Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аэробные метанотрофные бактерии экстремальных экосистем

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аэробные метанотрофные бактерии экстремальных экосистем"

На правах рукописи

ХМЕЛЕНИНА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

АЭРОБНЫЕ МЕ'ГАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЭКОСИСТЕМ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУ ЩИНО-2006

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов

Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К Скрябина РАН

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор ЮЛ. Троценко

Официальные оппоненты:

академик РАН,

доктор биологических наук,

профессор Г.А. Заварзин

доктор биологических наук, профессор Л.А. Головлева

доктор биологических наук, профессор Я.И. Бурьянов

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 13 апреля 2006 г. в 14 час 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01

в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина РАН

Автореферат разослан «(( » марта 2006 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Области с экстремальными физико-химическими условиями занимают значительную часть поверхности Земли и населены адаптированными к этим условиям микробными сообществами. Микроорганизмы, способные к существованию при повышенных или пониженных значениях рН, солености или температуры, в том числе в биотопах, где отсутствуют высшие формы жизни, приобрели или сохранили в процессе эволюции специфические структурно-функциональные и физиолого-биохимические свойства. Эти экстремофильные и экстремотолерантные микроорганизмы представляют ингерес как модели для изучения механизмов адаптации, способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов, и могут служить источниками получения биопротекторов, биостимуляторов, стабильных ферментов, ценными объектами для создания новых биотехнологий (Ventosa et al., 1998; Horikoshi, 1999).

Метан - наиболее распространенный на Земле ор1аничсский газ наивысшей степени восстановленное™, активно влияет на климат нашей планеты. Высокие скорости ежегодного прироста содержания метана в атмосфере (1%), привлекли внимание исследователей к факторам, регулирующим процессы его глобальной эмиссии. Важной особенностью поступающего в атмосферу метана является его преимущественно биологическое происхождение. Образование метана и его потребление осуществляют две специфические группы прокариот: анаэробные метаногенные археи и аэробные метанокисляющие метанотрофы, объединенные в метановый цикл или цикл Зенгена (Заварзин, 1979,1984). Аэробные метанотрофы широко распространены в почвенных и пресноводных экосистемах, и, обладая способностью синтезировать все клеточные компоненты из Ci-соединений, являются основой бактериальных фильтров, потребляющих до 80% образующегося метана (King, 1990; Hanson, Hanson 1996; Гальченко, 2001) Наличие у метанотрофов уникального фермента, метанмонооксигеназы (ММО), обусловливает их способность окислять наряду с СН4 широкий спектр алифатических и ароматических соединений и, следовательно, участие в биоремедиации окружающей среды (Dalton, 2005).

До недавнего времени большинсзво поддерживаемых в мировых коллекциях культур метанотрофов были выделены из пресных водоемов и почв и предъявлены мезофильными, нейтрофильными и негалофильными штаммами (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Целенаправленный поиск и изучение метанотрофов, адаптированных к условиям экстремальных биотопов, весьма актуальны, поскольку способствуют выяснению роли этих бактерий в различных природных эконишах и определяют возможность их интродукции в открытые экосистемы. Возрастающий интерес к экстремофильным метанотрофам обусловлен также перспективами их использования в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов адаптации и имеет целью более глубокое понимание особенностей биологии этой специализированной группы бактерий.

Состояние вопроса

Первые сведения о метанотрофах, способных к существованию в биотопах с высокими значениями температуры или солености, ограничивались описанием термофильных и термотолерантных метанотрофов, развивающихся при температуре до 55°С (Foster, Davis, 1966; Малашенко с соавт, 1975; 1978), а также морских метанотрофов, толерантных к 3% NaCl (Lidstrom, 1988). Сообщения о выделении метанотрофов из гиперсоленых озер не сопровождались описанием чистых культур (Малашенко с соавт., 1993, 1995) Структурно-функциональные особенности метанотрофов, обеспечивающие их выживание в биотопах с селективным давлением повышенных или пониженных значений температуры, солености и pH, практически не исследовались.

По совокупности цитологических, физиолого-биохимических и таксономических характеристик метанотрофные бактерии разделены на два основных типа (I и II), которые принадлежат к а- и у-подклассам Proteobacteria, соответственно. На основании классических исследований нескольких видов метанотрофов группой Дж. Р. Квейла (Англия) были открыты рибулозомонофосфатный (РМФ) и сериновый пути как основные механизмы ассимиляции Сг соединений у метанотрофов I и П типов, соответственно. В дальнейшем, у представителей рода Methylococcus, отнесенных к промежуточному 'X' типу метанотрофов (у-подкласс Proteobacteria), был выявлен минорный рибулозобисфосфатный (РБФ) путь фиксации С02 как дополнительный к сериновому и рибулозомонофосфатному циклам ассимиляции углерода. Значительный прогресс в исследованиях метанотрофии, достигнутый в последние два десятилетия, отражен в монографиях и обзорах (Малашенко с соавт., 1993; Anthony, 1991; Гальченко с соавт., 1986; Романовская с соавт, 1991; Murrell, Dalton, 1992; Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Dalton, 2005) и трудах специализированных Ci-симпозиумов. Ко времени начала целенаправленных поисков метанотрофов, адаптированных к существованию при температуре >55°С, солености > 3% NaCl, pH > 9 или <5, перечень узаконенных таксонов насчитывал 8 родов (Bowman et al., 1993,1995).

Было показано, что круговорот углерода в соленых и содовых водоемах включает все необходимые звенья - от фиксации углекислоты до образования метана, одного из основных конечных продуктов разложения органического материала в анаэробной зоне (Заварзин, 1993; Zhilina, Zavarzin, 1994; Заварзин и др., 1996, 1999; Сорокин и др., 1996, Ventosa, 1998; Joye et al, 1999). Тем не менее, экспериментальные данные о дальнейших путях стока СЦ либо отсутствовали, либо были крайне противоречивыми. Возможность окисления метана и наличия метанотрофов в соленых экосистемах казалась сомнительной из-за низкой растворимости СН4 (Conrad et al., 1995)

В последнее десятилетие несколькими группами исследователей предпринимаются активные попытки выделения и изучения термофильных и термотолерантных метанотрофов, но их таксономическое разнообразие ограничивается тремя родами: Methylococcus, Methylocaldum и 'Methylotermus'. Наиболее детально изучен Methylococcus capsulatum, который является одним из основных объектов молекулярно-генетических исследований. Метанотрофы рода Methylocaldum по физиологическим свойствам близки видам Methylococcus, но несколько различаются по последовательности 16S rDNA (Bodrossy et al, 1995, 1997). Их свойства описаны

2

весьма поверхностно, а механизмы термоадаптации не изучались Род 'Methylotermus' практически не изучен, а единственный изолят 'НВ' утерян (Bodrossy et al., 1999). Нестабильность роста и частая потеря коллекционных культур метанотрофов, растущих при повышенных температурах, является следствием недостаточной изученности их физиолого-биохимических особенностей.

Присутствие метанотрофов в различных холодных экосистемах было впервые показано В.Ф. Гальченко радиоизотопным и иммунофлуоресцентным методами, а также подтверждено анализом специфических маркеров в составе экстрагированных из природных образцов тральной ДНК и фосфолипидов (Vecherskaya et а!., ¡993; Гальченко, 1994; Sundh et al., 1995) Системные исследования метанотрофов психросферы под руководством акад ГА Заварзина привели к выделению из тундровой почвы первого психрофилыюго метанотрофа Melhylobacter psychrophilus (Омельченко, 1993, 1996). Психроактивные ацидофильные метанотрофы выделены из почв тундры и кислых таежных болот (Dedysh et al., 1998,2000,2003)

Метан присутствует в многолетнемерзлых породах, а также в анаэробных грунтовых водах гранитных пород, где в основном имеет геохимическое происхождение, а также является результатом биохимической активности метаногенов (Gilichinsky, 2001; Sherwood et al, 1993, Pedersen, 1997). Повышающаяся с глубиной радиация может приводить к появлению молекулярного кислорода вследствие радиолиза воды, создавая, таким образом, условия для развития аэробных метанотрофов Хотя присутствие и роль метанотрофов в подомных микробных сообществах практически не изучались, тем не менее, эти экстремальные экосистемы следует рассматривать как потенциальный ресурс новых метанотрофных бактерий. Поскольку условия экстремальных биотопов способствуют максимальному проявлению метаболического потенциала экстремофильных метанотрофов, изучение особенностей их биологии имеет важное научно-практическое значение.

Цель и задачи исследований

Цель данной работы - поиск и выявление особенностей биологии аэробных метанотрофных бактерий различных экстремальных экосистем.

Для достижения этой цели решали следующие основные задачи:

1. Оценить потенциальную активность потребления метана аэробными метанотрофными сообществами различных экстремальных экосистем.

2. Выделить чистые культуры доминирующих метанотрофных бактерий из соленых и содовых озер, термальных источников, грунтовых вод глубинных залежей гранитов.

3. Идентифицировать метаногрофные изоляты из различных экстремальных биотопов с привлечением подходов полифазной таксономии.

4. Исследовать основные цитологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности зкетремофильных/толерантных метанотрофов, обуславливающие их адаптацию к соответствующим биотопам.

5. Изучить основные механизмы осмоадаптации у галофильных и галотолерантных метанотрофов

6. Сформировать коллекцию чистых культур зкетремофильных/толерантных метанотрофов.

Научная новизна

Впервые из экстремальных экоситем различных географических регионе» мира выделены и детально охарактеризованы умеренно галофильные, алкалофильные, термофильные и психроактивные метанотрофы. Выделенные из содовых и соленых озер Центральной и Юго-Восточной Азии, Америки и Африки галофильные и алкалофильные метанотрофы классифицированы как новые виды родов Methylomicrobium (Mm aicaliphttum, Mm buryatense, Mm. modestohalophihim) и Melhylocystis (Mes gottschalki). Из термального источника Японии выделен в чистую культуру и классифицирован как новый род и вид умеренно термофильных галотолерантных метанотрофов Methylolhermus thermalis, образующий вместе с галофильным мезофильным метанотрофом Methylohalobius cremeensis филогенетически обособленную ветвь в подклассе Gammaproteobacteria Выявлены галотолерантность и факторы, регулирующие полиморфизм умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum. Из подземных вод глубинных залежей гранитов Финно-Скандинавского шельфа выделены штаммы психроактивных метанотрофов, представляющие новый вид Methylomonas scandinavica.

В многолетнемерзлых породах найдены гены, специфичные для практически всех известных родов метанотрофных бактерий, включая мезофильные, психрофильные/психротрофные и термотолерантные формы. Показано, что метанотрофы даже после длительного пребывания в мерзлоте (от 1 тыс до 1.8-3 млн лет) способны окислять и ассимилировать метан, в том числе при отрицательной температуре, поэтому могут быть активными в вечномерзлых экосистемах.

Расшифрованы механизмы осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов: аккумуляция органических осмопротекторов (эктоина, глутамата, сахарозы) и ионов калия в клетках, накопление фосфатидилглицерина и фосфатидилхолина в составе мембран, формирование гликопротеиновых S-слоев р2 или рб симметрии. Выявлен новый тип трехмерной организации S-слоев у метанотрофов.

У галотолерантных и галофильных метанотрофов впервые определены пути биосинтеза органических осмопротекторов, нуклеотидные последовательности и организация генов биосинтеза эктоина, проведен их филогенетический анализ. Обнаружена связь наличия гена аспартокиназы (ask) в кластере ect-генов с повышенной солеустойчивостью метанотрофов и особенностями центрального метаболизма. Впервые клонирована, очищена и охарактеризована диаминобутират-ацетшггрансфераза, катализирующая одну из ключевых стадий биосинтеза эктоина, выявлена регуляция синтеза эктоина на уровне активности данного фермента.

Практическая значимость

Создана коллекция детально охарактеризованных экстремофильных/толерантных метанотрофов, которая служит базой референтных штаммов при идентификации новых изолятов, а также при проведении сравнительных физиолого-биохимических исследований. Способность галофильных метанотрофов накапливать циклическую иминокислоту эктоин (до 15% веса сухой биомассы) может быть использована для получения данного биопротектора, применяемого в медицине, косметике и научной практике. Проведенная расшифровка нуклеотидных последовательностей генов и

организации структуры эктоинового оперона создала реальные предпосылки получения эктоина путем целенаправленного генно-инженерного конструирования новых эффективных штаммов-продуцентов на основе непищевого сырья - метана и метанола. Полученные сведения о механизмах регуляции ферментов пути биосинтеза эктоина у галофильных метанотрофов способствуют подбору оптимальных условий их культивирования с целью увеличения выхода этого универсального биопротектора. Обнаруженная нами способность галотолерантных метанотрофов синтезировать экзополисахариды из метана или метанола может найти практическое применение Полученная научно-методическая информация об особенностях биологии экстремофильных/толерантных метанотрофов используется в курсе лекций для магистрантов и аепиранюв Путинского госуниверситета. Апробация результатов

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции памяти акад. E.H. Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996, 2005), международных симпозиумах "Microbial Growth on Ci Compounds" (Геттингсн, 1989; Уорик, 1992; Сан-Диего, 1995), Гордоновских научных конференциях "Молекулярные основы микробного Ci метаболизма" (Нью Хемпшир, 1998; Коннектикут колледж, 2002. Маунт Холиок колтедж, 2004, CIIH), международном INTAS симпозиуме (Москва, 1997), международных конференциях "MICROBIAL RESPONSE ТО STRESS- what's new and how can it be applied''", Сесичбра, Португалия, 1997 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 статьи и 6 обзоров. Благодарности. Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН, принимавшим участие в данной работе: с.н.с. лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН к.б.н. Сузиной Н.Е. за помощь в исследованиях ультраструктуры экстремофильных метанотрофов, с.н.с. к.х.н. Сахаровскому В.Г. за идентификацию осмопротекторов методами ,3С- и 'Н-ЯМР спектроскопии, к.б.н. Калюжной М.Г., м.н.с. Решетникову A.C., м.н.с. Ешинимаеву Б.Ц, а также аспирантам Медведковой К.А., Цыренжаповой И.С., Мустахимову И.И., магистрантам Смирновой К.В. и Рыжмановой Я.В. Их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях. Автор признателен сотрудникам Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАИ дб.н. Жилиной Т Н. и д.б н. Горленко В.М. за любезно предоставленные пробы ила содовых озер, д.б.н. Дедыш С.Н. и д.б.н. Васильевой Л.В за плодотворное сотрудничество в изучении ацидофильных и психрофильных метанотрофов, а также к.б.н. Лысенко A.M. за определение ГЦ состава ДНК. Автор выражает благодарность д.б.н. Осипову Г.А. (академическая группа РАМН, Москва) за анализ жирнокислотного состава клеток метанотрофных бактерий.

Особую благодарность автор выражает д.б.н., профессору Ю.А. Троценко - инициатору этой работы и научному консультанту, а также профессору Г Готгшалку (Гетгингенский университет, Германия) за внимание и поддержку данных исследований в рамках программы INTAS.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, изложена на 214 страницах, включая 37 таблиц, 25 рисунков и списка цитируемой литературы из 426 наименований, из них 85 на русском и 341 на аш лийском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы асследованвя

Пробы ила из содовых водоемов Тувы были предоставлены д б.н. Т.Н. Жилиной (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН), пробы ила и воды из щелочных озер Южного Забайкалья, Монголии, Египта и США - д б.н, проф В.М. Горленко (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН), пробы ила термальных источников Японии - J. Tsubota (Research and Development Department Osaka Gas Co, Осака, Япония), образцы почв Северной тайги и Субарктической тундры и многолетнемерзлых пород Северо-Восточной Сибири - д.гм.н Д.А. Гиличинским и к б.н Е.М Ривкиной (Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино) Культуры ацидофильных метаиотрофов предоставлены д.б.н С Н. Дедыш, Methylobacler psychrophilus 21Z - д б н. Л.В. Васильевой, Methylomicrobium sp. AMOI - д.б.н Д.Ю. Сорокиным (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН). Для сравнительных экспериментов использовали штаммы облигатных метанотрофов из коллекции ВКМ ИБФМ РАН.

Потенциальную активность потребления метана образцами ила и воды из содовых озер оценивали по скорости окисления 14СН4 до |4С02 и по включению радиоуглерода в кислотоустойчивые продукты, последнее служило индикатором ассимиляцинных процессов (Sokolov, Trotsenko, 1995).

Основной подход при выделении накопительных и чистых культур метанотрофных бактерий, наиболее адаптированных к условиям биотопов, заключался в использовании сред и параметров культивирования, которые максимально соответствовали условиям in iitu.

Идентификацию выделенных метанотрофов осуществляли известными методами полифазной таксономии, включая световую и электронную микроскопию, анализ жирных кислот, фосфолипидов, хинонов, определение путей первичного и центрального метаболизма, содержания Г+Ц в ДНК, ДНК-ДНК гибридизацию, ПЦР-амплификацию и секвенирование 16S рДНК, а также генов, кодирующих специфические для метанотрофов ферменты мембранную и растворимую ММО - ртоА и ттоХ, метанолдегидрогеназу (МДГ) - mxaF.

Для экстракции ДНК из природных образцов и чистых культур использовали модификацию стандартного метода (Lee, 1996). Анализ полученных нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей, а также построение филогенетических дендрограмм проводили с применением стандартных компьютерных программ CLUSTAL X software program (vi.62b) (Thompson et al., 1997), BLAST program (Altschul et al„ 1990), Treecon (версия 1 3b) (Van de Peer & De Wächter, 1994), Lasergen program (DNASTAR, Ltd, London, UK).

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 1. ГАЛОФИЛЬИЫЕ И АЛКАЛОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФЫ

1.1. Выделение накопительных и чистых культур галофильиых и алкалофильных иетанотрофов. К началу данной работы сведения о метанотрофах, способных к существованию в биотопах с повышенными значениями солености, ограничивались описанием морских метанотрофов, толерантных к 3% NaCl (Sieburth et al., 1987; Lidstrom, 1988) Выделенные из гиперсоленых водоемов метанотрофы не были получены в чистых культурах (Малашенко с соавт., 1993,1995), а высокощелочные содовые озера как места обитания метанотрофных бактерий, не исследовались. Впервые процессы потребления метана удалось выявить в донных осадках и воде гиперсоленых озер Крыма с применением радиоизотопного метода (Sokolov, Trotsenko, 1995) Это, наряду с измеренной нами активностью потребления "Сметана в воде и осадках содовых озер разных географических регионов России и Монголии, служило первым указанием на присутствие метанотрофов в нейтральных и высокощелочных водоемах с различной степенью минерализации [4,14,24]. Активность процесса потребления метана образцами ила содовых озер оказалась на порядок выше, чем в пробах из нейтральных гиперсоленых озер Крыма.

Как правило, природные метанотрофные сообщества экстремальных экосистем состояли из тесно связанных ассоциаций гетеротрофных и метанотрофных бактерий, попытки их разделения приводили к потере метанотрофного компонента. Это, по-видимому, связано с зависимостью метанотрофов от выделяемых гетеротрофами ростовых факторов, синтез de novo которых у метанотрофов мог быть репрессирован. Поэтому потребовалась разработка специальных приемов для их выделения. Для обогащения накопительных культур метанотрофами на первых этапах выделения в среды добавляли стерильный фильтрат культуральной жидкости накопительной культуры или спутника, а также отделяли относительно крупные и тяжелые клетки метанотрофов от, как правило, более мелких гетеротрофных спутников асептическим фильтрованием или центрифугированием. Внесение в среды ингибитора роста эукариот - циклогексимида (20 мкг/мл), было необходимым условием для успешного выделения солезависимых метанотрофов, служащих источником питания для Protozoa (Lidstrom, 1988). В совокупности с методом серийных разведений эти приемы в итоге привели к выделению чистых культур и созданию первой коллекции галофильных и галоалкалофильных метанотрофов.

Из соленых и содовых озер Крыма, Центральной и Юго-Восточной Азии и Африки выделены 17 штаммов метанотрофов. По данным фено- и генотипического анализа штаммы классифицированы как 3 новых вида рода Methylomicrobium Mm alcaliphilum, Mm buryatense и Mm modestohalophihm [8,9,16] (табл. 1, рис. 1). Кроме того, к известным таксонам метанотрофов отнесены выделенные из соленых озер Кулундинской степи с нейтральными значениями рН Methylohacter marinus 1С (99% сходства последовательности генов 16S рРНК с типовым штаммом этою вида) и накопительная культура Methylohalobius crimeensis Алкалотолерантный метанотроф II морфотипа, выделенный из

Таблица 1. Некоторые ростовые хараюеристики галофильных и галотолерантн ых метанотрофов, выделенных из соленых и щелочных озер

Параметры озер Тип Ростовые характеристики

Штамм ВЦМ*

Озеро, регион рн Общая Диапазон (оптимум)

мвнералн-

зацня, г/л tonr'C рн NaCl,%

Methylomicrobium aicoliphilum

5Z Хадын, Тува 9.5 13 I 30 7.2-9.5(9) 0.2-10

0)

20Z Шара-Нур, Тува 9.5 30 I 30 7.2-10(9.5) 0.2-

10(3)

FM3 Хотонтын, 9.7-10.3 360 I 8-30 6.8-10.5 0-6(1,3)

Монголия (8.6)

ЕЗ Фазда, Египет 9.7 250 I 8-37 6.8-10.5 0-9 (0.8)

(9.0)

МЫ Моно Лэйк, США 9.5 80 I 8-30 6.8-10.3 0-7(1)

(9.0)

1S Кулундинское, 9.3-9.6 20-46 i 26 (9.5) 0-8(3)

Кулундинская

степь, Россия

2S -«- 9.9 30-82 i 26 (9.5) 0-8 (3)

4S 9.1-9.3 108-150 I 26 (9.5) 0-8 (3)

4SI -«- 9.1-9.3 108-150 1 26 (9.5) 0-8(3)

5S -«- 9.3-9.5 100-118 i 26 (9.5) 0-8(3)

Methylocystis goííschalki

ВЗ Малое Гужирное, 10.0 40 п 8-30 6.0-9.5(7.5) 0-1.0

Бурятия, Россия (0.2)

Methylomicrobium buryaíense

4G Хилганта, Южное 9.6 41.6 i 30 6.8-10.5 0-4(1)

Забайкалье (9.0)

5G Нижний Мукей, 9.5 8 I 30 6.8-10 (8.0) 0-5(1)

Южное Забайкалье

6G Барун Торей, 9.2 9.9 i 30 6.8-11 (9.0) 0-4(1)

Южное Забайкалье

7G Цайдам, Южное 10 15.8 i 26 6.8-11(9.0) 0-5(1)

Забайкалье

5b Горбунка, Южное 9.5 i 30 6.8-9.5 (9.5) 0-5 (0.8)

Забайкалье

3S Петуховское, 9.9 54 i 26 6.8-9.5 (9.5) 0-8 (3)

Кулундинская

степь, Россия

Methylohalobius crimeensis

3C** Кулундинское, 7.8-8.2 226-283 i 29 (7.5) до 8

Кулундинская

степь, Россия

Methylobacter marínus

1С Бурлинское, 7.45 360 i 29 6.8-9(7.5) 1-4(2)

Кулундинская

степь, Россия

Methylomicrobium modestohalophilum

IOS Сысык-Сиваш, 7 140 i 26 5.5-8.5(6.5) 1-4(2)

Крым, Украина

* ВЦМ - внутрищлоплазматические мембраны

■ Bacillus tubtiUa ATCC 6051' ' Mtfhyfocapw acldfpMa7

■ Mathylocella paluatris' • Mathylocella sUvntrto1

100

100 l-l Mathylocella tundra*'

i Methylocyetia gottscftalkl B5

-1 W— Mathylocyatls ectiinoidas7

H Utthylocyatia parvus' [j5^M»tfiyiiw/nitt sporlum'

Methytoilnus tnchoipartum' Methylohakiblus crim—nslt W^jjlathylothamus thermalls7 Methyfothermus sp.HB Mathylococcus capsulatut BathT JMhytocaldum gmclle1 Methylocaldum taptdum' -^Methylocaldum xzagediense1 Methylocaldum siegetttense 0-12 Mathyiococcus thermophHus1 Mathylosphaara hamonli

ft

100

48

, ■ Mathykxnonaa rubra 1КЮ

' Methylomonaa scandtnavlca ■ Methyfomonas mathanlca' 1Mathylomonaa auranttaca*

Поо

' Methylomonat fodlnarum ¡— Methylobacter psychrophllusT \%jrniylobacter bowl' Methylobacter vinetandlf r^Methylobacter Ititaua'

Mathylobactor whlttenburyl1 r^^Methylomlcroblum agller Methylomicmblum album1

C-Methyloaarelna quisqulllarum1 • Methylosarclna tlbrata* •Methylomicrobium buryat&nse'

Methylomicmblum «p. Amol luV Methylomicmblum pelaglcumT I 6r— 'Methylomicmblum alcallphllum 5Z' \^fc^Methylomicrx>blum modestohalophllum 10S' Methylomicmblum »p. №

Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показывающий филогенетическое положение экстремофильньп/толераитных метанотрофов среди других типовых таксонов метанотрофов Alfa- ■ Салют-подклассов Proteobacleria.

,0.05,

5в ьмз

Мейту1от1сгоЫит а1саИрМ1ит 202

- МеЛу1откгоЫит акаИркИит 52 481

Ь ЕЗ гМ1Л

- Ме1ку!от1сгоЫит тодеШоЬа1орЫ1ит Юв Мейту1откгоЫит ip.NI , Зв

1— Ме1Иу1от1сгоЫит Ьигушеп$е 5В

- Ме1ку1откгоЫит хр.АМ01

— МеЛуЬткгоЫит ре1цекитТ

— Ме1Ьу1оггасгоЫит а$>йе

— МеЛуЬт^сгоЫит а!Ьит'

— Ме1Иу!оЬас(ег \uteu?

— МеАу1оЬааег ч/ЫНепЬигу? МеЛуЬЬаМег ут^1апс1НТ

7С

■ Ме(Ну1оЬас1ег Ьочгз

ч:

Ме1ку1оЬас1ег 5/?. ВВ5.1 Ме1ку1оЬаШг тагтшТ

-Ме1ку1оЪалег рвускгорЫ1м

I-Ме^отопса трИатсаТ

-МеЖуЬтопаз гиЬга

— МеЛуЬярИаега Нажот? ■ Ме1Иу1осаШит зге$е<Иете1

—\iethylococcus саряиШиз Ва&

-Ме!Иу1оИа!оЫш сптеега^

-Ме1ку1оЛегти5 ЛегтаПв МУНТ

-МеЛуШкегтш даНВ

I— Ме1ку1о5тш (псЬохропит '— МегИукзтш зропит1 -ВЗ

-Ме^уЬсуяНя рагуия

-МаЬгу1осувЛв есЫпогскй1

Рас. 2. Дендрограмма, построенная на основании сравнения транслированной аминокислотной последовательности гена ртоА нюлятов гало- и алкалофнльиых и других физиологических групп метанотрофных бактерий.

содового озера Бурятии, условно классифицирован как новый вид метанотрофсв 'МеЛу1осуИи %оШсЪсйЬ' (табл. 1 и 3). С использованием праймеров /)/иоА18917682г из ДНК всех штаммов бьш амплифицирован фрагмент гена, кодирующего каталитическую субъединицу мембранной ММО. Филогения ртоА гена галоалкалофильных метанотрофов соответствует филогении гена, кодирующего 168 рРНК (рис. 1,2).

1.2. Физнолого-биохимические свойства

По отношению к солености и щелочности среды изоляты разделены на 5 групп: умеренно галофильные нейтрофильные (Methylomicrobium modestohalophilum IOS, Methylobacter marinus 7C), умеренно галофильные алкалотолеракгные (Methylomicrobium buryatense 5G, 7G), галофильные алкалофильные (Methylomicrobium alcahphilum 5Z, 20Z, 1S, 2S, 4S, 4S1, 5S), галотолерантные факультативно алкалофильные (Methylomicrobium buryatense 4G, 6G, 6G, 5B, 3S) и алкалотолеракгные ('Methylocystis gottschalki' ЗВ). За исключением 'Methylocystis gottschalki', выделенные из содовых озер культуры способны расти при солености до 6-12% NaCI и этим отличаются от ранее описанных морских метанотрофов (Sieburth et al., 1987; Lidstrom, 1988).

Таблица 2. Кинетические параметры метан-зависимого потребления кислорода у штаммов Мт. ЬигуШеме, выращенных при различных значениях рН (V, нмоль мин'1 мг1 белка)

рН Штамм 4G Штамм 5G Штамм 6G Штамм 7G

среды

К,х10"7М V * тая К,х10'7М Ушах К,х10"7м Vjnax К„хЮ'7М V ' шах

7.2 9.6 111.2 24 9 90.0 22.7 81.7 21.3 47.3

9.5 9.8 184.6 25.3 119.4 19.3 137.3 20.9 89.8

В щелочных озерах, различающихся гидрохимическими условиями, присутствуют штаммы одного вида с достаточно различимыми фенотипическими свойствами, что указывает на длительную эволюцию локального метанотрофного сообщества. Так, выделенные из слабоминерализованных содовых озер Бурятии (общая минерализация 8-16 г/л) различные штаммы вида Мт Ъшуслепы имели относительно высокое сродство к метану (1^=2.9 мкМ), которое было выше (К,=0 9) у штамма 40, изолированного из озера Хилганта с относительно высокой общей минерализацией (46.6 г/л), что может свидетельствовать об адаптации метанотрофов на уровне ММО к условиям низкой растворимости метана в соленой среде [9,10] (табл. 2).

Рис. 3. Зависимость скорости роста Мт. modestohalophilum IOS от солености среды: а) без добавления супернатанта; б) с добавлением стерильного супернатанта культуральной жидкости гетеротрофного

_i

спутника (20% по объему).

NaCI, %

Таблица 3. Основные свойства гшюадкалофвдывп непшотрофов

Свойства Afethylo- Methylo- Methylomicrobmm Methylobacter Methyiohalobvus Methyto- Methylo- 'Metkylocystis

microbium microbium modestohalophiïum marinus А45 crimeensis microbium microbium gottschaUd'

buryatense alcaliphilum IOS haùenseAMOl sp. N1

(Kalyuzhnaya (Khmelenina et (Калюжная с соавт. (Lidstiom, (Неуег et al. (Socokinetal., (Fuse et al., (Ешинимаев с

et al., 2001) aL,1997) 1998) 1988) 2005) 2000) 1998) ооавт., 2006)

Морфология Палочки Палочки Палочки Палочки Кокки Овоиды Папочки Копи

Размер клеток (мхм) 1-1.3x2.0-3.0 1.2-13*2.0-3.0 0.9-1.2x1.8-2.8 0.6-1.2x2.1-3 0.8-13x1.6-3.2 1-2x2-4 0.8-1.2x2.1-3 0.5-1x10x1.5

Подвижность + + + + + + (1-3) + -

(количество жгутиков)

Пигмент Белый Кремовый Кремовый Коричневый Кремовый Кремовый Кремовый Белый

Тип ВЦМ I I I I I I I п

Э-слои рб рб или p2 н.о. h.o. рб н.о. -

Растворима» ММО -/+ - - - - - +/- -

Мембранная ММО + + + + + + + +

Путь О-ассимиллцин РМФ РМФ РМФ РМФ, РМФ РМФ РМФ сериновый

сериновый

Диапазон рН (оптимум) 6.8-10.5(93) 7.2-9.5(9.0) 5.5-8.5 (6.5) 5.5-9.0 (7.2) 6.5-7.5 9.0-10.2 (9-10) н.о. 6.5-9.0 (8.0)

Диапазон ЫаС1, % 0-5 0.2 -10 0.2-9 0.05-3 1.2-15 0.2-4 н.о. 0-1.0

Оптимум ЫаС1, % 0.75 1-3 2 0,8 6-9 0.2 h.o. 0.2

Диапазон °С (оттшум) 8-37 (30) 7 - 37(30) 15-37(25) (37) 15 - 42(30) 15-37(28) и.о. 8-37 (26)

Устойчивость к + + и.о. + + + н.о. и.о.

нагреванию Устойчивость к + + h.o. + + + н.о. н.о.

высушиванию

Жирные кислоты Скл 21 56.6 43.7 8.4 22-23 и.о. h.o. 1.0

Сад 66 40 25.5 78.3 14-20 h.o. и.о. 3.0

5 52-61 н.о. н.о 94.5

Кардиолипин + + + н.о. + h.o. и.о. и.о.

Фосфатидклхолин - - - н.о. - h.o. h.o. h.o.

Основной хинон Q-8 Q-8 Q-8 Q-8 Q-8 н.о. н.о. h.o.

Г + Ц, то! % 51.5 47.9 46.2 54-55 58.7 50.3 н.о. 60.5

Источник Содовые Содовые Лиман Морская Соленое Озеро Магади Морская Содовое

озера озера вода озеро вода озеро

Как правило, максимальные и оптимальные значения солености для роста у изолированных культур не соответствовали гидрохимическим условиям озер (табл. 1). Так, у Мт. то^юЬа!орЬиит 1 Ой оптимальное значение солености для роста (1.5% 1%С1) и максимальная концентрация соли, при которой возможен рост (4% №01), существенно ниже, чем соленость воды в озере Сасык-Сиваш (14% N801). Добавление стерильного супернатанта гетеротрофного спутника, изолированного из накопительной культуры, повышало скорость роста метанотрофа, оптимальное значение солености и верхнюю границу галотолерантности (рис. 3). Аминокислотный анализ супернатанта гетеротрофного спутника выявил присутствие глутамата, пролина и эктоина, известных как осмопротекторы ряда бактерий. Следовательно, в экосистемах с повышенным содержанием ЫаС1 солеустойчивос1ь метанотрофов зависит от метаболитов, поставляемых другими компонентами микробных сообществ

19].

и. Особенности метаболизма солезавнснмых метанотрофов

Проведенный скрининг показал, что присутствие растворимой формы ММО, наряду с мембранной ММО, является штаммовым свойством галоалкалофильных метанотрофов. Только Мт. ЬигуШете 50 способен к окислению нафталина до нафтола и имеет ген, кодирующий эММО, что подтверждено ПЦР с использованием праймера ттоХХИ.

Пути первичного и промежуточного метаболизма изолятов соленых и щелочных озер достаточно типичны для метанотрофов I или II морфотипов. Галоалкалофильные штаммы окисляют метан до СОг с участием дегидрогеназ метанола, формальдегида и формиата. Шгаммы, отнесенные к родам Ме(Ну1ат1сгоЫит и Ме{ку1оЬас1ег, ассимилируют углерод метана на уровне окисленности формальдегида через РМФ-цикл, о чем свидетельствует присутствие ключевого фермента этого пути - гексулозофосфатсинтаы [5]. По аналогии с известными метанотрофами, у них функционируют два пути распада фосфосахаров: через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконаталвдолазу и фруктозобисфосфатальдолазу (рис. 4), при этом в гликолитической последовательности участвует пирофосфат- (но не АТФ) зависимая 6-фосфофруктокиназа Цикл Кребса разомкнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназа проявляет активность только с НАДФ*. Ферменты глиоксилатного шунта (изоцитратлиаза и мапатсинтаза) отсутствуют. Ассимилируют аммоний посредством восстановительного аминирования а-кетоглугарата и пирувата, а также через глутаматный цикл (ГС/ГОГАТ).

За исключением 1Ме1Ну1осуШ$ %оШсЪсйЫ' ВЗ, все изоляты содовых и соленых озер реализуют энергетически наиболее эффективный РМФ-цикл Сгассимиляции. Преобладание метаиотрофов I типа с РМФ-путем, в этих экосистемах, очевидно, является закономерным результатом селективного давления высокой солености и/или щелочности, поскольку существование в этих условиях связано с дополнительными энергетическими затратами на биосинтез осмопротекторов и поддержание ионного внутриклеточного гомеостаза.

Поскольку использованные нами условия для выделения чистых культур метанотрофов способствовали выявлению наиболее адаптированных и быстрорастущих форм, иекотрые представители метанотрофных сообществ (гипер)соленых и щелочных озер,

13

сн* сн,он

Рибулозо- 5Ф

НСООН

со2

Сахарозе- 6Ф

Фн-И УД«

САХАРОЗА

Фруктозе- 6Ф-

I

Глюкоз о- 6Ф

НАДФН, бФ-Глюконат

ФФн

- НАДФНг

УДФ-глюкоза

[Гликоген],,

УДФ

КДФГ

Пируват

[ГЛИКОГЕН]^

ОСЬ НАДНз

НАД* Н8КоА

ФруктозоН.бФг

|--— ДАФ

Глицеральдегид-ЗФ

^ НАДН, Глицерат-1,ЗФ2

И

ЗФ- Глицерат

АТФ

Ацетил-КоА

СО2-

Цитрат Иэоцитрат

Фосфоенолпируват АТФ.

АД* Глутамин

ИНГ —/

АТФ Глутамат

НАД(Ф)Н,-

а- Кетоглутарат

НАДФН2

Оксалоацетат НАД(Ф)Н2 ч|

Малат

Аспартат

ЫЩ*

ГЛУТАМАТ

Фумарат Суюдинат

Аспартил-Ф

I-—НАДФН,

Аспартил-р-полуальдегид Глутамат —•—Л

а- Кетоглутарат — 1

Диаминобутират Ацетил-КоА —4

КоА

М-ацетил-диаминобутират

I

) эктоин

Рис. 4. Пути С! метаболизма и биосинтеза осмонротекторов у М&Иу1отгсгоЫит сйсаИркИит 20Ж

очевидно, остались вне поля зрения. Несомненно, для более адекватной оценки видового разнообразия метанотрофов в этих экстремальных экосистемах необходимо сочетание традиционных подходов с методами молекулярной экологии.

Примечательной особенностью солезависимых метанотрофов является их устойчивость к относительно высоким концентрациям метанола (до 7%, v/v), что, как правило, не свойственно метанотрофам I типа. Рост Methylomicrobium buryalense 5В на метаноле происходил с более высокой скоростью, чем на метане, и сопровождался накоплением в среде формальдегида (ФА, 1.2 мМ), формиата (8 мМ), а также гетерополисахарвда (2.6 г/л), содержащего 23% белка и 77% углеводов, а также редукцией ВЦМ и появлением гранул гликогена в клетках [17].

мМ

OIW мм

ОЙ«*)

80 120 160 Время роста, ч

80 120 Время роста, ч

Рве. 5. Накопление формальдегида (1) и формиата (2) при росте (3) МеЛуЬписгоЫит ЬигуШепье 5В на метане (а) нли метаноле (б).

Накопление формальдегида и формиата в среде в высоких концентрациях (рис. 5) является основной проблемой «метанольного» роста метанотрофов и связано с особенностями регуляции ферментов С г-окисления. При росте на метаноле (в отсутствие метана) возникает дефицит окисленных цитохромов и НАД*, поскольку не функционирует механизм окисления НАДН и цитохромов в реакции монооксигенировании метана. Как следствие, формальдегид и формиат не могут быть полностью окислены до С02, Мы полагаем, что синтез внутри- и внеклеточных ди- и полимеров (сахарозы, гликогена и ЭПС), происходящий из первичных интермедиатов РМФ-цикла, служит одним из механизмов «сброса» токсичного формальдегида Толерантность метанотрофов к метанолу возрастала при повышении рН и солености. Напротив, при росте на метаноле повышаются верхние пределы солености и рН. Предположено, что НАДН и цитохромы дополнительно окисляются в реакциях, поддерживающих внутриклеточный ионный гомеостаз. Природу этих реакций у галотолерантных алкалофильных метанотрофов предстоит выяснить.

1.4, Механизмы осмоадаптации

Аэробные бактерии, способные расти при высокой солености, для компенсации внешнего осмотического давления накапливают так называемые «совместимые растворимые вещества», поглощая их из внешней среды или синтезируя de novo, а также регулируют ионный состав цитоплазмы путем откачки ионов натрия и заменой их па ионы калия (Galinski, 1995; Ventosa et al, 1998, Oren, 1999) В дополнение к этим активным механизмам осмоадаптации, существуют «пассивные» механизмы защиты, включающие изменения в составе клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и других клеточных структур (Kates, 1986; Beveridge et al., 1997). Наши исследования цитобиохимических особенностей солезависимых мстанотрофов показали, что при адаптации к высоким значениям солености метанотрофы реализуют все перечисленные механизмы [4,5,8,9,10,12,13].

1.4.1. Особенности ультраструктуры солезависнмых метанотрофов. Галофильные и алкалофильные изоляты имеют два типа ВЦМ: I тип ВЦМ в виде стопок мембранных везикул в центре клетки или II гип ВЦМ в виде протяженных листов, расположенных параллельно клеточной стенке, как у 'Methybcystis gottschalki' ВЗ. Кроме того, эти бактерии, содержат характерные включения гранул гликогена или полигидроксибутирата (ГОТЗ), соответственно (рис 6)

Другой интересной особенностью ультраструктуры солезависимых метанотрофов рода Methylomicrobium является наличие дополнительных слоев (S-слоев) на внешней поверхности клеточной стенки. S-слои представлены двумя основными типами организации' двумерной (плоскостной) с расположением составляющих субъединиц в наклонной (р2) симметрии у Мт modeitohalophilum IOS и Мт alcaliphilum ML1, или трехмерной - в виде монослоя чашевидных структур, расположенных в гексагональной (рб) симметрии у штаммов Мт. alcaliphilum и Мт buryatense (рис. бе,к). Напротив, S-слои у Мт. keniense AMOl, первоначально описанные как глобулярные структуры (Sorokin et al., 2000), обнаружены нами также у Мт buryatense 3S и различных штаммов Мт alcaliphilum. Анализ ультратонких срезов и криосколов клеток Мт. keniense AMOl выявил, что глобулярные структуры имеют полости, и, следовательно, S-слои этих штаммов представлены мелкими конусовидными образованиями высотой 18 нм и диаметром 13 нм, уложенными на клеточной поверхности в гексагональной (рб) симметрии (рис. 5ж-и). Следовательно, тот или иной способ организации S-слоев является штаммовым, но не видовым свойством метанотрофов рода Methylomicrohium. Отсутствие S-слоев у клеток Мт. alcaliphilum 20Z, растущих при солености и рН, ниже оптимальных значений (рН 7.2 без NaCl), указывает на связь этих надклеточных структур с осмоадапгацией.

Одна из предполагаемых функций бактериальных S-слоев - создание дополнительной ригидности клеточного конверта (Sara, Sleytr, 2000), что особенно важно для галофильных и галотолерантных метанотрофов, поскольку существование в условиях изменяющегося осмотического давления ставит проблему предотвращения лизиса клеток. Однако отсутствие поверхностных слоев у нейтрофильных галофилов Methylobacter marinus 1С и Methylohalobius crimeensis (метанотрофного

Рис. 6. Морфология и ультраструктура клеток галоалкалофильных четанотрофов Methylobaaci marinus 1С (а),'Methylomicrobium modeslohalophilum IOS' (б,в),'Methylomicrobium alcaliphilum 20Z' (г-с,ч) Meíhylonncrobium sp AMOl (ж-и), Melhybmicrobium buryalense 5B (к) и 'Metbylocysus gollscalki' ВЗ (л) д. з - сколы клеточной поверхпосж, выявляющие рб симметрию S-слоев, в - негативно окрашенный S-слой р2 симметрии. а,б,г.е,ж,и,к-ч - ультратонкие срезы мв - мембранные везикулы, чс - чашевидные структуры S-слоя рб - симметрии, гли - гранулы пикогена Длина масштабной линейки 0.5 чкч (а,б,г,ж,к-м) и 0,2 мкм (в,д,е,з,и).

компонента накопитезьной культуры ЗС. идентифицированного на основании анализа гена рто4 табл !) не позволяет однозначно рассмафивать S-слои в качестве общею для метанотрофов механизма адатации к высокой солености

Присутствие S-слоев у всех без исключения сотезависичых алкалофитьных и алкалотолерантных мета1Ю1рофов, подверженных воздействию не только повышенной солености, но и высоких значений рН, согласуется с представлениями о том, что синтез вторичных полимеров, к которым можно отнести белки S-слоев, является показателем состояния стресса у бактерии (Ьанаскьян. 2003) Известно, что усиление окислительных процессов, необходимое для знергизации систем поддержания внутриклеточного ионного гомеос(аза, имеет следствием образование токсичных интермедиатов, в первую очередь активных форм кислорола (Linton, Rey, 1989, Плакунов с соавт, 2004) Поскотьку при окислении метана посредством ММО образуется активные формы кислорода в качестве промежуточных окислителей этой инертной молекулы (Murrel! et al. 2000) увеличение антиокистительных функций клеток за счет поддержания высокого пула SH-содсржащих компонентов - поверхностных белков (Linton, Rey. 1989), или синтеза экзоферментов, обладающих антиоксидантным действием, сайтом связывания которых могут быть S-с.юи (Claus et al, 2005, Сузина, Фихте. 1986). для метанотрофов особенно актуально Для понимания истинной роли S-слоев у экстремофильных метанотрофов необходимы летальные цитобиохимические и генетические исследования

1.4.2. Фосфолипидный состав клеток. Цитоплазматическая мембрана галофильных бактерий представляет собой дополнительный пассивный барьер для катионов (Kates 1986. Russe! et al. 1986)

Таблица 4. Влияние условий культивирования на фосфолипидный состав гало- и алкалофильных метанотрофов (% от общего содержания)

Фосфолипиды Mm. alcaliphUum 20Z Mm. moilestohalophilum IOS

без NaCl 6% NaCl без NaCl 3% NaCl

рН 7.0 рН 9.0 рН 7.0 рН 9.0 рН 7.0 рН 7.0

Фосфатидная кислота (ФК) 27 21 1 3 3 3 8 1

Фосфатидилхолин (ФХ) 75 63 28 30 - -

Фосфатидилсерин (ФС) 14 17 6 1 1 следы следы

Фосфатидилэ1анодамин (ФЭА) 40 48 86 05 86 48

Фосфатидилглицерин (ФГ) 8.1 53 40 54 79 50

Кардиолипин (КЛ) 3 5 24 16 11.5 22 1.2

Все исследованные культуры отвечали на повышение солености среды накоплением отрицательно заряженного ФГ (а также ФХ у Мт акаЬрЫЫт 20Т) и понижением доли ФЭА (табл 4) Явление так называемою 'ФГ/ФЭА антагонизма' имело место также при изменении рН среды культивирования Отрицательно заряженные фосфолипиды (ФГ), а также цвитеррионный ФХ обладают

стабилизирующим действием на мембраны, формируя мембранный бислой и изменяя их проницаемость для катионов (протонов и ионов Na+' (Thiemann, Imhoff, 1991). Таким образом, при адаптации к высокой солености метанотрофы реализуют общий для всех солезависимых бактерий «пассивный» механизм поддержания ионного гомеостаза клеток

У метанотрофов рода Methylomicrobium преобладают насыщенные и мононенасыщенные С^ жирные кислоты (65-80% от общего содержания). Однако в отличие от других метанотрофов I типа, гексадеценовые кислоты представлены в основном изомером С16:1ш7с, в то время как изомер С16:1со8с, характерный для метанотрофов рода Methylomonas и негалофильных видов рода Methylomicrobium, отсугствует (Bowman et al., 1991, 1993). Состав жирных кислот у Mm alcaliphilum 5S незначительно варьировал при изменении рН ростовой среды (табл. 5).

Таблица 5. Жирнокислотяый состав клеток метанотрофов рода Methylomicrobium

(% от общего содержания)

Жирные кислоты Mm. alcaliphilum Mm. burya-tense SB Mm. album Mm. agile3 Methylobacter »pp.3

20Z FM3 £3 4S 5S' 5Ss

14:0 2.9 2.6 2.7 2.6 2.1 3.4 4.71 0.7-1.8 7.64-9 7

U5-.0 0-7.3 0-0.4

15:0 3.2 3.0 3.6 1.8 3.0 2.5 0.87 0-4.2

а15:0 0.95

16:1ш8с 12.1-19.0

16:1со7с 49.2 53.9 38.4 49.5 49.8 52.0 50.98 14.1-1.9 56.8-57.4

16:lto7t 8.0 8.3 8.6 93 10.0

16:1ш6с 5.9-14.4 4.4-4.9

16:1со5с 19.9 19.1 18.0 14.7 15.07 5.6-7.4 5.5-7.8

16:la5t 5.6-28 2 10-10.8

16:1ш9 6.2 3.8

16:lmll 16.0 21.9

16:0 14 6 11.4 16.3 16.8 161 15.4 20.95 11.3-18.1 8.2-8.4

16:0 ЗОН 0.87

18:2оо6,9с 1.03

17:0 0-0.1

18:1со9с 0.1 0.5 0.3 0.2 0.5 0.3 1.22

18:1ш7с 0.3 0.4 0.3 0.4 0.61 0-26.5

18:0 1.3 0.6 1.1 0.7 0.5 0.9 1.36 0-2.8

18:0 ЗОН 138

клетки выращены при рН 9;2> клетки выращены при рН 7,2; 3) данные Bowman et al. (1993)

Ранее жирные кислоты С16:1о>8с рассматривались в качестве универсального идентификационного маркера, а также для количественной оценки метанотрофов I типа в различных природных экосистемах (Bowman et al., 1991; Sundh et al., 1995). Однако наши исследования свидетельствуют о существенных отличиях жирнокислотных профилей у солезависимых и соленезависимых представителей рода Methylomicrobium, и, следовательно, накладывают ограничения в области применения изомеров C16:1<d8c как сигнала на присутствие метанотрофов в природных экосистемах.

1.4.3. Осмопротекторы галотолераитных метанотрофов. В спиртоводорастворимой фракции клеток всех тестированных галофильных и галотолерантных метанотрофов, выращенных при повышенной солености, методами ТСХ и 'Н-ЯМР-спектроскопии идентифицированы глутама:, сахароза и эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоновая кислота) (рис. 7). Суммарное содержание осмолитов в клетках, растущих в присутствии 1 М ЫаС1, достигало 1.5 М, что достаточно для поддержания осмотического равновесия между цитоплазмой и средой, а также для создания тургора в клетках. Выявлена также высокая внутриклеточная концентрация калия 0.36 М, которая на порядок превышала его концентрацию в среде, указывая на активный транспорт этого катиона против концентрационного градиента [12,13].

Ряс. 7. 'Н-ЯМР-спектры метанольиых экстрактов клеток Мт. buryatense 7G, выращенных в присутствии 0.75%NaCI (а) или 5%NaCl (б). Пики соответствуют сигналам протонов при

соответствующих атомах -СН2-групп глутамата (03 и 04), сахарозы (С2-С|г) и метальной группы эктоина (Эг). * -сигнал протонов метильной группы малеиновой кислоты, используемой в качестве количественного стандарта.

Скрининг разных штаммов галофильных и апкалофильных метанотрофов показал, что внутриклеточные пулы глутамата и сахарозы не превышали 0.3 М и не всегда зависели от внешней солености (табл. 6), поэтому не исключено, что накопление этих соединений может регулироваться иными, нежели осмотический стресс, факторами.

По способности аккумулировать эктоин солезависимые метанотрофы можно разделить на две группы, что коррелирует с их верхним пределом галотолерантности. Так, различные штаммы вида Мт. alcaUphilum, накапливали эктоин до 12-15% от веса сухих клеток и росли в среде с содержанием NaCl выше 100 г/л. В то же время, у Мт modestohalophttum IOS, Мт keniense AMOl и всех исследованных штаммов Мт. buryatense, не способных расти в присутствии более чем 40-50 г/л NaCl, максимальное содержание экгоина в клетках не превышало 5% от веса сухой биомассы (табл. 6).

(а)

П

A 0t<H

С2-12

(в)

___JL,

7 6 5 4 3 2 1 8, м.д.

Таблица 6. Содержание осмопротекторов в клетках солезависимых метанотрофов (нмоль мг1 сухих клеток)

Штамм Концентрация NaCI в среде, % Эктоин Глутамат Сахароза

Mm. buryatense 5G 0.75 0 171 94

3 99 93 88

б 280 121 151

Mm. buryatense 6G 0.75 0 22 0

5 127 85 73

Mm. buryatense 7G 0 0 34 29

0.75 0 160 29

3 250 80 205

5 264 120 305

Mm. buryatense 5B 0.75 0 27 0

3 282 39 140

Mm. akaliphilum 20Z 0 33 38 0

3 450 148 140

6 842 178 223

9 1050 360 300

Mm. alcaliphilum 5S 1 0 н.о н.о

3 170 н.о н.о

5 590 н.о н.о

8 840 н.о н о

1.4.4. Пути биосинтеза осмопротекторов. Поскольку галофильные и галотолерантные метаиотрофы растут на минеральных средах в присутствии метана в газовой фазе и не развиваются в сложных органических средах, основным механизмом аккумуляции органических осмопротекторов является их синтез de novo. Энзимологический анализ экстрактов клеток Mm. alcaliphilwn 20Z показал, что биосинтез глутамата метанотрофами осуществляется посредством восстановительного аминирования а-кетоглутарата, а также через глутаматный цикл (рис. 4). Синтез сахарозы осуществляется в пути, наиболее распространенном в растительных и микробных клетках: из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата с участием сахарозофосфатсинтазы и сахарозофосфатфосфатазы (рис. 4). Поскольку предшественники сахарозы образуются уже в первичных реакциях ассимиляционного РМФ-цикла, он может осуществляться быстрее, чем синтез эктоина. Логично полагать, что использование сахарозы в качестве дополнительного к эктоину осмопротсктора обеспечивает преимущество этим бактериям в экосистемах с быстро меняющейся соленостью. Энзимологическим анализом установлено, что путь биосинтеза эктоина у метанотрофов аналогичен таковому у галофильных гетеротрофных бактерий (Peters et al, 1990), у которых он является ответвлением пути биосинтеза аминокислот аспартатного семейства (рис. 4).

1.4.5. Организация генов биосинтеза эктоинн у четанотрофов.

Анализ имеющихся в базе данных нуклсотидных последовательностей обнаружил достаточно высокую консервативность ecí-генов у гетеротрофных галофильных бактерий, причем они, как правило, расположены в одном кластере в последовательности ectABC (Canovas et al., 1998, Louis, Galinski. 1997, Göller et al, 1998 Kuhlman, Bremer, 2002) В связи с )ги» нами была избрана основанная на ПЦР методология идентификации соответствующих последовательностей в ДНК Мт alcaliphihtm 20Z [25, 27, 32]. Разработанные вырожденные праймеры позволили амплифицировать фрагменты генов eclB и ectC Затем в результате серии инвертированных ПЦР впервые удалось расшифровать полную нуклеотидную последовательность генов, кодирующих ферменты синтеза эктоина у Mm. alcahphilum 20Z. Положение праймеров для ПЦР и сайтов для рестриктаз схематически представлены на рис. 5.

С применением компьютерного анализа программы DNAStar в суммарной нуклеотидной последовательности обнаружены четыре открытые рамки считывания (ОРС), которые кодировали белки с рассчитанными молекулярными массами 18.8, 47.8, 15.2 и 53.3 кДа. Транслированные аминокислотные последовательности трех ОРС имели от 24 до 63% идентичности с EctA, EctB, EctC галофильных бактерий, продукт четвертой ОРС был на 50% идентичен аспарюкиназе из Vibrio cholerae (Pílughoeft et al, 2003), V parahaemolyticus (Makmo et al, 2003) и V fachen (Ruby et al, 2005).

Компактное расположение четырех ОРС (42 п н. между ectA и eclB генами, 50 п н между ecíB и ectC генами и 60 п н между eclC и ask) указывало на локализацию тетрады генов в хромосоме Мт alcahphilum 20Z в одном опсроне. Возможность этих генов транскрибироваться в виде одной матричной РНК выявлена методом ПЦР обратной транскрипции [32J (рис 5)

Гены ectA, eclB и ectC были клонированы в вектор рЬТ22Ь-, определяющий синтез рекомбинантных белков с дополнительными 6 His на С-конце Полученные рекомбинантне плазмиды рЕТectA pFTectB рЕ'ГectC трансформировали в штамм h. coli BL21(DE3), экспрессирующий РНК-полимеразу фага Т7 под контролем промотора lacUV5 Индукцией ИПТГ и последующей очисткой металл-хелатной хроматографией из экстрактов клеток Е coli получены активные препараты рекомбинантных ДАБ-ацетилтрансферазы ДАБ-аминотрансферазы и эктоинсинтазы.

Таким образом, в отличие от большинства гетеротрофных галофильных бактерий, у Мт alcaliphttum 20Z ect-тены составляют 4-х генный оперон ectABCask, включающий дополнительный ген аспартокиназы (рис. 5).

Рис. 5. Организация генов в ДНК

Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

(А) Расположение ecf-генов и положение

праймеров, использованных для ПЦР и RT-PCR

Последовательности вырожденных праймеров Atf,

Тга 1, Тга 2, Тга 4, ТгаЗ, Cr и специфических для

фрагментов ДНК праймеров AtrI, EF, AskR, AskT,

AskIR, AskIF и Tra2.1, использованных для

инвертированной ПЦР, представлены в работе [32]

Пары праймеров 807 и 1551, 1851 и 2688, 2660 и

3753 применялись для получения cDNA-продуктов

с использованием мРНК, (В) Гель-электрофорез

продуктов RT-PCR, полученных с праймерами,

По аналогичной схеме идентифицировали гены синтеза эктоина у нескольких представителей галофильных и галотолерантных метанотрофов (табл. 7). Особенность организации I енов биосинтеза эктоина у алкалофильных Мт кепете АМ01 и Мт. ЬигусЛете 5В, а также нейтрофильного Ме(ку1оЬас1ег тагтш 1С заключается в том, что ОРС, соответствующая гену асиартокиназы (сак) отсутствовала Отсутствие гена азк в данной последовательности генов коррелирует с меньшей солеустойчивостью метанслрофов, по сравнению с Мт сЛсаИрЫит (до 10% №С1), а также более низким уровнем эктоина в клетках.

Таблица 7. Организация ect-генов и солеустойчивость галофильных и гало! олерантных метанотрофов

Метанотроф Организация ect-генов Толераитность к

соли, % NaCl

Methylomicrobntm alcaliphilum 20Z ectABCask 10

Meihylomicrobium alcaliphilum 4S ectABCask 8

Meihylomicrobium alcaliphilum 5S ectABCask 8

Meihylomicrobium alcaliphilum ML1 ectABCask 7

Meihylomicrobium bwyatense 3S ectABCask 8

Meihylomicrobium buryatense SB ectABC 4

Meihylomicrobium keniense AMOl ectABC 5

Methylobacter marinus 1С ectABC 4

Выявленная нами особенность организации ect-reнов у метанотрофов коррелирует с их солеустойчивостью и обусловлена особенностями центрального метаболизма облигатных метанотрофов в целом. Аспартокиназа катализирует первую реакцию пути биосинтеза аминокислот аспартатною семейства (треонина, метионина и лизина), ответвлением которого является последовательность, обеспечивающая синтез эктоина. У гетеротрофных бактерий аспартокиназа представлена несколькими изоформами, причем их активность по-разному регулируется аминокислотами - конечными продуктами данного пути (Wampler, Westhead, 1968). У облигатных метанотрофов в пути биосинтеза аминокислот аспартатного семейства изоформы аспартокиназы отсутствуют (Малашенко с соавт., 1987; Ward et al, 2004). Появление гена специфической аспартокиназы в эктоиновом опероне у метанотрофов с повышенной солеустойчивостью закономерно, поскольку обеспечивает относительную независимость функционирования двух путей -синтеза эктоина и других аминокислот аспартатного семейства.

1.4.6. Клонирование, очистка и характеристика ДАБ-ацетилтрансферазы. Несмотря на большой интерес к эктоину, как к одному из доминирующих эубактериальных осмопротекторов, ферменты пути его биосинтеза остаются малоисследованными. Во многом это обусловлено сложностью детекции активности и нестабильностью ключевых ферментов - диаминобутиратацетилтрансферазы, диаминобутиратаминотрансферазы и эктоинсинтазы (Ono et al., 1999) При изучении свойств этих ферментов у метанотрофов нами выбрана стратегия накопления и выделения целевого белка, основанная на клонировании и гетерологичной экспрессии есг-генов в штамме-суперпродуценте, что позволило существенно сократить количество этапов очистки [27,28].

ДАБ-ацетилтрансферазу выделяли из клеток Е. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pEYeclA, с использованием афинной металл-хелатной хроматографии. Полученный гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы с удельной активностью 200 Е/мг

белка был стабилен при 4"С или -70°С 0 1ечение 1 месяца. При гель-фильтрации очищенною препарата с использованием носителя ииго@е1 АсА54 пик активности белка соответсшовал м м. 40 кДа, что согласуется с димерной формой фермента. Основные свойства ДАБ-ацетилтрансферазы представлены в табл. 8.

Таблица 8. Основные свойства ДАБ-ацетилтрансферазы МеЛу1опйсгоЬ1ит а1саИрЫ1ит 202 и

НаЬтопт е1ощЫа 01ГТ30018

Характеристики Мт. акаИрЫЫт 202 Я. е1оп%Ш 0ит30018 (Опо ег а!., 1999)

Оптимум рН 9.5 8.2

Оптимальная температура 20°С 20°С

Молекулярная масса (БОБ-электрофорез) 20 Ша и.о.

Молекулярная масса (Гель- фильтрация) 40 кЭа 45кБа

Кт(ДАБ) 0 465 шМ н.о.

Кт (Ацетил-КоА) 0.0367 тМ и.о.

Ингибиторы (1мМ) гп2\ Сд2\ АТФ и.о.

Оптимум КС! 0 25 М 0.4 М

Оптимум №С1, М 0.1-0.2 М 0.4 М

Стабильность в течение месяца Стабилен Не стабилен

при 4°С или -70°С

Ранее ДАБ-ацетилтрансферазу удалось частично очистить традиционным методом колоночной хроматографии из галофильной гетеротрофной НЫотопса е1оп%ма (Опо е1 а1., 1999). Полученный фермент с удельной активностью 50 Ед • мг'1 белка был нестабилен и поэтому недостаточно охарактеризован. Сравнение свойств этих ферментов показало, что для ДАБ-ацетилтрансфераз обеих бактерий характерен необычно низкий температурный оптимум - около 20°С и зависимость активности от присутствия КС1 или КаС1. Однако ферменты этих организмов отличаются по стабильности и оптимальными значениями рН и солей для активности. Свойства ферментов коррелируют с физиологическими характеристиками бактерий - более высоким рНопт У галотолерантного алкалофильного Мт. ЫсаИрЪИюп 20Z, напротив, потребностью в более высокой ионной силе для обеспечения максимальной скорости реакции у гетеротрофа Н. ь1ощШа, оптимально растущего в присутствии 12-15% №С1. Следовательно, имеет место зависимая от физиологических особенностей данных бактерий структурно-функциональная адаптация ферментов биосинтеза эктоина.

Проявление максимальной активности ДАБ-ацетилтрансферазы из Мт а1са11рЫ1ит 20Ъ и Н. е1ощ(йа при высокой ионной силе свидетельствует о «галофильной» природе ферментов, что свойственно ферментам из анаэробных микроорганизмов, реализующих «солевой шп» осмоадаптации Хотя Мт. акаИрЫЫт 201 и Н. е1оп%сйа осуществляют принципиально иной тиг. осмоадаптации, связанный с синтезом совместимых растворимых веществ, тем не менее,

внутриклеточная концентрация К* у Mm alcaliphilum 20Z, достигала 0.36 М [12] Можно предположить, что эти аэробные бактерии, реализуют «смешанный тип» осмоадаптации. В свете этих данных, а также недавних исследований, свидетельствующих о способности галофильных анаэробов синтезировать и аккумулировать органические осмопротекгоры (Grant, 2004), можно констатировать, что у аэробных и анаэробных микроорганизмов при адаптации к низкой водной активности проявляются общие основные закономерности. Наши результаты подтверждают постулированную высокую консервативность пути синтеза эктоина у галофилов в отношении участвующих ферментов и соответствующих генов (Kuhlman, Bremer, 2002), при этом свидетельствуют о разнообразии их организации и регуляции, что, обусловлено физиологическими и биохимическими особенностями бактерий, а также, вероятно, условиями их местообитания.

ГЛАВА 2. УМЕРЕННО ТЕРМОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФЫ

Свойства метанотрофов, растущих при повышенных температурах, изучены крайне скудно, следствием этого является нестабильность роста, частая потеря коллекционных культур и необходимость их реизоляции. Из проб навоза и силоса нами выделены в чистые культуры два штамма метанотрофов (0-12 и Н-11), способных расти в диапазоне температур от 37 до 61°С, оптимально при 55-57°С, имеющих наибольшее сходство фено- и генотипических (99% сходства последовательностей 16S rDNA и гена ртоА) признаков с Md. szegediense [26] (табл 9). Присутствие в пробах силоса и навоза Md.szegediense, первоначально описанного как обитателя термальных источников (Bodrossy et al., 1995), свидетельствует о широком распространении и высокой адаптвбельности этого вида к различным термальным экосистемам.

Кроме того, из образцов ила термального источника Хиого (Япония) нами выделен штамм MYHT, который по последовательности 16S рДНК (рис. 1) одинаково близок как к виртуальному (утерянному из коллекций) 'Methylotherrma' HB (91% сходства) (Bodrossy et al., 1999), так и мезофильному галофилу Methylohalobivs crimeensis (90%) (Heyer et al., 2005). Штамм MYHT, растущий в диапазоне температур 37-67°С, с максимальной скоростью при 57-59°С, классифицирован как Methylothermus thermalis gen nov. sp. nov.[30].

Характерным общим свойством представителей рода Methylocaldum является полиморфизм присутствие в культуре, растущей при оптимальной температуре, наряду с мелкими кокковидными клетками очень крупных палочек и кокков, причем некоторые из коюсовидных клеток имели толстую капсулу, напоминая цисты типа 'Azotobacter', сохранявшие, однако, развитую систему ВЦМ (рис.ба-в). Изучение влияния температуры на морфологию клеток показало, что причиной полиморфизма могут быть нарушения клеточного деления при стрессовых воздействиях, в первую очередь, флуктуациях температуры. При пересеве с оптимальной температуры (57°С) на пониженную (37°С) полиморфизм наиболее ярко выражен: клетки штамма 0-12 увеличивались до гигантских размеров, или приобретали неправильную форму (рис. 6г), напоминая процесс множественного почкования.

Рис 6 . Морфология и ультраструктура клеток умеренно термофильных четанотрофов

Methylocaldum izegedieme 0-12 (а-е), выращенных при 57°С (а-в,е) или 37°С (г,л) в присутствии NaCl (е) или без соли (а-в,г.д) и Methylothermm thermalu (ж-и). в, д -иистоподобные клетки; а, ж - фазовый контраст, б-е, з - >льтратонкие срезы и - негативный контраст. Длина масштабной линейки 3 мкм (а.ж) и 0.5 мкм (б-е, з,и)

Таблица 9. Основные свойства термофильных и термотолерантных метанотрофов

Свойства Methylococcus 'Ме1ку1ососсш Methylocaldum \fethylocaIdum \1ethyiocaUum 'А4е(Ну1осаШит Metkylothermus

capsulatus ЛегторИиих' gracile 1ериЫт хгевеЖепге sгegedlenze' thermale

(Foster, Davis, (Малашенко с (Bodrossy et al, (Воёгочяу с! а1, (ВойгоБчу а1., (Ешинимасв с (Tsubota et al.,

1966) соавт, 1975) 1997) 1997) 1997) соавт., 2004) 2005)

Морфолошя Кокки Кокки Плеоморфные Плсоморфные Плсоморфныс Плеоморфные Округлые палочки

Размер клеток(цт) 0 7-0 9x0.7-0.9 0 7-0.9x0 7-1.2 0 4-0.5x1 0-1 5 1 0-1 2x1.0-1 5 0 6-1 0x1 0-1 5 0 6-0 8x1 8-2 0 0 6-0.8x1.0-1.2

Тип I Г I I I I I

зММО + - - - - - -

Подвижность - - ¥ + + + -

Цисты типа' Лго1оЬас1ег' л )- + + + ч- -

ЦВС1 колоний Белый до Кремовый до Бурые Бурые до Бурые до светло- Светло- Светло-

кремовош коричнево! о коричневого коричнево! о коричневмй коричневый

Диапазон Г°С(оптимум) 30-55 (37-42) 37-62 (55) 20-47 (42) 30-47 (42) 37-62 (55) 37-61 (55) 37-65 (55-57)

Диапазон рН (оптимум) 6.0-8.0 (6.5-7.5) 6 5-8.0 (7.5) н о н.о. н о 6 8 5 (7.2) 6.5-8.0 (6.5)

Соленость (% КаС1) н о н.о H о н о н о 0-2 (0.5) 0-3 (0,5)

Рост на меганоле(0.1 %) + + - - - +

Путь С |-ассимиляции РМФ, РБФ, РМФ, РБФ, РМФ, РБФ, РМФ, РБФ, РМФ, РБФ, РМФ, РБФ, РМФ

сериновый сериновый сериноный сериновый сериновый сериновый

о-КетоглутаратДГ - - - - - - -

Жирные кислоты, (%)

С160 + + 63.5 37 2

С16 1 + ь 133 _

С18-1 - н о. н.о н 0 0 17 \

С17сус - - 90 35 2

С9-ОМе-16"0 - - 46 -

Кардиолипии + н.о н.о и о н.о + -

Фосфатидилэтаноламин + н.о. н о н о н о + +

Фосфат идилхолин + н о н о н.о н.о - -

Убихинон Q-8 н.о. н о н о н о Метилен-0-8 0-8

ГЦ в ДНК, мол % 62.5 63 3 56-58 57.2 56.5 58.5 62.5

Источник выделения Донные осадки водоемов, Активный ил Почва Горячий источник Силос, Горячий источник

Активный ил навоз

После определенного периода адаптации к 37°С клетки в культуре были представлены преимущественно мелкими кокками (рис. бв,д), но теряли способность к росту при последующих пересевах Напротив, при выращивании МЛ szegedlense 0-12 при 55°С с соблюдением предосторожностей, предотвращающих температурный стресс (засев теплого инокулята в среду, предварительно прогретую до температуры культивирования, и поддержание стабильного температурного режима при замене газовой фазы), явление полиморфизма не наблюдали

Примечательной особенностью физиологии термофильных метанотрофов оказалась относительно высокая толерантность к соли (до 2-3% №С1) и стимуляция роста добавлением 0,5% ЫаС!. При этом стресс, связанный с понижением температуры, снимался в присутствии соли: почти все клетки в культуре МЛ 5ге%еЛ1ет>е 0-12, растущей при 0.5% ЫаС1 и температуре 55°С или 37°С, были представлены вегетативными коккоидами (рис. бе). Однако полиморфизм не свойствен М1 ¡ИегтаНя, что коррелирует с наличием 8-слоев, очевидно обеспечивающих ригидность клеточной стенки и устойчивость к внешним воздействиям.

Таблица 10 Жирнокислотный профиль клеток МеИ/уШЛегтю ¡Иегта1к и МлНуЫсаЫит ¡гекееНеме, выращенных при разных температурах (% от общего содержания)_

Жирные кислоты МеИ$уШкегтш !кегтаШ МУНТ МеИгуксаШит кедойепге 8 р. 11-11 МеЛу1осаЫит szegediense «р. 0-12

59 "С 37 "С 55 "С 37 °С 55 "С

12:0 0.10 0.11 0

14:1\у5 0.25 - 0.2 -

14:0 1.24 3.12 2.40 3.26 1.97

14:0 20Н 0.33

15:Ы6 0.32 - 0.22 -

15:0 2.07 2.49 2.50 2.54 3.51

15.0 20Н 0.17

16:1 43.6 13.27 47 11.90

16:1со7с 3.46

16:0 37,24 43.57 64.99 43.22 63.67

16:0 20Н 8,41

17:1 0.19 0.15

¡17:1 0.44 0.34

17:1ш8 0.24 0.26

17:1«>6 0.44 0.43

17сус 4.71 5.78 6.07 3.35 8.99

17:0 2.52 0.44 0.68

ЗМ6:0 0.37 0.98 0.64

9-ОМе-16:0 4.85 4.62

18:1 0.24 0.29 0 17

18:1м7с 0.35

18:1а>9с 35.16

18:0 1.74 0.23 0.20 0.26

9-ОМе-17:0 0.59 0 60

11-ОМе-17:0 0.59 0 60

19:1сус 2.41 1.37

При оптимальной температуре культивирования (55°С) у Md. szegediense 0-12 и Н-11 преобладали насыщенные жирные кислоты С160 и в существенном количестве присутствовали необычные для эубактерий метилированные и циклические производные (С9-ОМе-1б:0 и С17сус). При снижении температуры до 37°С возрастало содержание ненасыщенных жирных кислот, а метилированные производные не обнаружены (табл. 10) Очевидно, насыщенные и метилированные жирные кислоты, наряду с их циклическими производными, участвуют в стабилизации структуры клеточной мембраны, снижая ее текучесть при высоких температурах. У Ш. /ЬегтаШ МУНТ состав жирных кислот также весьма необычен (табл. 10). В отличие от других метанотрофов I типа, характеризующихся преобладанием гексадекановых и гексадеценовых жирных кислот, Ми ¡ИегтаШ МУНТ имеет одинаковое содержание С!6:0 (37.2%) и С18:1ш9с (35.2%). Наличие октадеценовых жирных кислот, очевидно, является адаптивным признаком, поскольку известно, что температура плавления мембраны повышается с увеличением длины углеродной цепи жирной кислоты. Эти особенности липидного состава мембран у новых изолятов требуют радикального переосмысления значения жирнокислотного профиля как идентификационного маркера при изучении метанотрофов в природных экосистемах, а также предоставляют новую информацию, важную для таксономии зкетремофильных метанотрофов.

Таблица 11. Активности ферментов первичного и центрального метаболизма в экстрактах клеток штаммов 0-12 и Н-11, выращенных при разных температурах (нмоль мин'' - мг"1 белка)

Фермент Кофактор Штамм О-12 Штамм Н-11

55°С ЗТС 55°С ЪТС

Метанолдегидрогеназа ФМС 3 2 5 3

Формальдегидцегидрогеназа ФМС 5 0 10 0

НА/Г 0 0 0 0

Формиа гдегидрогеназа ФМС 45 211 2 104

НАД* 4 111 6 85

Гексулозофосфатсинтаза 174 176 81 97

Оксипируватредуктаза НАДН 22 2 119 25

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза 8.5 5 22 6

КДФГ-альдолаза 22 1 6 1

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа НЛДФ* 29 52 22 36

6-Фосфоглюконат дегидрогеназа НАДФ1 11 16 8 10

а-Кетоглутаратдсгндрогеназа НАД* 0 0 0 0

Особенностью конструктивного метаболизма МеЛуЬсаМит ер. является функционирование одновременно трех путей С1-ассимиляции (РМФ, серинового и цикла Кальвина), что позволяет отнести эта бактерии, наряду с МеЛуЬсоссш сарт1а1ш, к 'X' типу метанотрофов. Уровни ключевых ферментов этих путей у Ш. szegedien.se зависели от температуры роста (табл 11). Так, на фоне

неизменно высокой активности ГФС, ключевого фермента РМФ-цикла, уровень оксипируватредуктазы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, индикаторных ферментов серинового пути и цикла Кальвина, соответственно, существенно возрастали при повышении температуры выращивания. Усиление потока углерода на ассимиляционные процессы через сериновый путь и цикл Кальвина, более энергоемкие, по сравнению с РМФ-циклом, возможно, объясняется тем, что при воздействии высоких температур на микроорганизмы имеет место увеличение количества активных форм кислорода (Sugiyama et al., 2000, Плакунов с соавт, 2004) Поэтому механизм, позволяющий увеличить энергетические затраты бактерий на ассимиляционные процессы при повышении температуры роста, можно рассматривать как один из способов защиты от избыточного кислорода (Linton, Rey, 1989).

В отличие от Ш szegediense, Mt. thermalis ассимилирует углерод метана исключительно через РМФ-цикл. При этом оба метанотрофа имеют достаточно близкие диапазоны ростовой температуры (табл.9). Различия в механизмах термоадаптации у этих термофильных метанотрофов еще предстоит выяснить. Возможно, чрезвычайно энергоемкий процесс синтеза S-слоев у Mt. thermalis может быть механизмом «сброса» избыточной энергии и одновременно способом удаления активных форм кислорода. В этой связи следует отметить наличие связанной с S-слоями перекись-разлагающей активности у Methylococcus capsulatus Texas или трубчатыми поверхностными структурами у Methylocystis echinoides 2 (Сузина, Фихте, 1986). Способность к синтезу меланина Md szegediense можно рассматривать в качестве способа защиты от литического действия Н2О2 и кислородных радикалов.

ГЛАВА 3. АЭРОБНЫЕ МЕТАНОТРОФЫ ХОЛОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Большая часть земной поверхности находится под влиянием низких температур (Morita, 2000). Это зоны снежного покрова, постоянно холодные почвы, воды и осадки полярных регионов, меромиктические озера и др. Более половины территории России находится в зоне распространения вечной мерзлоты Систематические исследования метанотрофов психросферы под руководством академика Г.А. Заварзина привели к выделению из тундровой почвы первого психрофильного метанотрофа Methylobacter psychrophilus (Омельченко и др., 1992, 1993; Васильева с соавт, 1999; Турова с соавт., 1999), который растет при температурах от 3.5 до 20°С, оптимально при 5-10°С и представлен кокковидными клетками с ВЦМI типа и необычными газовыми везикулами 3.1. Особенности метаболизма Methylobacter psychrophilus. В совместных экспериментах было показано, что скорость окисления метана и активности ферментов первичного и промежуточного метаболизма Methylobacter psychrophilus и термотолерантного Methylococcus capsulatus (Техаь) в одинаковой степени уменьшались при понижении температуры инкубации с 30°С до 5°С [2] (табл 12). Следовательно, свойства этих ферментов не являются решающим фактором психроадаптации Однако скорость включения 3Н-лейцина в кислотоустойчивые метаболиты клеток оказалась максимальной при 10°С и снижалась при повышении температуры (15-37°С), указывая на зависимый от температуры синтез белка.

Таблица 12. Активности ферментов первичного и нейтрального метаболизма в экстрактах клеток Methylobacterpsychrophilus 8р. Z-21 и Methytococcus capsulatus (Texas) при разных температурах инкубации (имоль/минхмг белка)

Фермент Кофактор Штамм Z-21 Штамм Texas

Температура инкубации, "С

5 1 15 I 30 5 1 15 I 30

Метанолдегидрогеназа ФМС 23 38 76 22 32 61

Формальдегиддегидрогеназа ФМС 2 4 7 6 8 17

НАД* 4 8 9 4 7 42

Формиатдегидрогеназа ФМС 47 60 131 76 114 219

НАД* 29 32 77 63 75 227

Оксипируватредуктаза НАДН н.о. 1 3 н.о н.о 61

НАДФН но. 2 6 н.о. н.о. 20

Серин- н.о. 3 8 н.о. н.о. 42

глиоксилатаминотрансфераза

Гексулозофосфатсинтаза 224 366 658 н.о. н.о. 660

6-Фосфофруктокиназа ФФИ 24 64 183 0,9 1 5

АТФ 0 9 13 0 0 6

Глюкозо-6-ДГ НАД* 0 2 7 н.о. н.о. 43

НАДФ" 5 10 36 н.о. н.о. 29

6-ФосфоглюконатДГ НАДФ* 12 20 44 н.о. н.о. 51

НАД* 0 0 0 н о. н.о. 3

Фруктозо-1,6- 16 37 130 но н.о. 12

бисфосфатальдолаза

КДФГ-альдолаза 0 5 11 н.о. н.о. 27

I

3.2. Особенности метаболизма ацидофильных метанотрофов. Ацидофильные метанотрофы, впервые выделенные С.Н. Дедыш из кислых торфяных болот бореальной зоны и тундры, а также кислых лесных почв (Dedysh et al., 1998, 2000, 2003), представлены двумя новыми родами -Methylocella и Methylocapsa, образуя филогенетически обособленную группу в а-подклассе Proteobacteria. Три вида рода Methylocella - Ml. palustris, Ml. silvestris и Ml. tundrae, характеризуются своеобразной ультраструктурой клеток - отсутствием ВЦМ, свойственных представителям всех других родов метанотрофов, что коррелирует с наличием только растворимой формы ММО. Единственный описанный до сих пор вид рода Methylocapsa (Ма acidiphila) имеет мембранную ММО, а вегетативные клетки обладают развитой системой ВЦМ, собранных в плотные пакеты и ориентированных параллельно одной из сторон клеточной стенки.

Нами установлено, что особенностью метаболизма Methylocella и Methylocapsa является наличие активных дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглкжоната (табл.13). Поскольку ферменты пентсзофосфатного пути не функционируют у других метанотрофов с сериновым путем, можно предположить более высокий метаболический потенциал у этих бактерий [15,21,22,23].

Таблица 13. Активности ферментов первичного и центрального метаболизма в экстрактах клеток ацидофильных метанотрофрв (нмоль/мин*мг белка)

Фермент Кофактор Methylocella Methylocella Methylocella Methylocapia

palmtrisK sihestris tundrae acidiphüa

Мембрансвязанная ММО 0 0 0 100

Растворимая ММО 73 20 + 0

Метанолдегидрогеназа ФМС 21 137 383 219

Формальдегиддегидрогеназа ФМС 5 4 85 20

Формиатдегидрогеназа ФМС 133 22 128 42

НАД* 112 10 438 28

Оксипируватредуктаза НАДН 160 64 322 38

НАДФН 187 0 257 0

Серин- НАД(Ф)Н 161 28 192 33

глиоксилатаминотрансфераза,

Гексулозофосфатсинтаза 20 0 0 0

6-Фосфофруктокиназа ФФ„ 37 27 211 75

АТФ 0 0 0 0

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа НАД* 25 133 64 0

НАДФ* 8 16 128 32

6-Фосфоглюконатдегидрогсиаза НАДФ+ 20 15 85 33

НАД* 0 113 42 16

Фруктозо-1,6- 80 22 32 43

бисфосфатальдолаза

2-кето-З-дезокси-б- 0 0 н.о 0

фосфоглюконатальдолаза

Пируваткиназа НАД* 0 н.о. 96 0

Пируватдегидрогеназа 0 н.о. 0 0

Цитратсинтаза НАД* 36 Н.0 и.о. н.о.

Изоцитратдегидрогеназа 0 0 н.о. 46

НАДФ* 13 8 н.о. 40

а-Кетоглугаратдегидрогеназа НАД* 15 12 51 13

Малатдегвдрогеназа НАДН н.о н.о. н.о. 19

НАДФН 130 и.о. н.о. н о.

Изоцитратлиаза н.о 0 0 0

Малатсинтаза н.о 20 58 12

Глутаматдегидрогеназа НАДН 28 8 8 0

НАДФН 0 0 0 0

Глутаматсинтаза НАДН 10 н.о. 84 33

НАДФН 0 н.о. 127 0

Глутаминсинтетаза Мпг\ АТФ 23 н.о. 83 92

При отсутствии у ацидофильных метаногрофов гексокиназы, поставщиком Сб-фосфосахаров для этих реакций, возможно является цикл Кальвина, гены ключевых ферментов которого сЪЪЬ найдены у Me. acldiphila (Спиридонова с соавт., 2005). Метаболические особенности ацидофильных метаногрофов являются предметом наших дальнейших совместных исследований в связи с недавно обнаруженной способностью бактерий рода Methylocella расти на полиуглеродных субстратах (Dedysh et al., 2005; Theisen et al., 2005).

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* j БИБЛИОТЕКА (

о» ш —* ;

. чщТЪг

33. Метанотрофы почв Северной тайги и Субарктической тундры Россин. Образцы почв Северной тайги и Субарктической тундры, взятые с глубины 5-15 или 40-50 см, обладали высокой метанокисляющей активностью (до 35 нчоль/г почвы в день) в диапазоне температур от +4 до +22°С [18]. Скорости окисления и ассимиляции 14С-метана зависели от температуры инкубации и были максимальными при 15°С (рис. 7). Следовательно, метанотрофные сообщества представлены умеренно психрофильными и психроактивными формами.

г почвы • сут. г почвы • сут.

37 44 45 70 71 76 204 207211 27 37 44 45 70 71 76 204 207211

» образца № обра«ца

гпочвы-сут. 15 С г почвы-чл. 22°С

27 37 44 45 70 71 76 204 207211 27 37 44 45 70 71 76 204 207 211

№ образца Мгобразца

Рис. 7. Скорости окисления я ассимиляции 14С-метана образцами почв Северной тайтн (№ 27,37,44,45,70,71,76) и Субарктической тундры (№ 204,207,211) Россия.

Для всех исследованных нами почв получены положительные результаты амплификации генов вММО, мММО и МДГ. С использованием группоспецифичных праймеров проведен качественный ПЦР-анализ структуры метанотрофных популяций этих экосистем. Метанотрофные бактерии представлены преимущественно родами I морфотипа: МеЛу1оЬас1ег, Ме!ку1отопаз, Ме()гу1о$рНаега и \-fethylom¡сгоЫит В ряде образцов обнаружены метанотрофы II морфотипа, которые близки, но не идентичны представителям Ме!Ьу1о51пш/Ме1Иу1осу5Ш. Следовательно, выделение чистых культур метанотрофов холодных экосистем может привести к обнаружению новых таксонов этих бактерий.

фрагменты, амплифицированные из образца 40-50 с использованием праймерной системы 16ИгКИА27}/МЫ007г, были выделены и частично секвенированы. Филогенетический анализ выявил их принадлежность к роду Ме1Иу1откгоЫит, причем наиболее близкими оказались последовательности, полученные из образцов ила ряда озер Северной Америки [18].

3.4. Метанотрофы многолетнемерзлых пород. Область вечной мерзлоты занимает примерно две треп» территории России. В мерзлых породах присутствуют углеродсодержащие газы - СН4 и С02, которые принято считать результатом предшествовавшей замерзанию микробиологической активности. Приоритетными исследованиями группы ДА Гиличинского (УогоЬуоуа ег а1, 1997) установлено, что тонкодисперсные мерзлые породы являются своеобразными природными хранилищами жизнеспособных аэробных и анаэробных микробных сообществ, причем общая численность микроорганизмов в мерзлых отложениях лишь на один порядок величин меньше, чем в тундровых почвах. Однако сведения о возможности существования метанотрофов и их метаболической активности в вечномерзлых грунтах отсутствовали в доступной литературе до начала наших исследований.

Анализ бразцов многолетнемерзлых пород, различающихся глубиной залегания (1-50 м) и временем нахождения в мерзлоте (10-200 тыс. до 3 млн лет), показал, что они окисляли МСН4 до |4С02 и включали радиоуглерод в кислотоустойчивые продукты при температурах инкубации +5°С и -5°С (табл.14). ПЦР-анализом тотальной ДНК с использованием праймеров на гены ртоА и ттоХ выявлено присутствие генов мММО во всех исследованных пробах, за исключением пород, находившихся в мерзлом состоянии в течение 1,8-3 млн лет. Это, вероятно, связано с существенно меньшей численностью в них метанотрофных бактерий. Соответствующие продукты ПЦР-амплификащш были получены после инкубации древних образцов в течение 40 дней в аэробных условиях в присутствии метана при +5°С. Использованием для ПЦР-амплификации праймеров на известные роды метанотрофных бактерий определен качественный состав метанотрофных популяций. Почти во всех исследованных пластах выявлены положительные сигналы, специфичные для родов Ме1Иу1откгоЫит, М&Иу1оЬас1ег и МыЬуЬтопаь. Напротив, представители Ме1ку1о$тш и \iethyIocystis присутствовали лишь в нескольких образцах, что было несколько неожиданным, поскольку эти бактерии считаются наиболее жизнеспособными среди известных метанотрофов. Использование генетического маркера на род Ме1ку!осе1!а, дало положительный результат для 9 из 15 проверенных образцов Лишь с одной из тестированных проб амплифицировался праймер, специфичный для метанотрофов рода МегЬуЬьрЪаега, Получен также положительный результат ПЦР-амплификации с использованием молекулярных маркеров на ДНК, специфичную для Маку1ососст и Ме1Ну1оса1с1ит [19].

Итак, получены первые свидетельства того, что многолетнемерзлые породы обладают достаточно широким разнообразием метанотрофов, поскольку в них обнаружены гены, специфичные для практически всех известных в настоящее время родов метанотрофных бактерий, включая

Таблица 14. Потребление метана в образцах проб вечномерзлых отложений Северо-Восточной Сибири в их ПЦР-аналнз

Сква- Глу- Возраст Окисление/ассимилзщия ПЦР-амплификация с группоспецифичными праймерами

жина бина (тыс. лет) СН»,(пмодь/г почвы

№ (и) в день)

+5°С -5°С Methylo- Methylo- Methylo- Methylo- Metbylo- Methylo- Methyloceila Methylosinus/

microbium monas coccus bacter sphaerae caldum Metkylocystis

453/98 0.4 до 1 398/9 238/51 - + + + - + + -

6/91 4.8 10 12/0 н.о. + - - + - + + -

» 6.3 10 0/0 Я.О. + - - + - + - +

» 11.8 10 4/0 46/0 + + - + - + + -

7/90 2.3 15-20 2/0 0/0 - - + - - + + -

17/91 12.3 30 32/2 и.о. + - + + - -+ - -

14/99 8.4 20-30 30/2 30/3 + + + + + + - +

» 26.7 100 61/15 27/3 + + + + - + + -

15/99 6.7 20-30 6/0 0« + + + + - - + -

» 14.2 100 8/0 11/0 + + + + - + - -

» 23.4 100 12/0 5/0 + + + + - + - -

16/99 10.9 100 5/0 0/0 + + + + - - + +

1/98 16 1800-3000 н.о. 0/0 + - + + - - + +

2/94 32 1800-3000 Н.О. 35/0 + - + + - - - -

» 50.3 1800-3000 и.о. 38/0 + - + + - - + -

Таблица 15. Основные свойства непрофильных ■ пааротолерантиых метанотрофов

Свойства МеЛу1оЬас1ег Methylosphaera МеЛу1отопт МеЛу1оЫ1а МеЛу1осе!1а МеАу1осе11а Methylocapsa

рхусМгор/Шш hansoni зсатИявпса раЬаЩя silvestris ШпЛпе acidiphüa

(Омельченко с (Bowman et •!., (Ка1ушЬпауа Л (БедузЬ Л а1., (ОипйеМ е! а., (ОебувЬ е1 а1., (Dedysh et al., 2002)

соалт. 1996) 1997) а1,1999) 2000) 2003) 2004)

Морфология Кокки Кокки Овоиды Биполярные палочки Папочки Искривленные палочки Агрегированные хокки

Размер, мкм 1.0x1.7 1.5x2.0 0.6-0.8x1.7 0.6-1.0x2.0 0.6-0.8 х 1.2-1.5 0.6-1.0x1.0-1.5 0.7-1.0* 1.2

Подвижность + - + - - - +

Внутрипитоплазмати- Стопки н.о. Стопки Сферические Сферические Сферические Слои везикул,

ческие мембраны везикулярных дисков везикулярных дисков везижупы везикулы везикулы параллельные одной из сторон ЦМ

Покоящаяся стадия - - - Экзоспоры - н.о. Цисты типа 'Azotobacter'

Диапазон рН (оптимум) 5.9-7.6 (6.7) н.о. 5.0-9.0 (7.5) 4.5-7.0 (5.0-5.5) 4.5-7.0(5.5) 4.2-7.5(55-6.0) 4.2-7.2 (5.0-5.5)

Температуры роста 1-20 0-20 5-30 10-25 4-30 5-30 10-30

(оптимум), ТС (6-10) (10-13) (15) (15) (15-25) (15) (15)

Зависимость от ИаС! н.о. Морская вода До 5% - - - -

Форма ММО н.о. Мембранная Мембранная Растворимая Растворимая Растворимая Мембранная

Путь С) ассимиляции РМФ РМФ РМФ Серивовый Сериновый Сериновый Сериновый

Фиксация N2 н.о. + - + + + +

Ассимиляция и.о. н.о. ГДГ, ГС / ТОГАТ ГС/ТОГАТ ГС/ТОГАТ ГС/ТОГАТ ГС/ТОГАТ

Основные фосфолипиды н.о. н.о. ФЭА, ФГ ФМЭА н.о. н.о. ФГ

Основные жирные 16:1 16:1а>8с, 16:1<в7с и.о. 18:1<о7с, 16:1, 18:1<в7с, 18:1<в7с, 16:1, 18:1ш7с, 16:1,

кислота 16:0 16:1«7с, 16:0, 17:0,18:0,19:0 16:0 16:0

ДНК, Г+Ц, моль% 45.6 43-46 53.8 60-63 60 60-63 63

Подкласс С а т т а р г о t е о Ь а с t е г I а Alfaproteobacterla

Сокращения ■ "РМФ - рибулозомонофосфет, ГДГ - глутаыаггдегчцрогеназа; ГС / ГОГАТ - глугамияекнтегаза / таутамин-оксоглутаратамияотрансфераза; ФЭА - фосфатидилэтаноламин; ФГ - фосфатидилглицерин; ФМЭА - фосфатидилметнлэтаноламив; ЦМ - цитоппазыатическая мембрана.

мезофильные, психрофильные/психротрофные и термотолерантные формы. Даже после длительного пребывания в мерзлоте (от ! тыс до 1.8-3 млн лет) метанотрофы способны окислять и ассимилировать метан, в том числе при отрицательной температуре, поэтому являются активными в вечномерзлых экосистемах В случае глобального потепления климата и оттаивания мерзлоты жизнеспособные микробные сообщества могут участвовать в метановом цикле.

3.5. Метанотрофы глубинных залежей гранитов. Глубинные твердые породы, среди которых наиболее распространены граниты, содержат грунтовые воды с концентрациями метана, достигающими 18 мМ (Рес1ег5еп, 1997) Повышающаяся с глубиной радиация может приводить к появлению молекулярного кислорода вследствие радиолиза воды, создавая условия для существования метанотрофов, что, однако, нуждалось в экспериментальной проверке.

Присутствие метанотрофов в грунтовых водах на глубине от 68 до 450 м ниже уровня моря выявлено нами ПЦР-анализом и радиоизотопным методом (рис. 8) Потенциальная активность потребления метана в анаэробных подземных водах на два порядка ниже, чем в наземных водных экосистемах.

KA300S

HD0025

68

179

300

400

420

Щ окисление Q ассимиляция

Рис. 8. Потенциальные активности потребления |4С-метана в образцах грунтовых вод туннеля Aspo (Швеция).

Из образцов глубинных грунтовых вод гранитов туннеля Aspo (Hard Rock Laboratory, Швеция), впервые выделены накопительные и чистые культуры метанотрофов. Методом ПЦР с использованием выделенной из грунтовых вод тотальной ДНК, были амплифицированы фрагменты 'функциональных' и филогенетических генов, специфичных для метанотрофных бактерий [И]. В

38

большинстве образцов присутствовали представители родов Methylomonas, Melhylobacter, а в накопительных культурах - Methylocystis Выделен в чистую культуру подвижный розовоокрашенный облигатный метанотроф I морфотипа, растущий в диапазоне 5-30°С, оптимально при 15°С (табл 15), идентифицирований как новый вид Methylomonas scandinavica sp. nov. В отличие от других метанотрофов рода Methylomonas, этот вид не способен к росту при 37°С и имеет низкий уровень сходства последовательности гена 16S рРНК с Methylomonas methanica (94%).

Таким образом, подземная биосфера является источником новых метанотрофных бактерий Поглощая кислород, метанотрофы могут быть ответственны за анаэробиоз в подземных экосистемах Более того, преобразуя метан, имеющий главным образом геохимическое происхождение (Barker et al., 1982; Wallin et al., 1995), в доступную для других микроорганизмов (неорганическую форму, метанотрофы продуктами своей жизнедеятельности поддерживают существование подземных микробных сообществ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований дают основание считать, что аэробные метанотрофные бактерии являются активным компонентом микробных сообществ, населяющих (гипер)соленые и щелочные водоемы, горячие источники, водоносные слои глубинных залежей гранитов, многолетнемерзлотные грунты, в том числе возрастом около 3 млн. лет. Эти экстремальные экосистемы следует рассматривать как важный ресурс новых метанотрофных бактерий, представляющих новые таксоны а- и у-подклассов протеобактерий

Экстремофильные/экстремотолерантные метанотрофы приобрели или сохранили в процессе эволюции специфические структурно-функциональные и физиолого-биохимические свойства, позволяющие этим бактериям приспосабливаться к условиям соответствующих экстремальных биотопов. Метанотрофы, реализуя общие для бактерий стратегии адаптации, имеют специфические черты, обусловленные особенностями их метаболизма.

Основными итогами данной работы являются доказательство таксономического и структурно-функционального многообразия метанотрофов, а также создание коллекции охарактеризованных экстремофильных/толерантных метанотрофов [33-38]. В свете новых данных, полученных нами и коллегами, необходимы дальнейшие исследования необычной биологии этих бактерий, перспективных для решения таких важных вопросов, как механизмы регуляции ММО и свойства других ферментов Сi-метаболизма, причины и молекулярные основы облигатной метанотрофии, поскольку именно экстремальные условия способствуют наиболее полному проявлению метаболического потенциала этих бактерий. Следует признать, что мы находимся лишь в середине пути к пониманию особенностей метаболической организации облигатных и факультативных метанотрофов Необходимы новые подходы для расшифровки молекулярных механизмов адаптации метанотрофов к широкому спектру факторов, ограничивающих их рос г и метаболизм. Эти фундаментальные исследования невозможны без детально охарактеризованных чистых культур и должны базироваться на геномных и протеомных технологиях, активно

используемых современным поколением микробиологов и генетиков на примере Methylococcus capsulatus Bath (Ward et al., 2004; Kao et al., 2004). Экстремофильные/толерантные метанотрофы представляют несомненный интерес как модельные объекты для астробиологии, поскольку метан, метанол и формальдегид, являясь компонентами космической и земной криптосферы, могли способствовать возникновению, распространению и эволюции внеземных ферм жизни, включая анаэробных и аэробных метилотрофов. Наконец, благодаря способности к аэробной деградации различных поллютантов и синтезу биопротекоров (эктоин) в экстремальных условиях, метанотрофы приобретают все большее значение для биотехнологии и глобальной экологии [35J.

ВЫВОДЫ

1 Методами классической и молекулярной микробиологии доказано присутствие и активная жизнедеятельность метанотрофных сообществ в различных экстремальных биотопах с высокими и низкими значениями pH, солености и температуры.

2. Показано, что в соленых и содовых озерах Крыма, Центральной и Юго-Восточной Азии, Америки и Африки преобладают гало(алкало)фильных метанотрофы I типа, классифицированные как новые виды рода Methylomicrobium- М alcaliphilum, М buryatense, М modestohalophilum Они характеризуются повышенными скоростями потребления метана и реализуют различные стратегии осмоадаптации: образуют поверхностные гликопротеиновые слои (S-слои) р2 или рб симметрии, варьируют жирнокислотный и липидный состав мембран, аккумулируют в клетках ионы калия и органические осмопротекторы - эктоин, глутамат и сахарозу.

4. Впервые определены пути биосинтеза основных осмопротекторов, а также нуклеотидные последовательности генов, кодирующих ферменты синтеза эктоина: диаминобутират(ДАБ) ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (eclB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартокиназу (ask). Обнаружены различия в организации эктоинового кластера у гапотолерантных метанотрофов М. kenieme AMOl (ectABC) и М alcaliphilum 20Z (ectABCask). Дополнительное присутствие гена аслартокиназы (ask) коррелирует с повышенным содержанием эктоина в клетках и большей солеустойчивостью метанотрофов. Клонированием и экспрессией гена ectA из Mm. alcaliphilum 20Z в Escherichia coli впервые получен гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы, выявлена регуляция активности фермента уровнями АТФ, NaCl и KCl

5. Выделен и охарактеризован новый умеренно термофильный галотолерантный метанотроф Methylothermus thermalis gen. nov sp. nov., реализующий рибулозомонофосфатный (РМФ) цикл Для новых изолятов умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum (Н-11 и 0-12) характерны галотолерантность, качественная и количественная зависимость состава жирных кислот от температуры роста, одновременное функционирование основного РМФ и дополнительных рибулозобисфосфатного и серинового путей. Показано, что причиной полиморфизма метанотрофов рода Methylocaldum является температурный стресс, который снимается в присутствии NaCl.

6. Изученные метанотрофные сообщества почв Северной тайги и Субарктической тундры представлены преимущественно психрофильными и психроактивными формами. Напротив, в многолетнемерзлых породах Колымской низменности найдены гены метанмонооксигеназы и 168 рРНК, специфичные для большинства известных таксонов метанотрофных бактерий Обнаружено, что даже после длительного пребывания в мерзлоте (от 1 тыс до 1.8-3 млн лет) метанотрофы способны окислять и ассимилировать метан, в том числе при отрицательной температуре (-5°С) Особенностью метаболизма психроактивных ацидофильных метанотрофов родов Ме1Ъу1осе11а и МеЛуЬсарэа является реализация серинового пути и окислительного пентозофосфатного цикла, в отличие от психрофильного метанотрофа 1 типа \iethylobacler рьусУигорЫш с РМФ-циклом С,-ассимиляции.

7. Установлено, что грунтовые воды глубинных залежей грантов (68-460 м ниже уровня моря) являются ресурсом новых метанотрофных бактерий, адаптированных к низкотемпературным анаэробным условиям подземных экосистем. Выделен психроактивный метанотроф, классифицированный как новый вид Ме1ку1отопа$ зсатИпачка эр поу.

8. Полученные результаты свидетельствуют о таксономическом и структурно-функциональном многообразии экстремофильных/толерантных метанотрофов и служат основой для расширения коллекционного фонда аэробных метилотрофов, разработки новых способов получения целевых метаболитов (эктоин) и биоремедиации экстремальных экосистем от поллютантов.

Список публикаций по теме диссертации Экспериментальные статьи:

1. Хмеленииа В.Н., Гаазов Р.Р., Сузина Н.Е., Доронина Н.В., Мшенский Ю.Н., Троценко Ю.А.

Синтез полисахаридов Methylococcus capsulatus в различных условиях культивирования Микробиология. 1992. Т. 61. № 3. С. 404-410.

2. Омельченко М.В., Васильева JI.B., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофильного метанотрофа Микробиология. 1993 Т. 62. № 5 С. 849-854.

3. Хмеленина В.Н., Бесчестный А.П., Гаязов Р.Р., Троценко Ю.А. Влияние пирофосфата на рост метаболизм Methylomonas methanica Микробиология. 1994. V. 63. Jfe 2. С. 188-193.

4. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Метанотрофные бактерии соленых водоемов Украины и Тувы. Микробйология. 1996. Т. 65. № 5.С. 736-743.

5. Trotoenko У.А., Khmeleniiia V.N., Beschastny А.Р. The Ribulose Monophosphate (Quayle) cycle. News and Views. Proc. Int. Symp. Microbial Growth on C| compounds. Eds: M.E. Lidstrom, R.Tabita, Kluwer Publishers. 1996. P. 4-8.

6. Пименов H.B., Русанов И.И., Поглазова М.И., Митюшина Л.Б., Сорокин Д.Ю., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Бактериальные обрастания на коралловидных постройках в местах выхода газовыделений в Черном море. Микробиология. 1997. Т. 66. № 3 С. 422-428

7. Хмеленина В.Н., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. Физиолого-биохимические особенности галоалкалотолерантного метанотрофа. Микробиология 1997. Т. 66 № 4 С. 447-453.

8 Khmelenina V.I., Kalyu/hnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva soda lakes. Current Microbiol 1997. V. 35. P. 257-261.

9. Калюжвая М.Г., Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Баранова С.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Новый умеренно галофильный метанотроф рода Methylobacter. Микробиология. 1998. Т. 67. №4 С. 527-534.

10. Калюжвая М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья. Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 689-697.

11. Kalyuzhnaya М., Khmelenina V.N., Kotelnikova S., Holmquist L., Pedersen K., Trotsenko Y.A.

Methylomonas scandinavica sp. nov., a new methanotrophic psychrotrophic bacterium isolated from deep igneous rock ground water of Sweden Syst. Appl Microbiol. 1999 V. 22. P. 565-572.

12. Kbmelenina V.N., Kalyuzhnaya M., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Gottschalk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch. Microbiol. 1999. V. 172. № 5. P. 321-329.

13. Хмеленина B.H., Сахаровский В.Г., Решетников A.C., Троценко Ю.А. Синтез органических осмопротекторов i алофильными и алкалофильными метанотрофами. Микробиология. 2000. Т. 69 №4. С. 465-470.

14. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Кал южная М.Г., Троценко Ю.А. Потенциальная активность окисления метана и аммония метанотрофными сообществами содовых озер Южного Забайкалья. Микробиология. 2000. Т. 69. № 4 С. 553-558.

15. Dedysh S.N., Liesack W., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Abing A.M., Panikov N.S., Tiedje J.M. Methylocella palustru gen. nov, sp. nov., a new methane-oxidizing acidophilic bacterium from peat bogs representing a novel sub-type of serine pathway methanotrophs Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V 50. P.955-969.

16. Kalyuzhnaya M.G., Khmelenina V.N., Eshinimaev B.C., Suzina N.E., Nikitin D.N., Solonin A.P., Lin J.-R., McDonald I., Murrell C., Trotsenko Y.A. Taxonomic characterization of new alkaliphilic and alkalitolerant methanotrophs from soda lakes of the Southeastern Transbaikal region and description of Methylomicrobium buryatense sp. nov Syst. Appl. Microbiol. 2001. V. 24. № 2. P. 166-176.

17. Ешииимаев Б.Ц., Хмеленина B.H., Сахаровский В.Г., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Физиолого-биохимические и цитологические особенности галоалкало-толерантного метанотрофа при росте на метаноле. Микробиология. 2002. Т. 71. № 5 с. 690 - 700.

18. Калюжная М.Г., Макутииа В.А., Русакова Т.Г., Никитин Д.В., Хмеленина В.Н., Дмитриев В.В., Троценко Ю.А. Метанотрофные сообщества почв северной тайги и субарктической тундры России. Микробиология. 2002. Т. 71. № 2 С. 264 - 271.

19. Хмеленина В.Н., Макутина В.А., Калюжная MX., Ривкина Е.М., Гиличинский Д.А., Троценко Ю.А. Обнаружение жизнеспособных метанотрофных бактерий в многолетнемерзлых осадочных породах Северо-Восточной Сибири. Доклады Академии Наук. 2002. Т. 384. № 2. С. 283-285.

20. Пименов Н.В., Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А., Митюшина Л.Б. Потребление метана и углекислоты симбиотрофными бактериями в жабрах митилид (Bathymodiolus) гидротермальных полей Рейнбоу и Логачев Срединно-Атлангического хребта. Микробиология 2002. Т.71. № 5. С. 681- 689.

21. Dedysh S.N., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Liesack W., Tiedje J.M.

Methylocapsa acidiphila gen nov. sp. nov., a novel methane-oxidizing and dinitrogen-fixing acidiphilic bacterium from Sphagnum bog Int T Svst Evo! Microbiol 2002 V. 52. Xs I. P. 251-261.

22. Dunlield P., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. Methylocella silvestris sp. nov. a novel methanotrophic bacterium isolated from an acidic forest cambisol. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. № 3 P. 1231-1239.

23. Dedysh S.N., Berestovskaya Y.Y., Vasylieva L.V., Belova S.E., Belova S.E., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Liesack W. Methylocella tundrae sp. nov., a novel methanotrophic bacterium from acidic peatlands of tundra, int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. 52. №1. P. 151-156.

24. Sorokin D.Y., Gorlenko M.V., Namsaraev B.B., Namsaraev Z.B., Tourova T.P., Lysenko A.M., Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A., Kuenen G.J. Microbial communities of the northem-east Mongolian soda lakes. Hydrobiology. 2004. V. 522. P. 235-248.

25. Решетников A.C., Хмеленина B.H., Троценко Ю.А. Обнаружение генов биосинтеза эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий. Доклады Академии Наук. 2004. Т. 396. №6. С. 831-834.

26. Ешвннмаев Б.Ц., Медведкова К.А., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Осипов Г.О., Лысенко А.М., Троценко Ю.А. Новые термофильные метанотрофы рода Methylocaldum. Микробиология. 2004. Т. 73. №4. С. 530-539.

27. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Mustakhimov. I.I., Ryzhmanova Y.V, Trotsenko Y.A. Genes and enzymes of ectoine biosynthesisin the haloalkaliphilic obligate methanotroph "Methylomicrobium alcaliphilum 20Z". In: Adaptation to Life at High Salt Concentration in Archae, Bacteria and Eukarya. N Gunde-Cimerman, A. Oren, A. Plemenitas (Eds.) Springer Science + Business Media B.V. Dordrecht, The Netherlands. 2005, V.9. P. 329-338.

28. Решетников A.C., Хмеленина B.H., Мустахимов И.И., Троденко Ю.А. Клонирование, очистка и характеристика диаминобутиратацетилтрансферазы галотолерантного метанотрофа Methylomicrobmm alcaliphilum 20Z. Биохимия. 2005. Т. 70. №8. С. 1063-1069.

29. Dedysh S.N. Smirnova K.V., Khmelenina V.N.,Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dunfield P. Methylotrophic autotrophy in Beijerincha mobilis. J. Bacteriol. 2005. V.187. P. 3884-3888.

30 Tsnbota J., Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Methylothermus thermalis gen nov, sp. nov. - a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1877-1884.

31. Гайиутдииова E.A., Ешинимаев Б.Ц., Цыренжапова И .С., Дагурова О.П., Сузина Н.Е., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Аэробные метанотрофные сообщества донных осадков озера Байкал. Микробиология. 2005. Т. 74. Л» 4. С. 562-571.

32. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the ectoine biosynthesis genes of haloalkalitolerant obligate methanotroph "Methylomicrobmm alcaliphilum 20Z". Arch. Microbiol 2006. V. 184. №5. P. 286-296

Обзоры:

33. Trotsenko Y.A., Khmelenina V,N. Biology of extremophilic and cxtremotolerant methanotrophs Arch. Microbiol. 2002. V. 177. № 1. P. 123-131.

34. Троценко Ю.А., Хмеленина B.H. Особенности биологии галоалкалофильных метанотрофов. Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 149-159.

35. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н. Биотехнологический потенциал аэробных метилотрофных бактерий: настоящее и будущее. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. №5. С. 495-503.

36. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. Aerobic methanotrophic bacteria of cold ecosystems FEMS Microbiol. Ecol. 2005.V. 53. P. 15-26.

Главы в сборнике:

37. Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Особенности метаболизма облигатных метанотрофов. В книге: Труды Института микробиологии им СН Виноградского, выпуск 13. Под ред. В.Ф Гальченко М. Наука. 2006, С. 24-44.

38. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников А.С., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем. В книге: Труды Института микробиоло! ии им. СII. Виноградского, выпуск 13. Под ред. В.Ф. Гальченко. М. Наука. 2006, С. 147-171.

Тезисы докладов:

39. Цветкова MX., Хмеленина В.Н., Соколов А.П., Троценко Ю.А. Аэробные мстилотрофы (гипер)соленых экосистем. Тезисы I конф. памяти академика Е.Н Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы". Москва. МГУ. 1996. с.94.

40. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N., Kalyozhnaya M.G., Sokolov A.P. Osmoadaptation in aerobic haloalkalotolerant methanotrophic bacteria Abstr European Conf. "Microbial response to stress: what's new and how can it be applied?" Sesimbra, Portugal. 1997. p.105

41. Trotsenko Y., Khmelenina V., Doronina N.t Kalyuzbnaya M., Sokolov A. Isolation and characterisation of moderately halophilic aerobic methylotrophs INTAS Sympos "Microbial ecology and biotechnology with reflection on extremophiles". Moscow. 1997. p 12.

42. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N., Kaluyzhnaya M.G., Dedysh S.N., Panikov N.S. Isolation and characterization of alkaliphilic and acidophilic methanotrophs Abstr 8th European Congress on Biotechnology. Budapest. 1997. M02318.

43 Kalynzhnaya M.G., Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Suzina N.E.,Trotsenko Y.A. The S layers of haloalkaliphilic methanotroph Methylomicrobium alcaliphilus 20Z: isolation and structure-function characterization. Abstr. Int. symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Pushchino. 2000. p.66.

44. Калюжная М.Г., Решетников A.C., Ешинимаев Б.Ц., Петрова О.В., Каинов Д.Е. Новые (гало)алкалофильные метанотрофы: фнзиолого-биохимические особенности и таксономия Тезисы конф. «Горизонты физико-химической биологии». Пущино. 2000. с.200.

45. Калюжная MX., Хмелеяина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников А.С., Мезюха У.А., Троценко Ю.А. Особенности биологии метанотрофных бактерий содовых озер Юго-Восточной Сибири и Монголии. Тезисы II конф. памяти акад. Е Н. Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы". Москва, МГУ. 2000. с.95.

46. Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko V.A. Cytobiochemical peculiarities of moderately haloalkaliphilic methanotroph Methylomicrobium buryatense 5B grown at high methanol concentrations. Abstr.l" FEMS congress of Furopean microbiologists Slovenia, Ljubljana June 29-July 3,2003. p 328.

47. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Genes and enzymes of ectoine biosynthesis in halophilic/tolerant methanotrophs. Abstr. Iм FEMS congress of European microbiologists. Slovenia, Ljubljana. June 29-July 3, 2003 p. 346-347

48. Хмеленина B.H., Троценко Ю.А. Метанотрофные сообщества мерзлых грунтов СевероВосточной Сибири. Тезисы докладов 2-й Международной конференции «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии» Пущино, 16-20 июня 2003 г. С. 119.

49 Trotsenko Y.A., Smirnova K.V., Khmelenina V.N. Diversity and viability of methanotrophic communities in Russian permafrost soils. Abstr. Intern. Conf. on Arctic Microbiology. Rovaniemi, Finland.22-25.3 2004. p. 19.

50. Троценко Ю.А., Хмеленина B.H. Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем Автотрофные микроорганизмы. Тезисы докл. 5 конф. памяти академика Е.Н. Кондратьевой «Автотрофные микроорганизмы». Москва. МГУ 2005. с.94.

к исполнению 07/03/2006 Исполнено 09/03/2006

Заказ № 135 Тираж' 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробные метанотрофные бактерии экстремальных экосистем"

Актуальность проблемы.5

Состояние вопроса.6

Цель и задачи исследований.8

Научная новизна. 8

Практическая значимость работы.9

Апробация результатов.10

Публикации. 10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.12

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хмеленина, Валентина Николаевна

выводы

1. Методами классической и молекулярной микробиологии доказано присутствие и активная жизнедеятельность метанотрофных сообществ в различных экстремальных биотопах с высокими и низкими значениями pH, солености и температуры.

2. Показано, что в соленых и содовых озерах Крыма, Центральной и Юго-Восточной Азии, Америки и Африки преобладают гало(алкало)фильных метанотрофы I типа, классифицированные как новые виды рода Methylomicrobium: М. alcaliphilum, М. buryatense, М. modestohalophilum. Они характеризуются повышенными скоростями потребления метана и реализуют различные стратегии осмоадаптации: образуют поверхностные гликопротеиновые слои (S-слои) р2 или рб симметрии, варьируют жирнокислотный и липидный состав мембран, аккумулируют в клетках ионы калия и органические осмопротекторы - эктоин, глутамат и сахарозу.

3. Впервые определены пути биосинтеза основных осмопротекторов, а также нуклеотидные последовательности генов, кодирующих ферменты синтеза эктоина: диаминобутират(ДАБ) ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (ectB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартокиназу (ask). Обнаружены различия в организации эктоинового кластера у галотолерантных метанотрофов М. keniense AMOl (ectABC) и М. alcaliphilum 20Z (ectABCask). Дополнительное присутствие гена аспартокиназы (ask) коррелирует с повышенным содержанием эктоина в клетках и большей солеустойчивостью метанотрофов. Клонированием и экспрессией гена ectA из Mm. alcaliphilum 20Z в Escherichia coli впервые получен гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы, выявлена регуляция активности фермента уровнями АТФ, NaCl и KCl.

4. Выделен и охарактеризован новый умеренно термофильный галотолерантный метанотроф Methylothermus thermal is gen. no v. sp. nov., реализующий рибулозомонофосфатный (РМФ) цикл. Для новых изолятов умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum (Н-11 и 0-12) характерны галотолерантность, качественная и количественная зависимость состава жирных кислот от температуры роста, одновременное функционирование основного РМФ и дополнительных рибулозобисфосфатного и серинового путей. Показано, что причиной полиморфизма метанотрофов рода Methylocaldum является температурный стресс, который снимается в присутствии NaCl.

5. Изученные метанотрофные сообщества почв Северной тайги и Субарктической тундры представлены преимущественно психрофильными и психроактивными формами. Напротив, в многолетнемерзлых породах Колымской низменности найдены гены метанмонооксигеназы и 16S рРНК, специфичные для большинства известных таксонов метанотрофных бактерий. Обнаружено, что даже после длительного пребывания в мерзлоте (от 1 тыс до 1.8-3 млн лет) метанотрофы способны окислять и ассимилировать метан, в том числе при отрицательной температуре (-5°С). Особенностью метаболизма психроактивных ацидофильных метанотрофов родов Methylocella и Melhylocapsa является реализация серинового пути и окислительного пентозофосфатного цикла, в отличие от психрофильного метанотрофа I типа Methylobacter psychrophilus с РМФ-циклом С i-ассимиляции.

6. Установлено, что грунтовые воды глубинных залежей гранитов (68-460 м ниже уровня моря) являются ресурсом новых метанотрофных бактерий, адаптированных к низкотемпературным анаэробным условиям подземных экосистем. Выделен психроактивный метанотроф, классифицированный как новый вид Methylomonas scandinavica sp. nov.

7. Полученные результаты свидетельствуют о таксономическом и структурно-функциональном многообразии экстремофильных/толерантных метанотрофов и служат основой для расширения коллекционного фонда аэробных метилотрофов, разработки новых способов получения целевых метаболитов (эктоин) и биоремедиации экстремальных экосистем от поллютантов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований дают основание считать, что аэробные метанотрофные бактерии являются активным компонентом микробных сообществ, населяющих (гипер)соленые и щелочные водоемы, горячие источники, водоносные слои глубинных залежей гранитов, многолетнемерзлотные грунты, в том числе возрастом около 3 млн. лет. Эти экстремальные экосистемы следует рассматривать как важный ресурс новых метанотрофных бактерий, представляющих новые таксоны а- и у-подклассов протеобактерий.

Экстремофильные/экстремотолерантные метанотрофы приобрели или сохранили в процессе эволюции специфические структурно-функциональные и физиолого-биохимические свойства, позволяющие этим бактериям приспосабливаться к условиям соответствующих экстремальных биотопов. Метанотрофы, реализуя общие для бактерий стратегии адаптации, имеют специфические черты, обусловленные особенностями их метаболизма.

Основными итогами данной работы являются доказательство таксономического и структурно-функционального многообразия метанотрофов, а также создание коллекции охарактеризованных экстремофильных/толерантных метанотрофов. В свете новых данных, полученных нами и коллегами, необходимы дальнейшие исследования необычной биологии этих бактерий, перспективных для решения таких важных вопросов, как механизмы регуляции ММО и свойства других ферментов Ci-метаболизма, причины и молекулярные основы облигатной метанотрофии, поскольку именно экстремальные условия способствуют наиболее полному проявлению метаболического потенциала этих бактерий. Следует признать, что мы находимся лишь в середине пути к пониманию особенностей метаболической организации облигатных и факультативных метанотрофов. Необходимы новые подходы для расшифровки молекулярных механизмов адаптации метанотрофов к широкому спектру факторов, ограничивающих их рост и метаболизм. Эти фундаментальные исследования невозможны без детально охарактеризованных чистых культур и должны базироваться на геномных и протеомных технологиях, активно используемых современным поколением микробиологов и генетиков на примере Methylococcus capsulatus Bath (Ward et al., 2004; Kao et al., 2004). Экстремофильные/толерантные метанотрофы представляют несомненный интерес как модельные объекты для астробиологии, поскольку метан, метанол и формальдегид, являясь компонентами космической и земной криптосферы, могли способствовать возникновению, распространению и эволюции внеземных форм жизни, включая анаэробных и аэробных метилотрофов. Наконец, благодаря способности к аэробной деградации различных поллютантов и синтезу биопротекоров (эктоин) в экстремальных условиях, метанотрофы приобретают все большее значение для биотехнологии и глобальной экологии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хмеленина, Валентина Николаевна, Пущино

1. Андреев Л.В., Гальченко В.Ф. (1978) Жирнокислотный состав и идентификация метанотрофных бактерий. Доклады АН СССР. 239(5): 1465-1468.

2. Баснакьян И.А. (2003) Стресс у бактерий. Москва. «Медицина». 135 с.

3. Безрукова Л.В., Николенко Ю.И., Нестеров А.И., Гальченко В.Ф., Иванов М.В. (1983) Сравнительный серологический анализ метанотрофных бактерий. Микробиология. 52(5):800-805.

4. Беляев A.C., Черных H.A., Гальченко В.Ф., Иванов М.В. (1995) Детекция метилотрофов в природных образцах методом амплификации фрагмента moxF-гена. Микробиология. 64(6): 788-791.

5. Беляев С.С., Иванов М.В. (1975) Радиоизотопный метод определения интенсивности бактериального метанобразования. Микробиология. 44(4): 166-168.

6. Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Иванов М.В. (1975) Измерение скорости микробиологического метанокисления с использованием нСН4. Микробиология. 44(1): 542-545.

7. Берг И.А., Кеппен О.И., Красильникова E.H., Уголькова Н.В., Ивановский Р.Н. (2005) Углеродный метаболизм аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae. Микробиология. 47(3): 305-312.

8. Бесчастный А.П., Соколов А.П., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (1992) Очистка и некоторые свойства пирофосфат-зависимой фосфофруктокиназы облигатного метанотрофа Methylomonas methanica. Биохимия. 57(8):1215-1221.

9. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. (2002) Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий. Микробиология. 71(4):500-508.

10. Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю., Заварзин Г.А. (1999) Психрофильные ацидофильные метанотрофы из сфагнеты вечной мерзлоты. Доклады Академии Наук. 368(1):125-128.

11. И. Гальченко В.Ф. (1994) Сульфатредукция, метанобразование и метанокисление в различных водоемах Оазиса Бангер Хиллс, Антарктида. Микробиология. 63(4):683-698.

12. Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. М., ГЕОС. 500 с.

13. Гальченко В.Ф. (2003) Криптобиосфера Марса. Авиакосмическая и экологическая медицина. 37:15-23.

14. Гальченко В.Ф. (1995) Бактериальный цикл метана в морских экосистемах. Природа. 6: 35-48.

15. Гальченко В.Ф., Андреев JI.B., Троценко Ю.А. (1986а) Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино, Изд.НЦБИ. 96 с.

16. Гальченко В.Ф., Большиянов Д.Ю., Черных Н.А., Андерсен Д. (1995) Бактериальные процессы фотосинтеза и темновой ассимиляции углекислоты в озерах Оазиса Бангер Хиллс, Восточная Антарктида. Микробиология. 64(6):833-844.

17. Гальченко В.Ф., Галкин С.В., Леин АЛО., Москалев Л.И., Иванов М.В. (1988а) Роль бактерий-симбионтов в питании беспозвоночных из районов активных подводных гидротерм. Океанология. 28:1020-1031.

18. Гальченко В.Ф., Горлатов С.Н. и Токарев В.Г. (19866) Микробиологическое окисление метана в осадках Берингова моря. Микробиология. 55(4): 669-673.

19. Гальченко В.Ф., Дулов Л.Е., Крамер Б., Конова Н.И., Барышева С.В. (2001) Биогеохимические процессы цикла метана в почвах, болотах и озерах Западной Сибири. Микробиология. 70(2): 215-225.

20. Гальченко В.Ф., Леин А.Ю., Галимов Е.М., Иванов М.В. (19886) Метанотрофные бактерии-симбионты как первичное звено пищевой цепи в океане. Доклады АН СССР. 300(3):717-720.

21. Гальченко В.Ф., Намсараев Б.Б., Мшенский Ю.Н., Нестеров А.И., Иванов М.В. (1984) Рост метанотрофных бактерий в присутствии метанола. Микробиология. 53(5):724-730.

22. Гальченко В.Ф., Нестеров А.И., Иванов М.В. (1982) Содержание белка и аминокислот в биомассе метанотрофных бактерий. Доклады АН СССР. 264(2): 494496.

23. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1977) Выделение и свойства новых штаммов облигатных метанотрофов. Микробиология. 46(5): 890897.

24. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Тюрин B.C., Троценко Ю.А. (1975) Выделение чистых культур метанотрофов и их свойства. Микробиология. 44(5): 844-850.

25. Гаязов P.P., Четина Е.В., Мшенский Ю.Н., Троценко Ю.А. (1990) Физиологические и цитологические особенности Methylomonas methanica при росте на метане в присутствии метанола. Прикл. биохимия и микробиол. 26(3): 394-398.

26. Григорян А.Н., Горская J1.A. (1975) Биосинтез на природном газе. Обзор. Главное управление микробиологической промышленности при СМ СССР. М. 101 с.

27. Гринберг Т.А. (1984) Образование и природа пигментов Methylomonas rubra. Микробиол. журнал. 46(6): 69-71.

28. Грищук Ю.В., Мунтян М.С., Попова И.В., Сорокин Д.Ю. (2003) Транспорт ионов, сопряженный с работой терминальной оксидазы экстремально щелочелюбивой солеустойчивой бактерии рода Thioalkalovibrio. Биохимия. 68(4): 477-483.

29. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова A.B., Заварзин Д.Г., Жилина Т.Н. (1999) Активность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья. Микробиология. 68(5): 664-670.

30. Дедыш С.Н. (2002) Ацидофильные метанотрофы. Микробиология. 71(6): 741-754.

31. Дедыш С.Н. (2006) Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов. В книге: Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, выпуск 13. Под ред. В.Ф. Гальченко. Москва. Наука.

32. Дибров П.А., Костырко В.А., Лазарева P.JI., Скулачев В.П., Смирнова И.А. (1987) Роль ионов Na+ в дыхании, образовании мембранного потенциала и движении морской щелочеустойчивой бактерии Vibrio alginilyticus. Биохимия. 52(1): 15-23.

33. Доронина Н.В., Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. (1988) Новые виды ограниченно факультативных метилотрофов. 57(5): 828-834.

34. Ермилова Е.В., Залуцкая Ж.М., Лапина Т.В. (2004) Подвижность и поведение микрооганизмов. Т.1.170с.

35. Заварзин Г. А. (1984) Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука. 199с.

36. Заварзин Г.А. (1993) Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты. Микробиология. 62(5): 789800.

37. Заварзин Г.А. (1995) Круговорот метана в экосистемах. Природа. 6: 3-14.

38. Заварзин Г.А. (1997) Эмиссия метана с территории России. Микробиология. 66(5): 669673.

39. Заварзин Г.А., Жилина Т., Кевбрин В.В. (1999) Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие. Микробиология. 68(5): 579-599.

40. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. (1996) Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы. Микробиология. 65(4) 546-553.

41. Иванов М.В., Нестеров А.И., Намсараев Б.Б., Гальченко В.Ф., Назаренко A.B. (1978) Распространение и геохимическая деятельность метанотрофных бактерий в водах угольных шахт. Микробиология. 47(1): 489-494.

42. Исаченко Б.Л. (1951) Хлористые, сульфатные и содовые озера Кулундинской степи и биогенные процессы в них. Избранные труды. М.-Л.: Издательство АН СССР. 143-162.

43. Кашнер Д. (1981) Жизнь микроорганизмов при высоких концентрациях солей и растворенных веществ. Сб. «Жизнь микробов в экстремальных условиях». Под. Ред. Д. Кашнера. Москва. С. 365-425.

44. Кравченко И.К., Быкова С.А. (2004) Окисление атмосферного метана микроорганизмами аэробных почв. В книге: Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, выпуск 12. Под ред. В.Ф. Гальченко. М. Наука. С. 235-248.

45. Лось Д.А. (2005) Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестник Российской Академии Наук. 75(4): 338-345.

46. Лысенко A.M., Гальченко В.Ф., Черных H.A. (1988) Таксономическое изучение облигатных метанотрофных бактерий методом ДНК-ДНК гибридизации. Микробиология. 57(5): 816-822.

47. Мапашенко Ю.Р., Квасников Е.И., Романовская В.А., Богаченко В.Н. (1971) Выделение чистых культур облигатных метанокисляющих бактерий. Микробиология. 40(4): 724-729.

48. Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э., Соклов И.Г. (1987) Регуляция активности аспартаткиназы МеШу1ососсш /кегторкПт регулируется аминокислотами аспартатного семейства. Микробиология. 57(5): 740-744.

49. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Богаченко В.Н., Швед А.Д. (1975) Термофильные и термотолерантные бактерии, ассимилирующие метан. Микробиология. 44(5): 855-862.

50. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. (1978) Метанокисляющие микроорганизмы. М., Наука. 195с.

51. Малашенко Ю.Р., Соколов И.Г., Романовская В.А. (1987) Микробный метаболизм неростовых субстратов. Киев. Наукова думка.191с.

52. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Бергер У., Романовская В.А., Мучник Ф.В. (1993) Биология метанобразующих и метанокисляющих микроорганизмов. Киев: Наукова думка, 255 с.

53. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Романовская В.А., Бергер У., Будкова Е.Н., Шатохина Э.С. (1995) Синтез и окисление метана бактериями в гипергалинных озерах. Микробиол. журнал. 57(3): 24-29.

54. Методы общей бактериологии (1984) Силикагель как отвердитель бактериологических сред. Под ред. Ф. Герхардта. Москва. Мир.Т. 1. С. 360-361.

55. Намсараев Б.Б., Жилина Т.Н. Кулырова А.В., Горленко В.М. (1999) Бактериальное образование метана в содовых озерах юго-восточного Забайкалья. Микробиология. 68(5): 671-676.

56. Нестеров А.И. (1983) Физиологические основы микробиологических способов снижения содержания метана в угольных шахтах. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биол. наук. Пущино, ИБФМ РАН. С. 1-44.

57. Нестеров А.И., Иванов М.В. (1983). Экология метанотрофных бактерий. Успехи микробиологии. 18: 3-18.

58. Омельченко М.В., Васильева Л.В., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (1993) Пути первичного и промежуточного метаболизма у психрофильного метанотрофа. Микробиология. 62(50): 849-854.

59. Омельченко М.В., Васильева J1.B., Заварзин Г.А., Савельева Н.Д., Лысенко A.M., Митюшина J1.JI.(1996) Новый психрофильный метанотроф рода Methylobacter. Микробиология. 65(3): 384-389.

60. Перт С. Дж. (1978) Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир. 332 с.

61. Пинчук Г.Э., Шатохина Э.С., Щурова З.П. (1987) Характеристика роста метанокисляющих бактерий Methylococcus thermophilus в присутствии аминокислот аспартатного семейства. Микробиология. 6(4): 621-625.

62. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В. (2004) Множественный стресс у бактерий зло или благо? В книге: Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, выпуск 12. Под ред. В.Ф. Гальченко. М. Наука. 2004, С. 338-361.

63. Практикум по биохимии (1989) Под ред. С.Е. Северина, Г.А.Соловьевой. Изд. МГУ, 509с.

64. Работнова И.Л., Позмогова И.Н., Баснакьян И.А. (1981) Хемостатное и периодическое культивирование при изучении физиологии микроорганизмов. Итоги науки и техники. Сер. «Микробиология». Культивирование микроорганизмов. МЖ ВИНИТИ. 11:3-54.

65. Решетников A.C., Мустахимов И.И., Хмеленина В.Н., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. (2005) Идентификация и клонирование гена пирофосфат-зависимой 6-фосфофруктокиназы Methylomonas methanica. Доклады Академии Наук. 405(6): 837839.

66. Ривкина Е.М., Щербакова В.А., Лауринавичус К.С. (2003) Процессы метанобразования в многолетнемерзлых отложениях. Тезисы докладов 2-й Международной конференции «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». Пущино. С. 97.

67. Романовская В.А., Столяр М.С., Малашенко Ю.Р. (1991) Систематика метилотрофных бактерий. Киев, "Наукова думка". 212с.

68. Северина Л.О. (1995). Бактериальные S-слои. Микробиология, Т.64, № 6, с.725-733.

69. Скулачев В.П. (1985). Натриевый цикл новый тип бактериальной энергетики. Биохимия, Т.50, №2, с.179-183.

70. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. Москва:Наука. 564 с.

71. Слободкин Ф.И., Заварзин Г.А. (1992) Образование метана в галофильных цианобактериальных матах лагун озера Сиваш. Микробиология. 61(2): 294-299.

72. Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Романовская В.А. (1981) Цепь транспорта электронов у термофильной метанокисляющей культуры Methylococcus thermophilus. Микробиология. 50(1): 3-29.

73. Соколов И.Г., Романовская В.А. (1992) Механизмы облигатной метилотрофии. Микробиол. журнал. 54(5): 87-104.

74. Сорокин Д.Ю., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л. (1996) Выделение и характеристика алкалофильных хемоорганотрофных бактерий, окисляющих восстановленные неорганические серные соединения до тетратионата. Микробиология. 65(2): 294-299

75. Спирин A.C. (1958) Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия. 23: 656-662.

76. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. (1986) Ультраструктурная организация метанотрофных бактерий. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 85 с.

77. Троценко Ю.А., Четина Е.В. (1988) Энергетический метаболизм метанотрофных бактерий. Успехи микробиологии. 22:3-34.

78. Троценко Ю.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В. (2001) Аэробные метилотрофные бактерии как фитосимбионты. Микробиология. 70(6): 910-928.

79. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н. Биотехнологический потенциал аэробных метилотрофных бактерий: настоящее и будущее. Прикл. биохимия и микробиология. 2005(5): 495-503.

80. Турова Т.П., Омельченко М.В., Фегединг К.В., Васильева Л.В. (1999) Филогенетическое положение психрофильного метанотрофа Methylobacter psychrophilus sp. nov. Микробиология. 68(4):568-570.

81. Тюрин B.C., Гальченко В.Ф. (1976) Субмикроскопическое строение мембранного аппарата метанотрофных бактерий. Микробиология. 45(3): 503-506.

82. Тюрин B.C., Горская Л.А., Кафтанова A.C., Логинова Т.М., Михайлов A.M. (1985) Некоторые особенности ультратонкой структуры Methylococcus capsulatus при культивировании в различных условиях. Микробиология. 54(6): 770-775.

83. Филатова Л.В., Берг И.А., Красилышкова E.H., Ивановский Р.Н. (2005а) Исследование механизма ассимиляции ацетата у пурпурных несерных бактерий, не

84. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. (1990) Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol.172: 762-770.

85. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59: 143-169.

86. Amaral J.A., Ren T., Knowles R. (1998) Atmospheric methane consumption by forest soils and extracted bacteria at different pH values. Appl. Environ. Microbiol. 64(7): 2397-2402.

87. Ambler R.P., Dalton H., Meyer T.E., Bartsch R.G., Kamen M.D. (1986). The amino acid sequence of cytochrome c-555 from the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus. Biochem. J., V.233, p.333-337.

88. Anthony C. (1991). Assimilation of carbon in methylotrophs. In: Biology of methylotrophs (eds. Goldberg I. and Rokem J.S.), p.79-109. Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass.

89. Anthony C. (1992) The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenases. Int. J. Biochem. 24: 29-39.

90. Anthony C., Ghosh M., Blake C.C.F. (1994) The structure and function of methanol dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinine. Biochem. J. 304(3):5-674.

91. Anthony C., Williams P. (2003) The structure and mechanism of methanol dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta.l647:8-23.

92. Anthony C., Zatman L.J. (1964) The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. Biochem. J. 92(3): 614-621.

93. Arrhenius T., Arrhenius G., Paplawsky W. (1994) Archean geochemistry of formaldehyde and cyanide and the oligomerization of cyanohydrin. Orig.Life Evol. Biosph. 24: 1-17.

94. Asenjo J.A., Suk S.S. (1986) Microbial conversion of methane into poly-beta-hydroxybutyrate (PHB): growth and intracellular accumulation in a type II methanotroph. J. Ferment. Technol. 64(4): 271-278.

95. Avail-Jaaskelainen S., Palva A. (2005) Lactobacillus surface layers and their applications. FEMS Microbiol. Rew. 29(3): 511-529.

96. Baeinziger J.E., Jarrell H., Smith I.S. (1993) Molecular motions and dynamics of a duinsaturated acyl chain in lipid bilayer: implication for a role in biological membranes. Biochemistry. 31:3379-3385.

97. Barnes, R.O., Goldberg E.D. (1976) Methane production and consumption in anoxic marine sediments. Geology. 4:297-300.

98. Barra L., Pica N. Gouffi N., Walker G.C., Blanco C., Trauwetter A. 2003. Glucose 6-phosphate dehydrogenase is required for sucrose and trehalose to be efficient osmoprotectants in Sinorhizobium melliloti. FEMS Microbiol. Lett. 229(2): 183-188.

99. Bastien C., Machlin S., Zahn Y., Donaldson R., Yanson R. S. (1989) Organization of genes required for oxidation of methanol to formaldehyde in three II type methanotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 55:124-3130.

100. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L„ Kovaks K.L., Embley T.M., Prosser J.I., Murrell J.C. (2002) The ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulalus (Bath). Arch. Microbiol. 177:279-289.

101. Benaroudj N., Lee H., Goldberg A.L. (2001) Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. J.Biol.Chem. 276: 24261-24267.

102. Best D.J., Higgins I.J. (1981) Methane-oxidizing activity and membrane morphology in a methanol-grown obligate methanotroph, Methylosinus trichosporium OB3b. J. Gen. Microbiol. 125(l):73-84.

103. Bestvater T., Galinski E.A. (2002) Investigation into a stress-inducible promoter region from Marinococcus halophilus using green fluorescent protein. Extremophiles. 6(1): 15-20.

104. Blackmore M.A., Quayle J.R. (1970) Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase. Biochem. J. 118; 53-59.

105. Bodelier, P.L.E., Roslev, P., Henckel, T. and Frencel, P. (2000) Stimulation by ammonium -based fertilizers of methane oxidation in soil around rice roots. Nature. 403: 421-424.

106. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell C.J., Radajewski S., Weiharter A., Sessitsch A. (2003) Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs. Environ. Microbiol. 5(7): 566-582.

107. Bodrossy L., Kovacs K.L., Donald I.R., Murrell J.C. (1999) A novel thermophilic methane-oxidizing y-Proteobacterium. FEMS Microbiol.Letters. 170:335-341.

108. Bodrossy L., Murrell J.C., Dalton H., Kalman M., Puskas L.G., Kovacs K.L. (1995) Heat-tolerant methanotrophic bacteria from the hot water effluent of a natural gas field. Appl.Environ. Microbiol. 61:3549-3555.

109. Boer W.E., Hazeu W. (1972) Observations on the fine structure of a methane-oxidizing bacterium. Antonie van Leeuwenhoek. 38: 33-47.

110. Bolbot J.A., Anthony C. (1980) The metabolism of pyruvate by the facultative methylotroph Pseudomonas AMI. J. Gen.Microbiol. 120(1): 233-244.

111. Booth I.R., Higgins C.F. (1990) Enteric bacteria and osmotic stress intracellular potassium glutamate as a secondary signal of osmotic stress? FEMS Microbiol. Rev. 75(2-3): 239-246.

112. Boot H.J., Pouwels P.H. (1996) Expression, secretion and antigenic variation of bacterial S-layer proteins. Mol. Microbiol. 21: 1117-1123.

113. Borjesson G., Sund I., Tunlid A., Frostegard A.,Svensson H. (1998a) Microbial oxidation of CH4 at high partial pressures in an organic landfill cover soil under different moisture regimens. FEMS Microbiol.Ecol. 26: 207-217.

114. Borjesson G., Sund I., Tunlid A., Svensson H. (1998b) Methane oxidation in landfill cover soils, as revealed by potential oxidation measurements and phospholipid fatty acid analyses. Soil Biol. Biochem. 30(10/11): 1423-1433.

115. Bourne, D.G., Holmes, A.J., Iversen, N. and Murrell, J.C. Fluorescent oligonucleotide probes for identification of physiological groups of methanotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 31,29-38.

116. Bouvier P., Rohmer M., Benveniste P. and Ourisson G. (1976). A8-Steroids in the bacterium Methylococcus capsulatus. Biochem. J., V. 159, №14, p.267-271.

117. Bowman J.P., McCammon S.A., Skerratt J.H. (1997) Methylosphaera hansonii gen. nov., sp.now., a psychrophillic, group I methanotroph from Antarctic marine-salinity, meromictic lakes. Microbiology (UK). 143:1451-1459.

118. Bowman J.P., Skerratt J.H., Nichols P.D., Sly L.I. (1991) Phospholipid fatty acid and lipopolysaccharide fatty acid signature lipids in methane-utilizing bacteria. FEMS Microbiol. Ecol.85: 15-22.

119. Bowman J.P., Sly L.I., Stackebrandt E. (1995). The phylogenetic position of family Methylococcaceae. Int. J. Syst. Bacteriol., V. 45, № 1, p. 182-185.

120. Brusseau G.A., Bulygina E.S., Hanson R.S. (1994) Phylogenetic analysis and development of probes for differentiating methylotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60:626-636.

121. Buenger J. and Driller H. (2005) Ectoine: an effective natural substance to prevent UVA-induced premature photoaging. Skin Pharmacology and Physiology. 17 #5 (http://content.karger.com.ProduktDB/produkte.asp?doi=80216).

122. Bulygina E.S., Galchenko V.F., Govorukhina N.I., Netrusov A.I., Nikitin D.I., Trotsenko Yu.A., Chumakov K.M. (1990) Taxonomic studies on methylotrophic bacteria by 5S ribosomal RNA sequencing. J.Gen.Microbiol. 136(3): 441-446.

123. Bussmann I., Pester M., Brune A., Schink B. (2004) Preferential cultivation of type II methanotrophic bacteria from littoral sediments (Lake Constance). FEMS Microbiol. Ecol. 47:179-189.

124. Cánovas D., Borges N. Vargas C., Ventosa A., Nieto J.J., Santos H. (1999) Role of Ny-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine.Appl. Environ. Microbiol. 65(9): 3774-3779.

125. Cardy D.L. Murrell J.C. (1990) Cloning, sequencing and expression of the glutamine synthetase structural gene (glnA) from the obligate methanotroph Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. 136:343-352.

126. Carls R.A., Hanson R.S. (1971) Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle mutants of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 106: .848-855.

127. Cavalier-Smith T. (2002) The neomuran origin of archaebacteria, the negibacterial root of the universal tree and bacterial megaclassifícation. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 776.

128. Cavanaugh C.M. (1983) Chemoautotrophic bacteria in marine invertebrates from sulfide-rich habitats. Nature. 302:58-61.

129. Cavanaugh C.M., Levering P.R., Maki J.S., Mitchele R., Lidstrom M.E. (1987) Symbiosis of methylotrophic bacteria and deep sea mussels. Nature. 325(6102):346-348.

130. Chen Y.P., Yoch D.C. (1988) Reconstitution of the electron transport system that couples formate oxidation to nitrogenase in Methylosinus trichosporium OB3b. J. Gen. Microbiol. 134:3123-3128.

131. Chen Y.P., Yoch D.C. (1989) Isolation, characterization and biological activity of ferredoxin-NAD+ reductase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. 171: 5012-5016.

132. Childress J.J., Arp A.J., Fisher C.R. (1984) Metabolic and blood characteristics of the hydrothermal vent tube-worm Riftiapachyptila. Marine Biology. 83(4770): 109-124.

133. Childress J.J., Fisher C.R., Brooks J.M., Kennicutt II M.C., Bidigare R., Anderson A.E. (1986) A methanotrophic marine molluscan {Bivalves, Mytillidae) symbiosis: Mussels fueled by gas. Science. 233:1306-1308.

134. Chistoserdova L., Vorholt J.A., Thauer R.K., Lidstrom M.E. (1998) CI transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic archae. Science. 281:99-102.

135. Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M.G., Marx C.J., Lapidus A., Vorcholt J.A., Staley J.T., Lidstrom M.E. (2004) The enigmatic planctomycetes may hold a key to origins of methanogenesis and methylotrophy. Mol. Biol. Evol. 21(7): 1234-1241.

136. Chomczynski P., Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162: 156-15

137. Claus H., Acka E., Debaerdemaeker T., Evard C., Declercq J-P., Harris J.R., Schlott B., König H. (2005) Molecular organization of selected prokaryotic S-layer protein. Can. J. Microbiol. 51:731-743.

138. Collins M.D., Howarth O.W., Green P.N. (1986) Isolation and structural determination of a novel coenzyme from a metane-oxidizing bacterium. Arch. Microbiol. 146: 263266.

139. Conrad R., Frenzel P., Cohen Y. (1993) Methane emission from hypersaline microbial mats: lack of aerobic methane oxidation activity. FEMS Microbiol. Ecol.610:229-232.

140. Conrad, R. (1996) Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases. (H2, CO, CH4, OCS, N20 and NO). Microbiol. Rev.60: 609-640.

141. Costello A., Lidstrom M.E. (1999) Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments. Appl. Environ. Microbiol. 65: 5066-5074.

142. Da Costa M.S., Santos H., Galinski E.A. (1998) An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61: 117-153.

143. Dalton H. (1981) Methane mono-oxygenases from a variety of microbes. In: Microbial Growth on Cj Compounds: Proc. 3rd Intern. Symp. Heyden. L. Pl-10.

144. Dalton H. (1985) Implication of the nature of methane monooxygenase on carbon assimilation in methanotrophs. In: Microbial gas metabolism, mechanistic, metabolic and biotechnological aspects. Eds. Poole R.K., Dow C.S. Academic Press. London. 201208.

145. Dalton H. (2005) The natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria. Phil. Trans. R. Soc. B. 360: 1207-1222.

146. Dlugokencky E.J., Masarie K.A., Lang P.M., Tans P.P. (1998) Continuing decline in the growth rate of the atmospheric methane burden. Nature. 393: 447-450.

147. Dunfield P., Knowles R., Moore T.R. (1993) Methane production and consumption in temperate and subarctic peat soils: response to temperature and pH. Soil. Biol. Biochem. 25:321-326.

148. Dunfield P.F., Liesack W., Henckel T., Knowles R., Conrad R. (1999) High affinity methane oxidation by a soil enrichment culture containing a type II methanotroph. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1009-1014.

149. Davies T.R. (1973) Isolation of bacteria capable of utilizing methane as a hydrogen donor in the process of denitrification. Water.Res. 7:575-579.

150. Dedysh S.N., Panikov N.S., Liesack W., Gropkopf R., Zhou J., Tiedje J.M. (1998) Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs. Science. 282: 281284.

151. Denhardt D.T. (1966). A membrane filter technique for determination of complementary DNA. Biochem. Biophys. Res. Com. 23: 641-646.

152. Dijken van J.P., Quayle J.R. (1977) Fructose metabolism in four Pseudomonas species. Arch. Microbiol. 114:.281-286.

153. Dijkhuizen L., Harder W., de Boyer L. (1984) Genetic manipulation of restricted facultative methylotroph Hyphomicrobium by the R-plasmid mediated introduction. Arch. Microbiol. V. 139. 4. P. 311-318.

154. Di Giulio M. (2003) The ancestor of the Bacteria domain was a hyperthermophile. J. Theor. Biol. 224: 277-283.

155. DiSpirito A.A, Zahn J.A., Gracham D.W., Kim H.J., Larive C.K., Derrick T.S., Cox C.D., Taylor A. (1998) Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. 180:3606-3613.

156. Dixon G.H., Kornberg H.L.(1959). Assay for key enzymes of glyoxylate cycle. Biochem. J. 72:3-11.

157. Doherty D. (1970) L-glutamate dehydrogenase (yeast). In: Methods in Enzymol. XXVII A, p.850.

158. Dunfield P.F., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. (2003). Methylocella silvestris sp. nov., a novel methane-oxidizing bacterium isolated from an acidic forest cambisol. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1231-1239.

159. Dworkin M., Foster J.M. (1956) Studies of Pseudomonas methanica (Sohngen) nov. comb. J. Bacteriol. 72:646-659.

160. Ebbar M., Sohn-Bosser L., Bremer E., Bernard T., and Blanco C. (2005) Ectoine-induced proteins in Sinorhizobium meliloti include an ectoine ABC-type transporter involved in osmoprotection and ectoine catabolism J. Bacteriol. 187: 1293-1304.

161. Eccleston M., Kelly D.P. (1972) Assimilation and toxicity of exogenous amino acids in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus. J. Gen. Microbiol. 71(3):541-544.

162. Ehhalt L.H. The athmospheric cycle of methane. In: Microbiol production and utilization of gases (H2, CO, CH4). Eds H.G. Shlegel, G. Gottschalk, N. Pfenning. Gottingen. p. 1322.

163. ElIer, G., Stubner S., Frenzel P. (2001) Group-specific 16S rRNA targeted probes for the detection of type I and type II methanotrophs by fluorescence in situ hybridization. FEMS Microbiol. Lett. 198: 91-97.

164. Fang J., Barcelona M.J., Semrau J.D. (2000) Characterization of methanotrophic bacteria on the basis of intact phospholipid profiles. FEMS Microbiol. Lett. 189(1): 67-72.

165. Faria T.Q., Lima J.C., Bastos M., Macanita A.L., Santos H. (2004) Protein stabilization by osmolytes from hyperthermophules. J.Biol.Chem. 269(47): 48680-48691.

166. Ferenci T., Strom T. Quayle J.R. (1974) Purification and properties of 3-hexulose phosphate synthase from Methylococcus capsulatus. Biochem. J. 144:477-486.

167. Fisher C.R., Childress J.J., Oremland R.S., Bidigare R.R. (1987) The importance of methane and thiosulfate in the metabolism of the bacterial symbionts of two deep-sea mussels. Mar.Biol. 96:59-71.

168. Foster J.W., Davis R.H. (1966) A methane dependents coccus with notes on classification and nomenclature of obligate methane-utilizing bacteria. J.Bacteriol. 91:1924-1931.

169. Fouet A., Mesnage S. (2002) Bacillus anthracis cell envelope components. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 271: 87-113.

170. Franzmann P.D., Roberts N.J., Mancuso C.A., Burton H.R., McMeekin T.A. (1991) Methane production in meromictic Ace Lake, Antarctica. Hydrobiologia. 210:191-201.

171. Galchenko V.F. (1995a) Ecology of methanotrophic bacteria in aquatic ecosystems. Physiol. Gen. Biol. Rev. 9:1 -92.

172. Galchenko V.F. (1995b) Methane oxidation in sea basins. Ecol. Chem. 4(l):31-47.

173. Galchenko V.F., Lein A.Yu., Ivanov M.V. (1989) Biological sinks of methane. In: Exchange of trace gases between terrestrial ecosystems and the atmosphere. Eds: M.O.Andreae and D.S.Schimel. Willey. C. 59-71.

174. Galchenko, V.F. and Andreev, L.V. (1984) Taxonomy of obligate methanotrophs. In: Microbial growth on CI compounds (Crawford, R.L. and Hanson, R.S., Eds.), pp. 269275. American Society of Microbiology, Washington.

175. Galinski EA (1995) Osmoadaptation in bacteria. Adv Microbial Physiol 37: 273-328

176. Galinski E.A., Pfeiffer H.P., Triiper H.G. (1985) l,4,5,6,-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid, a novel cyclic acid from halophilic phototrophic bacteria of genus Ectothiorodospira. Eur. J. Biochem.149: 135-139.

177. Galinski E.A., Triiper H.G. (1994) Microbial behavior in salt-stressed ecosystems. FEMS Microbiol. Rev. 15: 95-108.

178. Gardner WS, Miller WH (1980) Reverse-phase liquid chromatographic analysis of amino acids after reaction with o-phthalaldehyde. Anal.Biochem. 101: 61-65.

179. Gassner G.T., Lippard S.J. (1999) Component interaction on the soluble methane monooxygenase system from Methylococcus capslatus (Bath). Biochemistry. 38: 1276812785.

180. Gilbert B., McDonald I.R., Stafford G.P., Finch R., Nielsen A.K., Murrell J.C. (2000) Molecular analysis of the pmo (Particulate Methane Monooxygenase) operons from two type II methanotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 66:66-975.

181. Glockner F.O., Kube M., Bauer M. et al. (14 coauthors) (2003) Complete genome sequence of the marine planctomycete Pirellula sp. strainl. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 100: 8298-8303.

182. Goller K, Ofer A, Galinski EA (1998) Construction and characterization of an NaCl -sensitive mutant of Halomonas elongata impaired in ectoine biosynthesis. FEMS Microbiol. Lett. 161: 293-300.

183. Graham D.W., Korich D.G., LeBlanc R.P., Sinclair N.A., Arnold R.G. (1992) Application of a colorimetric plate assay for soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. 58(7): 2231-2236.

184. Grant W.D., Jones B.E. (2000) Alkaline environments. In: Encyclopaedia of microbiology / Ed. J. Lederberg. San-Diego. Acad. Press.l: 126-133.

185. Grant WD (2004) Life at low water activity. Phil Trans R Soc Lond B 359: 1249-1267

186. Green J., Dalton H. (1985) Protein B of soluble methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus Bath. J. Biol. Chem. 260:15795-15801.

187. Green L., Dalton H. (1986) Steady-state kinetic analysis of soluble methane monooxygenase from Methylococcus capslatus (Bath). Biochem. J. 236(1):I55-162.

188. Guckert J.B., Ringelberg D.B., White D.C., Hanson R.S., Bratina B.J. (1991) Membrane fatty acids as phenotypic markers in the polyphasic taxonomy of methylotrophs within the Proteobacteria J. Gen. Microbiol. 137: 2631-2641.

189. Gulledge J., Ahmad A., Steudel P.A., Pomerantz W.J. and Cavanaugh C.M. (2001) Family and genus-level 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for ecological studies of methanotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4726-4733.

190. Hagemeier C.H., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R.K., Vorholt J.A. (2000) Characterization of the second methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AMI. Eur. J. Biochem. 267:762-3769.

191. Hanson R.S., Hanson T.E. (1996) Methanotrophic bacteria. Microbiol. Rev. 60(2): 39471.

192. Harrits S.M., R.S. Hanson (1980) Stratification of aerobic methane oxidizing organisms in Lake Mendota, Madison, Wisconsin. Limnol. Oceanogr. 25:412-421.

193. Hase C.C., Fedorova N.D., Galperin M.Y., Dibrov P.A. (2001) Sodium ion cycle in bscterial pathogens: evidence from cross-genome comparisons. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 353-370.

194. Henckel T., Jackel U., Conrad R. (2001) Vertical distribution of the methanotrophic community after drainage of rice field soil. FEMS Microbiol. Ecol. 34: 279-291.

195. Henckel T., Jackel U„ Schnell S., Conrad R (2000) Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil oxidizing atmospheric methane. Appl. Environ. Microbiol. 66:1801-1808.

196. Heyer J., Galchenko V.F., Dunfield P.F. (2002) Molecular phylogeny of type II methane-oxidizing bacteria isolated from various environments. Microbiology (UK). 48:2831-2846.

197. Heyer J., Berger U„ Hardt M., Dunfield P.F. (2005) Methylohalobius crimensis gen. nov. sp. nov., a moderately halophilic methanotrophic bacterium isolated from hypersaline lakes of Crimea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55(5): 1817-1826.

198. Higgins I.J., Quayle J.R. (1970) Oxygenation of methane by methane-grown Pseudomonas methanica and Methanomonas methanooxidans. Biochem. J. 118: 201208.

199. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C. (1980) New findings in methane-utilizing bacteria highlight their impotance in the biosphere and their commercial potential. Nature (London). 286(9235):561-564.

200. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C., Scott D. (1981) Methane-oxidizing microorganisms. Microbiol. Rev. 45(4):556-590.

201. Holmes A.J., Lidstrom M.E., Murrell J.C. (1995a) Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionary related. FEMS Microbiol. Lett. 132:203-208.

202. Holmes A.J., Owens N.J., Murrell J.C. (1995b) Detection of novel marine methanotrophs using phylogenetic and functional gene probes after methane enrichment. Microbiology (UK). 141(8): 1947-1955.

203. Holmes A.J., Roslev P., McDonald I.R., Iversen N., Henriksen K., Murrell J.C. (1999) Characterization of methanotrophic bacterial populations in soils showing atmospheric methane uptake. Appl. Environ. Microbiol.65: 3312-3318.

204. Horikoshi K. (1999) Alkaliphiles: some applications of their products in biotechnology. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 63(4): 735-750

205. Hou C.T., Laskin A.I., Patel R. (1979) Growth and polysaccharide production by Methylocystisparvus OBBP on methanol. Appl. Environ. Microbiol. 37: 800-804.

206. Humphrey A.E. (1967) A critical review of hydrocarbon fermentations and their industrial utilization. Biotech.Bioeng.9:3-24.

207. Hutchens E., Radajewski S., Dumont M.G., McDonald I.R., Murrell J.C. (2004) Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable-isotope probing. Environ. Microbiol. 6: 111-120

208. Jaeckel U., Thummes K., Kaempfer P. (2005) Thermophilic methane production and oxidation in compost. FEMS Microbiol. Ecol. 52: 175-184.

209. Jaenicke R., Sterner R. (2003) Life at high temperatures. Ed. Dworkin M. The Prokaryotes. Electronic resource of microbial community. http://l 41.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm

210. Jaenicke R., Boehm G. (1998) The stability of proteins in extreme environments. Curr. Opin. Structural Biol. 8: 738-748.

211. Jahnke L.L. (1992) The effect of growth temperature on the methyl sterol and phospholipid fatty acid composition of Methylococcus capsulatus (Bath). FEMS Microbiol. Lett. 93: 209212.

212. Jahnke L.L., Summons R.E., Dowling L.M., Zahiralis K.D. (1995). Identification of methanotrophic lipid biomarkers in cold-seep mussel gills: chemical and isotopic analysis. Appl. Environ. Microbiol. 62(2): 576-582.

213. Jeffries P., Wilkinson J.F. (1978) Electron microscopy of the cell wall complex of Methylomonas albus. Arch. Microbiol. 119(2): 227-229.

214. Joergensen L. (1985) Methane oxidation by Methylosinus trichosporium measured by membrane-inlet mass spectrometry. In: Microbial gas metabolism (ed. Pool R.K and Dow C.S.), Acad. Press, INC (London) LTD. p.287-295.

215. Jones B.E, Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. (1998) Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles. 2:191-200.

216. Jones B.E., Grant W.D., Collins N.C., Mwatha W.E. (1994) Alkaliphiles: diversity and identification. Bacterial diversity and systematics. Eds Priest FG et al. New York: Plenium Press. P. 195-228.

217. Jones H.A., Nedwell D.B. (1993) Methane emission and methane oxidation in landfill cover soil. FEMS Microbiol. Ecol. 102: 185-195.

218. Johnson P.A., Quayle J.R. (1964) Microbial growth on CI-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate of methanol-grown Pseudomonas AMI. Biochem J. 93: 281-290.

219. Joye S.B., Connell T.L., Miller L.G., Oremland R.S. and Jellison R.S. (1999) Oxidation of ammonia and methane in an alkaline, saline lake. Limnol. Oceanogr. 44(1): 178-188.

220. Kaserer H. (1905) Uber die Oxidation des Wasserstoffes und des Methane durch Mikroorganismes (The oxidation of hydrogen and methane by microorganisms). Ztsch. Landw. Versuchsw. in Osterreich. 8: 789-792.

221. Kasting J., Sefert J.L. (2002) Life and evolution of Earth's atmosphere. Science. 296: 1066-1068.

222. Kates (1986) Influence of salt concentration on membrane lipids of halophilic bacteria. Microbiol. Rev., 39: 95-101.

223. Kempf B., Bremer E. (1998) Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments. Arch Microbiol 170: 319-330.

224. Keppler F., Hamilton J.T.G., Bras M., Rockmann T. (2006) Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions. Nature. 439: 187-191.

225. Kim H. J., Graham D. W., DiSpirito A. A., Alterman M. A., Galeva N., Larive C. K., Asunskis D. (2004) Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305: 1612 1615.

226. King G.M. (1990) Regulation by light of methane emissions from a wetland. Nature. 345(6275): 513-515.

227. Klotz M.G., Norton J.M. (1998) Multiple copies of ammonia mon'ooxygenase (amo) operons have evolved under biased AT/GC mutational pressure. FEMS Microbiol. Lett. 132:03-311.

228. Knap S, Ladenstain R, and Galinski EA. (1999) Thermal stabilization of bovine ribonuclease A by naturally occurring osmolyte beta-hydroxyectoine and betaine. Extremophiles. 3:191-198.

229. Knief C., Lipski A., Dunfield P.F. (2003) Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils. Appl. Environ. Microbiol. 69(11): 6703-6714.

230. Koh S., Bowman J.P., Sayler G.S. (1993) Soluble methane monooxygenase production and trichloroethylene degradation by a type I methylotroph Methylomonas methanica 68-1. Appl.Environ. Microbiol. 59(4):960-967.

231. Kolb S., Knief C., Stubner S., Conrad R. (2003) Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays. Appl. Environ. Microbiol. 69(5): 2423-2429.

232. Kornberg A., Horecker B.L. (1955) Glucose-6-phosphate dehydrogenase In: Methods Enzymol. 1: 323.

233. Korotkova N., Lidstrom M.E. (2001) Connection between poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on Ci and C2 compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacterid. 183(3): 1038-1046.

234. Kraegeloh A., Kunte H.J. (2002) Novel insights into the role of potassium for osmoregulation in Halomonas elongata. Extremophiles. 6: 453-462.

235. Kuen B., Koch A., Asenbauer E., Sara M., Lubitz W. (1997) Molecular characterization of of the Bacillus stearothermophilus PV72 S-layer gene sbsB induced by oxidative stress. J. Bacteriol. 179: 1664-1670.

236. Krulwich T.A. (1995) Alcaliphiles: basic molecular problems of pH tolerance and bioenergetics. Molecular Microbiol. 15: 403-410.

237. Krulwich T.A., Ito M, Gilmour R., Guffanti A.A. (1997) Mechanisms of cytoplasmic pH regulation in alkaliphilic strains of Bacillus. Extremophiles. 1(4):163-169.

238. Kuhlman A.U., Bremer E. (2002) Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacilluspasteurii and related Bacillus spp. Appl. Environ. Microbiol.68: 772-783.

239. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembry of head of bacteriophage T4. Nature (London). 227: 680-685.

240. Lang E., Lang H. (1960) Spezifische Farbreaktion zum direkten Nachweise der Ameisensaure. Z. Anal. Chem. 260: 8-10

241. Lee D.H., Noh S.A., Kim C.K. (2000) Development of molecular biological to analyze bacterial species diversity in freshwater and soil ecosystems. J.Microbiol. 38(1): 11-17.

242. Lee S.J., Lipscomb J.D. (1999) Oxygen activation catalysed by methane monooxygenase hydroxylase component: proton delivery during the 0-0 bound cleavage step. Biochemistry. 38: 4423-4432.

243. Levering P.J., Dijkhuizen L., Harder W. (1984) Metabolic regulation in the facultative methylotroph Arthrobacter PI. Growth on primary amines as carbon and energy source. Arch. Microbiol. 139: 188-195.

244. Lindsay M.R., Webb R.J., Strous M., Jetten M.S., Butler M.K., Forde R.J., Fuerst J.A. (2001) Cell compartmentalization in planctomycetes: novel types of structural organization for the bacterial cell. Arch. Microbiol. 175: 413-429.

245. Lidstrom M.E. (1988) Isolation and characterization of marine methylotrophs. Antonie van Leuwenhoek. 54: 189-199.

246. Linton J.D., Vokes J. (1978) Growth of the methane-utilising bacterium Methylococcus NCIB 11083 in mineral salts medium with methanol as sole source of carbon. FEMS Microbiol. Letters. 4: 125-128.

247. Linton J.D. (1990) The relation between metabolic production and the growth efficiency of the producing organism. FEMS Microbiol. Rev. 75:1-18.

248. Los D.A., Murata N. (1998) Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochim. Biophys. Acta. 1394: 3-15.

249. Lolkema J.S., Speelmans G., Konings W.N. (1994) Na(+)-coupled versus H(+)-coupIed energy transduction in bacteria. Biochim. Biophys. Acta 1187(2): 211-215.

250. Louis P., Galinski E.A. (1997) Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli. Microbiology (UK) 143: 1141-1149

251. Luft J.H. (1964) Elctron microscopy of cell extraneous coats as revealed by ruthenium red staining. J. Cell. Biol. 23:23. 54A-55A.

252. Lunn J.E. (2002) Evolution of sucrose synthesis. Plant Physiol. 128: 1490-1500.

253. Malin G., Lapidot A. (1996) Induction of synthesis tetrahydropyrimidine derivatives in Streptomyces strain and their effect on Escherichia coli in response to osmotic and heat stress. J. Bacteriol. 178(2): 385-395.

254. Marmur J.A. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3: 208-214.

255. Martins L.O., Huber R., Huber H., Stetter K.O., da Costa M.S., Santos Y. (1997)Organic solutes in hyperthermophilic archaea. Appl.Environ.Microbiol. 63: 896902.

256. Marx C.J., Chistoserdova L., Lidstrom M.E. (2003) Formaldehyde detoxifying role of the tetrahydromethanopterin-linked pathway in Methylobacterium extorquens AMI. J.Bacteriol. 185:7160-7168.

257. Marx C.J., Miller J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E. (2004) Multiple formaldehyde oxidation/detoxification phathway in Burgholderia fungorum LB400. J.Bacteriol. 186:2173-2178.

258. Matthews E. (1993) Wetlands. In: Atmospheric Methane: Sources, sinks and role in Global Change. Ed. By Khalil M.A.K. Springer, Berlin. Series I. Chapter. 15:315-361.

259. McDonald I.R., Kenna E.M., Murrell J.C. (1995) Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR. Appl.Environ.Microbiol. 61:116-121.

260. McDonald, I.R., Murrell, C.J. (1997a) The particulate methane monooxygenase gene pmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs. FEMS Microbiol. Lett. 156,205-210.

261. McDonaId I.R., Murrell C.J. (1997b) The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 63:218-3224.

262. McDonald I.R., Upton M., Hall G., Pickup R,W., Edwards C., Saunders J.R., Ritchie D.A., Murrell J.C. (1999) Molecular ecological analysis of methanogens and methanotrophs in blanket bog peat. Microbiol. Ecol. 38: 225-233.

263. McKay C.P., Friedman E.I., Wharton R.A., Jr., Dawies W.L. (1992) History of water on Mars: a biological perspectives. Adv.Space Res. 12:231-238.

264. Meers J.L., Tempest D.W. (1970) Glutamine (amide): a-oxoglutarate aminotransferase oxidoreductase (NADP) an enzyme involved in biosynthesis of glutamate by some bacterial. J. Gen. Microbiol. 64: 187-194.

265. Meister M., Saum S., Alber B.E., Fuchs G. (2005) L-Malyl-coenzyme A//?-methylmalyl-coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of the isocitrate lyase-negative bacterium Rhodobacter capsulatus. J. Bacteriol. 187(4): 1415-1425.

266. Messner P., Sleytr U.B. (1992) Crystalline bacterial cell-surface layers. Adv. Microbial. Physiol. 33:213-275.

267. Miguez C.B., Bourque D., Green C.W., Groleau D. (1997) Detection and isolation of methanotrophic bacteria possessing soluble methane monooxygenase (sMMO) genes using the polymerase chain reaction (PCR). Microbiol. Ecol. 33: 21-31.

268. Mitsui R., Sakai Y., Yasueda H., Kato N. (2000) A novel operon encoding formaldehyde fixation: the ribulose monophosphate pathway in the gram-positive facultative methylotrophic bacterium Mycobacterium gastrii MB 19. J. Bacteriol. 182:944-948.

269. Morita, R.J. (2000) Low-temperature environments. In: Lederberg J, (ed) Encyclopedia of microbiology. 2nd edition, vol 1. Acad Press, San Diego. P. 93-98.

270. Morris S.A., Radajewski S., Willison T.W., Murrell J.C. (2002) Identification of the functionally active methanotroph population in a peat soil microcosm by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1446-1453.

271. Murata N., Los D.A. (1997) Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiol. 115:875-879.

272. Murrell J.C., Dalton H. (1983a) Ammonia assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath) and other obligate methanotrophs. J. Gen. Microbiol. 129:1197-1206.

273. Murrell J.C., Dalton H. (1983b) Purification and properties of glutamine synthetase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. 129:1187-1196.

274. Murrell J.C., Dalton H. (1983) Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. J.Gen. Microbiol. 129: 3481-3486.

275. Murrell J.C., Dalton H. (1992) Methane and methanol utilizers. Biotechnology handbooks. Ed. Atkinson T., Sherwood R.F. Plenum Press. London. 286p.

276. Murrell J.C., Gilbert B., McDonald I.R. (2000a) Molecular biology and regulation of methane monooxygenase. Arch. Microbiol. 173:325-332.

277. Murrell J.C., McDonald I.R., and Bourne D.J. (1998) Molecular methods for the study of methanotrophs ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 27: 103-114.

278. Murrell J.C., McDonald I.R., Gilbert B. (2000b) Regulation of expression of methane monooxygenases by copper ions. Trends Microbiol. 8(5):21-225.

279. Murrell J.C., Radajewski S. (2000) Cultivation-independent techniques for studying methanotroph ecology. Res. Microbiol. 151: 807-814.

280. Nguen H.T., Elliott S.J., Yip J.H., Chan S.I. (1998) The particulate methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper-containing three-subunit enzyme. J. Biol. Chem. 273(14):957-7978.

281. Nishida I., Murata N. (1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 541568.

282. Owen R.L., Lapage S.P. (1976) The thermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic application. J. Appl. Bacteriol. 41: 335-340.

283. Pacheco-01iver M., McDonald I.R., Groleau D., Murrell C.J., Miguez C.B. (2002) Detection of methanotrophs with highly divergent pmoA genes from Arctic soils. FEMS Microbiol. Lett. 209: 313-319.

284. Parker B.C., Simmons Jr. G.M., Seaburg K.G., Cathey D.D., All-Nutt F.C.T. (1982) Comparative ecology of plankton communities in seven Antarctic Oasis lakes. J. Plank. Res. 4:271-286.

285. Patel R.N., Felix A. (1980) Microbial oxidation of methane and methanol: crystallization of methanol dehydrogenase and properties of holo- and apo-methanol dehydrogenase from Methylomonas methanica. J. Bacteriol. 133(2): 41-649.

286. Patt T.E., Cole I.C., Bland J., Hanson R.S. (1974) Isolation and characterization of bacteria that grow on methane and organic compounds as sole sources of carbon and energy. J. Bacteriol. 120:955-964.

287. Pedersen K. (1996) Investigation of subterranean bacteria in deep crystalline bedrock and their importance for the disposal of nuclear waste. Can. J. Microbiol. 42: 382-391.

288. Pedersen K. (1997) Microbial life in deep granitic rock. FEMS Microbiol. Rev. 20: 399414.

289. Pernthaler, A., Amann, R. (2004) Simultaneous fluorescence in situ hybridization of mRNA and rRNA in environmental bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70: 5426-5433.

290. Peters R., Galinski E.A., Truper H.G. (1990) The biosynthesis of ectoine. FEMS Microbiol. Lett. 71: 157-162

291. Phelps P.A., Agarval S.K., Speitel G.E., Georgiou G. (1992) Methylosinus trichosporium OB3b mutants having constitutive expression of soluble methane monooxygenase in the presence of high levels of copper. 58(11): 3701-3708.

292. Pflughoeft K.J., Katharine K., Watnick PI (2003) Role of ectoine in Vibrio cholerae osmoadaptation. Appl. Environ. Microbiol. 69: 5919-5927

293. Pomper B.K., Vorholt J.A. (2001) Characterization of the formyltransferase (Ftr) from Methylobacterium extorquens AMI. Eur. J. Biochem. 269: 769-4775.

294. Poolman B., Glaasker E. (1998) Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria. Mol. Microbiol. 29(2): 397-407.

295. Popov V.O., Lamzin V.S. (1994) NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J. 301:625-643.

296. Prabhu J., Schauwecker F., Grammel N., Keller U., Bernhard M. (2004) Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongata. Appl.Environ.Microbiol. 70(5): 3130-3132.

297. Quayle J.R. (1969) Microbial growth on Ci compounds. Proc. Biochem. 2:25-29.

298. Quayle J.R. (1972) The metabolism of the one-carbon compounds by microorganisms. Adv. Microb. Physiol. 7:119-203.

299. Quayle J.R., Ferenci T. (1978) Evolutionary aspects of autotrophy. Microbiol. Rev. 42:251-273.

300. Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. (2000) Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403: 646-649.

301. Radajewski S., Webster G., Reay D.S., Morris S.A., Ineson P., Nedwell D.B., Prosser J.I., Murrell J.C. (2002) Identification of active methylotroph populations in an acidic forest soil by stable-isotope probing. Microbiology. 148: 2331-2342.

302. Radajewski, S., McDonald I.R. and Murrell C.J. (2003) Stable-isotope probing: a window to the function of uncultured microorganisms. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 296302.

303. Rasmussen R.A., Khalil M.A. (1984) Atmospheric methane in the recent and ancient atmospheres: concentrations, trends interhemispheric gradient. J. Geophys. Res. 89(7): 11599-11605.

304. Reeburgh W.S. (1976) Methane consumption in Cariaco Trench waters and sediments. Earth. Planet. Sci.Lett. 28:337-344.

305. Reeburgh W.S. (1983) Rates of biogeochemical processes in anoxic sediments. Ann. Rev. Earth. Planet. Sci. 11-.269-298.

306. Ren T., Amaral J. A., Knowles R. (1997) The response of methane consumption by pure cultures of methanotrophic bacteria to oxygen. Canad. J. Microbiol. 43: 925-928.

307. Reynolds E. S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. 17: 208-213.

308. Ribbons D. (1975) Oxidation of CI compounds by particulate fraction from Methylococcus capsulatus: distribution and properties of methane-dependent reduced nicotinamide adenine nucleotide oxidase (methane hydroxylase) J.Bacteriol. 122: 13511363.

309. Rivkina E., Friedmann E.I, Gilichinsky D. (2000) Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point. Appl. Environ. Microbiol. 66:3230-3233.

310. Roeßler M., Müller V. (2001) Osmoadaptation in bacteria and archaea: common principles and differences. Environ. Microbiol. 3: 743-754.

311. Roeßler M., Müller, V. (2002) Chloride, a new environmental signal molecule involved in gene regulation in a moderately halophilic bacterium, Halobacillus halophilus. J. Bacteriol. 184: 6207-6215.

312. Roeßler M., Wanner G., Müller V. (2000) Motility and flagellum synthesis in Halobacillus halophilus are chloride dependent. J. Bacteriol. 182: 532-535.

313. Roslev P., Iversen N. (1999) Radioactive fingerprinting of microorganism that oxidize atmospheric methane in different soils. Appl. Environ. Microbiol. 65(9): 4064-4070.

314. Rudd J.W.M., Hamilton R.D. (1978) Methane cycling in a eutrophic shield lake and its effect on whole lake metabolism. Limnol. Oceanogr. 23(2): 337-347.

315. Rudd J.W.M., Hamilton R.D., Campbele N.E.R. (1974) Measurement of microbial oxidation of methane in lake water. Limnol. Oceanogr. 19(3): 519-524.

316. Russel N.J., Adams R., Bygraves J., Kogut M. (1986) Cell envelope phospholipids changes in moderate halophilic bacteria during phenotypic adaptation to altered salinity and osmotic stress. FEMS Microbiol. Rev. 39: 103-107.

317. Sakai Y., Mitsui R., Katayama Y., Yanase H., Kato N. (1999) Organization of the genes involved in the ribulosemonophosphate pathway in an obligate methylotrophic bacterium, Methylomonas aminofaciens 17sl. FEMS Microbiol. Lett. 176:125-130.

318. Salerno G.L., Curatti, L. (2003) Origin of sucrose metabolism in higher plants: when, how and why? Trends in Plant Science. 8: 63-69.

319. Santos H., daCosta M.S. (2002) Compatible solutes in organisms that live in hot saline environments. Environ. Microbiol. 4(9): 501-509.

320. Sara M., Sleytr U.B. (2000) S-layer proteins. J. Bacteriol. 182: 859-868.

321. Schouten S., Bowman J.P., Rijpstra I.C., Damste J.S.S. (2000). Sterols in psychrophilic methanotroph, Methylosphaera hansonii. FEMS Microbiol. Lett., V.186, № 2, p. 193195.

322. Shacterle G.R., Pollack R.L. (1973) A simplified method for quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem. 51: 654-657

323. Sharpe P.L., Koffas M., Wilczek J., Knoke K., Odom J.M. (2002) Genomic and genetic analysis of central carbon metabolism in the obligate methanotroph Methylomonas sp. 16A. (http://zeyc.mimas.ac.uk/zetoc/wzgw?terms=CN046661813&field=zid)

324. Sherwood Lollar B., Frape S. K., Fritz P., Macko S.A., Welhan J.A., Blomquist P.W. (1993) Evidence for bacterially generated hydrocarbon gas in Canadian shield and Fennoscandian shield rocks, Geochim. Cosmochim. Acta. 57: 5073-5085.

325. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1980) Pathways of ammonia assimilation in obligate methane utilizers. FEMS Microbiol. Lett. 5(1): 187-191.

326. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. (1982) Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 13(2): 237-242.

327. Sieburth J.M., Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M., Laux D. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixed layer of the deep ocean Methylomonaspelagica sp. nov. Curr. Microbiol. 14(5): 285-293.

328. Sinnighe Damste J.S., Strous M., Rijpstra W.I., Hopmans E.C., Greenvasen J.A., van Duin A.C., van Niftrik L.A. Jetten M.S.(2002) Linearly concatenated cyclobutane lipids from a dense bacterial membrane. Nature. 419: 708-712.

329. Skulachev V.P. (1992) The laws of cell energetics. Eur. J. Biohem. 208: 203-209.

330. Sleator R.D., Hill C. (2001) Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiol. Rev. 26:49-71.

331. Sleytr U.B. (1997) Basic and applied S-layer research: an overview. FEMS Microbiol. Rev. 20(1/2): 5-12.

332. Sleytr U.B., Beveridge T.J. (1999) Bacterial S-layers. Trends Microbiol. 7: 253-260.

333. Sleytr U.B., Sara M., Pum D., Schuster B. (2001) Characterization and use of crystalline bacterial cell surface layers. Prog. Surf. Sei. 68: 231-278.

334. Smirnova G.V., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. (2000) The role of antioxidant enzymes in response of Escherichia coli to osmotic upshift. FEMS Microbiol. Lett. 186: 209-213.

335. Smith A. J., Hoare D.R. (1977) Specialist phototrophs, lithotrophs and methylotrophs: a unity among a diversity of Procaryotes? Bacteriol. Rev. 41(l):419-448.

336. Smith R.L., Miller L.G., Howes B.L. (1993) The geochemistry of methane in Lake Fryxell, an amictic, permanently ice-covered, Antarctic lake. Biogeochemistry. 21:95115.

337. Söhngen N.L. (1906) Uber Bakteria welche Methan als Kohlenstorfnah'rung und Energie-quelle gebrauchen (On the bacteria which use methane as a carbon and energy source.) Zentr. Bakt. Parazitenk. 15:513-517.

338. Söhngen N.L. (1910) Sur de role du methane dans la vie organique (The role of methane in organic life). Ree. Trav. Chim. 29:238-374.

339. Sokolov A.P., Trotsenko Y.A. (1995) Methane consumption in (hyper) saline habitats of Crimea (Ukraine). FEMS Microbiol. Lett. 18(4):299-304.

340. Sorokin D.Y., Jones B.E., Kuenen J.G. (2000) A novel obligately methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment. Extermophiles. 4:145-155.

341. Southward A.J., Southward E.C., Dando P.R., Rau G.N., Felbeck N. Flügel H. (1981)i -y j -j

342. Bacterial symbionts and low C/ C ratios in tissues of Pogonophora indicate unusual nutrition and metabolism. Nature. 293:616-620.

343. Srere PA (1969) Citrate synthase. In: J.M. Lowenstein (ed) Methods in Enzymology. Academic Press, London. 13:3-11.

344. Stafford G.P., Scanlan J., McDonald I.R., Murrell J.C. (2003) rpoN, mmoR and mmoG, genes involved in regulating the expression of soluble methane monooxygenase in Methylosinus trichosporium OB3b. Microbiology (UK). 149: 771-1784.

345. Stephen K.C., Hamilton J.H. (1974) Gluconeogenesis by Veilionella parvula M4: evidence for the indirect conversion of pyruvate to P-enolpyruvate. Can. J. Microbiol. 20: 19-28.

346. Stirling D.I., Dalton H. (1978) Purification and properties of an NAD(P)+-linked formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. 107: 19-29.

347. Strom T., Ferenci T., Quayle J.R. (1974) The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium (OB3b). Biochem. J. 144:465-476.

348. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., Lidstrom M.E. (1999) Role of multiple gene copied in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath. Microbiology (UK). 145. 1235-1244.

349. Sugiyama K., Izawa S., Inoue Y. (2000) The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275(20):.15535-15540.

350. Sundh I., Borga P., Nilsson M., Svensson B.H. (1995) Estimation of cell number of methanotrophic bacteria in boreal peatlands based on analyses of specific phospholipid fatty acids. FEMS Microbiol. Ecol. 18:103-112.

351. Sutton G.C., Russell N.J., Quinn J.R. (1991) The effect of salinity on the phase behavior of total lipid extracts and binary mixtures of the major phospholipids isolated from a moderately halophilic eubacterium. Biochem. Biophys. Acta. 1061: 235-246.

352. Tamaoka J., Komagata K., Kinoshita T., Shen G., Kodama T., Imai I., Minoda Y.(1985) Methylubiquinone, a new isoprenoid quinone in methane-oxidizing bacterium strain H-2. FEMS Microbiol. Lett. 29(1/2): 151-154.

353. Taylor S.C. (1977) Evidence for the presence of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase and phosphoribulokinase in Methylococcus capsulatus (Bath). FEMS Microbiol.Lett. 2:305-307.

354. Taylor S.C., Dalton H., Dow C.S. (1981) Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and carbon assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. 122:89-94.

355. Thauer R.K. (1998) Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. Microbiology (UK). 144: 2377-2406.

356. Theisen A.R., Murrell J.C. (2005) Facultative methanotrophs revisited. J. Bacteriol. 187(13): 4303-4305.

357. Thiemann B., Imhoff I.F. (1991) The effect of salt on the lipid composition of Ectothiorhodospira. Arch. Microbiol. 156(5):376-384.

358. Thomas S.R., Trust T.J. (1995) Tyrosine phosphorylation of the tetragonal paracrystalline array of Aeromonas hydrophila: molecular cloning and high-level expression of the S-layer protein gene. J. Mol. Biol. 245: 568-581.

359. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmaugin F, Higgins DG (1997) The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 25:4876-4882.

360. Toukdarian A.E., Lidstrom M.E. (1984) Nitrogen metabolism in a new obligate methanotroph iMethylosinus' strain 6. J. Gen. Microbiol. 130:1827-1837.

361. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N., Beschastny A.P. (1996) The Ribulose Monophosphate (Quayle) cycle: News and Views. Microbial Growth on C compounds. Eds. Lidstrom M.E., Tabita. R. Kluwer Acad. Publishers. NY. 4-8.

362. Trotsenko Y.A., Shishkina V.A. (1990) Studies on phosphate metabolism in obligate methylotrophs. FEMS Microbiol. Rev. 87(3-4):267-271.

363. Truffa-Bachi P., Cohen G.N. (1970) Aspartokinase I and homoserine dehydrogenase I. Methods Enzymol. 17A: 694-699.

364. Tsien H.-C., Bratina B.J., Tsuji K„ Hanson R.S. (1990) Use of oligonucleotide signature probes for identification of physiological groups of methylotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 56:2858-2865.

365. Tsuji K., Tsien H.C., Hanson R.S., DePalma S.R., Scholtz R., LaRoche S. (1990) 16S ribosomal RNA sequence analysis for determination of phylogenetic relationships among methylotrophs. J. Gen. Microbiol. 136:1-10.

366. Uchiyama Y., Shinohara Y., Tomioka N., Kusakabe I. (1999) Induction and enhancement of stress proteins in trichloroethylene-degrading methanotrophic bacterium Methylocystis sp. M. FEMS Microbiol. Lett. 170:125-130.

367. Vecherskaya M.S., Galchenko V.F., Sokolova E.N., Samarkin V.A. (1993) Activity and species composition of aerobic methantrophic communities in tundra soils. Current Microbiol. 27: 181-184.

368. Ventoza A., Nieto J.J., Oren A. (1998) Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2): 504-544.

369. Vorholt J.A. (2002) Cofactor-dependent of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria. Arch. Microbiol. 178:39-249.

370. Vorholt J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R.K. (1998) NADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. 180:351-5356.

371. Vorholt J.A., Marx C.J., Lidstrom M.E., Thauer R.K. (2000) Novel formaldehyde activating enzyme in Methylobacterium extorquens AMI required for growth on methanol. J. Bacteriol. 182: 645-6650.

372. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Mamukelashvili A., Zalinova N., Gilichinsky D., Rivkina E., Vishnivetskaya T. (1997) The deep cold biosphere: facts and hypothesis. FEMS Microdiol. Rev. 20:277-290.

373. Wampler DE, Westhead EW (1968) Two aspartokinases from Escherichia coli. Nature of the inhibition and molecular changes accompanying reversible inactivation. Biochemistry 7: 1661-1671.

374. Walsh D.A., Cooper R.H., Denton R.M., Bridges B.I., Randle P.S. (1976) Elementary reactions of the pig heart pyruvate dehydrogenase complex. Biochem. J. 157:41-67.

375. Ward, N., Larsen, Q., Sakwa, J., Bruseth L., at al., and 38 coauthors. (2004) Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath) PLoS Biology. 2: 1616-1628.

376. Wartiainen, I., Hestens, A.G. and Svenning M.M. (2003) Methanotrophic diversity in high arctic wetlands on the islands of Svalbard (Norway) denaturing gel electrophoresis analysis of soil DNA and enrichment cultures. Can. J. Microbiol. 49, 602-612.

377. Wartiainen I., Hestnes A.G., McDonald I.R., Svenning M.M. (2006a) Methylobacter tundripaludum sp. nov., a methane-oxidising bacterium from arctic wetland soil on the Svalbard islands, Norway (78°N). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 109-113.

378. Wartiainen I., Hestnes A.G., McDonald I.R., Svenning M.M. (2006b) Methylocystis rosea sp. nov., a novel methanotrophic bacterium from Arctic wetland soil, Svalbard, Norway (78°N). Int. J. Syst. Evo. Microbiol. 56: 541-547.

379. Whalen, S.C., Reeburgh, W.S. (1990) Consumption of atmospheric methane by tundra soils. Nature. 346: 160-162.

380. Wampler D.E., Westhead E.W. (1968) Two aspartokinases from Escherichia coli. Nature of the inhibition and molecular changes accompanying reversible inactivation. Biochemistry. 7(5): 1661-1671

381. Whittenbury R. (1969) Microbial utilization of methane. Proc. Biochem. 4: 51-56.

382. Whittenbury R. (1980) The interrelationship of autotrophy and methylotrophy as seen in Methylococcus capsulatus (Bath). Microbial growth on C\ compounds. Ed. Dalton H. Heiden. London. 181-190.

383. Whittenbury R., Dalton H. (1981) The methylotrophic bacteria. In "The Procaryotes". Eds. M.P. Starr et al. Springer-Verlag, Berlin, 894-902.

384. Whittenbury R., Dalton H., Eccleston M., Reed H.L. (1975) The different types of methane oxidizing bacteria and some of their more unusual properties. Proc. Int. Symp. "Microbial Growth on Ci Compounds". Tokyo, 1-9.

385. Whittenbury R., Kelly D.P. (1977) Autotrophy: a conceptual phoenix. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 27: 121-149.

386. Whittenbury R., Phillips K.C., Wilkinson J.F. (1970) Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J. Gen. Microbiol. 61:205-218.

387. Wohlfarth A., Severin J., Galinski E.A. (1990) The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonadaceae. J. Gen. Microbiol. 136: 705-712.

388. Wolnak B., Andreen B.H., Chsholm J.A., Saaden M. (1967) Fermentation of methane. Biotechnol. Bioeng. 9: 57-68.

389. Wood A. P., Aurikko J. P., Kelly D. P. (2004) A challenge for 21st century molecular biology and biochemistry: what are the causes of obligate autotrophy and methanotrophy? FEMS Microbiol. Rev. 28:335 352.

390. Wood W.A. (1971) Assay of enzymes representative of metabolic pathways. Methods Microbiol. 6A: 421.

391. Woodland M.P., Gammack R. (1985) Microbial Gas Metabolism. Eds Poole R.K., Dow C.S. Academic Press. London.

392. Yoch D.C., Chen Y.P., Hardin M.G. (1990) Formate dehydrogenase from the methane-oxidizer Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. 172(8):4456-4463.

393. Zahn J.A., DiSpirito A.A. (1996) Membrane-associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. 178:1018-1029.

394. Zahn J.A., Bergman D.J., Kunz J.M., DiSpirito A.A. (2001) Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. 183: 832-6840.

395. Zhilina T.N., Zavarzin G.A. (1990) Extremely halophilic, methylotrophic anaerobic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 87(3-4): 315-322.

396. Zhilina T.N., Zavarzin G.A. (1994) Alkaliphilic anaerobic community at pH 10. Cur. Microbiol. 29(2): 109-112.