Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

Щукин, Владимир Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z"

На правах рукописи

ЩУКИН ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ГАЛОТОЛЕГАИТНОГО МЕТАПОТРОФА \IETHYL0MICR0BWM А1САПРПШ]М1йЪ

03.01.04 Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2012

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Троценко Юрий Александрович

Официальные оппоненты: Дедыш Светлана Николаевна

доктор биологических наук ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, зав. лабораторией

Соляникова Инна Петровна доктор биологических наук ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино

Защита состоится4&и/аУАі012 г. вна заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed-gov.ru./ и http://www.ibpm.ru./

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук Н.В.Доронина

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ Б И ЬЛ И OTE KA

_гоАктуаль

юсть проблемы. Клеточная оболочка бактерий является важным фактором их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. У аэробных метанотрофов, использующих метан в качестве источника углерода и энергии, клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану (Гальченко, 2001; Троценко, Хмеленина, 2008). Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов несколько отличается по химическому составу от таковой других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием предельно восстановленного газообразного субстрата -метана. Так, в наружной мембране термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath обнаружены специфические белки, в том числе мультигемовые цитохромы с типа, что указывает на окислительно-восстановительные процессы, происходящие на клеточной поверхности (Karlsen et al. 2008,2011).

Интригующей особенностью ряда метанотрофов является наличие на внешней поверхности клеточной стенки упорядоченных гликопротеиновых S-слоев. У метанотрофов рода Methylomicrobium, включая галоалкалофилов Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. buryatense (штаммы 5В, 5G, 6G и 7G), а также негалофильного нейтрофила Mm. album BG8, S-слои представлены монослоем чашевидных структур, уложенных в гексагональной (рб) симметрии (Jeffries et al., 1987; Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). Напротив, у Me. capsulatus (штаммы 874 и Texas) S-слои имеют тетрагональную (р4) симметрию расположения белковых субъединиц (Тюрин с соавт., 1985; Сузина, Фихте, 1986). Однако функции этих структур у метанотрофов остаются не понятными. Уровень понимания истинной роли S-слоев у различных микроорганизмов в значительной степени зависит от расшифровки соответствующих генетических детерминант белковых компонентов и выяснении связи S-слоев с другими поверхностными белками микроорганизма.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - идентификация и первичная характеристика доминирующих поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить основные поверхностные белки у Mm. alcaliphilum 20Z и определить нуклеотидные последовательности кодирующих их генов.

2. Изучить возможную связь основных поверхностных белков с S-слоями или другими структурами клеточной оболочки.

3. Выделить и охарактеризовать инсерционные мутанты Mm. alcaliphilum 20Z по поверхностным белкам, изучить основные свойства полученных мутантов.

Научная новизна. У Mm. alcaliphilum 20Z в составе ассоциированных с клеточной поверхностью белков найдены белки с м.м. 27 и 80 кДа, проявлявшие высокую гомологию (>50% идентичности) с поверхностными белками 'СогА' и 'СогВ' Methylomicrobium album BG8. Обнаружена локализация белка 'СогА' в основании чашевидных структур S-слоев и периплазматическая локализация 80-кДа белка, отнесенного к новому классу дигемовых цитохром с пероксидаз. Сконструированы инсерционные мутанты по генам 'corА' и 'corВ'. Постулирована роль 'СогА' в прикреплении S-слоев к клеточной поверхности метанотрофа. Мутант по гену 'согВ' рос на метане с высокой скоростью и имел более высокие активности ферментов окисления С|-соединений по сравнению с родительским штаммом. Показана коэкспрессия белков 'СогА' и 'СогВ' при низком содержании меди в ростовой среде. Кроме 'СогА' и 'СогВ' при биотинилировании целых клеток метились а-субъединица метанолдегидрогеназы (МДГ) и 59-кДа белок, указывая на экспонирование на наружной поверхности клеточной стенки по крайней мере фрагментов этих белков. Полученные приоритетные данные по идентификации и характеристике поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z создают предпосылки дальнейших исследований их роли у галоалкалофильных метанотрофов.

Научно-прастическое значение. Результаты изучения поверхностных белков и кодирующих их генов у галоалкалофила 20Z представляют интерес для продукции целевых белков посредством гетерологнчной экспрессии ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых минеральных средах. Кроме того, определение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Разработанный метод получения мутантов Mm. alcaliphilum 20Z перспективен в качестве эффективного инструмента при изучении функциональных генов/ферментов у метанотрофов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2007-2011гг), на I школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), на XIV международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на V и VII молодёжных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009,2011).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ГФУ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы»

(№ Госрегистрации 01.20.0403398), поддержана грантами РФФИ (08-04-01732-а, 10-04-01224-а) и госконракгами № 4.749.11.0111, № 02.740.11.0296.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 4 тезисов.

Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Дуде В.И., К.6.Н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Серебряковой М.Е., к.б.н. Зиганшину P.A., к.б.н. Решетникову A.C., к.б.н. Бесчастному А.П., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Crpyicrypa и объем работы. Диссертация изложена на 116 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 ссылок, из них 18 на русском и 157 на английском языках, содержит 4 таблицы и 47 рисунков.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистые культуры облигатных метанотрофов Mm. alcaliphilum 20Z и Мс. capsulatus Bath из коллекции ВКМ (№ В-2133, № В-2116). Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде «П» в атмосфере СН4 и воздуха (1:1) (Гальченко и др., 1986). Для выращивания Mm. alcaliphilum 20Z в среду дополнительно вносили Na-карбонатный буфер и 3% NaCl (Хмеленина с соавт., 1997). Escherichia coli SI7-1, Top Stab 10, BL21(DE3) выращивали при 37°С на жидкой или агаризованной средах "LB", добавляя при необходимости хлорамфеникол, канамицин, гентамицин и/или ампициллин.

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Marmur, 1961). Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию проводили согласно протоколам (Sambrook, Russell, 2001). Тотальную РНК выделяли модифицированным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Последовательности ДНК и белков анализировали с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Для выравнивания аминокислотных последовательностей использовали программу ClustalX (vi.62b). Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura et al., 2007).

Идентификация и выделение основных поверхностных белков. Клетки штамма 20Z обрабатывали флуоресцентным реагентом дансилхлоридом, который реагирует со свободными аминогруппами аминокислот и не проникает через внешнюю мембрану (Walker, 1994). Поверхностные белки идентифицировали в УФ после

разделения тотальных клеточных белков ДСН-ПААГ электрофорезом. Для дополнительной идентификации и препаративной наработки поверхностных белков клетки обрабатывали биотиновым зондом, биотинилированные полипептиды собирали на магнитные частицы, покрытые стрептавидином (Karisen et al., 2005). Масс-спектрометрический анализ полипептидов выполнен к.б.н. P.A. Зиганшиным (ФГУ Институт биоорганической химии РАН, г. Москва).

Получение инсерционных мутантов по генам 'согА' и 'согВ'. Процедура включала амплификацию нуклеотидных последовательностей двух плеч инактивируемого гена, клонирование полученных ПЦР-продуктов в плазмиду pK18mob, содержащую ген устойчивости к канамицину (Schäfer, 1994), и клонирование в эту плазмиду гена устойчивости к гентамицину aaC¡ между клонированными плечами. Для конъюгации со штаммом 20Z использовали штамм-донор Е. coli S17-l/pK18mob:¿/-¿2.oaC7. Конъюганты отбирали по устойчивости к гентамицину и чувствительности к канамицину.

Цитобиохимические исследования. Ультраструктуру клеток метанотрофов изучали с помощью электронного микроскопа JEOL JEM 100В (Япония). Приготовление ультратонких срезов и просмотр препаратов в электронном микроскопе проводили в лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН совместно с к.б.н. Сузиной Н.Е.

Клонирование и экспрессия генов. Ген 'согВ' амплифицировали из геномной ДНК Aim. alcahphilum 20Z, клонировали в вектор рЕТ22Ь и экспрессировали в клетках Е. coli BL21(DE3). Рекомбинантный 'CorB'-His6-tag выделяли и очищали из клеток Е. coli с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-arapo30й, согласно протоколу фирмы "Quiagen" (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу белка определяли электрофорезом в ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970).

Включение MCII« суспензиями клеток измеряли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре LS-30 «Beckman» (США) в смеси, содержащей 2,5-дифенилоксазола и I, 2-бис-(5-фенилоксазолил-2)бензола в 1 л толуола (Sokolov, Trotsenko, 1995).

Выделение и анализ осмопротекторов. Низкомолекулярные органические соединения - потенциальные осмопротекторы, экстрагировали из клеток метанолом. Количество сахарозы оценивали с антроновым реактивом в модификации (Hendel, 1968). Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ («LKB», Швеция) (Ешинимаев с соавт., 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Mm. aicaliphilum 20Z

Для идентификации основных поверхностных белков Mm. aicaliphilum 20Z клетки обрабатывали флуоресцентным реагентом дансилхлоридом (Walker, 1994). После разрушения клеток нагреванием в денатурирующем буфере проводили ДСН-ПААГ электрофорез тотальных белков. В УФ были выявлены четыре белковые полосы м.м. 27, 59, 67 и 80 кДа (рис. 1а). Окрашивание гелей Кумасси G-250 подтвердило, что эти белки являются мажорными в спектре тотальных клеточных белков (рис. 16).

Для выделения и идентификации поверхностных белков использовали метод биотинилирования. Клетки обрабатывали биотиновым зондом, затем белки экстрагировали гуанидин гидрохлоридом (ГГХ) и биотинилированные полипептиды собирали на магнитные частицы, покрытые стрептавидином (Karlsen et al., 2005). кДа м а б в

Рис. 1. ДСН-ПААГ электрофорез мажорных поверхностных белков Mm. aicaliphilum 20Z. а) - белки из обработанных дансилхлоридом клеток (визуализация УФ при 260 им); б) - тотальные клеточные белки, окрашенные кумасси G - 250; в) - белки, полученные биотинилированием М - маркеры молекулярных масс.

Последующий ДСН-ПААГ электрофорез белков, освобожденных от стрептавидин-биотина, также выявил наличие четырех основных белковых полос. Выделение белков с использованием данного метода указывает на нековалентную связь белков м.м. 27, 59, 67 и 80 кДа с компонентами клеточной стенки (рис. 1в).

2. Идентификация генов поверхностных белков. Идентификация 67-кДа белка.

Выделенные поверхностные белки подвергали трипсинолизу в геле и получали MALD1 масс-спектры белковых фрагментов (рис. 2). Их сравнение со спектрами пептидов в базе данных Mascot показало сходство 67 кДа-белка с большой а-субъединицей МДГ метанотрофов.

Рис. 2. Масс-спектрометрическнй анализ последовательностей полнпеп гидов 67-кДа поверхностного белка, полученных трипеннолнзом в геле.

Обнаружение МДГ на внешней поверхности клеточной стенки Mm. alcaliphilum 20Z оказалось весьма неожиданным, поскольку известно, что у термотолеранта Мс. capsulatus Bath этот фермент локализован в цитоплазматической мембране (ЦМ) и периплазме, а также во внутрицитоплазматических мембранах (ВЦМ), где образует с мембранной метанмонооксигеназой (мММО) надмолекулярные комплексы, окисляющие метан до формальдегида (Myronova et al., 2006). Поэтому дансилирование и биотинилирование МДГ при обработке целых клеток Mm. alcaliphilum 20Z могло указывать на поверхностную локализацию большой субъединицы МДГ, Ранее МДГ также была найдена на клеточной поверхности нейтрофильного метанотрофа Mm. album BG8 (Brantner et a!., 2002).

Идентификация 27-кДа белка. Сравнение масс-спектров пептидов, полученных трипсинолизом 27-кДа белка, не выявило схожие белки в соответствующей базе данных. Однако удалось идентифицировать последовательности двух пептидов

VSVEVS и QFVVGGI (рис. 3). Поиск с помощью программы Blast по аминокислотным последовательностям этих пептидов выявил аналогичные участки у белка 'СогА' из нейтрофильного метанотрофа Mm. album BG8 (Berson, Udstrom, 1997) и белка МорЕ из Мс. capsulatus Bath (Karisen et al., 2003). При амплификации с прайме рам и, сконструированными на гены 'согА' и торЕ. используя ДНК Mm. alcaliphilum 20Z, был получен неспецифический ПЦР-п роду кт. Анализ фланкирующих последовательностей этих генов выявил консервативные участки в гене тса Мс. capsulatus Bath и фрагменте открытой рамки считывания (ОРС), расположенной ниже гена 'cor А' у Mm. album BG8, на которые были сконструированы несколько праймеров для ПЦР. В результате был получен ПЦР-продукт, одинаковый по размеру (-200 п.н.) у штаммов 20Z и Bath. Секвенирование этого продукта выявило наибольшее сходство с последовательностью гена тса из Мс. capsulatus Bath и неполной ОРС из Mm. album BG8.

Далее с использованием векторетного ПЦР удалось секвенировать ген, кодирующий белок с рассчитанной м.м. 80 кДа, гомологичный белку Мса, аннотированному как дигемовая цитохром с пероксидаза, а также ОРС, расположенную выше этого гена. Трипсинолизом in silico транслированной аминокислотной

27 кДа

VSVEV3

YQFWGGI

■U.

Рис. 3. Масс-спектрометрический анализ последовательностей полипептидов 27-кДа поверхностного белка, полученных трипсинолизом в геле.

последовательности этой ОРС были получены пептиды, аналогичные таковым, обнаруженным после MALDI-анализа 27-кДа белка. В недавно секвенированном геноме Mm. alcaliphilum 20Z (Vuilleumier et al., 2012) эти гены были аннотированы как 'согА' и 'corB' (MEALZv4_2S3\ и MEALZv4_2832) (рис. 4) по аналогии с их обозначением у Mm. album BG8 (Berson, Lidstrom, 1997; Karlsen et al., 2010).

'corA'

*corB'

ppk

MEALZvi 2831

MEALZv4 2832

Рис. 4. Расположение генов 'corA' и 'corB' на хромосоме Mm. alcaliphilum 20Z.

'CorA'-Mm.alcaliphilum 20Z -------------------------------------------------|

'CorA' -Mm. album BG8 -------------------------------------------------j

MopE -Mc.capsulatus Bath GLDTLDRDGDGSTADADCNDFAPTIHPGAAEATLDGVDSNCDGRDSGVAE

'CorA' -Mm. alcaliphilum 20Z |KTV</BpBVATBp\LT|Lp3HBTT|NGG|NFf F|PTN|sfV|NB 'CorA' -m. album BGB lYNS гДр1Д|УАД|Ь FFgN PLQJtA|SGt|- - - FDKNn|sAd|t Д

MopE -Mc. capsulatus Bath WETFKN[-GH^p^-FKIiSpPG^THIYGPPR-§ilGYNi''SlS|A|G

'CorA'-Mm. alcaliphilum 20Z §dS|yM|G-----------------WGWTHBBwP^tMBGQWTl

'CorA'-Mil.album BG8 IysByMHIg-----------------B^^SpVGFVKLK^GiflHl

MopE -Mc. capsulatus Bath KTsiYrjP|TGTKWNDDTITPVSDGQDI|R(®JjrGKWSl.L'HG§AGDKfTi

'CorA' -Mm. alcaliphilum 20Z gjDA----■gDGFHP|V4'V'«|RRCl----------------lRFlPiUI

'CorA'-Mm.album BG8 Лт----- 7EVSGLHP^BHrAG§----------------1NIKT|4

MopE -Mc. capsulatus Bath ::iKGAHFf ^ IjHRPE|GPLFWAGTQDLDEGQTAL§|DS|T

'CorA' -Mm. alcaliphilum 20Z §BHg|SQSQDjNfH|TLD^PVj---------P|N^R|HMEgm

'CorA' -Mm. album BG8 ■■hMKQF|o|YEP|EAT|AEN|---------P|HNII

MopE -Mc. capsulatus Bath |iprlVQH§DWTB'.';LPPKAj|HTAPAGVDTELYiePi5SYTMl®DsB

'CorA' -Mm.alcaliphilum 20Z рД[ДЦ1|СЕ'ЩДДн--ЖрпШгДД—тИрИсЯу—vM 'CorA' -мт.album BG8 dId—Wpae^MqBy-48MdgWgWI;MtIpeIgIyMMBI

'CorA'-Мл.alcaliphilum 20Z |HBDIDTS------------KgVgQRflPVSjJSFgG

'CorA' -Mm. album BG8 HlDSlAYiS-----GPGSGa|(|TJ|[|TvhH|sI|-

MopE -Mc. capsulatus Bath LEV|DW§VD§DGKLTTTGEVWE ;J|KgCWVNgT|SK--

Рис. 5. Выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей белка 'CorA' у Mm. alcaliphilum 20Z, Mm. album BG8 и Mc. capsulatus Bath. Рамками обозначены триптофан-!30, гистидин-132 и гистидин-203.

'СогА' из Mm. alcaliphilum 20Z имеет 52% идентичности с 'СогА' из Mm. album BG8 (Berson, Lidstrom, 1997) и 23% идентичности с MopE из Mc. capsulatus Bath (Karlsen et al., 2003) (рис. 5). В то же время, в частично аннотированных геномах метанотрофов Ms. trichosporium ОВЗЬ, М. silvestris BL2, Mb. tundripalitdum и М. infernorum V4 гомологи данного белка нами не выявлены (https://www.genoscope.cns.fr/agc/mage).

Гомолог обнаруженного у Mm. alcaliphilum 20Z поверхностного белка с м.м. 27 кДа был впервые описан у Mm. album BG8 (Berson, Lidstrom, 1997) и получил

аббреавиатуру 'CorA' (copper repressible). Однако он имеет незначительную гомологию (<10% идентичности) с ранее описанным белком CorA (cobalt resistant) -представителем семейства трансмембранных белков, функционирующих как Mg2*-транспортеры у широкого спектра организмов: бактерий (включая перечисленных метанотрофов), архей, животных и человека (Silver, 1969; Niegowski, Eshaghi, 2007). Идентификация 80-кДа белка. Трипсинолиз белка с м.м. 80 кДа, выделенного с использованием метода биотинилирования, и анализ масс-спектров продуктов трипсинолиза показали, что данный белок кодируется геном 'согВ'. В геноме штамма 20Z ему соответствует ОРС MEALZv4_2832 (рис. 4). Транслированная аминокислотная последовательность гена 'согВ' из Mm alcaliphilum 20Z проявляла 59% идентичности (73% сходства) с периплазматическим белком 'СогВ' из Mm. album BG8 (Karlsen et al., 2010) и 43% идентичности (57% сходства) с белком Мса (SACCP) из Мс. capsulatus Bath (Karlsen et al.. 2005). Обнаружено сходство также в структуре этих белков у перечисленных метанотрофов, поскольку их аминокислотные последовательности содержат два предполагаемых гем-связывающих мотива (СххСН).

ПЦР анализ известных метанотрофов с использованием праймеров, разработанных нами на основе консервативной 5'-области гена 'согВ', выявил соответствующие нуклеотидные последовательности в ДНК метанотрофов, относящихся к родам Methylocaldum, Melhylomicrobium, Methylococcus и Methylobacter (рис. 6).

1 ' 1 1 S (, 7 К l) III 11 Р П II IS Ii, 17

mm w

Рнс. 6. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, амплнфицированных из ДНК метанотрофов I и II типов с использованием пары праймеров mcaFl/mcaRl на ген 'согВ'. I - Mm.

alcaliphilum 20Z; 2 - Mm. alcaliphilum 3S; 3 - Mm. buryatense 5G; 4 - Md. szegediense 0-12; 5 - Mb. marinus 7C; 6 - M. scandinavica SR5; 7 - Mc. capsulatus Bath: 8 - Ms. Irichosporium OB3b; 9 - Mc. parva Se48; 10 - Mc. minimus 72; 11- Mb. chroococcum 41; 12 - Melhylocyslis J/J.MF5; 13 - Mc. hey er і і S AK 1; 14-Mc. hey er її SAK2; 15 - Melhylocyslis sp. F387; 16 - Melhylocyslis sp. SR3; 17 - Melhylocyslis sp. HKR,

В отличие от этих метанотрофов I и X типов, у представителей метанотрофов II

типа Melhylocyslis и Methylosinus, ген-гомолог 'согВ' не обнаружен. Это может быть

связано с различиями в путях первичного С і -метаболизма и значительной дивергенцией

генов. Согласно геному, Ms. irichosporium ОВЗЬ обладает цитохром с пероксидазой

(ZP 06890702.1), но этот фермент имеет низкую гомологию с белком 'СогВ' (7%

идентичности). Данные ПЦР подтверждены анализом последовательностей геномов

метанотрофов, поскольку гены-гомологи 'согВ' обнаружены в геномах более широкого

спектра метанотрофов. нежели таковые гена 'corА ' (рис. 7).

Bactarotdas fragilis 3 1 12(ZP 07809611 1) васMAI fragil,s 638R (CBW23200 1) 8aelar«daafraei»aNCTC 9343 (YP 2123121) Saetarottea fragrts YCH46 (YP.099957 1)

Ftavobactarlum Johnsoniaa UW101 (YP 0011948231) -SotlalaacanadansaDSU 3403 (ZP Ов5в22вв 1)

- Camtdatus HUrospta deüuvil (YP 003799654 1) NC10 badarium Outch aadimanl (CBE68719.1) PtwtWaaialarfDSM 80Ä8 (YP 003372459 1)

Ftavobactarlum paychmphihjm JIP02 88 (YP 0012954891) Crocaibactar at/anttcus HTCC2559 (YP 003718585 1) ■ Ftavobactar» bactanum BBFL7 (ZP 01203361.1) -Ftambadanacaaa badarium HQM9 (ZP 09315821 1)

* Ceitutophaga lytica DSM 7489 (YP 0042820981) -МнтокШа marha ATCC 23134 (ZP 01892084 1) ICallukiphaga a«KOfaDSM 14237(YP 0041892381)

-Kmkinobacter sp 4H3 7 5 (YP 004431238 1) -Laauwenhoaktetta btandansta MED217 (ZP 01080982 1) " Polanbactar sp MED152 (ZP 01052391 1) -Mathyloanua tochoapcrmm ОВЗЬ (ZP 08890194 1) -Methytostous Mchosponum ОВЗЬ (ZP 08890702 1) SingtAsphaara acidipbils DSM 18658 (ZP 095702821)

" Mathylocystis so ATCC 49242 (ZP 08073088 1)

—Leptospira biПака serovar Paloe strem (YP 001838598 1) Cytophaga hutchmaoni ATCC 33408 (YP 8718791) Marlfrohwtdus tarrooiydins PV 1 (ZP 01451839 1)

Laptonama Uhrn DSM 21528 (EHQ05189 1) Pseudomonas ItuorascensPIO 1 (YP 350897 1)

Aiaromonas sc S89 (ZP 09502903.1)

Hyrirogamvrga sp. 128 (ZP 02176618 1) Candidatus NHroapra dafluvM (YP 003799654 1)

SlnguHsptjmara aadlphlta DSM 18958 (ZP 09571851 1) I Psaudovtbrk* № FO BE01 (AEV39547 1) 1 Psaudmtbno sp JE062 (ZP 05087311 1) -HypftompcrDlxum tfanitrifcvia ATCC 51686 (YP 003754881 1)

- FJavobacfar« badarium BBFL7 (ZP 01202659 1) Ha/tseomanobadar hydrossts DSM 1100 (YP 004450040 1) Sacctwophaqus dagradans 2 40 (YP 527064 1) Cytophaga hutcNnaonk ATCC33406 (YP 6771501)

JLaptoapfra srtarrogans aarevar Copenhagenl (YP 0010661) Leptospira mlarrogans Copenhagam (YP 000666 1)

Laptothrts ehotodnU SP (YP 001790891 1) paffl/a addwvans BPH (YP 001563915 1)

Populus trtchocarpa (EEF10207 1)

Methytomcrobium alcaiiphtlum 20Z (YP 00491B063 1) „lh„m ЯП» I7P 1М4Я.1М7 11

thyhca/dum szagadtansa 0-12 (YP 004513589.1)

-Malhylomonas mathantca MC09 (YP 004513569 1)

-Mtrosomonas sp AL212 (YP 004294341 1)

Canddalus Nitmspta dalkKi (YP 003799122 1) Poiaromonas napMhatanrwans (YP 973674 I)

-Mathytoeoccus eapsufatus Bath (YP 1149961)

-Mathytobadar tundripaludum SV96 (ZP 0S7II0I.1 I)

IPftoiobacfarfum profundum SS9 (YP 130381 1) Photobactarium profundum 3TCK (ZP 01216862 1)

-Attaromonas macflaotf* ATCC27126 (ZP 047188901)

w.to.f«! ochracatm DSM 4365 (YP_003266662 1)

Рис. 7. Филограмма цитохром с пероксидаз. Построена на основе сравнения транслированной аминокислотной последовательности гена 'согВ', кодирующего дигемовую цитохром с пероксидазу Mm. alcaliphilum 20Z, с близкими цитохром с перохсидазами других бактерий. Примечательно, что белки 'СогВ' штаммов 20Z и BG8 располагаются дискретно.

3. Изучение функции белка 'СогВ'

Для выяснения функции белка 'СогВ' у Kim. alcaliphilum 20Z, ген 'corB' клонировали в экспрессионный вектор pET22b (Yanisch-Perron et al„ 1985). Рекомбинантной плазмидой pET22b: 'corB' трансформировали клетки Е. coli BL21 (DE3). Экспрессию белков индуцировали в ранней логарифмической фазе роста культуры добавлением ИПТГ (рис. 8).

97 «Я*

а б в

Рис. 8. ДСН - ПААГ электрофоре) белков из клеток Е. coli BL21 (DE3), трансформированы* плазмидой рЕТ22Ь:'согв'. 1 - без индукции ИПТГ, 2 - после 3 ч индукции; 3 - растворимая фракция; 4 - тельца включения в S М мочевине. М - маркеры молекулярных масс.

Рис. 9. ДСН - ПААГ электрофорез 'СогВ'-Hiss - tag. а) - окрашивание Ку масси;

б) - окрашивание на гем-содержащий белок;

в) - иммуноблоттинг.

М.-чмаркеры молекулярных масс

Препарат 'CorB'-His6-tag был очищен из экстракта Е. coli аффинной хроматографией на Ni2+-NTA колонке. Методом денатурирующего гель-электрофореза выявлена одна белковая полоса, что свидетельствовало о гомогенности полученного препарата. Белок имел м.м. около 80 кДа (рис. 9а) и перекись-разлагающую активность 12,5 нмоль/мин • мг белка. В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что поверхностный 80-кДа белок может быть отнесен к семейству бактериальных дигемовых цитохром с пероксидаз. впервые обнаруженных у Мс. capsulalus Bath (Zahn et al„ 1997; Karisen et al.. 2005).

4. Изучение экспрессии генов 'согА' и 'согД'

Содержание белка 'СогА' в клетках Мт. а1саИрЫ1ит 202 анализировали методом ДСН-ПААГ электрофореза тотальных клеточных белков. Относительное содержание белка 'СогА' возрастало при понижении концентрации меди в среде (рис. 10), а также в динамике роста культуры (рис. 11).

Время Docra. часы:

24 48 72

М i 2 3 4

Я)

w Msm m

Рис. 10. Экспрессия белка 'СогА' Мт. акаИрЫШт 202 при различном содержании меди в среде. 1, 2 - ДСН-ПААГ электрофорез тотальных клеточных белков; 3,4- иммуноблоттинг 1, 3 - клетки выращивали в присутствии 0,1 мк.М меда; 2, 4 - клетки выращивали в среде без добавления меди.

150

Рис. II. Зависимость экспрессии белка 'СогА' от времени культивирования Мт. а!саИрИИит а) - иммуноблоттинг; б) - время отбора проб (отмечено стрелками).

Экспрессия 'СогА' в условиях лимитирования медью может указывать на участие белка в гомеостазе данного катиона в клетках Mm. alcaliphilum 20Z. Эти результаты коррелируют с ключевой функцией ионов меди в метаболизме метанотрофов. Как известно, ионы меди необходимы для синтеза и активности мММО, поскольку медь входит в состав активного центра данного фермента (Choi et at., 2003). Ранее индукция синтеза белка 'СогА' при недостатке ионов меди в среде культивирования была показана для Mm. album BG8 (Berson, Lidstrom, 1997). Аналогично, индукция экспрессии МорЕ происходила у Мс. capsulatus Bath, растущего в отсутствие меди (Karisen et а!., 2003). Полученные мутанты Mm. album BG8 по белку "СогА' проявляли низкую жизнеспособность, причем увеличение содержания меди в среде до 5 мкМ не улучшало их рост (Karisen et а!.. 2010).

Для проверки возможности сопряженной транскрипции генов 'согА' и 'согВ' проводили ПЦР с использованием обратной транскриптазы. В результате был получен фрагмент ожидаемой длины -2240 п.н. (рис. 12), что указывало на котранскрипцию 'согА' и 'согВ' в виде одной мРНК. Показано, что у Mm. album BG8 гены 'согА ' и 'согВ' составляют оперон (Karisen et al., 2010). Напротив, в хромосоме Мс. capsulatus Bath гены, кодирующие гомологи этих белков, располагаются в обратном порядке, составляя оперон тса-торЕ (Karisen et al., 2003).

Рис. 12. Организации генов 'согА'-'согВ' у Мт. акаИрИИит 207.: а) - расположение праймеров, используемых при ОТ-Г1ЦР; б) - электрофореграмма ПЦР-продуктов. 1 - ПЦР-продукт, полученный с хромосомной ДНК (положительный контроль); 2 - ПЦР-продукт, полученный с кДНК; 3 - маркеры молекулярных масс; 4 - продукт ПЦР, полученный с мРНК без обратной транскриптазы (отрицательный контроль).

ОЕФ ЗБОС

Рис. 13. Флуоресценция клеток Мт. а1са11рИИит 2Ш, содержащих плазмиду рСМ130:СРР:Ргот:

а) - клетки, выращены в среде без меди;

б) - в присутствии 0.1 мкМ меди.

Для изучения влияния ионов меди на транскрипцию генов 'согА' и "согВ' использовали репортерный ген gfp, который был клонирован в плазмиду рСМІЗО под контролем предполагаемой промоторной области. Рекомбинантной плазмидой рСМІЗО.GFP.Prom трансформировали клетки 1С. coli SI7-1 для дальнейшего конъюгативного переноса в Mm. alcaliphilum 20Z. Флуоресценция клеток, выращенных в среде без меди, была в 7 раз выше, по сравнению с флуоресценцией клеток трансконъюгантов, выращенных в присутствии 0,1 мкМ меди (рис. 13), указывая на участие меди в регуляции транскрипции 'согА ' 'согВ' оперона.

5. Топология белка 'СогА'

Для получения препаратов поверхностных белков клетки штамма 207 обрабатывали 6 М 1ЛС1. Диализ экстракта, полученного после осаждения клеток, против воды привел к выпадению в осадок полупрозрачных хлопьев, а электронно-микроскопические исследования этого осадка выявили наличие структур, напоминающих чашевидные структуры 8-слоев (рис. 14). ДСН-ПААГ электрофорез осадка, растворенного кипячением в буфере для нанесения, выявил наличие мажорной белковой полосы с м.м. 27 кДа (рис. 15а). Напротив, ДСН-ПААГ электрофорез экстракта, полученного после обработки клеток ГТ'Х и диализа против воды (что также

приводило к выпадению в осадок густых белых хлопьев), выявил множественные белковые полосы (рис. 156). Это показывает, что ГГХ является более мощным слущивающим агентом для клеток Мт. ЫсаИрИНит 20/.

а б м

Рис. 14. 'Электронная микроскопия чашевидных структур 8-слоя Мт. акаЧрШШт 20X, полученных экстрагированием 6 М ЫГ1 Длина масштабной линейки 25 нм

Рис. 15. ДСН-ПААГ электрофорез белков Мт. акаИрНИит 207,, экстрагированных 6 М иС1 (а) и 5 М ГГХ (б). М - маркеры молекулярных масс.

Белковые хлопья, полученные после обработки клеток 1лС1, растворяли в 5 М ГГХ и подвергали гель-фильтрации на Сефарозе СЬ-6П. На очищенный таким образом препарат белка с м.м. 27 кДа были наработаны поликлональные антитела кролика. Для уточнения локализации белка целые клетки, а также их ультратонкие срезы обрабатывали специфичными поликлональными антителами и белком А, меченным коллоидным золотом, а затем просматривали в электронном микроскопе (рис. 16).

Электронно-микроскопические исследования показали, что антитела связываются с поверхностью клеток (рис. 16а) и локализуются в основании чашевидных структур (рис. 16в), а также могут ассоциироваться с отдельно расположенными фрагментами 5-слоя (рис. 166). Следовательно, 27-кДа белок локализован на внешней мембране и связан с Б-слоями.

Рис, 16. Ультраструктура клеток Мт. акаИрНИит 20г (а, ультратонкий срез) н локализация 27-кДа белка (б-д). Целые клетки (б), фрагмент 8-слои (в) и ультратонкие срезы (г-д) обработаны антителами к 27-кДа белку и коллоидным золотом с размером частиц 8,3 нм. Длина масштабной линейки 1 мкм (а,б), 0,2 мкм (в) и 0,05 мкм (г-д). 43 - частицы золота; ЧС -чашевидные структуры; НМ - наружная мембрана; ЦМ - цитоплазматичесхая мембрана.

6. Топология белка 'СогВ'

Электронно-микроскопические исследования клеток Мт. а!саИрИИит 202, обработанных поликлоиальными антителами к 80-кДа белку, выделенному методом биотинилирования, и белком А, меченным коллоидным золотом, показали, что по крайней мере фрагменты белка 'СогВ' экспонированы на внешней поверхности клеточной стенки (рис. 17а). Неравномерное мечение поверхности клеток золотом, возможно, является следствием экранирования этого белка Б-слоями. Обработка антителами ультратонких срезов клеток метанотрофа выявила преимущественно периплазматическое расположение 80-кДа белка (рис. 176).

Рис. 17. Локализация 80-кДа белка. Целые клетки (а) и ультратонкие срезы (б) обработаны антителами к белку 'СогВ' и коллоидным золотом с размером частиц 5 нм. 43 - частицы золота; ЦМ - цитоплазматическая мембрана. Длина масштабной линейки ! мкм.

7. Получение и анализ инсерционнмх мутантов по генам 'сотА' и 'согВ'

Для выяснения роли поверхностных белков 'СогА' и "СогВ' у Мт. акаИркИит 202 методом двойной гомологичной рекомбинации были получены мутанты с инсерцией в генах 'согА ' (рис. 18) и 'согВ'.

и-и

рК18:тоЬ:11-12

рК18:тоЬ±1-ааСМ2:

Хромосомная ДНК

Рис. 18. Схема получения инсерционного мутанта у метанотрофов по гену 'согА'.

Нуклеотидные последовательности фланкирующих плеч инактивируемого гена -LI и L2 - клонировали в плазмиду pK.18mob, которая не реплицируется в метанотрофных бактериях (Schäfer, 1994). В полученную конструкцию (pKI8mob:i/-

Рис. 19. Рост исходного штамма (■) и мутанта Мт. акаИрНИит по гену 'согА' (♦) на среде в присутствии 0,2% метанола

L2) клонировали ген устойчивости к гентамицину (aaCI) между клонированными плечами. Для конъюгативного переноса плазмиды рК 1 %mob:LI-L2:aaCl в клетки Мт. alcaliphilum 20Z использовали штамм-донор Е. coli SI7-1.

Фенотипическая характеристика 'CorA'-мутанта. Клетки мутантного штамма по белку 'СогА' утратили способность к росту на метане, но восстанавливали рост в присутствии метанола (0,2%) (рис. 19).

osюом Электронно-микроскопические исследования

показали, что на поверхности большинства клеток мутанта S-слои отсутствуют. При этом чашевидные структуры либо хаотично располагаются вблизи поверхности клетки, либо имеют вид упорядочений организованных скоплений в межклеточном пространстве (рис. 20а). В последнем случае чашевидные структуры (ЧС) образовывали бислои ориентированных друг к другу основаниями 'чашек' (рис. 206). Следовательно, белок "СогА' необходим для роста Mm. alcaliphilum 20Z на метане и для прикрепления регулярных поверхностных структур S-слоев к наружной мембране. Рентгеноструктурный анализ поверхностного белка МорЕ из Мс. capsulalus Bath показал, что в сайте связывания ионов меди содержится, наряду с гистидиновыми остатками His-132 и His-203, кинуренин, продукт окисления триптофана-130. При этом рекомбинантный белок, в котором триптофан не окислен, не связывал медь. Предположено, что окисление триптофана-130 у Мс. capsulalus Bath осуществляется поверхностно расположенной дигемовой цитохром с пероксидазой, кодируемой геном тса, локализованным в одном опероне с торЕ (Karlsen et al., 2011). Проведенный нами анализ выявил наличие в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативные аминокислоты, которые формируют сайты связывания меди в МорЕ Мс. capsulalus Bath (рис. 5).

Рнс. 20. Ультраструкгура клеток Мт. а1саИрИИит с инактивированным геном 'согА'. а) - ультратонкие срезы; б) - негативное контрастирование фрагмента 8-слоя. ЧС - чашевидные структуры, НМ - наружная мембрана Длина масштабной линейки 0, 2 мкм.

Фенотипическая характеристика 'СогВ'-мутанта. Клетки мутанта по цитохром с пероксидазе имели Я-слои типичной морфологии, а также образовывали миелиноподобные гранулы (рис. 21).

МС

Рис. 21. Ультратонкие срезы клеток мутанта Мт. акаИрИНит с ннактивированным геном 'согВ'.

ЧС - чашевидные структуры, МС - миелиноподобные структуры. Длина масштабной линейки О, 2 мкм

Рис. 22. Рост клеток Мт. аІсаІірНИит 20г (1,3) и мутантного штамма по гену 'согВ' (2,4) на среде с рН 9,0 (1,2) и рН 11,0(3,4).

В отличие от мутанта по белку 'СогА', мутант по 'СогВ' не только не утратил способность расти на метане, но характеризовался более высокой скоростью роста, причем рос при более щелочных значениях рН (рис. 22).

Кроме того, в бесклеточных экстрактах мутанта обнаружены повышенные уровни активности ферментов С і-окисления - дегидрогеназ метанола, формальдегида и формиата (табл. 1). Пероксидазная активность в бесклеточном экстракте 'СогВ'-мутанта оказалась незначительно ниже, чем у исходного штамма (табл. 1), свидетельствуя о том, что у Мт. аісаііркіїит 207 'СогВ' является не единственной пероксидазой.

Таблица 1. Активности ферментов в бесклеточных экстрактах Мт. аІсаІірИИит 20Ї и 'СогВ'-мутанта (имоль/мин мг белка)

Фермент Кофактор Мт. аІсаІірИИит 207. 'СогВ '-мутант

Метанолдегидрогенаэа ФМС 252 694

Формальдегиддегидргеназа НАД+ 6 11,5

Формиатдегидрогеназа НАД+ 26 180

ФМС 2,5 36,5

Пероксидаза АБТС 25 19

Диметоксифенол 17 14

4-Аминоантипирин 18 11

АБТС - 2, 2'- азино-бис (З-этилбентгиазолин-6-сульфонат) аммония

3 3

61 ; ея й я а а ^а 5 5

Окисление метана клетками с инсерцией в гене 'согВ' выше по сравнению с клетками

дикого типа (рис. 23). Это соответствует

более высоким активностям ферментов

окисления Срсоединений у мутанта по

белку 'СогВ' (таб. 1).

Известно, что скорость роста

метанотрофов коррелирует с

интенсивностью окислительных

процессов, а также уровнем активных

форм кислорода (АФК) (Медведкова с

соавт., 2009). В свою очередь,

аккумуляция АФК может приводить к

неэнзиматическому окислению

триптофана-130 в кинуренин,

обеспечивая тем самым модификацию Рис. 23. Окисление метана суспензиями ,„ ,,

«леток Мт-, акаНрИИит 20Х (1) и мутанта по СогА • необходимую для связывания и 'СогВ' (2). Клетки штаммов выращены на транспорта ионов меди к ММО. метане.

Уровни осмопротекторов у мутантов. Внутриклеточные уровни сахарозы и эктоина мутанта по белку 'СогА' были выше, чем у клеток дикого типа (рис. 24 и 25). Накопление осмопротекторов, очевидно, поддерживает тургор цитоплазмы, что особенно актуально при отсутствии 8-слоев. Это подтверждает связь 'СогА' с 8-слоями и их участие в сохранении ригидной и функциональной клеточной стенки изучаемого метанотрофа.

5 $*»N»CI

I " )•• „ ■

i ' —■

■ w 5-.N.LI

й 5-.N.CI

M-flJl J

II I

дикий тип СогВ -м\ Tairr 'СогА -мутант

Рис. 24. Содержание сахарозы (мкг/мг клеток) в клетках дикого типа Mm. alcaHphilum 20Z, а также у мутантов по 'СогА' и 'СогВ'.

8. Идентификация 59-кДа белка

Принимая во внимание, что 59-кДа белок доминирует в спектре поверхностных белков, метящихся при биотинилировании, мы предположили его участие в формировании S-слоев у Mm. alcaliphilum 20Z. Однако экстракцией поверхностных белков 6 М LiCI не удалось получить гомогенный препарат для идентификации белка MALDl-анализом. Поскольку у 'СогА'-мутанта S-слои не связаны с клеточной стенкой и обнаруживались в среде, белки выделяли из культуральной жидкости с последующим разделением ультрацентрифугированием в градиенте (5-40%) сахарозы. Электрофорез полученных фракций в ДСН-ПААГ выявил несколько белковых полос, среди которых был мажорный белок с м.м. 59 кДа (рис. 26). Трипсинолизом и анализом MALDI масс-спектров продуктов удалось идентифицировать последовательности двух пептидов DTGFQSTQTPQi и SVNENNI(L) (рис. 27а). На их основе в геноме Mm. alcaliphilum 20Z выявлена ОРС MEALZv4 0966, продуктом которой является полипептид, предварительно аннотированный как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа.

Рис. 26. ДСН-ПААГ электрофорез белков фракции S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z после разделения в градиенте сахарозы. М - маркеры молекулярных масс.

дикий тип 'СогВ'-м\та№г СогА-м\та»л

Рис. 25. Содержание эктоина (мг/мг клеток) в клетках дикого типа Мт. акаНрЫШт 20'/., а также у мутантов по 'СогА' и 'СогВ'.

t DTGFOSTOTPOl

59 кДа

SVNENNI(L)

59кДа-Мт.alcaliphi1 um 20Z MPLRAHSLKINPMNKL§HGLLCLLTASTYNaGa8dLLTIYRQALEA TolC-Mm.album BG8 ------------MNKSglLSAIALCLLVRAARAgDLLTIYRQALEE

59кДа-Мш.alcaliphilum 20Z DPQlBSARLQAeBgHaQKGQALGQMLPQBnKEBNWSKnEoBiFAQG TolC-Мш. album BG8 DPRL|sAAAKLE|GgAQKGQALGQMLPQgN^^NWSANQQ|lDNGS

59кДа-mm.alcaliphilum 20z gainnSypgtry^slnqtlvdfakfwBwrraSkvedqyaaeaiea

TolC-Mm.album BG8 HATNSgYAGTRY§gSLNQTLVDFAKFt^WRRAgKVEDQYAAEQlEA

59кДа-Мт.alcaliphilum 20Z QNElBYKVVERYFDWLQANDELNFTrBekQBtBKQLEQVRKQBaKQ To 1С - Mm. album BG8 ENELgNNWERYFTVLEAEDQLALAR§EKE§T§LQLEQVQKQ§AKQ

59кДа-Mm.alcaliphilum 20Z MlKITDVYABEARLDQBaa8eiMAESEBvKAEESLRELTGVRPD§P TolC-Mm.album BG8 BbKITDVYAlEARLDL|AAlEIKAESQivlARQGLRELTGVMpL|L

ЪЭкДа-Мт. alcaliphilum 20ZYGLQI TolC-Mm.album BG8 SRL"

¡EGDLKDWIAMAQSQN РАЙМЙКТI AI EAAENN VA V lEGDLQQWIEMAKSQNPlgSgKRKAIEAAENNVTV

59кДа-Mm. alcaliphilum 20 Z QKSKYHpVVDLQLNYBDTDTGglls-TQTPQIQTQVAAINBNVPBFS TolC-Mm. album BG8 QKSKYgPVVDLQLNY8DTNTG®SQRLGSDIQNQVAAINfNVPiFS

59кДa~Mm.alcaliphilum 20Z GGTTTHQLFEAQHRLEQSKNDNeBtlrBlIketSDAFLsHnaSvfiH TolC-Mm.album BG8 GGTTTQQLFEAKSQLRLSQYDNEgALR§LgKETSDAFLSiNADvfS

Рис. 27. Идентификация поверхностного 59-кДа белка, (а) - масс-спектрометрический анализ последовательностей полипептидов, полученных трипсинолизом в геле; (б) - выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей 59-кДа белка у Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8,

59-кДа белок имел 62% идентичности аминокислотной последовательности с поверхностным белком наружной мембраны Mm. album BG8, аннотированным как белок TolC семейства I типа (рис. 276). В геномах Mm. alcaliphilum 20Z и Mm album BG8 присутствуют еще по две ОРС, транслированные аминокислотные последовательности которых имели -30% идентичность с 59-кДа белком (рис. 28). Итак, оба метанотрофа имеют по три белка из семейства TolC с гомологией каждой пары 62, 42 и 60% соответственно. Недавно показано, что роль TolC включает почти все аспекты адаптации бактерий к неблагоприятным условиям (Zgurskaya et ai., 2011).

Vibrio choierae RC385 (ZP 06942985.1) Vitirin mimir.us VM573

Vibrio malschnikovli CIP 6914 (ZP 05880816.1) Vibrio HuviaHs (ABC41332.1)

-Vihrin VlilniflCliS

— Vibrio ccralliilvlicus ATCC (ZP 05884294 I)

-Grimontia hollisae CIP 101886 (ZP 06052810 I)

Pholobsclerium orofundum 3TCK IZP 01219903 I) Pholobaclnrium damsaiaa IZP 08312405 !) Photobactarlum darnsnlae IZP 06156209 1) Shewaneiia oiezoloierans WP3 IYP 002310163 1) Shewanella so. HN 41 Ivo« I (ZP 08564777 I) Yersinia hercnvtari ATCC 43970 (ZP 04626883 I) Pseudoallaromonas so BSi20429 (ZP 09227084.1) - Thioalkalivibrio sulfiitoDhilus (YP 0025I2567.11

- Nitrosococcus haloohilus 1 (YP 003528916.1) - Melhvioohaaa Ihiooxidans IZP 05104958.1)

- Desulfomiciobium bacuiatum (YP 003157852.1) Melhviocalclum szeoedianse O 12 (AAY82088 I)

Methvlococcus caosulatus Balh (YP 1137391) Melhvlomonas rmthanica MCOBiYP 004511576.1) Mefhviomicrobium alcalinhilum 20Z IY P 004918929 I) Meihviomimhium album BG8 (ZP 08484531.1) - MRthvinhac/ftr liindrinalitflum SV96 (7.P 09782639 1)

Methvtomicrobium album BGB (ZP 0B485229 1)

Melhytom'crobium alcalip/iilum 20Z

Malhvlourtustrichmnorium OB3 (ZP 06»»M78 I)_

SS Kfla Methylamicrabium afca/ipM/unr) 20Z (YP_0049I6254.I) MeUwIomicrobium album BGS (ZP 0848674 I.Ii Marinobaclerium sfMari S30 (ZP 09507457.1)

Pseudomonas Ruorascens F113 T (AEV62740 11 Pseudomonas m&ndocina Ymo (YP OOI186218 1) Pseudomonas osvchrotolerans L1 (ZP 09284201 1) Azotobactar vineiandii DJ tvoe (YP 002798816 I)

Pseudomonas outida VWS19 (YP 00174828 II) Pseudomonas syringae B728a Typ (YP_234031.1) Pseudomonas svrinoaa DSM 502S2 (EGH67689.1) Pseudomonas svnnoae dv 1 (EGH7563I.D

Рис. 28. Фнлограмма белков иаружней мембраны TolC-семейства.

Для подтверждения поверхностной локализации 59-кДа белка суспензии клеток обрабатывали трипсином. В течение первых 30 мин после добавления трипсина относительное количество 59-кДа белка значительно снижалось, при этом количество остальных белков не изменялось. Через 2 ч содержание 59-кДа белка достигало исходного уровня (рис. 29). Следовательно 59-кДа белок доминирует в спектре тотальных клеточных белков штамма 20Z и локализован на поверхности клетки, что согласуется с возможным участием данного белка в формировании стенок чашевидных структур.

Рис. 29. Белковые профили клеток штамма 2йХ до и после обработки трипсином клеток. Время обработки: 1-контроль, без обработки; 2-30 мин; 3 - 1 ч; 4 - 2 ч.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимой предпосылкой успешного выяснения функций S-слоев у микроорганизмов является идентификация основных поверхностных белков и кодирующих их генов. В данной работе идентификацию и выделение поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z проводили с использованием дансилирования и биотинилирования. Благодаря этим подходам нам удалось определить и наработать в препаративных количествах белки, экспонированные на наружной поверхности клеточной стенки, в числе которых доминируют белки S-слоев. В итоге были обнаружены четыре мажорных, ассоциированных с клеточной поверхностью белка: 27, 59, 67 и 80 кДа.

Нами установлено, что поверхностный 27-кДа белок полностью идентичный белку 'СогА', ранее обнаруженному у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8, кодируется у Mm. alcaliphilum 20Z геном MEALZv4_2831. Методами иммунно-цитобиохимии с использованием антител к очищенному белку впервые продемонстрировано, что 'СогА' локализован в основании чашевидных структур S-слоев и ответственен за связывание S-слоев с наружной мембраной метанотрофа. С помощью полученного инсерционного мутанта доказана необходимость белка 'СогА' для роста клеток на метане, но не на метаноле, что, наряду с экспрессией этого белка при понижении содержания меди в среде, указывает на его важную роль в процессе окисления СН4 с участием медь-зависимой ММО. Проведенный нами Blast анализ выявил уникальность белка 'СогА' для метанотрофов, образующих S-слои, что косвенно подтверждает гипотезу о возможной функции 'СогА' в качестве элемента специфической транспортной системы ионов меди, например, в случае экранирования S-слоями доставки и транспортировки этого катиона посредством других переносчиков (например, сидерофором - метанобакгином).

80-кДа белок (ОРС MEALZv4 J2832), обладающий перекись-разлагающей а1ггивностью, идентифицирован нами как дигемовая цитохром с пероксидаза нового класса. Наибольшую гомологию этот белок проявлял с поверхностным белком 'СогВ' Mm. album BG8(Karlsen et al., 2010). Нами доказана периплазматическая локализация дигемовой цитохром с пероксидазы у Mm. alcaliphilum 20Z. Пространственная близость 'СогА' и 'СогВ' на клеточной поверхности, наряду с коэкспрессией данного тандема белков, подразумевает их совместное участие в гомеостазе ионов меди у Mm. alcaliphilum 20Z. Не исключено, что цитохром с пероксидаза окисляет ключевую аминокислоту белка 'СогА* (триптофан), от модификации которой зависит связывание ионов меди, как в случае гомолога этого белка (МорЕ) из Мс. capsulatus Bath (Karisen et al., 2011). Данное предположение основано на присутствии в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативных аминокислот - аналогов, формирующих сайты связывания меди (гистидин-132, гистидин-203 и триптофан-130) у Мс. capsulatus Bath.

Кроме того, постулировано, что в формировании S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z участвует 59-кДа белок, доминирующий в спектре поверхностных белков. В геноме Mm. alcaliphilum 20Z идентифицирован ген данного белка, который предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа, гомологичный представителям семейства TolC. Белки этого семейства участвуют в адаптации бактерий к различным стрессам и неблагоприятным условиям. В частности, о возможном участии TolC в формировании S-слоев косвенно свидетельствует присутствие соответствующего гомолога у Mm. album BG8 (ZP_08486741.I).

Таким образом, определение у метанотрофов первичной аминокислотной последовательности интегральных поверхностных белков, а также белковые компоненты S-слоев, идентификация соответствующих генов и выяснение условий их экспрессии позволит уточнить представление о белковом комплексе наружной клеточной мембраны - сурфацеоме (Karisen et al., 2011). Дальнейшие исследования белков сурфацеома метанотрофов представляют несомненный интерес для конструирования новых систем гетерологичной экспрессии целевых пептидов, экспонируемых на поверхности рекомбинантных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Из клеточных оболочек галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z впервые выделены поверхностные белки с молекулярными массами 27, 59, 67 и 80 кДа, определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Установлено, что белок с м.м. 67 кДа является большой субъединицей метанолдегидрогеназы. Поверхностный белок с м.м. 59-кДа предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны 1 типа.

2. Иммуноцитохимическими и электронно-микроскопическими методами доказана локализация белка 'СогА' с м.м. 27 кДа в основании чашевидных структур S-слоёв. Показано, что 80-кДа белок локализован в периплазме и идентифицирован как дигемовая цитохром с пероксидаза нового семейства 'СогВ'.

3. Впервые получен мутант с инактивированным геном 'corА', не способный расти на метане и лишенный S-слоёв при росте на метаноле. Мутация в гене 'согВ', кодирующем цитохром с пероксидаэу, сопровождалась повышенной скоростью роста клеток на метане и высокими активностями ферментов Сг окисления.

4. Обнаружена котранскрипция генов, кодирующих 'СогА' и 'СогВ', в виде одной бицистронной мРНК в условиях низкого содержания меди в среде культивирования.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Хмеленина D.H., Щукин В.Н., Решетников A.C., Мустахимов И.И., Сузина Н.Е., Ешинимаев Б.Ц., Троценко Ю.А. Структурно-функциональные особенности метанотрофов гиперсоленых и щелочных водоемов. Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 498-508.

2. Щукин B.II., Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Микробиология. 2011. Т. 80. №5. С. 595-605.

Тезисы докладов:

1. Щукин В.Н. Поверхностные белки гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z: выделение и характеристика. I Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008". 6-10 июля 2008 г., Казань.

2. Щукин В.Н., Ешинимаев Б.Ц. Мутант гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектный по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка. V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 26-27 октября 2009г.

3. Щукин В.Н. Первичная характеристика "Ттутанта по синтезу поверхностного перекись-разлагающего белка у гало(алкало)фильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 14 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 2010г.

4. Щукин В.Н. Первичная характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. VII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 24-26 октября 2011 г.

Подписано в печать: 21.05.2012

Заказ № 7385 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

-- л

12-16441

2011355494

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щукин, Владимир Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурно-функциональные особенности метанотрофов 9 1.1. Пути первичного метаболизма метанотрофов. Роль меди в окислении метана.

1. 2. Системы поглощения меди у метанотрофов. Метанобактин. 18 Глаьа 2. Структурно-функциональные особенности метанотрофов соленых и щелочных водоемов

2.1. Гало(алкало)фильные метанотрофы

2.2. Основные стратегии адаптации метанотрофов к высоким значениям солености и рН

Глава 3. Общая характеристика бактериальных Б-слоев

3.1. Выделение и химический состав Б-слоев

3.2. Функции 8-слоев

3.3. Способность Б-слоев к самосборке и практическое применение

3.4. Цитохром с пероксидазы бактерий 40 ЗЛ Поверхностные белки метанотрофов 42 3.6. Б-слои метанотрофов

Глава 4. Материалы и методы исследования

4.1. Объекты исследования и культивирование бактерий

4.2. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. а1саИрЫ1ит

4.3. Трипсинолиз белка в геле и экстракция пептидов

4.4. Экстрагирование поверхностных белков

4.5. Получение поликлональных антител

4.6. Разделение белков Б-слоя Мт. акаИркИит К)Ъ в градиенте сахарозы

4.7. Электрофорез в ДСН-ПААГ

4.8. Иммуноблоттинг 52 4.У. Выделение геномной ДНК

4.10. Выделение плазмидной ДНК

4.11. Выделение РНК

4.12. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

4.13. Векторетная ПЦР

4.14. Получение компетентных клеток и их трансформация

4.15. Клонирование и экспрессия гена 'согВ'

4.16. Очистка фрагментов ДНК

4.17. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК

4.18. Выделение рекомбинантных белков с помощью металлхелатной хроматографии

4.19. Определение концентрации белка

4.20. Получение инсерционных мутантов по генам 1согА' и 1согВ'

4.21. Микроскопические исследования

4.22. Определение включения 14СН4 суспензиями клеток

4.23. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

4.24. Определение активности ферментов

4.25. Определение пероксидазной активности в геле

4.26. Определиние состава жирных кислот

4.27. Определение содержания сахарозы и эктоина в клетках Мт. аІсаІірШІит

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Особенности ультраструктуры клеток галоалкалофильных метанотрофов

5.1. Детекция и выделение основных поверхностных белков Мт. аісаііркіїит

5.2.2. Идентификация 27-кДа белка

5.2.3. Идентификация 80-кДа белка

5.3. Изучение функции белка 'СогВ'

5.4. Изучение экспрессии генов 'согА ' и 'согВ'

5.5. Топология белка 'СогА'

5.6. Топология белка 'СогВ'

5.7. Получение и анализ инсерционных мутантов по генам 'согА ' и 'согВ'

5.7.1. Фенотипическая характеристика 'СогА'- мутанта Мт. аІсаІірЬіІит

5.7.2. Фенотипическая характеристика 'СогВ'- мутанта Мт. аІсаІірЬіІит

5.7.3. Уровни осмопротекторов и жирнокислотный состав мутантов

5.8. Идентификация 59-кДа белка

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z"

Актуальность проблемы. Клеточная оболочка бактерий является важным фактором их адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. У аэробных метанотрофов, использующих метан в качестве источника углерода и энергии, клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану (Гальченко, 2001; Троценко, Хмеленина, 2008). Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов несколько отличается по химическому составу от таковой других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием предельно восстановленного газообразного субстрата - метана. Так, в наружной мембране термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath обнаружены специфические белки, в том числе мультигемовые цитохромы с типа, что указывает на окислительно-восстановительные процессы, происходящие на клеточной поверхности (Karlsen et al., 2011). Дополнительной особенностью ряда метанотрофов является наличие на внешней поверхности клеточной стенки упорядоченных гликопротеиновых S-слоев. У метанотрофов рода Methylomicrobium, включая галоалкалофилов Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. buryatense (5В, 5G, 6G, 7G), а также негалофильного нейтрофила Mm. album BG8, S-слои представлены монослоем чашевидных структур, уложенных в гексагональной (рб) симметрии (Jeffries, Wilkinson, 1987; Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). У Methylococcus capsulatus (штаммы Texas и 874) S-слои характеризуются тетрагональной (/>4) симметрией расположения белковых субъединиц (Тюрин с соавт., 1985; Сузина, Фихте, 1986). Однако функции этих структур у метанотрофов остаются не выясненными. Выяснение роли S-слоев у различных микроорганизмов связано в первую очередь с расшифровкой соответствующих генетических детерминант их белковых компонентов и выяснении связи S-слоев с другими поверхностными белками микроорганизма (Северина, 1995; Sara, Sleyu-, 2000).

Научная новизна- У Mm. alcaliphilum 20Z в составе ассоциированных с клеточной поверхностью белков обнаружены белки с молекулярными массами 27 и 80 кДа, проявлявшие высокую гомологию (>50% идентичности) с поверхностными белками 'СогА' и 'CorB' Methylomicrobium album BG8. Впервые выявлена локализация белка 'CorА' в основании чашевидных структур S-слоев и периплазматическая локализация 80-кДа белка, отнесенного к новому классу дигемовых цитохром с пероксидаз. Впервые получены инсерционные мутанты по генам 1согА' и 1согВ'. Показано участие 'СогА' в прикреплении S-слоев к клеточной поверхности метанотрофа. Мутант по гену 1согВ' рос на метане с высокой скоростью и имел более высокие активности ферментов окисления С i-соединений по сравнению с родительским штаммом. Показана коэкспрессия белков 'СогА' и 'СогВ' при низком содержании меди в ростовой среде. Кроме 'СогА' и 'СогВ' при биотинилировании целых клеток метились большая субъединица МДГ и белок, с м.м. 59 кДа, указывая на экспонирование на наружной поверхности клеточной стенки по крайней мере фрагментов этих белков. Полученные приоритетные данные по идентификации и характеристике поверхностных белков Mm. alcaliphilum 20Z создают предпосылки дальнейших исследований их роли у галоалкалофильных метанотрофов.

Научно-практическое значение. Исследование поверхностных белков и кодирующих их генов у метанотрофов представляет интерес для продукции целевых белков посредством гетерологичной экспрессии. Это перспективно ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых минеральных средах. Кроме того, изучение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Разработанный метод получения мутантов Mm. alcaliphilum 20Z перспективен • в качестве эффективного инструмента при изучении функциональных генов/ферментов у метанотрофов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2007-2011гг), на I школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), на XIV международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на V и VII 7 молодёжной шкоде-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2011).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.

Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н., проф. Дуде В.И., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Серебряковой М.Е., к.б.н. Зиганшину P.A., к.б.н. Решетникову A.C., к.б.н. Ешинимаеву Б.Ц., д.б.н. Осипову Г.А. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н., проф. Троценко Ю.А. и д.б.н. Хмелениной В.Н.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 ссылок, из них 18 на русском и 157 на английском языках, содержит 4 таблицы и 47 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Щукин, Владимир Николаевич

выводы

1. Из клеточных оболочек галотолерантного метанотрофа Methylomicrohium alcaliphilum 20Z впервые выделены поверхностные белки с молекулярными массами 27, 59, 67 и 80 кДа, определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Установлено, что белок с м.м. 67 кДа является большой субъединицей метанолдегидрогеназы. Поверхностный белок с м.м. 59-кДа предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны I типа.

2. Иммуноцитохимическими и электронно-микроскопическими методами доказана локализация белка 'СогА' с м.м. 27 кДа в основании чашевидных структур S-слоёв. Показано, что 80-кДа белок локализован в периплазме и идентифицирован как бактериальная дигемовая цитохром с пероксидаза нового семейства 'СогВ', впервые обнаруженная у Мс. capsulatus Bath.

3. Впервые получен мутант с инактивированным геном icorA', не способный расти на метане и лишенный S-слоёв при росте на метаноле. Мутация в гене 'согВ', кодирующем цитохром с пероксидазу, сопровождалась повышенной скоростью роста клеток на метане и высокими активностями ферментов окисления Ci-соединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функции S-слоев, характерных для многих бактерий, до сих пор не выяснены (Sara, Sleytr, 2000). Для галотолерантных алкалофильных метанотрофов можно лишь предполагать роль S-слоев в качестве дополнительного ригидного каркаса клеточной стенки, предотвращающего лизис клеток в условиях изменяющегося осмотического давления содовых озер, подверженных пересыханию и флуктуациям солености. При этом отсутствие S-слоев у нейтрофильных галофильных изолятов, отнесенных к родам Methylobacter и Methylohalobius, не позволяет рассматривать S-слои как универсальный механизм, способствующий выживанию при высокой солености. Кроме того, S-слои в виде 'рюмок', напоминающих чашевидные структуры у галотолерантных представителей рода Methylomicrobium, описаны у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8 (Brantner et al., 2000). Более того, S-слои тетрагональной (р4) симметрии описаны у ряда штаммов негалофильного термотолерантного метанотрофа Me. capsulatus (Texas и 874) (Тюрин с соавт., 1985; Фихте, Сузина, 1986). В то же время, в литературе отсутствуют сведения о наличии S-слоев у физиолого-биохимически 'родственной' группы аэробных бактерий - метилотрофов, использующих в качестве источников углерода и энергии окисленные или замещенные производные метана, но не растущих на метане. Необходимой предпосылкой успешного выяснения функций S-слоев у микроорганизмов является идентификация основных поверхностных белков и кодирующих их генов. В данной работе идентификацию и выделение поверхностных белков у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z проводили с использованием дансилирования и биотинилирования. Благодаря этим подходам удалось определить и наработать в препаративных количествах белки, экспонированные на наружной поверхности клеточной стенки, в числе которых доминируют белки S-слоев. В итоге были обнаружены четыре мажорных ассоциированных с клеточной поверхностью белка: 27, 59, 67 и 80 кДа.

Нами установлено, что поверхностный 27-кДа белок идентичный белку 'СогА', ране.; обнаруженному у нейтрофильного негалофильного метанотрофа Mm. album BG8, кодируется у Mm. alcaliphilum 20Z геном MEALZv42831. Методами иммунно-цитобиохимии с использованием антител к очищенному белку впервые продемонстрировано, что 'СогА' локализован в основании чашевидных структур S-слоев и ответственен за связывание S-слоев с наружной мембраной метанотрофа. С помощью полученного инсерционного мутанта доказана необходимость белка 'СогА' для роста клеток на метане, что, наряду с экспрессией этого белка при понижении содержания меди в среде, указывает на его важную роль в процессе окисления СН4 с участием медь

98 зависимой ММО. Проведенный нами Blast анализ выявил уникальность белка 'СогА' для метанотрофов, образующих S-слои, что косвенно подтверждает гипотезу о возможной функции 'СогА' в качестве элемента специфической транспортной системы ионов меди, например, в случае экранирования S-слоями доставки и транспортировки этого катиона посредством других переносчиков (например, сидерофором метанобактином).

80-кДа белок (ОРС MEALZv42832), обладающий перекись-разлагающей активностью, идентифицирован нами как дигемовая цитохром с пероксидаза нового класса. Наибольшую гомологию этот белок проявлял с поверхностным белком 'CorB' Mm. album BG8(Karlsen et al., 2010). Нами доказана периплазматическая локализация дигемовой цитохром с пероксидазы у Mm. alcaliphilum 20Z. Пространственная близость 'СогА' и 'СогВ' на клеточной поверхности, наряду с коэкспрессией данного тандема белков, подразумевает их совместное участие в гомеостазе ионов меди у Mm. alcaliphilum 20Z. Не исключено, что цитохром с пероксидаза окисляет ключевую аминокислоту белка 'СогА' (триптофан), от модификации которой зависит связывание ионов меди, как в случае гомолога этого белка (МорЕ) из Мс. capsulatus Bath (Karisen et al., 2011). Данное предположение основано на присутствии в 'СогА' Mm. alcaliphilum 20Z и Mm. album BG8 консервативных аминокислот - аналогов, формирующих сайты связывания меди (гистидин-132, гистидин-203 и триптофан-130) у Мс. capsulatus Bath.

Кроме того, постулировано, что в формировании S-слоев Mm. alcaliphilum 20Z участвует 59-кДа белок, доминирующий в спектре поверхностных белков, хотя для okoi чательного утверждения требуются дополнительные исследования. В геноме Mm. alcaliphilum 20Z идентифицирован ген данного белка, который предварительно аннотирован как секретируемый белок внешней мембраны (outer membrane protein, ОМР) I типа, гомологичный представителям семейства TolC. Белки этого семейства охватывают почти все аспекты адаптации бактерий к различным стрессам и неблагоприятным условиям. В частности, о возможном участии TolC в формировании S-слоев косвенно свидетельствует присутствие соответствующего гомолога у Mm. album BG8 (ZP08486741.1).

Определение у метанотрофа первичной аминокислотной последовательности интегральных поверхностных белков, а также белковые компоненты S-слоев, идентификация соответствующих генов и выяснение условий их экспрессии позволит в дальнейшем расширить представление о белковом комплексе наружной клеточной мембраны - сурфацеоме (Karisen et al., 2011). Дальнейшие исследования белков сурфацеома метанотрофов представляют несомненный интерес для конструирования новых систем гетерологичной экспрессии целевых пептидов, экспонируемых поверхности рекомбинантных бактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щукин, Владимир Николаевич, Пущино

1. Гайер Г. Электронная гистохимия. (1974) Москва. «Мир».

2. Гальченко В.Ф. (2001) Метанотрофные бактерии. Москва. ГЕОС. 500 с.

3. Дебабов В.Г. (2004) S-слои бактерий и архей как объект бионанотехнологий. Молекулярная биология. Т. 38. № 4. С. 578-591.

4. Ешинимаев Б.Ц., Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (2002) Физиолого-биохимические и цитологические особенности галоалкало-толерантного метанотрофа при росте на метаноле. Микробиология. Т. 71. № 5. С. 690-700.

5. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Баранова С.В., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1998) Новый умеренно галофильный метанотроф рода Methylobacter. Микробиология. Т. 67. № 4. С. 532-539.

6. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. (1999) Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. Микробиология. Т. 5. С. 689-697.

7. Решетников A.C., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (2004) Обнаружение генов биосинтеза эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий. Доклады РАН. Т. 396. №6. С. 831-834.

8. Северина JI.O. (1995) Бактериальные S-слои. Микробиология. Т. 64. № 6. С. 725-733.

9. Скулачев В.П. (1985) Натриевый цикл новый тип бактериальной энергетики. Биохимия. Т. 50. № 2. С. 179-183.

10. Сузина Н.Е., Фихте Б.А. (1986) Ультраструктурная организация метанотрофных бактерий. Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 85 с.

11. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. (2008) Эстремофильные метанотрофы. Ред. В.Ф. Гальченко.Пущино. ОНТИ ПНЦ РАН. 206 с.

12. Тюрин B.C., Горская JI.A., Кафтанова A.C., Логинова Т.М., Михайлов A.M. (1985) Особенности тонкого строения Methylococcus capsulatus при различных условиях культивирования. Микробиология. Т. 21. № 6. С. 770-775.

13. Хмеленина В.Н., Ешинимаев Б.Ц., Решетников A.C., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (2006) Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем. Труды Института микробиологии. Москва. Наука. Т. 13. С. 147-171. Ред. В.Ф. Гальченко.

14. Хмеленина В.Н., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. (1997) Физиолого-биохимические особенности галоалкалотолерантного метанотрофа. Микробиология. Т. 66. № 4. С. 447-453.

15. Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. (2000) Синтез органических осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами. Микробиология. Т. 69. № 4. С. 465-470.

16. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. (1996) Метанотрофные бактерии солёных водоёмов Украины и Тувы. Микробиология. Т. 65. № 5. С. 696-703.

17. Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. (2006) Особенности метаболизма облигатных метанотрофов. Труды Института микробиологии. Москва. Наука. Т. 13. С. 24-44. Ред. В.Ф. Гальченко.

18. Хмеленина В.Н., Щукин В.Н., Решетников А.С., Мустахимов И.И., Сузина Н.Е., Ешинимаев Б.Ц., Троценко Ю.А. (2010) Структурно-функциональные особенности метанотрофов гиперсоленых и щелочных водоемов. Микробиология. Т. 79. № 4. С. 498-508.

19. АН Н., and Murrell J.С. (2009) Development and validation of promoter-probe vectors for the study of methane monooxygenase gene expression in Methylococcus capsulatus (Bath). Microbiology. V. 155. P. 761-771.

20. Anthony C. (1991) Assimilation of carbon by methylotrophs. Biotechnology. V. 18. P. 79109.

21. Anthony C., and Zatman L.J. (1964) The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27. Biochem. J. V. 92. P. 614-621.

22. Atack J.M., and Kelly D.J. (2007) Structure, mechanism and physiological roles of bacterial cytochrome с peroxidases. Adv. Microb. Physiol. V. 52. P. 73-106.

23. Baani M., and Liesack W. (2008) Two isozymes of particulate methane monooxygenase with different methane oxidation kinetics are found in Methylocystis sp. strain SC2. Prot. Natl. Acad. Sci. USA. V. 105. P. 10203-10208.

24. Balasubramanian R., and Rosenzweig A.C. (2008) Copper methanobactin: a molecule whose time has come. Curr. Opin. Chem. Biol. V. 12. № 2. P. 245-249.

25. Baumeister W., and Lembcke G. (1992) Structural features of archaebacterial cell envelopes. J. Bioenerg. Biomembr. V. 24. P. 567-575.

26. Bergmann D.J, Zahn J.A., and DiSpirito A.A. (1999) High molecular- mass multi-c-heme cytochromes from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 181. P. 991-997.

27. Bergmeer H.U., Bergmeer J., and Grabl M. (1983) Methods of enzymatic analysis. 3rd edition. Verlag. Chemie GmbH. V. 2. P. 203-211.

28. Berson O., and Lidstrom M. (1997) Cloning and characterization of cor A, a gene encoding a copper-repressible polypeptide in the type I methanotroph, Methylomicrobium albus BG8. FEMS Microbiol. Lett. V. 148. P. 169-174.

29. Beveridge T.J., Pouwels P., Sara M., Kotiranta A., and Launatmaa K. (1997) Functions of S-layers. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 99-119.

30. Blakesley R.W., and Boezi J.A. (1977) A new staining technique for proteins in polyacrylamide gels using coomassie brilliant blue G250. Anal. Biochem. V. 82. № 2. P. 580-582.

31. Bodrossy L., Murrell J.C., Dalton H., Kalman M., Puskas L.G., and Kovacs K.L. (1995) Heat-tolerant methanotrophic bacteria from the hot-water effluent of a natural-gas field. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. P. 3549-3555.

32. Brantner C.A., Buchholz L.A., Remsen C.C., and Collins M.L. (2000) Isolation of intracytoplasmic membrane from the methanotrophic bacterium Methylomicrobium album BG8. Curr. Microbiol. V. 40. № 2. P. 132-134.

33. Callegari L., Riboli B., Sanders W., Coconelli P, Kok J., Venema G., and Morelli L. (1998) The S-layer gene of Lactobacillus helveticus CNRZ 892: cloning, sequencing and heterologous expression. Microbiology. V. 144. P. 719-726.

34. Chami M., Bayan N., and Peyret J.L. (1997) The S-layer protein of Corynebacterium glutamicum is anchored to the cell wall by its C-terminal hydrophobic domain. Mol. Microbiol. V. 23. P. 483-492.

35. Chauvaux S., Matuschek M., and Beguin P. (1999) Distinct affinity of binding sites for Slayer homologous domains in Clostridium thermocellum and Bacillus anthracis. J. Bacteriol. V. 181. P. 2455-2458.

36. Dalton H. (2005) The Leeuwenhoek Lecture 2000 the natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. V. 360. P. 1207-1222.

37. Dedysh S.N., Knief C., and Dunfield P.F. (2005) Methylocella species are facultatively methanotrophic. J. Bacteriol. V. 187. P. 4665-4670.

38. DiSpirito A.A., Zahn J.A., Graham D.W., Kim H.J., Larive C.K., Derrick T.S., Cox C.D., and Taylor A. (1998) Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Bacteriol. V. 180. № 14. P. 3606-3613.

39. Dworkin J., and Blaser M.J. (1997) Molecular mechanisms of Campylobacter fetus surface layer protein expression. Mol. Microbiol. V. 26. P. 433-440.

40. Eichler J. (2001) Post-translational modification of the S-layer glycoprotein occurs following translocation across the plasma membrane of the haloarchaeon Haloferax volcanii. Eur. J. Biochem. V. 268. P. 4366-4374.

41. El Ghazouani A., Basle A., Firbank S.J., Knapp C.W., Gray J., Graham D.W., and Dennison C. (2011) Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorg. Chem. V. 50. № 4. P. 1378-1391.

42. Engelhardt H., and Peters J. (1998) Structure research on surface layers: a focus on stability, surface layer homology domains, and surface layer-cell wall interaction. J. Struct. Biol. V. 124. P. 276-302.

43. Erman J.E., and Vitello L.B. (2002) Yeast cytochrome c peroxidase: mechanistic studies via protein engineering. Biochim. Biophys. Acta Protein Struct. Mol. Enzymol. V. 1597. P.193-220.

44. Fernandez-Herrero L.A., Olabarria G., and Berengner J. (1997) Surface proteins and a novel transcription factor regulate the expression of the S-layer gene in Thermus thermophylus HB8. Mol. Microbiol. V. 24. P. 61-72.

45. Fitch M.W., Graham D.W., Arnold R.G., Agarwal S.K., Phelps P, Speitel G.E., and Georgiou G. (1993) Phenotypic characterization of copper-resistant mutants of Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V. 59. № 9. P. 2771-2776.

46. Fjellbirkeland A., Kleivdal H., Joergensen C., Thestrup H., and Jensen H.B. (1997) Outer membrane proteins of Methylococcus capsulatus (Bath). Arch. Microbiol. V. 168. P. 128133.

47. Fouet A., Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M., and Gounon P. (1997) Molecular characterization of the Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the major cell-associated antigen. Mol. Microbiol. V. 23. № 6. P. 1147-1155.

48. Fulop V., Ridout C.J., Greenwood C., and Hajdu J. (1995) Crystal structure of the di-haem cytochrome c peroxidase from Pseudomonas aeruginosa. Structure. V. 3. P. 1225-1233.

49. Graham D.W., Kim H.J., Galeva N., Larive C.K., and Alterman M. (2005) Purification and physical-chemical properties of methanobactin: a chalkophore from Methylosinus trichosporium OB3b. Biochemistry. V. 44. № 13. P. 5140-5148.

50. Graham D.W., and Kim H.J. (2011) Production, isolation, purification, and functional characterization of methanobactins. Methods Enzymol. V. 495. P. 227-245.

51. Gruber K., and Sleytr U.B. (1991) Influence of an S-layer on surface properties of Bacillus stearothermophilus. Arch. Microbiol. V. 156. P. 181.

52. Handel E. (1968) Direct microdetermination of sucrose. Analytical biochemistry. V. 22. P. 280-283.

53. Helland R., Fjellbirkeland A., Karlsen O.A., Ve T., Lillehaug J., and Jensen H.B. (2008) An oxidized tryptophan facilitates copper binding in Methylococcus capsulatus-secreted protein MopE. J. Biol. Chem. V. 283. № 20. P. 13897-904.

54. Holmes A.J., Costello A., Lidstrom M.E., and Murrell J.C. (1995) Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol. Lett. V. 132. P. 203-208.

55. Howorka S., Sara M., Wang Y., Kueni B, Sleytr U.B., Lubitz W., and Bayley H. (2000) Surface-accessible residues in the monomeric and assembled forms of a bacterial surface layer protein. J. Biol. Chem. V. 275. P. 37876-37886.

56. Hynonen U., Westerlund-Wikstrom B., and Palva A. (2002) Identification by flagellum display of an epithelial cell and fibronectin-binding function in the SlpA surface protein of Lactobacillus brevis. J. Bacteriol. V. 184. P. 3360-3367.

57. Jarrell K.F., Jones G. M., Kandiba L., Nair D.B., and Eichler J. (2010) S-layer glycoproteins and flagellins: reporters of archaeal posttranslational modifications. Archaea. P. 948-956.

58. Jeffries P., and Wilkinson J.F. (1978) Electron microscopy of the cell wall complex of Methylomonas albus. Arch. Microbiol. V. 119. № 2. P. 227-229.

59. Johnson P.A., and Quayle J.R. (1964) Microbial growth on Ci-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 93. P.281-290.

60. Karlsen O.A., Larsen O., and Jensen H.B. (2010) Identification of a bacterial di-heme cytochrome c peroxidase from Methylomicrobium album BG8. Microbiology. V. 10. P. 37119-37128.

61. Karlsen O.A., Larsen O., and Jensen H.B. (2011) The copper responding surfaceome of Methylococccus capsulatus Bath. FEMS Microbiol. Lett. V. 323. № 2. P. 97-104.

62. Karlsen O.A., Lillehaug J.R., and Jensen H.B. (2008) The presence of multiple c-type cytochromes at the surface of the methanotrophic bacterium Methylococcus capsulatus (Bath) is regulated by copper. Mol. Microbiol. V. 70(1). P. 15-26.

63. Kay W.W., Phipps B.M., Ishiguro E.E., Olafson R.W., and Trust T.J. (1984) Surface layer virulence A-proteins from Aeromonas salmonicida strains. Can. J. Biochem. Cell Biol. V. 62. №11. P. 1064-1071.

64. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., and Gottschalk G. (1999) Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch Microbiol. V. 172. P. 321-329.

65. Knapp C.W., Fowle D.A., Kulczycki E., Roberts J.A., and Graham D.W. (2007) Methane monooxygenase gene expression mediated by methanobactin in the presence of mineral copper sources. PNAS. V. 104. № 29. P. 12040-12045.

66. Koval S.F. (1997) The effect of S-layers and cell surface hydrophobicity on prey selection by bacterivorous protozoa. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 138-142.

67. Kuen B., Koch A., Asenbauer E., Sara M., and Lubitz W. (1997) Molecular characterization of the second S-layer gene sbsB of Bacillus stearothermophilus PV72 expressed by oxidative stress. J. Bacteriol. V. 179. P. 1664-1670.

68. Kuhlmann A.U., and Bremer E. (2002) Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. Appl.Environ.Microbiol. V.68. №2. P. 772-783.

69. Kwon M., Chong S., Han S., and Kim K. (2003) Oxidative stresses elevate the expression of cytochrome c peroxidase in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. V. 1623. P. 1-5.

70. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V. 227. P. 680-685.

71. Lamb D.C., Jackson C.J., Warrilow A.G., Manning N.J., Kelly D.E., and Kelly S.L. (2007) Lanosterol biosynthesis in the prokaryote Methylococcus capsulatus: insight into the evolution of sterol biosynthesis. Mol. Biol. Evol. V. 24. №8. P. 1714-1721.

72. Leibovitz E., Lemaire M., and Miras I. (1997) Occurence and function of a common domain in S-layer and other exocellular proteins. FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P.127-133.

73. Lemaire M., Miras I., Gounon P., and Béguin P. (1998) Identification of a region responsible for binding to the cell wall within the S-layer protein of Clostridium thermocellum. Microbiology. V. 144. P. 211-217.

74. Lidstrom M.E. (1988) Isolation and characterization of marine methanotrophs. Antonie Van Leeuwenhoek. V. 54. № 3. P. 189-199.

75. Lorea G., Torino M.J., Font de Valdez G., and Ljungh A. (2002) Lactobacillus express cell surface proteins which mediate binding of immobilized collagen and fibronectin. FEMS Microbiol. Letters. V. 206. P. 31-37.

76. Lortal S., Rouault A., Cesselin B., and Sleytr U.B. (1992) Paracrystalline surface layers of dairy propionibacteria. Appl Environ Microbiol. V. 59. № 8. P. 2369-2374.

77. Lupas A., Engelhardt H., and Peters J. (1994) Domain structure of the Acetogenium kivui surface layer revealed by electron crystallography and seguence analysis. J. Bacteriol. V. 176. P. 1224-1233.

78. Marmur J.A. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. V. 3. P. 208-214.

79. McDonald I.R., and Murell J.C. (1997) The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. № 8. P. 3218-3224.

80. Merkx M., and Lippard S.J. (2002) Why OrfY Characterization of mmoD, a long overlooked component of the soluble methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Biol. Chem. V. 277. P. 5858-5865.

81. Messner P., and Christian R. (1990) Characterization of the surface layer glycoprotein of Clostridium symbiosum HB25. J. Bacteriol. V. 172. P. 2576-2583.

82. Messner P., and Sleytr U.B. (1992) Crystalline bacterial cell surface layers. Adv. Microbiol. Physiol. V. 3. P. 213-275.

83. Messner P., Steiner K., Zarschler K., and Schaffer C. (2008) S-layer nanoglycobiology of bacteria. Carbohydr. Res. V. 343. № 12. P. 1934-51.

84. Minard K.I., and McAlister-Henn L. (2001) Antioxidant function of cytosolic sources of NADPH in yeast. Free Radic. Biol. Med. V. 31. P. 832-843.

85. Muller D.J., Baumeister W., and Engel A. (1999) Controlled unzipping of a bacterial surface layer with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 1317013174.

86. Moll D., Huber C., and Schlegel B. (2001) S-layer streptavidin fusion proteins as template for nanopatterned molecular arrays. Proc. Natl. Acad. USA. V. 99. P. 1464614651.

87. Morton J.D., Hayes K.F., and Semrau J.D. (2000) Effect of copper speciation on whole-cell soluble methane monooxygenase activity in Methylosinus trichosporium OB3b. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. P. 1730-1733.

88. Murrell J.C., and Radajewski S. (2000) Cultivation-independent techniques for studying methanotroph ecology. Res. Microbiol. V. 151. P. 807-814.

89. Murrell J.C., Gilbert B., and McDonald I.R. (2000) Molecular biology and regulation of methane monooxygenase. Arch. Microbiol. V. 173. P. 325-332.

90. Myronova N., Kitmitto A., Collins R.F., Miyaji A., and Dalton H. (2006) Three-dimensional structure determination of a protein supercomplex that oxidizes methane to formaldehyde in Methylococcus capsulatus (Bath). Biochemistry. V. 45. P. 11905-11914.

91. Navarre W.W., and Schneewind O. (1999) Surface protein of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell envelope. Microbiol. Mol. Biol. Rev. V. 63. P. 174-182.

92. Neubauer A., Pum D., and Sleytr U.B. (1996) Fibre-optic sensor using enzyme membrane with 2D crystalline structure. Biosensors Bioelectronics. V. 113. P. 317-325.

93. Niegowski D., and Eshaghi S. (2007) The Cor A family: structure and function revisited. Cell. Mol. Life Sci. V. 64. P. 2564-2574.

94. Nomellini J.F., Kupsu S., Sleytr U.B., and Smit J. (1997) Factors Controlling In Vitro Recrystallization of the Caulobacter crescentus paracrystalline S-Layer. J. Bacteriol. V. 179. P. 6349-6354.

95. Olabarria G., Carrascosa J.L., and Berenguer J. (1996) A conserved motif in S-layer proteins is involved in peptidoglycan binding in Thermus thermophilus. J. Bacteriol. V. 178. P.4765-4772.

96. Palva A. (1997) Molecular biology of the Lactobacillus brevis S-layer gene (slpA). FEMS Microbiol. Rev. V. 20. P. 83-88.

97. Paul G., and Wieland F. (1987) Sequence of the halobacterial glycosaminoglycan. J. Biol. Chem. V. 262. P. 9587-9593.

98. Paul G., Lompeich F., and Wieland F. (1986) Asparaginyl-N-acetylgalactosamine. Linkage unit of halobacterial glycosaminoglycan. J. Biol. Chem. V. 261. P. 1020-1024.

99. Peters J. (1996) A hyperthermostable protease of the subtilisin family bound to the surface layer of the archaeon Staphylothermus marinus. Curr. Microbiol. V. 6. P. 739-749.

100. Plekhanov A.Y. (1996) Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel. Anal. Biochem. V. 239. P. 110-111.

101. Prior S.D., and Dalton H. (1985) The effect of copper ions on membrane content and methane monooxygenase activity in methanol-grown cells of Methylococcus capsulatus (Bath). J. Gen. Microbiol. V. 131. P. 155-163.

102. Pum D., and Sleytr U.B. (1999) The application of bacterial S-layers in molecular nanotechnology. Trends Biotechnol. V. 17. P. 8-12.

103. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., and Trotsenko Y.A. (2010) Ectoine biosynthesis genes identification in moderate halophilic alphaproteobacteria Methylarcula marina. Mikrobiologia. V. 79. № 6. P. 859-860.

104. Rothfuss H., Lara J.C., Schmid A.K. and Lindstrom M.E. (2006) Involvement of the Slayer proteins Hpi and SlpA in the maintenance of cell envelope integrity in Deinococcus radiodurans R1. Microbiology. V. 152. P. 2779-2787.

105. Sambrook J., and Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 3rd edn Cold Spring Harbor Laboratory. New-York.

106. Sara M. (2001) Conserved anchoring mechanisms between crystalline cell surface S-layer proteins and secondary cell wall polymers in Gram-positive bacteria.Trends Microbiol. V. 9. P. 47-49.

107. Sara M., and Sleytr U.B. (2000) S-Layer proteins. J. Bacteriol. Y.182. P. 859-868.

108. Sara M., Pum D., and Sleytr U.B. (1992) Permeability and charge-dependent adsorption properties of the S-layer lattice from Bacillus coagulans E38-66. J. Bacteriol. V. 174. № 11. P.3487-3493.

109. Schacterle G. R., and Pollack R.L. (1973) A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biologic material. Anal Biochem. V. 51. № 2. P. 654-655.

110. Schneitz C., Nuotioo L., and Lounatmaa K. (1992) Adhesion of Lactobacillus acidophylus to avian intestinal ephitelia cell mediated by the crystalline bacterial cell surface layer (Slayer). Appl. Bacteriol. V. 74. P. 290-299.

111. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J., Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R., Murrell J.C., and Lidstrom M.E. (1995) Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. J. Bacteriol. V. 177. №. 11. P. 3071-3079.

112. Semrau J.D., DiSpirito A.A., and Yoon S. (2010) Methanotrophs and copper. FEMS Microbiol. Rev. V. 34. P. 496-531.

113. Sieburgh J.M. Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M., and Laux D. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixed layer of the deep ocean Methylomonas pelagica sp. nov. Curr. Microbiol. V. 14. P. 285-293.

114. Silver S. (1969) Active transport of magnesium in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 62. P. 764-771.

115. Sleytr U.B., and Beveridge T.J. (1999) Bacterial S-layers. Trends. Microbiol. V. 7. P. 253260.

116. Sleytr U.B., and Sara M. (1997) Bacterial and archaeal S-layer proteins: structure-function relationships and their biotechnological applications. Trends Biotechnol. V. 15. P. 20-26.

117. Sleytr U.B., and Schuster B. (2000) S-layer-supported lipid membranes. J. Biotechnol. V. 74. № 3. P. 233-254.

118. Smid B.J., and Messner P. (1996) Toward selective elicitation Of Tnl-controlled vaccination responses:vaccine application of bacterial surface layer proteins.

119. Biotechnology. V. 44. P. 225-231.

120. Smith T.J., Slade S.E., Buron N.P., Murrell J.C., and Dalton H. (2002) Improved system for protein engineering of the hydroxylase component of soluble methane monooxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V. 68. P. 5268-5273.

121. Sokolov A.P., and Trotsenko Y.A. (1995) Methane consumption in (hyper) saline habitats of Crimea (Ukraine). FEMS Microbiol. Lett. V. 18. № 4. P. 299-304.

122. Sorokin D.Y., Jones B.E., and Kuenen J.G. (2000) A novel obligately methylotrophic, methane-oxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment. Extremophiles. V. 4. P.145-155.

123. Stafford G.P, Scanlan J., McDonald I.R, and Murrell J.C. (2003) RpoN, mmoR and mmoG, genes involved in regulating the expression of soluble methane monooxygenase in Methylosinus trichosporium OB3b. Microbiology. V. 149. P. 1771-1784.

124. Stein L.Y., Sayavedra-Soto L.A., Hommes N.G., and Arp D.J. (2000) Differential regulation of amoA and amoB gene copies in Nitrosomonas europaea. FEMS Microbiol. Lett. V. 192. №2. P. 163-168.

125. Stewart F.J., Newton I.G., and Cavanaugh C.M. (2005) Chemosynthetic endosymbioses: adaptations to oxic-anoxic interfaces. Trends Microbiol. V. 13. P. 440-448.

126. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., and Lidstrom M.E. (1999) Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus (Bath). Microbiology. P. 145. P. 1235-1244.

127. Storz G., and Imlay J.A. (1999) Oxidative stress. Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 188-194.

128. Takeguchi M., Miyakawa. K., and Okura I. (1998) Purification and properties of particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Mol. Catal. Chem. V. 132. P. 145-153.

129. Takeguchi M., Miyakawa. K., and Okura I. (1999) The role of copper in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b. J. Mol. Catal. Chem. V. 137. P. 161-168.

130. Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol, and Evol. V. 24. P. 15961599.

131. Thiemann B., and Imhoff I.F. (1991) The effect of salt on the lipid composition of Ectothiorhodospira. Arch. Microbiol. V. 156. № 5. P. 376-384.

132. Trinder P. (1976) Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann. Clin. Biochem. V. 6. P. 24-27.

133. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., and Higgins D.G. (1997) The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. V. 24. P. 4876^1882.

134. Thorne K.J., Oliver R.C., Maclntyre D.E., and Gordon J.L. (1977) Endotoxin-induced platelet aggregation and secretion. Changes in plasma membrane proteins. J. Cell Sci. V. 28. P. 225-236.

135. Trotsenko Y.A., and Murrell J.C. (2008) Metabolic aspects of obligate aerobic methanotrophy. Adv. App. Microbiol. V. 63. P. 183-229.

136. Van der Palen C.J., Slotboom D.J., Jongejan L., Reijnders W.N., Harms N., Duine J.A., and van Spanning R.J. (1995) Mutational analysis of mau genes involved in methylamine metabolism in Paracoccus denitrificans. Eur. J. Biochem. V. 230. P. 860-871.

137. Genome sequence of the haloalkaliphilic methanotrophic bacterium Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. J. Bacteriol. V. 194. № 2. P. 551-552.

138. Wang Y., Graichen M.E., Liu A., Pearson A.R., Wilmot C.M., and Davidson V.L. (2003) MauG, a novel di-heme protein required for tryptophan tryptophylquinone biogenesis. Biochemistry. V. 42. P. 7318-7325.

139. Wang Y., Li X., Jones L.H., Pearson A.R., Wilmot C.M., and Davidson V.L. (2005) MauG-dependent in vitro biosynthesis of tryptophan tryptophylquinone in methylamine dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. V. 127. P. 8258-8259.

140. Walker J.M. (1994) The dansyl method for identifying N-terminal amino acids. Methods Mol. Biol. V. 32. P. 321-328.

141. Walker S.G., Smith S.H., and Smit H.J. (1992) Isolation and comparison of the paracrystalline surface layer proteins of freshwater caulobacters. J. Bacteriol. V. 174. P.

142. Wösten M.M. (1998) Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiol. Rev. V. 22. P. 127-150.

143. Xin J-Y., Cui J-R., Hu X-X, Li S-B., Xia C-G., Zhu L-M., and Wang Y-Q. (2002) Particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium is a copper-containing enzyme. Biochem. Biophys. Res. Communit. V. 295. P. 182-186.

144. Yanisch-Perron C., Vieira J., and Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene. V. 33.

145. Yimga T.M., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., and Liesack W. (2003) Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl. Environ. Microbiol. V. 69. P. 593-602.

146. Zahn J.A., Bergman D.J., Kunz J.M., and DiSpirito A.A. (2001) Membrane-associated quinoprotein formaldehyde dehydrogenase from Methylococcus capsulatus (Bath). J. Bacteriol. V. 183. P. 832-6840.

147. Zgurskaya H.I., Krishnamoorthy G., Ntreh A., and Lu S. (2011) Mechanism and function of the outer membrane channel Tol C in multidrug resistance an1783-1792.1. P. 103-119.enterobacteria. Microbiology. V. 2. P. 189-192.

Информация о работе

Щукин, Владимир Николаевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Выделение и характеристика поверхностных белков галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы