Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12

Медведкова, Ксения Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12"

ТЕРМОАДАПТАЦИЯ УМЕРЕННО ТЕРМОФИЛЬНОГО МЕТАНОТРОФА

мЕттюслюим БгЕСЕоттЕ 0-12

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2009

2 3 ШШ

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и в Путинском государственном университете, г. Пущино.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, С. Н. Дедыш

доктор биологических наук, А.Г. Меденцев

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН,

г. Пущино

Защита состоится « 19» февраля 2009 г. в 930 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и на сайте института http://www.ibpm.ru/.

Автореферат разослан «15* » января 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. На Земле есть множество мест с постоянно высокой температурой (действующие вулканы, геотермальные источники, промышленные стоки и отходы сельского хозяйства), в которых обитают сообщества термофильных микроорганизмов. Интерес к этим прокариотам связан, в первую очередь, с наличием термостабильных высоко- и низкомолекулярных соединений, обуславливающих адаптацию к повышенным температурам (Jaenicke, Sterner, 2003). Присутствие метана геохимического или биогенного происхождения в высокотемпературных экосистемах предполагает существование в них метанотрофов.

Метанотрофы - структурно и функционально специализированная группа аэробных метилотрофных бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Метанотрофы обнаружены в самых разнообразных экосистемах, в том числе экстремальных, где их присутствие определено наличием метана и кислорода (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Khmelenina, 2002). Способность метанотрофов окислять СН4, наиболее восстановленную органическую молекулу, обусловлена наличием метанмонооксигеназы (ММО), которая может также соокислять широкий спектр алифатических, ароматических, гетероциклических и галогенированных углеводородов. Потребляя метан и соокисляя различные поллютанты в своих эконишах, метанотрофы снижают эмиссию СН4 и других парниковых газов в атмосферу и осуществляют естественную биоремедиацию. Кроме того, метанотрофы перспективны для биотехнологии как продуценты целевых соединений из доступных и относительно дешевых и возобновляемых субстратов - метана и метанола. Особый интерес представляют термофильные метанотрофы как потенциальные продуценты термозимов, в частности, ММО и других ферментов Cj метаболизма. Термофильные метанотрофы перспективны в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов адаптации и филогении с целью более глубокого понимания особенностей биологии и эволюции этой специализированной группы бактерий.

Среди метанотрофов известны термотолерантные представители рода Methylococcus (Foster, Davis, 1966; Малашенко с соавт., 1975), умеренно термофильные виды родов Methylocaldum и Methylothermus (Bodrossy et ah, 1995; 1997; 1999; Ешинимаев с соавт., 2004; Tsubota et al., 2005), а также недавно открытые термоацидофилы филума Verrucomicrobia (Dunfield et al., 2007; Islam et

а1., 2008; Ро1 е1 а]., 2007), однако механизмы их адаптации к изменениям температуры не исследованы.

Цель II задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью нашей работы было расшифровать особенности термоадаптации умеренно термофильного метанотрофа МеЖуЬсаЫит szegedíense 0-12. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Изучить зависимые от температуры цитобиохимические изменения у КМ. szeged¡ense 0-12.

2. Идентифицировать потенциальные термопротекторы и пути их биосинтеза у Мй. szegediense 0-12.

3. Определить природу бурого пигмента, синтезируемого КМ. В2е%ей1еп$е 0-12, и возможную связь с термоадаптацией.

Научная новизна работы. До начала наших исследований механизмы термоадаптации у метанотрофов были не известны. Нами обнаружено, что адаптация АЫ. szegediense 0-12 к повышенной температуре культивирования (57°С) происходит как на уровне изменения активности ферментов С( метаболизма, так и посредством накопления термопротектора - сахарозы. Установлено, что синтез сахарозы осуществляется из интермедиатов рибудозомонофосфатного (РМФ) цикла (фруктозо-6-фосфата и УДФ-глкжозы) с участием сахарозофосфатсинтазы, а деградация сахарозы катализируется сахарозофосфатфосфорилазой. Выявлена многоуровневая система защиты от активных форм кислорода (АФК) с участием глутатиона, пероксидазы и супероксиддисмутазы. Найдено, что адаптация к понижению температуры культивирования (45-37°С) сопровождается изменением морфологии, метаболизма, фосфолипидного и жирнокислотного состава клеток. Впервые показано, что КМ. szegedíense 0-12 синтезирует меланин из интермедиатов пути деградации тирозина, образующихся в ответ на снижение температуры культивирования метанотрофа. Полученные приоритетные результаты существенно углубляют представления об особенностях адаптации и выживания умеренно термофильных метанотрофов.

Практическое значение. Нами выявлены цитобиохимические особенности Md. szegediense 0-12, представляющие интерес для биотехнологии. Показано, что ферменты метаболизма, а также цитохром с пероксидаза имеют оптимумы активности в диапазоне 55 - 70°С, что позволяет реализовать метаболический потенциал данного метанотрофа для получения и применения термостабильных ферментов в процессах биоремедиации, биосинтеза метанола и других целевых

продуктов из относительно дешевого субстрата - метана. В частности, способность синтезировать меланин может быть использована для получения биопротекторов, применяемых при воздействии факторов мутагенной и канцерогенной природы. Показано, что исследуемые метанотрофы активно растут в диапазоне температур от 45-57°С, что делает перспективным их использование в качестве биофильтров для снижения концентрации метана в угольных шахтах. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на ежегодных конференциях молодых ученых г. Пущино (2003-2005), международной конференции «Наука и бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), ежегодной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005-2008), международной конференции «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007), 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), VI международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развитая микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), международной научной конференции «Экстремофилы» (Кейптаун, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 11 тезисов. Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН по теме «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.2.007 08221).

Благодарности. Автор искренне признателен всем сотрудникам лаборатории радиоактивных изотопов, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы, а также д.б.н. Осипову Г.А. (Академическая группа Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва) за определение жирнокислотного состава в клетках метанотрофов, к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц. за предоставление чистой культуры штамма 0-12, к.б.н. Сузиной Н.Е. за электронно-микроскопические исследования, д.б.н. Дуде В.И. и к.б.н. Дмитриеву В.В. за люминесцентную микроскопию клеток, д.б.н. Меденцеву А.Г. за помощь при проведении полярографических исследований, к.х.н. Сахаровскому В.Г. за 'М-ЯМР анализ экстрактов, с.н.с. Баскунову Б.П. за масс-спектрометрический анализ метаболитов, н.с. Ильченко В.Я. за определение свободных аминокислот (ИБФМ им. Г.К.

Скрябина РАН), к.б.н. Тихоновой Т.В. (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва) за двумерный гельэлектрофорез белков, к.б.н. Калиману A.B. (Институт Белка РАН) за секвенирование ПЦР продуктов, н.с. Тимошенко В.А. (МГУ им. М.В. Ломоносова) за ЭПР анализ.

Особую благодарность автор выражает своим учителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 308 ссылок, содержит 11 таблиц и 51 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объектом исследования являлся умеренно термофильный метаиотроф Methylocaldum szegediense 0-12, выделенный Б.Ц. Ешинимаевым в 2004 г из проб силоса, отобранных вблизи г. Пущино. В качестве объектов сравнения использовали чистые культуры термотолерантого Methylococcus capsidatus Bath и мезофилыюго Meihylocystis echinoidcs 2 из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН.

Культивирование метанотрофов. Md. szegediense 0-12 выращивали на модифицированной минеральной среде "П" (Гальченко, 2001), содержащей 1 мг/л CuS04x5H20 при 60-37°С. Мс. capsulatus и Ms. echinoides 2 на среде "П" при 45-28°С и 28°С, соответственно.

Микроскопические исследования проводили в лаборатории Структурно-функциональной адаптации микроорганизмов (ИБФМ РАН). Фиксацию клеток, приготовление ультратонких срезов с помощью ультрамикротома Reichert ULTRACUT System (Австрия) и их анализ на электронном микроскопе Jeol JEM 100В (Япония) проводили, как описано ранее (Khmelenina et al., 1999). Автофлуоресценцию целых клеток изучали с помощью опифлуоресцептного микроскопа (J1IOMAM-2) под фильтром Filter set 49 (>. возбуждения 365 нм, эмиссии 445 нм). Выявление нуклсоида в целых клетках проводили с использованием флуорохрома ДАФИ (Дуда с соавт., 2005). Физиолого-бнохимические свойства метанотрофов изучали по общепринятым методикам. Потенциальные активности потребления метана в целых клетках определяли радиоизотопным методом (Sokolov, Trotsenko, 1995). Жирнокислотный состав клеток был проанализирован д.б.н. Г.А. Осиповым (Академическая группа Исакова Ю.Ф., РАМН, г. Москва). Биосинтез белка у Md. szegediense 0-12 оценивали по включению 3Н-лейцина (Amersham, Англия) в ТХУ-нерастворимую фракцию. Содержание общего глутатиона (GSH + GSSG) в

клетках определяли по восстановлению ДТНБ (Tietze, 1968). Экстракцию термостабильных низкомолекулярных растворимых веществ из клеток проводили согласно Martins (1995) и анализировали методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и 'Н-ЯМР (Schwarz, 2006; Khmelenina et al., 1999). Количество сахарозы оценивали с антроновым реактивом в модификации (Hendel, 1968). Фракционирование клеточных компонентов проводили, разрушая клетки осмотическим шоком (Mizushima et al., 1966). Ароматические соединения экстрагировали из лиофильно высушенной культуральной жидкости этилацетатом (Wheeler et al., 2004), разделяли ТСХ и анализировали на масс-спектрометре Finnigan MAT Model 8430 (Германия). Меланиновые частицы выделяли, обрабатывая клетки лизоцимом, гуаиидинизотиоцианатом и кипячением в 6 N HCl (Wang et al., 1996) и анализировали методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на спектрометре СЭПР-5 (КБ «Рубин», Россия). Активности ферментов первичного и центрального метаболизма определяли по описанным методам (Trotsenko et al., 1986; Калюжная с соавт., 1999). Сахарозофосфатсинтазу определяли по образованию УДФ в реакционной смеси, регистрируя УДФ с помощью сопрягающих ферментов Hite (1993). Сахарозофосфорилазу определяли по ортофосфатзависимому образованию фруктозы из сахарозы с использованием сопрягающих ферментов: гексокиназы, изомеразы и дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата (Koga et al., 1991). Сахарозофосфатфосфатазу определяли по скорости образования ортофосфата (Bencini et al., 1983). Активности ферментов защиты от АФК измеряли согласно (Bergmeer, 1983; Verduyn et al., 1988; Trinder, et al., 1966). Супероксидцисмутазу определяли двумя методами (Beauchamp, Fridovich, 1971): 1) спектрофотометрически, по ингибировашда восстановления нитросинего тетразолия (NBT) ксантиноксидазой, и 2) в нативном ПААГ, по ингибированию фотовосстановления МВТ. Фенолоксидазу определяли с субстратами 2,2'-азино-бис(З-этилбензотиазолин-б-сульфонатом) (ABTS), 2,6-диметоксифенолом (ДМФ) и пирогаллолом (ПГ) (Morisaki et al., 2001; Hernandez-Romero et al., 2005). Активность тирозин-а-кетоглутарат аминотрансферазы определяли по тирозин-зависимому образованию глутамата из а-кетоглутарата методом ТСХ. Гомогентизат-1,2-диоксигеназу и малеилацетоацетатизомеразу измеряли известными методами (Sparnins et al., 1975). Тирозиндекарбоксилазу детектировали по скорости образования 14С02 из р14С-тирозина, улавливая углекислоту фенилэтиламином (Shishkina et al., 1982). Дезаминазы тирозина,

тирамина и фенилаланина определяли колориметрически микродиффузионным методом детекции аммиака (Любимов, 1968).

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли из клеток модифицированным методом (Marmtir, 1961). ПЦР проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Вскторетный ПЦР проводили согласно рекомендациям разработчиков метода (Ко et all., 2003). Анализ нуклеотидных последовательностей, их трансляцию в аминокислотные последовательности осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и пакета программ VectorNTI®Advance v.9.0. Для сравнения нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей с таковыми в GenBank использовали программу NCBI BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), для их выравнивания применяли программу ClustalX (vl.3), для построения филогенетических деревьев - TreeconW (версия 1.3Ь). Сайт сигнальной пептидазы и аминокислоты, участвующие в ковалентном связывании гема, определяли программами http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/ и

http://expasy.org/tools/scanprosite/

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Цнтофнзнологические и биохимические свойства Md. szegediense 0-12 Для расшифровки механизмов термоадаптации умеренно термофильного Md. szegediense 0-12 исследовали его цитофизиологические и биохимические особенности, культивируя штамм при крайних ростовых температурах (37-45°С и 55-57°С). В качестве объекта сравнения использовали Мс. capsulatus Bath, который выращивали при 45 или 29°С.

Md. szegediense 0-12 растет в интервале температур 37-61°С, оптимально -при 55°С (рмах=0,067 ч"1, время генерации 10 ч). Культура очень хорошо росла при 57°С (рис. 1). Скорость роста культуры, адаптированной к 45 °С, снижалась в 2,4 раза, по сравнению с ростом при оптимальной температуре. Хотя штамм 0-12 способен расти при 37°С, скорость роста уменьшалась в 5 раз, по сравнению с ростом при 55°С (цмах=0,013 ч"1 при 37°С).

Таким образом, у Md. szegediense 0-12 оптимальная температура культивирования практически равна максимальной температуре

Рис. 1. Зависимость скорости роста Md. szegediense 0-12 от температуры.

Клетки, выращенные при 37°С, окрашивали флуорохромом ДАФИ, который избирательно связывается с ДНК. Сочетанием флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии показано, что в гигантских клетках находится множество нуклеоидов. Поэтому было предположено, что цитологические изменения происходят вследствие нарушения клеточного деления при уменьшении температуры культивирования. Интересно отметить, что при

роста, что характерно для многих термофилов (Jaenicke and Sterner, 2003).

Характерным общим свойством представителей рода Methylocaldum является клеточный полиморфизм. Мы обнаружили, что культивирование Md. szegediense 0-12 при пониженной температуре 37°С сопровождалось усилением полиморфизма и существенными цитологическими изменениями клеток, по сравнению с ростом при оптимальной температуре (рис. 2). Клетки увеличивались на порядок в размерах, приобретали формы веретена, шара или гигантских палочек (рис. 2 г,д,е). На ультратонких срезах видно, что цитоплазма таких клеток практически полностью заполнена ВЦМ (рис. 2).

Рис. 2.

Ультраструктура клеток Md. szegediense 0-12, выращенных при 55°С (а,б), и 37°С (г, д, е). ВЦМ - внутрицитоплаз-матические мембраны; НМ - наружная мембрана;

Э - экзина; И - интина. Длина масштабной линейки - 0,5 мкм.

культивировании штамма 0-12 при 37°С, но с добавлением 0,5% NaCl, увеличения размеров клеток не выявлено. Очевидно, нарушение клеточного деления у Md. szegediense 0-12, выращенного при 37°С, снималось добавлением NaCl. Логично предполагать, что адаптация метанотрофов к высокой температуре и осмолярности среды имеет общие механизмы.

1.1. Фосфолипидные и жирнокислотные профили клеток

Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath

В фосфолипидном пуле клеток обеих культур найдены фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота и кардиолипин (табл. 1). Зависимые от температуры роста изменения фосфолипидного состава клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath различны. У Md. szegediense 0-12 с понижением температуры культивирования возрастал уровень ФЭА и снижалось относительное содержание ФГ и KJI. Напротив, у Мс. capsulatus Bath при пониженной температуре роста ФЭА отсутствовал, при этом основными фосфолигшдами были ФГ и KJ1. Это может быть связано с разными механизмами устойчивости к повышенной температуре умеренно термофильного Md. szegediense 0-12 и термотолерантного Мс. capsulatus Bath.

Таблица 1. Фосфолипидный состав клеток термофильных/толерантных метанотрофов при разных температурах культивирования.

% от суммы фосфолипндов

Фосфолипиды Md. szegediense 0-12 Мс. capsulatus Bath

55°С 37 °С 45°С 29°С

Фосфатидилссрин (ФС) 0,2 0,2 0,1 0

Фосфатидилхолии (ФХ) 0,6 0,3 2,8 0

Фосфатидная кислота (ФК) 0,7 0,4 0,05 0,2

Фосфатидилдиметилэтаноламин (ФДМЭА) 6,9 3,5 0 0

Фосфатидилэтаноламин (ФЭА) 58 71 48 0

Фосфатидилглицерин (ФГ) 19,5 17 41,4 85

Кардиолипин (KJI) 16 8,5 8 14,3

У термофильного и толерантного метанотрофов обнаружены зависимые от температуры изменения в жирнокислотном составе мембран. В клетках обоих штаммов, выращенных при высоких температурах, доминировала гексадекановая кислота С]б:о- При снижении температуры снижалось содержание насыщенных, но возрастала доля ненасыщенных жирных кислот (табл. 2). Кроме того, для клеток, выращенных при высоких температурах, характерно относительно высокое содержание Спсус- У Md. szegediense 0-12, выращенного при 37°С в присутствии 0,5 % №С1, выявлены 19:0 и 20:0 жирные кислоты, а в случае культивирования

при 55°С обнаружены редко встречающиеся у эубактерий метилированные жирные кислоты Сд.оме-16- Напротив, у Мс. capsulatus Bath изомер C9.o„,e-i6 отсутствовал.

Итак, клетки Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath, подобно другим термофильным микроорганизмам, характеризуются повышенным содержанием насыщенных и циклических жирных кислот. Известно, что насыщенные жирные кислоты участвуют в стабилизации структуры клеточной мембраны, снижая ее текучесть при высоких температурах, тогда как метилированные и циклические жирные кислоты ограничивают транспорт ионов в клетки. Кроме того, оба исследуемых метанотрофа способны изменять жирнокислотный состав, и, следовательно, регулировать текучесть мембран при изменении температуры культивирования. Таким способом, термофилы адаптируются в природе к флуктуациям температуры.

Таблица 2. Жирнокислотные профили клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath, выращенных при разных температурах и солености._

% от суммы жирных кислот

Жирная кислота Md. szegediense О-12 Без NaCI Md. szegediense О-12 0,5% NaCI Мс. capsulatus Bath

55°С 37°С 55°С 37°С 45°С 29°С

14:0 2 3,3 3 2 3 2,3

15:0 3,5 2,5 2,5 2,5 1,5 1,7

116:0 0 0 0,3 0 0 0

16:1 12 47 6,5 44 0 0

16:1 ю 9с 0 0 0 0 17,7 36,2

16:1 ш 7с 0 0 0 0 9,8 23,5

16:1 ш 5 0 0,2 0,4 0 9,6 6,4

16:0 64 43 61 39 47 28

117:1 0 0 1,3 0 0 0

17:1 0,34 0,2 0 0 0 0

17:1 и 8 0,3 0 0,2 0 0 0

17:1 0)6 0,4 0 0,2 0 0 0

17:1 со5 0 0 0 0 5,9 0,3

17сус 9 3,4 15 2,4 2,4 0,15

17:0 0,7 0,25 0,7 1,1 0 0

3hl 6:0 0,6 0 0,2 0,3 0,3 0,62

9-ОМе-16:0 4,6 0 0 0,6 0 0

18:1 0,2 0 0 0 0 0

18:1 0)9 0 0 2,5 0,4 0,5 0

18.10)7 0 0 0 0 1,4 1

18:0 0,3 0 0,14 2,5 0,3 0,4

9-С)Ме-17:0 0,6 0 0,3 0 0 0

11-ОМе-17:0 0,6 0 0,8 0 0 0

19:1сус 1,4 0 0,3 0 0 0

1.2. Особенности метаболизма Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath

У выращенных при разных температурах штаммов были найдены существенные различия в активностях ферментов первичного метаболизма (табл. 3). Скорости окисления и ассимиляции метана выше у клеток Md szegediense 0-12 и Me. capsulatus Bath, растущих при оптимальных температурах, по сравнению с пониженными, что соответствует скоростям роста при этих температурах. Активность МДГ у Me. capsulatus Bath, выращенного при 45°С, почти на порядок выше, чем при 29°С. Однако у Md. szegediense 0-12 активность МДГ не зависела от температуры выращивания. Активность ФДГ намного выше в клетках метанотрофов, выращенных при пониженных температурах.

Таблица 3. Активности ферментов первичного и центрального метаболизма в экстрактах клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath, выращенных при разных температурах (нмоль/мин мг белка).____

Md. szegediense Мс. capsulatus

Фермент Кофактор 0-12 Bath

55°С 37°С 45°С 29°С

I Ьлребление метана (нмоль/мг белка в минуту)

-окисление 12 3,4 22 1,9

-ассимиляция 1 0,2 8 0,44

Метанолдегидрогеназа (МДГ) ФМС 50 49 215 27

Формальдегиддегидрогеназа (ФАДГ) ФМС 5 0 1 0

НАД+ 0 0 0 0

Формиатдегидрогеназа (ФДГ) ФМС 45 211 42 6

НАД* 4 111 44 123

Гексулозофосфатсинтаза (ГФС)

-мембранная фракция 4010 4620 889 887

-цитозольная фракция 1010 158 652 142

Оксипируватредуктаза (ОПР) НАДФН2 0 0 64 6

надн2 22 2 119 25

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза(РБФК/0) 9 5 6 3

КДФГ-альдолаза 22 1 62 1

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа НАДФ+ 29 52 2 10

6-Фосфоглюконатдегидрогеназа НАДФ+ И 16 19 16

Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза НАДН, 8 5 24 25

6-фосфофруктокиназа ФФ„ 5 8 45 48

По-видимому, у двух метанотрофов синтез и/или активность ферментов окисления метана - ММО, МДГ и ФДГ, по-разному регулируется температурой. Напротив, активность ГФС, ключевого фермента РМФ цикла ассимиляции углерода, практически не зависела от температуры роста. Активность ГФС выявлялась преимущественно в мембранной фракции клеток. Ранее у Мс. capsulatus Bath была показана связь ГФС с мембранами (Strom et al., 1974), а также

образование супрамолекулярного мембранного комплекса МДГ и мММО, окисляющего метан до формальдегида (Myronova et al., 2006). Возможно, термофильным/толерантным метанотрофам необходима более компактная пространственная организация процессов окисления и ассимиляции метана.

Уровни активности ОПР и РБФК/О - индикаторных ферментов серинового пути и цикла Кальвина, были значительно выше у клеток, выращенных при повышенных температурах (табл.3). Кроме того, при повышении температуры увеличивались активности КДФГ-альдолазы, катализирующие распад фосфосахаров в пути Энтнера-Дудорова, но снижались уровни ферментов окислительного сегмента пентозофосфатного пути, главным образом, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Известно, что для ассимиляции Ci соединений в сериновом или РБФ путях метанотрофам требуется больше НАДН и АТФ, чем для фиксации углерода через РМФ-цикл, так же как для синтеза метаболитов путем Энтнера-Дудорова по сравнению с гликолизом. В целом, с возрастанием температуры снижались уровни ферментов, связанных с образованием восстановителей, но повышались активности ферментов ассимиляции углерода через энергоемкие пути. Можно полагать, что изменения температуры культивирования метанотрофов в первую очередь отражаются на энергетическом статусе клеток, который является одним из вероятных механизмов регуляции С] метаболизма в ответ на изменения температуры.

Для Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath были определены оптимальные температуры для активности ряда ферментов Q метаболизма (рис.3).

А, нмоль/мг белка

20 30 40 50 60 70 80 20 30 40 50 60 70 80 15 25 35 45 55 65 75

Температура,°С

Рис. 3. Влияние температуры измерения на активность ключевых ферментов: (а) Methylocaldum szegediense 0-12; (б) Methylococcus capsulatus Bath; (в) Methylocystis echinoides.

Температурные оптимумы активности ФДГ, ОПР, РБФК/О и ГФС у штамма 0-12 находились в интервале от 50 до 65°С, а у штамма Bath - от 40 до 60°С. В качестве объекта сравнения использовали также мезофильный метанотроф Ms. echinoides 2, оптимально растущий при 28°С (рис. 3). Этот представитель II типа метанотрофов не имеет ГФС и РБФК/О, поэтому изучали влияние температуры на активность ФДГ и ОПР. Температура для проявления максимальной активности этих ферментов составляла 40°С, что значительно ниже оптимальных значений у термофильного и термотолерантного штаммов. Это свидетельствует об адаптации термофильных и термотолерантных метанотрофов на уровне свойств ферментов Ci-метаболизма.

2. Идентификация органических термопротекторов у MiL szegediense 0-12

В клетках McL szegediense 0-12 выявлено накопление свободных углеводов. С использованием ЯМР, ТСХ и антронового реагента обнаружено накопление сахарозы (рис. 4). Содержание сахарозы возрастало при повышении температуры культивирования и достигало максимальных значений (1,2%) у клеток, растущих при 57°С в присутствии 1% NaCl (табл. 4). Примечательно, что мезофил Ms. echinoides 1 и термотолерант Мс. capsulatus Bath не накапливали сахарозу.

Сг-Сц

——■-------

6. ррт

Рис. 4. Н-ЯМР спектр спиртоводо-растворимой фракции клеток М/. s:egediense 0-12, выращенных при 55°С. Пики соответствуют сигналам протонов при С а] и С2-С,2 атомах углерода сахарозы.

Таблица 4. Внутриклеточные уровни сахарозы и активность сахарозофосфатсинтазы у

Условия культивирования Содержание сахарозы (мкг/100мг сухих клеток) Сахарозофосфатсинтаза нмоль/мин мг белка

45° 50-150 11

45°С + 1% NaCl 440 8

57°С 250 20

57°С + 0.5% NaCl 555 20

57°C+l%NaCl 1230 16

В экстрактах клеток Мс1. szegedien.se 0-12, выращенных при 45°С или 57°С, обнаружены активности сахарозофосфатсиитазы и сахарозофосфатфосфатазы, свидетельствующие о том, что у данного метанотрофа синтез сахарозы происходит из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата - первичных метаболитов РМФ цикла Срассимиляции (табл. 4, рис.5).

Присутствие активности сахарозофосфорилазы указывает на способность метанотрофа расщеплять сахарозу до утилизируемых интермедиатов - глкжозо-1-фосфата и фруктозы. Примечательно, что активности сахарозофосфатсиитазы выше у клеток, выращенных при 57°С, чем при 45°С, но не зависели от присутствия №С1 в среде культивирования, что указывает на связь синтеза сахарозы с термо-, но не осмоадаптацией. Основываясь на энзимологических данных, мы предложили схему пути биосинтеза сахарозы у КЫ. szegediense 0-12 (рис. 5).

Рис. 5. Путь биосинтеза сахарозы у АМ szegediense 0-12. СФС - сахарозофосфатсинтаза, СФФ - сахарозофосфатфосфатаза, СФ - сахарозофосфорилаза.

Изучение термопротекторных свойств сахарозы показало, что добавление 40-400 мМ сахарозы к коммерческому препарату лактатдегидрогеназы повышало остаточную активность фермента после 10 мин прогревания при 50°С, по сравнению с инкубацией без добавления сахарозы (табл. 5). Бесклеточные экстракты АМ szegediense 0-12 также оказывали термостабилизирующее действие на лактатдегидрогеназу. Кроме того, сахароза в концентрации 10 или 20 мМ стабилизировала ФДГ в бесклеточных экстрактах Md. szegediense 0-12, Мс. сар$и1аш ВаШ и Мя. echinoides 2. Причем, добавление 20 мМ сахарозы к экстрактам КЫ. szegediense 0-12 сохраняло 50% активности ФДГ, по сравнению с

контролем без добавок (10% остаточной активности) (рис. 6). Следовательно,

сахарозу можно рассматривать в качестве термопротектора, стабилизирующего

ферменты С] метаболизма метанотрофов при воздействии повышенных

температур.

Таблица 5. Активность исходной) после 10 мин 50°С в присутствии экстрактов клеток Md. sz выращенных при 37°С их

_Добавки_

Без добавок, контроль

Экстракт клеток, 37°С

Экстракт клеток, 57°С Спиртоводорастворимая фракция клеток, (57°С)* Сахароза, 40 мМ Сахароза, 400 мМ

* Концентрация сахарозы с

Таким образом, можно полагать, что термофильная природа Md. szegediense 0-12 обусловлена свойствами ферментов и способностью синтезировать сахарозу в качестве термопротекторного соединения.

3. Системы зашиты от активных форм кислорода у термотолерантного

и умеренно термофильного метанотрофов

Одним из следствий воздействия высокой температуры на микроорганизмы является увеличение уровня АФК. Зависимость уровня АФК от температуры культивирования в клетках термофильного и термотолерантного метанотрофов изучали с использованием 2,7-дихлорофлуоресцеин диацетата, который, взаимодействуя с АФК, флуоресцирует. У Мс. capsulatus Bath и Md. szegediense О-12, выращенных при температурах, близких к оптимальным (45 и 57°С, соответственно), флуоресценция клеток в 1,4 и 2,2 раза выше, по сравнению с выращенными при пониженных температурах клетками. Следовательно, повышение температуры роста сопровождается усилением образования АФК, которое, в свою очередь может быть следствием возрастания интенсивности окисления метана и ассимиляции углерода через цикл Кальвина (табл. 3),

ЛДГ (в % от инкубации при сахарозы или egediense 0-12, и 57°С.

% активности

38,0

64.6

69.7

46,0

52,3 82,7

оставляла 10 мМ

Остаточная активность, % 100

80 Н

40 -

(а) (б)

Культуры

Рис. 6. Остаточная активность ФДГ после 20 мин инкубации при повышенных температурах в бесклеточных экстрактах: (a) Md. szegediense 0-12 (60°С); (б) Мс. capsulatus Bath (50°С); (в) Ms. echinoides 2 (40°С) без сахарозы (1), в присутствии 10 мМ (2) или 20 мМ (3) сахарозы.

поскольку реакции, катализируемые ММО и РБФК/О. сопровождаются образованием Н202 и других АФК.

С повышением температуры увеличивается активность связанной с мембранами пероксидазы (табл. 6, рис. 7). что указывает на ее участие в детоксикации АФК.

Рис. 7. Локализация пероксидазной активности в клетках Md. szegediense 0-12 выращенных при 57 (а) или 45°С (б).

У обоих метанотрофов не найдена активность каталазы. Более того, в геноме Мс. capsidatus Bath отсутствуют гены, кодирующие этот фермент. В бесклеточных экстрактах выявлены активности СОД, которые не зависели от температуры выращивания культуры (табл. 6).

Таблица 6. Активности ферментов и уровни глутатиона в клетках Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulahis Bath, выращенных при разных температурах (нмоль/мин мг белка)_

Фермент Субстрат/кофактор Md. segediense 0-12 Мс. capsulatus Bath

45°С 57 °С 29°С 45 °С

Пероксидаза ABTS 7 13 47 60

Диметоксифенол 15 26 24 35

4-ААП 4 6 4 8

Каталаза н2о2 0 0 0 0

Супероксиддисмутаза о- 2 2 1,5 1,5

GSH пероксидаза Н202, GSH 16,9 10,8 3,1 3,9

Глутатионредуктаза GSSG, НАДФН 2 3 1 2

Ппокозо-б-фосфатдегидрогеназа НАДФ+ 50 25 10 2

Глутатаон, нмоль/мг сухих клеток 2 0,3 1,6 4.9

Уровень общего глутатиона в клетках А/с/, szegediense 0-12, выращенных при 45°С, в 7 раз выше, чем в клетках, выращенных при 57°С. При этом активность С8Н пероксидаза была несколько выше, нежели у клеток, выращенных при 57°С (табл. 6). Кроме того, при снижении температуры культивирования возрастала активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (табл. 6), поставляющей

НАДФНз для восстановления глутатиона глутатионредукгазой. хотя активность последней была очень низкой.

По сравнению с оптимальной температурой роста, в клетках Md. szegediense 0-12, выращенных при 45°С, обнаружено повышенное содержание перекисных липидов, показателем которых служила реакция с тиобарбитуровой кислотой, что коррелировало с высокими уровнями глутатиона и активностями GSH пероксидазы (табл. 6). По-видимому, у данного метанотрофа при температуре культивирования, ниже оптимальных значений, имеет место нарушение структуры мембран и связанных с ними реакций. В процессе утилизации перекисных форм жирных кислот преимущественно участвуют глутатион и GSH пероксидаза. Напротив, у Мс. capsulatus Bath внутриклеточный уровень глутатиона в 3 раза выше при высокой температуре культивирования (45°С), по сравнению с пониженной (29°С), при этом степень разрушения липидов также возрастала при повышении температуры. Однако активность глутатион-пероксидазы практически одинакова при разных температурах.

У Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath обнаружены по крайней мере 3 гем-содержащих белка, один из которых имеет м.м. -80 кДа (рис. 8). Аналогичную массу имеет белок Мса 2950 из Мс. capsulatus Bath, известный как дигемовая пероксидаза, локализованная на поверхности клеток (Karlsen eí al., 2005). С использованием векторетной библиотеки у Md. szegediense 0-12 нам удалось амплифицировать и секвенировать ген (2275 п.н.), кодирующий предполагаемую дигемовую цитохром с пероксидазу.

Анализ транслированнной аминокислотной последовательности в программе BLAST выявил наибольшее сходство продукта этого гена (40% гомологии) с поверхностным белком Мса 2590 из Мс. capsulatus Bath. Белки обоих метанотрофов имеют аминокислотные последовательности, являющиеся сайтом сигнальной пептидазы, что указывает на способность белка транспортироваться через цитомембрану и его внеклеточную локализацию (рис. 7). Таким образом, у Md. szegediense 0-12 гем-содержащий белок П| локализован главным образом в периплазме, а также связан с ВЦМ. Вероятно, он вносит существенный вклад в перекись-разлагающую активность у данного метанотрофа.

0-12 Bath М

кДа

116

ЯШт п>

Рис. 8. Реакция на гем содержащие белки в денатурирующем ПААГ.

4. Синтез меланинового пигмента Mil. szegediense 0-12

Образование темно-коричневого пигмента характерно для умеренно термофильных метанотрофов рода Mcthylocaldum (Aid. szegediense, Md. gracilis и Md. tepidum) (Малашенко с соавт., 1975; Bodrossy et al. 1997). Нами показано, что колонии Md. szegediense 0-12, растущие при температуре 55-57°С, имели кремовый огтенок, однако при 45°С постепенно становились темно-коричневыми, но пигмент не диффундировал в агаризованную среду. Культуральная жидкость при пониженной температуре приобретала желто-бурый цвет. Следовательно, образование коричневого пигмента Md. szegediense 0-12 индуцировалось снижением температуры культивирования. Клетки, выращенные при 45°С, обрабатывали 4 М гуанидинизотиоцианатом и кипятили в 6 N НС1. В результате такой обработки получали черный осадок, который не растворялся в воде, копц. НС1 или 5 N NaOH, а также в бутаноле, хлороформе, ацетоне, гексане, бензоле или толуоле, но был слабо растворим в метаноле и диметилсульфоксиде и частично растворялся в 1 N NaOH. Эти свойства пигмента, выделенного из клеток Md. szegediense 0-12, близки свойствам ряда меланинов, предшественником которых является тирозин (Nosanchuk et al., 2003).

б. Клетки, выращенные при 57°С

1500 а. Клетки, выращенные при 1500

750 45°С Л 750

0 CO 1 0

-750 If Fi с E -750

1500 < -1500"

1500 750 ■ О -750

-1500

Бурый пигмент »^YAiA

3000

3200 3400 3600 Магнитное поле, G

3000

3200

3400 3600 Магнитное поле, G

Рис. 9. ЭПР спектры клеток Md. s:egediense 0-12, выращенных при 45°С (а) или при 57°С (б), и пигмента, выделенного из клеток Md. szegediense 0-12, выращенных при 45°С (в).

Лиофильно высушенные клетки Md. szegediense 0-12, выращенные при 45°С или 57°С, и выделенный из клеток пигмент анализировали методом ЭПР (рис. 9). ЭПР спектры свидетельствовали о наличии свободных радикалов в составе пигмента, а также в пигментированных клетках (выращенных при 45°С). Это указывает на

меланиновую природу бурого пигмента Md. szegediense 0-12 и подтверждает его образование в ответ на снижение температуры культивирования.

Меланизированные клетки Md. szegediense 0-12 обладали автофлуоресценцией. В отличие от клеток, выращенных при 57°С, флуоресценция клеток, выращенных при 45°С, была стабильной и не исчезала в течение продолжительного времени. Известно, что автофлуоресценцией обладают клетки, синтезирующие меланин из гомогентизиновой кислоты (Frases et al., 2007).

В культуралыюй жидкости Md. szegediense 0-12, выращенного при 45°С, методом ТСХ и визуализацией в УФ выявлены два доминирующих вещества, которые идентифицированы как 4-гидроксифенилуксусная и гидроксифенилпропановая кислоты (M/Z 151 и 165, соответственно). Эти ароматические соединения являются интермедиатами путей катаболизма тирозина, а их накопление в культуральной жидкости Md. szegediense 0-12 свидетельствует о нарушении функционирования этих путей при понижении температуры.

В бесклеточных экстрактах Md. szegediense 0-12 найдены активности ферментов, участвующих в деградации тирозина (табл. 7). Активность а-кетоглутарат-тирозинаминотрансферазы, которая переносит аминогруппу тирозина на а-кетоглутарат с образованием глутамата и дигидроксифенилпирувата, выше у клеток, выращенных при 45°С, по сравнению с клетками, растущими при 57°С.

Таблица 7. Активности ферментов деградации тирозина в экстрактах

Ферменты Кофактор Md. szegediense О-12

57°С 45°С

Тирози н-а- кетоглутарат ам инотрансфераза Глутамат 6,9 10,4

Гомогентизат-1,2-диоксигеназа 8 4

Мапеилацетоацетат изомераза GSH 0,5 0,1

Тирозиндекарбоксилаза 6 18

Тираминдезаминаза 0,5 1,5

В экстрактах штамма 0-12 найдены активности ферментов гомогентизатного пути распада тирозина - гомогентизат-1,2-диоксигеназы и малеилацетоацетат-изомеразы. Активности этих ферментов у клеток, вырашенных при 57°С, составляли 4 и 8 нмоль/мин/мг белка соответственно, однако практически отсутствовали в клетках, выращенных при 45°С. Следовательно, у Мй. szegediensë 0-12, растущего при оптимальной температуре, функционирует

гомогентизатный путь деградации тирозина через фумарат и ацетоацетат (рис. 9). По-видимому, связанные с понижением температуры культивирования нарушения в катаболизме гомогентизипоиой кислоты приводят к ее накоплению и полимеризации в меланин.

1'адиоизотопным методом выявлена активность тирозиндскарбоксилазы, которая втрое выше у клеток, выращенных при 45°С, по сравнению с выращенными при 55°С клетками (табл. 7). Декарбоксилирование тирозина и последующие превращения продукта реакции (тирамипа), возможно, способствуют дополнительному образованию гидроксифенилацетата и гомогентизата, которые могут трансформироваться в меланин посредством спонтанной окислительной полимеризации. В экстрактах КМ. szegediense 0-12 найдена активность тирамипдезаминазы, что подтверждает путь образования гидроксифенилацетата через тирамин (рис. 10).

02 вБН

Глутамат

а-Кето-глугара-

ТИРОЗИН

Гидрокси-фенилпируват

Гомогентизат

со2

ЫН3

Маленл-ацетоацетат

Ш3

/ т- ' МЕЛАНИН Тирамин Гидрокси--■-►

фенилацетат Гидроксикоричпая Гидроксифенил-

Фумарил-ацетоацетат

Фумарат +

Ацетоацетат

пропионат

Рис. 10. Связь катаболизма тирозина и синтеза меланина у М. szegediense 0-12.

Итак, у КМ. szegediense реализуются несколько возможностей превращения тирозина: трансаминирование, декарбоксилирование и дезаминирование. Эти активности либо не изменяются, либо возрастают при снижении температуры культивирования. Однако последующие катаболические реакции, приводящие к деградации образуемых продуктов до интермедиатов цикла Кребса (через гомогентизатный путь), значительно замедляются, что приводит к их накоплению и трансформации в меланин.

5. Заключение

Проведенное нами сравнительное изучение структурно-функциональных и физиолого-биохимических свойств Md. szegediense 0-12 при различных условиях культивирования показало, что этот умеренно термофильный метанотроф, реализуя общие для термофилов стратегии термоадаптации, имеет специфические черты, обусловленные особенностями Ci-метаболизма.

К механизмам, позволяющим Md. szegediense 0-12 адаптироваться к постоянно меняющимся условиям в природных экосистемах, очевидно, следует отнести способность к изменению морфологии, метаболизма, фосфолипидного и жирнокислотного состава клеток, причем.последнее свойственно также другим термофильным прокариотам. Однако наряду с характерным для термофилов увеличением доли ненасыщенных жирных кислот, у Md. szegediense 0-12 в ответ на повышение температуры культивирования появляются необычные для эубактерий метилированные жирные кислоты C9.0mc-i6, обнаруженные у термофильных архей.

Нами показано, что ферменты Сгметаболизма Md. szegediense 0-12 максимально активны при более высоких температурах, нежели ферменты термотолерантных или мезофильных метанотрофов. Дальнейшие исследования свойств других ферментов Ci-метаболизма, и прежде всего ММО, могут внести существенный вклад в реализацию биотехнологического потенциала термофильных метанотрофов.

Нами обнаружено, что термоадаптация Md. szegediense 0-12 происходит посредством синтеза и накопления в клетках сахарозы, стабилизирующей белки при повышении температуры. Синтез сахарозы осуществляется из первичных интермсдиатов ассимиляции Q-соединений по пути, который реализуют растения, цианобактерии и некоторые протеобактерии. Судя по наличию у Md. szegediense 0-12 сахарозофосфорилазы - фермента, расщепляющего сахарозу до утилизируемых продуктов, этот дисахарид может служить также в качестве запасного источника углерода, обеспечивающею выживаемость метанотрофа при дефиците метана. Возможно, способность к синтезу сахарозы определяет широкое распространение бактерий этого рода в природе (Bodrossy et al., 1997; Knief et al., 2003; Ешинимаев с соавт., 2004; Jackel et al., 2005). Примечательно, что у термотолерантного Мс. capsulatus Bath накопление сахарозы не обнаружено.

деградации тирозина, накапливающихся в ответ на снижение температуры культивирования мстанотрофа. Бактерий рода Methylocaldum находят как в высокотемпературных экосистемах - термальных источниках, отходах различных тепловых производств, так и в экосистемах с низкой температурой или подверженных флуктуациям - отходы животноводческих ферм, рисовые поля, и др. Вероятно, меланин у Md. szegediense выполняет защитную функцию, предохраняя клетки не только от перепада температур, но и от воздействия других неблагоприятных факторов (АФК, антибиотики, УФ).

Нами доказано, что термофильные метанотрофы имеют многоуровневую систему защиты от АФК: активности цитохром с пероксидазы, СОД, глутатионпероксидазы и внутриклеточный глутатион, способный напрямую удалять гидроксильные радикалы (ОН') и синглетный кислород (О). Полученные экспериментачьные данные свидетельствуют о существенных различиях в механизмах термоадаптации термофильного и термотолерантного метанотрофов. Md. szegediense 0-12, в противоположность Мс. capsulatus Bath, не проявляет клеточный полиморфизм, не способен образовывать меланин и синтезировать сахарозу при флуктуациях температуры. Однако Мс. capsulatus Bath формирует регулярные поверхностные структуры (S-слои), подобно Melhylothermus thermalis, клетки которого также не проявляют полиморфизм (Tsubota et al., 2005). Не исключено, что меланин, имеющий более жесткую структуру, по сравнению с S-слоями, препятствует расхождению клеток Md. szegediense 0-12 при делении, что приводит к изменению морфологии. Интересно, что с поверхностными образованиями клеток термофильных и термотолерантных метанотрофов (меланином или S-слоями) связана перекись-разлагающая активность (Сузина, Фихте, 1986). Это наводит на мысль о защитной функции этих поверхностных структур у термофильных метанотрофов.

Выявленные нами цитобиохимичсские особенности Md. szegediense 0-12 создают предпосылки для дальнейших исследований механизмов термоадаптации на молекулярном уровне. В этом отношении Md. szegediense представляет интерес не только в научном плане, но и в биотехнологическом аспекте, поскольку может служить источником новых биопротекторов, биостимуляторов и стабильных ферментов.

выводы

1. Расшифрованы цитобиохимические перестройки, происходящие при адаптации умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12 к различным температурам культивирования (37,45 или 55°С). При оптимальной температуре роста (55°С) в клетках увеличивалась доля насыщенных С|6о, циклических Ci7cyc жирных кислот и появлялись необычные для эубактерий метилированные С]6-омс-9 жирные кислоты. Напротив, адаптация к пониженной температуре роста (37°С) сопровождалась изменением морфологии клеток и накоплением ненасыщенных жирных кислот C^i-

2. Показано, что активности ферментов серинового пути и цикла Кальвина у Md. szegediense 0-12 максимальны при температуре культивирования 55°С, что предполагает их участие в рефляции энергетического статуса клеток. Оптимумы активностей формиатдегидрогеназы, оксипируватредуктазы, рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы и гексулозофосфат-синтазы в экстрактах клеток Md. szegediense 0-12 находятся в интервале 50-65°С, тогда как у термотолерантного Methylococcus capsulatus Bath при 40-60°С, что обуславливает разную термоадаптабелыюсть этих метанотрофов.

3. Обнаружено, что Md. szegediense 0-12 в ответ на повышение температуры культивирования и солености среды накапливает сахарозу при участии сахарозофосфатсинтазы, катализирующей конденсацию УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата. Показано, что сахароза стабилизирует активность ферментов С] метаболизма при повышенных температурах, являясь потенциальным термопротектором.

4. Установлено, что Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath имеют многоуровневую систему защиты от активных форм кислорода, о чем свидетельствует присутствие в клетках свободного глутатиона и активностей глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и цитохром с пероксидазы. При этом пероксидазная активность локализована в периплазматическом пространстве клеток и ВЦМ.

5. Выявлено, что клетки Md. szegediense 0-12 синтезируют меланин при субоптимальной температуре роста (45°С). Предположено, что меланин образуется из интермедиатов деградации тирозина, накапливающихся в ответ на снижение температуры культивирования.

6. Найдены существенные различия в термоадаитации термофильного и термотолерантного метанотрофов: в противоположность Md. szegediense 0-12, Мс. capsulatus Bath не проявляет клеточный полиморфизм, не способен образовывать меланин и синтезировать сахарозу.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.Л., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Осипов Г.О., Лысенко A.M., Троцеико Ю.А. Новые термофильные метанотрофы рода Methylocaldum. Микробиология. 2004. Т. 73. №4. С. 448-456.

2. Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Сахароза как фактор термоадаптации термофильного мстанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12. Микробиология. 2007. Т. 76. №4. С. 567-569.

3. Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Баскунов Б.П., Троценко Ю.А. Синтез меланина умеренно термофильным метанотрофом Methylocaldum szegediense зависит от температуры культивирования. Микробиология. 2008.1.11. №1. С. 126128.

Тезисы:

1. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А. Новые термофильные и термотолерантные метанотрофы. 7-ая Путинская школа - конференция молодых ученых «Биология- наука 21-века». Пущино, 2003, с. 273.

2. Медведкова К.А., Ешинимаев Б.Ц. Цитобиохимические особенности новых умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum . 8-ая Путинская школа - конференция молодых ученых «Биология- наука 21-века». Пущино, 2004, с. 155

3. Троценко Ю.А., Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е. Цитобиохимические особенности новых умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum. Международная конференция Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина. Пущино, 2004, с. 30.

4. Медведкова К.А., Ешинимаев Б.Ц. О термоадаптации метанотрофных изолятов рода Methylocaldum. Всероссийская молодежная школа - конференция молодых ученых «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2005, с. 43.

5. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А. Новые умеренно термофильные метанотрофы родов Methylothermus и Methylocaldum. 9-ая Путинская школа -конференция молодых ученых «Биология- наука 21-века». Пущино, 2005, с.203.

6. Medvedkova К.А. Production of melanin-like pigment by moderately thermophilic methanotroph Methylocaldum szegediense 0-12. The young scientists and students international scientific conference «Modern problems of microbiology and biotechnology». Odesa, 2007, p. 29.

7. Медведкова K.A., Хмеленина В.H., Троценко Ю.А. Термоадаптация умеренно термофильных метанотрофов Methylocaldum szegediense 0-12 и Methylococcus capsulatus Bath. Материалы 2-го .Байкальского Микробиологического симпозиума с международным участием. «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ». Иркутск, 2007, с. 158.

8. Медведкова К.А. Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12. Всероссийская молодежная школа конференция молодых ученых «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2007, с. 72.

9. Медведкова К.А. Температурная адаптация Methylococcus capsulatus Bath и Methylocaldum szegediense 0-12. Материалы VI Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2008, с. 92-94.

10.Medvedkova К.A., Khmelenina V.N., SuzinaN.E., Y.A. Trotsenko. Temperature -induced adaptive responses of thermophilic and thermotolerant obligate methanotrophs. The international scientific conference «Extremophiles». Cape Town, South Africa, 2008, p. 66.

11 .Медведкова К.А. Системы антиоксидантной защиты умеренно термофильных метанотрофов Methylocaldum szegediense и Methylococcus capsulatus. IV молодежная школа - конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2008, с. 32.

Подписано в печать:

11.01.2009

Заказ № 1463 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Медведкова, Ксения Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Особенности биологии термофильных метанотрофов.

1.1. Экология и физиология.

1.2. Общая характеристика термофильных метанотрофов.

1.3. Метаболизм Methylococcus capsulalus Bath.

1.3.1. Метанмонооксигеназа, ее роль и регуляция.

1.3.2. Ассимиляция Ci-соединений.

1.3.3. Пути ассимиляции азота.

1.3.4. Биосинтез стеролов.

1.4. Геномные реконструкции метаболизма «Methylacidiphilum infernorum».

Глава 2. Особенности адаптации термофильных и термотолерантных прокариот.

2.1. Тепловой шок.

2.2. Особенности внутриклеточных структур у термофилов.

2.2.1. Белки и ферменты термофилов.

2.2.2. Механизмы стабилизации нуклеотидов.

2.2.3. Внутриклеточные факторы, стабилизирующие белки и ДНК.

2.2.3.1. Анионные термопротекторы.

2.2.3.2. Незаряженные осмолиты.

2.2.4. Строение цитоплазматических мембран термофильных бактерий.

2.2.5. Системы антиоксидантной защиты у микроорганизмов.

Глава 3. Пигменты метанотрофов.

3.1. Биосинтез меланинов у микроорганизмов.

3.2. Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Объекты исследования.

4.2. Культивирование метанотрофов.

4.3. Микроскопические исследования.

4.3.1. Выявление нуклеоида в целых клетках.

4.4. Изучение физиологических свойств.

4.5. Аналитические определения.

4.6. Идентификация органических осмолитов.

4.6.1. Аминокислотный анализ.

4.6.2. Ионообменная тонкослойная хроматография.

4.6.3. Экстракция термостабильных низкомолекулярных растворимых веществ из клеток.

4.6.4. Разделение углеводсодержащих низкомолекулярных веществ.

4.7. Определение включения 14СН4 суспензиями клеток.

4.8. Определение влияния температуры инкубации на биосинтез белка и окисление метана.

4.9. Фракционирование клеток.

4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов.

4.9.2. Определение концентрации белка.

4.9.3. Электрофорез в ДСН-ПААГ.

4.10. Определение активности ферментов.

4.10.1. Определение активности ферментов первичного и центрального метаболизма

4.10.2. Определение оптимальной температуры для активности ферментов.

4.10.3. Определение термостабилизирующего влияния экстракта, спиртоводорастворимой фракции клеток штамма 0-12 и сахарозы на активность ЛДГ и ФДГ.

4.11. Выделение ароматических метаболитов из культуральной жидкости.

4.12. Выделение и изучение свойств меланина.

4.13. Визуализация перекись - разлагающей активности клеток Md. szegediense 0-12.

4.14. Молекулярно-генетические методы.

4.14.1. Выделение и очистка препаратов ДНК.

4.14.2. ПЦР-амплификация.

4.14.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

4.14.4. Очистка фрагментов ДНК.

4.14.5. Лигирование фрагментов ДНК.

4.14.6. Получение компетентных клеток и их трансформация.

4.14.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.

Глава 5. Результаты и обсуждение.

5.1. Цитофизиологические и биохимические свойства Md. szegediense 0-12.

5.1.1. Особенности роста Md. szegediense 0-12 при различных температурах.

5.1.2. Окисление и ассимиляция метана при разных температурах культивирования адаптированными клетками Md. szegediense 0-12.

5.1.3. Влияние температуры инкубации на биосинтез белка Md. szegediense 0-12.

5.1.4. Цитологические особенности Md. szegediense 0-12.

5.1.5. Фосфолипидные и жирнокислотные профили клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath.

5.1.6. Влияние температуры культивирования на активность ферментов первичного и центрального метаболизма.

5.1.7. Влияние температуры измерения на активность ключевых ферментов С] метаболизма.

5.2. Идентификация органических термопротекторов у Md. szegediense 0-12.

5.2.1. Накопление и путь биосинтеза сахарозы у Md. szegediense 0-12.

5.2.2. Влияние сахарозы на термостабильность ФДГ и ЛДГ.

5.3. Системы защиты от активных форм кислорода у термотолерантного и умеренно термофильного метанотрофов.

5.3.1. Активности ферментов защиты от АФК.

5.4. Синтез меланинового пигмента Мс?. szegediense 0-12.

5.4.1. Выделение и изучение свойств меланинового пигмента.

5.4.2. Изучение локализации меланина в клетках Md. szegediense 0-12.

5.4.3. Поиск предшественника синтеза меланина.

5.4.4. Расшифровка путей синтеза меланина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12"

Актуальность проблемы. На Земле есть множество мест с постоянно высокой температурой (действующие вулканы, геотермальные источники и промышленные стоки), в которых обитают сообщества термофильных микроорганизмов. Интерес к термофильным прокариотам связан, в первую очередь, с наличием у них уникальных по стабильности биополимеров и низкомолекулярных соединений, обуславливающих адаптацию к повышенным температурам (Jaenicke, Sterner, 2003). Присутствие в высокотемпературных экосистемах метана геохимического или микробиологического происхождения предполагает возможность существования в них метанотрофов.

Метанотрофы — структурно и функционально специализированная группа аэробных метилотрофных бактерий, использующих метан и метанол в качестве источника углерода и энергии. Метанотрофы обнаружены в самых разнообразных экосистемах, в том числе в экстремальных, где их присутствие определено наличием метана и кислорода (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Способность метанотрофов окислять СН4, наиболее восстановленную органическую молекулу, обусловлена», наличием метанмонооксигеназы (ММО), которая может также соокислять широкий спектр алифатических, ароматических, гетероциклических и галогенированных углеводородов. Потребляя метан и соокисляя различные поллютанты в своих эконишах, метанотрофы снижают эмиссию метана и других парниковых газов в атмосферу и осуществляют естественную биоремедиацию. Кроме того, метанотрофы перспективны для биотехнологии как продуценты целевых соединений из доступных и относительно дешевых и возобновляемых субстратов - метана и метанола. В этой связи представляют особый интерес термофильные метанотрофы, как потенциальные продуценты ферментов (термозимов). В частности, ММО и другие ферменты Ci метаболизма могут обладать полезными свойствами, обусловленными термофильной природой их продуцентов (Trotsenko, Khmelenina, 2002). Термофильные метанотрофы перспективны в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов адаптации и филогении с целью более глубокого понимания особенностей биологии и эволюции этой специализированной группы бактерий.

Среди метанотрофов известны термотолерантные представители рода Methylococcus (Foster, Davis, 1966; Малашенко с соавт., 1975), умеренно термофильные виды родов Methylocaldum и Methylothermus, а также недавно открытые термоацидофилы филума Verrncomicrobia (Bodrossy et al., 1995; 1997; 1999; Ешинимаев с соавт., 2004; Tsubota et al., 2005; Dunfield et al., 2007; Islam et al., 2008; Pol et al., 2007), однако механизмы их адаптации к изменениям температуры не исследованы.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью нашей работы было расшифровка особенностей термоадаптации умеренно термофильного мтанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Изучить зависимые от температуры цитобиохимические изменения у Md. szegediense 0-12.

2. Идентифицировать потенциальные термопротекторы и пути их биоситнеза у Md. szegediense 0-12.

3. Определить природу бурого пигмента, синтезируемого Md. szegediense 0-12, и возможную связь с термоадаптацией.

Научная новизна работы. До начала наших исследований механизмы термоадаптации у метанотрофов были не известны. Нами обнаружено, что адаптация Md. szegediense 0-12 к повышенной температуре культивирования (57°С) происходит как на уровне изменения активности ферментов Ci метаболизма, так и посредством накопления термопротектора - сахарозы. Установлено, что синтез сахарозы осуществляется из интермедиатов РМФ цикла (фруктозо-6-фосфата и УДФ-глюкозы) с участием сахарозофосфатсинтазы, а деградация сахарозы катализируется сахарозофосфатфосфорилазой. Выявлена многоуровневая система защиты от активных форм кислорода (АФК) с участием глутатиона, пероксидазы и супероксиддисмутазы. Найдено, что адаптация к понижению температуры культивирования (45-37°С) сопровождается изменением морфологии, метаболизма, фосфолипидного и \ жирнокислотного состава клеток. Впервые показано, что Md. szegediense 0-12 синтезирует меланин из интермедиатов пути деградации тирозина, образующихся в ответ на снижение температуры культивирования метанотрофа. Полученные приоритетные результаты существенно углубляют представления об особенностях адаптации и выживания умеренно термофильных метанотрофов.

Практическое значение. Наши исследования механизмов термоадаптации Md. szegediense 0-12 выявили ряд цитобиохимических особенностей, представляющих интерес для биотехнологии. Показано, что ферменты Ci метаболизма, а также цитохром с пероксидаза имеют оптимумы активности в диапазоне 55 - 70°С, что позволяет реализовать метаболический потенциал данного метанотрофа для получения и применения термостабильных ферментов в процессах биоремедиации, биосинтеза метанола и других целевых продуктов из относительно дешевого субстрата — метана. В частности, способность синтезировать меланин может быть использована для получения биопротекторов, применяемых при воздействии факторов мутагенной и канцерогенной природы. Показано, что исследуемые метанотрофы являются активно растущими в диапазоне температур от 45-57°С, что делает перспективным их использование в качестве биофильтров для снижения концентрации метана в угольных шахтах.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на ежегодных конференциях молодых ученых г. Пущино (2003-2005), международной конференции «Наука и бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), ежегодной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005-2008), международной конференции «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007), 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ" (Иркутск, 2007), VI международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), международной научной конференции «Экстремофилы» (Кейптаун, 2008), а также на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 11 тезисов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Медведкова, Ксения Александровна

выводы

1. Расшифрованы цитобиохимические перестройки, происходящие при адаптации умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12 к различным температурам культивирования (37, 45 или 55°С). При оптимальной температуре роста (55°С) в клетках увеличивалась доля насыщенных Ci6:o, циклических Ci7cyc жирных кислот и появлялись необычные для эубактерий метилированные Ci6-oMe-9 жирные кислоты. Напротив, адаптация к пониженной температуре роста (37°С) сопровождалась изменением морфологии клеток и накоплением ненасыщенных жирных КИСЛОТ Ci6 ь

2. Показано, что активности ферментов серинового пути и цикла Кальвина у Md. szegediense 0-12 максимальны при температуре культивирования 55°С, что предполагает их участие в регуляции энергетического статуса клеток. Оптимумы активностей формиатдегидрогеназы, оксипируватредуктазы, рибулозобиефосфаткарбоксилазы/оксигеназы и гексулозофосфат-синтазы в экстрактах клеток Md. szegediense 0-12 находятся в интервале 50-65°С, тогда как у термотолерантного Methylococcus capsulatus Bath при 40-60°С, что обуславливает разную гермоадаптабельность этих метанотрофов.

3. Обнаружено, что Md. szegediense О-12 в ответ на повышение температуры культивирования и солености среды накапливает сахарозу при участии сахарозофосфатсинтазы, катализирующей конденсацию УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата. Показано, что сахароза стабилизирует активность ферментов С] метаболизма при повышенных температурах, являясь потенциальным термопротектором.

4. Установлено, что Md. szegediense О-12 и Мс. capsulatus Bath имеют многоуровневую систему защиты от активных форм кислорода, о чем свидетельствует присутствие в клетках свободного глутатиона и активностей глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и цитохром с пероксидазы. При этом пероксидазная активность локализована в периплазматическом пространстве клеток и ВЦМ.

5. Выявлено, что клетки Md. szegediense О-12 синтезируют меланин при субоитималыюн температуре роста (45°С). Предположено, что меланин образуется из интермедиатов деградации тирозина, накапливающихся в ответ на снижение температуры культивирования.

6. Найдены существенные различия в термоадаптации термофильного и термотолерантного метанотрофов: в противоположность Md. szegediense 0-12, Мс. capsulatus Bath не проявляет клеточный полиморфизм, не способен образовывать меланин и синтезировать сахарозу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К механизмам, позволяющим Md. szegediense 0-12 адаптироваться к постоянно меняющимся условиям в природных экосистемах, очевидно, следует отнести способность к изменению морфологии, метаболизма, фосфолипидного и жирнокислотного состава клеток, причем последнее свойственно также другим термофильным прокариотам. Однако наряду с характерным для термофилов увеличением доли насыщенных жирных кислот, у Md. szegediense 0-12 в ответ на повышение температуры культивирования появляются необычные для эубактерий метилированные жирные кислоты Су.омс-16, обнаруженные у термофильных архей.

Нами показано, что ферменты Ci-метаболизма Md. szegediense 0-12 максимально активны при более высоких температурах, нежели ферменты термотолерантных или мезофильных метанотрофов. Дальнейшие исследования свойств других ферментов Ci-метаболизма, и прежде всего ММО, могут внести существенный вклад в реализацию биотехнологического потенциала термофильных метанотрофов.

Нами обнаружено, что термоадаптация Md. szegediense 0-12 происходит посредством синтеза и накопления в клетках сахарозы, стабилизирующей белки при повышении температуры. Синтез сахарозы осуществляется из первичных интермедиатов ассимиляции Q-соединений по пути, который реализуют растения, цианобактерии и некоторые протеобактерии. Судя по наличию у Md. szegediense 0-12 сахарозофосфорилазы - фермента, расщепляющего сахарозу до утилизируемых продуктов, этот дисахарид может служить также в качестве запасного источника углерода, обеспечивающего выживаемость метанотрофа при дефиците метана. Возможно, способность к синтезу сахарозы определяет широкое распространение бактерий этого рода в природе (Bodrossy et al., 1997; Knief et al., 2003; Ешинимаев с соавт., 2004; Jackel et al., 2005). Примечательно, что у термотолерантного Мс. capsulatus Bath накопление сахарозы не обнаружено.

Нами выявлено, что клетки Md. szegediense 0-12 синтезируют меланиновый пигмент при субоптимальной температуре роста (45°С). Судя по энзимологическим данным, меланин образуется из интермедиатов путей деградации тирозина, накапливающихся в ответ на снижение температуры культивирования метанотрофа.

Бактерий рода Methylocaldum находят как в высокотемпературных экосистемах -термальных источниках, отходах различных тепловых производств, так и в экосистемах с низкой температурой или подверженных флуктуациям — отходы животноводческих ферм, рисовые поля, и др. Вероятно, меланин у Md. szegediense выполняет защитную функцию, предохраняя клетки не только от перепада температур, но и от воздействия других неблагоприятных факторов (АФК, антибиотики, УФ).

Нами доказано, что термофильные метанотрофы имеют многоуровневую систему защиты от АФК: активности цитохром с пероксидазы, СОД, глутатионпероксидазы и внутриклеточный глутатион, способный напрямую удалять гидроксильные радикалы (ОН') и синглетный кислород (О'). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о существенных различиях в механизмах термоадаптации термофильного и термотолерантного метанотрофов. Мс. capsulatus Bath, в противоположность, Md. szegediense 0-12 не проявляет клеточный полиморфизм, не способен образовывать меланин и синтезировать сахарозу при флуктуациях температуры. Однако Мс. capsulatus Bath формирует регулярные поверхностные структуры (S-слои), подобно Methylothermus thermalis, клетки которого также не проявляют полиморфизм (Tsubota et al., 2005). Не исключено, что меланин, имеющий более жесткую структуру, по сравнению с S-слоями, препятствует расхождению клеток Md. szegediense 0-12 при делении, что приводит к изменению морфологии. Интересно, что с поверхностными образованиями клеток термофильных и термотолерантных метанотрофов (меланином или S-слоями) связана перекись-разлагающая активность (Сузина, Фихте, 1986). Это наводит на мысль о защитной функции этих поверхностных структур у термофильных метанотрофов.

Выявленные нами цитобиохимические особенности Md. szegediense 0-12 создают предпосылки для дальнейших исследований механизмов термоадаптации на молекулярном уровне. В этом отношении Md. szegediense представляет интерес не только в научном плане, но и в биотехнологическом аспекте, поскольку может служить источником новых биопротекторов, биостимуляторов и стабильных ферментов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Медведкова, Ксения Александровна, Пущино

1. Баснакьян И.А. (2003). Стресс у бактерий. Москва. «Медицина». 135 с.

2. Биологические мембраны. (1990). Методы: Пер. с англ./Под ред. Дж.Б. Финделея, У.Г. Эвапса. Изд. "Мир", 424с.

3. Бра М., Квинан Б., Сузин С.А. (2005). Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели. Биохимия. Т. 70, В. 2. С. 284-293.

4. Бриггон Г. (1986). Биохимия природных пигментов. Москва «Мир». С. 55-56.

5. Гальченко В.Ф. (2001). Метанотрофные бактерии. М. ГЕОС. 500с.

6. Гальченко В.Ф., Троценко Ю.А. (2006). Метанотрофия как научное направление. Труды Института микробиологии, Ред. В.Ф.Гальченко, М: Наука, Т.13. С. 5-23.

7. Геннис Р. (1997). Биомембраны молекулярная структура и функции. Москва. «Мир».

8. Гусев М. В., Минеева Л. А. (1992). Микробиология. Издательство МГУ.

9. Гусев Н. Б. (2003). Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии. Т. 43. С. 59—98.

10. Досон Р., Элиот Д. (1991). Справочник биохимика. М. «Мир». С. 400

11. Дуда В.И., Данилевич В. Н., Акимов В.Н., Сузина Н.Е., Дмитриев В.В., Шорохова А.П. (2005). Люминесцентно-микроскопическое изучение микроорганизмов, обработанных хаотроппыми агентами. Микробиология. Т. 74. №4. С. 505-10.

12. Ешинимаев Б.Ц., Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (2002). Физиолого- биохимические и цитологические особенности галоалкалотолерантного метанотрофа при росте на метаноле. Микробиология. Т. 71. №5. С. 596-603.

13. Ешинимаев Б.Ц., Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Осипов Г.А., Лысенко A.M., Троценко Ю.А (2004). Новые термофильные метанотрофы рода Methylocaldum. Микробиология. Т. 73. №4. С.530-539.

14. Заварзин Г.А. (1984). Бактерии и состав атмосферы. М. Наука. 199с. Заварзин Г.А. (1995). Круговорот метана в экосистемах. Природа. Т. 6. С. 3-14.

15. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. (1999). Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. Микробиология. №5. С. 689-697.

16. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. (1979). Карбоксилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. Микробиология. Т. 48. № 2. С. 202-207.

17. Лось Д. А. (2001а). Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. Соросовский образовательный журнал. Т.7. №9.

18. Лось Д.А. (20016). Структура и регуляция экспрессии и функционирование дееатураз жирных кислот. Успехи биологической химии. Т.41. С. 163 —198.

19. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. (1978). Метаиокисляющие микроорганизмы. М., Наука. 195с.

20. Милейковская Е., Жанг М., Доухан В. (2005). Роль кардиолипина в энергозапасающих мембранах. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели. Биохимия. Т. 70, №2. С. 191-196.

21. Мунтян М.С., Попова И.В., Блох Д.А., Скрипникова Е.В., Устиян B.C. (2005). Энергетика щелочелюбивых представителей рода Bacillus. Биохимия. Т. 70. №2. С. 171-176.

22. Панасенко О. О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003). Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии. Т. 43. С. 59-98.

23. Перт С. Д. (1978). Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. «Мир». С. 332.

24. Романовская В.А., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. (1991). Систематика метилотрофных бактерий. Киев. «Наукова Думка». 150 с.

25. Смирнова Г. В., Закирова О. Н., Октябрьский О.И. (2001а). Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок. Микробиология. Т.70. С. 595-601.

26. Смирнова Г. В., Красных Т. А., Октябрьский О.Н. (20016). Роль глутатиона при ответе Escherichia coli на осмотический шок. Биохимия. Т.66. С. 1195-1201.37

27. Соколов И.Г., Романовская В.А. (1992). Механизмы облигатной метилотрофии. Микробиол. журнал. V. 54. № 5. С. 87-104.38

28. Сысоев О.В., Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. (1989). Изучение роли глутатион. метилотрофных бактерий с различными путями Сi-метаболизма. Микробиология. Т. 58. №4. С. 549-552.

29. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. (1986). Ультраструктурная организация метанотрофиых бактерий. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 85 с.

30. Ткаченко А.Г., Федотова М.В. (2007). Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от стрессорных воздействий супероксидных радикалов. Биохимия. Т. 72(1). С. 128-136.

31. Тюрин В. С., Горская JI. А., Кафтанова А. С., Логинова Т. М., Михайлов А. М. (1985). Особенности тонкого строения Methylococcus capsulatus при разных условиях культивирования. Прикл. биохимия и микробиология. Т. 21. №6. С. 770-775.

32. Харакоз Д. П. (2001). О возможной физиологической роли фазового перехода «жидкое -твердое » в биологических мембранах. Успехи биологической химии. Т. 41, С.333 -364.

33. Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. (2000). Синтез органических осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами. Микробиология. Т. 69. № 4. С. 465-470.

34. Цырснжапова И. С., Ешинимаев Б.Ц., Хмеленина В.Н., Осипов Г.А., Троценко Ю.А. (2007). Новый термофильный аэробный метанотроф из термального источника Бурятии. Микробиология. Т. 76. №1. С.132-135.

35. Четина Е.В., Сузина Н.Е., Фихте Б.А., Троценко Ю.А. (1982). Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата Methylomonas methanica. Микробиология. Т.51. №2. С.247-254.

36. Четина Е.В., Троценко Ю.А. (1981). Внутриклеточная локализация ферментов окисления С)-соединений у облигатных метанотрофов. Микробиология. Т. 50. № 3. Р. 446-452.

37. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А. (1986). Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофными бактериями. Микробиология. Т.55. №3. С. 377-382.48

38. Allocati N., Masulli M., Pietracupa M., Federici L., and Ilio C. (2006). Evolutionarily conserved structural motifs in bacterial GST (glutathione S-transferasc) are involved in protein folding and stability. Biochem. J. V. 394. P. 11-17.

39. Amaratunga K., Goodwin P.M., O'Connor C. D., and Anthony C. (1997b). The methanol oxidation genes mxaFJGIR(S)ACKLD in Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiol Lett. V. 146. P. 31-38.

40. Angelis M., Cagno R., Huet C., Crecchio C., Fox P. F., and Gobbetti M. (2004). Heat shock response in Lactobacillus plantarum. Appl. and Environ. Microbiol. V. 70, № 3. P. 13361346.

41. Anthony C. (1982). The Biochemistry of Methylotrophs. New York. Academic Press.

42. Anthony C. (1991). Assimilation of carbon in mcthylotrophs. In: Biology of methylotrophs (Eds. Goldberg I. and Rokem J.S.), Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass. P. 79-109.

43. Anthony C., Ghosh M., and Blake C.C.F. (1994). The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinine. Biochem. J.1. V. 304. №3. P. 5-674.

44. Anthony С., Williams P. (2003). The structure and mechanism of methanol dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. V. 1647. P. 8-23.

45. Anthony C., Zatman L.J. (1964). The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. Biochem. J. V. 92. P.614-621.

46. Asada K., Yoshikawa K., Taiuhashi M.-A., Maeda Y., Enmanji K. (1975). Superoxide dismutases from a blue-green alga, Plectonema boryanum. J. Biol. Chem. V. 250. №. 8. P. 2801-2807.

47. Auman A.J., Speake C.C., and Lidstrom M.E. (2001). nifH sequence and nitrogen fixation in type I and type II methanotrophs. Appl. Environ. Microbiol. V. 67. № 9. P.4009-4016.

48. Bakermans C., and Nealson К. H. (2004). Relationship of critical temperature to macromolecular synthesis and growth yield in Psychrobacter cryopegella. J. Bacteriol. V. 186. №8. P. 2340-2345.

49. Barber R. D., Donohue T. J. (1998). Function of a glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides formaldehyde oxidation and assimilation. Biochemistry. V. 37. P. 530-537.

50. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L., Kovacs K.L., Emblcy T.M., Prosser J.I., and Murrell J.C. (2002). The ribulose-l,5-bisphosphate carboxylasc/oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath). Arch. Microbiol. V. 177. P.279-289.

51. Beauchamp C., Fridovich I. (1971). Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acilamide gels. Anal. Biochem. V. 44. P. 276-287.

52. Bergmann D. J., Zahn J. A., Hooper А. В., and DiSpirito A. A. (1998). Cytochrome P460 genes from the methanotroph Methylococcus capsulatus Bath. J. Bacteriol. V. 180. P. 64406445.

53. Bergmann D.J, Zahn J.A., and DiSpirito A.A. (1999). High molecular- mass multi-c-heme cytochromes from Methylococcus capsulatus Bath. J. Bacteriol. V. 181. P. 991-997.

54. Bergmeer H. U., Bergmeer J., Grabl M. (1983). 3rd edition. Methods of enzymatic analysis. Verlag. Chemie Gmb H. V. 2. P. 203-211.

55. Bernan V., Filpula D., Herber W., Bibb M., and Katz E. (1985). The nucleotide sequence of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus and characterization of the gene product.1. Gene. V. 37. P. 101-110.

56. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. (1983). Linear one-step assay for the determination of orthophosphate. Anal. Biochem. V. 132. P. 254-258.

57. Billi D., Wright D.J., Helm R.F., Prickett Т., Potts M. and Crowe J.H. (2000). Engineering desiccation tolerance in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. V.66, №4. P.l 680-1684.

58. Bird C. W, Lynch J. M., Pirt F. J., Rcid W. W., Brooks C-J. W., and Middleditch B. S. (1971). Steroids and squalene in Methylococcus capsulatus grown on methane. Nature. V. 230. P. 473-474.

59. Blackmore M.A., Quayle J.R. (1970). Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase. Biochem. J. V. 118. P.53-59.

60. Bodrossy L., Kovacs K.L., McDonald I.R., and Murrell J.C. (1999). A novel thermophilic methane-oxidising y-Proteobacterium. FEMS Microbiol. Lett. V.170. № 2. P.335-341.

61. Bodrossy L., Murrell J.C., Dalton H., Kalman M„ Puskas L.G., and Kovacs K.L. (1995). Heat-tolerant methanotrophic bacteria from the hot water effluent of a natural gas field. Appl. Environ. Microbiol. V.61. № 10. P.3549-3555.

62. Borges C. R., Roberts J. C., Wilkins D. G., and Rollins D. E. (2001). Relationship of melanin degradation products to actual melanin content: application to human hair. Anal. Biochem. V. 290. P. 116-125.

63. Borges N., Marugg J.D., Empadinhas N., and Costa M.S. (2004). Specialized roles of the two pathways for the synthesis of mannosylglycerate in osmoadaptation and thermoadaptation of Rhodothermus marinus. J. Biol. Chem. V.279. №11. P.9892-9898.

64. Borges N., Ramos A., Raven N.H., Sharp R.J., and Santos E. (2002). Comparative study of the thermostabilizing properties of mannosylglycerate and other compatible solutes on model enzymes. Extremophiles. V. 6. P.209-216.

65. Bouvicr P., Rohmer M., Benveniste P., and Ourisson G. (1976). Delta8(14)-steroids in the bacterium Methylococcus capsulatus. Biochem. J. V. 159. P. 267-271.

66. Brenot A., King K. Y., Janowiak В., Griffith O., Caparon M. G. (2004). Contribution of glutathione peroxidase to the virulence of Streptococcus pyogenes. Infection and Immunity. V. 72. №. l.P. 408-413.

67. Bruins M.E., Janssen A.M., Boom R. M. (2001). Thermozymes and their applications. Appl. Biochem. Biotechnol. V.90. P. 155-185.

68. Cardy, D.L., and Murrell, J.C. (1990). Cloning, sequencing and expression of the glutamine synthetase structural gene (glnA) from the obligate methanotroph Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. V. 136. P. 343-352.

69. Carls R.A., Hanson R.S. (1971). Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle mutants of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. V. 106. P. 848-855.

70. Carreira A., Ferreira L., Loureiro V. (2001). Brown pigment produced by Yarrowia lipolytica result from extracellular accumulation of homogentisic acid. Appl. Environ. Microbiol. V.67. № 8. P. 3463-3468.

71. Carreira A., Ferreira L., Loureiro V. (2001). Production of brown pigments by the yeast Yarrowia. J. Appl. Microbiol. V.90. P.372-379.90

72. Chen Y.P., Yoch D.C. (1988). Reconstitution of the electron transport system that couples formate oxidation to nitrogenase in Methylosinus trichosporium OB3b. J. Gen. Microbiol. V. 134. P. 3123-3128.91

73. Chen Y.P., Yoch D.C. (1989) Isolation, characterization and biological activity of ferredoxin-NAD+ reductase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V. 171. P. 5012-5016.

74. Chen Y.R., Hartman F.C. (1995). A signature of the oxygenase intermediate in catalysis by ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase as provided by a site-directed mutant. J. Biol. Chem. V.270. №20. P. 11741-11744.

75. Childress J.J., Fisher C.R., Brooks J.M., Kennicutt II M.C., Bidigare R., and Anderson A.E. (1986). A methanotrophic marine molluscan (Bivalves, Mytilidae) symbiosis: mussels fueled by gas. Science. V. 233. P. 1306-1308.

76. Chistoserdova L., Chen S.W., Lapidus A., and Lidstrom M.E. (2003). Methylotrophy in Methylohacterium extorquens AMI from a genomic point of view. J. Bacteriol. V. 185. P. 2980-2987.

77. Chistoserdova L., Laukel M., Portais J.C., Vorholt J.A., Lidstrom M.E. (2004). Multipleformate dehydrogenase enzymes in the facultative methylotroph Methylobacterium exlorquens AMI are dispensable for growth on methanol. J. Bacteriol. V. 186. P. 22—28.

78. Chistoserdova L., Rasche M.E., Lidstrom M.E. (2005). Novel dephosphotetrahydro-methanopterin biosynthesis genes discovered via mutagenesis in Methylobacterium extorquens AMI. J Bacteriol. V.187. P.2508-2512.

79. Chistoserdova L.V., Lidstrom M.E. (1994). Genetics of the serine cycle in Methylobacterium extorquens AMI: Identification, sequence, and mutation of three new genes involved in Ci assimilation, orf4, mtkA, and mtkB. J. Bacteriol. V. 176. P. 7398-7404.

80. Clare D. A., Rabinowitch H.D., and Fridovieh I. (1984). Superoxide dismutase and chilling injury in Chlorella ellipsoidea. Arch. Biochem. Biophys. V. 231. № 1. P. 158-163.

81. Clark A., Bradford S., Endmondson S., and Shriver J. (2004). Thermodynamics of core hydrophobicity and packing in the hyperthermophilic proteins Sac7d and Sso7d. Biochemistry. V.43. P. 2840-2853.

82. Colby, J., Stirling, D.I., and Dalton, H. (1977). The soluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath). Biochem. J. V. 165. P. 395-402.

83. Coon S., Kotob S., Jarvis В., Wang S., Fuqua W., Weiner R. (1994). Homogentisic acid is the product of MelA, which mediates melanogenesis in the marine bacterium Shewanella' colwellian D. Appl. Environ. Microbiol. V. 60. P. 3006-3010.

84. ЮЗ.с0уПе5 V.E., and al-Harthi, L. (1992). Induction of melanin biosynthesis in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. V. 58. P. 2861-2865.

85. Csaki R., Hanczar Т., Bodrossy L., Murrell J.C., and Kovacs K.L. (2001). Molceularcharacterization of structural genes coding for a membrane bound hydrogenase in

86. Methylococcus capsulatus (Bath). FEMS Microbiol Lett. V. 205. P. 203-207.

87. Cumino A., Curatti L., Giarrocco L., and Salerno G. L. (2001). Sucrose metabolism: Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minimal functional domains shuffled during evolution. FEBS Letters. V. 517. P. 19-23.

88. Curatti, L. Porchia A.C., Herrera-Estrella L., Salerno G.L. (2000). A prokaryotic sucrosc synthase gene (susA.) isolated from a filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium encodes a protein similar to those of plants. Planta. V. 211. P. 729-735.

89. Da Cosla M.S., Santos H., and Galinski E.A. (1998). An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. V. 61. P. 117-153.

90. Dalton II. (1992). Methane oxidation by methanotrophs: physiological and mechanistic implications. In: Methane and Methanol utilizers . Eds. Murrell J.C. and Dalton H., Plenum Press, New York. P. 85-114.

91. Dalton H. (2005). The natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria. Phil. Trans. R. Soc. В. V. 360. P. 1207-1222.

92. Dalton II., Leak D.J. (1985). Methane oxidation by microorganisms. In: Microbial gas metabolism. Eds. Pool R.K and Dow C.S., p. 173-200. Acad. Press, London, Ltd.

93. Dalton H., Wilkins P., and Jiang Y. (1993). Structure and mechanism of action of the hydroxylase of soluble methane monooxygenase. Eds. J.C.Murrell and D.P.Kelly. In: Microbial Growth on CI Compounds. Intercept Press, Ltd., Andover. P.65-80.

94. Davey, J.F., Whittenbury, R., and Wilkinson, J. F. (1972). The distribution in the methylobacteria of some key enzymes concerned with intermediary metabolism. Areh. Microbiol. V. 87. P. 359-366.

95. De Smet K.A.L., Weston A., Brown I.N., Young D.B. and Robertson B.D. (2000). Three pathways for trehalose biosynthesis in mycobacteria. Microbiology. V.146, P. 199-208.

96. Dijken van J.P., Quayle J.R. (1977). Fructose metabolism in four Pseudomonas species. Arch. Microbiol. V. 114. P.281-286.

97. DiSpirito A.A, Zahn J.A., Graham D.W., Kim H.J., Larive C.K., Derrick T.S., Cox C.D., and Taylor A. (1998). Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V. 180. P. 3606-3613.

98. Duan Z., Moller N., Greenberg J., and Weare J. H. (1992). The prediction of methane solubility in natural waters to high ionic strength from 0 to 250°C and from 0 to 1600 bar. Geochim. Cosmochim. Acta. V. 56. P. 1451- 1460.

99. Elmorea В. O., Bergmann D. J., Klotzc M. G., and Hoopera A. B. (2007). Cytochromes P460 and c-beta; A new family of high-spin cytochromes c. FEBS Letters. V. 581. P. 911916.

100. Enochs, W.S., Nilges, M.J., and Swartz, H.M. (1993). A standardized test for the identification and characterization of melanins using electron paramagnetic (EPR) spectroscopy. Pigment Cell Res. V. 6. P. 91-99.

101. Farewell A., and Neidhardt F.C. (1998). Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. Journal of bacteriology. V. 180. №17. P. 4704—4710.

102. Faria T. Q., Lima J.C., Bastos M., and Macanita L. (2004). Protein stabilization by osmolytes from hyperthermophiles. J. Biol. Chem. V. 279. N 47. P. 48680-48691.

103. Fassel T. A., Buchholz L.A., Collins M.L., and Remsen C.C. (1992). Localization of methanol dehydrogenase in two strains of methylotrophic bacteria detected by immunogold labeling. Appl. Environ. Microbiol. V. 58(7). P. 2302-2307.

104. Ferenci, Т., Strom, Т., and Quayle, J.R. (1974). Purification and properties of 3-hexulose phosphate synthase from Methylococcus capsulatus. Biochem. J. V. 144. P. 477-486.

105. Francis R.T. and Becker R.R. (1984). Specific indication of hemoproteins in polyacrylamide gels using a double-staining process. Anal. Chem. V. 136. P. 509-514.

106. Foster J.W., Davis R.H. (1966). A methane dependent coccus with notes on classification and nomenclature of obligate methane-utilizing bacteria. J.Bacteriol. V. 91. P. 1924-1931.

107. Fox B.G., Froland J.E., Dege J., and Lipscomb D.G. (1989). Methane monooxygenase from

108. Methylosinus trichosporium ОВЗЬ: purification and properties of a three component system with high specific activity from a type II methanotroph. J. Biol. Chem. V. 266. P. 540-550.

109. Frases S., Salazar A., Dadachova E., and Casadevall A. (2007). Ctyptococcus neoformans can utilize the bacterial melanin precursor homogentisic acid for fungal melanogenesis. Appl. Environ. Microbiol. V. 73. № 2. P. 615-621.

110. Funa N., Funabashi' M., Ohnishi Y., and Horinouchi S. (2005). Biosynthesis of hexahydroxyperylenequinone melanin via oxidative aryl coupling by cytochrome P-450 in Streptomyces griseus. J. Bacteriol. V. 187. No. 23. P. 8149-8155.

111. Funa N., Ohnishi Y., Fujii I., Shibuya M., Ebizuka Y., and Horinouchi S. (1999). A new pathway for polyketide synthesis in microorganisms. Nature. V. 400. P. 897-899.

112. Galtier N., Lobry J. R. (1997). Relationships between genomic G+C content, RNA secondary structure, and optimal growth temperatures in prokaryotes. J. Molec. Evol. V. 44. P. 632-636.

113. Gay della-Cioppa, Gager S., Sverlov G. G., Turpen Т.Н., and Grill L. K. (1990). Melanin production in Escherichia coli from a cloncd tyrosinase gene. Biotechnology. V.8. P. 634640.

114. Goodwin P. M., and Anthony C. (1995). The biosynthesis of periplasmic electron transport protein in methylotrophic bacteria. Microbiology (UK). V. 141. P. 1051-1064.

115. Grant W.D. (2004). Life at low water activity. Phil Trans R Soc Lond В. V. 359. P. 12491267.

116. Green P. (1992). Taxonomy of methylotrophic bacteria. In: Methane and methanol utilizers. Eds. Murrell J.C. and Dalton II., Plenium Press, New York. P.23-84.

117. Hanczar Т., Csaki R., Bodrossy L., Murrell J.C., and Kovacs K.L. (2002). Detection andlocalization of two hydrogenases in Methylococcus capsulatus (Bath) and their potential role in methane metabolism. Arch. Microbiol. V. 177. P. 167-172.

118. Hanson R.S. and Hanson Т.Е. (1996). Methanotrophic bacteria. Microbiol. Rev. V.60. №2. P.439-471.

119. Harald C., Deckerb H. (2006). Bacterial tyrosinases. System. Appl. Microbiol. V. 29. P. 314.

120. Harrison J., Jamet A., Muglia С. I., Sype G., Aguilar О. M., Puppo A., Frendo P. (2005). Glutathione plays a fundamental role in growth and symbiotic capacity of Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriology. V. 187. № 1. P. 168-174.147

121. Henckel Т., Jackel U., Schnell S., and Conrad R. (2000). Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil oxidizing atmospheric methane. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. P. 1801-1808.

122. Hendel E. (1968). Direct microdetermination of sucrose. Analytical biochemistry. V. 22. P. 280-283.

123. Hernandez-Romero D., Solano F., Sanchez-Amat A. (2005). Polyphenol oxidase activity expression in Ralstonia solanacearum. Applied and environmental microbiology. V. 71 (11). P. 6808-6815.

124. Hite D R. (1993). Elevated levels of both sucrose-phosphate synthase in Vicia guard cells indicate cell-specific carbohydrate interconvesions. Plant Physiol. V.101. P. 1217-1221.

125. Hocker, В., С. Jiirgens, M. Wilmanns, and Sterner R. (2001). Stability, catalytic versatility and evolution of the (Pa)8-barrel fold. Curr. Opin. Biotechnol. V. 12. P. 376-381.

126. Islam Т., Jensen S., Reigstad L. J., Larsen O., Birkeland N-K. (2008). Methane oxidation at 55°C and pH 2 by a thermoacidophilic bacterium belonging to the Verrucomicrobia phylum. Proc. Acad. Natl. Sci. V. 105. №1. P. 300-304.

127. Ivinst В., Holmes R. (1981). Factors affecting phaeomelanin production by a melanin-producing (mel) mutant of Vibrio cholerae. Infection and Immunity.V. 34, P. 895-899 34.

128. Jaenicke R. and Sterner R. (2003). Life at high temperatures. Ed. Dworkin M. The Prokaryotes. Electronic resource of microbiological community.http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm

129. Jackel U., Thimmes K., and Kampfer P. (2005). Thermophilic methane production and oxidation in compost. FEMS Microbiol Ecol. V.52. P.175-184.

130. Joergensen L. (1985). Methane oxidation by Methylosinus trichosporium measured by membrane-inlet mass spectrometry. In: Microbial gas metabolism. Ed. Pool R.K and Dow C.S., Acad. Press, London. P.287-295.

131. Joergensen L. (1985). The methane mono-oxygenase reaction system studied in vivo by membrane inlet mass spectrometry. Biochcm. J. V. 225. P. 441-448.

132. Johnson P.A., Quayle J.R. (1964). Microbial growth on Ci-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 93. P.281-290.

133. Kato N., Yurimoto H., Thauer R. K. (2006). The physiological role of the ribulose monophosphate pathway in bacteria and archaea. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 70. №1. P. 10-21.

134. Keith К. E., Killip L., He P., Moran G. R., Valvano M. A. (2007). Burkholderia cenocepacia C5424 produces a pigment with antioxidant properties using a homogentisate intermediate. J. of Bacteriology. V. 189. № 24. P. 9057-9065.

135. Khmelenina V.N, Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., and Gottsehalk G. (1999). Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch. Microbiol. V. 172. №5. P. 321-329.

136. Kilimann К. V., Doster W. and Vogel R. F. (2006). Protection by sucrosc against heat-induced lethal and sublethal injury of Lactococcus lactis: An FT-1R study. Bioehimica et Biophysica Acta. V. 1764. P. 1188-1197.171

137. Kim H. J., Graham D. W., DiSpirito A. A., Alterman M. A., Galeva N., Larive С. K., and Asunskis D. (2004). Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. V. 305. P. 1612 1615.

138. Kim K., Portis A. R. Oxygen- depedent H202 production by Rubisco. (2004). FEBS Letters. V. 571. P. 124-128.

139. Knapp C.W., Fowle D.A., Kulczycki E., Roberts J.A., and Graham D.W. (2007). Methane monooxygenase gene expression mediated by methanobactin in the presence of mineral copper sources. Proc. Natl. Acad. Sci. V. 104(29). P. 12040-12045.

140. Knief C., Lipski A., and Dunfield P.F. (2003). Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils. Appl. Environ. Microbiol. V. 69(11). P. 6703-6714.

141. Knief C., Dunfield P.F. (2005). Response and adaptation of different methanotrophic bacteria to low methane mixing ratios. Environ. Microbiol. V. 7(9). P. 1307-17.

142. Ко W-Y, Ryan M.D., Akashi H. (2003). Molecular Phylogeny of the Drosophila melanogaster species subgroup. J. Mol. Evol. V. 57. P. 562-573.

143. Koga Т., Nakamura K., Shirokane Y., Mizusawa K., Kitao S., Kikuchi M. (1991). Purification and some properties of sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides. Agric. Biol. Chem. V. 55 (7). P. 1805-1810.

144. Kornberg A., Horecker B.L. (1955). Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods1. Enzymol. V. 1.P.323.

145. Korotkova, N., and Lidstrom, M.E. (2002). Glyoxylate regeneration pathway in the methylotrophMethylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. V. 184. P. 1750-1758.

146. Lawrence A.J., and Quayle J.R. (1970). Alternative carbon assimilation pathways in methane-utilizing bacteria. J. Gen. Microbiol. V. 63. P. 371-374.

147. Lee J., Jung H., and Kim S. (2003). 1,8-Dihydroxynaphthalene (DHN)-melanin biosynthesis inhibitors increase erythritol production in Torula corallina, and DHN-melanin inhibits erythrose reductase. Appl. Environ. Microbiol. V. 69. P. 3427-3434.

148. Lees V., Owens N.J.P., and Murrell J.K. (1991). Nitrogen metabolism in marine methanotrophs. Arch. Microbiol. V. 157. P.60-65.

149. Lebedinsky A.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2007). Phylogenetic systematics of microorganisms inhabiting thermal environments. Biochemistry (Moscow). V. 72. №12. P. 1299-1312.

150. Lelieveld J., Crutzen P.J., and Bruhl C. (1993). Climate effects of atmospheric methane. Chemosphere. V.26. P.739-768.

151. Leslie S.B., Israeli E., Lighthart В., Crowe J.H. and Crowe L.M. (1995). Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Appl. Environ.Microbiol. V.61. №10. P.3592-3597.

152. Lieberman R.L., Rosenzweig A.C. (2004). Biological methane oxidation: regulation, biochemistry and active site structure of particulate methane monooxygenase. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. V. 39. P. 147-164.

153. Loapez-Serrano D., Sanchez-Amat A., and Solano F. (2002). Cloning and molecularcharacterization of a SDS-activated tyrosinase from Marinomonas mediterranea. V. 15. P. 104-111.

154. Lopez-Garcia P., Forterre P. (2000). DNA topology and the thermal stress response, a talc from mesophiles and hyperthermophilcs. BioEssays. V. 22. P. 738-746.

155. Louis P., Truper H.G., and Galinski E.A. (1994). Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compatible solutes. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.41. №6. P. 684-688.

156. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. V. 193(1). P. 265-275.

157. Lunn J. E.; Price G. D., and Furbank R. T. (1999). Cloning and expression of a prokaryotic sucrose-phosphate synthase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Molecular Biology. V. 40. V. 297-305.

158. Madigan M. Т., Oren A. (1999). Thermophilic and halophilic extremophils. Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 265-269.

159. Makula R.A. (1978). Phospholipid composition of methane- utilizing bacteria. J.Bacteriol., V.134. № 3. P.771-777.

160. Marmur J.A. (1961). A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. V. 3. P.208-214.

161. Martins L.O., Empadinhas N., Marugg J.D., Miguel C., Ferreiera C., da Costa M.S., and Santos H. (1999). Biosynthesis of mannosylglycerate in the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus. J. Biol. Chem. V. 274. P. 35407-35414.

162. Martins L.O., Santos H. (1995). Accumlation of mannosylglycerate and di-mio-inositol-phosphate by Pyrococcus furiosus in response to salinity and temperature. Appl. Environ. Microbiol. V.61. № 9. P.3299-3303.

163. Maruta K., Hattori K., Nakada Т., Kubota M., Sugimoto Т., and Kurimoto M. (1996a) Cloning and sequencing of trehalose biosynthesis genes from Arthrobacter sp. Q36. Biochim. Biophys. Acta. V. 1289. №1. P.10-13.

164. Mathai G., Sprott G. D., and Zeidel M. L. (2001). Molecular mechanism of water and solutetransport across archaebacterial lipid membranes. J. Biol. Chem. V. 276. P. 27266-27271.

165. McDonald I.R., Kenna E.M., Murrell J.C. (1995). Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR. Appl.Environ.Microbiol. 61:116-121.206

166. McDonald I.R., Murrell C.J. (1997b). The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 63:218-3224.907

167. McDonald, I.R., Murrell, C.J. (1997a). The particulate methane monooxygenase gene pmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs. FEMS Microbiol. Lett. 156, 205-210.

168. Merkx M., Kopp D.A., Sazinsky M.H., Blazyk J.L., Muller J., and Lippard S.J. (2001). Dioxygen activation and methane hydroxylation by soluble methane monooxygenase: a tale of two irons and three proteins. Angew. Chem. Int. Ed V.40. P.2782-2807.

169. Merkx M., Lippard S.J. (2002). Why OrfY? Characterization of mmoD, a long overlooked component of the soluble methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Biol. Chem. V. 277. P.5858-5865.

170. Mizushima S., Ishida M., Miura T. (1966). Subfraction of protoplast membrane, enzyme localization in Bacillus megaterium. J. Biochem. V. 60. P. 256-261.

171. Morisaki K., Fushimi Т., Kaneko S., Kusakabe I., Kobayashi H. (2001). Screening for phenoloxidases from edible mushrooms. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 65(10). P. 23342336.9.2

172. Murrell J.C., Dalton H. (1983a). Ammonia assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath) and other obligate methanotrophs. J. Gen. Microbiol. V. 129. P.1197-1206.

173. Murrell J.C., Dalton H. (1983a). Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. J. Gen. Microbiol. V. 129. № 11. P. 3481-3486.

174. Murrell J.C., Dalton H. (1992). Methane and methanol utilizers. Biotechnology Handbooks. Plenum press, New York. P. 34.9.5

175. Synechococcus PCC 7942: purification, nucleotide sequence analysis and expression in Escherichia coli. Biochem. J. V. 316. P. 251-257.

176. Myronova N., Kitmitto A., Collins R.F., Miyaji A., and Dalton H. (2006). Three-dimensional structure determination of a protein supercomplex that oxidizes methane to formaldehyde in Methylococcus capsulatus (Bath). Biochemistry. V. 45. P. 11905-11914.

177. Nash T. (1953). The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantsch reaction. Biochem. J. V.55, P. 416-421.

178. Nosanchuk J. D., Casadevall A. (2003). The contribution of melanin to microbial pathogenesis. Cellular Microbiol. V.5. № 4. P.203-223.

179. Oakley C.J., Murrell J.C. (1991). Cloning of nitrogenase structural genes from the obligate methanotroph Methylococcus capsulatus (Bath). FEMS Microbiol Lett. V. 62. P. 121-125.

180. Otani M., Ueki Т., Kozuka S., Segawa M., Sano K., Inouye S. (2004). Characterization of a Small Heat Shock Protein, Mx Hspl6.6, of Myxococcus xanthus. V. 187, № 15. P. 52365241.

181. Park J.H., Kim S.W., Kim E.B., Ro Y.T., and Kim Y.M. (2001). Stress-shock response of a methylotrophic bacterium Methylovorus sp. strain SSI DSM 11726. The J. Microbiol. V. 39. №3. P. 162-167.

182. Patel R.N., Felix A. (1980). Microbial oxidation of methane and methanol: crystallization of methanol dehydrogenase and properties of holo- and apo-methanol dehydrogenase from Methylomonas methanica. J. Bacteriol. V. 133. №2. P. 41-649.

183. Phucharoen K., Hoshino K., Takenaka Y., and Shinozawa T. (2002). Purification, characterization, and gene sequencing of a catalase from an alkali- and halo-tolerant bacterium, Halomonas sp. SKI. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 66. № 5. P. 955-962.

184. Pol A. Heijmans K., Harhangi H. R., Tedesco D., Jetten M-S. M., Op den Camp H- J. M. (2007). Melhanotrophy below рН 1 by a new Verrucomicrobia species. Nature. V. 450. P. 874-878.

185. Popov V.O., Lamzin V.S. (1994). NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J. V. 301. P. 625-643.

186. Porchia, A. C., Salerno G. L. (1996). Sucrose biosynthesis in a prokaryotic organism: presence of two sucrose-phosphate synthases in Anabaena with remarkable differences compared with the plant enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. V. 93. P. 13600-13604.33

187. Quayle J.R., Ferenci T. (1978) Evolutionary aspects of autotrophy. Microbiol. Rev. V. 42.

188. Reeburgh W.S. (1983). Rates of biogeochemical processes in anoxic sediments. Ann. Rev. Earth. Planet. Sci. V. 11. P. 269-298.

189. Rochat Т., Miyoshi A., Gratadoux J.J., Duwat P., Sourice S., Azevedo V., and Langella P. (2005). High-level resistance to oxidative stress in Lactococcus lactis conferred by Bacillus subtilis catalase KatE. Microbiology. V. 151. №9. P. 3008-3011.

190. Rohlin L., Trent J. D., Salmon K., and Kim U. (2005). Heat shock response of Archaeoglobus fulgidus. J. of Bacteriol. V. 187. №. 17. P. 6046-6057.

191. Rosas A.L., Casadevall A. (1997). Melanization affects susceptibility of Cryptococcus neoformans to heat and cold. FEMS Microbiol Lett. V. 153. P. 265-272.

192. Ruan L., He W., He J., Sun M , Yu Z. (2005). Cloning and expression of mel gene from Bacillus thuringiensis in Escherichia coli. Antonie van Leeuwenhoek. V. 87. P. 283-288.

193. Ruan L., Huang Y., Zhang G., Yu D., Ping S. (2002). Expression of the mel gene from Pseudomonas maltophilia in Bacillus thuringiensis. Letters Appl. Microbiol. V. 34. P. 244248.

194. Schacterle L.B., Pollack R.L. (1973). A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem., V.51. P.654-655.

195. Scholes P.В., Smith L. (1968). The isolation and properties of the cytoplasmic membrane of Micrococcus denilrificans. Biochem. Biophys. Acta. V. 153. P. 350-362.

196. Schwarz A., Nidetzky B. (2006). Asp-196 —> Ala mutant of Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase exhibits altered stereochemical course and kinetic mechanism of glucosyl transfer to and from phosphate. FEBS Letters. V.580. P. 3905-3910.

197. Scott M. D., Meshnick S. R. and Eaton J. W. (1987). Superoxide dismutase-rich bacteria. J. Biol. Chem. V. 262. № 8. P. 3640-3645.

198. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J., Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R., Murrell J.C. and Lidstrom M.E. (1995). Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. J. Bacteriol. V. 177. P. 3071-3079.

199. Shen G-J., Kodama T. and Minoda Y. (1982). Isolation and culture conditions of a thermophilic methane-oxidising bacterium. Agric. Biol. Chem. V. 46. P. 191-197.

200. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. № 2. P. 237-242.

201. Shishkina, V.N., Trotsenko, Y.A. (1979). Pathways of ammonia assimilation in obligate methane utilizers. FEMS Microbiol. Lett. V. 5. P. 187-191.

202. Siegele D. A. (2005). Universal stress proteins in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 187. №18. P. 6253-6254.

203. Sleator R.D., Hill C. (2001). Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiol. Rev. V. 26. P. 49-71.

204. Smith S. A., Tabita F. R. (2003). Positive and negative selection of mutant forms of prokaryotic (cyanobacterial) ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. J. Mol. Biol. V. 331. P. 557-569.

205. Smith T.J., Slade S.E., Burton N.P., Murrell J.C. and Dalton H. (2002). An improved system for protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V. 68. P. 5265-5273.

206. Soares D., Dahlke I., Li W.-T., Sandman K., Hethke C., Thomm M. and Reeve J. N. (1998). Archaeal histone stability, DNA binding, and transcription inhibition above 90°C. Extremophiles. V. 2. P. 75-81.

207. Sokolov A.P., Trotsenko Y.A. (1995). Methane consumption in (hyper) saline habitats of Crimea (Ukraine). FEMS Microbiol. Lett. V. 18(4). P.299-304.

208. Solano F., Garcia E., Perez de Egea E. and Sanchez-Amat A. (1997). Isolation and characterization of strain MMB-1 (CECT 4803), a novel melanogenic marine bacterium. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. №9. P. 3499-3506.

209. Sparnins V., Chapman P. (1976). Catabolism of tyrosine by the homoprotocatechuate pathway in gram-positive bacteria. J. Bacteriol. V. 127, No. 1. P. 362-366.

210. Sparnins V., Dagley S. (1975). Altenative routes of aromatic catabolism in Pseudomonus acidovorans and Pseudomonus putida: gallic acid as a substrate and inhibitor of dioxygenases. J. Bacteriol. V.121. №3. P.1374-1381.

211. Stainthorpe, A.C., Lees, V., Salmond, G.P.C., Dalton, H., and Murrell J.C. (1990). The methane monooxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath). Gene. V. 91. P. 27-34.

212. Stainthorpe, A.C., Murrell, J.C., Salmond, G.P., Dalton, H., and Lees, V. (1989). Molecular analysis of methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath). Arch. Microbiol. V. 152. P. 154-159.

213. Stephen K.C., Hamilton J.H. (1974). Gluconeogenesis by Veilionella parvida M4: evidence for the indirect conversion of pyruvate to P-enolpyruvate. Can. J. Microbiol. V. 20. P. 1928.

214. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., and Lidstrom M.E. (1999) Role of multiple gene copied in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath. Microbiology (UK). V. 145. P.1235-1244.

215. Strauss D.G., Berger U. (1983). Methylosin A und B, pigmente aus Methylosinus trichosporium. Z. Allg. Mikrobiol. V. 23. P. 661-668.

216. Strom Т., Ferenci Т., Quayle J.R. (1974). The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium (OB3b). Biochem. J. V. 144. P. 465-476.

217. Suzina N.E., Chetina E.V., Trotsenko Y.A., and Fikhte B.A. (1985). Peculiarities of the supramolecular organization of intracytoplasmic membranes in methanotrophs. FEMS Microbiol. Lett V. 30. P. 111-114.

218. Tabita F. R. (1988). Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms. Microbiol. Rev. V. 52. P. 155-189.

219. Takeguchi M., Ohashi M., and Okura I. (1999b). Role of iron in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. BioMetals. V.12. P.27-33.

220. Takeguchi M., Yamada Т., Kamachi Т., and Okura I. (1999a). Redox behavior of copper in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. BioMetals. V. 12. P. 27-33.

221. Tate, S., Dalton, H. (1999). A low-molecular-mass protein from Methylococcus capsulatus (Bath) is responsible for the regulation of formaldehyde dehydrogenase activity in vitro. Microbiology. 145. P. 159-167.

222. Tietze F. (1968). Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: application to mammalian blood and other tissues. Anal. Biochem. V. 27. P. 502-522.

223. Trinder P. (1976). Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann. Clin. Biochem. V. 6. P. 24.

224. Trotsenko Y.A., Shishkina V.A. (1990). Studies on phosphate metabolism in obligate methylotrophs. FEMS Microbiol. Rev. V. 87. № 3-4. P. 267-271.

225. Trotsenko y.A., Doronina N.V., Govorukhina N.I. (1986). Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. V.33. P.293-297.

226. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. (2002). Biology of extremophilic and extremotolerantmethanotrophs. Arch. Microbiol. V. 177. P. 123-131.

227. Trotsenko Y.A., Murrell J.C. (2008). Metabolic aspects of aerobic obligate methanotrophy. Adv. Appl. Microbiol. V. 63. P.183-229.

228. Uchiyama H., Shinohara Y., Tomioka N., and Kusakabe I. (1999). Induction and enhancement of stress proteins in a trichloroethylcne-degrading methanotrophic bacterium, Methylocystis sp. M. FEMS Microbiology Letters. V. 170. P. 125-130.

229. Verduyn C., Giuseppin M.L.F., Scheffcrs W., and van Dijken J.P. (1988). Hydrogen peroxide metabolism in yeasts. Appl. Environ. Microbial. V. 54. № 8. P. 2086-2090.

230. Vieille C., Sriprapundh D., Savchenko A., Kang S., Krishnamurthy H., Zeikus J. (2001). Thermostability mechanisms in enzymes from Thermotoga neapolitana and Pyrococcus furiosus. J. Microbiology. V.39. № 4. P. 245-249.291

231. Vorholt J.A. (2002). Cofactor-dependent of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria. Arch. Microbiol. V. 178. P. 39-249.

232. Vossenberg J. L., Ubbink-Kok Т., Elferink M. G., and Konings W. N. (1995). Ion permeability of the cytoplasmic membrane limits the maximum growth temperature of Bacteria and Archaea. Mol. Microbiol. V. 18, P. 925-932.

233. Walsh D.A., Cooper R.H., Denton R.M., Bridges B.J., and Randle P.S. (1976). Elementary reactions of the pig heart pyruvate dehydrogenase complex. Biochem. J. V.157. P. 41-67.

234. Wang G., Aazaz A., Peng Z., and Shen P. (2000). Cloning and overexpression of a tyrosinase gene me/from Pseudomonas maltopliila. FEMS Microbiol. Lett. V. 185, P. 23-27.

235. Bath) PLoS Biology. V. 2. P. 1616-1628.

236. Watanabe K., Shima M., Oshima Т., and Nishimura S. (1976). Heat-induced stability of tRNA from an extreme thermophile, Thermus thermophilus. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 72, P. 1137-1144.

237. Whittenbury R., Kelly D.P. (1977). Autotrophy: a conceptual phoenix. Symp. Soc. Gen. Microbiol. V. 27. P. 121-149.

238. Whittenbury R., Phillips K.C., and Wilkinson J.F. (1970). Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J. Gen. Microbiol. V. 61. P. 205-218.

239. Wood W.A. (1971). Assay of enzymes representative of metabolic pathways. Methods Microbiol. V. 6A. P.421.

240. Woodland M.P., Gammack R. (1985). Microbial Gas Metabolism. Eds Poole R.K., Dow C.S. Academic Press. London.303

241. Zahn J. A., Arciero D.M., Hooper A. B. Coats J. R., and Dispirito A. A. (1997). Cytochrome с peroxidase from Methylococcus capsulatus Bath. Arh. Microbiol. V. 168. P. 362-372.306

242. Zahn J.A., Bergman D.J., Kunz J.M., and DiSpirito A.A. (2001). Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 183. P. 832-6840.

243. Zhang M., Lidstrom M.E. (2003). Promoters and transcripts for genes involved in methanol oxidation in Methylobacterium extorquens AMI. Microbiology. V. 149. P. 1033-1040.

244. Zughaier, S.M., Ryley, H.C., and Jackson, S.K. (1999). A melanin pigment purified from an epidemic strain of Burkholderia cepacia attenuates monocyte respiratory burst activity by scavenging superoxide anion. Infect Immun. V. 67. P. 908-913.

Информация о работе

Медведкова, Ксения Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы