов. Напротив, у облигатных и факультативных метилобактерий активность ПФК отсутствует, за исключением Amycolatopsis methanolica. Низкая активность пирофосфатазы найдена у метилобактерий, содержащих ПФК, напротив, наибольшая - у метилобактерий, имеющих АТФ-зависимую 6- фосфофруктокиназу.

2. М. methanica 12 растет на пирофосфате (ФФн) и поддерживает высокий внутриклеточный уровень ФФН, синтезированного de novo даже в условиях фосфорного голодания. При этом имеет конститутивные ПФК и пирофосфатазу, а также индуцибельную, секретируемую щелочную фосфатазу, которая проявляется только при дефиците фосфора в среде.

3. Активность пирофосфатазы найдена в цитоплазме и в мембранной фракции М. methanica 12 в разном соотношении в зависимости от условий роста и способа разрушения клеток. Растворимая пирофосфатаза обладает низким сродством и положительной кооперативностыо к ФФн (Ал/=0,63 мМ; пх=2,7), активируется катионами Mg2+, что указывает на регуляторную роль фермента в метаболизме ФФн у этого метанотрофа.

4. ПФК М. methanica 12 - гомодимер (90кДа), локализуется в цитоплазме и цитоплазматических микроструктурах, обладает высоким сродством к ФФн (Км = 0,051 мМ) и фруктозо-1,6-Ф2 (Км=0,1 мМ), но низким к фруктозо-6-Ф (Км~ 0,394 мМ) и Фн (Км- 1,56 мМ), что обеспечивает пул фруктозо-6Ф для одновременного функционирования РМФ цикла ассимиляции формальдегида и пути Энтнера-Дудорова. Кроме того, используя ФФн вместо АТФ, ПФК совместно с альдолазой восполняет пул фосфотриоз для регенерации акцептора формальдегида (рибулозо-5-Ф) и биосинтеза, являясь необходимым энергосберегающим ферментом РМФ цикла. Это позволяет предложить новое уравнение РМФ цикла д ля метанотрофов I типа:

ЗНСНО + ФФн -» Триозофосфат + Фн

5. Определена нуклеотидная последовательность гена pß (1229 п.н.) М. methanica 12, который клонирован и экспрессирован в Escherichia coli. Продукт трансляции pfle гена состоит из 409 аминокислот с расчетной молекулярной массой 44,5 кДа и pi = 5,79. Филогенетический анатиз аминокислотных последовательностей выявил низкую степень гомологии ПФК М. methanica 12 с таковыми Methylococcus capsulatus Bath (16,5%) и Amycolatopsis methanolica (22,8%), но более высокое сходство с ПФК Propionibacteriumßeuäenreichii (60,1%).

6. С использованием препарата ПФК М. methanica 12 разработан новый метод биосинтеза меченного 32Р-ФФн из 32Р-ортофосфата и фруктозо-1,6-Ф2.

: Список публикаций по теме диссертации Статьи:

1. Бесчастный А.П., Соколов АЛ., Хмеленина В. Н., Троценко Ю.А. Очистка и некоторые свойства . пирофосфатзависимой фосфофруктокиназы облигатного метанотрофа Methylomonas methanica

//Биохимия. 1992. Т. 57. № 8. С. 1215-1221.

2. Хмеленина В.Н., Бесчастный А.П., Гаязов P.P., Троценко Ю.А. Влияние пирофосфата на рост и метаболизм Methylomonas methanica И Микробиология. 1994. V. 63. № 2. С. 188-193.

3. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N., Beschastny А.Р. The Ribulose Monophosphate (Quayle) cycle: News and Views // Proc. Int. Symp. Microbial Growth on Ci compounds / Eds: M.E. Lidstrom, R.Tabita, Kluwer Publishers. 1996. P. 4-8.

4. Бесчастный А.П., Шабалин Ю.А., Троценко Ю.А. Метод препаративного биосинтеза неорганического пирофосфата, меченного фосфором-32 // Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т. 33. № 6. С. 650-654.

5. Хмеленина В.Н., Цветкова М.Г.,Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. Особенности метаболизма метилотрофного актиномицета Amycolatopsis methanolica // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 327-334.

6. Решетников А.С., Мустахимов И.И., Хмеленина В.Н., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. Клонирование и характеристика пирофосфат-зависимой 6-фосфофруктокиназы у Methylomonas methanica И Доклады Академии Наук. 2005. Т.405 №6. С.837-839.

Тезисы:

1.A.P. Beschastny, V.N. Khmelenina, Y.A. Trotsenko. Properties and Role of Pyrophosphate-dependent 6-Phosphofructokinase from Methylomonas methanica. In: 7th International Symposium on Microbial Growth on CI Compounds, A30, August 1992, Warwick, UK.

2. V.N. Khmelenina, A.P. Beschastny, R.R. Gayazov, Y.A. Trotsenko. Inorganic Pyrophosphate as Phosphoiyl and Energy Donor for Growth of Obligate Methanotroph Methylomonas methanica. In: 7th International Symposium on Microbial Growth on CI Compounds, A31, August 1992, Warwick, UK.

3. Хмеленина B.H., Бесчастный А.П., Цветкова М.Г., Троценко Ю.А. Метаболическая роль неорганических полифосфатов и пирофосфата у облигатных и факультативных метилотрофных бактерий. Сборник тезисов конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров.

' Фундаментальные и прикладные аспекты». Пущино. 1995. С 55.

4. Бесчастный А.П., Хмеленина В.Н., Павлова Н... Троценко Ю.А. Метаболизм пирофосфата у аэробных метилотрофных бактерий. Сборник тезисов конференции «Автотрофные микроорганизмы» памяти акад. РАН Е.Н. Кондратьевой. "Диалог - МГУ". 1996. С. 81.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н. Крупянко В.И., д.б.н. Дорониной Н.В., к.б.н. Соколову А.П., к.х.н. Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Шабалину Ю.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц., асп. Мустахимову И.И., вед. инж. Петрову Н.Н. и Забирову Р.Х. Особую признательность автор выражает своим наставникам и учителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Принято к исполнению 15/11/2006 Исполнено 16/11/2006

Заказ № 937 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бесчастный, Александр Павлович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий.

1.1. Таксономическое разнообразие аэробных метанотрофов.

1.2. Пути окисления С\ - соединений у метилотрофных бактерий.

1.3. Система транспорта электронов и окислительное фосфорилирование.

1.4. Пути ассимиляции Q- соединений.

1.5. Центральный метаболизм.

Глава 2. Энзимологические аспекты метаболизма неорганического пирофосфата.

2.1. Пут образования и локализация ФФН в клетках.

2.2. Пирофосфатзависимые ферменты микроорганизмов.

2.3. Характеристика и метаболическая роль неорганических пирофосфатаз.

2.4. Свойства и метаболическая роль ПФК.

2.5. Филогенетический анализ и эволюция ПФК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования.

3.1. Объекты исследований.

3.2. Культивирование бактерий.

3.3. Методы разрушения клеток и получения бесклеточных экстрактов.

3.4. Измерение активности ферментов.

3.5. Очистка ПФК из М. methanica 12.

3.6. Очистка пирофосфатазы из М. methanica 12.

3.7. Электрофоретические методы.

3.8. Иммуноцитохимическое выявление ПФК в клетках M.methanica 12.

3.9. Гель-хроматография.

3.10. Определение кинетических параметров ПФК и ФФ„-азы.

3.11. Включение 32Р-ортофосфата в ФФ„ и Фр-1,6-Фг в реакции ПФК in vitro.

3.12. Молекулярно-биологические методы.

3.12.1. Манипуляции с хромосомной ДНК М. methanica 12.

3.12.2. Методы с использованием ПЦР.

3.12.3. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.

3.12.4. Секвенирование ПЦР - продуктов.

3.12.5. Филогенетический анализ генов ПФК и АТФ-ФФК.

3.12.6. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантной ПФК.

3.13. Аналитические методы.

Глава 4. Результаты и обсуждение.

4.1. Распространение ПФК у аэробных метилотрофных бактерий.

4.2. Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФн-азы.

4.3. Внутриклеточная локализация ФФн-зависимых ферментов М. methanica 12.

4.4. Очистка и характеристика ПФК М. methanica 12.

4.5. Очистка и характеристика неорганической пирофосфатазы М. methanica 12.

4.6. Секвенирование гена ПФК М. methanica 12.

4.7. Клонирование и экспрессия гена ПФК М. methanica 12.

4.8. Метод биосинтеза ФФН, мечешюго фосфором 32Р.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica"

Актуальность проблемы. Бактерии, использующие метан в качестве источника углерода и энергии (метанотрофы), вносят существенный вклад в глобальный круговорот углерода и азота биосферы. Метанотрофы представляют потенциальный интерес для производства кормового белка и различных полезных продуктов, а так же биодеградации, биотрансформации алифатических и ароматических поллютантов, снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов [Малашенко с соавт., 1978, 1993; МиггеН, Эакоп, 1992; Гальченко, 2001; Троценко с соавт., 2006]. Очевидно, что для эффективной реализации биотехпологического потенциала метанотрофов и понимания их роли в различных экосистемах необходимы детальные знания об организации и регуляции метаболизма у данных бактерий. Хотя интенсивные исследования биохимии метанотрофов привели к расшифровке специфических путей окисления и ассимиляции С|-соединений, тем не менее, остаются мало изученными метаболизм и функции неорганического пирофосфата (ФФН). При этом следует отметить существенные изменения в представлениях о метаболической роли ФФ„. Установлено, что у высших растений и ряда микроорганизмов энергия ФФ„ не теряется при гидролизе неорганической пирофосфатазой (ФФн-азой), а используется в ряде ферментативных реакций. Это подтвердили открытие пирофосфатзависимых ферментов, биосинтеза ФФИ в процессе фотосинтеза и окислительного фосфорилировапия; потребление экзогенного ФФН и стимулирующее действие на рост некоторых микроорганизмов [Ки1аеу, УаяаЬоу, 1983; Кулаев с соавт., 2005].

40 лет назад классические исследования группы Квейла в Шеффилдском университете (Англия) привели к открытию нового метаболического пути рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции (^-соединений у метанотрофов. Первые две реакции данного цикла катализируют специфические ферменты 3-гексулозофосфатсинтаза (ГФС) и фосфо-3-гексулоизомераза (ФГИ):

ГФС ФГИ

НСНО + Рибулозо-5Ф -*г [0-арабино-]Згексулозо-6Ф -Фруктозо-бФ

Предполагалось, что последующее фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата катализирует АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ФФК), являясь ключевой регуляторной стадией РМФ цикла. Однако факт очень низкой (2-8 мЕ/мг белка) активности ФФК у метанотрофов ставил под сомнение реальность и значимость гликолитического варианта РМФ цикла. Наличие небольших активностей ферментов пути Энтнера-Дудорова у данных бактерий привело к модификации схемы РМФ цикла, которая учитывала одновременное функционирование двух путей регенерации первичного акцептора формальдегида (рибулозо-5-фосфата). Это позволяло считать проблему «замкнутости» РМФ цикла условно решенной [Ström et al., 1974]. Однако обнаружение активности пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы (ПФК) и высокой внутриклеточной концентрацией ФФН у облигатных метаноторофов [Шишкина, Троценко, 1990; Trotsenko, Shishkina, 1990] реанимировало интерес к изучению особенностей организации и регуляции РМФ цикла, и, в частности, роли ПФК в С i-метаболизме данных бактерий, что требовало экспериментальной проверки. Кроме того, изучение свойств ПФК облигатных метанотрофов важно для понимания структурно-функционального разнообразия и эволюции данного фермента.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - определить свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы в метаболизме облигатного метанотрофа Methylomonas methanica 12. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Определить активности ФФН - и АТФ -зависимой 6-фосфофруктокиназы, а также пирофосфатазы у аэробных метилобактерий различных таксономических групп.

2. Исследовать влияние условий культивирования на активности и локализацию ПФК, пирофосфатазы и щелочной фосфатазы у M.methanica 12.

3. Выделить и изучить свойства ПФК и пирофосфатазы М. methanica 12.

4. Идентифицировать и секвепировать геи pfle, кодирующий ПФК М. methanica 12.

Научная новизна. Установлено, что высокая активность ПФК сопровождается низкой активностью ФФн-азы и отсутствием ФФК у облигатных метанотрофов I, II и X с ну типов. Напротив, у не использующих4"' метилобактерий разного таксономического положения, независимо от реализуемых путей Сi-ассимиляции, активность ФФ„-азы выше, а ПФК отсутствует. Исключением является факультативный метилотоф Amycolatopsis methanolica, обладающий небольшими активностями ПФК, ФФК и ФФ,,-азы.

Выявлено высокое содержание ФФ„ в клетках M.methanica 12 при различных условиях культивирования, даже па среде, дефицитной по фосфору, наряду с присутствием конститутивных ПФК и ФФ„-азы, что доказывает участие ФФН не только в резервировании фосфата, но и в конструктивном и энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Найдена секретируемая ЩФ, индуцируемая дефицитом фосфора. Обнаружено, что активность ФФн-азы М. methanica 12 локализуется в цитоплазме и в мембранах в разном соотношении в зависимости от условий роста клеток. Растворимая ФФ„-аза М. methanica 12 впервые очищена до гомогенного состояния и охарактеризована. Получены доказательства регуляторной природы растворимой ФФн-азы (олигомерпая структура, положительная кооперативность, низкое сродство к ФФ,„ а также активирующее действие Mg ).

Иммуноцитохимическим методом обнаружено присутствие ПФК в ассоциированном виде наряду с равномерным распределением в цитоплазме клеток М. methanica 12.

Впервые очищена и охарактеризована ПФК М. methanica 12, близкая по основным молекулярным свойствам аналогичным ферментам других микроорганизмов (кроме ПФК из A. methanolica), но отличается наибольшей удельной активностью. Секвенирован ген pfk М. methanica 12, кодирующий белок с высокой степенью дивергенции относительно ПФК Methylococcus capsulatus Balh и A. methanolica, по близкой ферменту из Propionibaclerium freudenreichii. Предложен новый вариант РМФ цикла, сопряженного с ПФК, что имеет принципиальное значение для понимания метаболической организации и эволюции метапотрофов.

Научно-практическое значение. Определены условия культивирования для максимального проявления активности и разработана схема очистки ПФК, что позволяет рассматривать М. methanica 12 в качестве эффективного продуцента данного фермента для определения ФФ„. С использованием препарата ПФК разработан простой метод биосинтеза меченного 32[Р]ФФН для научных исследований. Установлена способность М. methanica 12 расти на ФФН, что может найти применение в процессах биосинтеза и биоремедиации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на симпозиумах «Рост микроорганизмов на Ci -соединениях» (Уорик, Англия, 1992; Сан-Диего, США, 1995), научных конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров" (Пущино, 1995), "Автотрофные микроорганизмы", посвященной памяти акад. Е.Н. Кондратьевой (МГУ, 1996) и отчетных конференциях ИБФМ РАН.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н. Крупянко В.И., д.б.н. Дорониной Н.В., к.х.н. Шляпникову М.Г., к.б.и. Ивашиной Т.В., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Шабалину Ю.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Ешииимаеву Б.Ц., асп. Мустахимову И.И., вед. инж. Петрову Н.Н. и Забирову Р.Х. Особую признательность автор выражает своим наставникам и учителям — д.б.н., проф. Троцеико Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы, включающего 270 ссылку, из них 37 на русском и 233 на английском языках, содержит 19 таблиц и 31 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бесчастный, Александр Павлович

выводы

1. Активность пирофосфатзависимой 6-фосфофруктозокиназы (ПФК) обнаружена у аэробных метанотрофов I, II и X типов. Напротив, у облигатных и факультативных метилобактерий активность ПФК отсутствует, за исключением Amycolatopsis methanolica. Низкая активность пирофосфатазы найдена у метилобактерий, содержащих ПФК, напротив наибольшая - у метилобактерий, имеющих АТФ-зависимую 6- фосфофруктокиназу.

2. M.methanica 12 растет на ФФ„ и поддерживает высокий внутриклеточный уровень ФФ„, синтезированного de novo даже в условиях фосфорного голодания. При этом имеет конститутивные ПФК и пирофосфатазу, а также индуцибельную, секретируемую щелочную фосфатазу, которая проявляется только при дефиците фосфора в среде.

3. Активность пирофосфатазы найдена в цитоплазме и в мембранной фракции М. methanica 12 в разном соотношении в зависимости от условий роста и способа разрушения клеток. Растворимая пирофосфатаза обладает низким сродством и положительной кооперативностью к ФФН (ÄTa/=0,63 мМ; яд=2,7), активируется катионами Mg2+, что указывает на регуляторную роль фермента в метаболизме ФФ„ у этого метанотрофа.

4. ПФК М. methanica 12 - гомодимер (90кДа), локализуется в цитоплазме и цитоплазматических микроструктурах, обладает высоким сродством к ФФН {Км = 0,051 мМ) и фрукгозо-1,6Ф2 (/Cv/=0,1 мМ), но низким к фруктозо-бФ {км = 0,394 мМ) и Фн {км = 1,56 мМ), что обеспечивает пул фруктозо-бФ для одновременного функционирования РМФ цикла ассимиляции формальдегида и пути Энтнера-Дудорова. Кроме того, используя ФФН вместо АТФ, ПФК совместно с альдолазой восполняет пул фосфотриоз для регенерации акцептора формальдегида (рибулозо-5Ф) и биосинтеза, являясь необходимым энергосберегающим ферментом РМФ цикла. Это позволяет предложить новое уравнение РМФ-цикла для метанотрофов I типа: ЗНСНО + ФФН -> Триозофосфат + Фн

5. Определена нуклеотидная последовательность гена pfk (1227 п.н.) М. methanica 12, который клонирован и экспрессирован в Escherichia coli. Продукт трансляции pfk гена состоит из 409 аминокислот с расчетной молекулярной массой 44,5 кДа и pi = 5,79. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей выявил низкую степень гомологии ПФК M.methanica 12 с таковыми Methylococcus capsulatus Bath (16,5%) и Amycolatopsis methanolica (22,8%), но более высокое сходство с ПФК Propionibacterium freudenreichii (60,1%).

6. С использованием препарата ПФК М. methanica 12 разработан новый метод биосинтеза меченного 32Р-ФФ„ из 32Р-ортофосфата и фруктозо-1,6-Ф2.

Заключение

Высокие активности ПФК и уровни ФФН в клетках на фоне низкой активности ФФн-азы доказывают связь РМФ цикла М. тг\Ьап\са 12 с ПФК, катализирующей обратимую реакцию фосфорилирования фруктозо-6-Ф:

М82+

Фруктозо-бФ + ФФМ

Фруктозо-1,6Ф2 + Фн

Поэтому мы модифицировали постулированное ранее [Quayle, 1980] основное уравнение РМФ цикла

ЗНСНО + АТФ -> Триозофосфат + АДФ, чтобы отразить участие ФФц вместо АТФ:

ЗНСНО+ ФФМ -» Триозофосфат + Фц Однако данное уравнение не отражает одновременного функционирования гликолиза и пути Энтнера-Дудорова у метанотрофов I типа [Ström et al., 1974].

Рис. 31. Ключевая роль ПФК в метаболизме облигатного метанотрофа I типа М. methanica 12

Хотя нет экспериментальных данных о соотношении этих путей in vivo, судя по высокой активности ПФК, расщепление фруктозо-1,б-Ф2 доминирует у М. methanica 12, снабжая клетки глицеральдегид-3-фосфатом (ГАФ), необходимым для регенерации рибулозо-5-Ф в

РМФ цикле, и ФЕП, который карбоксилируется в оксалоацетат и далее вовлекается в ЦТК (Рис. 31). Как было ранее показано [Shishkina, Trotsenko, 1982], облигатные метанотрофы не имеют ферментов, обеспечивающих взаимопревращение ФЕП <-> пируват, что приводит к меньшему выходу АТФ (один моль вместо двух) при гликолитическом распаде фосфогексоз. Чтобы компенсировать этот дефицит, М. melhanica 12 использует независимый от АТФ фермент (ПФК), а также путь Энтнера-Дудорова, который является единственным способом синтеза пирувата, окисляемого до ацетил-КоА, поступающего в ЦТК. Очевидно, одновременное функционирование двух путей распада фосфогексоз необходимо для работы разомкнутого ЦТК у М. methanica 12. Хотя ПФК не регулируется аллостерически, in vivo этот фермент поддерживает определенное соотношение своих субстратов и продуктов, и, находясь в точке разветвления путей метаболизма углеводов, обеспечивает распределение пула фруктозо-б-Ф между РМФ циклом, ФБФ- и КДФГ-альдолазным путями расщепления фосфосахаров, а также синтезом гликогена у облигатного метанотрофа I типа М. methanica 12. Следовательно, для лучшего понимания регуляции РМФ цикла предстоит определить факторы, влияющие на динамику внутриклеточных концентраций субстратов и продуктов ПФК.

Филогенетический анализ расшифрованной нами полной нуклеотидной последовательности гена pfkM. methanica 12 и соответствующих генов, опубликованных в GeneBank, показал наибольшее родство фермента М. methanica 12 с Rhodopirellula baltica, Propionibacterium freudenreichii, Agrobacterium tumefaciens и Sinorhizobium meliloti, которые относятся к недавно классифицированной подгруппе "Р" II группы ФФК. Показано, что данная подгруппа является обособленной эволюционной ветвыо ФФН-ФФК и представлена ферментами из нескольких неродственных организмов: грамположительных бактерий рода Propionibacterium, эукариота Mastigamoeba balamuthi и а-протеобактерий Sinorhizobium meliloti и Agrobacterium tumefaciens [Bapteste et al., 2003].

Сравнение транслированной аминокислотной последовательности гена pfk у М. methanica 12 и соответствующего гена в недавно опубликованном геноме термотолерантного облигатного метанотрофа Мс. capsulatus Bath [Ward et al., 2004] выявило значительную степень дивергенции данных ферментов (16,5% идентичности). Это позволяет предположить, что ПФК у этих двух организмов имеет, скорее всего, различное происхождеиие. Ранее была выдвинута гипотеза о монофилетическом происхождении метанотрофов от одного общего предка [Quayle, Ferenci, 1978]. При этом Мс. capsulatus, реализующий одновременно три известных пути С i-ассимиляции, рассматривался в качестве своеобразного «Розеттского камня» в метилотрофии. Монофилетическое происхождение метанотрофов косвенно подтверждается присутствием ПФК у всех исследованных метанотрофов I, II и X типов. Однако высокая степень дивергенции этого гена у бактерий I типа (Л/. methanicci 12) и X типа (Л/с. capsulatus Bath) позволяет усомниться в справедливости этой гипотезы. С другой стороны, она указывает на очевидную связь между облигатной зависимостью от метана, как источника углерода и энергии, и необходимостью иметь пирофосфатзависимый фермент - ПФК. Следует отметить, что у весьма представительной группы не растущих на метане метилобактерий, реализующих те же пути С) ассимиляции (РМФ, РБФ, сериновый), этот фермент не обнаружен, за исключением грамположителыюго актиномицета A. methanolica.

Логично полагать, что функция ПФК в метаболизме метанотрофов I, II и X типов должна отличаться. Как выше обсуждалось, у метанотрофов I типа ПФК связана с ассимиляцией формальдегида через РМФ цикл и должна обеспечивать распределение Фр-6-Ф между гликолитичсским распадом и путем Эптнера-Дудорова. Напротив, у метанотрофов II типа первичными продуктами серинового пути являются Сз-соедииения, поэтому ПФК, по-видимому, участвует в глюкоиеогенезе (синтезе фосфогексоз из фосфотриоз). Промежуточное положение в этом отношении занимает Мс. capsulatus, у которого в доминирующем РМФ цикле образуются гексозофосфаты, а в минорном цикле Кальвина - 3-фосфоглицерат и фосфогликолат. Соответственно, регуляция биосинтеза интермедиатов гликолиза и глкжонеогенеза может осуществляться на уровне ключевых ферментов первичной Ci-ассимиляции (ГФС и РБФК/О).

Одна из центральных догм биохимии гласит, что ФФ„, образующийся в анаболических реакциях, немедленно гидролизуется высокоактивной неорганической пирофосфатазой с потерей энергии, что сдвигает равновесие этих процессов в сторону биосинтеза. Однако исследования последних десятилетий показали, что так происходит не у всех живых организмов [Кулаев, 1975; Kulaev, Vagabov, 1983; Кулаев с соавт., 2005]. Мы показали, что у облигатных метанотрофов, включая М. methanlca 12, ФФн-аза имеет низкую активность в сравнении, например, с Е. coli. С одной стороны, этот факт подтверждает функционирование ПФК в гликолитическом направлении, а с другой -предполагает, что недостаток активности ФФн-азы компенсируется высокой активностью ПФК, которая восполняет функцию пирофосфатазы без потери энергии ФФ„. Для проверки этого предположения мы исследовали свойства ФФ„-азы М. methanica 12.

Как оказалось, растворимая ФФн-аза у М. methanica 12 представлена, по-видимому, единственной формой и является весьма лабильным ферментом. При субклеточном фракционировании активность ФФ„-азы обнаруживалась как в растворимой (цитоплазматической) фракции, так и во фракции суммарных мембран. Это указывает на присутствие у М. methanica 12 мембраной пирофосфатазы. Обнаруженная у прокариот, простейших, дрожжей и растений мембранная ФФн-аза при гидролизе ФФН генерирует трансмембранпый потенциал, либо, напротив, синтезирует пирофосфат в процессе фотосинтеза или окислительного фосфорилирования аналогично синтезу АТФ АТФ-азой [Baltscheffsky, 1967; Кулаев и др., 1974; Mansurova, 1989]. В дальнейшем мы планируем детально исследовать свойства мембранной пирофосфатазы метанотрофов. Значение мембранной пирофосфатазы для метанотрофов вполне очевидно в связи с малой эффективностью сопряжения окислительного фосфорилирования при окислении Отсоединений и низкой внутриклеточной концентрацией АТФ при метилотрофном росте [Netrusov et al, 1977; Netrusov, Anthony, 1979; Четина, Троцеико, 1985].

Активность растворимой ФФн-азы не зависела от условий роста культуры и ие экспрессировалась при дефиците фосфора в среде, как можно было ожидать, если функция фермента в метаболизме связана с обеспечением клеток фосфатом. Напротив, щелочная фосфатаза экспрессировалась в таких условиях и секретировалась в культуральную среду. С использованием ВЭЖХ нами впервые получена в гомогенном состоянии и охарактеризована растворимая неорганическая ФФн-аза M.methanica 12. Фермент проявлял положительную кооперативность в отношении субстрата с коэффициентом Хилла пх ~ 2,9 и очень низкое сродство Кщ = 0,63 мМ. Олигомерная структура и сигмоидная кривая насыщения субстратом, а так же активация ионами магния указывают на регуляторную природу ФФн-азы M.methanica 12. Таким образом, несмотря на присутствие ФФн-азы в цитоплазме, она ие обеспечивает полный гидролиз ФФН, а регулирует его концентрацию, создавая условия, необходимые для функционирования ПФК в гликолитическом направлении.

Присутствие ПФК у всех исследованных метанотрофов и отсутствие у большинства не растущих на метане метилобактерий указывают на связь этого фермента с метаболизмом метана. Поскольку первая стадия окисления метана катализируется метанмонооксигепазой (ММО) и происходит с участием НАДН (в случае функционирования растворимой ММО) или восстановленных цитохромов (при функционировании мембранной ММО) как доноров электронов, отток этих восстановителей к метанмонооксигеназе снижает роль электронтранспортной цепи как поставщика АТФ. У метанотрофов обнаружен низкий внутриклеточный уровень АТФ, высокие внутриклеточные концентрации ФФН и низкая активность неорганической пирофосфатазы. Возможно, ФФН, являясь макроэргическим соединением, частично заменяет АТФ не только в ключевой реакции гликолиза, но и участвует в создании электрохимического потенциала на мембранах метанотрофов. Наши результаты подтверждаются присутствием в геноме Мс. capsulatus Bath, наряду с геном растворимой пирофосфатазы, двух генов, кодирующих мембранные Н+-пирофосфатазы [Ward et al., 2004].

Логично полагать, что дальнейшие исследования особенностей метаболизма неорганического пирофосфата у метанотрофов не только расширят наши теоретические представления, но и найдут применение при решении практических задач, связанных с реализацией биотехнологического потенциала этих уникальных бактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бесчастный, Александр Павлович, Пущино

1. Вагабов В.М., Трилисенко J1.B., Кулаев И.С. (2000) Зависимость длины цепи неорганических полифосфатов от содержания ортофосфата в среде у дрожжей. Биохимия. Т. 65. С. 414-420.

2. Величко И.С., Байков A.A. (1997) Гибридная форма неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия. Т. 62. №3. С. 275-279.

3. Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС, С. 204

4. Гальченко В.Ф., Андреев J1.B. и Троценко Ю.А. (1986) Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино: Изд. НЦБИ, С. 1-96.

5. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Тюрин B.C., Троценко Ю.А. (1975) Выделение чистых культур метанотрофов и их свойства. Микробиология. Т. 44. № 5. С. 844-850.

6. Гаязов P.P., Мшенский Ю.Н. (1991) Рост Methylococcus capsulalus при различных концентрациях аммонийного азота и неорганического фосфора. Микробиология Т. 60. №6. С. 172-174.

7. Гаязов P.P., Шишкина В.Н., Мшенский Ю.Н., Троценко Ю.А., Иванов Ю.А. (1985) Влияние температуры на рост и метаболизм Melhylomonas melhanica. ДАН СССР. Т. 284. № 3. С. 746-748.

8. Доронина Н.В. (1999) Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий. Автореферат докторской диссертации. ИБФМ РАН, Пущино.

9. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. (1984) Уровни ассимиляции углекислоты у бактерий с различными путями С|-метаболизма. Микробиология. Т.53. №6. С. 885-889.

10. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Сузипа Н.Е., Осипов Г.О., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. (2004) Новые термофильные метанотрофы рода MethyJocaldum. Микробиология. М. 73. № 4. С. 530-539.

11. Корнберг А. (1964) Горизонты биохимии. М. Мир. 191 С.

12. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. (2005) Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. М.: "Научный мир". 216 С.

13. Кулаев И.С., Коношенко Г.И. (1971) Обнаружение и некоторые свойства полифосфатаз Neurospora crassa, гидролизующих неорганические полифосфаты до ортофосфата. Биохимия. Т. 36. № 6. С. 1175-1182.

14. Кулаев И.С., Скрябин К.Г. (1974) Реакция неферментативного трансфосфорилирования за счет высокополимерных полифосфатов и их роль в абиогенезе. Журн. эвол. биохим. физиол. Т. 10. 553-560.

15. Кулаев И.С., Шади А., Мансурова С.Э. (1974) Полифосфаты фототрофных бактерий

16. Rhodospirillum rubrum при разных услових культивирования. Биохимия. Т. 39. С. 656661.

17. Личко Л.П. (1994) Биоэнергетика вакуолярной мембраны дрожжей. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. С. 59-65.

18. Логинова Н.В., Троцепко Ю.А. (1979) Карбоксилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. Микробиология. Т.42. №2. С. 202-207.

19. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. (1978) Метанокисляющие микроорганизмы. М., Наука. 195 С.

20. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Бергер У., Романовская В.А., Мучник Ф.В. (1993) Биология метанобразующих и метанокисляющих микроорганизмов. Киев: Наукова думка, 255 С.

21. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. (1991) Методы иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство). М.: Наука. С. 155-251.

22. Моносов Э.З., Нетрусов А.И. (1976) Локализация энергогенераторов у метанокисляющих бактерий. Микробиология. Т. 45. №4. С. 598-601.

23. Мутафов С. Б., Минкевич И. Г., Ерошин В. К. (1985) рН-ауксостат: теория и практика. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. С. 41.

24. Нетрусов А.И. (1987) Энергетический метаболизм метилотрофных бактерий. Биохимия и физиология метилотрофов (ред. Ю.А. Троценко). Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. С. 50-62.

25. Омельчеико М.В., Васильева Л.В., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (1993) Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофилыюго метанотрофа. Микробиология. Т. 62. № 5. С. 849-854.

26. Соколов А.П., Троценко Ю.А. (1977) Циклический путь окисления формальдегида у Pseudomonas oleovorans. Микробиология. Т. 46. № 6. С. 1119-1121.

27. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. (1986) Ультраструктурная организация метанотрофных бактерий. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. С. 116.

28. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н. (2005) Биотехнологический потенциал аэробных метилотрофных бактерий: настоящее и будущее. Прикл. биохимия и микробиология. Т. 41. №5. С. 495-503.

29. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. (2002) Особенности биологии галоалкалофильных метанотрофов. Микробиология. Т. 71. № 2. С. 149-159.

30. Хмеленина В.Н., Цветкова М.Г., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. (1997) Особенности метаболизма метилотрофного актиномицета Amycolatopsis methanolica. Микробиология. Т. 66. № 3. С. 327-334.

31. Четина Е.В., Троцепко Ю.А. (1989) Терминальные оксидазы метанотрофных бактерий

32. Methylomonas methanica. Микробиология. Т. 58. № 1. С. 31-35.

33. Четина Е.В. (1982) Изучение роли внутрицитоплазматических мембран в метаболизме метанотрофных бактерий Methylomonas methanica. Диссертация кандидата биологических наук. ИБФМ АН СССР. Пущино-на-Оке. С. 99-118.

34. Четина Е.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1981) Выделение и характеристика мембран Methylomonas methanica. Биохимия. Т. 46. № 11. С. 2100-2109.

35. Четина Е.В., Сузина Н.Е., Фихте Б.А., Троценко Ю.А. (1988) Цитохимическое выявление локализации ферментов энергетического метаболизма у Methylomonas methanica. Микробиология. Т. 57. № 1. С. 125 -131.

36. Четина Е.В., Троценко Ю.А. (1981) Внутриклеточная локализация ферментов окисления С|- соединений у облигатных метанотрофов. Микробиология, Т. 50. № 3 С. 446-452.

37. Четина Е.В., Троценко Ю.А. (1987) Уровни аденин- и пиридиннуклеотидов у метанотрофных бактерий. Микробиология, Т.56. №3. С. 369-373.

38. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А. (1986) Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофными бактериями. Микробиология. Т.55. №3. С. 377-382.

39. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А. (1990) Метаболизм неорганических полифосфатов и пирофосфата у метанотрофных бактерий. Микробиология. Т. 59. № 4. С. 533-538.

40. Agosti R.D., Van Praag E., Greppin H. (1992) Effect of chloride ions on the kinetic parameters of the potato tuber and mung bean pyrophosphate-dependent phosphofructokinase. Biochem. Int. V26. P.707-713.

41. Alves A.M.C.R., Euverink G.J.W., Santos H., Dijkhuizen L. (2001) Different physiological roles of ATP-, PPi dependent phosphofructokinase isoenzymes in methylotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica. J. Bacteriol. V. 183. No. 24. P. 7231-7240.

42. Alves A.M.C.R., Meijer W.G., Vrijbloed J.W., Dijkhuizen L. (1996) Characterisation and phylogeny of the pfp gene of Amycolatopsis methanolica encoding PPi-dependent phosphofructokinase. J. Bacteriol. V. 178. P. 149-155.

43. Amaratunga K., Goodwin P.M., O'Connor C.D., Anthony C. (1997) Erratum to «The methanol oxidation genes mxaFJCIR(S)ACKLD in Methylobacterium extorquens. (1997) Microbiol.1.tt. V. 146. P. 31-38. FEMS Microbiol. Lett. V. 150. P. 175-177.

44. Ambler R.P., Dalton H., Meyer T.E., Bartsch R.G., Kamen M.D. (1986) The amino acid sequence of cytochrome c-555 from the methane-oxidizing bacterium Methylococcus ccipsulatus. Biochem. J. V. 233. P. 333-337.

45. Anderson A.J., Dawes E.A. (1990) Occurrence, metabolism, metabolic role, industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. V. 54. P. 450-472.

46. Anderson R.L, Sabularse D.C. (1982) Inorganic pyrophosphate: D-fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase from mung bean. Methods Enzymol. V. 90 P. 91-97.

47. Anthony C. (1982) The biochemistry of methylotrophs. London: Acad. Press. P.251.

48. Anthony C. (1986) Bacterial oxidation of methane and methanol. Microbial. Physiology. V.27. P. 113-210.

49. Anthony C. (1991) Assimilation of carbon in methylotrophs. In: Biology of methylotrophs (eds. Goldberg I. and Rokem J.S.), Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass. P. 79-109.

50. Anthony C. (1992) The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenase. Int.J.Biochem. V.24. P. 29-39.

51. Anthony C., Ghosh M., Blake C.C.F. (1994) The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrroloquinoline quinone. Biochem. J. V. 304. №3. P. 665-674.

52. Anthony C., Williams P. (2003) The structure and mechanism of methanol dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. V. 1647. P. 8-23.

53. Anthony C., Zatman L.J. (1964) The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. Biochem.J. V.92. P. 614-621.

54. Ap Rees T., Green J.H., Wilson P.M. (1985) Pyrophosphate:fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase and glycolysis in non-photosynthetic tissues of higher plants. Biochem. J. V. 227. №1. p. 299-304.

55. Arimoto T., Ansai T., Yu W., Turner A.J., Takehara T. (2002) Kinetic analysis of PPi-dependent phosphofructokinase from Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiol. Lett. V. 207. №1. P. 35-38.

56. Attwood M.M., Arfman N., Weusthuis R.A., Dijkhuizen L. (1992) Purification and characterization of an NAD+-linked formaldehyde dehydrogenase from the facultative RuMP cycle methylotrophs Arthrobacter PI. Anton.van Leeuwen. V.62, №3. P. 201-207.

57. Baltscheffsky M. (1967) Inorganic pyrophosphate as an energy donor in photosynthetic, respiratory electron transport phosphorylation systems. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.28. P. 270-276.

58. Baltscheffsky M., Schulz A., Baltscheffsky H. (1999) H+-PPases: a tightly membrane-boundfamily. FEBS Lett. V. 457. P. 527-533.

59. Bapteste E., Moreira D., Philippe H. (2003) Rampant horizontal gene transfer and phospho-donor change in the evolution of the phosphofructokinase. Gene. V. 318. P. 185-191.

60. Bastien C., Machlin S., Zhang Y., Donaldson K., Hanson R.S. (1989) Organization of genes required for the oxidation of methanol to formaldehyde in three type II methylotrophs. Appl.Environ.Microbiol. V.55. №12. P. 3124-3130.

61. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L., Kovaks K.L., Embley T.M., Prosser J.I., Murrell J.C. (2002) The ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulars (Bath). Arch. Microbiol. V. 177. P. 279-289.

62. Baykov A., Volk S. (1985) Quantitative Detection of Orthophosphate in Polyacrylamide Gels. Anal. Biochem. V. 151. P. 13-15.

63. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of orthophosphate. Anal. Biochem. V. 132. P. 254-258.

64. Bertagnolli B.L., Cook P.F. (1984) Kinetic mechanism of pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Propionibacterium freudenreichii. Biochemistry. V. 23. №18. P. 4101-4108.

65. Blangy D., Buc H., Monod J. (1968) Kinetics of the allosteric interactions of phosphofructokinase from Escherichia coli. J. Mol. Biol. V. 31. P. 13-35.

66. Bodrossy L., Kovacs K.L., Donald I.R., Murrell J.C. (1999) A novel thermophilic methane-oxidizing y-Proteobacterium. FEMS Microbiol.Letters. V. 170. P. 335-341.

67. Bruchhaus I., Jacobs T., Denart M., Tannich E. (1996) Pyrophosphate dependent phosphofructokinase of Entamoeba histolytica', molecular cloning, recombinant expression and inhibition by pyrophosphate analogues. Biochem. J. V. 316. P. 57-63.

68. Byrom D. (1987) Polymer synthesis by microorganisms: technology, economics. Trends Biotechnol. V. 5. P. 246-250.

69. Carnal N.W., Black C.C. (1979) Pyrophosphate- dependent 6-phosphofructokinase, a new glycolytic enzyme in pineapple leaves. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 86. № l.P. 20-26.

70. Carnal N.W., Black C.C. (1983) Phosphofructokinase activities in photosynthetic organisms: the occurrence of pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase in plants and algae. Plant Physiol. V. 71. № l.P. 150-155.

71. Chen J., Brevet A., Fromant M., Leveque F., Schmitter J.-M., Blanquet S., Plateau P. (1990) Pyrophosphatase is essential for growth of Escherichia coli. J.Bacteriol. V.172. №10. P. 56865689.

72. Chen Y.P., Yoch D.C. (1988) Reconstitution of the electron transport system that couples formate oxidation to nitrogenase in Methylosinus trichosporium OB3b. J. Gen. Microbiol. V. 134. P.3123-3128.

73. Chen Y.P., Yoch D.C. (1989) Isolation, characterization and biological activity of ferredoxin-NAD+ reductase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. 171: 5012-5016.

74. Chi A, Kemp R.G. (2000) The primordial high energy compound: ATP or inorganic pyrophosphate? J. Biol. Chem. V. 275. P. 35677-35679

75. Chi A. S., Deng Z., Albach R. A., Kemp R. G. (2001) The two phosphofructokinase gene products of Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. V. 276. P. 19974-19981.

76. Chistoserdova L., Vorholt J.A., Thauer R.K., Lidstrom M.E. (1998) Ci transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic and methanogenic archaea. Science. V.281. P. 99-102.

77. Cho Y.K., Matsunaga T.O., Kenyon G.L., Bertagnolli B.L., Cook P.F. 1988. Isotope exchange as a probe of the kinetic mechanism of pyrophosphate-dependent phosphofructokinase. Biochemistry V. 27. №9. P. 3320-3325.

78. Clark J.E., Boegen H., Wood H.C. (1986) Isolation of intact chains of polyphosphate from Propionibacterium shermanii grown on glucose or lactate. J.Bacteriol., V.168. No 3. P. 12121219.

79. Cruden D.L., Durbin W.E., Markovetz A.J. (1983) Utilization of PPi as an energy source by a Clostridium sp. Appl Environ Microbiol. V. 46. P. 1403-1408.

80. Dandekar T., Schuster S., Snel B., Huynen M., Bork P. (1999) Pathway alignment: application to the comparative analysis of glycolytic enzymes. Biochem. J. V. 343. P. 115-124.

81. Davey J. F., Mitton J. R. (1973) Cytochromes of two methane-utilizing bacteria. FEBS Lett., V. 37. №2. P. 335-341.

82. Davis B.J. (1964) Disc electrophoresis II. Method, application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. V. 121. P. 321-403.

83. Deng C., Roberts D., Wang X., Kemp R.G. (1999) Expression, characterization and crystallization of the pyrophosphate-dependent phosphofructo-1-kinase of Borrelia burgdorferi. Arch. Biochem. Biophys V. 371. P. 326-331.

84. Deng Z., Huang M., Singh K., Albach R.A., Latshaw S.P., Chang K-P., Kemp R.G. (1998) Cloning and expression of the gene for the active PPi-dependent phosphofructokinase of Entamoeba histolytica. Biochem. J. V. 329. P. 659-664.

85. Denton H., Thong K.-W., Coombs G.H. (1994) Eimeria tenella contains a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase and a pyruvate kinase with unusual allosteric regulators. FEMS Microbiol. Lett. V. 115. P. 87-92.

86. DeSantis D., Tryon V.V., Pollack J.D. (1989) Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas pathway and the hexose monophosphate shunt. J. Gen. Microbiol. V. 135. P. 683-691.

87. Ding Y.-H.R., Ronimus R.S., Morgan H.W. (1999) Purification and properties of the pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Dictyoglomus thermophilum. Extremophiles V. 3. P. 131-137.

88. Ding Y.-H.R., Ronimus R.S., Morgan H.W. (2001) The phosphofructokinases of Thermotogamaritima: expression and characterisation of two unique enzymes. J. Bacteriol. V. 183. P. 791— 794.

89. Docampo R., Moreno S.N. (2001) The acidocalcisome. Mol. Biochem. Parasitol. V. 114. P. 151-159.

90. Duine J. A., Frank J., Ruiter L.S. (1979) Isolation of methanol dehydrogenase with a functional coupling to cytochrome c. J.Gen.Microbiol. V.l 15. P. 523-524.

91. Dunfield P., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. (2003) Methylocella silvestrls sp. nov. a novel methanotrophic bacterium isolated from an acidic forest cambisol. Int. J. of Syst. Evol. Microbiol. V. 53. № 3. P. 1231-1239.

92. Ellwood P.C., Tempest D.W. (1972) Effects of environment on bacterial wall content, composition. Adv. Microbial. Physiol. V. 7. P. 83-117.

93. Felsenstein J. (2004) PHYL1P: Phylogeny inference Package Version 3.6.: University of Washington, Seattle.

94. Ferenci T. (1976) Oxygen metabolism in Pseudomanas methanica. Arch. Microbiol. V. 108. P. 217-219.

95. Ferenci Т., Strom T. Quayle J.R. (1974) Purification and properties of 3-hexulose phosphate synthase from Methylococcus capsulaius. Biochem. J. V. 144. P. 477-486.

96. Findlay J. В. C., Evans W. H. (1987) Биологические мембраны. Методы, Пер. с англ. (1990) М.: Мир, С. 251-252.

97. Fothergill-Gilmore L.A., Michels P.A.M. (1993) Evolution of glycolysis. Prog. Biophys. Mol. Biol. V. 59. P. 105-235.

98. Hanson R.S., Hanson Т.Е. (1996) Methanotrophic bacteria. Microbiol. Rev. V.60. №2. P.439-471.

99. Harder W., Quayle J.R. (1971) The biosynthesis of serine and glycine in Pseudomonas AMI with special reference to growth on carbon sources other than Ci- compounds. Biochem. J. V. 121. P. 753-762.

100. Harold F. M. (1960) Accumulation of inorganic polyphosphates in mutants of Neurosporacrassa. Biochim. Biophys. Acta. V. 45. P. 172-188.

101. Heinonen J.K., Honkasalo S.H., Kukko E.I. (1981) A method for the concentration, for the colorimetric determination of nanomoles of inorganic pyrophosphate. Anal. Biochem. V. 117. P. 293-300.

102. Hill T.L. (1985) Cooperativity theory in biochemistry. Steady-State, equilibrium systems. Springer-Verlag. New York

103. Holbrook I.B., Leaver A.G. (1976) A procedure to increase the sensitivity of staining by Coomassie Brilliant Blue-perchloric acid solution. Anal. Biochem. V. 75. P. 634-636.

104. Ichiba T., Takenaka 0., Hachimori A. (1990) Primary structure of the inorganic pyrophosphatase from thermophilic Bacterium PS-3. J.Biochem., V.108. P.572-578.

105. Ilias M., Young T.W. (2006) Streptococcus gordonii soluble inorganic pyrophosphatase: an important role for the interdomain region in enzyme activity. Biochim Biophys Acta. V. 1764. №7. P. 1299-306.

106. Jetten M.S., Fluit T.J., Stams A.J., Zehnder A.J. (1992) A fluoride-insensitive inorganic pyrophosphatase isolated from Methanothrix soehngenii. Arch. Microbiol. V. 157. №3. P. 284289.

107. Josse J. (1966) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. II. Nature, binding of active substrate, the role of magnesium. J. Biol. Chem. V. 241. P. 1948-1957.

108. Josse J., Wong S.C.K. (1971) In The Enzymes. Boyer P.D. ed. 3rd Edn., Academic Press. New York. V. 4. P. 499-527.

109. Kalb V.F., Bernlohr R.W. (1977) A new spectrophotometric assay for protein in cell extracts. Anal. Biochem., V.82. P. 362-371.

110. Kang C.B.H., Ho K.K. (1991) Characterization of a soluble inorganic pyrophosphatase from Microcystis aeruginosa, preparation of its antibody. Arch. Biochem. Biophys. V. 289. № 2. P. 281-288.

111. Kemp R. G., Tripathi R. L. (1993) Pyrophosphate-dependent phosphofructo-1-kinasecomplements fructose-1,6-bisphosphatase but not phosphofructokinase deficiency in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 175. P. 5723-5724.

112. Klein C.R., Kesseler F.P., Perreli C., Frank J., Duine J.A., Schwartz A.C. (1994) A novel dye-linked formaldehyde dehydrogenase with some properties indicating the presence of a protein-bound redox-active quinone cofactor.

113. Klemme J. H. (1976) Regulation of intracellular pyrophosphatase-activity, conservation of the phosphoanhydride-energy of inorganic pyrophosphate in microbial metabolism. Z. Naturforsch. Teil C. V. 31. P. 544-550.

114. Klemme J. H., Gest H. (1971) Regulation of cytoplasmic inorganic pyrophosphatase of Rhodospirillum rubrum. Eur.J.Biochem. V. 22. P. 529-537.

115. Knight W.B., Dunaway-Mariano D., Ransom S.C., Villafranca J.J. (1984) Investigations of the metal ion-binding sites of yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem. V. 259. №5. P. 2886-2895.

116. Kornberg A. (1950) Enzymatic synthesis of triphosphopyridine nucleotide. J. Biol. Chem., V.182, P. 779-793.805-813

117. Kornberg A. (1962) On the metabolic significance of phosphorolytic and pyrophosphorolytic reactions. In M.Kasha, E.Pullman, eds, Horizons in Biochemestry. Acad. Press, New York, P. 251-287.

118. Korotkova N., Lidstrom M.E. (2001) Connection between poly-/?-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on Ci and Ci compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. V. 183. №3. P. 1038-1046.

119. Kukko E., Heinonen J., (1982) The intracellular concentration of pyrophosphate in the batch culture of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. V. 127. № 2. P. 347-349.

120. Kulaev I.S Vagabov V.M. (1983) Polyphosphate metabolism in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol. V. 24. P. 83-171.

121. Ladror U.S., Gollapudi L., Tripathi R.L., Latshaw S.P., Kemp R.G. (1991) Cloning, sequencing, and expression of pyrophosphate-dependent phosphofructokinse from Propionibacterium freudenreichii. J. Bio. Chem. V. 266. P. 16550-16555.

122. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V. 227. P. 680-685.

123. Lahti R. (1983) Microbial Inorganic Pyrophosphatases. Microbiol. Reviews. V. 47. № 2. P.169.179.

124. Large P.J., Peel D., Quayle J.R. (1961) Microbial growth on Ci -compounds. 2. Synthesis of cell constituents by methanol- and formate-grown Pseudomonas AMI, and methanol -grown Hyphomicrobium vulgare. Biochem. J. V. 81. P. 470-480.

125. Lees V., Owens N.J.P., Murrell J.C. (1991) Nitrogen metabolism in marine methanotrophs. Arch.Microbiol. V.157, № 1. P. 60-65.

126. Li Z., Phillips N.F.B. (1995) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Giardia lamblia: purification and characterisation. Protein. Expres. Purif. V. 6. P. 319-328.

127. Lichko L, Okorokov L. (1991) Purification, some properties of membrane-bound, soluble pyrophosphatases of yeast vacuoles. Yeast. V. 7. P. 805-812.

128. Lieberman R.L., Rosenzweig A.C. (2004) Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenase. Crit.Rev. Biochem.Mol.Biol. V.39. №3. P. 147-164.

129. Lipmann F. (1965) Projecting backward from the present stage of evolution of biosynthesis. In: The Origin of Prebiotic Systems and their Molecular Matrices (S.W.Fox, ed.), Acad. Press, New York, P. 212-216.

130. Lohmann R., Orgel L.E. (1968) Prebiotic synthesis: phosphorylation in aqueous solution. Science V. 161. P. 64-66.

131. Lowenstein J.M. (1958) Transphosphorylations catalysed by bivalent metal ions. J. Biochem. V. 70. P. 222-231.

132. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. V. 193. P. 265-275.

133. Macy J.M., Ljungdahl L.G., Gottschalk G. (1978) Pathway of succinate and propionate formation in Bacteroides fragilis. J. Bacteriol. V. 134. P. 84-91.

134. Mansurova S. E. (1989) Inorganic pyrophosphate in mitochondrial metabolism. Biochim. Biophys. Acta. V. 977. P. 237-247.

135. Marmur J.A. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J.Mol.Biol. V.3. P. 208-214.

136. McDonald I.R., Murrell J.C. (1997) The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl.Environ.Microbiol. V.63,№8. P. 3218-3224.

137. Mertens E (1991) Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase, an anaerobic glycolytic enzyme? FEBS Lett. V. 285. P. 1-5.

138. Mertens E., De Jonckheere J., Van Schaftingen E. (1993) Pyrophosphate dependent phosphofructokinase from the amoeba Naegleria fowleri, an AMP-sensitive enzyme. Biochem. J. V. 292. P. 797-803.

139. Mertens E. (1990) Occurrence of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-transferase in Giardia lamblia trophozoites. Mol. Biochem. Parasitol. V. 40. P. 147-150.

140. Mertens E. (1993) ATP versus pyrophosphate: glycolysis revisited in parasitic protists. Parasitology Today. V. 9. P. 122-126.

141. Michels P.A., Chevalier N., Opperdoes F.R., Rider M.H., Rigden D.J. (1997) The glycosomal ATP-dependent phosphofructokinse of Trypanosoma brucei must have evolved from an ancestral pyrophosphate-dependent enzyme. Eur. J. Biochem. V. 250. P. 698-704.

142. Miller S.L., Parris M. (1964) Synthesis of pyrophosphate under primitive earth conditions. Nature V. 204. P. 1248-1249.

143. Minnikin D.E., Adbolrahimzadeh H. (1974) Replacement of phosphatidylethanolamine, acidic phospholipids by an ornithine-amide lipid, a minor phosphorus-free lipid in Pseudomonas jluorescens NCMB 129. FEBS Lett. V. 43. P. 257-260.

144. Mitsui R., Sakai Y,, Yasueda H., Kato N. (2000) A novel operon encoding formaldehyde fixation: the ribulose monophosphate pathway in the gram-positive facultative methylotrophicbacterium Mycobacterium gastrii MB 19. J. Bacteriol. V. 182. P. 944 948.

145. Miyatake K., Enomoto T., Kitaoka S. (1984) Detection and subcellular distribution of pyrophosphate: D-fructose 6-phosphate phosphotransferase (PFP) in Euglena gracilis. Agr. Biol. Chem. V. 48. P. 2857-2859.

146. Mizushima S., Ishida M., Miura T. (1966) Subfraction of protoplast membrane, enzyme localization in Bacillus megaterium. J. Biochem. V. 60. P. 256-261.

147. Moore, S.A., Ronimus, R.S., Roberson, R.S., Morgan, H.W. (2002) The structure of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Structure (Camb). V. 10. P. 659-671.

148. Morton J.D., Hayes K.F., Semrau J.D. (2000) Effect of copper speciation on whole-cell soluble methane monooxygenase activity in Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V.66. №4. P. 1730-1733.

149. Muller M., Lee J. A., Gordon P., Gaasterland T., Sensen C.W. (2001) Presence of prokaryotic and eukaryotic species in all subgroups of the PPi-dependent group II phosphofructokinase protein family. J. Bacteriol. V. 183, P. 6714-6716.

150. Munk N., Rosenberg H. (1969) On the deposition and utilization of inorganic pyrophosphate in Tetrahymena pyriformis. Biochim. Biophys. Acta. V.177. P. 629-640.

151. Murrell J.C., Dalton H. (1983) Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. J.Gen.Microbiol. V.129, №11. P. 3481-3486.

152. Murrell J.C., Dalton H. (1992) Methane and methanol utilizers. Biotechnology handbooks. Ed. Atkinson T., Sherwood R.F. Plenum Press. London. 286 P.

153. Murrell J.C., Gilbert B., McDonald I.R. (2000) Molecular biology and regulation of methane monooxygenase. Arch. Microbiol. V. 173. P. 325-332.

154. Netrusov A.I., Anthony C. (1979) The microbial metabolism of Ci- compounds. Oxidative phosphorylation in membrane preparations of Pseudomonas (Methylobacterium) sp. AMI. Biochem. J. V. 178. №3. P. 353-360.

155. Nyren P., Beston F. Nore B.F., Baltscheffsky M. (1986) Studies on photosynthetic inorganic pyrophosphate formation in Rhodospirillum rubrum chromatophores. Biochem. Biophys. Acta. V. 851. P. 276-282.

156. Nyren P., Edwin V. (1994) Inorganic pyrophosphatase-based detection systems. Anal. Biochem. V. 220. P. 39-45.

157. Nyren P., Strid A. (1991) Hypothesis: the physiological role of the membrane-bound proton-translocating pyrophosphatase in some phototrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V.77. P. 265-270.

158. Oakley C.J., Murrell J.C. (1988) nijH genes in the obligate methane oxidizing bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V.49, №1. P. 53-57.

159. O'Brien W. E., Bowin S., Wood H. G. (1975) Isolation and characterization of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Propionibacterium shermanii. J. Biol. Chem. V. 250. № 22. P. 8690-8695.

160. O'Connor M.L., Hanson R.S. (1975) Serine transhydroxymethylase isoenzymes from a facultative methylotroph. J. Bacteriol. V.124. P. 985-996.

161. Ornstein L. (1964) Disc electrophoresis I. Background, theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. V. 121. P.321-403.

162. Patel R. N., Hou C. T., Felix A. (1979) Purification and properties of cytochrome c from Methylomonas methanica. J. Gen. Appl. Microbiol., V.25. P. 197-204.

163. Patel R.N., Hou C.T., Derelanko P., Felix A. (1980) Purification and properties of a heme-containing aldehyde dehydrogenase from Methylosinus trichosporium. Arch.Biochem. Biophys. V.203, №2. P. 654-662.

164. Peng Z-Y, Mansour TE. (1992) Purification and properties of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Toxoplasma gondii. Mol. Biochem. Parasitol. V. 54. P. 223-230.

165. Petzel J.P., Hartman P.A., Allison M.J. (1989) Pyrophosphate-dependent enzymes in walled bacteria phylogenetically related to the wall-less bacteria of the class Mollicutes. Int J. Syst Bacteriol. V. 39. №4. P. 413-419.

166. Pfleiderer C, Klemme J.H. (1980) Pyrophosphate-dependent D-fructose-6-phosphate-phosphotransferase in Rhodospirillaceae. Z. Naturforsch. V. 35. P. 229-238.

167. Phillips N.F.B., Li Z. (1995) Kinetic mechanism of pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Giardia lamblia. Mol. Biochem. Parasitol. V. 73. P. 43-51.

168. Phillips N.F.B., Li Z., Lindmark D.G. (1997) Isolation of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Hexamita injlala. Mol. Biochem. Parasitol. V. 90. P. 377-380.

169. Pollack J.D., Williams M.V. (1986) PPi-dependent phosphofructotransferase (phosphofructokinase) activity in the mollicutes (mycoplasma) Acholeplasma laidlawii. J. Bacteriol. V. 165 №1. P. 53-60.

170. Pomper B.K., Vorholt J.A., Chistoserdova L„ Lidstrom M.E., Thauer R.K. (1999) Amethenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolase and a methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase in Methylobacterium exlorquens AMI. Eur.J.Biochem. V.261, №2. P. 475-480.

171. Poorman R.A., Randolf A., Kemp R.G., Heinrikson R.L. (1984) Evolution of phosphofructokinase gene-duplication and creation of new effector sites. Nature 309 •A61-469

172. Popov V.O., Lamzin V.S. (1994) NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J. V. 301. P. 625-643.

173. Prior S.D., Dalton H. (1985) The effect of copper ions on membrane content and methane monooxygenase activity in methanol-grown cells of Methylococcus capsulatus (Bath). J.Gen. V.131.P. 155-163.

174. Quayle J.R. (1972) The metabolism of one-carbon compounds by microorganisms. In: Adv. Microbial Physiol., Acad. Press, London-New York. V. 7. P. 119-149.

175. Quayle J.R. (1980) The microbial assimilation of C| compounds. The Thirteenth CIBA Medal Lecture. Biochem.Soc.Trans. V.8, №1. P. 1-10.

176. Quayle J.R., Ferenci T. (1978) Evolutionary aspects of autotrophy. Microbiol. Rev. V.42. P. 251-273.

177. Rapoport T. A., Hohne W. E., Heitmann P., Rapoport S. M. (1973) Binding of ligands to the inorganic pyrophosphatase of baker's yeast. Eur. J. Biochem. V. 33. P. 341-347.

178. Rea P.A., Kim Y., Sarafian V., Poole R.J., Davies J.M., Sanders D. (1992) Vacuolar H+-translocating pyrophosphatases: a new category of ion translocase. TIBS. V. 17. P. 348-353.

179. Reeves R. E., Serrano R., South D. J. (1976) 6-Phosphofructokinase (pyrophosphate). Properties of the enzyme from Entamoeba histolytica and its reaction mechanism. J. Biol. Chem. V. 251. № 10. P. 2958-2962.

180. Reeves R. E., South D. J., Blytt H. J. Warren L. G. (1974) Pyrophosphate:D-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase. A new enzyme with the glycolytic function of 6-phosphofructokinase. J. Biol. Chem. V. 249. P. 7737-7741.

181. Roberson R.S., Ronimus R.S., Gephard S., Morgan H.W. (2001) Biochemical characterization of an active pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Treponema pallidum. FEMS Microbiol. Lett. V. 194. P. 257-260.

182. Roberton A.M., Glucina P.G. (1982) Fructose-6-phosphate phosphorylation in Bacteroides species. J. Bacterid. V. 150 №3. P. 1056-(1060)

183. Ronimus R. S., Morgan H. W. (2001) The biochemical properties and phylogenies of phosphofructokinases from extremophiles. Extremophiles V. 5. P. 357-373

184. Ronimus R.S., de Heus E, Ruckert A, Morgan HW. (2001) Sequencing, high-level expression and phylogeny of the pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from the thermophilic spirochete Spirochaeta thermophila. Arch. Microbiol. V. 175. P. 308-312.

185. Ronimus R.S., Morgan H.W., Ding Y-HR. (1999) Phosphofructokinase activities within the order Spirochaetales and the characterization of the phosphofructokinase from Spirochaeta thermophilci. Arch. Microbiol. V. 172. P. 401-406.

186. Roth J., (1983) The colloidal gold marker system for light, electron microscopic cytochemistry. Immunocytochemistry (Eds. Bullock G.R., Petrusz P.). London: Acad. Press. V. 2. P. 217-284.

187. Sakai Y., Mitsui R., Katayama Y., Yanase II, Kato N. (1999) Organization of the genes involved in the ribulosemonophosphate pathway in an obligate methylotrophic bacterium, Methylomonas aminofaciens 77a. FEMS Microbiol. Lett. V. 176. P. 125-130.

188. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NewYork

189. Sawyer M.H., Baumann P., Baumann L. (1977) Pathways of D-fructose and D-glucose catabolism in marine species of Alcaligenes, Pseudomonas marina and Alteromonas communis. Arch. Microbiol. V. 112. P. 169-172.

190. Schachov Y.A., Netrusov A.I., Gulikova O.M., Kulaev I.S. (1983) Regulation of pyrophosphatase activity of a methylotroph Pseudomonas (Methylobacterium) sp. AMI. Abstract IV-th Int. Symp. "Microb. Growth on CI compounds", Minneapolis, USA, P. 1-17.

191. Scholes P.B., Smith L. (1968) The isolation, properties of the cytoplasmic membrane of Micrococcus denitrificans. Biochem. Biophys. Acta. V. 153. P. 350-362.

192. Seiler U., Pape H., Schröder W. (1996) A pyrophosphate-dependent phosphofructokinase (PFK) from Actinoplanes sp., Abstracts of the Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie, March 24-27,1996, Bayreuth, Germany, No 119

193. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J.,Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R., Murreil J.C., Lidstrom M.E. (1995) Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. J.Bacteriol. V.177, №11. P. 3071-3079.

194. Seufferheld M., Lea C. R., Vieira M., Oldfield E., Docampo R. (2004) The H+-pyrophosphatase of Rhodospirillum rubrum is predominantly located in polyphosphate-rich acidocalcisomes. J. Biol. Chem. V.279. P. 51193-51202.

195. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1979) Pathways of ammonia assimilation in obligate methane utilizers. FEMS Microbiol. Lett. V.5. P. 187-191.

196. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1982) Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V. 13. № 2. P. 237-242.

197. Siebers B., Hensel R. (1993) Glucose metabolism of the hyperthermophilic archaeum Thermoproteus tenax. FEMS Microbiol. Lett. V. 111. P. 1-8.

198. Siebers B., Klenk H.P., Hensel R. (1998) PPi-dependent phosphofructokinase from

199. Thermoproteus tenax, an archaeal descendant of an ancient line in phosphofructokinase evolution. J. Bacteriol. V. 180. P. 2137-2143.

200. Smirnova I.N., Baikov A.A. (1983) Two-stage mechanism of the fluoride inhibition of inorganic pyrophosphatase using the fluoride ion. Biokhimiia. V. 48. №10. P. 1643-1653.

201. Smith T.J., Slade S.E., Buron N.P., Murrell J.C., Dalton H. (2002) Improved system for protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V.68. №11. P. 5268-5273.

202. Spector T. (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. Anal. Biochem. V. 86. P. 142-146.

203. Speer B.S., Chistoserdova L., Lidstrom M. E. (1994) Sequence of the gene for a NAD(P)-dependent formaldehyde dehydrogenase (class III alcohol dehydrogenase) from a marine methanotroph Methylobacter marinus A45. FEMS Lett. V.121, №3. P. 349-356.

204. Stitt M. (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate: fructose-6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate. Plant Physiol. V. 89. № 2. P. 628-633.

205. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., Lidstrom M.E. (1999) Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath. Microbiology. V.145, №5. 1235-1244.

206. Strom T., Ferenci T., Quayle J.R. (1974) The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium OB3B during growth on methane. Biochem. J. V. 144. P. 465-472

207. Takahashi N., Kalfas S., Yamada T. (1995) Phosphorylating enzymes involved in glucose fermentation of Actinomyces naeslundii. J. Bacteriol. V. 177. P. 5806-5811.

208. Takahashi N., Yamada T. (2000) Glucose metabolism by Provotella intermedia and Prevotella nigrescens. Oral Microbiol. Immunol V. 15. №3. P.188-195.

209. Taylor S.C., Dalton H., Dow C.S. (1981) Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and carbon assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. V. 122. P. 8994.

210. Tetas M., Lowenstein J. (1963) The effect of bivalent metal ions on the hydrolysis of adenosine di- and triphosphate. Biochemistry V. 2. P. 350-365.

211. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmaugin F., Higgins D.G. (1997) The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. V.25. № 24. P. 4876-4882.

212. Tominaga N., Mori T. (1977) Purification and properties of inorganic pyrophosphatase from Thiobacillus thiooxidans. J. Biochem. V. 81. P. 477-483.

213. Tommassen J., Lugtenberg B. (1982) Pho-regulon of Escherichia coli K-12: a minireview. Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. V. 133 A. P. 243-249

214. Tonge G.M., Drozd J.W., Higgins I.J. (1977) Energy coupling in Methylosinus Irichosporium. J. Gen. Microbiol., V. 99. P.229-232.

215. Tonge G.M., Harrison D. E.F., Knowles C.J., Higgins I,J. (1975) Properties and partial purification of the methane-oxidizing enzyme system from Methylosinus irichosporium. FEBS Lett. V. 58. P. 293-299.

216. Torriani A. (1960) Influence of inorganic phosphate in formation of phosphatases by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. V. 38. P. 460-466.

217. Torriani-Gorini A. (1994) Introduction of Pho regulon of Escherichia coli. In: Phosphate in Microorganisms (A.Torriani-Gorini, S.Silver, E.Yagil, eds). Amer. Soc. Microbiol. Washington, D.C. P. 1-4.

218. Trotsenko Y.A. (1983) Metabolic features of methane- and methanol-utilizing bacteria. Acta.Biotechnol. V.3,№ 3. P. 301-304.

219. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Govorukhina N.I. (1986) Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria. FEMS Microbiol.Lett. V.33, №1-2. P. 293-297.

220. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. (2002) Biology of extremophilic and extremotolerant methanotrophs. Arch. Microbiol. V.177, №2. P. 123-131.

221. Trotsenko Y.A., Shishkina V.A. (1990) Studies on phosphate metabolism in obligate methylotrophs. FEMS Microbiol. Rev. V. 87. № 3-4. P. 267-271.

222. Trotsenko Y.A., Shishkina V.N., Govorukhina N.I., Sokolov A.P. (1987) Biochemical basis for obligate methylotrophy and obligate autotrophy: comparative aspects. Winogradsky Symp. on Lithoautotrophy. P. 26.

223. Tsubota J., Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. (2005) Methyl other mus thermalis gen. nov., sp. nov. a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 55. P. 1877 1884.

224. Turner W.L, Plaxton W.C. (2003) Purification and characterization of pyrophosphate- and ATP-dependent phosphofructokinases from banana fruit. V. 217. №1. P. 113-121.

225. Uyeda K. (1979) Phosphofructokinase. In: Meister A. (ed) Adv. Enzymol., Wiley, New York. V. 48. P. 193-241.

226. Verhees C.H., Tuininga J.E., Kengen W.M., Stams S.M., J. van der Oost, W.M. de Vos. (2001) ADP-dependent phosphofructokinses in mesophilic and thermophilic methanogenic Archea. J. Bacteriol. V. 12. P. 7145-7153.

227. Villiotte P.J., Riefsnyder P.C., Bloomstone J.A., Howland J.L. (1991) Uptake of inorganic pyrophosphate Bacillus megaterium. FEMS Microbiol. Lett. V. 78. P. 293-296.

228. Vorholt J.A. (2002) Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria. Arch.Microbiol. V.178, №4. P. 239-249.

229. Vorholt J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R.K. (1998) The NADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AMI. J.Bacteriol. V.180. № 20. P. 5351-5356.

230. Wadzinski A.M., Ribbons D.W. (1975) Oxidation of Ci-compounds by particulate fractions from Methylococcus capsulatus: properties of methanol oxidase, methanol dehydrogenase. J. Bacteriol., V. 122. P. 1364.

231. Ward N., Larsen Q., Sakwa J., Bruseth L., and 38 coauthors. (2004) Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath) PLoS Biology. V.2.P. 1616-1628.

232. Ware D., Postgate J.R. (1971) Physiological, chemical properties of a reductant-activated inorganic pyrophosphatase from Desulfovibrio desulfuricans. J. Gen. Microbiol. V. 67. P. 145160.

233. Weaver T. L., Dugan P.R., (1975) Methylotrophic enzyme distribution in Methylosinus trichosporium. J. Bacteriol., V. 122. P. 433.

234. Wessberg K.L., Skolnick S., Xu J., Marciano-Cabral F., Kemp R.G. (1995) Cloning, sequencing and expression of the pyrophosphate-dependent phosphofructo-1-kinase from Naegleria fowleri. Biochem. J. V. 307. P. 143-149.

235. Whittaker A., Botha F.C. (1997) Carbon partitioning during sucrose accumulation in sugarcane internodal tissue. Plant Physiol. V. 115. №4. P. 1651-1659.

236. Whittenbury R., Krieg N. (1984) Melhylococcaceae fam. nov. In Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore. V.l. P.256-262.

237. Wolle R.C., Higgins I.J. (1979) Microbial biochemistry of methane a study in contrasts.1.: Int. Rev. Biochem. (Quayle J. R., ed.), Baltimore, V. 21, P. 268-355.

238. Wood H.G. (1977) Some reactions in which inorganic pyrophosphate replaces ATP and serves as a source of energy. Fed. Proc. V. 36. P. 2197-2205.

239. Wood H.G., (1994) Phosphate reserves and energy storage. In: Phosphate in Microorganisms (A.Torriani-Gorini, S.Silver, E.Yagil, eds). Amer. Soc. Microbiol. Washington, D.C. P. 245.

240. Wood H.G., Goss N.H. (1985) Phosphorylation enzymes of propionic acid bacteria and the roles of ATP, inorganic pyrophosphate and polyphosphates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 81. P. 312-315.

241. Xu J., Green P.C., Kemp R.G. (1994) Identification of basic residues involved in substrate binding and catalysis by pyrophosphate-dependent phosphofructokinase from Propionibacterium freudenreichii. J. Biol. Chem. V. 269. №22. P. 15553-15557.

242. Yoch D.C., Chen Y.P., Hardin M.G. (1990) Formate dehydrogenase from the methane-oxidizer Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V. 172. №8. P. 4456-4463.

243. Yuan X.-H., Kwiatkowska D., Kemp R.G. (1988) Inorganic pyrophosphate: fructoses-phosphate 1-phosphotransferase of potato tuber is related to the major ATP-dependent phosphofructokinase of £ coli. Biochem. Biophys Res Commun V. 154. P. 113-117.

244. Zahn J.A., Bergman D.J., Boyd J.M., Kunz J.M., DiSpirito A.A. (2001) Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 183. №23. P. 6832-6840.

245. Zhang M., Lidstrom M.E. (2003) Promoters and transcripts for genes involved in methanol oxidation in Methylobacterium exiorquens AMI. Microbiology. V.149. №4. P. 1033-1040.

Информация о работе

Бесчастный, Александр Павлович
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas Methanica - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы