Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z"

На правахрукописи

ооьиэи—

БУТ СЕРГЕИ ЮРЬЕВИЧ

ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА САХАРОЗЫ У ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО МЕТАНОТРОФА ИЕттшмюяовтм Аьслыртшм-тъ

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2013

005058595

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Троценко Юрий Александрович

Официальные оппоненты: Дедыш Светлана Николаевна

доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, зав. лабораторией

Ивановский Руслан Николаевич доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник

Ведущая'организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН.

Защита состоится и^^ича. 2013г. в № 'РОч. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

по адресу: Московская область, г. Пущино, проспект Науки, д.5, ИБФМ РАН, 142290.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН. Автореферат размещен на официальном сайге Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru и на сайте Института www.ibpm.ru.

Автореферат разослан «_?£»

Ученый секретарь Диссертационного совета 4 ^у-Ч

кандидат биологических наук / Н.В. Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахароза - один из основных природных продуктов. Являясь ключевым углеводом растений и цианобактерий, сахароза может синтезироваться двумя путями: с помощью последовательного действия сахарозофосфатсинтазы (SPS) и сахарозофосфатфосфагазы (SPP) с образованием интермедиага сахарозо-6-фосфата или напрямую, под действием сахарозосинтазы (SuS), которая также участвует в деградации этого дисахарида. В настоящее время выделены и охарактеризованы ферменты, участвующие в синтезе сахарозы у высших растений и цианобактерий -сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза и сахарозоситаза [Lunn, MacRae, 2003; Hagemann, 2011].

Биосинтез сахарозы - довольно редкое явление у протеобактерий, реализуется у галофильных аэробных метилотрофов с рибулозомонофосфатным (РМФ) путем Ci-ассимиляции [Khmelenina et al., 1999; Троценко, Хмеленина, 2008], а гомологи генов биосинтеза сахарозы найдены также в геномах хемоавтотрофов Nitrosomonas europaea, Magnetococcus sp. MC-1, Acidithiobacillits ferrooxidans [Norton et al., 2008]. Однако распространение пути биосинтеза сахарозы и функциональная роль дисахарида в клетках метилотрофов и других протеобактерий не исследованы.

Априорно сахарозе отводится роль запасного соединения, накопление которого при различных стрессовых воздействиях указывает на защитную функцию, аналогичную таковой, показанной для трегалозы [Lunn, 2002]. Так, выживаемость клеток Escherichia coli, несущих ген сахарозофосфатсинтазы, возрастала в 104 раз [Billi et al., 2000]. Недавно показано, что сахароза выполняет функцию термопротектора у умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense 0-12 [Медведкова и др., 2007]. Однако до сих пор гены и ферменты биосинтеза сахарозы не охарактеризованы ни у одного представителя протеобактерий. Пути метаболизма сахарозы изучены лишь у не синтезирующих сахарозу гетеротрофов, но использующих ее в качестве ростового субстрата - Zymomonas mobilis [Zembrzuski et al., 1992], Lactococcus lactis [Thompson et al., 1991] и E. coli [Sigrell et al., 1998]. У этих бактерий гены, кодирующие ферменты метаболизма сахарозы, локализованы в кластерах, включающих также гены транспортных белков [Reid, Abratt, 2005]. В связи с вышеизложенным, представлялось актуальным исследовать гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий на примере галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - определение путей метаболизма сахарозы у модельного галотолерантного метанотрофа Ме1\гу1от1сгоЫит ЫсаИрЫ1ит 202. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Идентификация генов, участвующих в метаболизме сахарозы у Мт. а1саИрМ1ит 20Z.

2. Очистка и характеристика рекомбинангных сахарозофосфатфосфатазы, амилосахаразы и фрукгокиназы из Мт. а1саИрЫ1ит 202.

3. Получение и фенотипическая характеристика мутантов по генам ¿рт и ес/ВС.

4. Изучение распространенности и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы у прокариот.

Научная новизна. Гены метаболизма сахарозы, организованные в трех- и четерыхгенные кластеры, обнаружены у различных групп микроорганизмов -протеобакгерий (хемоавтотрофов и метилотрофных бактерий) и цианобактерий. Филогенетический анализ показал, что данные кластеры были приобретены путем горизонтального переноса генов. Установлено, что сахароза выполняет роль осмопротекгора у Мт. акаИрЫЫт 2ОХ. Получен мутантный штамм, дефектный по генам биосинтеза эктоина есгВ и ес/С, который накапливает в 8 раз больше сахарозы по сравнению с исходным штаммом. Также получен мутант по гену ¿рз, не способный синтезировать сахарозу, что подтверждает ключевую роль сахарозофосфатсинтазы в биосинтезе сахарозы у Мт. а1саИрЫ1ит 202. Впервые у протеобакгерий очищены до электрофоретической гомогенности и охарактеризованы рекомбинантные сахарозофосфатфосфатаза, амилосахараза и фруктокиназа. Доказана котранскрипция генов ат$ и /гиК, что подтверждает участие фрукгокиназы в реутилизации фруктозы, образующейся при деградации эндогенной сахарозы.

Научно-праетическое значение.

Благодаря высокой активности, стабильности и строгой специфичности к фруктозе препарат очищенной рекомбинантной фрукгокиназы может использоваться в биохимических исследованиях в качестве сопрягающего фермента, а также для аналитического определения фруктозы. Мутант с инактивированным геном 5/« при выращивании на среде с высоким содержанием ЫаС1 имеет больший, по сравнению с родительским штаммом, выход мультифункционального биопротектора эктоина, что может найти практическое применение.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2010-2012гг), на XV и XVI Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011-2012 гг), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи

«Экотоксикология-2011» (Тула, 2011 гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011-2012 гг).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398). Работа была поддержана грантами РФФИ №10-04-01224-а, 11-04-97544-р_центр_а.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н., с.н.с. Решетникову А.С., к.б.н. Розовой О.Н., к.б.н., н.с. Мустахимову И.И., к.б.н., н.с. Федорову Д.Н., к.т.н., с.н.с. Ежову В.А. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., в.н.с. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 ссылок, из них 8 на русском и 204 на английском языках, содержит 9 таблиц и 44 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служила чистая культура облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ВКМ В-2133 [Khmelenina et al., 1997]. Клетки выращивали на среде "2П" [Хмеленина и соавт., 1997], содержащей различные концентрации NaCl, в атмосфере метана и воздуха (1:1) или в присутствии 0,5 или 5% метанола Перед засевом в среду вносили стерильный раствор 1 М ИаНСОз (5 мл на 100 мл среды). Штаммы Escherichia coli Top 10, S-17-1 и Rosetta (DE3) выращивали при 37°С на жидкой или агаризованной средах "LB", добавляя, при необходимости, селективные антибиотики (канамицин - 50 мкг/мл, тетрациклин - 10 мкг/мл, хлорамфеникол - 25 мкг/мл, ампициллин - 100 мкг/мл).

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом [Marraur, 1961]. Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию проводили стандартными методами [Sambrook, Russell, 2001]. Тотальную РНК выделяли модифицированным методом [Chomczynski, Sacchi, 1987]. Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Аминокислотные последовательности выравнивали посредством программы ClustalX (vl.62b) [Thompson et al., 1997]. Филогенетический анализ

проводили, используя пакет программ MEGA4, модель Maximum Parsimony [Tamura et al., 2007].

Клонирование и экспрессия генов. Гены sps, spp, JruK и ams амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в векторах рЕТ30а+, рЕТ28Ь или рЕТ22Ь+. Полученными рекомбинантными плазмидами pETsps, pETspp, pETfruK или pETams трансформировали компетентные клетки Е. coli Rosetta (DE3). Экспрессию генов в Е. coli индуцировали добавлением изопропил-1-тио-/Ш-галактопиранозида (ИПТГ)-Рекомбинантные ферменты SPS-His6, SPP-His6, FruK-His6 и Ams-His6 очищали металл-хелатной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA -агарозой, согласно протоколу фирмы "Qiuagen" (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц белков определяли электрофорезом в 8-12%-ном SDS-ПААГ по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Нативные молекулярные массы (м.м.) ферментов определяли с помощью градиентного 4-30% ПААГ электрофореза. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [Schacterle, Pollack, 1973].

Характеристика сахарозофосфатфосфатазы. Активность SPP определяли по образованию неорганического фосфата двумя методами: непрерывно (с сопрягающими ферментами пирофосфат-зависимой 6-фосфофрукгокиназой, фрукгозофосфатизомеразой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой) или периодически, используя реактив Бенцини [Bencini et al., 1983] при 35°С и рН 6,5. Для определения оптимума рН использовали следующие буферы: Na-цитратный (рН 5.0-6.0), MES-KOH (рН 6.0-7.0), Трис-HCl (рН 7.5-9.0) и Na-карбонатный (рН 9.0-10.0). Значения Кт и Fmax рассчитывали с помощью программы SigmaPlot 10.

Характеристика амилосахаразы. Общую активность амилосахаразы определяли по скорости образования фруктозы, с помощью сопрягающих ферментов — фрукгокиназы, фруктозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Гидролитическую активность измеряли по скорости образования глюкозы, используя сопрягающие ферменты - гексокиназу и глюкозофосфатдегидрогеназу. Трансгликозилирующую активность рассчитывали как разность общей и гидролитической активности. Измерения проводили при 30°С и рН 8,0. При необходимости в реакционную смесь добавляли гликоген в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Для определения оптимума рН использовали следующие буферы: MES-KOH (рН 6.0-7.0), TAPS-КОН (рН 7.5-9.0) и Na-карбонатаый (рН 9.0-10.0). Для определения термостабильности фермента аликвоты преинкубировали в микропробирках от 5 мин до 1 ч при 30, 40, 50 или 60°С, быстро переносили в лед, затем измеряли остаточную активность фермента при 30°С.

Характеристика фруктокиназы. Активность FruK определяли с помощью сопрягающих ферментов - фруктозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Влияние pH на активность FruK изучали с использованием следующих буферов (50 мМ): MES-KOH (pH 6,0-7,0), K-фосфатный (pH 6,5-5,5), Трис-HCl (pH 8,0-9,0) и Na-карбонатный (pH 9,0-10,5). Для определения термостабильности FruK апиквоту фермента преинкубировапи от 5 мин до 1 ч при 30-60°С, быстро переносили в лед, затем измеряли остаточную активность фермента при 30СС.

За единицу активности ферментов принимали количество белка, катализирующее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

Получение нокаут-мутантов. Фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, фланкирующие гены sps, ams, ectB и ectC, клонировали в суицидальном векторе рСМ184. В результате были получены векторы pCMsps, pCMams и pCMectBC. Для коньюгации в Mm. alcaliphilum 20Z использовали штамм-донор Е. coli S17-1, который предварительно трансформировали соответствующей плазмидой. Трансконъюганты отбирали по устойчивости к канамицину и чувствительности к тетрациклину.

Выделение и анализ оемопротекторов. Низкомолекулярные органические осмопротекторы экстрагировали из клеток метанолом. Содержание сахарозы определяли антроновым методом [Handel, 1968]. Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ [Ешинимаев с соавт., 2007].

Все измерения были проведены в трех повторностях, на рисунках и в таблицах представлены средние значения и стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

X. Определение физиологической роли сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z.

При росте Mm. alcaliphilum 20Z на метане или в присутствии метанола содержание сахарозы в клетках возрастало с увеличением солености среды (рис. 1). Выявленная зависимость накопления сахарозы от внешней солености удовлетворяет определению осмопротектора. Ранее было выдвинуто предположение, что процесс биосинтеза сахарозы у галофильных/толерантных метанотрофов может служить механизмом стока избыточного

формальдегида,

Z

г]

□ 1%NaCI

□ 3%NaCI ■ 5%NaCI

накапливающегося в среде в высоких концентрациях при экспоненциальном росте клеток на метаноле [Ешинимаев с соавт., 2002].

Рис. 1. Накопление сахарозы клетками Мт. а/саИр/гИит 20Х.

метанол, 0,5% метанол, 5%

Однако, при замене метана на метанол (0,5% по объему) в среде культивирования, внутриклеточное содержание сахарозы у Мт. а1саИрЫ1ит ТЛЪ не возрастало, а в клетках, выращенных в среде с низкой соленостью в присутствии 5% метанола, уровень дисахарида уменьшался (рис. 1).

Содержание сахарозы в клетках, растущих в присутствии 5% ЫаС1 (0,855М), достигает 14-18 мкг/(мг биомассы), в пересчете на внутриклеточную воду это соответствует приблизительно 50 мМ, что недостаточно для уравновешивания осмотического давления среды. Вместе с тем известно, что при той же солености Мт. а1саИрЫ1ит 20Т накапливал эктоин в концентрации около 700 мМ [КИте1ешпа е1 а1., 1999]. Логично предположить, что у данного метанотрофа сахароза является дополнительным к эктоину осмопротектором.

1р-есШС-Р

Хромосома 202

рр-есШС-Я Суицидальный вектор рСМ184

рекомбинация

Хромосома ДесЙЗС

V

рстКт рр-есФС-Я

Рис. 2. Схема инактивации генов есгВ и ес(С и расположение праймеров.

Для подтверждения осмопротекторной функции сахарозы у Мт. ЫсаИрИИит 202, с помощью двойной гомологичной рекомбинации нами был получен штамм ДейВС с делецией по генам еаВ и ес^С, кодирующим, соответственно, ферменты биосинтеза эктоина - диаминобутиратаминотрансферазу и эктоинсинтазу (Рис. 2).

160 ч

140"

1?П.

о 15 100.

5 80"

2

40.

20-

□ 202 Рис. 3. Накопление

сахарозы клетками И АесЧВС штаммов 20/. и \сс(В<'.

выращенных при различных концентрациях N80.

1 1 ■ 1 ■ 3%№С| 5%ИаС|

В клетках штаммов 20Z и AectBC, выращенных в среде с метанолом (0,5% по объему) при различной солености, определяли содержание эктоина и сахарозы. Анализ показал, что мутантный штамм AectBC не накапливал эктоин, однако концентрация сахарозы в клетках мутанта была в ~8 раз выше, чем в клетках дикого типа (Рис. 3).

Ранее близкие результаты были получены для мутантного штамма Synechocystis sp. РСС 6803, дефектного по гену АДФ-глюкопирофосфорилазы и неспособного синтезировать основной осмопротектор - гликозилглицерин. Содержание сахарозы у мутанта было в 29 раз выше, по сравнению с диким типом, и соизмеримо с уровнем гликозилглицерина у дикого штамма [Miao et al., 2002]. Это указывает на присутствие у гапотолерантных организмов компенсаторных механизмов, позволяющих восполнять недостаток одного осмопротектора за счет увеличения концентрации другого.

2. Идентификация и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы

В недавно опубликованном частично аннотированном геноме Mm. alcaliphilum 20Z (http://www, eenoscope. ens.fr/externe/Enslish/corps anelais.html) обнаружен локус из 4 генов, продукты которых, предположительно, участвуют в метаболизме сахарозы. Транслированные аминокислотные последовательности этих генов проявляли гомологию с сахарозофосфатсинтазами (SPS), сахарозофосфатфосфатазами (SPP), сахарокиназами pfkB-семейства и амилосахаразами (Ams). Предполагаемая сахарозофосфатсинтаза Mm. alcaliphilum 20Z проявляла наибольшее сходство с ранее охарактеризованными ферментами из цианобактерий Synechocystis РСС 6803 [Lunn et al., 2003], Synechococcus sp. 7002 [Cumino et al., 2010] и Prochlorococcus marinus [Lutfiyya et al., 2007] (соответственно 56,8; 53,1 и 42% идентичности транслированных аминокислотных последовательностей). Значительно меньшее сходство обнаружено с сахарозофосфатсинтазами таких растений, как Nicotiana tabacum [Lutfiyya et al., 2007], Arabidopsis thaliana [Park et al., 2008] и Zea mays [Bruneau et al., 1991] (29; 28,9 и 28,4% идентичности), и SPS галотермофильной анаэробной бактерии Halothermothrix orenii (20,9% идентичности) [Huynh et al., 2005].

Продукт второго гена был гомологичен сахарозофосфатфосфатазе из Synechococcus sp. 7002 [Cumino et al., 2010] (49,8% идентичности), однако имел лишь незначительное сходство с SPP Zea mays и N. tabacum (15,9 и 16, 7 % идентичности) [Lunn et al., 2000; Chen et al., 2005].

Открытая рамка считывания (ОРС), следующая за предполагаемым геном сахарозофосфатфосфатазы, кодировала белок, сходный с сахарокиназами pfkB-семейства. Данное семейство включает АТР-зависимые ферменты: рибокиназу, кетогексокиназу, фруктокиназу, 2-дегидро-З-дезоксиглюкокиназу, 1-фосфофруктокиназу, тагатозокиназу, 67

фосфофруктокиназу архей, а также минорную 6-фосфофруктокиназу (PfkB) Е. coli [Bork et al., 1993; Sigrell et al., 1997].

Продукт четвертой OPC данного кластера был аннотирован в геноме изучаемого метанотрофа как а-амилаза, однако имел наиболее высокую гомологию с охарактеризованными амилосахаразами гетеротрофных бактерий: Alteromonas macleodii [На et al., 2009], Neisseriapolysaccharea [De Montalk et al., 1999], Deinococcus geothermalis [Jung et al., 2009] и Deinococcus radiodurans [Pizzut-Serin et al., 2005] (39,4; 38,5; 37,6 и 36,7% идентичности соответственно).

Идентичные кластеры генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы (sps-spp-pfkB-ams), обнаружены нами у других представителей метанотрофов (Methylomicrobium album BG8 и Methylobacter íundripaludum SV96). а также у не растущих на метане метилобактерий (Methylophaga aminisulfidivorans MP и Methylophaga thiooxydans DMSOIO). У Methylomonas methanica MC09, в отличие от других метанотрофов, ген амилосахаразы расположен дистантно, т.е. отдельно на хромосоме. Кроме того, кластеры sps-spp-pfkB-ams обнаружены у цианобакгерии Synechococcus sp. РСС 7002 и хемоавтотрофных протеобактерий (Mariprofundus ferrooxydans PV-1, Thiocapsa marina 5811, Thiomicrospira crunogena XL-1 и Marichromatium purpuratum 984 (Рис. 4).

Mm. alcaliphilum 20Z, Methylobacter íundripaludum SV96, Mm. album BG8, Methylophaga aminisulfidivorans MP, Mariprofundus ferrooxydans PV-1, Synechococcus sp. PCC 7002, Thiocapsa marina 5811, Thiomicrospira crunogena XL-1, Marichromatium purpuratum 984

Desulfomicrobium baculatum DSM 4028

Methylobacillusflagellaius KT, Methylovorus sp. SIP3-4, Nitrosomonas sp. AL212

Methylomonas methanica MC09, Allochromatium vinosum DSM 180

Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC_53993, N. oceani ATCC 19707, N. halophilus Nc4, N. multiformis ATCC 25196

Рис. 4. Структура кластеров генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы у метилотрофов, хемоавтотрофов и цианобактерий.

sps spp fruK ams

fruK sps sus

lllllllljll

У некоторых бактерий структура генного кластера метаболизма сахарозы отличалась от таковой Mm. alcaliphilum 20Z. Так, у галофильных аммоний-окисляющих Nitrosococcus halophilus Nc4 и Nitrosococcus oceani АТСС 19707 гены spp располагаются отдельно на хромосоме, хотя сахарозофосфатфосфатазы этих бактерий филогенетически близки ферменту из Mm. alcaliphilum 20Z (41,3% и 40,1% идентичности, соответственно).

Более того, в хромосоме метилобактерий Mb. flagellatus KT и Methylovorus sp. SIP3-4, а также у хемовтотрофов A. ferrooxidans АТСС_53993 и Nitrosospira multiformis АТСС 25196 отсутствует ген spp. Интересно, что С-концевой домен как растительных, так и большинства цианобактериальных сахарозофосфатсштгаз гомологичен сахарозофосфатфосфатазе [Cumino et al., 2002; Lunn, 2002; Lunn and MacRae, 2003]. На этом основании предположено, что фермент может катализировать как синтазную, так и фосфатазную реакции [Lunn, 2002].

Итак, анализ доступных в Database геномов микроорганизмов выявил у хемоавтотрофных и метилотрофных бактерий присутствие генов, продукты которых проявляют гомологию с ферментами биосинтеза и реутилизации сахарозы, и которые, как правило, локализованы в трех- или четырехгенном кластерах. Однако гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобакгерий не изучались. К настоящему времени охарактеризованы только сахарозофосфатсинтазы и сахарозофосфатфосфатазы некоторых растений и цианобактерий, а ферменты утилизации экзогенной сахарозы - только у бактерий, использующих дисахарид в качестве ростового субстрата. В этой связи представлялось интересным определить функциональность генов кластера sps-spp-pjkB-ams у Mm. alcaliphilum 20Z, выделить и охарактеризовать соответствующие ферменты.

3. Определение функциональной роли гена сахарофосфатсинтазы (sps)

Ген sps (GenBank ССЕ22309.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в векторе рЕТ30а+, далее рекомбинантной плазмидой pETsps трансформировали компетентные клетки Е. coli Rosetta (DE3). Экспрессию рекомбинантного белка SPS-His6 индуцировали добавлением ИПТГ. Фермент был очищен из лизата клеток Е. coli до элекгрофоретически гомогенного состояния методом аффинной метапл-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-arapo3ofi. Однако полученный препарат фермента был неактивен. Для определения функциональной роли sps нами был получен мутант с инсерцией канамициновой кассеты в данном гене по схеме мутагенеза, аналогичной таковой для конструирования мутанта ectBC (Рис. 2). В клетках мутанта, выращенных на метаноле (0,5% по объему) при различной солености среды, определяли содержание сахарозы. Обнаружено, что полученный мутант не накапливал сахарозу. Это свидетельствовало о ключевой роли продукта гена sps в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z, а также о

том, что у данного метанотрофа функционирует единственный путь синтеза сахарозы с участием сахарозофосфатсинтазы.

4. Характеристика рекомбинантой сахарозофосфатфосфатазы (SPP).

Ген spp (GenBank ССЕ22310.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20k и клонировли в вектор рЕТ28Ь. Фермент, экспрессированный в клетках Е. coli Rossetta (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Согласно данным ДСН-ПААГЭ, электрофоретическая подвижность белка соответствовала м.м. ~35 кДа (Рис. 5А), что согласуется с теоретически рассчитанной м.м. (32,7 кДа). Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом пористости выявил несколько белковых полос с м.м. примерно 35, 70, 150 и 210 кДа, что указывает на возможность существования фермента одновременно в форме мономера, димера, тетрамера и гексамера (Рис. 5Б)

А M М2345Б Рис. 5.12% ДСН-ПААГ

Я 118 кДа б69кДа ». . электрофорез (А) и

90 кДа

440 кДа нативный градиентный 4-

232 кДа -

ff 48 кДа 30% ПААГЭ

s i ЗбкДа ' Î ? рекомбинантной SPP. 1,2,3,

. ..

27 кДа 67 кДа ..... ' %* 4, 5, - 5, 10, 20 и 40 мкг SPP

ff* соответственно, M -

Il 20 кДа ЗбкДа молекулярные маркеры.

Рекомбинантный фермент катализировал гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата. Наибольшую активность сахарозофосфатфосфатаза проявляла при 35°С и pH 6,5 (Табл.1).

Интересно отметить, что оптимумы работы SPP не совпадали с оптимальными условиями роста штамма 20Z (pH 9 и 30°С), но близки таковым у сахарозофосфатфосфатаз из других организмов (Табл. 1). Возможно, это объясняется приобретением генов синтеза сахарозы путем горизонтального переноса от мезофилов.

Зависимость активности SPP от концентрации сахарозо-6-фосфата соответствовала классическому уравнению Михаэлиса-Ментен (Гшах= 18,9±0,6; Кт = 36±4 мкМ). Активность сахарофосфатфосфатазы незначительно ингибировалась сахарозой {К\ = 1±0,6 М). Данная константа ингибирования гораздо выше, чем у других охарактеризованных SPP. По-видимому, эта особенность фермента из Mm. alcaliphilum 20Z обусловлена необходимостью поддержания высокой внутриклеточной концентрации сахарозы.

Таблица. 1. Свойства некоторых сахарозофосфатфосфатаз

Параметры Мт. alcaliphilum 20Z Synechocystis sp.PCC 6803 Anabaena sp. PCC 7120 Oryza sativa Pisum sativum

Молекулярная

масса 32,7 27 28 50 55

субъединицы, кДа мономер,

Субъединичная димер, мономер мономер димер димер

структура тетрамер, гексамер

рН оптимум 6,5 6,8 6,5 6,5 6,8

Температурный 35

оптимум (°С)

Кт (мМ) 0,036 0,0075 0,35 0,065 0,25

Ктах (Е/мг) 18,9 46 15,7 1250 -

^¡(сахароза) (мМ) 1000 161 80 - -

Ссылка Данная работа [Lunn, 2002] [Cumino et al., 2001] [Lunn et al., 2000] [Whitaker, 1984]

5. Характеристика рекомбинантой амилосахаразы (Ams).

Ген ams (GenBank ССЕ22312.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в вектор рЕТ30а+. Рекомбинантный фермент Ams-Hise экспрессировали в клетках Е. coli Rossetta (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Электрофоретическая подвижность бежа в ДСН-ПААГ соответствовала -75 кДа (Рис. 6А), что согласуется с расчетной м.м. (76,7 кДа). Нативный электрофорез в градиенте ПААГ (4-30%) выявил единственную полосу с м.м. около 70 кДа (Рис. 6Б), что свидетельствует о мономерной форме фермента.

А

94,6 кДа 66,2 кДа

45,0 кДа

М

669 кДа

^ ,4 440 кДа 232 кДа

г

Рис.6. 8% ДСН-ПААГ электрофорез (А) и нативный градиентный 430% ПААГЭ рекомбинантной амилосахаразы.

Аналогично другим описанным амилосахаразам, рекомбинантная Атв из Мт. ЫсаИрИИит 20Х катализировала одновременно гидролиз сахарозы до фруктозы и глюкозы, а также трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного остатка сахарозы на

полигликан [van der Veen et al., 2006; Pizzut-Serin et al., 2005; Jung et al., 2009; Ha et al., 2009]. Фермент проявлял максимальную активность при 30°С и рН 8,0, что согласуется с экофизиологическими параметрами, оптимальными для роста Mm. alcaliphilum 20Z.

Зависимость активности рекомбинантной амилосахаразы Mm. alcaliphilum 20Z от концентрации сахарозы подчинялась классической кинетике Михаэлиса-Ментен (Рис. 7), в отличие от ранее описанных Ams из Neisseria polysaccharea [De Montalk et al., 2000] и Deinococcus radiodurans [Pizzut-Serin et al., 2005]. Амилосахаразы этих гетеротрофных бактерий имели два плато на кривой зависимости активности от концентрации сахарозы и, соответственно, по два значения Vmix и Кт (Табл. 3). У амилосахаразы из N. polysaccharea и D. radiodurans имеется дополнительный сайт связывания сахарозы (SB2), наличие которого, по-видимому, обуславливает необычные кинетические свойства фермента [Skov et al., 2002]. Выравнивание аминокислотных последовательностей амилосахараз показало, что у Ams из Mm. alcaliphilum 20Z в позиции, соответствующей Gin445 и Туг446 в SB2 сайте N. polysaccharea, находятся метионин и аргинин (Рис. 7), что, вероятно, делает дополнительный субстрат-связываютций сайт нефункциональным.

Mm. а leal iph ílum Mm.album Methylovorus Mb.flagellatus Mp. aminisulfidivorans Synechococcus sp. 7002 T. crunogena N. polysaccharea N. sub flava D.geothermalis D.radiodurans

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей амилосахараз.

Рамкой обозначены аминокислоты, участвующие в связывании сахарозы в дополнительном субстрат-связывающем сайте амилосахаразы из N. polysaccharea [Skov et al., 2002].

Амилосахараза имела более высокое сродство к сахарозе в реакции трансгликозилирования (табл. 2), однако при введении в реакционную смесь затравки гликогена кажущаяся Кт для сахарозы как в реакции гидролиза, так и в реакции трансгликозилирования была одинакова. Кроме того, добавление гликогена увеличивало скорость трансгликозилирования, при этом скорость гидролиза сахарозы не изменялась.

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что основной функцией амилосахаразы является перевод избыточного количества эндогенной сахарозы Мт. а1саНрЫ1ит 20Ъ в полигликаны типа гликогена.

Таблица 2. Кинетические параметры рекомбинантной амилосахаразы Мт. а1саИрЫ1ит 20Z.

Реакция Без добавления гликогена В присутствии 0,1 мг/мл гликогена

Утах> нмоль/(мин*мг) Кткаж, мМ Углах, нмоль/(мин* мг) С'мМ

Трансгликозилирование 60±2 6±1 98±1 11,2±0,8

Гидролиз 53±1 11±1 51±1 12±1

6. Получение иисерционного мутанта по гену я»г$

Методом двойной гомологичной рекомбинации был получен мутант с инсерцией канамициновой кассеты в гене атя.

П20Т "Г С Дате

3%МаС1

Рис. 8. Накопление сахарозы клетками штаммов 20Z и Дате, выращенных при различном содержании N80 в среде.

Полученный мутант и штамм дикого типа выращивали на метаноле (0,5% по объему) при различных концентрациях МаС1. В клетках мутанта обнаружено примерно в 1,3 раза больше сахарозы, по сравнению с исходным штаммом (Рис. 8), что подтверждает участие амилосахаразы в деградации эндогенной сахарозы у Мт. акаИрШит 207.

Таблица 3. Свойства некоторых амнлосахараз прокариот.

Параметр Mm. alcaliphilum Neisseria polysaccharea Deinococcus radiodurans Deinococcus geothermalis Alteromonas addita

Субъединичная структура мономер (1 х76 кДа) мономер (1*70 кДа)

рН оптимум 8,0 6,0 7,0 7,0 (Гидролиз) 8,0 (Трансгликозилирование)

Температурный оптимум,"С 30 42 36 47 45

Кт, мМ

Общая активность 8,1 (11,3)* 4,0 ([сахароза] < 20 мМ) 71 ([сахароза] > 20 мМ) 10 ([сахароза] < 41 мМ) 84 ([сахароза] > 41 мМ)

Трансгликозилирование 6 (11,2)» 8,1 ([сахароза] <20 мМ) 112 ([сахароза] > 20 мМ

Гидролиз 11(11)» 2,5 ([сахароза] < 20 мМ) 29 ([сахароза] > 20 мМ)

4с.ь мин'

Общая активность 8,7(11,2)» 44([сахароза] < 20 мМ) 84 ([сахароза] > 20 мМ) 49,2 ([сахароза] < 41 мМ) 121 ([сахароза] > 41 мМ)

Трансгликозилирование 4,6(7,5)» 26 ([сахароза] < 20 мМ) 54 ([сахароза] > 20 мМ)

Гидролиз 4,1 (4,0)» 21 ([сахароза] < 20 мМ) 31 ([сахароза] < 20 мМ)

Ссылка Данная работа [Jung et al., 2009; van der Veen etal., 2006] [Emond et al., 2008; Pizzut-Serin etal., 2005] [Jung et al., 2009] [Ha et al., 2009]

* - в присутствии 0,1 мг/мл гликогена

7. Характеристика рекомбинантой фруктокиназы (FruK).

Ген, предварительно аннотированный как pfliB (GenBank ССЕ22311.1), амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в вектор рЕТ22Ь+. Рекомбинантный фермент экспрессировали в клетках Е. coli Rossetta (DE3), трансформированных плазмидой pETfruK. Фермент очищали из лизата клеток аффинной металл-хелатной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA-arapo3ofl до электрофоретически гомогенного состояния. Молекулярная масса субъединицы, определенная с помощью ДСН-ПААГЭ, соответствовала расчетной (34,5 кДа) (Рис. 9А). Нативный градиентный (430%) электрофорез в ПААГ выявил единственную полосу, соответствующую м.м. около 35 кДа (Рис. 9Б). Резонно предположить, что фермент in vivo является мономером.

Рекомбинантный белок катализировал АТФ-зависимое фосфорилирование фруктозы до фруктозо-6-фосфата, т.е. являлся фруктокиназой. Рекомбинантная FruK имела абсолютную специфичность к фруктозе, как акцептору фосфорильной группы, но не проявляла активности с глюкозой, ксилозой, рибозой, арабинозой, мальтозой, сахарозой, а также с глюкозо-6-фосфатом и фруктозо-6-фосфатом. Фруктокиназа была способна использовать в качестве фосфорильного донора АТФ, ГТФ и УТФ, но не ЦТФ и не пирофосфат.

М М

440 кДа

94,6 кДа 66,2 кДа 45,0 кДа

31,0 кДа и 21,5 кДа

Рис. 9. 12% ДСН-ПААГ электрофорез (А) и градиентный 4-30% ПААГ электрофорез (Б) рекомбинантной фруктокиназы.

Активность фермента зависела от ионов двухвалентных металлов (относительная активность): Мв2+ (100%), Мп2+ (146%), Со2+ (63%), гп2+(1,1%), №2+ (0,8%). Активность фермента не обнаруживалась в отсутствии металла-кофактора. Максимальная активность проявлялась при соотношении концентраций АТФ и М§2+ в диапазоне 1:1 - 1:1,5 (Рис. 10).

По-видимому, фруктокиназа использует комплекс Mg-АТФ и ингибируется свободным АТФ и высокими концентрациями ионов Mg2"1".

Рекомбинантная фруктокиназа была максимально активна при рН 9,0, что коррелирует с оптимальным значением рН для роста штамма 20Z. Напротив, температурный оптимум FruK (60°С) вдвое превышал таковой для роста данного метанотрофа. Аномально высокий температурный оптимум был обнаружен также у фруктокиназы из Bifidobacterium longum [Caescu et al., 2004] (Табл. 4).

Рис. 10. Зависимость активности фруктокиназы от концентрации ионов при постоянной концентрации АТФ (10 мМ).

Фруктокиназа из Мт. а1саНрЫ1ит 202 подчинялась классической кинетике Михаэлиса-Ментен, имела достаточно высокую активность и высокое сродство к фруктозе (Кшах= 141±6 Е/мг, кажущиеся ^тфрукгоза = 0,26±0,03 мМ, £тАТФ = 1,3±0,2 мМ), что указывает на способность данного метанотрофа метаболизировать фруктозу при достаточно низких концентрациях в клетке. Поскольку Мт. акаИрИИит 20Ъ не растет на фруктозе или других углеводных субстратах, роль фруктокиназы у данного метанотрофа не связана с ассимиляцией экзогенных Сахаров. Учитывая расположение гена 7гаК в кластере генов метаболизма сахарозы, можно предположить участие фруктокиназы в реутилизации сахарозы, образующейся при катаболизме эндогенной сахарозы амилосахаразой.

Таблица 4. Свойства некоторых фруктокиназ прокариот.

Параметры

Mm. Thermococcus Bifidobacterium Zymomonas Lactococcus

alcaliphilum 20Z litoralis longum mobilis lactis

Молекулярная масса субъединицы, кДа

35

35

28

Субъединичная

структура

рН-Оптимум

t-Оптимум

Субстратная

специфичность

Кт, мМ:

Фруктоза

АТР

Kiax, Е/мг белка:

Фруктоза

АТФ

Относительная активность с донором фосфорильных групп

мономер

9,0 60° Фруктоза

дим ер

7,5-8,0 80° Фруктоза

мономер

6,0 50° Фруктоза

димер

7,4

Фруктоза Манноза

Данная работа

[Qiuhao et al., 2004]

[Caescu et al., 2004]

димер

7,0

Фруктоза Манноза

0,25 2,3 0,74 0,7 0,31

1,3 0,81 0,77 0,45 0,59

141 920 1,8 350 -

АТФ (100%), АТФ (100%), АТФ (100%), - АТФ>ГТФ>

ГТФ (52%), ИТФ (73%), ИТФ (78%), ИТФ>УТФ

УТФ (22%), ГТФ (62%), ГТФ (23%),

ЦТФ (0%), УТФ (16%), ЦТФ (6%),

ФФ„(0%) ЦТФ (16%) ТТФ (0,18%)

[Fennington, [Thompson et al., Hughes, 1996]_1991]

8. Транскрипционная организация генов/гиК и шт

Для изучения потенциальной котранскрипции генов /гиК и ать, проводили ПЦР с применением обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР). кДНК, синтезированную с праймером Аб-ЯТ, использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами 1р-аз-Р и 1р-а5-11. В результате был получен фрагмент ДНК ожидаемой длины - 1010 п.н. Следовательно, гены /гик и атз сцеплены и транскрибируются в виде одной мРНК (Рис. 11).

Рис. 11. Транскрипционная организация /гиК и агт генов. 1 - ПЦР продукт, полученный с кДНК, 2 - ПЦР продукт, полученный с хромосомной ДНК (положительный контроль), 3 - ПЦР продукт, полученный с РНК, не подвергнутой обратной транскрипции (отрицательный контроль).

1010 п.н.

Одним из продуктов деградации сахарозы под действием амилосахаразы является фруктоза. Котранскрипция генов /гиК и атз подтверждает предположение об участии фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образовавшейся при катаболизме эндогенной сахарозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В частично аннотированном геноме галотолерантного метанотрофа \iethylomicrobium ЫсаИрЫЫт 20Х нами впервые обнаружен кластер генов зрз-.чрр-/гиК-атз, продуктами которых являются сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза, фруктокиназа и амилосахараза, катализирующие биосинтез и последующий метаболизм сахарозы. Показано, что сахароза накапливается р клетках при увеличении солености среды, но не в ответ на смену источника углерода и энергии с метана на метанол или повышение концентрации метанола в среде. Мутантный штамм, дефектный по генам основного осмопротектора - эктоина, накапливал в 8 раз больше сахарозы, по сравнению с родительским штаммом. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что Мт. а1саИрЫ1ит 20Ъ синтезирует сахарозу в качестве дополнительного осмопротектора.

Достоверно установлено, что кластер ¡рз^р-УгиК-атя присутствует в геномах как галофильных, так и негалофильных метилотрофов с РМФ путем (^-ассимиляции. Кроме того, гомологи этих генов найдены у галофильных и соленезависимых автотрофных протеобактерий с РБФ-циклом. В совокупности, это указывает на иные, нежели осмопротекторная, функции сахарозы у прокариот. Наличие аналогичных генных кластеров метаболизма сахарозы у различных групп прокариот, а также филогенетический анализ аминокислотных последовательностей соответствующих ферментов свидетельствуют о горизонтальном переносе генов, участвующих в биосинтезе и деградации сахарозы.

Впервые из метанотрофов клонированы гены сахарозофосфатфосфатазы, фруктокиназы и амилосахаразы, получены и охарактеризованы гомогенные препараты этих ферментов. Рекомбинантная сахарозофосфатфосфатаза отличалась от ранее охарактеризованных аналогичных ферментов присутствием нескольких олигомерных форм, а также высокой константой ингибирования сахарозой. Эта особенность сахарозофосфатфосфатазы коррелирует с осмопротекгорной ролью сахарозы и необходимостью поддержания относительно высокой внутриклеточной концентрации этого дисахарида.

Рекомбинантная амилосахараза Мт. ЫсаИрИИит 20Х, в отличие от описанных амилосахараз гетеротрофных бактерий, имела на порядок более низкую активность и подчинялась кинетике Михаэлиса-Ментен. Низкая активность амилосахаразы может быть

также связана с необходимостью поддерживать определенный пул сахарозы в клетке. Инактивация гена ams приводила к увеличению внутриклеточного содержания сахарозы, что подразумевает участие амилосахаразы в катаболизме дисахарида. Поскольку Mm. alcaliphilum 20Z синтезирует гликогеноподобный полисахарид [Khmelenina et al., 1999], логично предположить, что этот метанотроф реализует путь синтеза гликогена с использованием сахарозы в качестве интермедиата.

Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивной фрукшкиназы, имеющей строгую специфичность и высокое сродство к фруктозе, а также тот факт, что гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной матричной РНК, определенно свидетельствуют в пользу участия данного фермента в активировании образующейся фруктозы для последующего включения в метаболизм.

Клонирование и гетерологичная экспрессия гена sps в Е. coli не привели к получению активного препарата сахарозофосфатсинтазы. Однако инактивация гена sps сопровождалась потерей способности культуры синтезировать сахарозу, что подразумевает ключевую роль гена этого фермента в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. В то же время, наличие гена сахарозофосфатфосфатазы указывает на то, что биосинтез сахарозы у данного метанотрофа происходит двухступенчато, с образованием сахарозо-6-фосфата в качестве интермедиата, т.е. путем, функционирующим у растений и цианобакгерий [Page-Sharp et al., 1999; Lunn et al., 2000].

Как известно, Mm. alcaliphilum 20Z реализует РМФ-путь ассимиляции формальдегида с образованием фосфогексоз, в частности, фруктозо-6-фосфата и глюкозо-1-фосфата [Хмеленина с соавт., 1997]. Присутствие в геноме данного метанотрофа генов-гомологов АДФ-глюкопирофосфорилазы (YP004918751.1) и УДФ-глюкопирофосфорилазы (YP004918011.1) свидетельствует о том, что синтез сахарозы происходит именно из этих первичных продуктов РМФ-пути (Рис. 12).

Кроме того, присутствие амилосахаразы и фруктокиназы означает, что эндогенная сахароза в некоторых случаях (например, при понижении солености среды) используется для синтеза осмотически инертного гликогена (Рис. 12). Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z гена, кодирующего гликогенсинтазу, свидетельствует о том, что гликоген может синтезироваться альтернативным путем. Из приведенной схемы следует, что при синтезе гликогена с участием сахарозофосфатсинтазы и амилосахаразы затрачивается на одну молекулу нуклеозидгрифосфата больше, чем при участии гликогенсинтазы. Можно предположить, что синтез сахарозы с последующей трансформацией в гликоген служит своеобразным футильным циклом, используемым метанотрофом для сброса избыточной метаболической энергии.

ммо

СИ,

МДГ ФАДГ ФДГ СНзОН-► нсно -► нсоон -

Рибулозо-5Ф'

ГФС

Гексулозо-бФ I ГФИ

со2

Фруктоза

АТФ АДФ

Фруктозо-6Ф_

,_„ SPP

Ams J—Сахароза Сахарозо-бФ -

Pi

SPS

УДф"Л

(Гликоген),,

ФГИ

\

(Гликоген)„н

АДФ

УДФ-глюкоза

УПФ

Глюкозо-бФ

ФГМ Глюкозо-1Ф

АТФ

ФФн УТФ

АДФ-глюкоза

АПФ

/ ч

ФФн

Рис. 12. Предполагаемая схема метаболизма сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z.

ММО - метанмонооксигеназа, МДГ - метанолдегидрогеназа, ФАДГ -формальдегиддегидрогеназа, ФДГ - формиатдегидрогеназа, ГФС -гексулозофосфатсинтаза, ГФМ - гексулозо-фосфатизомераза, ФГИ -фосфоглюкоизомераза, ФГМ - фосфоглюкомутаза, УПФ - УДФ-глюкопирофосфорилаза, АПФ - АДФ-глюкопирофосфорилаза, ГС - гликогенсинтаза, SPS - сахарозофосфатсинтаза, SPP - сахарозофосфатфосфатаза, FruK - фруктокиназа, Ams - амилосахараза.

Таким образом, среди прокариот только фототрофы и хемоавтотрофы, а также аэробные метилотрофы способны синтезировать сахарозу. Исходя из высокой гомологии генов и ферментов метаболизма сахарозы у этих групп бактерий, уместно предположить реализацию у них аналогичного биохимического пути. В совокупности, это подтверждает ранее выдвинутую гипотезу общности происхождения автотрофных и метилотрофных прокариот [Whittenbury et al., 1980].

Данная работа инициировала расшифровку путей метаболизма и функциональной роли сахарозы у метилотрофных протеобактерий. Дальнейшие системные исследования особенностей биологии Mm. alcaliphilum 20Z и негалофильных (Methylobacillus ßagellatus KT) или термофильных (Methylocaldum szegediense 0-12) метилотрофов, включая анализ их генопротеомов и транскриптомов, приведут к лучшему пониманию феномена полифункциональности сахарозы, а также внесут ясность в сценарий эволюции путей метаболизма сахарозы у прокариот.

ВЫВОДЫ

1. В геноме галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z обнаружен кластер из четырех генов, продукты которых - сахарозофосфатсинтаза (SPS), сахарозофосфатфосфатаза (SPP), фрукгокиназа (FruK) и амилосахараза (Ams), участвуют в метаболизме сахарозы.

2. В экспериментах с мутантами доказано, что сахароза является дополнительным к эктоину осмопротектором. Инактивация двух генов пути биосинтеза основного ■ осмопротектора - эктоина, приводит к 8-кратному увеличению накопления сахарозы в клетках мутанта AectBC. Впервые полученный инсерционный мутант по гену сахарозофосфатсинтазы (Asps) не способен накапливать сахарозу, но при высокой солености среды культивирования синтезирует большее количество эктоина, чем исходный штамм.

3. Установлено, что рекомбинантная сахарофосфатфосфатаза существует в нескольких олигомерных формах с м.м. 33, 66, 132 и 198 кДа, катализирует гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата (Утх,- 18,9±0,6 Е/мг, Кткгж= = 36±4 мкМ).

4. Обнаружено, что рекомбинантная амилосахараза является мономером с м.м. 75 кДа, катализирует одновременно гидролиз сахарозы (Fmax = 53±1 мЕ/мг, А"тк"< = 11±1 мМ) и трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного остатка сахарозы на гликоген (Fmax = 60±2 мЕ/мг, Кт™ = 6±1 мМ), тем самым участвуя в деградации сахарозы и образовании полисахарида.

5. Выявлено, что рекомбинантная фрукгокиназа - мономер с м.м. 34,5 кДа, катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование фруктозы до фрукгозо-6-фосфага (Fmax = 141±6 Е/мг, кажущиеся АГтфрук1ша = 0,26±0,03 мМ, АГтАТФ = 1,3±0,2 мМ). Гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной полицистронной мРНК.

6. Впервые предложена схема путей метаболизма сахарозы у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Сахароза синтезируется из интермедиатов рибулозомонофосфатного

цикла ассимиляции формальдегида: фруктозо-6-фосфата и УДФ-глюкозы. Последующее превращение сахарозы в гликоген, по-видимому, служит не только для запасания углерода, но и для сброса избыточной метаболической энергии в клетках данного метанотрофа.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Бут С.Ю., Розова О.Н., Хмеленина В.Н., Решетников A.C., Троценко Ю.А. Свойства рекомбинантной АТР-зависимой фрукгокиназы галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Биохимия, 2012, Т. 77, Вып. 4, С. 474-480.

2. Бут С.Ю., Хмеленина В.Н., Мустахимов И.И., Троценко Ю.А. Получение и характеристика нокаут-мутантов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектных по генам синтеза сахарозы и экгоина. Микробиология. 2013. Т.82. №2. С. 251-253.

Тезисы докладов:

1.Бут С.Ю., Куревлев C.B., Решетников A.C. Идентификация генов биосинтеза сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино, 2011г. С. 360-361.

2. Бут С.Ю., Решетников A.C. Клонирование и характеристика рекомбинантных фрукгокиназы и амилосахаразы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011». Тула, 2011г. С. 37.

3. Бут С.Ю., Потапова A.B., Решетников A.C. Метаболизм сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011г. С. 7-9.

4. Бут С.Ю., Решетников A.C. Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XVI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино, 2012г. С.166-167.

5. Бут С.Ю., Решетников A.C. Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2012г. С. 7-9.

Подписано в печать:

25.02.2013

Заказ № 8193 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru